«ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΩΝ ΣΤΕΜΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΝΕΟΥ ΤΥΠΟΥ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΩΝ ΣΤΕΜΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΝΕΟΥ ΤΥΠΟΥ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ» Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ Β. ΣΚΟΥΡΑΣ Χημικός Πάτρα 2011

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΩΝ ΣΤΕΜΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΝΕΟΥ ΤΥΠΟΥ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ» ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ Β. ΣΚΟΥΡΑΣ Χημικός ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιμησιάρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Παύλος Κλεπετσάνης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Γεράσιμος Τσιβγούλης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Χημείας 2

3 Αφιερώνεται στους γονείς μου, Βασίλη και Ευαγγελία 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» κατά τα έτη Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Σ. Αντιμησιάρη, Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής για την ανάθεση του θέματος και την πολύτιμη αρωγή της κατά τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γ. Τσιβγούλη για τη βοήθειά του όσον αφορά στην πραγματοποίηση της σύνθεσης των λιπιδικών παραγώγων καθώς και τον κ. Π. Κλεπετσάνη για τις πολύτιμες συμβουλές του. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και όλους τους αγαπημένους μου ανθρώπους για την πολύπλευρη στήριξη που μου προσφέρουν πάντα και την πίστη τους σε μένα. 4

5 Περιεχόμενα Συντομογραφίες... 8 Περίληψη... 9 Εισαγωγή Γενική εισαγωγή στα λιποσώματα Αμφίφιλα μόρια Οργάνωση Δομή συσσωματωμάτων Διπλοστοιβάδες λιπιδίων Φωσφολιπίδια Αμφίφιλος χαρακτήρας Μεταβολές φάσης των στοιβάδων Φυσική προέλευση Μεικτά συστήματα Σχηματισμός λιποσωμάτων Λιποσώματα ως μεταφορείς βιοδραστικών ουσιών Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος Με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Multilamellar λιποσώματα (MLV) Μικρά λιποσώματα Unilamellar (SUV) Μεγάλα λιποσώματα Unilamellar (LUV) Μέθοδοι εγχύσεως διαλύτη Μέθοδοι αφαίρεσης απορρυπαντικών Μέθοδος εξάτμισης ανάστροφης φάσης Προκλητή από ασβέστιο μέθοδος σύντηξης Μέθοδος Microfluidization Εξώθηση υπο άζωτο μέσω polycarboriate φίλτρων Στιγμιαίος σχηματισμός ομοιογενών LUV Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Μέθοδος Freeze Thaw Γιγαντιαία λιποσώματα Λιποσώματα Multivesicular

6 1.6.6 Λιποσώματα Assymetric Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Διαπίδυση (dialysis) Φυγοκέντρηση (centrifugation) Χρωματογραφία γέλης (gel chromatography) Φυσικές ιδιότητες λιποσωμάτων Μέτρηση μεγέθους Επιφανειακό φορτίο Μεταβολική πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Συμβατικά Λιποσώματα Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας Εναλλακτικές οδοί για την προστασία των λιποσωμάτων Αιθέρες στέμματος Ιδιότητες αιθέρων στέμματος Δομή διαμόρφωση κατά την συμπλοκοποίηση με μεταλλοκατιόντα Χρήσεις αιθέρων στέμματος στην χορήγηση φαρμάκων Κυκλοδεξτρίνες (Γενικά) Φυσικές κυκλοδεξτρίνες Σχηματισμός συμπλόκων κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ενώσεις Πειραματικό μέρος Σύνθεση λιπιδίων Όργανα Υλικά Διαλύματα Μέθοδοι Πορεία συνθεσης νέων λιπιδίων Παρασκευή λιποσωμικών μορφών Όργανα Υλικά Διαλύματα Λιποσωμική σύσταση Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Μέθοδος παρασκευής πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων(mlv) Παρασκευή μικρών μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων

7 (SUV) Χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Μέτρηση συγκέντρωσης λιπιδίου Μελέτη της in vitro σταθερότητας λιποσωμάτων Αποτελεσματα Συζητηση Σύνθεση νέων λιπιδικών παραγώγων Λιπιδικό παράγωγο αιθέρα στέμματος Λιπιδικό παράγωγο κυκλοδεξτρίνης Σχηματισμός λιποσωμικών μορφών Σύγκριση μεγέθους stealth λιποσωμάτων και νέων παραγώγων Μελέτη σταθερότητας λιποσωμάτων που περιέχουν το νέοσυντιθέμενο λιπίδιο ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συμπεράσματα Σύνθεση λιπιδικών παραγώγων Μελέτη σταθερότητας λιποσωμικών σειρών ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 Συντομογραφίες CHOL CMC DOPE DPPC DRV DSPC FCS MLV NMR PBS PE PEG SUV TBS T m Χοληστερόλη (critical micelle concentration) κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλίου (dioleoylphosphatidylcholine) διολεϋλφωσφατιδυλοχολίνη (dipalmitoylglycerophosphatidylcholine) διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχλινη (Dehydrated Rehydrated Vesicle) Αφυδατωμένοεπανενυδατωμένο κυστίδιο (distearyloglycerophosphatidylcholine) διστεαρυλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (fetal calf serum) βόειος εμβρυϊκός ορός (multilamellar vesicle) πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Nuclear Magnetic Resonance) Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (phosphate buffer saline) ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (L α phosphatidylethanolamine) φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (polyethylenglycol) πολυαιθυλενογλυκόλη (small unilamellar vesicle) μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Tris Buffer Saline) ρυθμιστικό διάλυμα Tris (Transition temperature) Θερμοκρασία μετάπτωσης 8

9 Περίληψη Τα λιποσώματα αποτελούν ένα από τα πιο διαδεδομένα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων. Ένα από τα κυριότερα προβλήματά τους αποτελεί η γρήγορη απομάκρυνσή τους από τον οργανισμό που αντιμετωπίστηκε με την επικάλυψη της επιφάνειάς τους με πολυμερή και κυρίως πολυαιθυλενογλυκόλες (PEG). Η ύπαρξη του PEG στην επιφάνεια αύξησε κατά πολύ τον χρόνο παραμονής των λιποσωμάτων στον οργανισμό αλλά λόγω μειονεκτημάτων, όπως το φαινόμενο αυξημένης εκκαθάρισης απ τον οργανισμό μετά την δεύτερη δόση όπως και η ύπαρξη πολλών πατεντών, δημιουργούν την ανάγκη για την διερεύνηση νέων μορφών επικάλυψης των λιποσωμάτων. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η σύνθεση νέων λιπιδικών παραγώγων από κυκλοδεξτρίνες και αιθέρες στέμματος και ο σχηματισμός λιποσωμάτων από αυτά τα παράγωγα. Έναυσμα για την χρήση αυτών των χημικών ουσιών αποτέλεσε η ήδη χρησιμοποίηση τους στην μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων καθώς και οι χημικές ιδιότητές τους. Θεωρητικά η ύπαρξη ογκωδών υποκαταστατών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων προκαλεί στερεοχημική παρεμπόδιση στις αλληλεπιδράσεις με ουσίες στον οργανισμό, που θα μπορούσαν να προκαλούν την γρήγορη εκκαθάριση από τον οργανισμό, αυξάνοντας έτσι τον χρόνο παραμονής τους. Αρχικά συντέθηκαν τα λιπιδικά παράγωγα από DSPE (διστεάρυλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη) και 18 crown 6 ether καθώς και β κυκλοδεξτρίνη όμως ο καθαρισμός του παραγώγου με την κυκλοδεξτρίνη δεν κατέστει δυνατός και έτσι σχηματίστηκαν λιποσώματα μόνο από το λιπιδικό παράγωγο του αιθέρα στέμματος. Ως υλικά για την παρασκευή των λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν φωσφατιδυλοχολίνη αυγού (egg PC), το λιπιδικό παράγωγο του αιθέρα, διστεάρυλοφωσφατιδυλοαιθανολαμινη πολυαιθυλενογλυκόλη(dspe PEG) χοληστερόλη (CHOL) και Παρασκευάστηκαν με την μέθοδο του λεπτού υμενίου πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLVs) και με την χρήση υπέρηχων (probe sonicator) μικρά 9

10 μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUVs) και στη συνέχεια μελετήθηκε η σταθερότητα αυτών σε ορό αίματος χοίρου (FCS) Επίσης, προκειμένου να αποκτηθούν περισσότερες πληροφορίες για τα λιποσώματα που μελετήθηκαν, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός του μεγέθους καθώς και του ζ δυναμικού. Η μελέτη σταθερότητας των λιποσωμάτων που περιείχαν το λιπιδικό παράγωγο με τον αιθέρα στέμματος έδειξε ότι σε ποσοστά αντίστοιχα με αυτά του PEG ο αιθέρας στέμματος δεν προσδίδει μεγαλύτερη σταθερότητα. Θα μπορούσε να μελετηθεί μια σειρά λιποσωμάτων με μεγαλύτερο ποσοστό του λιπιδικού παραγώγου ούτως ώστε να αυξηθεί ο όγκος των υποκαταστατών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων και συνεπώς η παρεμπόδιση των αλληλεπιδράσεων. 10

11 Abstract Liposomes are one of the most common drug delivery systems. One of their main problems is their rapid clearance from the blood stream which was encountered by coating the surface with polymers and especially polyethylenoglyglycols (PEG). The coating of the surface with PEG increased the time of stay of liposomes in the blood stream but due to disadvantages, such as the phenomenon of increased clearance after the second dose as well as the existence of many patents, created the need for new forms of coating of the liposomes. The main purpose of this thesis was the synthesis of new lipidic derivatives from cyclodextrins and crown ethers as well as the formation of liposomes from these novel derivatives. The reason behind the choice of these chemical substances was that they are already being used in drug delivery as well as their chemical properties. In theory the existence of bulk substituents on the surface of liposomes causes stereochemical hindrance in interactions with substances in the body, which could cause the rapid clearance from the body, thereby increasing the time of stay in the blood stream. Initially lipid derivatives from DSPE (di stearylophosphatidylethanolamine) and 18 crown 6 ether and β cyclodextrin were synthesized but the purification of the cyclodextrin derivative was not made possible and thus liposomes were formed only from the crown ether lipid derivative. As starting material for the formation of liposomes was used egg phosphatidylcholine (egg PC), the crown ether lipid derivative, distearylophosphatidylethanolamine polyethyleneglycol (DSPE PEG) and cholesterol (CHOL). Multilamellar vesicles (MLVs) were prepared by the thin film method and with the use of ultrasounds (probe sonicator) small unilamellar vesicles (SUVs) were formed, and then their stability in fetal calf serum (FCS) was studied. In addition, in order to obtain more information about the liposomes that were formed, measurements were carried to determine their size as well as magnitude of the z potential. 11

12 The study on the stability of liposomes containing the lipid derivative with the crown ether showed that coating of the surface with the crown ether derivative in percentages equivalent to those of PEG does not confer greater stability on the contrary their stability is the same with conventional liposomes. Α study of liposomes with a higher proportion of the lipid derivative in order to increase the bulkiness of the substituents on the surface of the liposomes and thus preventing interactions resulting in the increase of the stability should be considered. 12

13 Εισαγωγή 13

14 Τα τελευταία χρόνια οι επιστήμονες του φαρμακευτικού τομέα επικεντρώνουν την προσοχή τους, εκτός από την ανακάλυψη νέων φαρμακομορίων, και στην φαρμακοτεχνική μορφή χορήγησης των βιοδραστικών ενώσεων. Πολλές προσπάθειες γίνονται, επίσης, για την στοχευμένη μεταφορά των βιοδραστικών ενώσεων στην περιοχή δράσης τους, μέσω φορέων για τους οποίους υπάρχουν εξειδικευμένοι υποδοχείς. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνονται μεγαλύτερες συγκεντρώσεις της βιοδραστικής ένωσης σε αυτές τις περιοχές και αποφεύγονται παρενέργειες ή οποιαδήποτε τοξικολογική επίδραση της βιοδραστικής ένωσης σε άλλες περιοχές του οργανισμού. Επιπρόσθετα, η θεραπευτική δράση της βιοδραστικής ένωσης είναι γρηγορότερη, ενώ η σταδιακή της απελευθέρωση μπορεί να τη προστατεύσει από αντίξοες συνθήκες στον οργανισμό (όπως ενζυματική υδρόλυση). Τα πιο διαδεδομένα συστήματα μεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων στις μέρες μας αποτελούν οι βιοδιασπώμενες μικροσφαίρες, βιοδραστικές ενώσεις συνδεδεμένες με πολυμερή καθώς και τα λιποσώματα που αποτελούν και το αντικείμενο της μελέτης μας. Γενική εισαγωγή στα λιποσώματα Τα λιπίδια, μαζί με τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊνικά οξέα, αποτελούν αναγκαία βιομόρια για τη δομή και τη λειτουργία της ζώσας ύλης. Τα περισσότερα λιπίδια είναι λίπη και κεριά, ωστόσο, αυτή η διατριβή εστιάζει στα αποκαλούμενα αμφίφιλα λιπίδια. Αυτός ο τύπος λιπιδίου είναι η κυρίαρχη δομική μονάδα των βιολογικών μεμβρανών, καθώς επίσης και των λιποσωμάτων. Τα λιποσώματα είναι σφαιρικές κλειστές δομές, που αποτελούνται από κυρτές στοιβάδες λιπιδίων, τα οποία εσωκλείουν μέρος του περιβάλλοντος διαλύτη στο εσωτερικό τους. Το μέγεθος ενός λιποσώματος κυμαίνεται από περίπου 20 nm μέχρι διάφορα μικρόμετρα και μπορούν να αποτελούνται από μια ή περισσότερες ομόκεντρες μεμβράνες, κάθε μια με ένα πάχος περίπου 4 nm. Τα λιποσώματα κατέχουν μοναδικές ιδιότητες εξ αιτίας του αμφίφιλου χαρακτήρα των λιπιδίων, τα οποία τα καθιστούν κατάλληλα για την παράδοση φαρμάκων. Μια σχηματική απεικόνιση ενός λιποσώματος παρουσιάζεται στο Σχήμα

15 Προκειμένου να γίνει κατανοητή η συμπεριφορά των λιποσωμάτων, μερικά γενικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα των αμφίφιλων και η συμπεριφορά τους στα διαλύματα ύδατος θα παρουσιαστούν κατωτέρω. Σχήμα 1.1 Σχηματική αντιπροσώπευση ενός λιποσώματος Göran Karlsson 1.1 Αμφίφιλα μόρια Τα αμφίφιλα μόρια βρίσκουν εφαρμογή σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων, τόσο διαφορετικά όσο τα απορρυπαντικά, τα χρώματα, το επίστρωμα εγγράφου, τα τρόφιμα και τα φαρμακευτικά προϊόντα. Είναι το ειδικό χαρακτηριστικό τους να συσσωματώνονται αυθόρμητα (δηλ. αυτό οργάνωση) σε ποικίλες δομές που τους επιτρέπουν να είναι χρήσιμα σε έναν μεγάλο αριθμό εφαρμογών Οργάνωση Ο λόγος για τον οποίο τα αμφίφιλα μόρια αυθόρμητα συσσωματώνονται, για να διαμορφώσουν μια ποικιλία από μικροδομές, οφείλεται στο ιδιαίτερο συνδυασμό των τμημάτων που φέρουν και συνδυάζουν ευελιξία, κατάλληλη διαμόρφωση αλλά και τμήματα με διαλυτότητες σε διαλύτες με μεγάλη διαφορά στη πολικότητα. Όλα τα αμφίφιλα αποτελούνται από ένα μέρος που είναι διαλυτό στους μη πολικούς διαλύτες, και ένα δεύτερο μέρος που είναι διαλυτό σε πολικούς. Έτσι, η διάλυση των ενώσεων αυτών είτε σε μη πολικούς διαλύτες είτε σε πολύ πολικούς διαλύτες, όπως το νερό, έχει ως συνέπεια την αυτοοργάνωση και 15

16 αυτοδόμηση των μορίων αυτών κατά τρόπο ώστε τα τμήματα τα μη διαλυτά στον αντίστοιχο διαλύτη να κρύβονται από το περιβάλλον του διαλύτη. Αυτό σημαίνει ότι οι διαλύτες που είναι είτε μη πολικοί, είτε πολύ πολικοί, όπως το νερό, προάγουν τη αυτό οργάνωση. Στις βιολογικές εφαρμογές, ο διαλύτης είναι νερό.. Στα περισσότερα αμφίφιλα, το υδροφοβικό μέρος αποτελείται από αλυσίδες υδρογονανθράκων, ενώ το υδρόφιλο μέρος αποτελείται από αυτό που ονομάζεται πολική κεφαλή. Στα υδατικά διαλύματα, τα αμφίφιλα μόρια διαλύονται ως μονομερή, καταρχάς, αλλά επάνω από μια ορισμένη συγκέντρωση, για να ελαχιστοποιήσουν τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, συσσωματώνονται αυθόρμητα. Αυτή η αυτόοργάνωση συνοδεύεται συνήθως από την αυξανόμενη εντροπία του συστήματος. Η αυξανόμενη εντροπία προέρχεται από τις αλληλεπιδράσεις νερούυδρογονανθράκων, που αναγκάζουν τα μόρια νερού σε μια διατεταγμένη δομή γύρω από το υδροφοβικό μέρος, όταν τα αμφίφιλα καταβυθίζονται ελεύθερα σαν μονομερή. Η απελευθέρωση των διατεταγμένων μορίων νερού μπορεί να επιτευχθεί με την οδήγηση των υδροφοβικών μερών εκτός του υδατικού διαλύματος και το διαχωρισμό τους μέσα στο εσωτερικό του συνόλου. Κατά συνέπεια, η αυξανόμενη εντροπία που κερδίζεται από τα μόρια νερού μπορεί να οδηγήσει σε ένα γενικό κέρδος στην ελεύθερη ενέργεια, έτσι ώστε η συσσωμάτωση να πραγματοποιείται αυθόρμητα. Πρέπει να αναφερθεί, εντούτοις, ότι υπάρχει ακόμα συζήτηση για την ύπαρξη τέτοιας τοπικά διατεταγμένης δομής νερού Δομή συσσωματωμάτων Η αυθόρμητη συσσωμάτωση οφείλεται, όχι μόνο στην προαναφερθείσα υδροφοβική συμβολή, αλλά συσχετίζεται επίσης με τις μοριακές ιδιότητες του αμφίφιλου. H αποκαλούμενη παράμετρος μέσου επιπολής [5], που λαμβάνει υπόψη παραμέτρους όπως ο υδροφοβικός όγκος, το μήκος αλυσίδων και το μέγεθος της περιοχής της πολικής κεφαλής, είναι ένας χρήσιμος οδηγός για την πρόβλεψη της βέλτιστης συνολικής δομής. Η αποτελεσματική περιοχή της πολικής περιοχής, εντούτοις, είναι δύσκολο να υπολογιστεί δεδομένου ότι μπορεί να 16

17 εξαρτηθεί έντονα από τους όρους τους διαλύματος. Η παράμετρος μέσου επιπολής, S, καθορίζεται από την εξίσωση: S = όπου u είναι ο όγκος του υδροφοβικού τμήματος του αμφίφιλου μορίου, l είναι το μήκος των αλυσίδων υδρογονανθράκων και a 0 είναι η αποτελεσματική περιοχή ανά πολικη κεφαλή. Αυτές οι παράμετροι περιέχουν τις πληροφορίες για τη γεωμετρική μορφή του μορίου και η παράμετρος μέσων επιπολής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να βρεθούν οι γεωμετρικοί περιορισμοί συσκευασίας και να περιοριστεί ο αριθμός διαθέσιμων μορφών στο σύνολο. Η αξία της παραμέτρου μέσων επιπολής συνδέει τις ιδιότητες του μορίου με τη μέση κυρτότητα των διαμορφωμένων συνόλων. Συμβατικά, η κυρτότητα ενός συνόλου είναι θετική εάν το σύνολο είναι κυρτό γύρω από το υδροφοβικό μέρος και αρνητικό εάν είναι κυρτό προς το πολικό μέρος. Οι πρώτες λέγεται, επίσης, ότι διαμορφώνουν κανονικά σύνολα και φάσεις, ενώ οι τελευταίες μορφές ανάστροφες. Παραδείγματος χάριν, οι μικρές τιμές του S υπονοούν τα ιδιαίτερα κυρτά σύνολα, μικκύλια, ενώ για S = 1 επίπεδες στοιβάδες διαμορφώνονται. Η σχέση μεταξύ της αξίας της παραμέτρου μέσων επιπολής και της βέλτιστης συνολικής δομής παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.2. Αν και η παράμετρος μέσων επιπολής μπορεί μόνο να θεωρηθεί ένα ακατέργαστο και κατά προσέγγιση πρότυπο για την πρόβλεψη της αναδιοργάνωσης, παρέχει την πολύτιμη διορατικότητα στο πώς οι αλλαγές της μοριακής δομής έχουν επιπτώσεις στη μορφή του διαμορφωμένου συνόλου. 17

18 Σχήμα 1.2 Η γεωμετρική έννοια συσκευασίας: η παράμετρος συσκευασίας των αμφίφιλων μορίων, των προτιμημένων συνολικών δομών και των αντίστοιχων φάσεων. Λ: micellar λύση, Χ: εξαγωνική φάση, Λ : πεταλώδης φάση. Οι υπογεγραμμένοι Ι και ΙΙ δείχνουν τις κανονικές και φάσεις, αντίστοιχα. 1.2 Διπλοστοιβάδες λιπιδίων Η διπλοστοιβάδα λιπιδίου είναι μια λεπτή μεμβράνη φτιαγμένη από δύο στρώματα μορίων λιπιδίου. Αυτές οι μεμβράνες είναι επίπεδα φύλλα που διαμορφώνουν ένα συνεχές φράγμα γύρω από τα κύτταρα. Η κυτταρική μεμβράνη σχεδόν όλων των ζώντων οργανισμών και πολλών ιών αποτελείται από διπλοστοιβάδα λιπιδίων, όπως επίσης και οι μεμβράνες που περιβάλλουν τους πυρήνες των κυττάρων και άλλες υπομοριακές δομές. Οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων είναι το φράγμα που συγκρατεί ιόντα, πρωτεΐνες και άλλα μόρια όπου απαιτείται 18

19 και τα αποτρέπουν από τη διάχυση στις περιοχές όπου δεν πρέπει να είναι. Οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων ταιριάζουν ιδανικά σε αυτόν τον ρόλο επειδή, ακόμα κι αν είναι μόνο μερικά νανόμετρα πυκνά, είναι αδιαπέραστες από τα περισσότερα υδατοδιαλυτά (υδρόφιλα) μόρια. Οι διπλοστοιβάδες είναι ιδιαίτερα αδιαπέραστες από τα ιόντα, κάτι το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να ρυθμίζουν τη συγκέντρωση και το ph με την άντληση των ιόντων στις μεμβράνες τους, χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες, τις αποκαλούμενες ιονικές αντλίες. Οι φυσικές διπλοστοιβάδες αποτελούνται συνήθως από φωσφολιπίδια, τα οποία έχουν μία υδρόφιλη κεφαλή και δύο υδρόφοβες ουρές. Όταν τα φωσφολιπίδια εκτίθενται στο νερό, διευθετούνται σε ενός ή δυο επιπέδων φύλλο (μία διπλοστοιβάδα) με όλες τις ουρές τους, δείχνοντας προς το κέντρο της στοιβάδας. Το κέντρο αυτής της διπλοστοιβάδας δεν περιέχει σχεδόν καθόλου ύδωρ και αποκλείει επίσης μόρια όπως σάκχαρα ή άλατα που διαλύονται στο νερό αλλά όχι σε οργανικούς διαλύτες. Αυτή η διαδικασία συσσωμάτωσης είναι παρόμοια με τη συγχώνευση των σταγονιδίων πετρελαίου στο νερό και οδηγείται από την ίδια δύναμη, την αποκαλούμενη υδροφοβική επίδραση. Επειδή οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων είναι αρκετά ευαίσθητες και είναι τόσο λεπτές που είναι αόρατες σε ένα κοινό μικροσκόπιο, η μελέτη τους αποτελεί πρόκληση. Τα πειράματα στις διπλοστοιβάδες απαιτούν συχνά προηγμένες τεχνικές, όπως η μικροσκόπια ηλεκτρονίων και η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων. Τα φωσφολιπίδια με ορισμένες κεφαλής ομάδες μπορούν να αλλάξουν τη χημεία επιφάνειας μιας διπλοστοιβάδας και μπορούν, παραδείγματος χάριν, να χαρακτηρίσουν ένα κύτταρο για καταστροφή από το ανοσοποιητικό σύστημα. Οι ουρές λιπιδίων μπορούν, επίσης, να έχουν επιπτώσεις στις ιδιότητες μεμβρανών, παραδείγματος χάριν με τον καθορισμό της φάσης της διπλοστοιβάδας. Οι βιολογικές μεμβράνες περιλαμβάνουν χαρακτηριστικά διάφορους τύπους λιπιδίων εκτός από τα φωσφολιπίδια. Ένα ιδιαίτερα σημαντικό παράδειγμα στα ζωικά κύτταρα είναι η χοληστερόλη, που βοηθά ενισχύοντας τη διπλοστοιβάδα και μειώνοντας τη διαπερατότητά της. Η χοληστερόλη βοηθά επίσης να ρυθμίσει τη δραστηριότητα ορισμένων πρωτεϊνών των μεμβρανών. Οι πρωτεΐνες μεμβρανών λειτουργούν όταν ενσωματώνονται σε μία λιπιδική διπλοστοιβάδα. Επειδή οι 19

20 διπλοστοιβάδες καθορίζουν τα όρια του κυττάρου και των διαμερισμάτων του, αυτές οι πρωτεΐνες μεμβρανών περιλαμβάνονται σε πολλές δια και μεσοκυττάριες κάνοντας διαδικασίες σηματοδότησης. Ορισμένα είδη πρωτεϊνών μεμβρανών περιλαμβάνονται στο στάδιο σύντηξης δύο διπλοστοιβάδων. Αυτή η σύντηξη επιτρέπει την ένωση δύο ευδιάκριτων δομών όπως την είσοδο ενός ιού σε ένα κύτταρο. Η κατηγορία λιπιδίων που θα εξεταστεί μέσα στην παρούσα εργασία είναι τα γλυκεροφωσφολιπίδια, συχνά αποκαλούμενα και φωσφολιπίδια Φωσφολιπίδια Τα φωσφολιπίδια είναι μια κατηγορία λιπιδίων και είναι ένα σημαντικό συστατικό σε όλες τις μεμβράνες κυττάρων καθώς μπορούν να διαμορφώσουν διπλοστοιβάδες λιπιδίων. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια περιέχουν ένα διγλυκερίδιο, μια ομάδα φωσφορικού άλατος, και ένα απλό οργανικό μόριο όπως χολίνη. Μια εξαίρεση σε αυτόν τον κανόνα αποτελεί η σφιγγομυελίνη, η οποία παράγεται από σφιγγοσίνη αντί γλυκερίνης. Το πρώτο φωσφολιπίδιο που προσδιορίστηκε υπό αυτήν τη μορφή στους βιολογικούς ιστούς ήταν λεκιθίνη, ή φωσφατιδυλοχολινη, στο λέκιθο αυγών, από τον Theodore Nicolas Gobley, έναν γάλλο φαρμακοποιό και χημικό, το

21 Σχήμα 1.3 Δομή φωσφολιπιδίου Οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων στα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια συνήθως περιέχουν έναν άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα, συνήθως μεταξύ 14 και 24. Πιο συχνά βρίσκουμε τα λιπαρά οξέα με 16 και 18 άτομα άνθρακα. Τα λιπαρά οξέα μπορεί να είναι ακόρεστα ή κορεσμένα. Το ισόμερες που ανευρίσκεται στα ακόρεστα λιπαρά είναι σχεδόν πάντα στη cis μορφή. Ένα κεκορεσμένο λιπαρό οξύ περιέχει μόνο απλούς δεσμούς ενώ τα ακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν διπλούς δεσμούς στην υδρογονανθρακική αλυσίδα τους. Οι διπλοί δεσμοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων χωρίζονται από μια τουλάχιστον μεθυλενική ομάδα. Η διαμόρφωση και ο αριθμός αυτών των διπλών δεσμών καθώς και το μήκος της αλυσίδας επιδρά στο σημείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της μεμβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είναι «μίγματα» επειδή τα λιπαρά οξέα που συνάπτονται στις θέσεις 1 και 2 του ίδιου μορίου συνήθως είναι διαφορετικά μεταξύ τους. Η αλυσίδα του λιπαρού οξέος στην εσωτερική θέση είναι ακόρεστη ενώ της εξωτερικής θέσης είναι κεκορεσμένη και μεγαλύτερου μήκους όσον αφορά τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. 21

22 Πίνακας 1.1 Κυτταρικά λιπαρά οξέα Κορεσμένο λιπαρό οξύ CH 3 (CH 2 ) 10 COOH CH 3 (CH 2 ) 12 COOH CH 3 (CH 2 ) 14 COOH CH 3 (CH 2 ) 16 COOH CH 3 (CH 2 ) 18 COOH CH 3 (CH 2 ) 22 COOH Ακόρεστο λιπαρό οξύ Χημική δομή CH 3 (CH 2 ) 5 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH CH 3 (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH CH 3 (CH 2 ) 4 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH CH 3 (CH 2 ) 4 (CH=CHCH 2 ) 3 CH=CH(CH 2 ) 3 COOH CH 3 CH 2 CH=CHCH 2 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH Ονομασία Λαουρικό Μυριστικό Παλμιτικό Στεαρικό Αραχιδικό Λινοσερικό Παλμιτολεϊκό Ολεϊκό Λινολεϊκό Αραχιδονικό Λινολενικό Αμφίφιλος χαρακτήρας Η κεφαλή ενός φωσφολιπιδίου είναι υδρόφιλη, ενώ οι υδροφοβικές "ουρές" αποφεύγουν το νερό. Η υδρόφιλη κεφαλή περιέχει την αρνητικά φορτισμένη ομάδα φωσφορικού άλατος, και μπορεί να περιέχει και άλλες πολικές ομάδες. Η υδρόφοβη ουρά αποτελείται συνήθως από μακριές αλυσίδες υδρογονανθράκων λιπαρού οξέος. Όταν τοποθετούνται στο νερό, τα φωσφολιπίδια διαμορφώνουν ποικίλες δομές ανάλογα με τις συγκεκριμένες ιδιότητες του φωσφολιπιδίου. Αυτές οι συγκεκριμένες ιδιότητες επιτρέπουν στα φωσφολιπίδια να διαδραματίσουν έναν σημαντικό ρόλο στην διπλοστοιβάδα φωσφολιπίδιων. Στα βιολογικά συστήματα, τα φωσφολιπίδια εμφανίζονται συχνά με άλλα μόρια (π.χ., πρωτεΐνες γλυκολιπίδια, χοληστερόλη) σε διπλοστοιβάδες όπως είναι οι κυτταρικές μεμβράνες λιπιδίου που εμφανίζονται όταν παρατάσσονται οι υδροφοβικές ουρές η μια ενάντια στην άλλη, διαμορφώνοντας μια μεμβράνη με τις υδρόφιλες κεφάλες και στις δύο πλευρές να κοιτούν το νερό. 22

23 Αυτός ο τύπος μεμβράνης είναι μερικώς διαπερατός, ικανός ελαστικής μετακίνησης, και έχει ρευστές ιδιότητες, στις οποίες οι ενσωματωμένες πρωτεΐνες (ακέραιες ή απομακρυσμένες πρωτεΐνες) και τα μόρια φωσφολιπιδίων είναι σε θέση να κινηθούν πλευρικά. Τέτοια μετακίνηση μπορεί να περιγραφεί από το ρευστό πρότυπο μωσαϊκών, που περιγράφει τη μεμβράνη ως μωσαϊκό των μορίων λιπιδίων που ενεργούν ως διαλύτης για όλες τις ουσίες και τις πρωτεΐνες μέσα σε αυτό, συνεπώς πρωτεΐνες και μόρια λιπιδίων είναι ελεύθερα να διαχυθούν πλευρικά μέσω της λιπιδικής δομής και να μεταναστεύσουν πέρα από τη μεμβράνη. Η χοληστερόλη συμβάλλει στη ρευστότητα μεμβρανών με το να εμποδίσει τη διευθέτηση των φωσφολιπιδίων. Εντούτοις, αυτό το πρότυπο έχει εκτοπιστεί τώρα, καθώς μέσω της μελέτης του πολυμορφισμού των λιπιδίων είναι τώρα γνωστό ότι η συμπεριφορά των λιπιδίων υπό φυσιολογικές (και άλλες) συνθήκες δεν είναι απλή Μεταβολές φάσης των στοιβάδων Μια από τις σημαντικότερες ιδιότητες της λιπιδικής διπλοστοιβάδας είναι η σχετική κινητικότητα (ρευστότητα) των μεμονωμένων μορίων λιπιδίων και πώς αυτή η κινητικότητα αλλάζει με τη θερμοκρασία. Αυτή η αντίδραση είναι γνωστή ως συμπεριφορά φάσης της διπλοστοιβάδας. Ευρέως, σε μια δεδομένη θερμοκρασία η διπλοστοιβάδα μπορεί να υπάρξει είτε σε μια υγρή είτε στερεά φάση. Η στερεά φάση αναφέρεται συνήθως ως φάση "πηκτωμάτων". Όλα τα λιπίδια έχουν μια χαρακτηριστική θερμοκρασία στην οποία κάνουν μια μετάβαση (λειώνουν) από το πήκτωμα στην υγρή φάση. Και στις δύο φάσεις τα μόρια λιπιδίων περιορίζονται στο δισδιάστατο επίπεδο της μεμβράνης, αλλά στην υγρή φάση τα μόρια είναι διάχυτα ελεύθερα μέσα σε αυτό το επίπεδο. Κατά συνέπεια, σε μία υγρή διπλοστοιβάδα ένα δεδομένο λιπίδιο θα ανταλλάξει γρήγορα θέσεις με τα γειτονικά εκατομμύρια φορές το δευτερόλεπτο και μέσω της διαδικασίας του random walk, μεταναστεύει σε μεγάλες αποστάσεις. 23

24 Εικόνα 1.4: Σχέση ανάμεσα στη φάση της μεμβράνης και τη θερμοκρασία Περιορισμός κινήσεων Σε αντίθεση με αυτήν την μεγάλη κινητικότητα στο επίπεδο, είναι πολύ δύσκολο για τα μόρια λιπιδίων να μετακινηθούν από μια πλευρά της διπλοστοιβάδας σε άλλη. Σε μια διπλοστοιβάδα φωσφατυδιλοχολινών αυτή η διαδικασία εμφανίζεται χαρακτηριστικά σε ένα χρονοδιάγραμμα εβδομάδων. Αυτή η απόκλιση μπορεί να γίνει κατανοητή λαμβάνοντας υπ όψιν την βασική δομή της διπλοστοιβάδας. Για να μετακινηθεί ένα λιπίδιο από τη μία πλευρά στην άλλη, η πολική κεφαλή πρέπει να διασχίσει τον υδροφοβικό πυρήνα της διπλοστοιβάδας, μια δυσμενής ενεργειακά διαδικασία. Αντίθετα από τις υγρής φάσης διπλοστοιβάδες, τα λιπίδια σε φάση πηκτώματος είναι κλειδωμένα σε μια θέση και δεν παρουσιάζουν ούτε μεταφορά από την μια στοιβάδα στην άλλη ούτε την πλευρική κινητικότητα. Λόγω αυτής της περιορισμένης κινητικότητας, οι διπλοστοιβάδες πηκτώματος στερούνται μια σημαντική ιδιότητα των υγρών bilayers διπλοστοιβάδων: τη δυνατότητα να ξανασφραγιστούν οι μικρές τρύπες. Οι 24

25 διπλοστοιβάδες υγρής φάσης μπορούν αυθόρμητα να θεραπεύσουν τα μικρά κενά, με τον ίδιο σχεδόν τρόπος που μια κηλίδα πετρελαίου στο ύδωρ θα μπορούσε να ρεύσει για να καλύψει ένα κενό. Αυτή η λειτουργία είναι ένας από τους λόγους που οι μεμβράνες κυττάρων αποτελούνται συνήθως από ρευστής φάσης διπλοστοιβάδες Φυσική προέλευση Η συμπεριφορά φάσης των λιπιδίων καθορίζεται κατά ένα μεγάλο μέρος από τις ελκτικές δυνάμεις Van der Waals, αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γειτονικών μορίων λιπιδίων. Η έκταση αυτής της αλληλεπίδρασης κυβερνάται στη συνέχεια από το πόσο μακριές είναι οι ουρές λιπιδίων και πόσο καλά μπορούν να διευθετηθούν. Τα λιπίδια με μακρύτερες ουρές έχουν μεγαλύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης, άρα μεγαλύτερες αλληλεπιδράσεις και μειωμένη συνεπώς κινητικότητα λιπιδίων. Κατά συνέπεια, σε μια δεδομένη θερμοκρασία, ένα λιπίδιο με μικρή ουρά θα είναι περισσότερο κινητικό από ένα κατά τα άλλα ίδιο με μακριά ουρά λιπίδιο. Ένας άλλος τρόπος να ειπωθεί αυτό θα ήταν ότι η θερμοκρασία μετάβασης φάσης αυξάνει με τον αυξανόμενο αριθμό ανθράκων στις αλυσίδες του λιπίδιου. Τα κορεσμένα λιπίδια φωσφατιδυλοχολινών με ουρές μακρύτερες από 14 άνθρακες είναι στερεά σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ εκείνα με λιγότερους από 14 είναι υγροί. Αυτό το φαινόμενο είναι ανάλογο με το γεγονός ότι το κερί παραφίνης, που αποτελείται από μακριά αλκάνια, είναι στερεό στη θερμοκρασία δωματίου, ενώ το οκτάνιο (βενζίνη), μικρής αλυσίδας αλκάνιο, είναι υγρό. Εκτός από το μήκος αλυσίδων, η θερμοκρασία μετάβασης μπορεί επίσης να επηρεαστεί από τον βαθμό ακορεστότητας των ουρών των λιπιδίων. Ένας ακόρεστος διπλός δεσμός μπορεί να παράγει μια συστροφή στην αλκυλική αλυσίδα, που αναστατώνει την κανονική περιοδική δομή. Αυτή η διάσπαση δημιουργεί πρόσθετο ελεύθερο διάστημα χώρο μέσα στην διπλοστοιβάδα που επιτρέπει την πρόσθετη ευελιξία στις παρακείμενες αλυσίδες. Είναι αυτή η διάσπαση του πακεταρίσματος που οδηγεί σε χαμηλότερες θερμοκρασίες μετάβασης με τους αυξανόμενους διπλούς δεσμούς. Αυτό έχει μια ιδιαίτερα ισχυρή 25

26 επίδραση αφού η μείωση του γενικού μήκους αλυσίδων κατά έναν άνθρακα αλλάζει συνήθως τη θερμοκρασία μετάβασης ενός λιπιδίου κατά 10 ο C ή λιγότερο, αλλά η προσθήκη ενός ενιαίου διπλού δεσμού μπορεί να μειώσει τη θερμοκρασία μετάβασης από 70 o C ή περισσότερο (βλ. τον Πίνακα1.2). Ένα παράδειγμα αυτής της επίδρασης μπορεί να βρεθεί στην καθημερινή ζωή όπως το βούτυρο, το οποίο έχει ένα μεγάλο ποσοστό από κορεσμένα λίπη, είναι στερεά στη θερμοκρασία δωματίου ενώ το φυτικό έλαιο, που είναι συνήθως ακόρεστο, είναι υγρό. Πίνακας 1.2 Θερμοκρασία μετάπτωσης (σε C) σε συνάρτηση του μήκους ουρών και κορεσμό. Όλα τα στοιχεία είναι για τα λιπίδια με PC και δύο ίδιες ουρές. Tail Length Double Bonds Transition Temperature

27 Σχήμα 1.5 Διάγραμμα που παρουσιάζει την επίδραση των ακόρεστων λιπιδίων σε μια διπλοστοιβάδα. Τα λιπίδια με μια ακόρεστη ουρά αναστατώνουν τη συσκευασία εκείνη με μόνο τις κορεσμένες ουρές. Η κατάληξη είναι η διπλοστοιβάδα να έχει περισσότερο ελεύθερο διάστημα και είναι συνεπώς πιο διαπερατή στο ύδωρ και άλλα μικρά μόρια Μεικτά συστήματα Οι διπλοστοιβάδες δεν χρειάζεται να αποτελούνται από έναν ενιαίο τύπο λιπιδίου και, στην πραγματικότητα, οι περισσότερες φυσικές μεμβράνες είναι ένα σύνθετο μίγμα διαφορετικών μορίων λιπιδίων. Τέτοια μίγματα εκθέτουν συχνά ενδιάμεσες ιδιότητες από τα συστατικά τους, αλλά είναι επίσης ικανά ενός φαινομένου που δεν φαίνεται στα ενιαία συστατικών συστήματα: τον διαχωρισμό φάσης. Εάν μερικά από τα συστατικά είναι υγρά σε μια δεδομένη θερμοκρασία ενώ άλλα είναι στη φάση πηκτώματος, οι δύο φάσεις μπορούν να συνυπάρξουν σε τοπικά διαχωρισμένους πληθυσμούς. Αυτός ο διαχωρισμός φάσης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στα βιοχημικά φαινόμενα επειδή συστατικά μεμβρανών όπως οι πρωτεΐνες μπορούν να χωριστούν στην μια ή στην άλλη φάση και να είναι έτσι τοπικά συγκεντρωμένη ή ενεργοποιημένη. 27

28 Χοληστερόλη Η παρουσία της χοληστερόλης ασκεί μια βαθιά αλλά περίπλοκη επιρροή στις ιδιότητες της λιπιδικής διπλοστοιβάδας λόγω των μοναδικών φυσικών χαρακτηριστικών της. Αν και είναι ένα λιπίδιο, η χοληστερόλη έχει ελάχιστες ομοιότητες με τα φωσφολιπίδια. Η υδρόφιλη περιοχή της χοληστερόλης είναι αρκετά μικρή, αποτελούμενη από μία ενιαία ομάδα αλκοόλης. Συνδεδεμένη σε αυτή την αλκοόλη είναι μια άκαμπτη επίπεδη δομή που αποτελείται από αρκετούς δακτυλίους. Στο αντίθετο άκρο της δομής των δακτυλίων υπάρχει μια μικρής αλυσίδας ουρά. Ήταν γνωστό για δεκαετίες ότι η προσθήκη της χοληστερόλης σε μια ρευστής φάσης διπλοστοιβάδα μειώνει τη διαπερατότητά της στο νερό. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι οφείλεται στην παρεμβολή χοληστερόλης μεταξύ των μορίων λιπιδίων, τη συμπλήρωση του ελεύθερου διαστήματος και τη μείωση της ευελιξίας των περιβαλλουσών αλυσίδων λιπιδίων. Αυτή η αλληλεπίδραση αυξάνει επίσης την μηχανική ακαμψία της ρευστής στοιβάδας και μειώνει τον πλευρικό συντελεστή διάχυσής τους. Αντίθετα, η προσθήκη της χοληστερόλης σε διπλοστοιβάδες φάσης πηκτώματος αναστατώνει την τοπική δομή διευθέτησης, αυξάνοντας τον συντελεστή διάχυσης του και μειώνοντας τον ελαστικό συντελεστή. Οι αλληλεπιδράσεις της χοληστερόλης με τα πολλών συστατικών συστήματα είναι ακόμα πιο περίπλοκες, δεδομένου ότι αυτές μπορούν να οδηγήσουν σε περίπλοκα διαγράμματα φάσης. Ένα σύστημα λιπίδιοχοληστερόλης που έχει μελετηθεί πρόσφατα με προσήλωση είναι τα lipid rafts. Τα lipid rafts είναι περιοχές πηκτωμάτων εμπλουτισμένες με χοληστερόλη που εμπλέκονται ενδεχομένως σε ορισμένες διαδικασίες κυτταρικών σημάτων, αλλά το θέμα παραμένει αμφισβητούμενο, με μερικούς ερευνητές που αμφιβάλλουν ακόμη και για την ύπαρξή τους in vivo. 28

29 Σχήμα 1.5 Η χημική δομή της χοληστερόλης, η οποία διαφέρει πολύ από ένα τυπικό φωσφολιπίδιο. 1.3 Σχηματισμός λιποσωμάτων Πολλοί πιθανοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για το σχηματισμό των λιποσωμάτων, και μερικοί από αυτούς είναι πιο σύνθετοι από άλλους. Μια προσέγγιση είναι να θεωρηθεί η αυθόρμητη μετατροπή μιας διπλοστοιβάδας σε ένα λιπόσωμα ένας ανταγωνισμός μεταξύ δύο αποτελεσμάτων, της ενέργειας κάμψης ή κυρτότητας και της ενέργειας ακρών μιας διπλοστοιβάδας. Για μια επίπεδη στοιβάδα, σε υδρόφιλο περιβάλλον, θα υπάρξει μια υψηλή ένταση επιφάνειας στο πλαίσιο της στοιβάδας. Η κάμψη μπορεί να μειώσει αυτήν την ενέργεια ακρών αλλά η κάμψη υπονοεί επίσης ένα ενεργειακό μειονέκτημα λόγω της προκληθείσης κυρτότητας. Για να ελαχιστοποιήσει περαιτέρω την ενέργεια άκρων, μια υψηλότερη κυρτότητα απαιτείται και τελικά μια κλειστή σφαίρα θα διαμορφωθεί, όπου η ενέργεια άκρων μειώνεται σε μηδέν. Η ενέργεια κάμψης, αφ' ετέρου, έχει φθάσει τώρα στο μέγιστό της και η περισσευούμενη ελεύθερη ενέργεια ανά λιπόσωμα, ανεξάρτητα από την ακτίνα, είναι 8 Λ Κ, όπου το 29

30 Κ είναι ο παράγοντας ακαμψίας. Κατά συνέπεια, τα μεγαλύτερα λιποσώματα ευνοούνται ενεργειακά, ενώ η εντροπία θα ευνοούσε πολλά μικρά. Εντούτοις, τα λιποσώματα είναι συνήθως σταθερά λόγω υψηλού ενεργειακού κόστους του σχηματισμού πόρων. Αυτό σημαίνει ότι ένα πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα απαιτείται προτού να καταρρεύσουν σε μια στοιβαδιακή φάση. 1.4 Λιποσώματα ως μεταφορείς βιοδραστικών ουσιών Η δυνατότητα εφαρμογής των βιοδραστικών ουσιών είναι πάντα ένας συμβιβασμός μεταξύ της θεραπευτικής δράσης τους και των παρενεργειών τους. Τα λιποσωμικά συστήματα παράδοσης βιοδραστικών ουσιών όχι μόνο επιτρέπουν την παράδοση υψηλότερων συγκεντρώσεων βιοδραστικών ουσιών, αλλά και μια πιθανή στόχευση των συγκεκριμένων κυττάρων ή των οργάνων. Οι επιβλαβείς παρενέργειες μπορούν επομένως να μειωθούν εξαιτίας της ελαχιστοποιημένης διανομής της βιοδραστικής ουσίας στους μη στοχευμένους ιστούς. Όπως όλα τα άλλα συστήματα μεταφορέων, η χρήση των λιποσωμάτων στην παράδοση βιοδραστικών ουσιών έχει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Ο αμφίφιλος χαρακτήρας των λιποσωμάτων, με την υδροφοβική διπλοστοιβάδα και τον υδρόφιλο εσωτερικό πυρήνα, επιτρέπει την διαλυτοποίηση ή την ενθυλάκωση και των υδροφοβικών και υδρόφιλων βιοδραστικών ουσιών. Μαζί με την καλή διαλυτική τους δύναμη, μια σχετικά εύκολη προετοιμασία και μια πλούσια επιλογή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων έχουν κάνει τα λιποσώματα τα ελκυστικά συστήματα μεταφορέων βιοδραστικών ουσιών. Εντούτοις, ένας πλήρης κορεσμός του ανοσοποιητικού συστήματος και οι αλληλεπιδράσεις με τις λιποπρωτεΐνες είναι μερικά παραδείγματα ενδεχομένως τοξικών και δυσμενών αποτελεσμάτων. Αποδοτικά συστήματα παράδοσης βιοδραστικών ουσιών βασισμένα στα λιποσώματα πρέπει να κατέχουν έναν μεγάλο αριθμό ειδικών ιδιοτήτων. Κατ' αρχάς, η καλή κολλοειδής, χημική και βιολογική σταθερότητα απαιτείται. Το 30

31 γεγονός ότι τα λιποσώματα είναι δομές μη ισορροπίας απαραιτήτως δεν σημαίνει ότι είναι ακατάλληλα για την παράδοση βιοδραστικών ουσιών. Αντίθετα, μια κολλοειδής σταθερή δομή μη ισορροπίας είναι λιγότερο ευαίσθητη στις εξωτερικές αλλαγές από ισορροπημένες δομές, όπως τα μικκύλια. Ως εκ τούτου, κολλοειδώς σταθερά λιποσωμάτα λειτουργούν συχνά καλά στις φαρμακευτικές εφαρμογές. Η βιολογική σταθερότητα περιλαμβάνει τον έλεγχο του ποσοστού εκκαθάρισης των λιποσωμάτων από το κυκλοφοριακό σύστημα ή τα διαμερίσματα του σώματος, εάν η βιοδραστική ουσία έχει χορηγηθεί τοπικά. Το ποσοστό εκκαθάρισης είναι ανάλογο της δόσης και ποικίλλει ανάλογα με το μέγεθος και το επιφανειακό φορτίο των λιποσωμάτων. Οι πρώτες μελέτες που χρησιμοποιούν τα συμβατικά λιποσώματα αποκάλυψαν ότι η εκκαθάριση ήταν πάρα πολύ γρήγορη για μια αποτελεσματική σε ζώντα οργανισμό παράδοση βιοδραστικών ουσιών. Εντούτοις, χρόνοι κυκλοφορίας που ήταν αρκετά μεγάλοι επιτεύχθηκαν με την ανάπτυξη των αποκαλούμενων sterically σταθεροποιημένων λιποσωμάτων. Σχήμα 1.6 Απεικόνιση λιποσώματος για μεταφορά φαρμάκων Επιπλέον, η βιολογική σταθερότητα περιλαμβάνει επίσης τη διατήρηση της βιοδραστικής ουσίας από το μεταφορέα καθοδόν στον προορισμό της (ένα 31

32 φαινόμενο γνωστό ως συνεχής απελευθέρωση). Παραδείγματος χάριν, οι πρωτεΐνες αίματος βρέθηκε ότι αφαιρούν τα μόρια φωσφολιπιδίων γρήγορα από την διπλοστοιβάδα, κάτι που οδηγεί σε μια διάσπαση των λιποσωμάτων και ως εκ τούτου απώλεια βιοδραστικών ουσιών προτού να φθάσουν οι μεταφορείς στον στοχευμένο προορισμό τους. Σε αντίθεση με μια συνεχή απελευθέρωση, τα λιποσώματα πρέπει επίσης να είναι σε θέση να απελευθερώσουν το εγκλωβισμένο φάρμακο και πρέπει επίσης να στοχεύσουν κατά προτίμηση. Επιπλέον, είναι σημαντικό η βιοδραστικη ουσία να μπορεί να το εγκλωβίσει κατά τέτοιο τρόπο ώστε η ποσότητα που απαιτείται για μια αποδοτική θεραπεία να επιτυγχάνεται. 1.5 Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος MLV(πολυστοιβαδιακα λιποσώματα) >0,5μm OLV(ολιγοστοιβαδιακά λιποσώματα) 0,1 1 μm UV(μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) ανεξάρτητα μεγέθους MVV(πολυδιαμερισματικά λιποσώματα) >1μm GUV(γιγαντιαία μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) >1μm LUV(μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) >100nm SUV(μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) nm 32

33 MLVs Multilamellar vesicles (μεγάλα πολυστοιβαδιακά σωματίδια) Τα MLV λιποσώματα αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό παράλληλων, ομόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωμάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Φάρμακα, καθώς και άλλες διαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στα υδατικά μεσοδιαστήματα ανάμεσα στις μεμβράνες, ενώ τα υδρόφοβα τμήματά τους ή υδρόφοβα φάρμακα μπορούν να διαλυτοποιηθούν στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας. Τα λιποσώματα αυτά έχουν μεγάλες και ετερογενείς διαμέτρους (1 10μm), χαμηλή ικανότητα εγκλωβισμού όγκου ανά μόριο λιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαμερίσματα. Η απόσταση μεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάμεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάμεων άπωσης. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη χρήση τους ως φορείς βιοδραστικών ουσιών και μεμβρανικά μοντέλα αρκετά πολύπλοκη. Σχήμα 1.7: Σχηματική απεικόνιση πολυστοιβαδιακού λιποσώματος σε διατομή και μεγέθυνση των περιοχών του. 33

34 LUVs & ΙUVs Large unilamellar vesicles & Intermediate unilamellar vesicles (Μεγάλα & μεσαίου μεγέθους μονοστοιβαδιακά σωματίδια) Τα λιποσώματα αυτά έχουν διάμετρο της τάξης των 1000nm και είναι μονοστοιβαδιακά. Τα λιποσώματα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισμό υδατοδιαλυτών υλικών, αν και η παρουσία μιας μόνο λιπιδικής μεμβράνης έχει ως συνέπεια μικρότερη μηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση με τα MLVs. Ωστόσο, αυτός ο τύπος λιποσωμάτων κρίνεται αρκετά κατάλληλος για την ενεργή φόρτωση ιονιζόμενων μορίων. SUVs Small unilamellar vesicles (Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) Τα SUV λιποσώματα αποτελούνται μόνο από μια διπλοστοιβάδα και έχουν διάμετρο nm. Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο μπορεί να σχηματίσει λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύματος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των μεμβρανών. Πρόκειται για θερμοδυναμικά ασταθή λιποσώματα που είναι επιρρεπή σε συσσωμάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης. 34

35 Σχήμα 1.8 Διατομή ενός μονοστοιβαδιακού λιποσώματος. Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στον υδατικό πυρήνα (περιοχή 1) ή να συνδεθούν στην εξωτερική επιφάνεια (περιοχή 3). Τα υδροφοβικά μόρια μπορούν να εγκλωβιστούν στη διπλοστοιβάδα (περιοχή 2). Στα φθορίζοντα λιποσώματα, οι φθορίζουσες ενώσεις είναι εγκλωβισμένες στο εσωτερικό και συνδεδεμένες στην επιφάνεια του λιποσώματος. (σήμανση F) Με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Το λιποσωμικό σύστημα μεταφοράς βιοδραστικών ουσιών διαθέτει ένα μεγάλο πλεονέκτημα έναντι άλλων κολλοειδών συστημάτων μεταφοράς: Επιτρέπει σχεδόν άπειρες πιθανότητες μεταβολής των δομικών και φυσικοχημικών χαρακτηριστικών. Αυτό το χαρακτηριστικό της ευελιξίας επιτρέπει στους επιστήμονες να τροποποιούν την in vivo συμπεριφορά των λιποσωμάτων και να σχεδιάζουν τις διάφορες λιποσωμικές μορφές ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεση και την επιθυμητή in vivo εφαρμογή, τα λιποσώματα διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες (σχ.1.9) 35

36 Σχήμα 1.9 Σχηματική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωμάτων: Συμβατικά (Conventional) λιποσώματα, Στερεοχημικά σταθεροποιημένα (Stealth) λιποσώματα, Στοχευμένα (Targeted), Κατιονικά (Cationic) λιποσώματα. Συμβατικά λιποσώματα (Conventional liposomes): Αυτά μπορούν να οριστούν ως λιποσώματα που αποτελούνται μόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισμένα) ή/και χοληστερόλη. Πρόκειται για την πλέον χρησιμοποιούμενη κατηγορία λιποσωμάτων στη μεταφορά βιοδραστικών ουσιών. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, όπως το μέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθμό και ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστoιβάδων. Τα συμβατικά λιποσώματα χαρακτηρίζονται από σχετικά μικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα. Όταν χορηγούνται in vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν την τάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του μονοπυρηνικού συστήματος φαγοκυττάρων, γνωστό επίσης και ως δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (RES). Tα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. Το γεγονός αυτό έχει αποτελέσει στόχο για διάθεση βιοδραστικών ουσιών μέσω λιποσωμάτων σε μολυσμένα μακροφάγα. Επιπλέον, τα συμβατικά 36

37 λιποσώματα έχουν χρησιμοποιηθεί για μεταφορά αντιγόνων. Λιποσωμικά εμβόλια έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών μολύνσεων καθώς επίσης και εναντίον όγκων. Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or sterically stabilized): Η ανάπτυξή τους αποτέλεσε ορόσημο στην έρευνα των λιποσωμικών συστημάτων μεταφοράς και αναζωπύρωσε το ενδιαφέρον γύρω από την έρευνα περί λιποσωμάτων. Στην πραγματικότητα, τα λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας άνοιξαν νέους δρόμους σε θεραπευτικές δυνατότητες που μέχρι τότε θεωρούνταν ανέφικτες για τα συμβατικά λιποσώματα. Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα να βγαίνουν εκτός κυκλοφορίας σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος είναι αυξημένη. Αυτό συμπίπτει με το γεγονός ότι οι περιοχές αυξημένης τριχοειδικής διαπερατότητας περιλαμβάνουν παθολογικές περιοχές, όπως στέρεους όγκους και περιοχές μολύνσεως και φλεγμονής. Προς το παρόν, ο πιο δημοφιλής τρόπος παραγωγής τέτοιων λιποσωμάτων είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) στην εξωτερική επιφάνεια. Σχήμα 1.10 Απεικόνιση stealth λιποσωμάτων Αυτά τα λιποσώματα λέγονται επίσης stealth ή στερεοχημικώς σταθεροποιημένα. Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητά τους να διαφεύγουν των μακροφάγων και ο δεύτερος στο μηχανισμό στερεοχημικής σταθεροποίησής τους, που είναι υπεύθυνος για την αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας. Το τελευταίο 37

38 οφείλεται σε φραγμό που δημιουργείται και αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις με μόρια και κυτταρικά συστατικά του βιολογικού περιβάλλοντος, κυρίως πρωτεΐνες. Ενσωμάτωση των PEGs στη λιποσωμική μεμβράνη Παρά τις αρκετές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη σύζευξη του PEG σε λιπίδια (Zalipsky S., 1995), οι περισσότερες από αυτές περιλαμβάνουν σύνδεση του PEG στη δραστική αμινομάδα της φωσφατίδυλοαιθανολαμίνης (PE). Στο εμπόριο είναι διαθέσιμα πολλά προϊόντα από διάφορες πηγές, όπως για παράδειγμα η διστεαροϋλο φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη συζευγμένη σε πολυαιθυλενογλυκόλη (DSPE PEG) μέσω ενός πεπτιδικού δεσμού. Οι φυσικές ιδιότητες των PEG lipids είναι παρόμοιες με αυτές των επιφανειοδραστικών ενώσεων. Μελέτες με PE PEG δείχνουν ότι μπορεί να σχηματίσει μικκύλια δίνοντας διαυγή διαλύματα στο νερό και ότι μπορεί να αποσταθεροποιήσει το σχηματισμό των διπλοστοιβάδων, όταν προστίθεται σε υψηλό ποσοστό σε σχέση με τα άλλα λιπίδια (Lasic D.D. et al., 1991). Τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα με PEG παρασκευάζονται είτε με προσθήκη του PEG lipid στο μείγμα πριν το σχηματισμό λιποσωμάτων, είτε με σύζευξη του PEG σε ήδη σχηματισμένα λιποσώματα (Woodle et al, 1992). Προσάρτηση των PEG στην επιφάνεια των προπαρασκευασμένων λιποσωμάτων Ένα παράγωγο PEG με ενεργό άκρο μπορεί να συζευχθεί με ορισμένες ενεργές ομάδες στη λιποσωμική επιφάνεια όμως η maleimide ομάδα. Αυτή η τεχνική συνήθως ονομάζεται post coating PEGylation τεχνική και είναι κατάλληλη για την προσκόλληση PEG στη επιφάνεια προπαρασκευασμένων ανοσολιποσωμάτων. Σ αυτή την περίπτωση οι αλυσίδες του πολυμερούς βρίσκονται μόνο στην εξωτερική πλευρά των λιποσωμάτων. 38

39 Διαμόρφωση στερεοχημικά σταθεροποιημένων λιποσωμάτων Ανάλογα με τη συγκέντρωση επικάλυψης και το μοριακό βάρος του PEG, τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα μπορούν να έχουν διαφορετικές διαμορφώσεις, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.11 (Hristova K. Et al., 1995). Καθοριστικός παράγοντας για τη διαμόρφωσή τους είναι η απόσταση ανάμεσα στις αλυσίδες του πολυμερούς επάνω στη λιποσωμική διπλοστοιβάδα. Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph: Αποτελούνται από φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE), διολεϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη(dope). Σε χαμηλό ph ενώνονται με τη κυτταρική μεμβράνη του ενδοσώματος και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 1.11). Είναι κατάλληλα για ενδοκυτταρική μεταφορά ασθενών βάσεων και μακρομορίων. Η βιοκατανομή και η φαρμακοκινητική τους είναι ανάλογη με αυτή των συμβατικών λιποσωμάτων. Σχήμα 1.11 Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph 39

40 Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes): Διαθέτουν ειδικά αντισώματα ή κλάσματα αντισωμάτων (Fab ή αντισώματα μονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους προκειμένου να ενισχύσουν τη στοχευμένη πρόσδεση. Αν και έχουν εξεταστεί για πληθώρα θεραπευτικών εφαρμογών, η εστίαση έχει γίνει στη μεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως και άλλα σωματίδια στην κυκλοφορία του αίματος, είναι δύσκολο στα ανοσολιποσώματα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαμερίσματα πλην του ήπατος και του σπλήνα. Γι αυτό, προκειμένου να εξασφαλιστεί προσιτότητα των υποδοχέων, επιχειρείται τοπική χορήγηση των λιποσωμάτων στις σωματικές κοιλότητες Σχήμα 1.12:.Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένου λιποσώματος. Τα stealth λιποσώματα εγκλωβίζουν το φάρμακο (1) σε μια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα (2).Η PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώματα να αποφεύγουν το ανοσοποιητικό σύστημα αυξάνοντας το χρόνο ημιζωής του φαρμάκου στο σώμα. Κατιονικά λιποσώματα (Cationic liposomes): Αυτά εκπροσωπούν σχετικά νέα μέλη της οικογένειας των λιποσωμάτων. Βρίσκονται στην πρώτη γραμμή ως συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού. Τα 40

41 κατιονικά λιπιδικά συστατικά τους αλληλεπιδρούν με και εξουδετερώνουν το αρνητικά φορτισμένο DNA, συμπυκνώνοντας έτσι το DNA σε μια πιο συμπαγή δομή. Τα σύμπλοκα λιπιδίου DNA παρέχουν προστασία και επάγουν την κυτταρική εσωτερίκευση και έκφραση του συμπυκνωμένου πλασμιδίου. Σχήμα 1.13 Κατιονικά λιποσώματα Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic liposomes): Τα λιποσώματα αυτά μπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυτταρική μεταφορά εγκλωβισμένων βιοδραστικών ουσιών μέσω σύντηξης με τη μεμβράνη των κυττάρων στόχων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι παρασκευής τους μεταξύ των οποίων είναι η χρήση λιπιδίων (όπως το DOPE) που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας και να προκαλούν φαινόμενα σύντηξης. Επίσης, πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη μπορούν να ενσωματωθούν σε λιποσώματα. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας 41

42 σύντηξης των λιποσωμάτων μπορεί να εφαρμοστεί προκειμένου να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα των λιποσωμικών συστημάτων μεταφοράς γενετικού υλικού. Γενικά, το μέγεθος, η ακαμψία των διπλοστοιβάδων, το φορτίο και οι τροποποιήσεις της επιφάνειας της διπλοστοιβάδας αποτελούν παραμέτρους που καθορίζουν την τύχη των λιποσωμάτων κατά την αποθήκευση και in vivo. 1.6 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Multilamellar λιποσώματα (MLV) Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηματισμό λεπτού υμενίου (film) κατά την εξάτμιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουμένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να απομακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χημικά αποικοδόμηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηματίζεται το λεπτό υμένιο, εκτίθεται σε ρεύμα αζώτου για πέντε λεπτά. Η ενυδάτωση (hydration) του υμενίου που ακολουθεί πραγματοποιείται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα ή με διάλυμα της προς εγκλωβισμό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτμισης των διαλυτών, πραγματοποιούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες της θερμοκρασίας μετάβασης φάσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυμα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερμανθεί σε αυτή τη θερμοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με μηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υμένιο αποκολλάται από τα τοιχώματά της, οπότε λαμβάνεται μία θολερή διασπορά με πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους MLV. Η μείωση του μεγέθους των MLV λιποσωμάτων και η δημιουργία ομογενούς σε αναφορά με το μέγεθος πληθυσμού, 42