ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΓΑΛΗΣ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΣΥΜΒΟΛΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΚΑΙ ΡΕΥΣΤΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΗΛΕΚΤΡΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΓΑΛΗΣ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΣΥΜΒΟΛΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΚΑΙ ΡΕΥΣΤΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΑΡΙΑ-ΔΗΜΗΤΡΟΥΛΑ ΖΑΒΑΛΗ Επιβλέπων: Δημήτριος Κουτσούρης Καθηγητής ΕΜΠ ΑΘΗΝΑ 2009

2 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΗΛΕΚΤΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΓΑΛΗΣ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΣΥΜΒΟΛΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΚΑΙ ΡΕΥΣΤΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΑΡΙΑ-ΔΗΜΗΤΡΟΥΛΑ ΖΑΒΑΛΗ Επιβλέπων: Δημήτριος Κουτσούρης Καθηγητής ΕΜΠ ΑΘΗΝΑ

3 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΗΛΕΚΤΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧ/ΚΩΝ & ΜΗΧ/ΚΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧ/ΚΩΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΓΑΛΗΣ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΣΥΜΒΟΛΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΚΑΙ ΡΕΥΣΤΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΑΡΙΑ-ΔΗΜΗΤΡΟΥΛΑ ΖΑΒΑΛΗ Επιβλέπων: Δημήτριος Κουτσούρης Καθηγητής ΕΜΠ Εγκρίθηκε από την τριμελή εξεταστική επιτροπή την 29 η Μαϊου Δημήτριος Κουτσούρης Κωνσταντίνα Νικήτα Κωνσταντίνος Μισιακός Καθηγητής ΕΜΠ Καθηγήτρια ΕΜΠ Ερευνητής Α, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε «Δ» 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η ανάθεση της διπλωματικής εργασίας έγινε από τον Δ. Κουτσούρη, Καθηγητή του Τμήματος Ηλεκτρολόγων Μηχανικών & Μηχανικών Ηλεκτρονικών Υπολογιστών του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου. Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Ινστιτούτο Μικροηλεκτρονικής σε συνεργασία με το Ινστιτούτο Ραδ/γών και Ραδ/πων του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» υπό την εποπτεία των ερευνητών Κ. Μισιακού, Ι. Μακρή, Ι. Ράπτη, Σ. Κακαμπάκου, Π. Πέτρου και του καθηγητή Δ. Κουτσούρη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή του ΕΜΠ Δ. Κουτσούρη και τον ερευνητή του ΕΜΠ Ι. Μακρή, για το ενδιαφέρον και τις εύστοχες υποδείξεις τους για τη βελτίωση της εργασίας αυτής. Θερμά ευχαριστώ τους ερευνητές του Ινστιτούτου Μικροηλεκτρονικής Δρ. Κ. Μισιακό και Ι. Ράπτη για τη σωστή καθοδήγηση και τη συνεχή επίβλεψη κατά την εκπόνησης της εργασίας. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τους ερευνητές του Ινστιτούτου Ραδ/γών και Ραδ/πων Σ. Κακαμπάκο και Π. Πέτρου για την ουσιαστικ ή συνεργασία, και την πολύτιμη βοήθεια τους σε όλη τη διάρκεια της ερευνητικής εργασίας. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ...7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ Βιοαισθητήρας Ανοσοσφαιρίνες Γενική λειτουργία των ανοσοσφαιρινών Βασική δομή των ανοσοσφαιρινών Ισότοπα αντισωμάτων Ιατρικές εφαρμογές Ερευνητικές εφαρμογές Αρχή ακινητοποίησης βιομορίων σε επιφάνειες Μέθοδοι προσρόφησης πρωτεϊνικών μορίων στα πλαστικά Μέθοδοι ομοιοπολικής σύνδεσης μορίων στα πλαστικά Μέθοδοι έμμεσης πρόσδεσης μορίων σε πλαστικά Ανοσοαισθητήρες...23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΟΠΤΙΚΟΙ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ Οπτικοί βιοαισθητήρες Φθορισμοανοσοαισθητήρες (οπτικών ινών, επίπεδης γεωμετρίας) Συμβολομετρικοί Φράγματος σύζευξης Συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων Συντονιζόντων κατόπτρων Ελλειψομετρικοί.37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΟΠΤΙΚΩΝ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΉΡΩΝ Εφαρμογές βιομοριακών αλληλεπιδράσεων Συστήματα οπτικών βιοαισθητήρων και εφαρμογές Mach Zehnder συμβολόμετρο Φασματοσκοπία ανακλαστομετρικής συμβολής: RΙfS Σύστημα συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων: SPR Συστήματα φράγματος σύζευξης: GC Συντονίζοντα κάτοπτρα: RM Τεχνική ελλειψομετρίας Συστήματα φθορισμού Συμπερασματικά 53 Κ ΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΜΕΘΟΔΟΣ Φασματοσκοπία ανάκλασης λευκού φωτός Αρχή ανίχνευσης Ανοσοχημικές αρχές ανάλυσης Αντιγόνο Αντίσωμα Σύνδεση αντισωμάτων σε στερεούς φορείς Περιγραφή πειραματικής διάταξης-οργανολογία Υλικά και Βιολογικά αντιδραστήρια.70 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ-ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πειραματική διαδικασία 73 5

6 Προετοιμασία των δισκ ίων Si σε στάδια Κατασκευή του ρευστομηχανικού καναλιού Αποτελέσματα Πειραματική πορεία Πειραματικά αποτελέσματα Προσδιορισμός της ευαισθησίας του συστήματος Επεξεργασία Αποτελεσμάτων Σταθερότητα συστήματος...82 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...84 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 Εισαγωγή: Η παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι παρέχει άμεσα πληροφορία σχετικά με την κινητική εξίσωση της ταχύτητας με την οποία τα βιομόρια αλληλεπιδρούν και τις σταθερές ισορροπίας. Αρκετές οπτικές μέθοδοι έχουν εφαρμοστεί για την ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων, όπως η ελλειψομετρία, η RIFS, οι κυματοδηγοί τύπου Mach Zehnder ή Grating Coupler, η τεχνολογία SPR, και οπτοηλεκτρονικοί αισθητήρες. Σε αυτή την αναφορά, παρουσιάζεται μια μεθοδολογία η οποία βασίζεται στη Φασματοσκοπία Ανάκλασης Λευκού Φωτός και ενδείκνυται για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα σε στερεά υποστρώματα. Η οπτική διάταξη αποτελείται από μια VIS NIR οπτική πηγή η οποία επικοινωνεί μέσω οπτικής ίνας με φασματοφωτόμετρο συνδεδεμένο σε Η/Υ. Το εξωτερικό τμήμα της οπτικής ίνας κατευθύνει το φως κάθετα πάνω στην επιφάνεια όπου συμβαίνουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των βιιομορίων. Το ανακλώμενο φως συγκεντρώνεται από το εσωτερικό τμήμα της οπτικής ίνας και κατευθύνεται στο φασματοφωτόμετρο. Οι αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα σε επιφάνεια διοξειδίου του πυριτίου επικαλυμμένη με πολυμερικό υμένιο. Μια αντλία χρησιμοποιείται για την παροχή των αντιδραστηρίων με ελεγχόμενο ρυθμό σε ένα μικρορρευστομηχανικό κανάλι. Το φάσμα της ανάκλασης καταγράφεται σε πραγματικό χρόνο. Οι αντιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνικών μορίων γίνονται αντιληπτές σαν μετατοπίσεις του μήκους κύματος εκεί που παρατηρείται το φαινόμενο της ενισχυτικής συμβολής. Οι μετατοπίσεις αυτές στο μήκος κύματος συμβαίνουν λόγω του σχηματισμού πρωτεϊνικού στρώματος είτε κατά τη διάρκεια της προσρόφησης των αντισωμάτων στο στερεό υπόστρωμα ή λόγω αλλαγής στο πάχος του πρωτεϊνικού στρώματος όταν τα συμπληρωματικά αντιγόνα δεσμεύονται από τα ήδη ακινητοποιημένα αντισώματα. Η προτεινόμενη μεθοδολογία εφαρμόστηκε για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο χωρίς τη χρήση ιχνηθέτη της αντίδρασης μεταξύ των συμπληρωματικών μορίων βιοτίνης- [36] όπως επίσης και για την ανίχνευση της πρόσδεσης των αντιγόνων mouse στρεπταβιδίνης IgG από ήδη ακινητοποιημένα αντισώματα anti-mouse IgG. Mouse IgG σε συγκεντρώσεις της τάξης των pm ανιχνεύτηκαν σε πολύ μικρούς χρόνους αντίδρασης (10 min). Ο οπτικός αισθητήρας είναι μια απλή, γρήγορη, χαμηλού κόστους διάταξη για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων που τον καθιστά κατάλληλο για διάφορες αναλυτικές εφαρμογές [82]. 7

8 Κεφάλαιο 1: Βιοοαισ θητήρες 1.1. Βιοαισθητήρας Ένας βιοαισθητήρας ορίζεται ως μία ανεξάρτητη ολοκληρωμένη συσκευή η οποία είναι ικανή να παρέχει συγκεκριμένη ποσοτική ή ημι-ποσοτική αναλυτική πληροφορία χρησιμοποιώντας ένα βιολογικό στοιχείο αναγνώρισης (βιοχημικός υποδοχέας) το οποίο βρίσκεται σε άμεση επαφή με ένα στοιχείο μετατροπέα (IUPAC, 1999). Με άλλα λόγια είναι μια αναλυτική συσκευή, ευαίσθητη σε ένα φυσικό η χημικό ερέθισμα, η οποία μετατρέπει μια βιολογική απόκριση σε ηλεκτρικό σήμα μεταδίδοντας πληροφορίες για μια ζωτική διαδικασία [1]. Ο όρος χρησιμοποιείται συχνά κα ι για συσκευές ανίχνευσης που προσδιορίζουν τη συγκέντρωση ουσιών και άλλες παραμέτρους βιολογικού ενδιαφέροντος χωρίς άμεση χρήση βιολογικών συστημάτων, π.χ. στη βιομηχανία τροφίμων. Ένας λειτουργικός βιοαισθητήρας πρέπει να έχει την πλειοψηφία των παρακάτω ιδιοτήτων: 1) ευαισθησία και δυνατότητα διαχωρισμού 2) επιλεκτικότητα και επαναληπτική ικανότητα 3) ταχύτητα απόκρισης 4) αξιοπιστία και ικανότητα αυτοελέγχου 5) δυναμικό εύρος 6) να μην επηρεάζεται από ηλεκτρικές η περιβαλλοντικές παρεμβάσεις 7) να έχει συνάφεια το σήμα εξόδου με το περιβάλλον της μέτρησης 8) διάρκεια ζωής και δυνατότητα επισκευής και επαναχρησιμοποίησης 9) οικονομική Τιμή Η ταξινόμηση γίνεται βάσει της αισθητήριας αρχής με την οποία ανιχνεύεται η μετρήσιμη ποσότητα και περιλαμβάνει τους εξής τύπους βιοαισθητήρων [2,6]: 1.Αγωγιμομετρικοί: Ανιχνεύουν αλλαγές στην αγωγιμότητα μεταξύ δύο ηλεκτροδίων όπως για παράδειγμα τα Nanowires Si. Όποιο βιολογικό μόριο το οποίο είναι φορτισμένο ή πολωμένο προσδεθεί στο νανοκαλώδιο πυριτίου θα αλλάξει την αγωγιμότητά του. 2.Ποτενσιομετρικοί 3.Χωρητικοί: Χρησιμοποιούνται όταν η αντίδραση της βιοαναγνώρισης μπορεί να προκαλέσει μια αλλαγή στη διηλεκτρική σταθερά του μέσου. 4.Αμπερομετρικοί: Ανιχνεύουν αλλαγές στο ρεύμα. 5.Θερμιδομετρικοί: Μετράνε τη θερμότητα που εκλύεται ή απορροφάται όταν τα μόρια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους 6. Ακουστικοί-Συντονισμού: Παρακολουθούν την αλλαγή στη συχνότητα συντονισμού κ την αντίσταση όταν τα βιομόρια αλληλεπιδρούν. 7.Οπτικοί: Συσχετίζουν αλλαγές στη συγκέντρωση του μορίου προς ανίχνευση με κάποια αλλαγή στις ιδιότητες του φωτός. 8.Φθορισμού: Οι αισθητήρες φθορισμού χρησιμοποιούν ιχνηθέτες για την ανίχνευση βιομοριακών αλληλεπιδράσεων. Ένας ιχνηθέτης μπορεί να είναι ραδιοϊσότοπο, ένζυμο, φθορίζουσα ουσία, ουσία χημειοφωταύγειας, μέταλλο. Πλεονεκτούν στο ότι έχουν πιο αναπτυγμένη τεχνολογία κ πετυχαίνουν μεγαλύτερες ευαισθησίες σε σχέση με τις με τις άμεσες μελέτες. Μειονεκτούν όμως στο γεγονός ότι οι φθορίζουσες ουσίες μπορεί να επηρεάσουν τον τρόπο με τον οποίο οι πρωτεΐνες προσδένονται σε άλλα μόρια (δραστικότητα). Ανάλογα µε την προς μελέτη αντίδραση οι βιοαισθητήρες κατατάσσονται σε βιοκαταλυτικούς, στους οποίους ο υποδοχέας μπορεί να είναι ένζυμο, κύτταρο ή ιστός και σε βιοσυγγενικούς, όπου ο υποδοχέας μπορεί να είναι DNA, RNA, ή αντίσωμα. 8

9 Ένας βιοαισθητήρας αποτελείται από τον υποδοχέα, δηλαδή το βιολογικό υλικό που ακινητοποιείται στην επιφάνεια του αισθητήρα και αντιδρά µε τον αναλύτη, ο οποίος είναι κάποιο άλλο µόριο που προστίθεται στο διάλυμα, τον μεταγωγέα, ο οποίος μετρά τη φ υσικοχημική μεταβολή και μπορεί να είναι ακουστικός, οπτικός ή ηλεκτροχημικός και από το ηλεκτρικό τμήμα, το οποίο λαμβάνει το σήμα από το μεταγωγέα, το καταγράφει και το εκφράζει υπό μορφή μετρήσεων (σχήμα 1.1). Επίσης ένας βιοαισθητήρας διαθέτει τα εξής εξαρτήματα: 1.βιοκαταλύτης 2.μετατροπέας 3.ενισχυτής 4.επεξεργαστής 5.έξοδος-οθόνη Σχήμα 1.1: Διάταξη Βιοαισθητήρα Οι ανοσοαισθητήρες μελετούν τη συγκεκριμένη αλληλεπίδραση μεταξύ αντισώματος και αντιγόνου. Οι τεχνικές των ανοσοδοκιµασιών πλεονεκτούν στο ότι είναι απλές, εξαιρετικά ευαίσθητες και οικονομικές στην κατανάλωση αντιδραστηρίων. Επίσης οι ανοσοπροσδιορισμοί χαρακτηρίζονται από μεγάλη επιλεκτικότητα όσον αφορά στην αντίδραση μεταξύ των συμπληρωματικών βιομορίων και γρήγορα αποτελέσματα [3]. Οι ανοσοχημικές μέθοδοι αποτελούν ειδική κατηγορία αναλυτικών τεχνικών στις οποίες χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήρια τα αντισώματα με σκοπό τον ειδικό ποιοτικό ή ποσοτικό προσδιορισμό συγκεκριμένων ουσιών σε βιολογικά ή άλλα δείγματα. Οι ανοσοπροσδιορισμοί ταξινομούνται σε δυο ομάδες [5] τι ς ανταγωνιστικού και μη ανταγωνιστικού τύπου. Στους ανοσοπροσδιορισμούς ανταγωνιστικού τύπου (competetive binding radioimmunoassays) (σχήμα 1.2), στους οποίους ανήκουν και οι ραδιοαναλύσεις (RIA) και στις οποίες τόσο το αντιγόνο ( επισημασμένο) όσο και το αντίσωμα καθήλωσης (capture antibody) είναι σε περιορισμένη ποσότητα σε σχέση με τη μετρούμενη ουσία. Στους ανοσοπροσδιορισμούς μη ανταγωνιστικού τύπου γνωστές και ως ραδιοανοσομετρικές αναλύσεις (IRMA) τόσο το αντίσωμα σύλληψης όσο και το αντίσωμα ανίχνευσης (2 ο αντίσωμα επισημασμένο) είναι σε περίσσεια σε σχέση με το προσδιοριζόμενο αντιγόνο (σχήμα 1.3). 9

10 Σχήμα 1.2: Ανταγωνιστικός ανοσοπροσδιορισμός Σχήμα 1.3: Μη ανταγωνιστικός ανοσοπροσδιορισμός Οι ανοσολογικές δοκιµασίες στερεάς φάσης για αντισώµατα διακρινονται σε αυτές που χρησιµοποιούν βιομόρια σηµ ασµένα µε ραδιοϊσότοπα (ραδιοανοσοανάλυση, radioimmunoassay, RIA) ή ένζυµα (ανοσοπροσροφητικήανάλυση στερεάς φάσεως µε σύνδεση ενζύµου (enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA) και στις άμεσες τεχνικές που δεν χρησιμοποιούν τέτοιου είδους προσδέματα. Στη ραδιοανοσοανάλυση σηµαίνεται το σταθερό συστατικό (αντίσωμα ή αντιγόνο) µε ραδιοϊσότοπο, συνήθως µε ραδιενεργό 125Ι. Στην τεχνική ELISA γίνεται χημική σύνδεση ενός ενζύμου µε το αντίσωμα ή το αντιγόνο. Αυτές είναι οι ευρύτερα χρησιµοποιούµενες από όλες τις ανοσολογικές δοκιμασίες, επειδή μπορεί να πραγματοποιηθεί μεγάλος αριθμός δειγμάτων σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα [4]. Πρόσφατα οι δείκτες φθορισμού (immunofluorescence) ή χημειοφωταύγειας (chemilluminescence) τείνουν να αντικαταστήσουν τα ραδιοϊσότοπα ως µ έσα σήµανσης. Από τις πιο διαδεδομένες μορφές ανοσολογικών προσδιορισμών είναι η τεχνική ELISA (σχήμα 1.4). Αντιγόνα επωάζονται σε ισότονο διάλυμα αλάτων, μέσα σε πλαστικά πλακίδια ή σωληνάρια. Μικρές ποσότητες προσροφώνται πάνω στην πλαστική επιφάνεια. Το ελεύθερο αντιγόνο απομακρύνεται µε πλύση. (Στο πλακίδιο μπορεί να προστεθεί περίσσεια άσχετης πρωτεΐνης για να παρεμποδισθεί οποιαδήποτε µη ειδική σύνδεση πρωτεϊνών). Προστίθεται το εξεταζόμενο αντίσωμα, το οποίο συνδέεται µε το αντιγόνο. Οι µη προσδεμένες πρωτεΐνες απομακρύνονται µε πλύση. Το αντίσωμα ανιχνεύεται από ένα σημασμένο πρόσδεμα/αντίσωμα. Το µη συνδεδεμένο πρόσδεμα απομακρύνεται µε πλύση. Τελικά υπολογίζεται το σήμα που βρίσκεται προσδεδεμένο στα πλακίδια. 10

11 Σχήμα 1.4: Έμμεση τεχνική ανοσολογικού ανοσοπροσδιορισμού 1.2. Ανοσοσφαιρίνες Οι ανοσοσφαιρίνες ή αντισώματα είναι γλυκοπρωτεΐνες που εμφανίζουν εξειδίκευση στη σύνδεση με συγκεκριμένα αντιγόνα ή τοξίνες εισβολέων. Τα αντισώματα είναι πρωτεΐνες γνωστές ως γάμα σφαιρίνες οι οποίες βρίσκονται στο αίμα ή σε άλλα βιολογικά υγρά των σπονδυλωτών οργανισμών. Με τη σύνδεση αυτή το ανοσοποιητικό σύστημα επιδιώκει την εξουδετέρωση της δράσης των ανεπιθύμητων τοξινών και διευκολύνει τη φαγοκυττάρωση των μικροοργανισμών που φέρουν στην επιφάνειά τους το συγκεκριμένο αντιγόνο. Παράγονται από τα πλασματοκύτταρα, τα οποία είναι προϊόν διαφοροποίησης των Β- λεμφοκυττάρων. Μόλις το κατάλληλο Β-λεμφοκύτταρο, του οποίου οι μεμβρανικοί υποδοχείς ταιριάζουν με το συγκεκριμένο αντιγόνο, έλθει σε επαφή με αυτό, ευαισθητοποιείται, πολλαπλασιάζεται και διαφοροποιείται σε πλασματοκύτταρο, το οποίο εξειδικεύεται στην παραγωγή της συγκεκριμένης ανοσοσφαιρίνης. Η διαδικασία αυτή απαιτεί και την ενεργητική συμμετοχή των βοηθητικών/επαγωγικών Τ-λεμφοκυττάρων [9]. Η πρώτη επαφή του οργανισμού με το αντιγόνο επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β-λεμφοκυττάρων, αλλά τα αντισώματα παράγονται σε σχετικά μικρές ποσότητες (ευαισθητοποίηση). Με τη δεύτερη επαφή του οργανισμού με το συγκεκριμένο αντιγόνο, το ανοσοποιητικό σύστημα είναι σε θέση να παράγει τα αντισώματα γρηγορότερα και σε μεγαλύτερες ποσότητες. Οι ανοσοσφαιρίνες [7] συμβολίζονται με τα γράμματα Ig (immunoglobulins). Κάθε μόριο ανοσοσφαιρίνης έχει μια βασική δομή που μοιάζει με το γράμμα «Υ». Αποτελείται από συνδυασμό δύο βαριών αλυσίδων (H, heavy) και δύο ελαφριών αλυσίδων (L, light) και σχηματίζουν για παράδειγμα μονομερή, διμερή, πενταμερή. Οι αλυσίδες αυτές ενώνονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Υπάρχουν πέντε διαφορετικοί τύποι βαριάς αλυσίδας στα αντισώματα που συμβολίζονται με τα γράμματα γ, α, μ, δ και ε, και διαφορετικά είδη αντισωμάτων, τα οποία κατηγοριοποιούνται σε διαφορετικά ισότοπα με βάση το είδος της βαριάς αλυσίδας που έχουν. Στα θηλαστικά είναι γνωστά πέντε διαφορετικά είδη ισοτόπων, τα οποία εκτελούν διαφορετικούς ρόλους και βοηθούν άμεσα το ανοσοποιητικό σύστημα να ανταποκριθεί κατάλληλα σε οποιοδήποτε ξένο σώμα (αντιγόνο) καλείται να αντιμετωπίσει. Οι προκύπτουσες ανοσοσφαιρίνες συμβολίζονται αντίστοιχα ως IgG, IgA, IgM, IgD και IgE. Κάθε τάξη ανοσοσφαιρίνης συμμετέχει διαφορετικά στην ανοσολογική απάντηση. Η ελαφριά αλυσίδα μπορεί να είναι δύο τύπων είτε κ, είτε λ. Σε κάθε μόριο ανοσοσφαιρίνης διακρίνουμε μια μεταβλητή περιοχή (στα σκέλη του γράμματος Υ) στην οποία συμμετέχουν τμήματα των ελαφρών και των βαριών αλυσίδων. Η περιοχή αυτή δίνει την εξειδίκευση στο αντίσωμα. Διακρίνουμε και μια σταθερή περιοχή, στην οποία συμμετέχουν επίσης τμήματα των ελαφριών και των βαρέων αλυσίδων. Η περιοχή αυτή 11

12 χρησιμεύει για τη σύνδεση με μεμβρανικούς υποδοχείς κυττάρων, αλλά και για τη σύνδεση με συστατικά του συστήματος του συμπληρώματος. Μερικές τάξεις ανοσοσφαιρινών εκκρίνονται ως πολυμερή της βασικής αυτής δομής. Σχήμα 1.5: Δομή αντισώματος. Κάθε αντίσωμα προσδένεται σε συγκεκριμένο αντιγόνο. Παρόλο που η γενική δομή όλων των αντισωμάτων είναι παρόμοια, μια μικρή περιοχή στην άκρη των πρωτεϊνών είναι ιδιαίτερα μεταβλητή, επιτρέποντας σε εκατομμύρια αντισώματα με μικρές δομικές διαφορές στα άκρα τους να διαφοροποιούνται. Η περιοχή αυτή είναι γνωστή ως υπερμεταβλητή (hypervariable) περιοχή. Κάθε μια από τις μεταβλητές αυτές περιοχές μπορεί να προσδεθεί σε ένα διαφορετικό στόχο, γνωστό ως αντιγόνο. Αυτή η τεράστια ποικιλία από αντισώματα επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστημα να αναγνωρίζει έναν εξίσου μεγάλο αριθμό αντιγόνων. Η μοναδική θέση αναγνώρισης του αντιγόνου από ένα αντίσωμα ονομάζεται επίτοπος. Αυτές οι θέσεις πρόσδεσης του αντιγόνου με το αντίστοιχο αντίσωμα παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση η οποία επιτρέπει στα αντισώματα να αναγνωρίζουν μόνο τα συμπληρωματικά τους αντιγόνα ανάμεσα στην πληθώρα μορίων που συντελούν έναν ολόκληρο οργανισμό. Η αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα ενεργοποιεί και άλλα μέρη του ανοσοποιητικού συστήματος. Τα αντισώματα έχουν την δυνατότητα να αδρανοποιούν άμεσα στόχους, όπως για παράδειγμα, με την πρόσδεση τους σε ένα τμήμα ενός παθογόνου οργανισμού το οποίο το χρειάζεται για να προκαλέσει μια μόλυνση. Ο μεγάλος και πολυποίκιλος πληθυσμός από αντισώματα δημιουργείται από τυχαίους συνδυασμούς μιας ομάδας από τμήματα γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν διαφορετικές θέσεις πρόσδεσης στα αντιγόνα (παράτοποι). Επίσης την ποικιλομορφία στα αντισώματα ευνοούν και κάποιες τυχαίες μεταλλάξεις που συμβαίνουν στα γονίδια των αντισωμάτων. Τα γονίδια στα αντισώματα επαναοργανώνονται μετατρέποντας την βάση της βαριάς αλυσίδας σε μια άλλη, δημιουργώντας ένα διαφορετικό ισότοπο του αντισώματος που διατηρεί την ειδική και μεταβλητή περιοχή του αντιγόνου. Συνεπώς ένα αντίσωμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί από διαφορετικά τμήματα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η παραγωγή των αντισωμάτων είναι ο κυριότερη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. 12

13 Γενική λειτουργία των ανοσοσφαιρινών: Οι ανοσοσφαιρίνες προσδένονται ειδικά σε ένα αντιγόνο [8]. Η πρόσδεση των αντιγόνων στα αντισώματα είναι η κύρια λειτουργία των αντισωμάτων και στοχεύει στην προστασία του οργανισμού. Η ισχύς του αντισώματος σχετίζεται με τον αριθμό των αντιγόνων που μπορεί να δεσμεύσει. Η ισχύς των αντισωμάτων υπολογίζεται να είναι το πολύ δύο αντιγόνα. Συχνά η πρόσδεση ενός αντισώματος σε ένα αντιγόνο [8] δεν επιφέρει άμεσο βιολογικό αποτέλεσμα. Οι ανοσοσφαιρίνες έχουν την ικανότητα να εκτελούν κάποιες λειτουργίες εφόσον πραγματοποιηθεί η πρόσδεση του αντισώματος στο αντιγόνο. Αυτού του είδους οι λειτουργίες μπορεί να είναι: 1. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη λύση των κυττάρων και την απελευθέρωση βιολογικά ενεργών μορίων. 2. Η πρόσδεση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Φαγοκύτταρα, λεμφοκύτταρα, κύτταρα του μαστού έχουν υποδοχείς στους οποίους προσδένονται ανοσοσφαιρίνες. Αυτή η πρόσδεση μπορεί να ενεργοποιήσει τα κύτταρα να εκτελέσουν κάποια λειτουργία. Κάποιες ανοσοσφαιρίνες προσδένονται σε υποδοχείς από πλακουντιακούς τροφοβλάστες, το οποίο έχει σαν αποτέλεσμα τη μεταφορά της ανοσοσφαιρίνης στον πλακούντα. Συνεπώς τα μεταφερόμενα μητρικά αντισώματα παρέχουν ανοσία στο έμβρυο Βασική δομή των ανοσοσφαιρινών: Η βασική δομή των ανοσοσφαιρινών φαίνεται στο σχήμα 1.5. Παρόλο που διαφορετικές ανοσοσφαιρίνες διαφέρουν δομικά, δομούνται από την ίδια βασική μονάδα. Τα αντισώματα είναι μεγάλου μοριακού βάρους (150kD) σφαιρικές πρωτεΐνες του πλάσματος και είναι γνωστά ως ανοσοσφαιρίνες. Έχουν αλυσίδες σακχάρων σε κάποια από τα αμινοξέα τους. Με άλλα λόγια τα αντισώματα είναι γλυκοπρωτεΐνες. Η βασική λειτουργική μονάδα από κάθε αντίσωμα είναι μια ανοσοσφαιρίνη (Ig) μονομερές-. Τα αντισώματα μπορεί να είναι διμερή, τριμερή, τετραμερή και πενταμερή. Μέρη της ανοσοσφαιρίνης: Η ανοσοσφαιρίνη είναι ένα μόριο σε σχήμα «Υ» το οποίο αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες: δυο ταυτόσημες αλυσίδες μεγάλου μοριακού βάρους και δύο ταυτόσημες μικρού μοριακού βάρους οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Κάθε αλυσίδα ανοσοσφαιρίνης συντίθεται από επιμέρους δομικές περιοχές, οι οποίες αποτελούνται από αμινοξέα και κατηγοριοποιούνται σε διαφορετικές κατηγορίες (για παράδειγμα η μεταβλητή ή IgV και η σταθερή IgC περιοχή) ανάλογα με το σχήμα τους και τη λειτουργία τους. Επίσης διακρίνονται από μια χαρακτηριστική αναδίπλωση στην οποία δυο βήτα φύλλα δημιουργούν μια «σάντουιτς» ένωση, τα οποία συγκρατούνται με την αλληλεπίδραση μεταξύ κυστεϊνών και άλλων φορτισμένων αμινοξέων. 13

14 Σχήμα 1.6: 1. Fab περιοχή, 2. Fc περιοχή, 3. Αλυσίδα μεγάλου μοριακού βάρους με μια μεταβλητή περιοχή (V H ) και μια σταθερή περιοχή (C H 1), μια ευέλικτη περιοχή, και δυο πιο σταθερές (C H 2 and C H 3) περιοχές. 4. Αλυσίδα μικρού μοριακού βάρους με μια μεταβλητή (V L ) και μια σταθερή (C L ) περιοχή. 5. Θέσεις πρόσδεσης για το αντιγόνο (παράτοποι) 6. Ευέλικτες περιοχές. Βαριές Αλυσίδες: Υπάρχουν πέντε τύποι από Ig μεγάλου μοριακού βάρους τα οποία επισημαίνονται με τα γράμματα του ελληνικού αλφαβήτου: α, δ, ε, γ και μ. Ο τύπος της αλυσίδας με το μεγάλο μοριακό βάρος ορίζει και την τάξη του αντισώματος, που μπορεί να απαντηθεί ως IgA, IgD, IgE, IgG και IgM αντίστοιχα. Οι αλυσίδες μεγάλου μοριακού βάρους διαφέρουν στο μέγεθος και στη σύνθεση: οι α και γ έχουν περίπου 450 αμινοξέα ενώ οι μ και ε έχουν περίπου 550 αμινοξέα. Κάθε βαριά αλυσίδα (σχήμα 1.6) έχει δύο περιοχές, την σταθερή περιοχή και την μεταβλητή. Η σταθερή περιοχή είναι ίδια σε όλα τα αντισώματα του ίδιου ισοτόπου, αλλά διαφέρει στα αντισώματα διαφορετικού ισοτόπου. Οι γ, α και δ βαριές αλυσίδες έχουν μια σταθερή περιοχή η οποία αποτελείται από τρεις Ιg περιοχές στη σειρά και μια ευέλικτη περιοχή. Οι βαριές αλυσίδες μ και ε έχουν μια σταθερή περιοχή η οποία αποτελείται από τέσσερις Ig περιοχές. Η μεταβλητή περιοχή στις αλυσίδες μεγάλου μοριακού βάρους διαφέρουν στα αντισώματα που παράγονται από διαφορετικά Β αλλά είναι ίδια για τα αντισώματα που παράγονται από ένα είδος Β κυττάρων ή από έναν Β κυτταρικό κλώνο. Η μεταβλητή περιοχή κάθε βαριάς αλυσίδας είναι περίπου 110 αμινοξέα και αποτελείται από μια Ig περιοχή. Ελαφριές Αλυσίδες: Στα θηλαστικά υπάρχουν δυο τύποι ελαφριών αλυσίδων που ονομάζονται λ και κ. Μια ελαφριά αλυσίδα έχει δυο διαδοχικές περιοχές: μια σταθερή περιοχή και μια μεταβλητή. Το κατά προσέγγιση μήκος της αλυσίδας κυμαίνεται μεταξύ 211 και 217 αμινοξέα. Κάθε αντίσωμα αποτελείται από δύο ελαφριές αλυσίδες οι οποίες είναι πάντοτε ταυτόσημες. Μόνο ένας τύπος κ ή λ της αλυσίδας χαμηλού μοριακού βάρους υπάρχει στα θηλαστικά. CDRs, Fv, Fab και Fc περιοχές Κάποια τμήματα του αντισώματος έχουν μοναδική λειτουργία [7,8]. Τα άκρα του σχηματισμού «Υ» για παράδειγμα, περιέχουν την περιοχή που προσδένεται το αντιγόνο. Για το λόγο αυτό τα άκρα του αντισώματος αναγνωρίζουν ξένα σώματα. Η περιοχή αυτή του αντισώματος λέγεται Fab (fragment antigen binding) περιοχή. Αποτελείται από σταθερή και 14

15 μια μεταβλητή περιοχή από κάθε βαριά και ελαφριά αλυσίδα του αντισώματος. Η παράτοπος θέση σχηματίζεται στο αμινοτελικό άκρο του μονομερούς του αντισώματος από τις μεταβλητές περιοχές των χαμηλού και υψηλού μοριακού βάρους αλυσίδων. Η μεταβλητή περιοχή αναφέρεται ως Fv περιοχή και είναι η πιο σημαντική περιοχή για την πρόσδεση στο αντιγόνο. Πιο συγκεκριμένα οι μεταβλητοί βρόγχοι, στις ελαφριές και βαριές αλυσίδες είναι υπεύθυνοι για την πρόσδεση στο αντιγόνο. Αυτοί οι βρόγχοι αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως CDRs (Complementarity Determining Regions). O σχηματισμός «Υ» παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος. Η περιοχή αυτή ονομάζεται Fc (Fragment, crystallizable) περιοχή και αποτελείται από δυο αλυσίδες μεγάλου μοριακού βάρους οι οποίες συνεισφέρουν δυο ή τρεις σταθερές περιοχές ανάλογα με την τάξη του αντισώματος. Η Fc περιοχή προσδένεται σε πρωτεΐνες-πρωτεΐνες του συμπληρώματος, κυτταρικούς υποδοχείς-fc υποδοχείς. Κατά συνέπεια μεσολαβεί σε φυσιολογικές διαδικασίες όπως κυτταρική διάλυση Ισότοπα αντισωμάτων: Τα αντισώματα απαντώνται σε διαφορετικά ισότοπα. Στα θηλαστικά υπάρχουν πέντε ισότοπα γνωστά ως IgA, IgD, IgE, IgG και IgM. Το πρόθεμα Ig προέρχεται από τη λέξη immunoglobulin-ανοσοσφαιρίνη που είναι μια άλλη ονομασία για τα αντισώματα. Τα ισότοπα διαφέρουν ως προς τις βιολογικές τους ιδιότητες, και την ικανότητά τους να αντιμετωπίζουν τα διάφορα αντιγόνα. Το ισότοπο του αντισώματος από ένα Β κύτταρο διαφοροποιείται κατά την κυτταρική ανάπτυξη και ενεργοποίηση. Τα διάφορα είδη των αντισωμάτων είναι τα παρακάτω [7]. Η ανοσοσφαιρίνη IgG είναι η κύρια ανοσοσφαιρίνη στο αίμα. Κατά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του αίματος σχηματίζει στο ηλεκτροφόρημα το έπαρμα γ. Για το λόγο αυτό συνηθίζεται να αποκαλείται και γ-σφαιρίνη. Περνάει τον πλακούντα και μέσω αυτής μεταβιβάζεται η παθητική ανοσία από τη μητέρα στο κύημα. Συμμετέχει ενεργά στη δευτερογενή απάντηση στο συγκεκριμένο αντιγόνο, αφού έχει προηγηθεί η ευαισθητοποίηση. Η ανοσοσφαιρίνη IgA είναι η κύρια ανοσοσφαιρίνη των εκκρίσεων των βλεννογόνων, όπου ο οργανισμός έρχεται σε άμεση επαφή με τους μικροοργανισμούς του περιβάλλοντος. Ανιχνεύεται στο σάλιο, στους βλεννογόνους του αναπνευστικού, στο κολπικό υγρό κ.α.. Η ανοσοσφαιρίνη IgM συμμετέχει στην πρώτη επαφή του οργανισμού με το συγκεκριμένο αντιγόνο. Σταδιακά δίνει τη θέση της στην IgG. Η παρουσία της σε αυξημένες ποσότητες ερμηνεύεται ως πρόσφατη λοίμωξη από μικροοργανισμό στον οποίο δεν είχε προηγηθεί ευαισθητοποίηση. Η ανοσοσφαιρίνη IgD ανιχνεύεται κυρίως στη μεμβράνη των λεμφοκυττάρων και σε μικρή ποσότητα στο αίμα. Συμμετέχει στη διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων μετά από την επαφή τους με το αντιγόνο, αλλά ο ρόλος της δεν είναι επαρκώς κατανοητός. Η ανοσοσφαιρίνη IgE έχει υποδοχείς για τη σύνδεση με τη μεμβράνη των βασεόφιλων και των μαστοκυττάρων (ή σιτευτικών κυττάρων). Τα κύτταρα αυτά έχουν την ικανότητα έκκρισης ισταμίνης, μόλις η ανοσοσφαιρίνη συνδεθεί με το αντίστοιχο αντιγόνο. Οι ποσότητες της ανοσοσφαιρίνης IgE είναι αυξημένες σε άτομα σε ατοπικά νοσήματα, δηλαδή σε νοσήματα αλλεργικής αιτιολογίας. Στις περιπτώσεις αυτές τα συμπτώματα οφείλονται στην ανεξέλεγκτη παραγωγή και έκκριση ισταμίνης. Η ανοσοσφαιρίνη IgE αυξάνει επίσης και σε άτομα με παρασιτικά νοσήματα Ιατρικές εφαρμογές: Διάγνωση ασθενειών και θεραπεία: Η ανίχνευση συγκεκριμένων αντισωμάτων είναι μια πολύ διαδεδομένη μορφή της διαγνωστικής ιατρικής και εφαρμογές [8] όπως η επιστήμη που ασχολείται με τις ιδιότητες 15

16 των ορών (serology) βασίζονται σε αυτές τις μεθόδους. Για παράδειγμα στα βιοχημικά τεστ αν δεν εμφανιστούν τα ζητούμενα αντισώματα για μια ασθένεια τότε είτε το πρόσωπο δεν έχει μολυνθεί ή η μόλυνση πραγματοποιήθηκε καιρό πριν την εξέταση και τα Β κύτταρα που παράγουν τα συγκεκριμένα αντισώματα έχουν αποσυντεθεί φυσιολογικά. Στην κλινική ανοσολογία τα επίπεδα των μεμονωμένων αντισωμάτων σε έναν ασθενή υπολογίζονται με νεφελομετρία. Αυξήσεις σε διάφορες ανοσοσφαιρίνες είναι κάποιες φορές χρήσιμο να εντοπίζονται για να αποφασιστεί η αιτία της καταστροφής του συκωτιού ενός ασθενή του οποίου η διάγνωση είναι ανεπαρκής. Για παράδειγμα υψηλές τιμές στην ανοσοσφαιρίνη IgA παραπέμπουν σε αλκοολική κύρωση του ήπατος. Παράλληλα ανεβασμένες τιμές στην IgM ανοσοσφαιρίνη δείχνουν ότι ο ασθενής πάσχει από ιογενή ηπατίτιδα, ενώ αν η IgG είναι αυξημένη μπορεί να πάσχει από ιογενή ή αυτοάνωση ηπατίτιδα και κύρωση. Τα αυτοάνωσα νοσήματα μπορεί να διαγνωστούν όταν τα αντισώματα προσδένονται σε επιτόπους του ιδίου οργανισμού και πολλά από αυτά ανιχνεύονται με εξετάσεις αίματος. Τα αντισώματα τα οποία στρέφονται εναντίον των ερυθρών κυττάρων ευθύνονται για την αιμολυτική αναιμία και ανιχνεύονται με το Coombs τεστ. Πρακτικά, αρκετές ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι βασισμένες στην ανίχνευση του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος χρησιμοποιούνται για να διαγνώσουν μολυσματικές ασθένειες, όπως για παράδειγμα οι: ELISA, ανοσοφθορισμός, ανοσοηλεκτροφόρηση. Στοχευόμενα μονόκλωνα αντισώματα εισάγονται σαν μια νέα μορφή θεραπείας για ασθένειες όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η σκλήρυνση κατά πλάκας, η ψωρίαση και πολλοί τύποι καρκίνου. Κάποιες ανωμαλίες στο ανοσοποιητικό σύστημα όπως η υπογαμμασφαιραναιμία καταλήγουν σε μερική ή ολική έλλει ψη από αντισώματα. Αυτές οι ασθένειες συχνά θεραπεύονται προκαλώντας μια παροδική μορφή ανοσίας που λέγεται παθητική ανοσία. Η παθητική ανοσία επιτυγχάνεται με τη μεταφορά έτοιμων αντισωμάτων στη μορφή ανθρώπινου ή ζωικού ορού στον ασθενή Ερευνητικές εφαρμογές: Συγκεκριμένα αντισώματα παράγονται εγχέοντας [8,9] ένα αντιγόνο σε ένα θηλαστικό, όπως ποντίκι, λαγός, αίγα για μικρές ποσότητες παραγωγής αντισώματος, πρόβατο ή άλογο για μεγαλύτερες ποσότητες παραγωγής αντισώματος. Το αίμα που απομονώνεται από αυτά τα ζώα περιέχει πολυκλωνικά αντισώματα- πολλαπλά αντισώματα τα οποία προσδένονται στο ίδιο αντιγόνο- στον ορό του αίματος, ο οποίος σε αυτή τη φάση καλείται αντιορός. Αντιγόνα επίσης εγχέονται και στα κοτόπουλα για τη δημιουργία πολυκλωνικών αντισωμάτων στον κρόκο του αυγού. Για την απόκτηση του αντισώματος το οποίο θα είναι εξειδικευμένο για μια επίτοπο θέση στο αντιγόνο, τα λεμφοκύτταρα τα οποία εκκρίνουν αντισώματα απομονώνονται από το ζώο και συγχωνεύονται με καρκινικά κύτταρα. Τα συγχωνευμένα κύτταρα ονομάζονται υβριδώματα, και διαρκώς αυξάνονται και εκκρίνουν αντισώματα στην καλλιέργεια [4]. Μονά υβριδώματα απομονώνονται για να δημιουργηθούν κυτταρικοί κλώνοι οι οποίοι παράγουν όλοι το ίδιο αντίσωμα. Αυτά τα αντισώματα ονομάζονται μονοκλωνικά αντισώματα (σχήμα 1.7). Τα πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα συχνά καθαρίζονται με χρωματογραφία συγγένειας. 16

17 Σχήμα 1.7: Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Στην έρευνα, τα καθαρά αντισώματα χρησιμοποιούνται σε πολλές εφαρμογές. Το πιο διαδεδομένο είναι να χρησιμοποιηθούν στην αναγνώριση και στον εντοπισμό ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών πρωτεϊνών. Τα αντισώματα χρησιμοποιούνται στη (κυτταρομετρία ροής) για τη διαφοροποίηση των κυττάρων από τις πρωτεΐνες που εκφράζουν. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων εκφράζουν διαφορετικούς συνδυασμούς από μόρια στην επιφάνειά τους, και παράγουν διαφορετικές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες. Επίσης χρησιμοποιούνται στην ανοσοκαταβύθιση (immunoprecipitation) για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών και οτιδήποτε είναι προσδεδεμένο σε αυτές από άλλα μόρια σε ένα κυτταρικό διάλυμα, στην ηλεκτροφόρηση όπου πραγματοποιείται ο διαχωρισμός και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών, και στην ανοσοϊστοχημεία ή στις μεθόδους ανίχνευσης με φθορισμό που στόχο έχουν να εξετάσουν την έκφραση των πρωτεϊνών σε μέρη ιστών ή να εντοπίσουν τις πρωτεΐνες μέσα στα κύτταρα με τη βοήθεια μικροσκοπίου. Οι πρωτεΐνες μπορεί να ανιχνευτούν και να ποσοτικοποιηθούν ανάμεσα στα αντισώματα χρησιμοποιώντας τεχνικές και ELISA ELISPOT Ακινητοποίηση βιομορίων σε επιφάνειες Ακινητοποίηση ονομάζεται η διαδικασία σύνδεσης ενός βιομορίου σε κάποιο αδιάλυτο υλικό-υπόστρωμα στήριξης, με τέτοιο τρόπο, ώστε να συνεχίσει να διατηρεί τις ιδιότητές του. Η σύνδεση πρωτεϊνικών μορίων και εν γένει βιομορίων σε επιφάνειες στερεών φορέων έχει βρει τα τελευταία χρόνια πολλαπλές εφαρμογές σε διάφορους επιστημονικούς, κλάδους, όπως η βιoϊατρική, η βιοχημεία, η ανοσοχημεία, η οργανική χημεία. Στη συνέχεια αναπτύσσεται διεξοδικά η εφαρμογή των ακινητοποιημένων στην επιφάνεια στερεών φορέων βιομορίων στον τομέα της ανοσοχημείας. Οι τεχνικές που έχουν αναπτυχθεί για την ακινητοποίηση βιολογικά ενεργών ουσιών (ενζύμων, αντιγόνων/αντισωμάτων, βακτηρίων, ιστών) βασίζονται σε φυσικές ή χημικές μεθόδους ή σε συνδυασμούς αυτών. Η κύρια φυσική μέθοδος είναι η προσρόφηση (adsorption) σε μη υδατοδιαλυτό φορέα. Οι πιο διαδεδομένες τεχνικές χημικής 17

18 ακινητοποίησης είναι η διαμοριακή σύνδεση (cross-linking) των ενζυμικών μορίων και η ομοιοπολική (covalent binding) σύνδεση σε ενεργοποιημένο φορέα. Η διαμοριακή σύνδεση μέσω διλειτουργικών υποκαταστατών (bifunctional agents) συνδυάζεται συνήθως με προσρόφηση των πρωτεϊνικών μορίων [10]. Εκτός από την απευθείας πρόσδεση αντιγόνου ή αντισώματος στην επιφάνεια στερεών φορέων έχουν αναπτυχθεί διάφορες εναλλακτικές διαδικασίες ακινητοποίησης, όπως για παράδειγμα η πρόσδεση του αντισώματος της ανάλυσης στον στερεό φορέα μέσω ακινητοποιημένου δευτέρου αντισώματος, μέσω συστήματος αβιδίνης-βιοτίνης. Σημαντικά πλεονεκτήματα των τεχνικών στερεάς φάσης αποτελούν η μείωση των αναλυτικών σταδίων, καθώς παραλείπεται το στάδιο της φυγοκέντρησης που είναι απαραίτητο σε όλες τις τεχνικές διαχωρισμού, η δυνατότητα χρησιμοποίησής τους για οποιοδήποτε ζεύγος αντιγόνου-αντισώματος, η πολύ χαμηλή μη ειδική δέσμευση που τις χαρακτηρίζει, οι αυξημένες δυνατότητες αυτοματοποίησης που προσφέρουν, η δυνατότητα ανάπτυξης νέων τύπων ανοσοχημικών προσδιορισμών. Κυριότερα μειονεκτήματα των τεχνικών στερεάς φάσης είναι ότι απαιτούν ικανές ποσότητες αντιδραστηρίων, καθώς και το ότι σε ορισμένες περιπτώσεις η πρόσδεση στη στερεά φάση επηρεάζει την ταχύτητα ή και την ικανότητα σύνδεσης μεταξύ αντιγόνων και αντισωμάτων. Τις περισσότερες εφαρμογές ως στερεά φάση στους ανοσοχημικούς πρoσδιoρισμoύς βρίσκουν διάφοροι πλαστικοί φορείς σε ποικίλες μορφές (σωλήνες, σφαιρίδια, φρεάτια μικροτιτλοδότησης, μικροσωματίδια, σωματίδια και φορείς πολυσακχαριτικής φύσεως, μεμβράνες κατασκευασμένες είτε από πλαστικά πολυμερή, είτε από πολυσακχαρίτες (π.χ. κυτταρίνη) καθώς και γυάλινοι σωλήνες. Ειδική κατηγορία υλικών που χρησιμοποιούνται ως στερεοί φορείς για την ανάπτυξη ανοσοχημικών προσδιορισμών αποτελούν τα μαγνητικά σωματίδια τα οποία παρασκευάζονται με ενσωμάτωση παραμαγνητικού υλικού συνήθως κάποιων οξειδίων του σιδήρου σε σφαιρίδια ενός αδρανούς πολυμερούς υλικού. Τα τελευταία χρόνια, με την ανάπτυξη του πεδίου των ανοσοαισθητήρων οι oπoίοι συνδυάζουν την αρχή των ανοσοχημικών τεχνικών με τεχνικές ανίχνευσης που επιτρέπουν την παρακολούθηση της εξέλιξης της αντίδρασης αντιγόνου-αντισώματος έχουν χρησιμοποιηθεί ως στερεοί φορείς οπτικές ίνες κατασκευασμένες από γυαλί ή πυρίτιο, καθώς και ψηφίδες πυριτίου. Οι στερεοί φορείς που χρησιμοποιούνται στους ανοσοχημικούς προσδιορισμούς διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους ως προς το λόγο του όγκου αντίδρασης προς την επιφάνεια αντίδρασης, ο οποίος επηρεάζει τόσο την κινητική των αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα στη διεπιφάνεια, όσο και το δυναμικό εύρος των ανοσοχημικών προσδιορισμών που τελικά αναπτύσσονται. Επειδή οι αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα μόνο σε μικρή απόσταση από την επιφάνεια του στερεού φορέα, ο χρόνος που απαιτείται για την επίτευξη της ισορροπίας είναι πολύ μεγαλύτερος συγκριτικά με τις αντιδράσεις υγρής φάσης, ενώ η διάχυση των αντιδρώντων είναι ο καθοριστικός παράγοντας που ρυθμίζει την ταχύτητα των αντιδράσεων. Έτσι, οι μικροσωματιδιακοί φορείς που έχουν μεγαλύτερη επιφάνεια σε σχέση με τους σωλήνες, τα μακροσφαιρίδια, πλεονεκτούν ως προς αυτούς ως προς την ταχύτητα των προσδιορισμών. Οι μεμβράνες, τέλος, έχουν σε σύγκριση με άλλες μορφές στερεών φορέων μεγαλύτερη επιφάνεια προσρόφησης και παρέχουν τη δυνατότητα συνεχούς ροής αντιδραστηρίων, ώστε η διάχυση να μην είναι πλέον ο ρυθμιστικός παράγοντας της ταχύτητας της ανοσοαντίδρασης. Οι διάφοροι στερεοί φορείς που χρησιμοποιούνται στους ανoσoχημικούς προσδιορισμούς διαφέρουν επίσης ως προς τον τρόπο σύνδεσης των βιομορίων στην επιφάνειά τους. Η μέθοδος πρόσδεσης εξαρτάται από τον υδρόφιλο ή υδρόφοβο χαρακτήρα της επιφάνειας του στερεού φορέα και την παρουσία σε αυτήν δραστικών ομάδων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για αντίδραση με δραστικές ομάδες του βιομορίου. Οι μακροσκοπικοί πλαστικοί φορείς (σωλήνες, σφαιρίδια) που παρασκευάζονται κυρίως από πoλυστυρένιo, πολυπροπυλένιο, πολυβινυλοχλωρίδιο και πολυαιθυλένιο δεν φέρουν στην επιφάνεια τους δραστικές ομάδες, αλλά παρά ταύτα πρωτεϊνικά μόρια μπορούν να 18

19 ακινητοποιηθούν στην επιφάνεια. τους με προσρόφηση. Είναι φυσικά δυνατή η επιφανειακή τροποποίηση αυτών των πολυμερών και η εισαγωγή δραστικών ομάδων, οι μέθοδοι όμως είναι συχνά χρονοβόροι και έχουν μειωμένη επαναληψιμότητα. Επιφανειακή τροποποίηση για την εισαγωγή δραστικών ομάδων είναι απαραίτητη και στην περίπτωση των γυάλινων στερεών φορέων, οι οποίοι δεν προσροφούν βιομόρια στην επιφάνειά τους. Οι μικροσωματιδιακοί πλαστικοί φορείς μπορεί ανάλογα με το πολυμερές από το οποίο έχουν παρασκευαστεί να έχουν υδρόφοβη ή υδρόφιλη επιφάνεια και να φέρουν ή όχι στην επιφάνειά τους δραστικές ομάδες, οπότε η πρόσδεση βιομορίων πραγματοποιείται ανάλογα με την φύση του υλικού, είτε με προσρόφηση, είτε με ομοιοπολική σύνδεση. Οι πολυσακχαρικοί μικροσωματιδιακοί φορείς, τέλος, διαφέρουν από τους πλαστικούς στερεούς φορείς, τόσο στη χημεία, όσο και στην απόδοση της επικάλυψης με μόρια. Η πρόσδεση μορίων στην επιφάνειά τους γίνεται αποκλειστικά με ομοιοπολικό τρόπο Μέθοδοι προσρόφησης πρωτεϊνικών μορίων στα πλαστικά: Μια από τις πιο διαδεδομένες τεχνικές ακινητοποίησης βιομορίων σε επιφάνεια είναι αυτή της προσρόφησης (adsorption). Η προσρόφηση των βιομορίων πάνω σε μη υδατοδιαλυτούς φορείς είναι η απλούστερη μέθοδος ακινητοποίησης. Η σύνδεση του βιομορίου με το μη υδατοδιαλυτό υλικό γίνεται μέσω ιοντικών, πολικών ή υδρόφοβων δεσμών ή δεσμών υδρογόνου ή μέσω π-ηλεκτρονιακών αλληλεπιδράσεων. Η σύνδεση των πρωτεϊνών στα πλαστικά με υδρόφοβη επιφάνεια επιτυγχάνεται κυρίως με μη ειδικές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Οι δυνάμεις που συμμετέχουν στη δημιουργία αυτής της σύνδεσης είναι δευτερεύουσες δυνάμεις Van der Waals, οι οποίες αν και ασθενείς οδηγούν σε ισχυρή σύνδεση λόγω της μεγάλης τους έκτασης. Η ακινητοποίηση επιτυγχάνεται κατά την επαφή υδατικού διαλύματος του βιομορίου με το προσροφητικό μέσο για κάποια χρονική περίοδο, μετά την πάροδο της οποίας η περίσσεια του βιομορίου απομακρύνεται από το διάλυμα. Διάφορα υλικά, όπως το διοξείδιο του τιτανίου, νάυλον μεμβράνες τροποποιημένες με τεταρτοταγή αμμωνιακά άλατα, πηκτή διοξειδίου του πυριτίου (silica gel), αλουμίνα, κατιονικές και ανιονικές ιονανταλλακτικές ρητίνες, κεραμικά υλικά έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για την ακινητοποίηση μεγάλου αριθμού βιομορίων. Το προσροφητικό υλικό πρέπει να έχει υψηλή προσροφητική χωρητικότητα, μεγάλη συγγένεια με το προσροφούμενο βιομόριο. Τέλος το βιομόριο πρέπει να προσροφάται κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να διατηρεί το μεγαλύτερο ποσοστό της ενεργότητάς του. Τα προσροφούμενα βιομόρια διατηρούν πολύ υψηλ ό ποσοστό ή σχεδόν όλη την αρχική τους ενεργότητα ανάλογα με τη φύση των αναπτυσσόμενων δεσμών, οι οποίοι δεν προκαλούν καταστροφή των ενεργών κέντρων. Η προσρόφηση πρωτεϊνών στην επιφάνεια ενός υλικού είναι μία αντιστρεπτή διαδικασία, γι αυτό οι συνθήκες παρασκευής και λειτουργίας (ph, ιοντική ισχύς, θερμοκρασία, διαλύτης), πρέπει να διατηρούνται σταθερές. Αλλαγές των συνθηκών λειτουργίας μπορούν να προκαλέσουν την εκρόφηση του βιομορίου με αποτέλεσμα τη μείωση της ενζυμικής του δραστικότητας. Η σύνδεση των πρωτεϊνών δεν επηρεάζεται γενικά από το είδος του ρυθμιστικού διαλύματος, οι μεταβλητές που κυρίως επηρεάζουν την προσρόφηση στη στερεά φάση είναι η θερμοκρασία, ο χρόνος και η συγκέντρωση του διαλύματος επώασης. Το ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί επίσης να. περιέχει ουδέτερα άλατα όπως χλωριούχο νάτριο, δεν πρέπει όμω ς να περιέχει μη ιοντικά επιφανειοδραστικά όπως Τritοn Χ100 ή Tween 20, γιατί ανταγωνίζονται τις πρωτεΐνες για τις θέσεις δέσμευσης του πλαστικού. Ο απαιτούμενος χρόνος επώασης εξαρτάται τόσο από τη θερμοκρασία επώασης όσο και από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυμα επώασης. Οι πιο συνηθισμένες θερμοκρασίες επώασης είναι 4 C, θερμοκρασία δωματίου, ή 37 C. Όταν η επώαση γίνεται στους 4 C ή σε θερμοκρασία δωματίου, ο χρόνος επώασης κυμαίνεται από 18 έως 24 ώρες. Αντίθετα, όταν η επώαση γίνει στους 37 C, ο απαιτούμενος χρόνος μειώνεται σε λίγες ώρες. 19

20 Κατά την προσρόφηση των πρωτεϊνικών μορίων στην επιφάνεια στερεών φορέων δεν ενδιαφέρει μόνο η ποσότητα της πρωτεΐνης που ακινητοποιείται αλλά και η λειτουργικότητά της. Κατά την προσρόφηση επέρχονται αλλαγές στην τριτοταγή διαμόρφωση των πρωτεϊνικών μορίων που έχουν ως αποτέλεσμα αλλαγή στη λειτουργικότητάς τους. Οι αλλαγές στη διαμόρφωση πρωτεϊνικών μορίων κατά την προσρ όφησή τους στην επιφάνεια στερεών φορέων σχετίζονται με τη μετακίνηση υδρόφοβων τμημάτων της πρωτεΐνης που σε διάλυμα βρίσκονται στο εσωτερικό της προς την εξωτερική επιφάνεια, ώστε να ενισχυθεί η αλληλεπίδραση με την υδρόφοβη επιφάνεια του στερεού. Από μελέτες που έγιναν με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης, προκύπτει ότι τα προσροφημένα στην επιφάνεια πλαστικών φορέων αντισώματα σε συνθήκες κορεσμού σχηματίζουν συστάδες (clusters), τα οποία πιθανότατα αντιστοιχούν στο μικρό ποσοστό (περίπου 10%) των ακινητοποιημένων αντισωμάτων που διατηρούν τη δεσμευτική τους ικανότητα. Γεγονός είναι ότι, παρά την εκτεταμένη καταστροφή των πρωτεϊνικών μορίων, κατά την προσρόφησή τους στην επιφάνεια πλαστικών φορέων η μέθοδος εξακολουθεί να εφαρμόζεται ευρέως, και ο λόγος είναι ότι η τεχνική της προσρόφησης είναι απλή στην εφαρμογή της, το μικρό δε ποσοστό των δραστικών μορίων που παραμένει είναι στις περισσότερες περιπτώσεις αρκετό για την εφαρμογή για την οποία προορίζεται. Τέλος η σταθερότητα των προσροφημένων πρωτεϊνών παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των επικαλυμμένων με αντιγόνο ή αντίσωμα πλαστικών φορέων μετά από απομάκρυνση με κατάλληλη επεξεργασία των ανοσοπροσροφημένων μορίων [12] Μέθοδοι ομοιοπολικής σύνδεσης μορίων στα πλαστικά: Η ομοιοπολική σύνδεση βιομορίων στην επιφάνεια πλαστικών στερεών φορέων δεν είναι απαραίτητη αφού ο υδρόφοβος χαρακτήρας των πλαστικών φορέων επιτρέπει την εύκολη πρόσδεση των πρωτεϊνικών μορίων, ωστόσο σε ορισμένες περιπτώσεις πλεονεκτεί σε σχέση με την προσρόφηση ως προς τη σταθερότητα της σύνδεσης και τη διατήρηση της δραστικότητας των προσροφημένων μορίων. Επίσης, η ομοιοπολική σύνδεση είναι απαραίτητη για τη σύνδεση ουσιών που δεν προσροφούνται ικανοποιητικά στα πλαστικά. Για την ομοιοπολική σύνδεση μορίων σε πλαστικούς φορείς είναι αναγκαία η ύπαρξη δραστικών ομάδων στην επιφάνεια των πλαστικών με τις οποίες είναι δυνατή η σύζευξη με ομάδες του μορίου. Εκτός από τα πλαστικά υλικά που από κατασκευής φέρουν δραστικές ομάδες τα τελευταία χρόνια έχουν παρασκευαστεί προϊόντα στα οποία έχουν ενσωματωθεί δραστικές ομάδες, όπως αμινομάδες, αλδεϋδοδομάδες, καρβοξυλομάδες, και άλλες ομάδες. Αν δεν υπάρχουν δραστικές ομάδες στην επιφάνεια του πλαστικού, αυτές μπορούν να εισαχθούν με διάφορες μεθόδους οι οποίες διαφέρουν, τόσο στη πολυπλοκότητά τους, όσο και στον μηχανισμό στον οποίο στηρίζονται. Πλαστικοί φορείς στην επιφάνεια των οποίων έχουν εισαχθεί ενεργές ομάδες (με ακτινοβόληση, με χημικό τρόπο, με εμφύτευση ουσιών στο πλαστικό σε συνθήκες πλασματος ή με επικάλυψη του φορέα με πολυμερές που φέρει δραστικές ομάδες) έχουν χρησιμοποιηθεί για ομοιοπολική σύνδεση πρωτεϊνών, ανοσοσφαιρινών, πεπτιδίων, αντιγόνων ή βιοτίνης για εφαρμογή σε ανοσοχημικούς προσδιορισμούς. Ο τρόπος με τον οποίο θα πραγματοποιηθεί η ομοιοπολική πρόσδεση βιομορίων στην επιφάνεια των πλαστικών φορέων εξαρτάται από τις διαθέσιμες για αντίδραση ομάδες ανεξάρτητα από τον τρόπο που δημιουργήθηκαν οι ομάδες αυτές στο στερεό ή με το είδος του μορίου που ανήκουν. Στο σχήμα 1.8, παρουσιάζονται σχηματικά οι σημαντικότερες από τις αντιδράσεις που πραγματοποιούνται ανάμεσα στις δραστικές ομάδες του στερεού φορέα και του βιομορίου. 20

21 Σ χήμα 1.8: Αντιδράσεις ενεργοποίησης υλικών στήριξης στην ομοιοπολική σύνδεση Η επιλογή της αντίδρασης πρόσδεσης που θα χρησιμοποιηθεί σε κάθε περίπτωση καθορίζεται κατά κύριο λόγο από τις διαθέσιμες ομάδες, αλλά και από τη διατήρηση ή όχι 21

22 της λειτουργικότητας του μορίου στις συνθήκες αντίδρασης, τη σταθερότητα σύνδεσης, κ.α. Έτσι, οι αντιδράσεις μεταξύ αμινομάδων και καρβοξυλομάδων είναι πoλύ κοινές και οδηγούν στη δημιουργία σταθερών αμιδικών δεσμών, αλλά οδηγούν σε μια μάλλον τυχαία πρόσδεση του βιομορίου που σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να μην είναι ευνοϊκή για τη λειτουργικότητά του. Πρόσθετα, σε περιπτώσεις βιομορίων που φέρουν στο σκελετό τους αμινομάδες και καρβοξυλομάδες η χρήση αντιδραστηρίων ενεργοποίησης, όπως τα καρβοδιϊμίδια, οδηγεί εκτός από τη σύνδεση στον στερεό φορέα, σε ενδο- και δια- μοριακή σύμπλεξη των μορίων, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργικότητά τους. Γενικά, με τις μεθόδους ομοιοπολικής σύνδεσης είναι δυνατή η σύνδεση μεγαλύτερης ποσότητας πρωτεΐνης από αυτήν που μπορεί να προσδεθεί στο στερεό με προσρόφηση, η αύξηση όμως αυτή δεν οδηγεί πάντα σε ανάλογη αύξηση της δραστικότητας του ακινητοποιημένου μορίου. Ως προς τις φυσικές μεθόδους ακινητοποίησης η μέθοδος υστερεί σε απλότητα, αφού οι αντιδράσεις ενεργοποίησης των υλικών στήριξης είναι χρονοβόρες και σε ορισμένες περιπτώσεις απαιτούν την χρήση ακριβών αντιδραστηρίων [10] Μέθοδοι έμμεσης πρόσδεσης μορίων σε πλαστικά: Η απευθείας πρόσδεση αντιγόνων ή αντισωμάτων στην επιφάνεια πλαστικών φορέων πολλές φορές οδηγεί είτε σε απώλεια της λειτουργικότητάς τους, είτε σε μη ικανοποιητική συγκέντρωση της ουσίας που μας ενδιαφέρει στην επιφάνεια του στερεού. Για τους λόγους αυτούς έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι έμμεσης ακινητοποίησης βιομορίων στην επιφάνεια στερεών φορέων, όπου η σύνδεση βιομορίου-στερεού πραγματοποιείται μέσω ενός μορίου-γέφυρας. Το μόριο-γέφυρα μπορεί να είναι μία πρωτεΐνη με μεγάλη σταθερά συγγενείας για σύνδεση με τον πλαστικό φορέα. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο μόριο γέφυρα είναι η βόειος οραλβουμίνη (BSA). Μετά την πρόσδεση της BSA στην επιφάνεια του στερεού, η ουσία που ενδιαφέρει μπορεί να ακινητοποιηθεί με ομοιοπολική σύνδεση με τα μόρια της BSA [2]. Μια άλλη μέθοδος ακινητοποίησης εκμεταλλεύεται την υψηλή σταθερά σύνδεσης της βιοτίνης με τις πρωτεΐνες αβιδίνη και στρεπταβιδίνη [12]. Επειδή όμως η αβιδίνη και η στρεπταβιδίνη έχουν σχετικά χαμηλή σταθερά σύνδεσης με το πολυμερές η πρόσδεση στην επιφάνεια του στερεού μπορεί να επιτευχθεί μέσω ομοιοπολικής σύνδεσης της αβιδίνης ή της στρεπταβιδίνης στο στερεό, χρήσης μίας βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης, π.χ. BSA που προσροφάται εύκολα στο στερεό, ή χρήση βιοτίνης ομοιοπολικά συνδεδεμέvης στην επιφάνεια του στερεού. Η μέθοδος ακινητοποίησης μέσω του συστήματος αβιδίνης-βιοτίνης έχει το πλεονέκτημα ότι μπορεί να εφαρμοστεί για οποιοδήποτε ζεύγος αντιγόνου-αντισώματος, ωστόσο στην πράξη η εφαρμογή της περιορίζεται λόγω του ότι: η πρόσδεση της αβιδίνης στην στερεά επιφάνεια συνοδεύεται από εκτεταμένη απώλεια της ικανότητας της να δεσμεύει τη βιοτίνη, η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί μόνο για απoμoνωμένα αντισώματα και όχι για αντιορούς, η μέθοδος περιλαμβάνει ένα επιπλέον στάδιο, αυτό της βιοτινιλίωσης του αντισώματος. Απαραίτητη προϋπόθεση για την επιτυχή εφαρμογή αυτής της μεθόδου πρόσδεσης είναι η προσρόφηση να μην επηρεάζει τη δραστικότητα του μορίου-γέφυρα. Τέλος, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ολόκληρα τα κύτταρα ως αντιδραστήρια στερεάς φάσης. Επειδή, όμως, η χρήση τους δημιουργεί προβλήματα υψηλής μη ειδικής δέσμευσης, η εφαρμογή τους είναι περιορισμένη. Οι διάφοροι μέθοδοι ακινητοποίησης σε στερεούς φορείς με χρήση του συστήματος αβιδίνης -βιοτίνης παρουσιάζεται στο σχήμα

23 1) 2) Σχήμα 1.9: Μέθοδοι ακινητοποίησης αντισωμάτων με χρήση του συστήματος αβιδίνης βιοτίνης. 1) Πρόσδεση μέσω βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης, 2) Ομοιοπολική σύνδεση της αβιδίνης στην επιφάνεια του στερεού φορέα 1.4. Ανοσοαισθητήρες Η ανάπτυξη μικροσυστημάτων μέτρησης και αυτοματισμού στο πεδίο των ανοσοαναλύσεων και των αναλύσεων DNA αποτελεί ένα γρήγορα εξελισσόμενο και αναπτυσσόμενο τομέα έρευνας που αναμένεται να έχει πολλές εφαρμογές και σημαντική συνεισφορά τόσο ως προς τον όγκο και την ποιότητα των λαμβανομένων πληροφοριών όσο και ως προς τη μείωση του κόστους των αναλύσεων (υλικά, αντιδραστήρια, εργασία). Στην κατεύθυνση αυτή κομβικό σημείο αποτελεί η ανάπτυξη μεταλλακτών σήματος κατάλληλα τροποποιημένων με βιομόρια αναγνώρισης ώστε να λειτουργούν ως ανοσοαισθητήρες ή 23

24 αισθητήρες DNA [13]. Η χρήση αυτών των αισθητήρων μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη απλών, γρήγορων, ευαίσθητων και εύκολων στη χρήση τους αναλυτικών μικροσυστημάτων τα οποία θα μειώσουν σημαντικά τον χρόνο της ανάλυσης, θα χρησιμοποιούνται λόγω του μικρού μεγέθους τους σε κινητές μονάδες ιατρικής φροντίδας (π.χ. ασθενοφόρα). Επίσης, θα μπορούν να χρησιμοποιούνται από όχι ιδιαίτερα εξειδικευμένους χρήστες ή και από τους ίδιους τους ασθενείς. Πέραν των εφαρμογών που έχουν οι αισθητήρες στην υγεία άλλοι τομείς όπου αναμένεται να βρουν εφαρμογές είναι ο έλεγχος ρύπανσης του περιβάλλοντος, η ανίχνευση μεταλλαγμένων τροφίμων, ο τοξικολογικός έλεγχος, κλπ. [13]. Οι ανοσοαισθητήρες ανάλογα με τη φυσικοχημική παράμετρο η οποία μελετάται διακρίνονται σε: ηλεκτροχημικούς πιεζοηλεκτρικούς οπτικούς ανοσοαισθητήρες. Οι ηλεκτροχημικοί ανοσοαισθητήρες διακρίνονται σε αμπερομετρικούς, ποτενσιομετρικούς, αγωγιμομετρικούς. Στους αγωγιμομετρικούς ανοσοαισθητήρες το αντίσωμα ακινητοποιείται στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου. Η πρόσδεση του αντιγόνου στο αντίσωμα προκαλεί αλλαγή στην αγωγιμότητα κοντά στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Η ηλεκτροχημική μέθοδος μέτρησης είναι άμεση, δεν απαιτείται δηλαδή χρήση επισημασμένων ανοσοαντιδραστηρίων. Δομές των ηλεκτροδίων σε διαστάσεις μικρομέτρων ή νανομέτρων αυξάνουν την ευαισθησία του αισθητήρα αφού το ηλεκτρικό πεδίο συγκεντρώνεται πιο κοντά στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου όπου συμβαίνει η ανοσοαντίδραση. Η αμπερομετρική μέθοδος μέτρησης (σχήμα 1.10) είναι μια έμμεση μέθοδος διότι σε αυτή γίνεται χρήση ηλεκτρενεργής ουσίας (ενζύμου και ηλεκτρενεργού προϊόντος). Στο ηλεκτρόδιο στο οποίο έχει ακινητοποιηθεί στρώμα βιομορίων παρατηρείται ρεύμα όταν προσδένονται σε αυτό τα προσημασμένα μόρια προς ανίχνευση. Υπάρχει γραμμική συσχέτιση μεταξύ του ρεύματος και της συγκέντρωσης του προσημασμένου μορίου. Η μεταφορά ηλεκτρονίων από και προς το ηλεκτρόδιο παρατηρείται εξαιτίας της οξειδοαναγωγικής συμπεριφοράς κατάστασης του μορίου-ιχνηθέτη. Σχήμα 1.10: Αμπερομετρικός ανοσοαισθητήρας Πειράματα όπως της ELISA χρησιμοποιούν αντισώματα και ένζυμα σε συνδυασμό, με σκοπό να οδηγηθούμε στην οπτική αναγνώριση της αντίδρασης μεταξύ αντισώματος και αντιγόνου. Οι ίδιες αρχές μπορεί ν α χρησιμοποιηθούν στις ηλεκτροχημικές ανοσοαναλύσεις, οι οποίες βασίζονται στη μέτρηση του ρεύματος που παράγεται κατά την οξείδωση ή την αναγωγή μιας ηλεκτροενεργής ουσίας στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου το οποίο διατηρείται υπό σταθερό δυναμικό. Το ηλεκτρόδιο στο οποίο ακινητοποιείται το κατάλληλο ανοσοαντιδραστήριο κατασκευάζεται από Pt, Au, C. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία ηλεκτρενεργών ουσιών είναι είτε οξειδοαναγωγάσες (π.χ υπεροξειδάση της ραπανίδος HRP) [13] είτε υδρολυτικά (π.χ. αλκαλική φωσφατάση). Συνήθως το ηλεκτρενεργό προϊόν της ενζυμικής ουσίας προσδιορίζεται αμπερομετρικά (σχήμα 1.11) με τη χρήση κατάλληλου διαμεσολαβητή που είναι ουσία μικρού μοριακού βάρους, η οποία 24