Καθαρισμός των ενζύμων

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ Ενότητα γ Καθαρισμός των ενζύμων ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

2 Καθαρισμός των ενζύμων Εύρεση πρωτοκόλλου «κατιούσας επεξεργασίας» (downstream processing) Βέλτιστος καθαρισμός ενζύμων Συνεκτιμώνται: Ιδιότητες ενζύμου Μέγεθος, ισοηλεκτρικό σημείο, υδροφοβικότητα, διαλυτότητα, γλυκοζυλίωση, συγγένεια έναντι υποστρωμάτων και βιομορίων, εξάρτηση από μεταλλοϊόντα, θερμοευασθησία, οξειδοαναγωγική ευαισθησία Προσμίξεις Βιολογική πηγή: μικροοργανισμός, φυτό, ζωικός ιστός/όργανο, ιστοκαλλιέργεια Θέση στο κύτταρο: ενδοκυττάριο/εξωκυττάριο Είδος προσμίξεων: νουκλεϊνικά οξέα, μεμβράνες, ιζήματα συσσωματωμάτων, άλλες πρωτεΐνες, πρωτεάσες, πολυφαινόλες, λιποπολυσακχαρίδια (LPS) Aπλότητα: μείωση των σταδίων καθαρισμού Οικονομία

3 Καθαρισμός των ενζύμων Δυνατότητα εφαρμογής καθαρισμού σε βιομηχανική κλίμακα Ταχύτητα: αποφυγή χρονοβόρων τεχνικών Δυνατότητα παρακολούθησης καθαρισμού Τελικό αποτέλεσμα

4 Καθαρισμός των ενζύμων Ιδιότητα ενζύμου Μέγεθος/μάζα Ιονισμός/πολικότητα Διαλυτότητα Χημική Συγγένεια Τεχνική καθαρισμού Φυγοκέντρηση, διαπίδυση, χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους Χρωματογραφίες: ιοντοαλλαγής, υδρόφοβη ανάστροφης φάσης. Ηλεκτροφόρηση, ισοηλεκτρική εστίαση Κατακρήμνιση: ph, ιοντική ισχύς Χρωματογραφία συγγένειας, Ηλεκτροφόρηση, κατακρήμνιση συγγένειας

5 Α. Αρχικό στάδιο: Διαχωρισμός στερεών από υγρή φάση που εμπεριέχει το ένζυμο Β. Στάδιο χαμηλού καθαρισμού: Τεχνικά καλύτερη κατάσταση για το επόμενο στάδιο Γ. Συμπύκνωση, χονδροειδής καθαρισμός Γ. Στάδιο υψηλού καθαρισμού: με χρωματογραφικές τεχνικές Δ. Στάδιο μορφοποιήσεως: Τελικος καθαρισμός, συμπύκνωση αποθήκευση

6 Ρύθμιση πειραματικών παραγόντων καθαρισμού Α. Αρχικό στάδιο: Διαχωρισμός στερεών από υγρή φάση που εμπεριέχει το ένζυμο Διάρρηξη κυττάρων Μη μηχανικές τεχνικές Ωσμοτικό σοκ, θερμικό, κατάψυξη-τήξη, ΝaΟΗ, γουανιδίνιο, ΕDΤΑ, Triton X-100, οργανικοί διαλύτες (χλωροφόρμιο, αιθέρας), λυσοζύμη. Μηχανικές τεχνικές Δονητής υπερήχων, θρυμματισμός με σφαιρίδια, υψηλή πίεση σε ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα Ιοντική ισχύς ( mm) Θερμοκρασία (4-6 ºC) ph 6-8 Mεταλλοϊόντα: ναι ή όχι; Πρωτεάσες: προσθήκη αναστολέων Πολυφαινόλες (φυτά): προσθήκη πολυαμιδίου πολυβινυλοπυρρολιδόνης (PVP) Οξειδωτικοί παράγοντες: αναγωγή (δισουλφίδια, πολυφαινόλες);

7 Ρύθμιση πειραματικών παραγόντων καθαρισμού Α. Αρχικό στάδιο: Διαχωρισμός στερεών από υγρή φάση που εμπεριέχει το ένζυμο Διαχωρισμός υγρών-στερεών Φυγοκέντριση Διήθηση, υπερδιήθηση

8

9 Ρύθμιση πειραματικών παραγόντων καθαρισμού Β. Στάδιο χαμηλού καθαρισμού: Συμπύκνωση, χονδροειδής καθαρισμός Τεχνικά καλύτερη κατάσταση για το επόμενο στάδιο Γ Απομάκρυνση νουκλεϊνικών οξέων Κατακρήμνιση: πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπρομυκίνη Απομάκρυνση πρωτεϊνών Κατακρήμνιση με άλατα (εξαλάτωση) με οργανικούς διαλύτες: logs = logs 0 -K /D 2 s θερμική μετουσίωση Κατανομή σε υδατικά διφασικά διαλύματα (χρήση δεξτράνης και πολυαιθυλενο γλυκόλης)

10 Κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο

11 Ρύθμιση πειραματικών παραγόντων καθαρισμού Γ. Στάδιο υψηλού καθαρισμού με χρωματογραφικές τεχνικές Χρωματογραφία: ιοντοαλλαγής υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων ανάστροφης φάσης συγγένειας αποκλεισμού μεγέθους

12 Συνδεσμολογία σύγχρονων συσκευών χρωματογραφίας

13 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Αρχή: αναστρεπτή δέσμευση του φορτισμένου ενζύμου σε αντίθετα φορτισμένη στήλη. Το δεσμευμένο ένζυμο μπορεί να εκλουστεί μετά από προσθήκη καταλλήλου ιόντος

14 Αλλαγή φορτίου πρωτεϊνης ανάλογα με το ph του διαλύματος Άρα σε κατάλληλο ph μια πρωτεΐνη μπορεί να δεσμευτεί σε φορτισμένη ομάδα

15 Χαρακτηριστικά στήλης χρωματογραφίας Μορφολογία στήλης Στερεά φάση (αλληλεπίδραση, μέγιστη διάχυση) Υγρά φάση Ροή Έκλουση δείγματος (ομοιομορφία)

16 Προσθήκη δείγματος

17 Έκλουση δείγματος

19 Μορφολογία σωματιδίων στερεάς φάσης Σεφαρόζη Πολυστυρένιο (Source, MonoBeads)

20 Μέγεθος και σύσταση σωματιδίων στερεάς φάσης

21 Φορτισμένες ομάδες ιοντοανταλλακτών

22 «ισχυροί» και «ασθενείς» ιοντοανταλλάκτες Η ορολογία αναφέρεται στην κατάσταση ιονισμού της φορτισμένης ομάδας και όχι στην ισχύ δέσμευσης πάνω στη στήλη

23 «ισχυροί» ιοντοανταλλάκτες + - Καμπύλες τιτλοδότησης ισχυρών ιοντοανταλλακτών Το φορτίο τους διατηρείται σταθερό σε μεγάλο εύρος ph

24 «ασθενείς» ιοντοανταλλάκτες Καμπύλες τιτλοδότησης ασθενών ιοντοανταλλακτών Το φορτίο τους διατηρείται σταθερό σε στενό εύρος ph

25 Χαρακτηριστικά έκλουσης δείγματος-βελτιστοποίηση ph Τύπος και «ισχύς» ιοντοανταλλάκτη Κλίση ιοντικής ισχύος (συγκέντρωση άλλατος) Τύπος άλλατος

26 ph Καμπύλες μεταβολής συνολικού φορτίου ανάλογα με το ph του διαλύματος Οι περισσότερες πρωτεΐνες έχουν pi μεταξύ 5,5 και 7,5

28 Έκλουση πρωτεϊνικού δείγματος από κατιοντοανταλλάκτη (-) ανιοντοανταλάκτη (+)

29 Eπίδραση του pη στο διαχωρισμό των εκλουόμενων κορυφών Ο διαχωρισμός βελτιστοποιείται όταν το pη του διαλύματος είναι κοντά στο pι της εκλουόμενης πρωτεΐνης

30 Eπίδραση του pη στο διαχωρισμό των εκλουόμενων κορυφών Ο διαχωρισμός βελτιστοποιείται όταν το pη του διαλύματος είναι κοντά στο pι της εκλουόμενης πρωτεΐνης

31 Επίδραση τύπου και «ισχύος» ιοντοανταλλάκτη στο διαχωρισμό Παράδειγμα έκλουσης ιδίου δείγματος σε διαφορετικές στήλες

32 Επίδραση κλίσης ιοντικής ισχύος στο διαχωρισμό

33 Παράδειγμα έκλουσης με διαφορετικές σταδιακές κλίσεις άλατος

34 Παράδειγμα έκλουσης με διαφορετικές ισοκρατικές συγκεντρώσεις άλατος

35 Επίδραση όγκου έκλουσης στο διαχωρισμό

36 Επίδραση ανταγωνιστικού ιόντος στο διαχωρισμό

37 Μέγεθος σωματιδίων στερεάς φάσης και χαρακτηριστικά έκλουσης

38 Βελτιστοποίηση μεθόδου: λίγες προσμίξεις, μικρός όγκος Παράδειγμα έκλουσης με διαφορετικές σταδιακές κλίσεις άλατος

39 Βελτιστοποίηση μεθόδου: λίγες προσμίξεις, μικρός όγκος Παράδειγμα έκλουσης με διαφορετικές ισοκρατικές συγκεντρώσεις άλατος

40 Χρωματογραφία υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων Hydrophobic region Αρχή: αναστρεπτή δέσμευση υδροφοβικών περιοχών του ενζύμου σε ακινητοποιημένες υδροφοβικές ομάδες. Η παρουσία άλατος αυξάνει τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις απομακρύνοντας διατεταγμένα μόρια νερού από τις υδρόφοβες περιοχές του ενζύμου.

41 Το νερό έχει πολικό χαρακτήρα και προσανατολίζεται ανάλογα γύρω από τα ένζυμα

42 Αρχή μεθόδου

43 Περιγραφή Μεθόδου Στο δείγμα προστίθεται άλας, ακολουθεί φυγοκεντρηση το υπερκείμενο προστίθεται στη στήλη κάτω από υψηλή συγκέντρωση άλατος. Έκλουση Το δείγμα εκλούεται με μια κλίση συγκέντρωσης όπου η συγκέντρωση άλατος σταδιακά ελαττώνεται. Οι υδρόφιλες πρωτεΐνες εκλούονται νωρίτερα (ψηλότερη συγκέντρωση άλατος) και οι πλέον υδρόφοβες στην χαμηλότερη συγκέντρωση άλατος

44 Προσθήκη δείγματος

45 Έκλουση δείγματος μετά από ελλάτωση συγκεντρώσεως άλατος

46 Έκλουση δείγματος μετά από ελλάτωση συγκεντρώσεως άλατος

47 Χρωματογραφία υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων Οι πλέον υδρόφιλες πρωτεΐνες εκλούονται πρώτες καθώς η συγκέντρωση άλατος ελαττώνεται

48 Ομάδες στερεάς φάσης

49 Μέγεθος σωματιδίων στερεάς φάσεως και χαρακτηρηστικά έκλουσης

50 Επίδραση σύστασης φάσεως άλατος στην έκλουση

51 Επίδραση φάσεως άνευ άλατος στην έκλουση

52 Ισοκρατική έκλουση

53 Χρωματογραφία ανάστροφης φάσης Αρχή: αναστρεπτή δέσμευση υδροφοβικών περιοχών του ενζύμου σε ακινητοποιημένες υδροφοβικές ομάδες. Η απομάκρυνση του ενζύμου γίνεται μετά από διέλευση οργανικού διαλύτη

54 Χρωματογραφία ανάστροφης φάσης-τεχνική υψηλής ανάλυσης

55 Αρχή μεθόδου: δέσμευση υδροφοβικών ομάδων ενζύμου σε υδρόφοβες ομάδες της στήλης, έκλουση με αυξανόμενη συγκέντρωση οργανικού διαλύτη

56 Εφαρμογή δείγματος

57 Έκλουση μετά από αύξηση συγκεντρώσεως οργανικού διαλύτη

58 Έκλουση μετά από αύξηση συγκεντρώσεως οργανικού διαλύτη

59 Υδρόφοβες ομάδες στερεάς φάσης Ενίσχυση υδροφοβικότητας δείγματος με σύζευξη ιόντων

60 Επίδραση ιόντος σύζευξης στην ανάλυση των εκλουομένων πρωτεϊνών

61 Επίδραση υδατικής φάσης στην ανάλυση των εκλουομένων πρωτεϊνών

62 Τύποι οργανικής φάσης στην χρωματογραφία ανάστροφης φάσης

63 Επίδραση οργανικής φάσης στην ανάλυση των εκλουομένων πρωτεϊνών

64 Τυπικό χρωματογράφημα της μεθόδου

65 Η χρωματογραφία ανάστροφης φάσης μπορεί να συνδιαστεί με επακόλουθο προσδιορισμό μάζης

66 Συνδεσμολογία

67 Χρωματογραφία συγγένειας: αρχή

68 Χρωματογραφία συγγένειας Ομάδες συγγένειας δεσμευμένες με στερεή φάση με επόξυ, αλδεύδικούς η αρυλ εστέρες Μεταλλοχηλική χρωματογραφία Ni 2+ /Zn 2+ /Co 2+ δεσμευμένα σε ιμινοδιοξικό οξύ

69

70

71 Παραδείγματα και εφαρμογές

72 Καθαρισμός και απομάκρυνση πρωτεασών σερίνης (θρομβίνη, τρυψίνη, ζυμογόνα)

73

74 Πρωτεάσες σερίνης και ζυμογόνα με συγγένεια προς αργινίνη

75 Χρήση ακινητοποιημένης ηπαρίνης για απομόνωση πρωτεϊνών που δεσμεύονται στο DNA ή είναι παράγοντες πήξης του αίματος

76

77 Xρήση ακινητοποιημένης στρεπταβιδίνης για δέσμευση βιοτινιλυωμένων αντισωμάτων για δέσμευση αντιγόνου

78 Γενετική ένθεση απολήξεων αναγνωρίσεως στο ενζυμικό μόριο Απομόνωση μετά από συνένωση/συνέκφραση με άλλη πρωτεϊνη Το παράδειγμα της GST S-μεταφοράσης

79 Πλασμίδιο υπερέκφρασης

80 Στερεή φάση με γλουταθειόνη

81 Expression/purification of the ALF C-terminal 107 aa polypeptides (ALF IV) in E coli High yield and high solubility after cleavage of GST-tag ALF IV 107 MW= kda GST-ALF IV 30.0 GST Fraction# Fraction (2 ml)#

82 Μεταλλοχηλική χρωματογραφία

83 Μεταλλοχηλική χρωματογραφία Απομάκρυνση δεσμευμένης πρωτεΐνης ισοκρατικά ή με κλίση Αρχή:

84 Μεταλλοχηλική χρωματογραφία

85 Μεταλλοχηλική χρωματογραφία Επίδραση αλληλεπιδρώντος μετάλλου

86 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης

87 Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης Ve

88 Ve1 Ve2 Ve3

89 Χαρακτηριστικά έκλουσης: Kav Ve V 0 Vt Vi όγκος έκλουσης κάθε πρωτεϊνης που εισέρχεται στα κοκκία της στήλης νεκρός όγκος μεταξύ μικροσφαιριδίων συνολικός όγκος της στήλης όγκος των κοκκίων της στήλης (όγκος στερεάς φάσης) Kd συντελεστής που προσδιορίζει την κατανομή ενζύμου μεταξύ κινητής και στατικής φάσης Ve = Vo + Kd Vi Ve = Vo + Kav (Vt-Vo) Kav = Ve Vo Vt - Vo Kav: αναλογία πόρων προσιτών στο μόριο με Ve

90 Επίδραση στερεάς φάσης στην ανάλυση

91 Επιλογή στερεάς φάσης

92 Eπίδραση ιξώδους στο διαχωρισμό

93 Eπίδραση αρχικού όγκου στο διαχωρισμό

94 Eπίδραση ταχύτητας έκλουσης στο διαχωρισμό

95 Eπίδραση αναγωγικών ουσιών στο διαχωρισμό

96 Χρήση χρωματογραφίας μοριακής διήθησης για αλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος

97 Σύγκριση χρωματογραφίας μοριακής διήθησης και ανάστροφης φάσης στην αφαίρεση άλλατος

98 Περίληψη χρωματογραφικών τεχνικών

99 Ρύθμιση πειραματικών παραγόντων καθαρισμού Δ. Στάδιο μορφοποιήσεως Χρωματογραφική τεχνική που δίνει καθαρό ένζυμο σε επιθυμητό ρυθμιστικό Ακολουθούν: συμπύκνωση κατακρήμνηση σε θειικό αμμώνιο προσθήκη γλυκερόλης, σταθεροποιητών λυοφιλίωση Περαιτέρω καθαρισμός; (LPS, χρωματογραφία συγγένειας με πολυμυξίνη Β) Αποθήκευση

100 Ενδοτοξίνες (LPS)

101 Β1 Πολυμυξίνη Β Β2

102 Παράδειγμα: Καθαρισμός γλουταρεδοξίνης 2 από Escherichia coli

103

104

105

106 ΤΕΛΟΣ