ΠΡΟΣΤΠΟ ΠΕΛΡΑΜΑΣΛΚΟ ΛΤΚΕΛΟ ΠΑΝΕΠΛΣΘΜΛΟΤ ΠΑΣΡΩΝ ΚΕΜΑΣΛΚΘ ΕΝΟΣΘΣΑ: Σεχνολογία Αναςυνδιαςμζνου DNA_Κλωνοποίθςθ

Transcript

1 ΚΕΜΑΣΛΚΘ ΕΝΟΣΘΣΑ: Σεχνολογία Αναςυνδιαςμζνου DNA_Κλωνοποίθςθ Ερωτήςεισ για προβληματιςμό: Τπάρχει τρόποσ να απομονϊςετε π.χ. δφο γονίδια, να τα ζχετε ξεχωριςτά το ζνα από το άλλο χρθςιμοποιϊντασ βιοχθμικζσ μεκόδουσ; ε ποιεσ διαφορετικζσ ιδιότθτεσ μπορείτε να βαςιςτείτε ϊςτε να τα ξεχωρίςετε; Θ ΑΠΑΝΣΘΘ δόκθκε με τθν τεχνικι τθσ Κ σ ΔΡΑΣΘΡΛΟΣΘΣΑ 1 Κόψιμο του DNA ΒΘΜΑ 1. ασ δίνεται θ ακόλουκθ αλλθλουχία δίκλωνου DNA που περιζχει δφο γονίδια των οποίων θ κζςθ είναι ςτθ γραμμοςκιαςμζνθ περιοχι GGTACTACATGTATGTTTACTCATCTACGAATTCAATATATGCGGGAAAGATTCTGAAAGAA 3 CCATGATGTACATACAAATGAGTAGATGCTTAAGTTATATACGCCCTTTCTAAGACTTTCTT TTCAATCATACATAGGTAGTACATGTATGTTTACTCATCTACGAATTCAATAAAAGCGGGGAATTCG 3 AAGTTAGTATGTATCCATCATGTACATACAAATGAGTAGATGCTTAAGTTATTTTCGCCCCTTAAGC 5 ΒΘΜΑ 2. Τποκζςτε ότι υπάρχει θ δυνατότθτα να κόψω το DNA με ζνα μοριακό ψαλίδι το οποίο κόβει με ειδικό τρόπο το δίκλωνο DNA δθλαδι όπου υπάρχει θ αλλθλουχία 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Παρατθριςτε τθν Εικόνα με προςοχι ΕΡΩΣΘΘ Σι δεςμοφσ κόβει το Μοριακό Ψαλίδι; BHMA 3. τθν πιο πάνω αλλθλουχία ΨΑΞΣΕ να βρείτε τθν αλλθλουχία 5 GAATTC..3 και γράψτε τα τμιματα που κα προκφψουν μετά το κόψιμο ςτθν κατάλλθλθ κζςθ 1 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

2 ΟΔΘΓΛΕ Να αφιςετε λίγο κενό μεταξφ των γραμμικϊν τμθμάτων Ζςτω ότι προζκυψαν τμιματα δίκλωνου DNA Παρατθριςτε τα άκρα των τμθμάτων που ςχεδιάςατε και γράψτε τισ παρατθριςεισ ςασ Ερωτήςεισ για προβληματιςμό: Κα μποροφςατε να φτιάξετε εςείσ ζνα τζτοιο μοριακό ψαλίδι ι μιπωσ ζχει προνοιςει θ φφςθ γιϋ αυτό; Η ΑΠΑΝΤΗΣΗ δόκθκε από τα βακτιρια που ζχουν ςυγκεκριμζνα ζνηυμα τισ Περιοριςτικζσ Ενδονουκλεάςεσ (Π.Ε.) (restriction enzymes) Για πιο λόγο να φζρουν τα βακτιρια αυτζσ τισ πρωτεΐνεσ (ζνηυμα); Η ΑΠΑΝΤΗΣΗ είναι ότι τα ζνηυμα αυτά είναι κατά κάποιο τρόπο το ΑΝΟΟΠΟΛΘΣΛΚΟ ΤΣΘΜΑ των βακτθρίων ενάντια ςτθν ειςβολι από φάγουσ Και πϊσ αυτά τα ζνηυμα δεν κόβουν το DNA του ίδιου του βακτθρίου; Η ΑΠΑΝΤΗΣΗ είναι ότι τα ίδια τα βακτιρια τροποποιοφν τισ αλλθλουχίεσ αναγνϊριςθσ για τισ Π.Ε. που τα ίδια φζρουν ϊςτε να μθν μποροφν να κοποφν από αυτζσ. 2 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

3 ΔΡΑΣΘΡΛΟΣΘΣΑ 2 φνδεςθ τμθμάτων DNA που ζχουν κολλϊδθ άκρα (sticky ends) ΒΘΜΑ 1. Πθγαίνετε ςτθν ιςτοςελίδα προχωριςτε κάτω τθν ςελίδα μζχρι τθν εικόνα Ξεκινιςτε πατϊντασ το (BEGIN) ΟΔΘΓΛΕ <ςελ 2/7> υπάρχουν δφο DNA ενόσ πλαςμιδίου και ενόσ φάγου ΠΑΡΑΣΘΡΘΣΕ τισ διαφορζσ ςτο μζγεκοσ (ηεφγθ βάςεων) <ςελ 3/7> Θ Περ.Ενδ. που αναγνωρίηει τθν αλλθλουχία 5 GAATTC 3 ονομάηεται EcoRI και κόβει ςε όςα ςθμεία βρίςκεται αυτι θ αλλθλουχία μεταξφ 5 G AATTC.3 <ςελ 4/7> Αν δεν αναμείξουμε αυτά τα τμιματα DNA ΠΑΡΑΣΘΡΘΣΕ τι κα ςυμβεί <ςελ 5/7> Σϊρα αναμειγνφονται τα τμιματα του πλαςμιδίου και φάγου που ζχουν προκφψει από τθ δράςθ τθσ EcoRI Αυτό που προκφπτει ονομάηεται ΑΝΑΤΝΔΛΑΜΕΝΟ DNA το γιατί ονομάζεται έτσι; κα το καταλάβετε απαντϊντασ ςτθν ερϊτθςθ τθσ <ςελ 6/7> ΕΔΩ τοποκετιςτε το δείκτθ ςε κάκε επιλογι για να βρείτε πιο μόριο είναι το ΑΝΑΤΝΔΛΑΜΕΝΟ και γράψτε τον οριςμό ΕΡΩΣΘΘ Πϊσ ονομάηεται το ζνηυμο που μπορεί να δθμιουργεί 3ϋ- 5ϋφωςφοδιεςτερικοφσ δεςμοφσ μεταξφ τμθμάτων DNA και να τα ενϊνει; Τπάρχει λόγοσ να προςκζτουμε in vitro αυτό το ζνηυμο και γιατί; 3 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

4 ΔΡΑΣΘΡΛΟΣΘΣΑ 3 Φορείσ κλωνοποίθςθσ Ασ κυμθκοφμε τι περιέχει ζνα πλαςμίδιο και που υπάρχουν πλαςμίδια ςτθ φφςθ Περιζχουν 1. Περιοχι που αναγνωρίηεται ωσ κζςθ ζναρξθσ τθσ αντιγραφισ 2. Γονίδιο που όταν εκφραςτεί παράγει μια πρωτεΐνθ που προςδίδει ανκεκτικότθτα ςε κάποιο αντιβιοτικό Τπάρχουν τα βακτιρια κακϊσ τουσ είναι απαραίτθτα ςτο διαρκι πόλεμο με τουσ μφκθτεσ Ζςτω ότι ζχω κόψει ςε πολλά τμιματα DNA από το ανκρϊπινο γονιδίωμα (μζγεκοσ 3x 10 9 η.β.) Ο ςκοπόσ μασ δεν είναι να κολλιςουν αυτά ξανά μεταξφ τουσ αλλά να κολλιςουν ςε ζνα μόριο το οποίο μπορεί να αντιγραφεί ανεξάρτθτα μζςα ςε ζνα κφτταρο. Ερώτηςη Τπάρχει κάποιο τζτοιο μόριο που μπορεί να αντιγράφεται ανεξάρτθτα και ςτο οποίο να κολλιςω τμιμα από το ανκρϊπινο γονιδίωμα; Απάντηςη ΝΑΛ το πλαςμίδιο το οποίο τροποποιϊ in vitro ζτςι ϊςτε να περιζχει μια περιοχι με πολλζσ διαφορετικζσ αλλθλουχίεσ αναγνϊριςθσ για τισ Π.Ε. 4 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

5 ΘΜΕΛΩΘ ασ δίνεται ζνασ πίνακασ με οριςμζνεσ περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ, με τισ αλλθλουχίεσ αναγνϊριςισ τουσ και τον τρόπο που κόβουν τθν κατάλλθλθ αλλθλουχία ςτο δίκλωνο DNA. ΕΦΑΡΜΟΓΘ Α) Σοποκετιςτε τισ εικόνεσ ςτθ ςειρά ζτςι ϊςτε να παρουςιάηονται τα βιματα για το ςχθματιςμό Αναςυνδιαςμζνου DNA EIKONA 1 EIKONA 2 EIKONA 3 EIKONA 4 Βιμα 1 Βιμα 2 Βιμα 3 Βιμα 4 Β) Σι ζχει προθγθκεί ϊςτε να προκφψει το τμιμα Χ Γ) Ποια είναι θ αναγκαία προχπόκεςθ για καταλιξουμε ςτο ΒΘΜΑ 4; ΔΡΑΣΘΡΛΟΣΘΣΑ 4 Επιλογι Κατάλλθλθσ Περιοριςτικισ Ενδονουκλεάςθσ Προβληματιςμόσ Ποια Περιοριςτικι Ενδονουκλεάςθ πρζπει να χρθςιμοποιθκεί για το ςχθματιςμό αναςυνδιαςμζνου πλαςμιδίου με κάποιο γονίδιο άλλου οργανιςμοφ; 5 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

6 ΒΘΜΑ 1. Πθγαίνετε ςτθν ιςτοςελίδα Και προχωριςτε ςτθ ςελίδα Πρζπει να κόψετε το γονίδιο από το DNA ενόσ οργανιςμοφ και να το ειςάγεται ςε φορζαπλαςμίδιο Σασ δίνονται 4 Περιοριςτικζσ Ενδονουκλεάςεσ. Πατϊντασ με το δείκτθ ςε κάκε ζνηυμο φαίνεται ποια αλλθλουχία αναγνωρίηει το κάκε ζνηυμο και πϊσ τθν κόβει. Προχωριςτε και εκτελζςτε τθ δραςτθριότθτα αφοφ επιλζξετε το κατάλλθλο ζνηυμο. ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ: Γράψτε ποια ιταν τα κριτιρια που χρθςιμοποιιςατε για να δθμιουργιςετε το ςυγκεκριμζνο αναςυνδιαςμζνο DNA ΔΡΑΣΘΡΛΟΣΘΣΑ 5 Μεταςχθματιςμόσ και επιλογι κλϊνων με τα μεταςχθματιςμζνα βακτιρια Ερώτηςη Με ποιο τρόπο κα δθμιουργιςουμε κλϊνουσ αυτϊν των αναςυνδιαςμζνων πλαςμιδίων; Ι με άλλα λόγια πϊσ κα εξαςφαλίςουμε ςυνκικεσ ϊςτε να αντιγραφοφν τα πλαςμίδια-φορείσ Απάντηςη 1. Ειςάγοντασ τα πλαςμίδια μζςα ςε βακτθριακά κφτταρα ξενιςτζσ αλλά κάτω από τισ κατάλλθλεσ ςυνκικεσ Παρακολουκιςτε τθ διαδικαςία μζςα από τθν ιςτοςελίδα 6 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

7 Αυτι θ διαδικαςία που παρακολουκιςατε αφορά αυτό που λζμε τα βακτιρια γίνονται παροδικά διαπερατά ςε μακρομόρια φμφωνα με τθ διαδικαςία που παρακολουκιςατε ςχεδιάςτε τουσ πικανοφσ πλθκυςμοφσ βακτθριακϊν κυττάρων που ζχουν δθμιουργθκεί μεταςχθματιςμζνων ι μθ μεταςχθματιςμζνων ι ότι άλλο εςείσ πιςτεφετε ότι ζχει ςυμβεί 2. Αναπτφςςοντασ τα βακτιρια μεταςχηματιςμζνα ή μη ςε κατάλλθλο κρεπτικό υλικό χολιάςτε τθ φράςθ κατάλλθλο κρεπτικό υλικό (ασ κυμθκοφμε αν ζχουμε αξιοποιιςει τθν ιδιότθτα που ζχουν τα πλαςμίδια να φζρουν γονίδια που τουσ προςδίδουν ανκεκτικότθτα ςε αντιβιοτικά) ( ασ προςζξουμε τθν εικόνα 5) Ποια βακτιρια δεν κα αναπτυχκοφν ςε ζνα κρεπτικό υλικό που περιζχει το αντιβιοτικό αμπικιλίνθ και τα οποία ζχουν μεταςχθματιςτεί με τα πλαςμίδια τθσ Εικόνασ 5; ε τι μασ ζχει εξυπθρετιςει θ ικανότθτα των πλαςμιδίων να αντιγράφονται ανεξάρτθτα μζςα ςτο βακτιριο ξενιςτι; 7 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

8 ΤΝΟΨΛΗΟΝΣΑ Αν κζλουμε να μελετιςουμε κάποιο γονίδιο δθλαδι να το απομονϊςουμε από το ςυνολικό γονιδίωμα ενόσ οργανιςμοφ αρκεί να φτιάξουμε ΑΝΑΤΝΔΛΑΜΕΝΟ DNA που φζρει αυτό το γονίδιο με το οποίο ςτθ ςυνζχεια ΜΕΣΑΧΘΜΑΣΛΗΟΤΜΕ βακτιρια-ξενιςτζσ. Θ επιλογι των μεταςχθματιςμζνων βακτθρίων βαςίηεται ςτθν παρουςία ςτο κρεπτικό υλικό ανάπτυξθσ, αντιβιοτικοφ για το οποίο είναι αρχικά ευαίςκθτο το βακτιριο αλλά αποκτά ανκεκτικότθτα χάρθ ςτθν ιδιότθτα του πλαςμιδίου. Θ τελικι εικόνα είναι ζνα ςφνολο κλϊνων που κάποιοι από αυτοφσ φζρουν το επικυμθτό γονίδιο 8 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ

9 Θ επιλογι του κλϊνου που φζρει το επικυμθτό γονίδιο είναι κζμα επόμενθσ παρουςίαςθσ Πίνακασ με διάφορεσ Περιοριςτικζσ Ενδονουκλεάςεσ Πόςα τμιματα μπορεί να προκφψουν ςτο γονιδίωμα π.χ. του ανκρϊπου μετά τθ δράςθ μιασ Περιοριςτικισ Ενδονουκλεάςθσ; Αν χρθςιμοποιιςετε τθν EcoRI που αναγνωρίηει τθν αλλθλουχία 6 βάςεων 5 GAATTC 3 Αυτό ςθμαίνει ότι 4 6 είναι θ πικανότθτα να βρεκεί αυτι θ αλλθλουχία ςτο γονιδίωμα δθλαδι 1 φορά ςε κάκε 4096 βάςεισ. 9 Κατερίνα Καλόςακα, Βιολόγοσ