ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΙΔΙΚΟΣ ΛΟΓΑΡΙΑΣΜΟΣ ΚΟΝΔΥΛΙΩΝ ΕΡΕΥΝΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΚΑΡΑΘΕΟΔΩΡΗ 2010 ΕΚΤΕΝΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΟΥ ΕΡΓΟΥ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΙΔΙΚΟΣ ΛΟΓΑΡΙΑΣΜΟΣ ΚΟΝΔΥΛΙΩΝ ΕΡΕΥΝΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΚΑΡΑΘΕΟΔΩΡΗ 2010 ΕΚΤΕΝΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΟΥ ΕΡΓΟΥ Κωδικός Έργου: Α. ΤΙΤΛΟΣ: ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΤΟΞΙΚΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΣΤΡΑΓΓΙΣΜΑΤΩΝ ΑΠΟ ΧΥΤΑ ΣΕ ΥΔΡΟΒΙΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΕΝΔΕΙΚΤΩΝ ΚΑΙ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ. Β. ΣΤΟΧΟΣ: Το προτεινόμενο έργο στοχεύει στη μελέτη της σύστασης των στραγγισμάτων από χώρους υγειονομικής ταφής απορριμμάτων (ΧΥΤΑ), καθώς και των πιθανών βιολογικών επιπτώσεων μιας τυχαίας ή εκ προμελέτης εναπόθεσης/διαρροής του σε υδάτινα οικοσυστήματα. Με την ολοκλήρωση του προτεινόμενου έργου θα προκύψουν δεδομένα για την τοξικότητα των ρυπογόνων ουσιών που περιέχονται στα στραγγίσματα, ενώ η μελέτη των επιπτώσεων του στραγγίσματος σε οργανισμούς-βιοενδείκτες, πιθανό να αποτελέσει αρωγός για τις αρχές, στην προσπάθεια λήψης κατάλληλων μέτρων για τη σωστή διαχείριση των απορριμμάτων, με κύριο γνώμονα τόσο τη Δημόσια Υγεία, όσο και την προστασία των υδάτινων πόρων. Ειδικότερα, επι μέρους στόχοι του προτεινόμενου ερευνητικού έργου αποτελούν: Ο ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός των φυσικοχημικών παραμέτρων των στραγγισμάτων. Ο έλεγχος τοξικότητας του στραγγίσματος σε οργανισμούς-βιοενδείκτες (μακροασπόνδυλα με τη μορφή μικροβιοτέστ Artoxkit M για παράκτια και αλμυρά νερά και Thamnotoxkit F TM για γλυκά νερά. Η μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων του στραγγίσματος σε ιστούς και απομονωμένα κύτταρα (αιμοκύτταρα της αιμολέμφου) του μυδιού-βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis (Lmk), με τη χρήση Βιομαρτύρων. Η πιθανή συσχέτιση των διαφόρων ρυπογόνων ουσιών που περιέχονται στο στράγγισμα με τις επιπτώσεις που προκαλούνται και αναλύονται με τη χρήση Βιομαρτύρων στον οργανισμό- Βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis. Γ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ: Τα τελευταία χρόνια, γίνεται μια προσπάθεια δημιουργίας χώρων υγειονομικής ταφής απορριμμάτων (ΧΥΤΑ) σε περιοχές κατάλληλα διαμορφωμένες, έτσι ώστε να επιτευχθεί η αποτελεσματική εναπόθεση απορριμμάτων, με την ελάχιστη περιβαλλοντική επιβάρυνση. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τη δημιουργία των ΧΥΤΑ είναι η διαφυγή αποβλήτων στο περιβάλλον, μέσω της διαλυτοποίησής τους σε ρέοντα ύδατα. Υδάτινες εκροές, πλούσιες σε ρυπογόνες ουσίες καλούνται στραγγίσματα και δημιουργούνται με την επαφή του νερού με τα απόβλητα. Με δεδομένο ότι τα στραγγίσματα περιλαμβάνουν μεγάλο αριθμό μεταλλικών στοιχείων, οργανικής ύλης και άλλων ρυπογόνων ουσιών, στόχος του προτεινόμενου έργου είναι η μελέτη των επιπτώσεων των στραγγισμάτων σε υδρόβιους οργανισμούς, τόσο του γλυκού νερού, όσο και των παράκτιων περιοχών. Συγκεκριμένα, θα πραγματοποιηθούν μελέτες τοξικότητας με τη χρήση οργανισμών- Βιοενδεικτών, όπως τα ανόστρακα καρκινοειδή Thamnocephalus platyurus και Artemia franciscana, με τη μορφή των μικροβιοτέστ, καθώς και μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων του στραγγίσματος με τη χρήση βιοχημικών, ιστοχημικών και/ή μοριακών παραμέτρων που ονομάζονται Βιομάρτυρες στο Δίθυρο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis που αποτελεί οργανισμό- Βιοενδείκτη σε μελέτης εκτίμησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Η μελέτη Βιομαρτύρων, σε συνδυασμό με τη γνώση της φυσιολογίας του εκάστοτε οργανισμού και του οικοσυστήματός του, αποτελούν μια ικανοποιητική μέθοδο εκτίμησης των επιπτώσεων των διαφόρων ρυπογόνων ουσιών στους οργανισμούς και ταυτόχρονα προσφέρουν και μια σαφή εικόνα της κατάστασης του περιβάλλοντος. 1

2 Δ. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ (μέχρι 10 σελίδες) 1. Σημερινή γνώση στο θέμα: Τα τελευταία χρόνια, γίνεται μια προσπάθεια δημιουργίας χώρων υγειονομικής ταφής απορριμμάτων (ΧΥΤΑ) σε περιοχές κατάλληλα διαμορφωμένες (αδιαπέραστα πετρώματα, χρησιμοποίηση στεγανωτικών υλικών, για την αποφυγή διαρροών των στραγγισμάτων στο περιβάλλον/ Νομοθεσία για ΧΥΤΑ: οδηγία της ΕΕ για την υγειονομική ταφή 99/31/ΕΚ και ΚΥΑ 29407/3508/2002, η οποία συμπληρώνει της παλαιότερη ΚΥΑ /1997, για την κατάρτιση πλαισίου προδιαγραφών και γενικών προγραμμάτων διαχείρισης στερεών αποβλήτων), έτσι ώστε να επιτυγχάνεται η αποτελεσματική εναπόθεση των απορριμμάτων/αποβλήτων, με την ελάχιστη περιβαλλοντική επιβάρυνση. Προς αυτή την κατεύθυνση κινούνται είδη οι Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής και οι χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, εκτός από τις περιπτώσεις στις οποίες τα υλικά είναι εντελώς αδρανή. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τη δημιουργία των ΧΥΤΑ είναι η διαφυγή των αποβλήτων στο περιβάλλον, μέσω της διαλυτοποίησής τους σε ρέοντα ύδατα. Υδάτινες εκροές, πλούσιες σε ρυπογόνες ουσίες καλούνται στράγγισμα και δημιουργούνται μετά την επαφή του νερού με τα απόβλητα [1]. Η σύνθεση των στραγγισμάτων εξαρτάται τόσο από την ηλικία του ΧΥΤΑ όσο και τον τύπο των απορριμμάτων που δέχεται [2]. Η εκχύλιση/διήθηση του νερού διαμέσου των απορριμμάτων συμβάλλει στην διαδικασία της αποικοδόμησής τους, με τη διαμεσολάβηση βακτηρίων και μυκήτων, μια διαδικασία που απαιτεί αυξημένη κατανάλωση οξυγόνου, με αποτέλεσμα πολύ γρήγορα να δημιουργούνται ανοξικές συνθήκες. Επιπλέον, κατά τη διαδικασία της αποικοδόμησης δημιουργούνται όξινες συνθήκες (πτώση της τιμής του ph), γεγονός που δίνει τη δυνατότητα σε πολλά μεταλλικά ιόντα, αδιάλυτα σε περιβάλλον με βασικό ph, να διαλυθούν στο δημιουργούμενο στράγγισμα. Σε χώρους που δέχονται μεγάλες ποσότητες αστικών, και βιομηχανικών απορριμμάτων/αποβλήτων, με την εξαίρεση χημικών αποβλήτων, τα στραγγίσματα μπορεί να χαρακτηριστούν ως ένα υδατικό διάλυμα α) διαλυμένης οργανικής ύλης (αλκοόλες, οξέα, αλδεΰδες, σάκχαρα, κλπ.), β) ανόργανων συστατικών (ανιόντα και κατιόντα, συμπεριλαμβανομένου του θείου, χλωρίου, σιδήρου, αλουμινίου, ψευδαργύρου και αμμωνίας), γ) βαρέων μετάλλων (μόλυβδος, κάδμιο, νικέλιο, χαλκός, υδράργυρος) και δ) ξενοβιοτικών οργανικών συστατικών, όπως αλογονομένα οργανικά (PCBs, διοξίνες, κ.λπ.) [3-4]. Επιπλέον, το στράγγισμα μπορεί να περιέχει μεγάλες ποσότητες στάχτης και οικοδομικών υλικών, όπως ο γύψος, ο οποίος μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων υδρόθειου [5]. Παρ όλα τα μέτρα που λαμβάνονται, παράνομες εναποθέσεις επικίνδυνων ουσιών στο περιβάλλον, επιβαρύνουν σημαντικά τη σύσταση των υγρών αποβλήτων. Επιπλέον, διαρροές στραγγισμάτων στο υδάτινο περιβάλλον μπορεί να επιφέρουν άμεσες ή μακροχρόνιες μεταβολές στις δομές των βιοκοινοτήτων, ενώ έντονες είναι επιπτώσεις σε υδρόβιους οργανισμούς του γλυκού νερού και των παράκτιων περιοχών [6]. Ο καθορισμός της τοξικότητας διαφόρων ρυπογόνων ουσιών γίνεται συνήθως με τη χρήση οργανισμών Βιοενδεικτών [7-8]. Το ανόστρακο καρκινοειδές των γλυκών νερών Thamnocephalus platyurus παρουσιάζει μεγάλη γεωγραφική εξάπλωση και είναι ευαίσθητο σε χημικές ουσίες και απόβλητα, ενώ το θαλάσσιο καρκινοειδές Artemia sp. παρουσιάζει ανοχή σε μεγάλο εύρος αλατότητας και χρησιμοποιείται ευρύτατα σε δοκιμές τοξικότητας διαφόρων ρυπογόνων ουσιών [9-14]. Τα Δίθυρα Μαλάκια αποτελούν μια ομάδα ασπονδύλων με ιδιαίτερη εμπορική αξία, ενώ είδη του γένους Mytilus (π.χ. M. galloprovincialis, M. trossulus, M. californianus) χρησιμοποιούνται ευρύτατα τόσο σε εργαστηριακό επίπεδο, όσο και στο περιβάλλον (Μussel Watch Programmes) ως οργανισμοί-βιοενδείκτες για την εκτίμηση της κατάστασης των υδάτων [15-17]. Η ικανότητα συσσώρευσης τοξικών ουσιών στους ιστούς τους, σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από τις αντίστοιχες του θαλασσινού νερού, η γνώση της φυσιολογίας και της συμπεριφοράς τους, σε συνδυασμό με την μελέτη τους σε γενετικό και βιοχημικό επίπεδο, δίνει τη δυνατότητα στους ερευνητές να εκτιμήσουν την κατάσταση του θαλάσσιου οικοσυστήματος, καθώς και τις βιολογικές επιπτώσεις διαφόρων ρυπογόνων ουσιών [18-24]. Η εκτίμηση των βιολογικών επιπτώσεων διαφόρων ρυπογόνων ουσιών επιτυγχάνεται με τη μελέτη βιοχημικών, ιστοχημικών και μοριακών παραμέτρων που ονομάζονται Βιομάρτυρες [25-30]. Οι Βιομάρτυρες μπορεί να διακριθούν σε γενικού και ειδικού stress. Οι Βιομάρτυρες γενικού 2

3 stress συνιστούν αποκρίσεις σε μια ομάδα ρυπογόνων ουσιών, χωρίς να προσδιορίζεται ακριβώς η φύση τους, σε αντίθεση με τους Βιομάρτυρες ειδικού stress, οι οποίοι σχετίζονται με την απόκριση των οργανισμών σε συγκεκριμένες ομάδες ουσιών. Η ταυτόχρονη μελέτη και συσχέτιση Βιομαρτύρων γενικού και ειδικού stress, σε συνδυασμό με τη γνώση της φυσιολογίας του εκάστοτε οργανισμού και του οικοσυστήματός του, δίνουν μια ικανοποιητική εικόνα των επιπτώσεων των διαφόρων ρυπογόνων ουσιών στους οργανισμούς. Με άλλα λόγια, οι Βιομάρτυρες χρησιμοποιούνται ως εργαλεία έγκαιρης και έγκυρης εκτίμησης των επιπτώσεων των ρυπογόνων ουσιών [26, 30-32]. 2. Ανάπτυξη της μεθοδολογίας του προγράμματος: Το πρώτο στάδιο της μελέτης περιλαμβάνει την επεξεργασία και ανάλυση των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών σε δείγματα στραγγίσματος που θα συλλέγονται για χρονικό διάστημα ενός έτους (τουλάχιστο 6 δειγματοληψίες) από το ΧΥΤΑ της Πάτρας, έτσι ώστε να διερευνηθούν τυχόν ποιοτικές και ποσοτικές εποχικές μεταβολές στη σύνθεσή τους. Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν μέτρηση της τιμής του ph, του βιοχημικά απαιτούμενου οξυγόνου (BOD 5 ), του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (COD), των ολικών στερεών (TS), των πτητικών στερεών (VS), της αγωγιμότητα, της θολερότητας, του ολικού αζώτου, φωσφόρου και των ολικών φαινολών, των βαρέων μετάλλων (μόλυβδος, κάδμιο, νικέλιο, χρώμιο, ψευδάργυρος, υδράργυρος κ.α.), καθώς και της συγκέντρωσης οργανικών ρύπων (PCBs), σύμφωνα με γνωστές μεθόδους ανάλυσης και προσδιορισμού [33]. Παράλληλα, θα πραγματοποιούνται έλεγχοι τοξικότητας των δειγμάτων του στραγγίσματος που θα συλλεχθούν σε διαφορετικές εποχές του έτους (ανάλογα με τις εποχικές ή μη μεταβολές των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των δειγμάτων) με τη χρήση των μικροβιοτέστ Artoxkit M και Thamnotoxkit F TM, με απώτερο στόχο τον προσδιορισμό του όγκου των δειγμάτων που προκαλεί στο κάθε είδος, ποσοστό θνησιμότητας 50% (LC 50 ) κατά την βραχυχρόνια έκθεση (24 και/ή 48 ώρες), καθώς και των διαφοροποιήσεων που πιθανό να προκαλεί το κάθε δείγμα στους οργανισμούς-βιοενδείκτες του γλυκού και αλμυρού νερού που θα χρησιμοποιηθούν. Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων του δείγματος σε ιστούς του μυδιού Mytilus galloprovincialis. Η μελέτη περιλαμβάνει προκαταρκτική έκθεση 96 ωρών, σε διαφορετικούς όγκους δείγματος από στράγγισμα (γνωστών φυσικοχημικών παραμέτρων), προκειμένου να υπολογιστεί ο όγκος στον οποίο παρατηρείται θνησιμότητα 50% (LD 50 ) των ατόμων. Ανάλογα με τα αποτελέσματα της προκαταρτικής έκθεσης, άτομα του είδους θα εκτεθούν σε υποθανατογόνες αραιώσεις του δείγματος, υπό ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες (θερμοκρασία, αλατότητα, φωτοπερίοδος) για χρονικό διάστημα 7 ημερών, και θα ελεγχθούν διάφοροι παράμετροι-βιομάρτυρες, όπως: α) η σταθερότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης στα αιμοκύτταρα με χρήση της τεχνικής neutral red uptake, β) τα επίπεδα των μεταλλοθειονινών (ΜΤ) και γ) της μαλονικής διαλδεϋδης (MDA) στην αιμόλεμφο, τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια, δ) τα επίπεδα της ολικής γλουταθειόνης (GSH + GSSG) στην αιμόλεμφο, καθώς και οι γενοτοξικές επιπτώσεις που μπορεί να προκληθούν όπως ε) η εμφάνιση μικροπυρήνων και στ) οι βλάβες του γενετικού υλικού στα αιμοκύτταρα των εκτιθέμενων ατόμων. Επιπλέον, θα πραγματοποιηθούν πειράματα έκθεσης απομονωμένων αιμοκυττάρων της αιμολέμφου για 1 ώρα σε διαφορετικές αραιώσεις του δείγματος, υπό ελεγχόμενες συνθήκες (θρεπτικό υλικό καλλιέργειας), έτσι ώστε να διερευνηθεί α) η επαγωγή κυτταροξικών φαινομένων που οδηγούν σε αυξημένη θνησιμότητα και β) η πιθανή επαγωγή οξειδωτικού stress, με προσδιορισμό των παραγόμενων ανιόντων σουπεροξειδίου (. Ο 2 - ), των νιτρικών οξειδίων (ΝΟ) και των προϊόντων της λιπιδικής υπεροξείδωσης των μεμβρανών (MDA). Από τη συγκριτική μελέτη των παραπάνω παραμέτρων σε άτομα ελέγχου (control group of mussels/ unexposed mussels) και σε άτομα που εκτέθηκαν στο συγκεκριμένο δείγμα (exposed mussels) θα εξαχθούν σημαντικά δεδομένα, σχετικά τις βιολογικές επιπτώσεις του στραγγίσματος, ενώ από την έκθεση των απομονωμένων κυττάρων θα προκύψουν σημαντικά δεδομένα για τους μηχανισμούς που πιθανό να σχετίζονται με την πρόκληση των τοξικών επιπτώσεων του στραγγίσματος τόσο σε κυτταρικό επίπεδο όσο και σε επίπεδο οργανισμού. Επίσης, θα πραγματοποιηθεί στατιστική ανάλυση συσχέτισης μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων και των επιμέρους φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του δείγματος, έτσι ώστε να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση (αρνητική ή θετική) μεταξύ τους. 3

4 Το προτεινόμενο ερευνητικό έργο θα ολοκληρωθεί σε 4 πακέτα εργασίας (ΠΕ 1-4), τα οποία περιγράφονται αναλυτικά στη συνέχεια: ΠΕ 1: Ανάλυση φυσικοχημικών παραμέτρων των δειγμάτων. Δείγματα στραγγίσματος μεταφέρονται στο εργαστήριο, όπου και φυλάσσονται στους 4 o C, μέχρι την πραγματοποίηση των μετρήσεων. Η τιμή ph, η αγωγιμότητα και η ποσότητα του διαλυμένου οξυγόνου, θα προσδιορίζονται άμεσα στο χώρο της δειγματοληψίας με φορητή συσκευή HACH, καθώς και μετά από τη μεταφορά και συντήρηση στο εργαστήριο, πριν από τη διεξαγωγή των επιπλέον αναλύσεων. Οι μετρήσεις των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του στραγγίσματος θα πραγματοποιηθούν με συσκευή HACH (μοντέλο DR2800), σύμφωνα με γνωστά πρωτόκολλα εργασίας [33]. ΠΕ 1.1 Μέτρηση φυσικοχημικών παραμέτρων: Η μέτρηση του βιοχημικά απαιτούμενου οξυγόνου (BOD) θα πραγματοποιηθεί σε ειδικές φιάλες και υπό κατάλληλες συνθήκες (θερμοκρασία 20 ο C για 5 ημέρες/bod 5 ), προκειμένου να εκτιμηθεί το ποσό του διαθέσιμου οξυγόνου που χρειάζονται τα βακτήρια, προκειμένου να αποικοδομήσουν τη διαθέσιμη οργανική ύλη. Με ανάλογη τεχνική θα προσδιοριστεί και το χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (COD) που βασίζεται στη χημική οξείδωση των οργανικών ουσιών και πλεονεκτεί χρονικά έναντι αυτής του BOD 5 αφού χρειάζεται λίγες μόνο ώρες για να πραγματοποιηθεί. Ο προσδιορισμός των νιτρικών (NO 3 - ), τα οποία είναι ευδιάλυτα και μεταφέρονται σε υδάτινες δεξαμενές, αποτελώντας τροφή για το πλαγκτόν, τα υδρόβια φυτά και τα φύκη, καθώς και των νιτρωδών ιόντων (NO 2 - ), τα οποία είναι ασταθή και γρήγορα μετατρέπονται σε νιτρικά [33], θα πραγματοποιηθεί φωτομετρικά, σε μήκος κύματος 500 nm με τη συσκευή HACK (DR2800), ακολουθώντας τα αντίστοιχα πρωτόκολλα μέτρησης. Με ανάλογο τρόπο και σε μήκος κύματος 610 nm, θα προσδιοριστούν τα φωσφορικά ιόντα (PO 4-3 ), τα οποία σε υψηλές συγκεντρώσεις είναι τοξικά για τους ζωικούς οργανισμούς. Τα ολικά στερεά (το στερεό υπόλοιπο που προκύπτει μετά από ξήρανση του δείγματος σε θερμοκρασία o C, περιλαμβάνουν τα «ολικά αιωρούμενα στερεά», δηλαδή το ποσοστό των ολικών στερεών που συγκρατούνται από φίλτρο (<1 μm) και τα «ολικά διαλυμένα στερεά», που αποτελούν το ποσοστό εκείνο που διέρχεται από το φίλτρο. Ο προσδιορισμός των ολικών και των πτητικών αιωρούμενων στερεών θα πραγματοποιηθεί σύμφωνα με γνωστά πρωτόκολλα [33], ενώ τα ολικά αιωρούμενα στερεά (TSS Total Suspended Solids) υπολογίζονται μετά από διήθηση ποσότητας δείγματος, γνωστού βάρους από ηθμό ινών υάλου. Οι φαινόλες και τα παράγωγά τους είναι αρωματικές ενώσεις που έχουν στο βενζολικό δακτύλιο τουλάχιστον ένα υδροξύλιο και προέρχονται κυρίως ως παραπροϊόντα φυσικών οργανικών ενώσεων όπως της λιγνίνης και της ταννίνης, οι οποίες είναι ευρέως διασκορπισμένες στο φυσικό περιβάλλον [34]. Η μέτρηση των φαινολών θα πραγματοποιηθεί φωτομετρικά σε μήκος κύματος 760 nm, μέσω της ανίχνευσης των ολικών υδροξυ-φαινυλομάδων, με τη χρήση αναγμένων δειγμάτων φωσφομολυβδαινικού οξέος (phosphomolybdic acid) και φωσφοβολφραμικού οξέος (phosphotungstic acid) που περιέχονται στο αντιδραστήριο Folin Ciocalteau [35]. ΠΕ 1.2 Μέτρηση βαρέων μετάλλων και πολυχλωριομένων διφαινυλίων (PCBs): Η μέτρηση των συγκεντρώσεων των βαρέων μετάλλων, τα οποία αποτελούν κύριους περιβαλλοντικούς ρύπους, οι οποίοι συσσωρεύονται συσσωρεύονται στους ιστούς των ζώων, θα πραγματοποιηθεί σε συσκευή ατομικής απορρόφησης Perkin Elmer Aanalyst 800 και φούρνο γραφίτη THG A graphite Furnace (AS-800 autosampler). Τα πολυχλωριομένα διφαινύλια (PCBς) αποτελούν μια ομάδα ενώσεων του χλωρίου, τα οποία διακρίνονται από το βαθμό χλωρίωσης και τη θέση των ατόμων χλωρίου στο βενζολικό δακτύλιό τους. Η συγκέντρωση των PCBs θα πραγματοποιηθεί με χρήση της συσκευής HACH Lange DR2800 και το αντίστοιχο πρωτόκολλο [33]. 4

5 ΠΕ 2: Έλεγχος τοξικότητας με χρήση των Artoxkit M και Thamnotoxkit F TM. Το μικροβιοτέστ Thamnotoxkit F στηρίζεται στον προσδιορισμό της τιμής LC 50 που προκύπτει μετά την έκθεση προνυμφών του ασπόνδυλου καρκινοειδούς Thamnocephalus platyurus σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του στραγγίσματος. Συγκεκριμένα, θα πραγματοποιηθεί εκκόλαψη των κύστεων του Τhamnocephalus platyurus 24 ώρες πριν την έναρξη της διαδικασίας ελέγχου της τοξικότητας. Μετά την ολοκλήρωση της εκκόλαψης, οι προνύμφες θα εκτεθούν σε διαφορετικές αραιώσεις του δείγματος για 24 ώρες και θα υπολογιστεί η % θνησιμότητά τους. Με παρόμοιο τρόπο υπολογίζεται η % θνησιμότητα της Artemia franciscana (μικροβιοτέστ Artoxkit M). ΠΕ 3: Μελέτη τοξικών επιπτώσεων του στραγγίσματος σε ιστούς του μυδιού Βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis (Lmk), με τη χρήση Βιομαρτύρων. Η μελέτη περιλαμβάνει προκαταρκτική έκθεση ατόμων του είδους Mytilus galloprovincialis (Lmk) σε διαφορετικούς όγκους/αραιώσεις του στραγγίσματος. Συγκεκριμένα, άτομα του είδους θα τοποθετηθούν σε δεξαμενές με τεχνητό θαλασσινό νερό (35 αλατότητα και θερμοκρασία ο C, φωτοπερίοδος 12-12) και θα εκτεθούν για 96 ώρες σε διαφορετικές αραιώσεις του δείγματος. Στη συνέχεια, ανάλογα με τα εξαγόμενα αποτελέσματα, άτομα θα εκτεθούν σε 2 υποθανατογόνες αραιώσεις του δείγματος (γνωστής συγκέντρωσης σε ανόργανα και οργανικά στοιχεία) για χρονικό διάστημα 7 ημερών. Μετά το τέλος της έκθεσης θα πραγματοποιηθεί συλλογή των ιστών από κάθε ομάδα έκθεσης (αιμόλεμφος και αιμοκύτταρα, βράγχια και πεπτικός αδένας) προκειμένου να πραγματοποιηθεί ο προσδιορισμός των διαφόρων Βιομαρτύρων. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης διατηρούμε και άτομα ελέγχου, με τα οποία θα γίνει η τελική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. ΠΕ 3.1 Εκτίμηση της σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης σε αιμοκύτταρα, με χρήση της χρωστικής neutral red (neutral red retention time/nrr): Τα λυσοσώματα των αιμοκυττάρων παρουσιάζουν μεγάλη ευαισθησία στην παρουσία εξωγενών ρυπογόνων ουσιών, οι οποίες συντελούν στην αποσταθεροποίηση των μεμβρανών τους και στην αύξηση της διαπερατότητάς τους σε διάφορα υποστρώματα, όπως η χρωστική neutral red [18,26,36]. Η εξαγωγή των αποτελεσμάτων βασίζεται στην παρατήρηση με οπτικό μικροσκόπιο των αιμοκυττάρων κατά τακτά χρονικά διαστήματα (κάθε 15 λεπτά για χρονικό διάστημα πάνω από 135 λεπτά), ενώ οι επιβλαβείς επιπτώσεις εκτιμώνται από το χρόνο μέσα στον οποίο παρατηρείται αποσταθεροποίηση των λυσοσωμικών μεμβρανών σε ποσοστό μεγαλύτερο από 50% των κυττάρων, με επακόλουθη διάχυση της χρωστικής στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνονται τα διάφορα στάδια διάχυσης της χρωστικής neutral red σε αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis. a) Παραμονή της χρωστικής στο εσωτερικό των λυσοσωμάτων για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο των 30 min, b) Η χρωστική παραμένει στα λυσοσώματα, τα οποία δείχνουν σημάδια διόγκωσης μετά από χρονικό διάστημα 45 min, c) Διάχυση της χρωστικής στο κυτταρόπλασμα, μετά το πέρας 60 min, d) Μεγέθυνση των λυσοσωμάτων και ολική διάχυση της χρωστικής στο κυτταρόπλασμα (από Dailianis et al. [26] ). ΠΕ 3.2 Ανίχνευση μικροπυρήνων σε αιμοκύτταρα και κύτταρα βραγχίων: Η παρουσία μικροπυρήνων σε αιμοκύτταρα και κύτταρα βραγχίων του μυδιού σχετίζεται με την πρόκληση μεταλλαξιγένεσης και γενοτοξικών επιπτώσεων. Πρόκειται για πυρήνες μεγέθους μικρότερο του 1/3 του μεγέθους του κανονικού πυρήνα των κυττάρων, οι οποίοι περιέχουν 5

6 γενετικό υλικό, ως επακόλουθο μεταλλαξιγόνων διεργασιών, μη κανονικού διπλασιασμού και μεταγραφής του DNA, καθώς και μεταφραστικές διεργασίες του RNA, ενώ το ποσοστό εμφάνισής τους αυξάνει μετά την επίδραση διαφόρων ρυπογόνων ουσιών [26, 37-38]. Παράλληλα με την ανίχνευση των παραπάνω δομών, προσπαθούμε να παρατηρήσουμε την ύπαρξη διαφορετικών μορφών που αποκαλούνται ανωμαλίες αιμοκυττάρων (abnormalities of hemocytes) και σχετίζονται με την πρόκληση γενοτοξικών επιπτώσεων, όπως: 1) Ύπαρξη δύο πυρήνων (binucleated) σε κάθε κύτταρο, 2) Ύπαρξη δύο μικροπυρήνων, 3) Μικροπυρήνες συνδεδεμένοι με τον πυρήνα του κυττάρου (eight-shaped nuclei), 4) Άλλες διαφοροποιήσεις του πυρήνα (Εικόνα 2). Εικόνα 2. Εμφάνιση μικροπυρήνων και πυρηνικών ανωμαλιών σε αιμοκύτταρα και κύτταρα βραγχίων του μυδιού Mytilus galloprovincialis. (a) Μικροπυρήνας σε κύτταρο βραγχίου (βέλος) (b) Δύο μικροπυρήνες σε αιμοκύτταρο, (c) Εμφάνιση δύο πυρήνων (binucleated) σε κύτταρο από βράγχια, (d) εμφάνιση μικροπυρήνα συνδεδεμένου με τον πυρήνα του κυττάρου (από Dailianis et al. [26] ). ΠΕ 3.3 Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA σε αιμοκύτταρα: Διάφορες ρυπογόνες ουσίες μπορεί να προκαλέσουν βλάβες του DNA είτε άμεσα είτε έμμεσα μέσω της αναστολής των μηχανισμών επιδιόρθωσης, ο προσδιορισμός των οποίων αποτελεί ένα σημαντικό μοριακό Βιομάρτυρα εκτίμησης των γενοτοξικών επιπτώσεων σε θαλάσσιους οργανισμούς [59]. Για τον προσδιορισμό της βλάβης του γενετικού υλικού στα αιμοκύτταρα των εκτιθέμενων ατόμων θα χρησιμοποιηθεί η τεχνική ανάλυσης Κομητών (Comet assay/alkaline Single Cell Gel Electrophoresis). Πρόκειται για μια μέθοδο, κατά την οποία εκτιμάται το ποσοστό βλάβης του DNA (εμφάνιση κατακερματισμένου DNA με τη μορφή κομματιών DNA/ strand breaks/sbs, αντιπροσωπευτική της βλάβης του γενετικού υλικού/dna damage), σε κύτταρα οργανισμών που έχουν εκτεθεί ή εκτίθεται σε κάποιο τοξικό παράγοντα [60-65]. ΠΕ 3.4 Προσδιορισμός των επιπέδων των μεταλλοθειονινών στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια: Οι Μεταλλοθειονίνες (ΜΤ) είναι κυτταροπλασματικές πρωτεϊνες (6-7 kda), πλούσιες σε κυστεΐνη και έχουν αναφερθεί σε όλα σχεδόν τους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένου των Ιχθύων [39-40], των Μαλακίων και Καρκινοειδών [41-48]. Ειδικότερα για τα Δίθυρα μαλάκια, η ανίχνευση 9 ισομορφών ΜΤ, σε μονομερή και διμερή μορφή, καθώς και η ακολουθία των αμινοξέων τους, υποδηλώνουν διττή λειτουργία τόσο σε επίπεδο διατήρησης της ομοιόστασης, όσο και σε επίπεδο αποτοξίνωσης του οργανισμού από τις βλαβερές επιπτώσεις ρυπογόνων ουσιών [49-53]. Οι ΜΤ επάγονται από ένα μεγάλο αριθμό στρεσσογόνων παραγόντων, με κυριότερους τα μέταλλα Cd, Cu, Zn, Hg, Co, Ni, Bi, Ag, ενώ συμμετέχουν στην αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού, λόγω της ικανότητάς τους να δεσμεύονται με ελεύθερες ρίζες [53, 54-56]. Η μέτρηση των επιπέδων των ΜΤ ως βιομάρτυρα έκθεσης σε βαρέα μέταλλα βρίσκει μεγάλη αποδοχή και εφαρμόζεται σε πολλά ερευνητικά προγράμματα σε όλο τον κόσμο. Στην παρούσα μελέτη θα χρησιμοποιηθεί η μέθοδος ποσοτικής ανάκτησης των ΜΤ με τη χρήση RNA, μια μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρύτατα από πολλά ερευνητικά εργαστήρια σε χώρες της Μεσογείου [30, 42, 57-58]. Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί μέτρηση των κυριότερων μετάλλων σε ιστούς (πεπτικό αδένα και βράγχια) μυδιών πριν και μετά την έκθεσή τους στο δείγμα του στραγγίσματος, προκειμένου να συσχετιστεί η τυχόν επαγωγή των ΜΤ με τη συσσώρευση βαρέων μετάλλων στους ιστούς των εκτιθέμενων ατόμων. ΠΕ 3.5 Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, μέσω προσδιορισμού των επιπέδων της μαλονικής διαλδεϋδης (malondialdehyde/mda) στην αιμόλεμφο, τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια: 6

7 Η μαλονική διαλδεϋδη (MDA) αποτελεί παράγωγο της υπεροξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, καθώς και του καταβολισμού του αραχιδονικού οξέος και αποτελεί σημαντικό βιομάρτυρα της επαγωγής οξειδωτικού stress. Η παρουσία MDA σχετίζεται με την πρόκληση βλαβών τόσο του DNA όσο και πρωτεϊνών του κυττάρου [66-68]. Ο προσδιορισμός της MDA στους ιστούς και στα απομονωμένα αιμοκύτταρα θα πραγματοποιηθεί με τη χρήση θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBA) σύμφωνα με γνωστές μεθόδους [69-70]. ΠΕ 3.6 Προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής γλουταθειόνης στην αιμόλεμφο: Η γλουταθειόνη (GSH) ανήκει στην κατηγορία των αντιοξειδωτικών μορίων χαμηλού μοριακού βάρους και η βιοσύνθεσή της πραγματοποιείται in vivo κάθε φορά που το κύτταρο έχει να αντιμετωπίσει καταστάσεις οξειδωτικού stress. Η GSH απαντά σε όλα τα ζωικά κύτταρα και μπορεί να αντιδράσει με ελεύθερες ρίζες, όπως με ΗΟ και να παραχθεί η θειϊλική ρίζα (GS ). Οι ρίζες αυτές μπορεί να αντιδράσουν μεταξύ τους και να παραχθεί το δισουλφύδιο της γλουταθειόνης (GSSG) που αποτελείται από δύο μόρια GSH συνδεδεμένα με τις SH ομάδες, μέσω δισουλφιδικού δεσμού. Ο προσδιορισμός της ολικής γλουταθειόνης θα πραγματοποιηθεί σε κύτταρα της αιμολέμφου, σύμφωνα με τη φωτομετρική μέθοδο των Owens & Belcher [71]. ΠΕ 4: Μελέτη της επαγωγής οξειδωτικού stress σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis (Lmk), μετά την έκθεση σε διαφορετικές αραιώσεις του δείγματος. Θα πραγματοποιηθεί έκθεση μικρής χρονικής διάρκειας (1 ώρα) απομονωμένων αιμοκυττάρων της αιμολέμφου σε διαφορετικές ποσότητες του επιλεγμένου δείγματος και προσδιορισμός: α) της σταθερότητας των λυσοσωμικών μεμβρανών, μέσω της πρόσληψης της χρωστικής neutral red και β) της επαγωγής οξειδωτικού stress, μέσω του προσδιορισμού των. Ο 2 -, ΝΟ και της MDA. Η απομόνωση και διατήρηση των κυττάρων σε θρεπτικό υλικό, καθώς και η έκθεσή τους στο δείγμα των ρυπογόνων ουσιών θα πραγματοποιηθεί, σύμφωνα με γνωστό πρωτόκολλο [70]. ΠΕ 4.1 Εκτίμηση της πρόσληψης της χρωστικής neutral red: H μέθοδος βασίζεται στο φωτομετρικό προσδιορισμό (μήκος κύματος 540 nm) της χρωστικής neutral red που προσλαμβάνεται από ζωντανά αιμοκύτταρα, σύμφωνα με τροποποιημένο πρωτόκολλο [70] και αποτελεί ένα δείκτη τοξικότητας για τον εκάστοτε παράγοντα έκθεσης. ΠΕ 4.2 Προσδιορισμός των ανιόντων σουπεροξειδίου και των νιτρικών οξειδίων: Ο προσδιορισμός των. O 2 - που αποτελούν ελεύθερες ρίζες του οξυγόνου, ως απόκριση στην επαγωγή οξειδωτικού stress, θα πραγματοποιηθεί με τη χρήση της ουσίας NBT, σύμφωνα με γνωστή φωτομετρική μέθοδο [70]. Ο προσδιορισμός των ΝΟ θα πραγματοποιηθεί με τροποποίηση της μεθόδου αντίδρασης Griess [72], με την οποία προσδιορίζονται τα νιτρώδη ιόντα (NO 2 - ), που αποτελούν τελικά προϊόντα της διάσπασης των νιτρικών οξειδίων [70]. ΠΕ 4.3 Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, μέσω του προσδιορισμού των επιπέδων της MDA: Ο προσδιορισμός της MDA στα αιμοκύτταρα θα πραγματοποιηθεί μετά από έκθεση των αιμοκυττάρων σε διαφορετικές αραιώσεις του δείγματος, σύμφωνα με τη μέθοδο που προτείνεται σε πρόσφατα δημοσιευμένη εργασία [70]. 3. Σκοπιμότητα, σημασία και συμβολή του προγράμματος: Σκοπός του προτεινόμενου έργου είναι η εφαρμογή μιας ολοκληρωμένης μελέτης, η οποία περιλαμβάνει τον προσδιορισμό των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του στραγγίσματος, της τοξικότητάς του, καθώς και τις βιολογικές επιπτώσεις που μπορεί να προκαλέσει σε υδρόβιους οργανισμούς, όπως ο οργανισμός-βιοενδείκτης Mytilus galloprovincialis. Η εφαρμογή τεστ τοξικότητας σε μακροασπόνδυλα του γλυκού και αλμυρού νερού, καθώς και η μελέτη διαφόρων μοριακών και κυτταρικών Βιομαρτύρων σε ιστούς και απομονωμένα κύτταρα των μυδιών, αποτελούν σημαντικά εργαλεία τόσο σε μελέτες τοξικότητας όσο και σε μελέτες εκτίμησης των γενοτοξικών και κυτταρικών επιπτώσεων των ρυπογόνων ουσιών που πιθανό να περιέχονται σε 7

8 υδάτινα απόβλητα, όπως τα στραγγίσματα. Από τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων πιθανό να προκύψουν σημαντικά συμπεράσματα για την τοξικότητα των διαφόρων ρυπογόνων ουσιών του στραγγίσματος, τη συμβολή τους στην πρόκληση κυτταρικών και μοριακών διαταραχών και κατεπέκταση στη διατάραξη της φυσιολογικής ομοιόστασης των οργανισμών. Επιπλέον, η μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων των υγρών αποβλήτων/στραγγισμάτων που προέρχονται από ΧΥΤΑ ευελπιστούμε ότι θα αποτελέσει ένα σημαντικό δεδομένο στην προσπάθεια λήψης μέτρων για τη σωστή διαχείριση των αποβλήτων, με κύριο γνώμονα τόσο τη Δημόσια Υγεία, όσο και την προστασία των υδάτινων πόρων. 4. Βιβλιογραφία 1. Lema, J.M., Mendez, R., Blazquez., R., Characteristics of landfill leachates and alternatives for their treatment: a review. Water Air Soil Pollut. 40, Henry, J., Heinke, G., Environmental Science and Engineering, Prentice Hall. 3. Kang, K.H., Shin, H.S., Park, H., Characterization of humic substances present in landfill leachates with different landfill ages and its implications. Water Res. 36, Wang, Z.P., Zhang, Z., Lin, Y.J., et al Landfill leachate treatment by a coagulation photooxidation process. J. Hazard. Mater. 95, Kjeldsen, P., Barlaz, M.A., Rooker, A.P., Anders Baun, A., Ledin, A., Christensen, T.H., Present and Long-Term Composition of MSW Landfill Leachate: A Review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 32, Abu-Rukah, Y., Al-Kofahi. O., The assessment of the effect of landfill leachate on groundwater quality A case study: El-Akader landfill site-north Jordan. J. Arid Environ. 49, Michniewicz, M., Nalecz Jawecki, G., Stufka Olczyk, J., Sawicki, J., Comparison of Chemical Composition and Toxicity of Wastewaters from Pulp Industry. In: Persoone et al. (Eds), New Microbiotests for Routine Toxicity Screening and Biomonitoring, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, pp Isidori, M., Parrella, A., Piazza, C.M.L., Strada, R., Toxicity Screening of Surface Waters in Southern Italy with Toxkit Microbiotests. In: Persoone et al. (Eds.), New Microbiotests for RoutineToxicity Screening and Biomonitoring, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, pp Sorgeloos, P., Remiche-Van der Wielen, C., Persoone, G., The use of Artemia nauplii for toxicity tests. A critical analysis. Ecotoxicology and Environmental Safety 2, Persoone, G., Vanhaecke, P., Intercalibration exercise on a short-term standard toxicity test with Artemia nauplii. Final report. Contract EEC-ENV-396B(N), p Persoone, G., Wells, P.G., Artemia in aquatic toxicology: a review. In: Sorgeloos, P., Bengston, W., Decleir, W., Jaspers, E. (Eds), Artemia research and its Applications. Vol. 1. Morphology, Genetics, Strain characterization, Toxicology. Universa Press, wetteren, Belgium, p Matthews, R.S., Artemia salina as a test organism for measuring superoxide-mediated toxicity. Free Rad. Biol. Med. 18, Hartl M. and Humph, H.U., Toxicity assessment of fumonisis using the rine shrimp (Artemia salina) bioassay. Food Chemistry and Toxicology 38, Katranitsas, A., Castritsi-Catharios, J., Persoone, G., The effects of copper based antifouling paint on mortality and enzymatic activity of non-target marine organisms. Marine Pollution Bulletin 46, NRC, The International Mussel Watch: Report of a Workshop. Washington DC, US National Academy of Sciences, National Research Council, Publications Office, pp Goldberg, E.D., The mussel watch concept. Environmental Monitoring Assessment 7, Bayne, B.L., Measuring the biological effects of pollutants: the mussel watch approach. Water Science Technlogy 21, Moore, M.N., Cellular responses to pollutants. Marine Pollution Bulletin 16,

9 19. Widdows, J., In: The effects of Stress and Pollution on Marine Animals. Praeger Press, New York, pp Amiard, J.C., Amiard-Triquet, C., Berthert, B., Metayer, C., Contribution to the ecotoxicological study of cadmium, lead, copper and zinc in the mussel Mytilus edulis. Marine Biology 90, Farrington, J.W., Davis, A.C., Tripp, B.W., Phelps, D.K., Galloway, W.B., Mussel Watch -measurements of chemical pollutants in bivalves as one indicator of coastal environment quality. In: Boyle T.P., (Ed.), New approaches to monitoring aquatic ecosystems, ASTM STP 940. Philadelphia: American Society for Testing and Materials, pp Cossa, D., A review of the use of Mytilus spp. as quantitative indicators of cadmium and mercury contamination in coastal waters. Oceanologica Acta 12(4), Regoli, F., Trace metals and antioxidant enzymes in gills and digestive gland of the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34, Lafontaine, de Y., Gagne, F., Blaise, C., Costan, G., Gagnon, P., Chan, H.M., Biomarkers in zebra mussels (Dreissena polymorpha) for the assessment and monitoring of water quality of the St Lawrence River (Canada). Aquatic Toxicology 50, Depledge, M.H The rational basis for the use of biomarkers as ecotoxicological tools. In: Fossi, M.C., Leonzio, C. (Eds.), Nondestructive Biomarkers in Vertebrates (pp ). Boca Raton: Lewis Publishers. 26. Dailianis, S., Domouhtsidou, G.P., Raftopoulou, E., Kaloyianni, M., Dimitriadis, V.K., Evaluation of neutral red retention assay, micronucleus test, acetylcholinesterase activity and a signal transduction molecule (camp) in tissues of Mytilus galloprovincialis (L.) in pollution monitoring. Marine Environmental Research 56, Chevre, N., Gagne, F., Gagnon, P., Blaise, C., Application of rough sites analysis to identify polluted aquatic sites based on a battery of biomarkers: a comparison with classical methods. Chemosphere 51, Cajaraville, M.P., Bebianno, M.J., Blansco, J., Porte, C., Sarasquete, C., Viarengo, A., The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environment of the Iberian Peninsula: a practical approach. Science of the Total Environment 247, Sarkar, A., Ray, D., Shrivastava A.N., Sarker, S., Molecular Biomarkers: their significance and application in marine pollution monitoring. Ecotoxicology 15, Domouhtsidou G.P., Dailianis S., Kaloyianni M. and Dimitriadis V.K., Lysosomal membrane stability and metallothionein content in Mytilus galloprovincialis (L.), as biomarkers. Combination with trace metal concentrations. Marine Pollution Bulletin 48, McCarthy, J.F., Shugart, L.R., Biomarkers of Environmental Contamination, Lewis Publishers, MI, pp Huggert, R.J., Kimerle, R.A., Mehrle, P.M., Bergman, H.L., (Eds.), Biomarkers; Biochemical, Physiological and Histological Markers of Anthropogenic Stress. Lewis Publishers, Boca Raton, Florida, 347 pp. 33. APHA, AWWA, WPCF, "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater." 19 th edition. Washington DC, USA: American Public Health Association. 34. Paterson, B., Cowie, C.E., Jackson, P.E., Determination of phenols in environmental waters using liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography 731A, Waterman, P.G., Mole, S., Analysis of phenolic plant metabolites. In: Lawton, H.J., Likens, G.E. (Eds.), Methods in Ecology. Blackwell Scientific Publications, Oxford. 36. Viarengo, A., Moore, M.N., Mancinelli, G., Mazzucotelli, A., Pipe, R.K., Farrar, S.V., Metallothioneins and lysosomes in metal toxicity and accumulation in marine mussels: the effect of cadmium in the presence and absence of phenathrene. Marine Biology 94, Bresler, V., Bissinger, V., Abelson, A., Dizer, H., Sturn, A., Kratket, R., Fishelson, L., Hansen, P.D., Marine mollusks and fish as biomarkers of pollution stress in littoral regions of the Red Sea, Mediterranean Sea and North Sea. Helgoland Marine Research 53, Herbert, A., Hansen, P.D., Genotoxicity in fish embryos. In: Microscale testing in aquatic toxicology. Boca Raton, CRC Press, pp

10 39. Pisoni, M., Cogotzi, L., Frigeri, A., Corsi, I., Bonacci, S., Iacocca, A., Lancini, L., Mastrototaro, F., Focardi, S., Svelto, M., DNA adducts, benzo(α)pyrene monooxygenase activity, and lysosomal membrane stability in Mytilus galloprovincialis from different areas in Taranto coastal waters (Italy). Environmental Research 96, Singh, N.P., McCoy, M.T., Tice, R.R., Scheider, E.L., A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research 237, Coogan, T.P., Bare, R.M., Waalkes, M.P., Cadmium-induced DNA strand damage in cultured liver cells: Reduction in cadmium genotoxicity following zinc pre-treatment. Toxicology Applied Pharmacology Anderson, D., Yu, T.W., Phillips, B.J., Schmezer, P., The effects of various antioxidants and other modifying agents on oxygen radical-generated DNA damage in human lymphocytes in the COMET assay. Mutation Research 307, Hassoun, E.A., Stohs, S.J., Cadmium-induced production of superoxide anion and nitric oxide, DNA single strand breaks and lactate dehydrogenase leakage in J774A.1 cell cultures. Toxicology 112, Pruski, A.M., Dixon, D.R., Effects of cadmium on nuclear integrity and DNA repair efficiency in the gill cells of Mytilus edulis L. Aquatic Toxicology, 57, Dailianis S., Piperakis S.M. and Kaloyianni M., Cadmium effects on ROS production and DNA damage via adrenergic receptors stimulation: role of Na + /H + exchanger and PKC. Free Radical Research 39, Olsson, P.E., Kling, P., Hogstrand C., Mechanisms of heavy metal accumulation and toxicity in fish. In: Langston, W.J., Bebianno, M.J., (Eds.), Metal metabolism in aquatic environments. Chapman & Hall, London, pp Roeva, N.N., Sidorov, A.V., Yurovitskii, Y.G., Metallothioneins, protein binding heavy metals in fish. Biological Bulletin 26, Livingstone, D.R., Pipe, R.K., Mussels and environmental contaminants: molecular and cellular aspects. In: Gosling E.,(Ed.), The mussel Mytilus: ecology, physiology, genetics and culture. Elsevier Science Publishers, pp Viarengo, A., Ponzano, E., Dondero, F., Fabbri, R., A Simple Spectrophotometric Method for Metallothionein Evaluation in Marine Organisms: an Application to Mediterranean and Antarctic Molluscs. Marine Environmental Research 44, Langston, W.J., Bebianno, M.J., Burt, G.R., Metal handling strategies in molluscs. In: Langston, W.J., Bebianno, M.J. (Eds.), Metal Metabolism in Aquatic Environments. Chapman and Hall, London, pp Mouneyrac, C., Amiard, J.C., Amiard-Triquet, C., Effects of natural factors (salinity and body weight) on cadmium, copper, zinc and metallothionein-like protein levels in resident populations of oysters Crassostrea gigas from a polluted estuary. Marine Ecology Progress Series 162, Isani, G., Andreani, G., Kindt, M., Carpene, E., Metallothioneins (MTs) in marine mollusks. Cellular and Molecular Biology 46, Lionetto, M.G., Giordano, M.E., Caricato, R., Pascariello, M.F., Marinosci, L., Schettino, T., Biomonitoring of heavy contamination along Salento coast (Italy) by metallothionein evaluation in Mytilus galloprovincialis and Mullus barbatus. Aquatic Conservation Marine and Freshwater Ecosystems 11, Petrovic, S., Ozretic, B., Krajnovic-Ozretic, M., bobinac, D., Lysosomal membrane stability and metallothionein in digestive gland of mussels (Mytilus galloprovincialis Lam.) as biomarkers in a field study. Marine Pollution bulletin 42, Raspor, B., Dragum, Z., Erk, M., Ivankovic, D., Pavii, J., Is the digestive gland of Mytilus galloprovincialis a tissue of choice for estimating cadmium exposure by means of metallothioneins? Science of the Total Environment 333, Frankenne, F., Noel-Lambot F., Disteche A., Isolation and characterization of metallothioneins from cadmium-loaded mussel Mytilus edulis. Comparative Biochemistry and Physiology C 66,

11 57. Frazier, J.M., George, S.S., Overnell, J., Coombs, T.L., Kägi, J., Characterization of two molecular weight classes of cadmium binding proteins from the mussel, Mytilus edulis (L). Comparative Biochemistry and Physiology C 80, Mackay, E.A., Overnell, J., Dunbar, B., Davidson, I., Hunziker, P.E., Kagi, J.H.R., Fothergill, J.E., Complete amino acid sequences of five dimeric and four monomeric forms of metallothionein from the edible mussel Mytilus edulis. European Journal of Biochemistry 218, Roesijadi, G., Metallothioneins in metal regulation and toxicity in aquatic animals. Aquatic Toxicology, 22, Viarengo, A., Nott, J.A., Mechanisms of heavy metal cation homeostasis in marine invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology 104C, Barka, S., Processus de detoxication et localization tissulaire des metaux traces (cuivre, zinc, nickel, cadmium, argent et mercure) chez un crustace marin Tigriopus brevicornis (Muller). Etude du biomarqueur proteines type metallothioneines, de la bioaccumulation des metaux et des consequences sur le transfert trophique. These de Doctorat, Universite de Paris 6, pp Thornally, P.J., Vasak, M., Possible role of metallothionein in protection against radiation-induced oxidative stress. Kinetics and mechanism of its reaction with superoxide and hydroxyl radicals. Biochimica et Biophysica Acta 827, Sato, M., Bremner, I., Oxygen free radicals and metallothionein. Free Radical Biol Med 14, UNEP, The MED POL biomonitoring program concerning the effects of pollutants on marine organisms along the Mediterranean coasts. UNEP (OCA) MED WG 132/3 Athens Greece. 65. UNEP/RAMOGE, Manual on the Biomarkers Recommended for the MED POL Biomonitoring Programme, UNEP, Athens. 66. Leuratti, C., Sighn, R., Lagneau, C., Farmer, P. B., Plastaras, J. P., Marnett, L.J., Shuker, D. E., Determination of malondialdehyde-induced DNA damage in human tissues using an immunoslot blot assay. Carcinogenesis 19, Tavazzi, B., Di Pierro, D., Amorini, A.M., Fazzina, G., Tuttobene, M., Giardina, B., Lazzarino, G., Energy metabolism and lipid peroxidation of human erythrocytes as a function of increased oxidative stress. Eur. J. Biochem. 267, Kaloyianni, M., Dailianis, S., Chrisikopoulou, E., Zannou, A., Koutsogiannaki, S., Alamdari, D.H., Koliakos, G., Dimitriadis, V.K., Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp. Biochem. Physiol. C, 149, Niehaus, W.G. Jr., Samuelsson, B., Formation of malonaldehyde from phospholipid arachidonate during microsomal lipid peroxidation. Eur. J. Biochem. 6, Dailianis, S., Production of superoxides and nitric oxide generation in haemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis (Lmk.), after exposure to cadmium: a possible involvement of Na + /H + exchanger in the induction of cadmium toxic effects. Fish & Shellfish Immunol. 27, Owens, C.W.I., Belcher, R.V., A colorimetric micro-method for the determination of glutathione. Biochem. J. 94, Green LC, Wagner DA, Glogowski J. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 1982; 126:

12 Ε. ΧΡΟΝΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΤΟΥ ΕΡΓΟΥ Το προτεινόμενο έργο πρόκειται να πραγματοποιηθεί με Επιστημονικό Υπεύθυνο τον Δρ. Στέφανο Νταϊλιάνη (Λέκτορα του τμήματος Βιολογίας). Το αναλυτικό βιογραφικό σημείωμα επισυνάπτεται στο Παράρτημα. Ο μεταπτυχιακός φοιτητής που θα δραστηριοποιηθεί στα πλαίσια του προτεινόμενου ερευνητικού έργου πρόκειται να επιλεγεί πριν την έναρξη της υλοποίησης του έργου. Το χρονοδιάγραμμα μέσα στο οποίο πρόκειται να υλοποιηθεί το έργο φαίνεται στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Στάδια υλοποίησης του έργου. Με διαφορετικό χρώμα απεικονίζεται η χρονική διάρκεια, μέσα στην οποία θα υλοποιηθεί το κάθε πακέτο εργασίας (ΠΕ). ΜΗΝΕΣ ΠΑΚΕΤΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕ 1: Ανάλυση φυσικοχημικών παραμέτρων των δειγμάτων. ΠΕ 1.1: Μέτρηση φυσικοχημικών παραμέτρων. ΠΕ 1.2: Μέτρηση βαρέων μετάλλων και πολυχλωριομένων διφαινυλίων (PCBs) ΠΕ 2: Έλεγχος τοξικότητας με χρήση των Artoxkit M και Thamnotoxkit F TM. ΠΕ 3: Μελέτη τοξικών επιπτώσεων του στραγγίσματος σε ιστούς του μυδιού Βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis (Lmk), με τη χρήση Βιομαρτύρων. ΠΕ 3.1: Εκτίμηση της σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης σε αιμοκύτταρα, με χρήση της χρωστικής neutral red (neutral red retention time/nrr). ΠΕ 3.2: Ανίχνευση μικροπυρήνων σε αιμοκύτταρα και κύτταρα βραγχίων. ΠΕ 3.3: Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA σε αιμοκύτταρα. ΠΕ 3.4: Προσδιορισμός των επιπέδων των μεταλλοθειονινών στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια. ΠΕ 3.5: Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, μέσω προσδιορισμού των επιπέδων της μαλονικής διαλδεϋδης (malondialdehyde/mda), στην αιμόλεμφο, τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια. ΠΕ 3.6:Προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής γλουταθειόνης στην αιμόλεμφο. ΠΕ 4: Μελέτη της επαγωγής οξειδωτικού stress σε απομονωμένα αιμοκύτταρα, μετά από έκθεση σε διαφορετικές αραιώσεις του δείγματος. ΠΕ 4.1: Εκτίμηση της πρόσληψης της χρωστικής neutral red. ΠΕ 4.2: Προσδιορισμός των ανιόντων σουπεροξειδίου και των νιτρικών οξειδίων. ΠΕ 4.3: Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, μέσω του προσδιορισμού των επιπέδων της MDA. ΥΠΟΒΟΛΗ ΕΚΘΕΣΗΣ ΠΡΟΟΔΟΥ Х Х ΥΠΟΒΟΛΗ ΤΕΛΙΚΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΠΡΟΟΔΟΥ Х 12

13 ΣΤ.ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΑΙΤΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΡΟΫΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ Η συνολική διάρκεια του έργου θα είναι 3 χρόνια. Η ανάλυση του προϋπολογισμού θα έχει ως ακολούθως: 1. ΥΠΟΤΡΟΦΙΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΙ ΦΟΙΤΗΤΕΣ (82 %) Με βάση το ύψος της χρηματοδότησης που ανέρχεται στα ετησίως για 3 χρόνια, με το 82% του προϋπολογισμού να αποδίδεται για την πληρωμή των μεταπτυχιακών φοιτητών, παρατίθεται ο παρακάτω πίνακας. ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΜΗΝΕΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ ΜΕΣΗ ΜΗΝΙΑΙΑ ΑΜΟΙΒΗ ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΔΑΠΑΝΗ Μεταπτυχιακός φοιτητής , ΣΥΝΟΛΟ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ Το ποσό με το οποίο θα καλυφθεί μέρος των αναλωσίμων και οργάνων που θα χρησιμοποιηθούν κατά τη διάρκεια του έργου δίνεται αναλυτικά στον παρακάτω πίνακα. Ο προϋπολογισμός των αναλωσίμων καθορίζεται από τον πειραματικό σχεδιασμό, κατά τον οποίο είναι απαραίτητα τόσο τα χημικά αντιδραστήρια για την περάτωση των μετρήσεων, όσο και ο πειραματικός εξοπλισμός για τη διατήρηση των οργανισμών, την έκθεσή τους, καθώς και την επακόλουθη μέτρηση των διαφόρων παραμέτρων. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΟΣΟ Χημικά αντιδραστήρια για τις αναλύσεις Αναλώσιμα εργαστηριακού εξοπλισμού και αναλυτικών οργάνων Συντήρηση ενυδρείων και αναλώσιμα ενυδρείων (φίλτρα, λάμπες 200 UV, τεχνητό θαλασσινό νερό). Φιάλες αερίων για όργανο ατομικής απορρόφησης. 500 ΣΥΝΟΛΟ ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΕΙΣ Η συμμετοχή του υποψηφίου μεταπτυχιακού φοιτητή σε ένα τουλάχιστο διεθνές συνέδριο (εξωτερικού ή εσωτερικού) κρίνεται απαραίτητη για τη δημοσιοποίηση και ανάδειξη του έργου, του πανεπιστημίου, καθώς και του πεδίου μελέτης του έργου. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΟΣΟ Συμμετοχές σε συνέδρια (1 εσωτερικού και 1 εξωτερικού) 1500 Μετακινήσεις για συλλογή στραγγισμάτων και μυδιών. 100 ΣΥΝΟΛΟ 1600 ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΔΑΠΑΝΗ ΕΡΓΟΥ

14 Ζ. ΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗΣ ΟΜΑΔΑΣ ΚΑΙ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗ ΚΑΘΕ ΜΕΛΟΥΣ (Επισυνάπτονται πλήρη βιογραφικά) Ο μεταπτυχιακός φοιτητής που θα δραστηριοποιηθεί στα πλαίσια του προτεινόμενου ερευνητικού έργου πρόκειται να επιλεγεί πριν την έναρξη της υλοποίησης του έργου. Το πλήρες βιογραφικό σημείωμα του επιστημονικού υπευθύνου επισυνάπτεται στο Παράρτημα. Η. ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΤΕΛΕΥΤΑΙΑΣ ΤΡΙΕΤΙΑΣ Δεν υπάρχουν προγράμματα κατά τη διάρκεια της συγκεκριμένης χρονικής περιόδου. 14

15 Προσωπικά στοιχεία Βιογραφικό Επιστημονικού Υπευθύνου Επώνυμο ΝΤΑΙΛΙΑΝΗΣ Όνομα ΣΤΕΦΑΝΟΣ Θέση στο Ίδρυμα ΛΕΚΤΟΡΑΣ Τμήμα ΒΙΟΛΟΓΙΑ Τηλέφωνο επικοινωνίας Έτος Ίδρυμα Τίτλος (πτυχίο, διδακτορικό) 2000 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ-ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2005 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ-ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑ PhD ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Κύρια ερευνητική δραστηριότητα Υδατική τοξικολογία ζωικών οργανισμών. Προσδιορισμός βαρέων μετάλλων και οργανικών στους ιστούς θαλάσσιων οργανισμών και στην υδάτινη μάζα. Μέτρηση φυσικοχημικών χαρακτηριστικών υγρών. Παρακολούθηση της θαλάσσιας ρύπανσης με χρήση οργανισμών Βιοενδεικτών. Μελέτη νέων Βιομαρτύρων της θαλάσσιας ρύπανσης. Μελέτη της επαγωγής οξειδωτικού stress, μετά από έκθεση σε ρυπογόνους παράγοντες. Συμμετοχή σηματοδοτικών μηχανισμών. Μελέτη της δράσης τοξικών παραγόντων (ανόργανων και οργανικών) ως ενδοκρινικοί αποδιοργανωτές/ endocrine disrupters) σε κύτταρα και η συμμετοχή τους στην επαγωγή σηματοδοτικών μηχανισμών. Μελέτη της επαγωγής βλαβών του DNA, μετά από έκθεση κυττάρων σε ρυπογόνους παράγοντες. Μελέτη κυτταρικού θανάτου (απόπτωση, νέκρωση) σε κύτταρα θαλάσσιων οργανισμών, ως απόκριση στην επίδραση ρυπογόνων παραγόντων. Επιστημονικές εργασίες τα τελευταία 7 χρόνια (σε διεθνή περιοδικά με κριτές) 1. Dailianis S., Domouhtsidou G.P., Raftopoulou E., Kaloyianni M. and Dimitriadis V.K. (2003). Evaluation of neutral red retention assay, micronucleus test, acetylcholinesterase activity and a signal transduction molecule (camp) in tissues of Mytilus galloprovincialis (L.) in pollution monitoring. Marine Environmental Research, 56: (Cited 47 15

16 times). 2. Domouhtsidou G.P., Dailianis S., Kaloyianni M. and Dimitriadis V.K. (2004). Lysosomal membrane stability and metallothionein content in Mytilus galloprovincialis (L.), as biomarkers. Combination with trace metal concentrations. Marine Pollution Bulletin, 48: Dailianis S. and Kaloyianni M. (2004). Cadmium induces both pyruvate kinase and Na + /H + exchanger activity through protein kinase C mediated signal transduction, in isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis (L.). The Journal of Experimental Biology, 207: Dailianis S., Piperakis S.M. and Kaloyianni M. (2005). Cadmium effects on ROS production and DNA damage via adrenergic receptors stimulation: role of Na + /H + exchanger and PKC. Free Radical Research 39(10): Kaloyianni M., Stamatiou R. and Dailianis S. (2005). Zinc and 17β-estradiol induce modifications in Na + /H + exchanger and pyruvate kinase activity through protein kinase C in isolated mantle/gonad cells of Mytilus galloprovincialis. Comparative Biochemistry and Physiology C, 141: Kaloyianni Μ., Ragia V., Tzeranaki I. and Dailianis S. (2006). The influence of Zn on signaling pathways and attachment of Mytilus haemocytes to extracellular matrix proteins. Comparative Biochemistry and Physiology C, 144 (1): Raftopoulou E., Dailianis S., Dimitriadis V. and Kaloyianni M. (2006). Introduction of camp and establishment of neutral lipids alterations as pollution Biomarkers using the mussel Mytilus galloprovincialis. Correlation with a battery of Biomarkers. The Science of the Total Environment, 368: Dailianis S. and Kaloyianni M. (2007). Role of camp in tissues of mussel Mytilus galloprovincialis as a potent Biomarker of cadmium in marine environments. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,52: M. Kaloyianni, M., Dailianis, S*., Chrisikopoulou, E., Zannou, A., Koutsogiannaki, S., Alamdari, D.H., Koliakos, G. and Dimitriadis, V.K. (2009). Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comparative Biochemistry and Physiology C, 149: Dailianis, S*., Patetsini, E., Kaloyianni, M. (2009). The role of signaling molecules on actin glutathionylation and protein carbonylation induced by cadmium, in haemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis (Lmk). The Journal of Experimental Biology 212: Dailianis S*. (2009). Production of superoxides and nitric oxide generation in haemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis (Lmk.), after exposure to cadmium: a possible involvement of Na + /H + exchanger in the induction of cadmium toxic effects. Fish & Shellfish Immunology 27: Επιστημονικές εργασίες στο αντικείμενο της πρότασης τα τελευταία 10 χρόνια (σε διεθνή περιοδικά με κριτές, συμπεριλαμβανομένων σχετικών επίσης διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας, βιβλίων, βραβείων, κ.ά.) Dailianis S., Domouhtsidou G.P., Raftopoulou E., Kaloyianni M. and Dimitriadis V.K. (2003). Evaluation of neutral red retention assay, micronucleus test, acetylcholinesterase activity and a signal transduction molecule (camp) in tissues of Mytilus galloprovincialis (L.) in pollution monitoring. Marine Environmental Research, 56: Domouhtsidou G.P., Dailianis S., Kaloyianni M. and Dimitriadis V.K. (2004). Lysosomal membrane stability and metallothionein content in Mytilus galloprovincialis (L.), as biomarkers. Combination with trace metal concentrations. Marine Pollution Bulletin, 48: