ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 Εισαγωγή ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΟ ΟΡΥΦΟΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΑΚΟ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ, BACTROCERA OLEAE ΚΑΙ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΤΟΥ ΕΙ ΟΥΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΥ ΑΥΓΟΥΣΤΙΝΟΥ ΑΝΤΩΝΙΟΥ ΠΑΤΡΑ

2 Εισαγωγή Τριµελής συµβουλευτική επιτροπή Ζαχαροπούλου Αντιγόνη Μίντζας Αναστάσιος Ματθιόπουλος Κωνσταντίνος Καθηγήτρια Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Αναπληρωτής καθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Τµήµα Βιοχηµείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας Επταµελής κριτική επιτροπή Ζαχαροπούλου Αντιγόνη Αλλαχιώτης Σταµάτης Σκούρας Ζαχαρίας Μίντζας Αναστάσιος Ματθιόπουλος Κωνσταντίνος Μπούρτζης Κωνσταντίνος Κίλιας Γεώργιος Καθηγήτρια Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Καθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Καθηγητής Τµήµα Βιολογίας Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αναπληρωτής καθηγητής Τµήµα, Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Τµήµα Βιοχηµείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας Επίκουρος καθηγητής Τµήµα ιαχείρισης Περιβάλλοντος & Φυσικών Πόρων Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων Επίκουρος καθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών 2

3 Εισαγωγή Πρόλογος Η παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του τοµέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών κατά τα χρονικά έτη υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας κυρίας Ζαχαροπούλου Αντιγόνης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την καθηγήτρια κυρία Ζαχαροπούλου Αντιγόνη διότι το λιγότερο από όσα έκανε ήταν να µου προσφέρει την ευκαιρία να ανακαλύψω την έρευνα στο εργαστήριό της µέσα από τη δυνατότητα που µου έδωσε να εκπονήσω αρχικά τη διπλωµατική µου εργασία και ακολούθως την παρούσα διδακτορική διατριβή. Από εκεί και πέρα ήταν πάντα δίπλα µου για ότι χρειάστηκα και πάντα συνεπής σε ότι είπε. Τη θεωρώ τόσο δάσκαλό µου, όσο και φίλη µου. Ευχαριστώ τον επίκουρο καθηγητή κύριο Ματθιόπουλο Κωνσταντίνο, ο οποίος µε µύησε στον κόσµο της µοριακής Βιολογίας και ειδικά γιατί µου έδειξε την φαντασία στην επιστήµη. Περισσότερο από όλα γιατί τον θεωρώ πραγµατικό φίλο µε τον οποίο θα µπορούσα να συζητήσω οτιδήποτε. Ο αναπληρωτής καθηγητής κύριος Μίτζας Αναστάσιος ήταν πάντα παρόν όταν τον χρειάστηκα για οποιαδήποτε εργαστηριακή ανάγκη, ενώ το κλίµα που πάντα δηµιουργούσε ήταν αυτό που έκανε οµορφότερες τις άπειρες ώρες της εργαστηριακής δουλειάς. Ο επίκουρος καθηγητής κύριος Κίλιας Γεώργιος µου έδωσε πολύτιµες συµβουλές για θέµατα πληθυσµιακής Γενετικής, ενώ ήταν πάντα εύκαιρος για οποιαδήποτε συζήτηση. Θέλω να ευχαριστήσω τους καθηγητές κυρίους Αλλαχιώτη Σταµάτη και Σκούρα Ζαχαρία, καθώς και τον αναπληρωτή καθηγητή κύριο Μπούρτζη Κωνσταντίνο, για την τιµή που µου έκαναν να είναι µέλη της κριτικής επιτροπής και για τις πολύτιµες διορθώσεις και παρατηρήσεις τους. Οι τότε µεταπτυχιακές φοιτήτριες Γουρζή Πολυξένη και Αγγελική Παπαλεξίου Γαρίου µε βοήθησαν στο ξεκίνηµα, όταν εκπόνησα τη διπλωµατική µου εργασία ως τεταρτοετής φοιτητής. Ο Ηλίας ο Στρατικόπουλος ήταν συνοδοιπόρος και καλός συνεργάτης στα χρόνια που διάρκεσε αυτή η εργασία και καλός φίλος πολύ νωρίτερα. Καλοί φίλοι όλα αυτά τα χρόνια, όπως ο Πολυκράτης Απόστολος και η Θεοδωράκη Μαρία συνεισέφεραν µε τον τρόπο τους και τους ευχαριστώ. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Παρασκευή Πούλου, µε την οποία µοιραζόµαστε κοινά όνειρα και φιλοδοξίες και ήταν πάντα δίπλα µου να µε στηρίζει στις, λίγες ευτυχώς, δύσκολες στιγµές. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς µου. Χωρίς τη δική τους στήριξη η εργασία αυτή πιθανότατα δεν θα είχε πραγµατοποιηθεί. Η παρούσα εργασία χρηµατοδοτήθηκε από το πρόγραµµα ΠΕΝΕ Ε -529 και τη Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστηµίου Πατρών. Επίσης κατά τα έτη ενισχύθηκα οικονοµικά από υποτροφία του Ι.Κ.Υ, το οποίο και ευχαριστώ. 3

4 Εισαγωγή I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...4 Α. Ο δάκος της ελιάς...5 A.1 Συστηµατική κατάταξη...5 A.2 Περιγραφή του εντόµου...5 Α.3 Προέλευση και εξάπλωση του είδους...6 A.4 Βιολογικός κύκλος...8 Α.5 ιατροφή...9 Α.6 Αναπαραγωγή...9 Α.7. Οικονοµική σηµασία του εντόµου...11 Α.7.1 Σηµασία της ελιάς...12 Α.7.2 Προσβολή του καρπού από το έντοµο...13 Α.8 Έλεγχος φυσικών πληθυσµών του εντόµου...14 Α.8.1 Παρακολούθηση φυσικών πληθυσµών...15 Α.8.2 Χρήση χηµικών εντοµοκτόνων...15 A.8.3 Βιολογικός έλεγχος...16 Α.8.4 Εναλλακτικές µέθοδοι ελέγχου...18 Α.8.5 Σηµερινή κατάσταση...20 Α.9 Γενετική του δάκου...20 Β. Πληθυσµιακή ανάλυση...24 Β.1 Ποικιλότητα φυσικών πληθυσµών...24 Β.2 Έλεγχος ισορροπίας ενός πληθυσµού Νόµος Hardy-Weinberg...24 Β.3 Προϋποθέσεις για την ισχύ του νόµου Hardy-Weinberg...25 Β.4 είκτες που χρησιµοποιούνται στην πληθυσµιακή ανάλυση...26 Β.4.1 Μέτρηση γενετικής ποικιλότητας...27 Β.4.2 Έλεγχος ισορροπίας πληθυσµού...27 Β.5 Εργαλεία για τη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας...28 Β.5.1 Βιοχηµικοί πολυµορφισµοί...28 Β.5.2 DNA δείκτες...29 Γ. Οι µικροδορυφόροι...34 Γ.1 Τι είναι οι µικροδορυφόροι - Γενικά...34 Γ.2 Εφαρµογές των µικροδορυφόρων στη σύγχρονη έρευνα...35 Γ.3 ιασπορά των µικροδορυφόρων στο γονιδίωµα...36 Γ.3.1 Μη τυχαία διασπορά των µικροδορυφόρων...37 Γ.3.2 Ρόλος των µικροδορυφόρων...40 Γ Οργάνωση χρωµατίνης...40 Γ Ρύθµιση µεταβολικών διεργασιών του DNA...42 Γ Ρύθµιση της γονιδιακής δραστηριότητας...44 Γ Ρόλος των µικροδορυφόρων σε διάφορες γενετικές ασθένειες...47 Γ.4 Μηχανισµοί µεταλλαξιγένεσης...49 Γ4.1 Γλίστρηµα του DNA κατά την αντιγραφή...50 Γ.4.2 Ανασυνδυασµός...52 Γ.4.3 Αλληλεπίδραση γλιστρήµατος DNA και ανασυνδυασµού...53 Σκοπός της διατριβής...55 ΙΙ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ.56 Βιολογικό υλικό...57 Α. Εργαστηριακή καλλιέργεια του εντόµου Bactrocera oleae

5 Εισαγωγή A1 ιατήρηση καλλιέργειας ενηλίκων ατόµων...58 A2 Τροφή ενηλίκων...59 Α3 Κώνοι ωοαπόθεσης - Συλλογή αυγών...59 Α4 Τροφή προνυµφών...62 B. Αποµόνωση µικροδορυφορικών δεικτών για το έντοµο Β. oleae...64 Β1 Αποµόνωση και επεξεργασία γονιδιωµατικού DNA...64 Β1.1 Αποµόνωση και καθαρισµός ολικού γονιδιωµατικού DNA...64 Β.1.2 Ηλεκτροφόρηση ολικού γονιδιωµατικού DNA σε πήκτωµα αγαρόζης...65 Β.2 Κατασκευή και διαλογή γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών...66 Β.2.1 Κατασκευή γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών (απλών)...67 Β Πέψη γονιδιωµατικού DNA µε ένζυµα περιορισµού...67 Β Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης σε πήκτωµα αγαρόζης...68 B Αποµόνωση DNA µεγέθους bp...68 B2.1.4 Πέψη φορέα κλωνοποίησης µε ένζυµα περιορισµού...69 B2.1.5 Αποφωσφορυλίωση φορέα κλωνοποίησης...70 B2.1.6 Αντίδραση σύνδεσης...70 B2.1.7 Προετοιµασία δεκτικών κυττάρων...71 B Προετοιµασία δεκτικών κυττάρων για χηµικό µετασχηµατισµό...72 B Προετοιµασία δεκτικών κυττάρων για ηλεκτροδιάτρηση...72 B2.1.8 Μετασχηµατισµός δεκτικών κυττάρων...73 B Μετασχηµατισµός δεκτικών κυττάρων µε τη χηµική µέθοδο...74 B Μετασχηµατισµός µε ηλεκτροδιάτρηση...75 B2.1.9 ιαλογή γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών...75 B Σήµανση ανιχνευτών...75 B ηµιουργία αντιγράφων αποικιών...76 B Λύση των αποικιών και δέσµευση του πλασµιδιακού DNA...77 B Υβριδοποίηση µεµβρανών ανιχνευτών...78 B Αποµόνωση θετικών αποικιών...79 B εύτερη διαλογή...79 Β Αραίωση θετικών αποικιών...79 B2.2 Κατασκευή εµπλουτισµένων βιβλιοθηκών...80 B2.2.1 Προετοιµασία συνδετών...81 B2.2.2 ηµιουργία φίλτρων µε ακινητοποιηµένα ολιγονουκλεοτίδια (ανιχνευτές)83 B2.2.3 Επιλογή κοµµατιών DNA µεγέθους ζευγών βάσεων...84 B2.2.4 Ενίσχυση γονιδιωµατικών θραυσµάτων...85 B2.2.5 Επιλογή κοµµατιών DNA που περιέχουν µικροδορυφορικές αλληλουχίες 86 B2.2.6 Νέα PCR-ενίσχυση των γονιδιωµατικών θραυσµάτων...88 B2.2.7 Κλωνοποίηση των επιλεγµένων κοµµατιών DNA...89 B Κλωνοποίηση χωρίς την αποµάκρυνση των συνδετών...89 B Κλωνοποίηση µε αποµάκρυνση των συνδετών...89 Β3 Χαρακτηρισµός αποικιών...91 B3.1 Καλλιέργεια αποµονωµένων αποικιών...91 B3.2 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA...91 B3.2.1 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µε αλκαλική λύση...92 B3.2.2 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µε τη χρήση του kit Wizard TM Miniprep 92 B3.3 Πέψη πλασµιδιακού DNA µε ένζυµα περιορισµού...93 B3.4 Μεταφορά DNA σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης (Southern)

6 Εισαγωγή Β3.5 Προσδιορισµός της πρωτοδιάταξης του DNA...95 Β3.5.1 Αντιδράσεις ανάλυσης της πρωτοδιάταξης...95 Β3.5.2 Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των αντιδράσεων...98 Γ. Σχεδιασµός - έλεγχος λειτουργικότητας εκκινητών και διαειδική ενίσχυση Γ1 Σχεδιασµός ζευγών εκκινητών Γ2 Έλεγχος λειτουργικότητας ζευγών εκκινητών µέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (PCR) Γ3 Ανάλυση PCR προϊόντων σε πήκτωµα αγαρόζης Γ4 ια-ειδική ενίσχυση και έλεγχος PCR προϊόντων Γενοτυπική ανάλυση Συλλογή δειγµάτων φυσικών πληθυσµών Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA από ένα άτοµο (single fly) PCR ενίσχυση µε χρήση σηµασµένων εκκινητών Ηλεκτροφόρηση PCR προϊόντων σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου Επεξεργασία αποτελεσµάτων γενοτυπικής ανάλυσης Ε. Παράρτηµα διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν ΙΙΙ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ..113 Α. Αποµόνωση µικροδορυφορικών δεικτών Α1 Αποµόνωση µικροδορυφορικών δεικτών από γονιδιωµατικές βιβλιοθήκες..114 A1.1 Κατασκευή γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών A1.2 ιαλογή γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών Α1.3 Χαρακτηρισµός θετικών αποικιών Α.1.4 Σχεδιασµός και έλεγχος λειτουργίας εκκινητών Α2 Αποµόνωση µικροδορυφορικών δεικτών από εµπλουτισµένες βιβλιοθήκες.126 A2.1 Κατασκευή εµπλουτισµένων βιβλιοθηκών Α2.2 Χαρακτηρισµός τυχαία επιλεγµένων κλώνων Α.2.3 Σχεδίαση ζευγών εκκινητών και έλεγχος λειτουργίας Α3 Αποµόνωση µικροδορυφορικών δεικτών µέσω δια-ειδικής ενίσχυσης Β. Έλεγχος ποιότητας µικροδορυφορικών δεικτών Γ. Ανάλυση της γενετικής δοµής φυσικών και εργαστηριακών πληθυσµών δάκου.147 Γ.1 Προκαταρκτική ανάλυση Γ.2 Πληθυσµιακή ανάλυση µεγάλης κλίµακας Γ.3 Σύγκριση φυσικών και εργαστηριακών πληθυσµών Ανάλυση πολυµορφισµού ατόµων από ατοµικές διασταυρώσεις Ε. ια-ειδική ενίσχυση ΣΤ. Σύγκριση αλληλουχιών µε γνωστές αλληλουχίες IV. ΣΥΖΗΤΗΣΗ..184 Συµπεράσµατα - Προοπτικές V. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 204 V. SUMMARY.207 VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ VII. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ.240 3

7 4 Εισαγωγή

8 Εισαγωγή Α. Ο δάκος της ελιάς A.1 Συστηµατική κατάταξη Ο δάκος της ελιάς (επιστηµονική ονοµασία Bactrocera oleae) είναι ένα ολοµετάβολο έντοµο που ανήκει στην οικογένεια Tephritidae (τάξη: ίπτερα). Αναλυτικά, η συστηµατική του κατάταξη έχει ως εξής: Οµοταξία: Τάξη: Οικογένεια: Υποοικογένεια: Φυλή: Γένος: Είδος: Εντοµα Diptera Tephritidae Dacinae Dacini Bactrocera Bactrocera oleae Η οικογένεια Tephritidae περιλαµβάνει είδη µεγάλης οικονοµικής σηµασίας, τα οποία αποτελούν παράσιτα σηµαντικών γεωργικών καλλιεργειών. Ειδικά το γένος Bactrocera περιλαµβάνει 28 υπογένη µε συνολικά περίπου 500 διαφορετικά είδη (Drew, 1989; Drew and Hancock, 1994; Drew and Hancock, 2000), πολλά από τα οποία αποτελούν σηµαντικά γεωργικά παράσιτα. Ενδεικτικά, µερικά από αυτά είναι τα είδη Bactrocera tryoni, B. dorsalis και B. cucurbitae, που προσβάλουν ποικιλίες φρούτων (White and Elson-Harris, 1992), όπως επίσης και το είδος B. oleae που αποτελεί το κύριο παράσιτο του καρπού της ελιάς, προκαλώντας µεγάλες οικονοµικές απώλειες (Montiel-Bueno and Jones, 2002). A.2 Περιγραφή του εντόµου Το ενήλικο άτοµο είναι µια µύγα µήκους 4-5 mm και µε άνοιγµα πτερύγων 12 mm (Εικόνα 1). Το κεφάλι είναι κοκκινωπό προς κίτρινο, µε πιο απαλή απόχρωση στο µπροστινό µέρος και έχει δύο µαύρα σηµάδια πάνω από τις κεραίες. Ο θώρακας είναι επίσης κοκκινωπός προς το κίτρινο και χαρακτηρίζεται από τέσσερις κάθετες γκρι ζώνες. Η κοιλιά έχει το ίδιο χρώµα µε το κεφάλι στην κεντρική της περιοχή, προς τα πλάγια όµως αποκτά µαύρο χρώµα. Στα 5

9 Εισαγωγή θηλυκά άτοµα, η κοιλιά καταλήγει σε ωοαποθέτη, µαύρου χρώµατος και µεγάλου µήκους. Τα φτερά είναι διαφανή και έχουν από µία µαύρη κηλίδα στο άκρο τους. Τα πόδια είναι ιδίου χρώµατος µε το κεφάλι. Το αυγά του είναι άσπρου χρώµατος, επιµήκη, µε µήκος 0,7 mm και διάµετρο 0,2 mm (Εικόνα 2). Η προνύµφη είναι λευκόχρωµη, προς το τέλος της ανάπτυξής της έχει µήκος 7 mm, το κεφάλι της είναι τραπεζοειδές και στο πρόσθιο άκρο της φέρει δύο τριµερείς κεραίες (Εικόνα 3). Το βοµβύκιο είναι ωοειδές, το χρώµα του ποικίλει από απαλό κίτρινο ως καφέ και το µήκος του είναι 4-4,5 mm περίπου (Εικόνα 4). Α.3 Προέλευση και εξάπλωση του είδους Η εξάπλωση του δάκου της ελιάς είναι συνυφασµένη µε τις περιοχές καλλιέργειας της ελιάς και για αυτό απαντάται σε όλες τις µεσογειακές χώρες. Ανατολικά εκτείνεται ως την Ινδία και δυτικά ως τις Κανάριες νήσους. Τα τελευταία χρόνια η καλλιέργεια της ελιάς έχει εξαπλωθεί και σε άλλες περιοχές, όπως στη Βόρεια και Κεντρική Αµερική (Καλιφόρνια, 6

10 Εισαγωγή Αριζόνα, Μεξικό και Ελ Σαλβαδόρ), στη Νότια Αµερική (Αργεντινή, Χιλή, Περού, Ουρουγουάη), στην κεντρική Ασία (Κίνα) και την Αυστραλία. Ο δάκος της ελιάς έχει εισβάλλει σε όλες αυτές τις περιοχές πλην της Αυστραλίας (Rice, 2000). Στον Χάρτη 1 φαίνεται η παγκόσµια εξάπλωση της καλλιέργειας της ελιάς και στο Χάρτη 2 η ζώνη καλλιέργειάς της στη Μεσόγειο. Η προέλευση και ο τρόπος εξάπλωσης του είδους δεν έχουν µελετηθεί συστηµατικά. Είναι σίγουρο ότι ο δάκος και η ελιά έχουν ακολουθήσει παράλληλη και άρρηκτα συνδεδεµένη πορεία για πάρα πολλά χρόνια, µε κύριο αίτιο την αποκλειστική εξάρτηση που έχουν από τον καρπό της ελιάς οι προνύµφες του είδους. Ήδη από τον 3 ο αιώνα π.χ. υπάρχουν µαρτυρίες για την προσβολή του ελαιοκάρπου από το δάκο στην περιοχή της Μεσογείου ( ήµου ΙΕ, διδακτορική διατριβή). Η γεωγραφική διασπορά πολλών συγγενικών ειδών στην περιοχή της Ινδίας αποτελεί µια ένδειξη για την πιθανή περιοχή της πρώτης εµφάνισης του είδους, αν και σήµερα εµφανίζει έλλειψη ελαιοδέντρων (Goulielmos et al., 2003). 7

11 Εισαγωγή A.4 Βιολογικός κύκλος Ως ολοµετάβολο έντοµο, ο δάκος υπόκειται σε µια σειρά αλλαγών που ξεκινούν από το έµβρυο, συνεχίζουν µε την προνύµφη που έχει τρία ενδιάµεσα στάδια, ακολουθεί το βοµβύκιο και ο κύκλος ολοκληρώνεται µε το ενήλικο άτοµο. Το στάδιο του εµβρύου: Η διάρκεια όλων των σταδίων ανάπτυξης επηρεάζεται πάρα πολύ από τη θερµοκρασία. Κάτω από σταθερές εργαστηριακές συνθήκες, η εµβρυογένεση ποικίλει από δέκα ηµέρες στους 10 o C ως δύο ηµέρες στους 32,5 o C. Η πιο γρήγορη εκκόλαψη των εµβρύων (2,5 ηµέρες) παρατηρείται στους 27,5-30 o C (Tsitsipis, 1977). Το χαµηλότερο όριο για την εκκόλαψη βρίσκεται στους 6-10 o C, ενώ το υψηλότερο όριο βρίσκεται στους o C. Ως βέλτιστη θερµοκρασία όµως θεωρούνται οι 27,5 o C (Crovetti et al., 1981; Fletcher and Kapatos, 1983; Girolami, 1979; Tsiripoulos, 1972; Tsitsipis, 1977). Στη φύση, η περίοδος εκκόλαψης ποικίλει από 2-4 ηµέρες το καλοκαίρι, 4-10 ηµέρες το φθινόπωρο, ως και ηµέρες στο τέλος του φθινοπώρου και το χειµώνα (Martelli, 1908; 1965; Martin, 1948; Silvestri, 1914). Προνυµφικό στάδιο: Κάτω από σταθερές εργαστηριακές συνθήκες, η διάρκεια του προνυµφικού σταδίου ποικίλει µεταξύ 37 ηµερών στους 12,5 o C και εννέα ηµερών στους 30 o C. Ο καλύτερος ρυθµός ανάπτυξης παρατηρείται µεταξύ 25 και 27,5 o C, ενώ το χαµηλότερο όριο για την ανάπτυξη είναι 6-11 o C (Crovetti et al., 1982; Fletcher and Kapatos, 1983; Girolami, 1979; Tsitsipis, 1980). Στη φύση, η ανάπτυξη της προνύµφης επηρεάζεται από την περιεκτικότητα του ελαιοκάρπου σε λάδι και το βαθµό ωρίµανσης του καρπού, όπως επίσης και από τη θερµοκρασία. Έχει παρατηρηθεί σε εργαστηριακές συνθήκες ότι η διάρκεια της προνυµφικής ανάπτυξης είναι, γενικά, µια ηµέρα µικρότερη στις µαύρες ελιές από ότι στις πράσινες (Tzanakakis, 1971). Σε προνύµφες που αναπτύχθηκαν σε καρπούς στη φύση, η ανάπτυξη ολοκληρώθηκε σε ηµέρες το φθινόπωρο, σε 63 και πάνω ηµέρες το χειµώνα και σε περίπου 20 ηµέρες την άνοιξη (Fletcher and Kapatos, 1983). Η διαφορά στη διάρκεια της ανάπτυξης που παρατηρείται µεταξύ φθινοπώρου και άνοιξης αποδίδεται στην ωρίµανση του καρπού, που αποτελεί καλύτερο υπόστρωµα για την προνύµφη (Neuenschwander and Michelakis 1979). 8

12 Εισαγωγή Το στάδιο του βοµβυκίου: Ο χρόνος που απαιτείται για την ολοκλήρωση της ανάπτυξης του βοµβυκίου ποικίλει από 48,6 ηµέρες στους 12,5 o C, ως 9,3 ηµέρες στους 30 o C, κάτω από σταθερές εργαστηριακές συνθήκες. Η βέλτιστη θερµοκρασία είναι στους 22,5-25 o C. Το χαµηλότερο όριο για την ανάπτυξη είναι στους 6-10 o C, ενώ το υψηλότερο όριο είναι στους o C (Crovetti et al., 1979; Fletcher and Kapatos, 1983; Girolami, 1979; Neuenschwander et al., 1986; Tsitsipis, 1980). Τα βοµβύκια στη φύση (στο έδαφος και σε καρπούς) ολοκληρώνουν την ανάπτυξή τους σε 16 ηµέρες το καλοκαίρι, ηµέρες το φθινόπωρο, ηµέρες το χειµώνα και ηµέρες την άνοιξη (Fletcher and Kapatos, 1983). Α.5 ιατροφή Τα ενήλικα τρέφονται από πολλά διαφορετικά φυτά και αξιοποιούν πολλές διαφορετικές πηγές ενέργειας, όπως χυµούς που εκκρίνονται από φρούτα, φύλλα και πληγές βλαστών, από µελίτωµα φυτών και νέκταρ. Στο εργαστήριο, για να υπάρχει κανονική παραγωγή αυγών χρειάζονται πηγή πρωτεϊνών και κυρίως ελεύθερα αµινοξέα. Στη φύση, τα θηλυκά άτοµα του είδους µπορούν να επιβιώσουν χρησιµοποιώντας γύρη ως πηγή πρωτεϊνών, αν και ιχνοστοιχεία και βιταµίνες είναι επίσης απαραίτητα (Fytizas, 1973a; Sacantanis, 1953; Severin, 1915; Tsiropoulos, 1980). Οι προνύµφες του δάκου στη φύση είναι µονοφάγες, αυστηρά περιορισµένες στο εσωτερικό του καρπού της ελιάς. Απαραίτητα για την ανάπτυξη των νεαρών προνυµφών στο µεσοκάρπιο είναι διάφορα συµβιωτικά βακτήρια, τα οποία συµβάλλουν στην ενζυµατική υδρόλυση των πρωτεϊνών του ελαιοκάρπου (Hagen, 1966; Tzanakakis and Stavrinides, 1973). Α.6 Αναπαραγωγή Σπερµατογένεση: Η σπερµατογένεση στα αρσενικά του είδους ξεκινάει ήδη πριν το στάδιο του βοµβυκίου και συνεχίζεται σε όλη τη διάρκεια του σταδίου, χωρίς όµως να ολοκληρωθεί. Η ωρίµανση των γεννητικών οργάνων ολοκληρώνεται περίπου τέσσερις ηµέρες µετά την εκκόλαψη του ενηλίκου ατόµου από το βοµβύκιο (Fytizas, 1973b). Η σπερµατογένεση επαναλαµβάνεται σε κύκλους των επτά ως δέκα ηµερών κατά τη διάρκεια της ζωής του ενηλίκου, συνεπώς τα σπερµατοζωάρια αντικαθίστανται και αποφεύγεται ο κίνδυνος εξάντλησής τους που µπορεί να προκύψει µετά από τρεις ως εννέα συζεύξεις. 9

13 Εισαγωγή Ωογένεση: Η ωογένεση αρχίζει και τελειώνει περίπου µε την εκκόλαψη του ενηλίκου από το βοµβύκιο. Σε εργαστηριακές συνθήκες, τα πρώτα ωάρια σχηµατίζονται έξι ως οκτώ ηµέρες µετά την εκκόλαψη του θηλυκού ατόµου από το βοµβύκιο (Fytizas and Bacoyannis, 1970). Σεξουαλική προσέλκυση: Η σεξουαλική προσέλκυση µέσω οσφρητικών ερεθισµάτων έχει δειχτεί σε εργαστηριακά πειράµατα, καθώς και σε πειράµατα πεδίου (Haniotakis, 1974; 1977). Σταγόνες µιας κίτρινης ελαιώδους ουσίας παράγονται από εκκριτικά κύτταρα των αναπαραγωγικά ώριµων ατόµων και στα δύο φύλα (Economopoulos et al., 1971). Τα ώριµα θηλυκά απελευθερώνουν και ένα µίγµα φεροµονών που προσελκύει τα αρσενικά άτοµα. Η απελευθέρωση των φεροµονών αρχίζει από την τρίτη µέρα ζωής του τέλειου εντόµου και από εκεί και πέρα συνεχίζεται σε κύκλους των δέκα ηµερών. Τα αρσενικά µπορούν να αποκριθούν στη φεροµόνη από την τρίτη µέρα της ζωής τους ως τέλεια έντοµα, όµως συνήθως αποκρίνονται µεταξύ έβδοµης και ενδέκατης ηµέρας. Σύζευξη: Στη φύση, η προσέλκυση και η σύζευξη γίνονται κατά το τέλος της ηµέρας (Cavalloro and Delrio, 1970) και καθορίζεται από έναν ενδογενή ρυθµό (Loher and Zervas, 1979). Η σεξουαλική ωριµότητα και στα δύο φύλα σηµατοδοτείται από αυξηµένη κινητική δραστηριότητα, τρίψιµο των ποδιών στην κοιλιά, στα φτερά, στο κεφάλι, στις κεραίες και µεταξύ τους, καθώς και δονήσεις των φτερών στα αρσενικά άτοµα (Economopoulos et al., 1971). Τα θηλυκά ζευγαρώνουν µία ως δύο ηµέρες πριν την εµφάνιση των αυγών στις ωοθήκες. Τα αρσενικά ωριµάζουν µία ως δύο µέρες νωρίτερα από τα θηλυκά (Zervas, 1985). Η µέση διάρκεια της σύζευξης είναι περίπου 2,5 ώρες (Economopoulos et al., 1976). Τα αρσενικά είναι πολυγαµικά και ζευγαρώνουν περίπου µία φορά την ηµέρα, ενώ τα θηλυκά είναι ολιγογαµικά και σπάνια ζευγαρώνουν πάνω από δύο φορές στην διάρκεια της ζωής τους. Μετά τη σύζευξη, τα θηλυκά δεν είναι δεκτικά σε νέα σύζευξη για ηµέρες. Αυτό παρατηρείται και σε άλλα είδη ιπτέρων και αποδίδεται σε συστατικά του σπέρµατος (Tzanakakis et al., 1968). Γονιµότητα Ωοαπόθεση: Η ποιότητα της τροφής, καθώς και η ένταση του φωτός επηρεάζουν πολύ το ρυθµό ωοαπόθεσης (Economopoulos and Tzanakakis, 1967; Tzanakakis 10

14 Εισαγωγή et al., 1967). Η σύζευξη επίσης επάγει την παραγωγή αυγών, παρότι η µεταφορά σπερµατοζωαρίων δεν πρέπει να είναι ο κύριος παράγοντας για αυτό (Cavalloro and Delrio, 1970; Economopoulos et al., 1976). Στο εργαστήριο, η γονιµότητα των θηλυκών µπορεί να είναι και 470 αυγά ανά θηλυκό άτοµο που έχει ζευγαρώσει µία φορά. Στη φύση, η γονιµότητα επηρεάζεται από τις κλιµατικές συνθήκες, την διαθεσιµότητα σε καρπό ελιάς και την κατάσταση των θηλυκών ατόµων, η οποία εξαρτάται από τη διατροφή τους. Οι θερµοκρασίες µεταξύ o C είναι βέλτιστες για την ωοαπόθεση. Σε θερµοκρασίες πάνω από 35 o C και κάτω από 15 o C η ωοαπόθεση σταµατάει (Kapatos, 1981). Από πειράµατα που έχουν γίνει στον ελλαδικό χώρο (συγκεκριµένα στην Κέρκυρα) βρέθηκε ότι για το µήνα Σεπτέµβριο η µέση γονιµότητα ήταν 107 αυγά ανά θηλυκό, ενώ για τους µήνες Οκτώβριο και Νοέµβριο ήταν 186 αυγά ανά θηλυκό (Kapatos and Fletcher, 1983). Για πολλά χρόνια ο δάκος της ελιάς θεωρείτο ως ένα έντοµο ικανό να αναπαράγεται καθ όλη τη διάρκεια του έτους, αν οι κλιµατικές συνθήκες είναι κατάλληλες και υπάρχει διαθεσιµότητα φρούτων-ξενιστών (Orphanidis, 1967; Sacantanis, 1957). Όµως υπάρχει µια περίοδος (τέλος άνοιξής-αρχή φθινοπώρου) αναπαραγωγικής ανωριµότητας του εντόµου (διάπαυση), παρά την καλή θερµοκρασία που επικρατεί (Stavrakis and Fytizas, 1980). Η περίοδος αυτή αποδίδεται στην έλλειψη καρπών κατάλληλων για ωοαπόθεση, σε συνδυασµό µε τις κλιµατικές συνθήκες (Ayoutantis et al., 1954; Fletcher et al., 1978; Orphanidis 1967; Mourikis and Fytizas, 1970). Αυτό επιβεβαιώθηκε µε µελέτες ατόµων σε εργαστηριακές συνθήκες όπου τα θηλυκά που βρίσκονταν σε διάπαυση δεν ζευγάρωναν µε αρσενικά, ακόµα και αν αυτά δεν βρίσκονταν σε διάπαυση (Tzanakakis and Prophetou-Athanassiadou, 1987) και στο πεδίο, όπου τα αρσενικά άτοµα δεν ανταποκρίνονταν σε παγίδες φεροµονών από το τέλος της άνοιξης ως τα µέσα του καλοκαιριού (Delrio et al., 1983; Haniotakis et al., 1981; Ramos et al., 1983). Α.7. Οικονοµική σηµασία του εντόµου Ο δάκος της ελιάς είναι ένα έντοµο εξαιρετικής οικονοµικής σηµασίας, δεδοµένου ότι είναι το κύριο παράσιτο του ελαιοκάρπου, που αποτελεί κύρια πλουτοπαραγωγική πηγή για πολλές χώρες. 11

15 Εισαγωγή Α.7.1 Σηµασία της ελιάς Το ελαιόδεντρο παίζει πολύ σηµαντικό ρόλο στην ζωή των ανθρώπων, κυρίως της Μεσογείου. Επηρεάζει, πέρα από την διατροφή τους, την οικονοµική, κοινωνική πολιτιστική και πολιτική τους καθηµερινότητα. Από πολύ παλιά είχε αυτόν το σηµαντικό ρόλο, είτε στην αρχαία Ελλάδα, είτε στην Ρωµαϊκή και Βυζαντινή αυτοκρατορία, αλλά και σε περιοχές περιφερειακά τους. Η χρήση των προϊόντων του καρπού της ελιάς ήταν πολύπλευρη (στη διατροφή, ως καύσιµο για κεριά, ως φαρµακευτικό και αρωµατικό, για το µαγείρεµα και τη θέρµανση). Επίσης, ως ένα από τα πρώτα εµπορεύσιµα προϊόντα συνέβαλε στη διάνοιξη των πρώτων οδών επικοινωνίας µεταξύ των λαών και των πολιτισµών. Σηµερινή κατανοµή του ελαιοδέντρου: Σήµερα καλλιεργούνται παγκοσµίως πάνω από ένα δισεκατοµµύριο ελαιόδεντρα, ενώ πάνω από το 98% από αυτά βρίσκονται στην λεκάνη της Μεσογείου. Η καλλιέργεια της ελιάς εξαπλώνεται συνεχώς και σήµερα καλλιεργείται σε πέντε από τις έξι ηπείρους (εκτός της Ανταρκτικής), παραµένει όµως ζωτικής σηµασίας για τις οικονοµίες των µεσογειακών χωρών. Είναι χαρακτηριστικό ότι στην Ελλάδα βρίσκεται το 14,7% των παγκοσµίων ελαιοδέντρων, στην Ιταλία το 22,6% και στην Ισπανία το 23,5% και για αυτές τις χώρες οι ελαιοκαλλιέργειες αποτελούν πάνω από το 33% των µόνιµων καλλιεργειών τους. Στην Τυνησία ειδικά φτάνει το 93% των µόνιµων καλλιεργειών. Η συνολική έκταση που κάλυπταν οι καλλιέργειες ελιάς για τα έτη ήταν περίπου σταθερή και ίση µε 8 εκατοµµύρια εκτάρια. Οι πρώτες χώρες σε έκταση καλλιεργειών τα ίδια έτη ήταν η Ισπανία µε περίπου 2,2 εκ. εκτάρια, η Τυνησία µε 1,3 εκ. εκτάρια, η Ιταλία µε 1,2 εκ. εκτάρια και η Ελλάδα µε 750 χιλιάδες εκτάρια (στοιχεία από FAO). Παραγωγή ελαιοκάρπου: Η παγκόσµια παραγωγή ελαιοκάρπου για τα έτη ήταν περίπου σταθερή (µε µια µικρή αύξηση) και κυµαινόταν µεταξύ 15 και 16 εκατοµµυρίων µεγατόνων. Την µεγαλύτερη παραγωγή είχε η Ισπανία µε 3,4 ως 5,8 εκ. µεγατόνους, η Ιταλία µε 2,1 ως 3,7 εκ. µεγατόνους και η Ελλάδα µε 2,1 ως 2,3 εκ. µεγατόνους (στοιχεία από FAO). Με δεδοµένο ότι το µεγαλύτερο ποσοστό από την παραγωγή αυτή εξάγεται σε άλλες χώρες, γίνεται φανερή η µεγάλη οικονοµική σηµασία της καλλιέργειας αυτής για χώρες όπως η Ελλάδα. Είναι αναγκαία λοιπόν η καλύτερη δυνατή προστασία από όλους εκείνους τους παράγοντες που µειώνουν την ποσότητα και την ποιότητα της σοδιάς και κυριότερος από αυτούς είναι ο δάκος της ελιάς. 12

16 Εισαγωγή Α.7.2 Προσβολή του καρπού από το έντοµο Τα θηλυκά άτοµα του είδους προσελκύονται από τον ξενιστή τους όταν οι ελιές είναι κατάλληλες για ωοαπόθεση (Fiestas et al., 1972; Girolami et al., 1983). Κατάλληλες θεωρούνται οι πιο ώριµες και όσες είναι µεγαλύτερες και πλουσιότερες σε υγρασία. Κάθε θηλυκό τείνει να αποθέσει τα αυγά σε καρπούς που δεν έχουν αποθέσει άλλα άτοµα προηγουµένως. Αφού ανοίξει την οπή µε τον ωοαποθέτη του, το θηλυκό αποθέτει τα αυγά και πριν φύγει από το φρούτο χρησιµοποιεί τον ωοαποθέτη για να απλώσει στην επιφάνεια του καρπού το χυµό που εκλύεται. Αυτό αποτρέπει άλλα θηλυκά από το να αφήσουν στον ίδιο καρπό τα αυγά τους. Η ζηµιά που κάνει ο δάκος στην παραγωγή µπορεί να συνοψισθεί στα εξής: α) πτώση του καρπού πριν την περίοδο της συγκοµιδής β) µείωση απόδοσης λόγω της κατανάλωσης του εσωτερικού του καρπού από τις προνύµφες που τρέφονται από αυτόν γ) µείωση της ποιότητας του ελαιολάδου, λόγω αυξηµένης οξύτητας, η οποία προκύπτει επειδή οι οπές που ανοίγει ο ωοαποθέτης λειτουργούν ως σηµεία εισόδου για παθογόνους µύκητες και δ) οι οπές αυτές οδηγούν στην άµεση απόρριψη από την αγορά των επιτραπέζιων βρώσιµων ελιών. Το µέγεθος της βλάβης έχει υπολογιστεί µε διάφορους τρόπους και σε διάφορες περιοχές. Για παράδειγµα στη Σαρδηνία της Ιταλίας, τη χρονική περίοδο χάθηκε το 19% της παραγωγής (Prota, 1979). Στην Ελλάδα, οι απώλειες µπορούν να φτάσουν και το 30-40% της παραγωγής, η συνδυασµένη δράση των εντοµοκτόνων όµως τις κρατά στο επίπεδο του 5% (Economopoulos, 1979). Από την άλλη όµως, η χρήση των εντοµοκτόνων έχει τις γνωστές αρνητικές συνέπειες στην ποιότητα του προϊόντος, αλλά και το περιβάλλον. 13

17 Εισαγωγή Εικόνα 5: Στίγµατα που δηµιουργεί ο ωοαποθέτης στον καρπό της ελιάς Εικόνα 6: ιαδροµές που σχηµατίζει η προνύµφη τρεφόµενη από τον καρπό Εικόνα 7: Καταστροφή της ποιότητας του καρπού από τη προνύµφη και επακόλουθες µολύνσεις Εικόνα 8: Οπή που δηµιουργεί η προνύµφη κατά την έξοδό της από τον καρπό Α.8 Έλεγχος φυσικών πληθυσµών του εντόµου Για την καταπολέµηση του εντόµου χρησιµοποιείται σήµερα η συνδυασµένη δράση πολλών διαφορετικών µεθόδων, φιλικών ή µη προς το περιβάλλον. υστυχώς η βάση της καταπολέµησης παραµένει και σήµερα η χρήση εντοµοκτόνων. Στη συνέχεια παρουσιάζονται περιληπτικά οι µέθοδοι αυτές. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η σύγχρονη τάση για την αντιµετώπιση των επιβλαβών εντόµων είναι η ολοκληρωµένη διαχείριση παρασίτων (IPM ή integrated pest management), η οποία είναι µια στρατηγική που συνδυάζει διάφορες πρακτικές και προσπαθεί να βελτιστοποιήσει τα πλεονεκτήµατα κάθε µιας από αυτές, ενώ παράλληλα ελαχιστοποιεί τα µειονεκτήµατά τους. Για να έχει επιτυχία, θεωρείται δεδοµένο ότι θα υπάρχει µια µικρής κλίµακας ζηµιά στην καλλιέργεια, η οποία και θεωρείται αποδεκτή. ίδεται έµφαση σε φυσικούς περιοριστικούς παράγοντες και καλλιεργητικές πρακτικές. Αν αυτές οι πρακτικές αποτύχουν να κρατήσουν τον πληθυσµό του εντόµου κάτω από το προβλεπόµενο όριο, επιπρόσθετες µέθοδοι ελέγχου χρησιµοποιούνται, µε τέτοιο τρόπο ώστε να επιβαρύνουν όσο το δυνατό λιγότερο το περιβάλλον. Συνεπώς, η γνώση της λειτουργίας του οικοσυστήµατος είναι αναγκαία για τη σωστή εφαρµογή της IPM. 14

18 Εισαγωγή Α.8.1 Παρακολούθηση φυσικών πληθυσµών Η παρακολούθηση και η εκτίµηση του µεγέθους των φυσικών πληθυσµών γίνεται είτε µε διάφορες παγίδες, είτε µε δειγµατοληψία καρπών. Η γνώση του µεγέθους του πληθυσµού είναι απαραίτητη για την επιλογή οποιασδήποτε µεθόδου καταπολέµησης. Χρήση παγίδων: Πιο γνωστές είναι οι παγίδες McPhail, οι οποίες περιέχουν κάποιου είδους ουσίες προσέλκυσης (όπως φεροµόνες ή αµµωνιακά άλατα ή υδρολυµένες πρωτεΐνες) και ένα εντοµοκτόνο. Χρησιµοποιούνται περισσότερο για παρακολούθηση παρά για καταπολέµηση και δίνουν ενδείξεις για το µέγεθος του πληθυσµού του εντόµου στη συγκεκριµένη περιοχή (Arambourg, 1986). Επίσης χρησιµοποιούνται χρωµατικές παγίδες, που εκµεταλλεύονται την προτίµηση του εντόµου στο κίτρινο χρώµα, και συγκεκριµένα για µήκη κύµατος µεταξύ 500 και 520 nm (Εικόνα 9) (Delrio et al., 1979; Prokopy et al., 1975). Εικόνα 9: Παγίδες McPhail, κίτρινου χρώµατος. Περιέχουν χηµικές ουσίες για την προσέλκυση των ενηλίκων, καθώς και εντοµοκτονο για τη θανάτωσή τους ειγµατοληψία φρούτων: Η δειγµατοληψία δίνει άµεσες πληροφορίες για το βαθµό της ζηµιάς που έχει γίνει στην παραγωγή, καθώς και έµµεσες πληροφορίες για το µέγεθος του πληθυσµού του εντόµου. Α.8.2 Χρήση χηµικών εντοµοκτόνων ύο τύποι ψεκασµών χρησιµοποιούνται σήµερα. Ο πρώτος είναι ενάντια στα ενήλικα άτοµα του είδους και ο δεύτερος είναι ενάντια στις προνύµφες που ζουν και τρέφονται εντός των καρπών. Ο πρώτος εκµεταλλεύεται τις διατροφικές συνήθειες των ενηλίκων και χρησιµοποιεί ως δόλωµα υποστρώµατα που προσελκύουν το έντοµο (διαλύµατα 1% πρωτεϊνών που απελευθερώνουν αµµωνία), σε συνδυασµό µε οργανοφωσφορικά (fentheion, 15

19 Εισαγωγή dimethoate, µαλαθείο, παραθείο, φωσφαµίδιο) ή πυρεθροειδή εντοµοκτόνα. Με αυτό τον τρόπο, µόνο ένα µέρος κάθε δέντρου χρειάζεται να ψεκασθεί, µε αποτέλεσµα να µειώνεται η ποσότητα του εντοµοκτόνου που απελευθερώνεται και καταστρέφει την πανίδα των χρήσιµων εντόµων. Επειδή η δράση αυτών των ψεκασµών είναι µικρής διάρκειας, είναι κρίσιµης σηµασίας η σωστή επιλογή του χρόνου εφαρµογής τους. Ο δεύτερος τύπος χρησιµοποιεί εντοµοκτόνα που δρουν ως προνυµφοκτόνα. Η εφαρµογή τους αποφασίζεται ανάλογα µε τον αριθµό των ζωντανών προνυµφών που βρίσκονται δειγµατοληπτικά στους καρπούς. Αυτή η µέθοδος, που χρησιµοποιούταν ευρύτατα κατά το παρελθόν, σήµερα έχει ατονήσει, κύρια λόγω των υπολειµµάτων των εντοµοκτόνων που ανιχνεύονται στο ελαιόλαδο και τις παρενέργειες που έχει σε επωφελή έντοµα του περιβάλλοντος. Οι ψεκασµοί αυτοί γίνονταν από αέρος, σήµερα όµως γίνονται µε τοπικό ψεκασµό. A.8.3 Βιολογικός έλεγχος Βασίζεται στη δυνατότητα αυτορρύθµισης των πληθυσµών, στα πλαίσια του οικοσυστήµατος. Η ύπαρξη πληθυσµών άλλων ειδών που δρουν ως παράσιτα, θηρευτές ή παθογόνα για το είδος στόχο µπορούν µε την κατάλληλη διαχείριση να περιορίσουν τους πληθυσµούς του σε αποδεκτά µεγέθη. Τα είδη αυτά µπορεί να προϋπάρχουν στην περιοχή (φυσικός έλεγχος) ή να εισαχθούν µε ανθρώπινη παρέµβαση (κλασσικός έλεγχος). Φυσικός βιολογικός έλεγχος: Περιορίζεται στις περιπτώσεις εκείνες που ένα γηγενές επιβλαβές έντοµο περιορίζεται από ένα γηγενή φυσικό εχθρό του. Γύρω από τη Μεσόγειο υπάρχουν αρκετά είδη που αποτελούν φυσικούς εχθρούς του δάκου της ελιάς. α) Opius concolor: είναι ένα ενδοπαράσιτο, µε περιοχή προέλευσης τη Βόρεια Αφρική. Πολλές φορές έχει χρησιµοποιηθεί (µέσω εισαγωγών του, µαζικής εκτροφής και απελευθέρωσής του) σε βόρειες µεσογειακές περιοχές, ενώ έχει γίνει και µεταφορά του σε κάποια νησιά της νότιας Μεσογείου (Biliotti and Delanoue, 1959; Delanoue, 1960; Silvestri, 1939). β) Eupelmus urozonus: είναι εξωπαράσιτο διαφόρων ειδών και έχει βρεθεί όχι µόνο ως πρωταρχικό παράσιτο, αλλά και ως δευτερογενές. Επειδή όµως παρουσιάζει χειµερινή διάπαυση και ανταγωνίζεται άλλα παράσιτα του δάκου, η χρησιµότητά του αµφισβητείται (Arambourg, 1964). 16

20 Εισαγωγή γ) Pnigalio mediterraneus: είναι εξωπαράσιτο που απαντάται γύρω από τη Μεσόγειο. Επιτίθεται και σε πολλά µικρολεπιδόπτερα. Παρότι έχουν παρατηρηθεί υψηλοί ρυθµοί παρασιτισµού του στο δάκο της ελιάς, ο παρασιτισµός αυτός δεν διατηρείται ιδιαίτερα σε πληθυσµούς δάκου µεγάλου µεγέθους (Arambourg and Pralavorio 1974). δ) Eurytoma martellii: είναι εξωπαράσιτο που µπορεί να απαντάται γύρω από όλη τη Μεσόγειο, αν και λίγο πιο σπάνια στην ανατολική Μεσόγειο. Στη δυτική Μεσόγειο µπορεί να φτάσει σε ικανοποιητικούς ρυθµούς παρασιτισµού, ειδικά την περίοδο Αυγούστου- Σεπτεµβρίου (Arambourg and Pralavorio 1974). ε) Cyrpoptix latipes: είναι επίσης εξωπαράσιτο και εµφανίζεται τοπικά και σε µη τακτά χρονικά διαστήµατα, συνήθως το φθινόπωρο (Stavraki, 1970). Γενικά, τα φυσικά αυτά εξωπαράσιτα έχουν µειωµένη χρησιµότητα στον έλεγχο του δάκου. Όταν οι πληθυσµοί του δάκου είναι µεγάλοι (µετά τον Σεπτέµβριο), οι πληθυσµοί των παρασίτων µειώνονται (Arambourg and Pralavorio, 1974; Pappas et al., 1977). στ) Prolasioptera berlesiana: είναι φυσικός θηρευτής των αυγών του δάκου της ελιάς και η καταστροφή που µπορεί να του προκαλέσει µπορεί να φτάσει το 30-50% (Michelakis et al., 1983). ζ) ιάφοροι θηρευτές των βοµβυκίων του εντόµου, όπως πολλά είδη των γενών Carabidae, Scolopendridae, Lithobiidae και διάφορα είδη Dermaptera. η) Θηρευτές των προνυµφών και των βοµβυκίων, όπως διάφορα είδη µυρµηγκιών και πουλιά (Neuenschwander et al., 1986). Κλασσικός βιολογικός έλεγχος: Αναφέρεται στην ανακάλυψη, εισαγωγή και εδραίωση µη ιθαγενών φυσικών εχθρών του εντόµου, µε σκοπό τον έλεγχο. Πολλά παράσιτα εκτός Μεσογείου έχουν βρεθεί και έχει γίνει προσπάθεια να εδραιωθούν στη βόρεια Μεσόγειο για τον έλεγχο του δάκου. Γενικά, η µέθοδος αυτή δεν έχει αποδώσει τα αναµενόµενα. Αυτό ίσως να οφείλεται στον µικρό αρχικό αριθµό των απελευθερωθέντων ατόµων, στην ελλιπή γνώση των βιολογικών και οικολογικών χαρακτηριστικών τους και στο ότι πιθανώς να εκµεταλλεύτηκαν άλλους ξενιστές πέρα από το δάκο (Neuenschwander et al., 1986). Η µόνη περίπτωση που φαίνεται ότι θα µπορούσε να αποδειχτεί χρήσιµη είναι του O. concolor. Εισήχθη και απελευθερώθηκε τη δεκαετία του 1920 σε Ιταλία, Ισπανία και Γαλλία, όµως δεν µπόρεσε να εδραιωθεί. Μετά την ανάπτυξη µεθόδων µαζικής παραγωγής, έδωσε καλύτερα αποτελέσµατα ( στην Ιταλία, 1976 στην Κέρκυρα), µέσω συνεχών 17

21 Εισαγωγή απελευθερώσεων (Monastero, 1967; Manikas and Tsiroyannis, 1981; Kapatos et al., 1977; Liaropoulos et al., 1977). Μικροβιακός βιολογικός έλεγχος: εν είναι γνωστή µέχρι τώρα κάποια πρακτική εφαρµογή παθογόνων µικροοργανισµών που να περιορίζουν τους πληθυσµούς του εντόµου. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η αποµόνωση δύο ιών από το δάκο στην Ελλάδα. Παρότι δεν είναι παθογόνοι σε φυσικές συνθήκες, ο ένας από αυτούς φαίνεται να είναι µολυσµατικός (Bergoin et al., 1983). Τεχνική στείρων εντόµων (SIT ή Sterile Insect Technique): Σκοπός της τεχνικής αυτής είναι η µείωση της µέσης γονιµότητας των θηλυκών του είδους, η οποία θα οδηγήσει στην ραγδαία µείωση του µεγέθους του πληθυσµού (Knipling 1955). Η µέθοδος αυτή συνίσταται στη µαζική εργαστηριακή καλλιέργεια ατόµων του είδους, στείρωση µε ακτινοβόληση βοµβυκίων ή ενηλίκων ατόµων και απελευθέρωσή τους (Tsitsipis, 1977; Cavalloro and Delrio, 1973; Cavalloro and Delrio, 1974). Τέτοια πειράµατα έγιναν στην Ελλάδα τα έτη και (Economopoulos, 1981; Economopoulos et al., 1977). Τα αποτελέσµατα δεν ήταν ενθαρρυντικά, γεγονός που αποδόθηκε στις διαφορές στη φυσιολογία και τη συµπεριφορά των στείρων ατόµων που απελευθερώθηκαν και των φυσικών πληθυσµών. Μελέτες που έγιναν σε γονιδιακές συχνότητες έδειξαν τεράστιες διαφορές µεταξύ εργαστηριακών και φυσικών πληθυσµών (Economopoulos and Zervas, 1982; Manoukas, 1983; Mazomenos and Pomonis, 1983; Tsiropoulos 1980; Zervas 1985; Bush and Kitto, 1979; Tsakas and Zouros, 1980; Zouros et al., 1982; 1987). Το γεγονός ότι η µέθοδος αυτή έχει πολύ καλύτερα αποτελέσµατα όταν απελευθερώνονται µόνο στείρα αρσενικά, όπως αποδείχτηκε σε άλλα συγγενικά είδη (C. capitata) σε συνδυασµό µε το ότι δεν έχουν φτιαχτεί στελέχη που να δίνουν αυτή τη δυνατότητα στο δάκο, µειώνουν ακόµη περισσότερο την αποτελεσµατικότητά της. Α.8.4 Εναλλακτικές µέθοδοι ελέγχου Καλλιεργητικές πρακτικές ως συµπληρωµατικός τρόπος ελέγχου: Είναι µέθοδοι που σκοπό έχουν να διακόψουν τον κύκλο ζωής του είδους ή να υποβοηθήσουν τους θηρευτές και τα παράσιτά του. Είναι οικονοµικές µέθοδοι και εύκολα εφαρµόσιµες, όµως επειδή είναι σε µεγάλο βαθµό έµµεσες, η αποτελεσµατικότητά τους είναι δύσκολο να αξιολογηθεί. 18

22 Εισαγωγή α) Χρησιµοποίηση δέντρων-παγίδων µε πρώιµη ανθοφορία: Σε ένα ελαιώνα που αποτελείται από δέντρα µιας συγκεκριµένης ποικιλίας, φυτεύονται και λίγα δέντρα, τα οποία ανθίζουν νωρίτερα. Αποτέλεσµα είναι να παρατηρείται συσσώρευση των ατόµων του δάκου σε αυτά τα δέντρα, οπότε η αντιµετώπιση είναι πιο στοχευµένη και αποτελεσµατική (Donimici et al., 1987; Michelakis et al., 1983). β) ηµιουργία κατάλληλων οικολογικών θώκων για τους εχθρούς του δάκου: αυτό γίνεται φυτεύοντας ενδιάµεσα και κάποια άλλα είδη φυτών, στα οποία βρίσκουν καταφύγιο οι εχθροί του εντόµου (Argyriou, 1981; Balachowsky, 1932; Katsoyannos, 1983). γ) Επιλογή σωστού χρόνου και τεχνικής για τη συγκοµιδή του ελαιοκάρπου: είναι αναγκαίο να γίνεται η συλλογή του ελαιοκάρπου από το δέντρο και όχι να απλώνονται δίχτυα όπου συλλέγεται ο καρπός µετά την πτώση του. Με αυτό τον τρόπο αποτρέπεται η δηµιουργία κατάλληλου υποστρώµατος (δηλαδή πολύ ώριµων καρπών) για την ωοαπόθεση (Kapatos and Fletcher 1983). Ανάπτυξη χηµικών που τροποποιούν τη συµπεριφορά: Πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για την αναγνώριση, αποµόνωση και χρησιµοποίηση τέτοιων τροποποιητικών ουσιών. Σε αυτές ανήκουν συνθετικές φεροµόνες που προκαλούν διακοπή της σύζευξης και ουσίες που λειτουργούν αποτρεπτικά προς την ωοαπόθεση. Τα µέχρις στιγµής πειραµατικά δεδοµένα όµως δεν είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά (Jones et al., 1983; Montiel-Bueno and Mata, 1983; Haniotakis, 1986; Girolami et al., 1981; 1982; Girolami and Strapazzon, 1982; Orphanidis and Kamoukos, 1970; Vita, 1978). ιακοπή συµβίωσης: Υπάρχουν συµβιωτικά βακτήρια που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των νεαρών προνυµφών του εντόµου (Hagen, 1966; Petri, 1909; Yamvrias et al., 1970). Παρότι τα δεδοµένα είναι ελλιπή, φαίνεται ότι ο κύριος ρόλος τους έγκειται στην υδρόλυση των πρωτεϊνών του µεσοκαρπίου του ελαιοκάρπου. Προσθέτοντας στην τροφή των προνυµφών ένα αντιβιοτικό, όπως η στρεπτοµυκίνη, η ανάπτυξη των προνυµφών διακόπτεται, όπως και αν ψεκαστούν οι ελιές µε το αντιβιοτικό λίγες µέρες πριν ή µετά την ωοαπόθεση. Αν όµως οι καρποί είναι πολύ ώριµοι, τότε οι προνύµφες αναπτύσσονται κανονικά (Lambrou and Tzanakakis, 1978; Tzanakakis and Stavrinides, 1973; Tzanakakis and Lambrou, 1975; Tzanakakis et al., 1975). 19

23 Εισαγωγή Α.8.5 Σηµερινή κατάσταση Από όσα ήδη έχουν αναφερθεί γίνεται κατανοητό ότι η αντιµετώπιση του δάκου της ελιάς αντιµετωπίζει συγκεκριµένα προβλήµατα, τα οποία συνοψίζονται στα έξής: α) η βάση της καταπολέµησης παραµένουν τα εντοµοκτόνα µε τα προβλήµατα που αυτά προκαλούν στο περιβάλλον και στην ποιότητα του προϊόντος. β) η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα εντοµοκτόνα, όπως συµβαίνει και σε άλλα είδη εντόµων καθιστά τη συνεχή χρήση των εντοµοκτόνων προβληµατική. Ήδη έχουν ανιχνευτεί µεταλλάξεις που σχετίζονται µε την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στο δάκο της ελιάς (Vontas et al., 2001; 2002; Stasinakis et al., 2001). γ) οι φιλικές προς το περιβάλλον µέθοδοι που έχουν µέχρι τώρα χρησιµοποιηθεί δεν έδωσαν ενθαρρυντικά αποτελέσµατα. Αυτό οφείλεται κυρίως στις περιορισµένες γνώσεις που υπάρχουν µέχρι σήµερα για τη βιολογία του εντόµου, τη γενετική του και τη γενετική δοµή των φυσικών πληθυσµών του. Α.9 Γενετική του δάκου Γονιδίωµα: Ο καρυότυπος του εντόµου αποτελείται από έξι ζεύγη χρωµοσωµάτων, ένα φυλετικό, µε το αρσενικό να είναι το ετερογαµετικό φύλο (Mavragani-Tsipidou et al., 1992; Krimbas, 1963) και πέντε αυτοσωµικά. Το Y είναι πολύ µικρό, ενώ το Χ είναι µικρότερο από όλα τα αυτοσωµατικά χρωµοσώµατα. Έχει βρεθεί ότι το Y και το µεγαλύτερο µέρος του Χ είναι υψηλά ετεροχρωµατινικές περιοχές (Mavragani-Tsipidou et al., 1992). Τα χρωµοσώµατά του πολυταινίζονται, εκτός των φυλετικών (γεγονός που δείχνει την ετεροχρωµατινική τους φύση) και έχουν αποµονωθεί από τους σιελογόνους αδένες, το λιπαρό σώµα και τα µαλπιγιανά σωληνάρια προνυµφών του είδους (Mavragani-Tsipidou et al., 1992; Zambetaki et al., 1995; Krimbas, 1963), χωρίς να έχει βρεθεί τυπικό χρωµόκεντρο σε καµµία περίπτωση. Σε µελέτες που έχουν γίνει σε άτοµα εργαστηριακών και φυσικών πληθυσµών, δεν έχουν βρεθεί χρωµοσωµατικές αναδιατάξεις (Mavragani-Tsipidou, 2002). ιάφορες αλληλουχίες των εντόµων D. melanogaster και C. capitata έχουν χρησιµοποιηθεί για την εύρεση οµολογιών µεταξύ των γονιδιωµάτων και των τριών ειδών (Zambetaki et al., 1999; 2000). Επίσης άλλα δύο γονίδια, τα scarlet και white, που προέρχονται από το έντοµο B. tryoni, έχουν χαρτογραφηθεί σε µοναδικές θέσεις στο δάκο της ελιάς Οι κλώνοι αυτοί αποτελούν µοριακούς δείκτες για τα πέντε αυτοσωµικά χρωµοσώµατα και επέτρεψαν την 20

24 Εισαγωγή εύρεση οµολογιών µεταξύ των συγγενικών ειδών C. capitata, B.oleae και B. tryoni (Mavragani-Tsipidou, 2002). Μελέτες ενζυµικών πολυµορφισµών: Σε διάφορες µελέτες έχουν αναλυθεί οι πολυµορφισµοί διαφόρων ενζυµικών συστηµάτων, µε έµφαση στις αλλαγές στις συχνότητες των διαφόρων αλληλοµόρφων κατά την καλλιέργεια του εντόµου σε συνθήκες τεχνητής εκτροφής, ιδιαίτερα στο γενετικό τόπο της αλκοολικής αφυδρογονάσης ή Adh. Οι Bush and Kitto (1979) µελέτησαν έναν εργαστηριακό και δύο φυσικούς πληθυσµούς του εντόµου µε τη βοήθεια 23 ενζύµων και βρήκαν σηµαντικές διαφοροποιήσεις στις συχνότητες των αλληλοµόρφων για την Adh και την φωσφογλυκονική αφυδρογονάση. Για την Adh βρέθηκαν δύο µορφές διαφορετικής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Οι Zouros et al. (1982) βρήκαν και µία τρίτη µε ενδιάµεση κινητικότητα. Οι επόµενες µελέτες αφορούσαν τις αλλαγές στις συχνότητες των αλληλοµόρφων αυτού του γενετικού τόπου κατά τη µεταφορά του πληθυσµού από τη φύση στο εργαστήριο (Economopoulos and Loukas 1986; Loukas et al., 1985; Tsakas and Zouros, 1980), το βιοχηµικό χαρακτηρισµό του µορίου (Mazi et al., 1998) και την επίδραση διάφορων παραγόντων της τεχνητής διατροφής στις συχνότητες αυτές (Kostantopoulou and Raptopoulos, 2003) Οι Goulielmos et al. (2001; 2003) έδειξαν την ύπαρξη διπλασιασµών αυτού του γενετικού τόπου στο γονιδίωµα. Οι µελέτες αυτές δείχνουν ότι η τεχνητή εκτροφή προκαλεί αλλαγές στις συχνότητες των αλληλοµόρφων του γενετικού τόπου της Adh, ενώ υπάρχει και µία έρευνα που εξετάζει την πιθανότητα χρησιµοποίησης αυτού του γενετικού τόπου για τον µετασχηµατισµό του εντόµου αυτού (Benos et al., 2000). Η χρησιµοποίηση των ενζυµικών πολυµορφισµών για την ανάλυση φυσικών πληθυσµών είναι πολύ περιορισµένη, σε αντίθεση µε άλλα είδη. Πληθυσµιακές µελέτες: Όσον αφορά την δοµή των φυσικών πληθυσµών του εντόµου, πολύ λίγα πράγµατα είναι γνωστά. Για την ακρίβεια, εκτός από την µελέτη των Bush and Kitto (1979), ενδιαφέρον παρουσιάζουν άλλες δύο µελέτες. Η πρώτη αφορά την ανάλυση τεσσάρων φυσικών πληθυσµών από την Ισπανία µε εννέα ενζυµικούς γενετικούς τόπους, που έδειξε ότι οι πληθυσµοί αυτοί ήταν αρκετά πολυµορφικοί (Ochando and Reyes 2000). Η δεύτερη µελέτη δεν είναι καθαρά πληθυσµιακή, γιατί εξετάζει µόνο δύο άτοµα από διαφορετικές περιοχές. Το γεγονός όµως ότι παρουσιάζει την πλήρη αλληλουχία του 21

25 Εισαγωγή µιτοχονδριακού τους DNA, εµφανίζοντας 31 νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις µεταξύ τους, την κάνει χρήσιµη σε µελλοντικές πληθυσµιακές αναλύσεις (Nardi et al., 2003). Φαινόµενα ανθεκτικότητας στα εντοµοκτόνα: Σε πολλά είδη εντόµων οικονοµικής σηµασίας έχουν ανιχνευτεί φαινόµενα ανάπτυξης ανθεκτικότητας στα εντοµοκτόνα (Georghiou, 1994). Συνεπώς και στο δάκο, ο οποίος από τη δεκαετία του 60 αντιµετωπίζεται µε εντοµοκτόνα, τέτοια φαινόµενα είναι αναµενόµενα και δυσκολεύουν την αντιµετώπισή του. Γενικά, τρία ενζυµικά συστήµατα πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας: οι µονοοξειδάσες του κυτοχρώµατος P 450, οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης και οι εστεράσες. Ειδικά οι εστεράσες είναι υδρολυτικά ένζυµα υπεύθυνα για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας σε οργανοφοσφωρικά εντοµοκτόνα σε πολλά είδη εντόµων. Στο δάκο υπάρχουν ενδείξεις ότι οι εστεράσες ελέγχονται από δύο µη συνδεδεµένα αυτοσωµικά γονίδια (Zouros et al., 1968), ενώ έχουν ανιχνευτεί αλλαγές στις συχνότητες των διαφόρων αλληλοµόρφων τους σε εργαστηριακούς πληθυσµούς που έχουν εκτεθεί σε dimethoate, οι οποίες µοιάζουν µε τις συχνότητες που εµφανίζονται στους φυσικούς πληθυσµούς που υπόκεινται για δεκαετίες σε αυτό το εντοµοκτόνο (Stasinakis et al., 2001). Βέβαια, αυτός δεν είναι ο µόνος µηχανισµός δηµιουργίας ανθεκτικότητας, η οποία µπορεί να επιτευχθεί επίσης µε γονιδιακή επέκταση. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις γονιδιακής επέκτασης στο γενετικό τόπο των εστερασών στο δάκο της ελιάς, σε πληθυσµούς που υπόκεινται στην δράση οργανοφοσφωρικών εντοµοκτόνων σε σχέση µε πληθυσµούς που δεν είχαν εκτεθεί σε αυτά (Tsakas, 1977; Tsakas and Krimbas, 1970). Η γονιδιακή επέκταση µε σκοπό την δηµιουργία ανθεκτικότητας έχει περιγραφεί και σε άλλα είδη εντόµων, όπως στην αφίδα Myzus persicae και το κουνούπι Culex pipiens (Devonshire and Field 1991; Devonshire et al., 1992; Mouches et al., 1990). Επίσης, τα τελευταία χρόνια έχουν βρεθεί συγκεκριµένες σηµειακές µεταλλάξεις στο γενετικό τόπο της ακετυλοχολινεστεράσης, το οποίο είναι ένα ένζυµο-κλειδί στη λειτουργία του κεντρικού νευρικού συστήµατος και αποτελεί τον κύριο στόχο για πολλά είδη εντοµοκτόνων, όπως τα οργανοφωσφορικά και τα καρβαµιδικά. Οι µεταλλάξεις αυτές φαίνεται να προσφέρουν αυξηµένη ανθεκτικότητα στα συγκεκριµένα εντοµοκτόνα, άλλες περισσότερο και άλλες λιγότερο (Vontas et al., 2001; 2002). 22

26 Εισαγωγή Από τα παραπάνω γίνεται φανερή η περιορισµένη γενετική πληροφορία για το έντοµο και τους φυσικούς πληθυσµούς του, αλλά και η απουσία των εργαλείων εκείνων που θα επιτρέψουν την ανάλυση τους. 23

27 Εισαγωγή Β. Πληθυσµιακή ανάλυση Η ανάλυση των φυσικών πληθυσµών ενός είδους µπορεί να απαντήσει σε πολλά και σηµαντικά ζητήµατα. Μπορεί να ρίξει φως στην προέλευση ενός είδους και στην πορεία εξάπλωσής του στο χώρο και το χρόνο. ιευκολύνει την διαχείριση πληθυσµών ειδών οικονοµικής σηµασίας. Ειδικά στον τοµέα των παρασιτικών εντόµων, µπορεί να βοηθήσει στο να διαπιστωθεί κατά πόσο υπάρχει γονιδιακή ροή µεταξύ ατόµων που ζουν στην ίδια ή σε διαφορετικές περιοχές, καθώς επίσης και στον έλεγχο φαινοµένων µετανάστευσης και εύρεσης των αρχικών περιοχών µόλυνσης σε περιοχές που τα συγκεκριµένα παράσιτα δεν προϋπήρχαν. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η ύπαρξη πολυµορφισµού στους πληθυσµούς που αναλύονται και η ανίχνευσή του µε κατάλληλες µεθόδους. Β.1 Ποικιλότητα φυσικών πληθυσµών Σχεδόν όλα τα είδη που υπάρχουν στη φύση ζουν οργανωµένα σε πληθυσµούς. Με τον όρο πληθυσµός προσδιορίζεται µια οµάδα ατόµων του ιδίου είδους που συνυπάρχουν στο χώρο και στο χρόνο και µπορούν να αναπαράγονται µεταξύ τους (το τελευταίο ισχύει για είδη µε φυλετική αναπαραγωγή). Οι φυσικοί πληθυσµοί χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη πολυµορφισµού, η οποία τους δίνει την δυνατότητα να προσαρµόζονται στις περιβαλλοντικές αλλαγές. Η ύπαρξη πολυµορφισµού είναι απαραίτητη για την επιβίωση του πληθυσµού και κατ επέκταση και του είδους, ακόµα και αν αυτές έχουν αρνητικό αντίκτυπο σε κάποια άτοµα του πληθυσµού που τις φέρουν. Αυτό δεν σηµαίνει ότι όλοι οι φυσικοί πληθυσµοί έχουν τον ίδιο βαθµό πολυµορφισµού. Η γενετική ποικιλότητα διαφέρει από πληθυσµό σε πληθυσµό (Ayala, 1982). Β.2 Έλεγχος ισορροπίας ενός πληθυσµού Νόµος Hardy-Weinberg Ένας πληθυσµός βρίσκεται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg όταν οι γενοτυπικές και γονιδιακές του συχνότητες παραµένουν σταθερές από γενιά σε γενιά. Αν ο πληθυσµός έχει µέγεθος Ν ατόµων και είναι διπλοειδής, τότε, κάθε γενετικός τόπος θα αντιπροσωπεύεται 2Ν φορές στον πληθυσµό. Αν υποτεθεί ότι για ένα γενετικό τόπο χ υπάρχουν στον πληθυσµό 24

28 Εισαγωγή µόνο δύο αλληλόµορφα Α και Β, ένα άτοµο µπορεί να έχει γενότυπο ΑΑ, ΑΒ ή ΒΒ. Η γενοτυπική συχνότητα δείχνει πόσες φορές υπάρχει ένας συγκεκριµένος γενότυπος προς το σύνολο των γενοτύπων. Αντίστοιχα, η γονιδιακή συχνότητα δείχνει πόσες φορές υπάρχει ένα αλληλόµορφο προς το σύνολο των αλληλοµόρφων. Β.3 Προϋποθέσεις για την ισχύ του νόµου Hardy-Weinberg Για να βρίσκεται ένας πληθυσµός σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg πρέπει οι διασταυρώσεις να είναι τυχαίες στον πληθυσµό. Όµως αυτό είναι σπάνιο σε φυσικούς πληθυσµούς, το να µην υπάρχουν δηλαδή παράγοντες που θα προκαλούν αποκλίσεις από την ισορροπία αυτή. Ακολούθως γίνεται µια συνοπτική αναφορά στους παράγοντες που προκαλούν αλλαγές των γονιδιακών συχνοτήτων στους φυσικούς πληθυσµούς και αποκλίσεις από την ισορροπία. Οµοµιξία: Αναφέρθηκε ήδη ότι προϋπόθεση είναι οι τυχαίες διασταυρώσεις, ο πληθυσµός να είναι συνεπώς παµµικτικός. Στην πραγµατικότητα όµως, τα άτοµα ενός πληθυσµού συνήθως διασταυρώνονται µε τα κοντινά τους, γεγονός που οδηγεί σε αποκλίσεις. Οι διασταυρώσεις µεταξύ συγγενικών ατόµων (οµοµιξία) δεν αλλάζουν τις γονιδιακές συχνότητες, αυξάνουν όµως το ποσοστό των οµοζυγωτικών ατόµων. Μεταλλάξεις: Με τον όρο µετάλλαξη εννοούµε µια αλλαγή σε επίπεδο γενετικού υλικού ενός ατόµου. Εισάγουν καινούρια αλληλόµορφα στον πληθυσµό, αλλά από µόνες τους δεν µπορούν να προκαλέσουν αλλαγές των γονιδιακών συχνοτήτων. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η διατήρηση και η διασπορά τους στον πληθυσµό. Αποτελούν το υπόστρωµα για την δράση άλλων δυνάµεων. Γονιδιακή ροή (µετανάστευση): Είναι ένας παράγοντας που µπορεί να προσθέσει καινούρια αλληλόµορφα σε ένα πληθυσµό ή να αλλάξει τις γονιδιακές συχνότητες των υπαρχόντων. Η αποτελεσµατικότητά της εξαρτάται από το πόσο διαφορετική είναι η γενετική δοµή του πληθυσµού και των ατόµων που µπαίνουν σε αυτόν µε µετανάστευση, από το µέγεθος του πληθυσµού και το µέγεθος της µετανάστευσης. 25

29 Εισαγωγή Τυχαία γενετική εκτροπή Ιδρυτική αρχή Φαινόµενα στενωπού: Οι τρεις αυτές περιπτώσεις οδηγούν σε αλλαγές γονιδιακών συχνοτήτων λόγω µικρού µεγέθους πληθυσµού. Η τυχαία γενετική εκτροπή αφορά τις περιπτώσεις εκείνες που ένας πληθυσµός είναι πολύ µικρός και συνεπώς µια µικρή αλλαγή µπορεί να έχει µεγάλη επίπτωση στις γονιδιακές συχνότητες της επόµενης γενιάς. Η ιδρυτική αρχή είναι ακραία περίπτωση γενετικής εκτροπής και αναφέρεται σε περιπτώσεις όπου ένας πληθυσµός δηµιουργείται από πολύ λίγα άτοµα ενός άλλου, µεγάλου πληθυσµού (π.χ. σε περιπτώσεις µετανάστευσης λίγων ατόµων ενός είδους σε περιοχές που αυτό δεν προϋπάρχει). Τα φαινόµενα στενωπού (bottle-neck effects) είναι επίσης δείγµα ακραίας γενετικής εκτροπής και αναφέρονται σε περιπτώσεις όπου ένας µεγάλος πληθυσµός αντιµετωπίζει κάποιου είδους περιβαλλοντική πίεση, µε αποτέλεσµα µόνο λίγα άτοµα από αυτόν να επιβιώνουν ή λίγα µόνο άτοµα να συµµετέχουν στην δηµιουργία της επόµενης γενιάς, µε αποτέλεσµα την δραστική αλλαγή των γονιδιακών συχνοτήτων. Φυσική επιλογή: Η φυσική επιλογή θεωρείται ως η κινητήρια δύναµη της εξέλιξης που ωθεί τις όποιες γονιδιακές αλλαγές προς συγκεκριµένη κατεύθυνση. Μπορεί να οριστεί ως η διεργασία που εκµεταλλεύεται την γενετική ποικιλότητα ενός πληθυσµού και τον ωθεί στην προσαρµογή του στις εκάστοτε συνθήκες του περιβάλλοντος. Βασική της ιδέα είναι η επιβίωση, αλλά και η επιτυχέστερη αναπαραγωγή του καλύτερα προσαρµοσµένου ατόµου. Είναι προφανές ότι για να δράσει η φυσική επιλογή απαραίτητη είναι η ύπαρξη γενετικής ποικιλότητας. Β.4 είκτες που χρησιµοποιούνται στην πληθυσµιακή ανάλυση Υπάρχουν διάφοροι δείκτες, που σκοπό έχουν να αποκαλύψουν το βαθµό ποικιλότητας, να δείξουν πόσο όµοιοι ή διαφορετικοί είναι οι πληθυσµοί µεταξύ τους, αν βρίσκονται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg και αν εµφανίζεται γονιδιακή ροή µεταξύ τους και σε ποιο βαθµό. Στη συνέχεια παρουσιάζονται κάποιοι από αυτούς τους δείκτες, οι οποίοι χρησιµοποιήθηκαν και στην παρούσα διατριβή. 26