ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου Geminin και της συγγενικής πρωτεΐνης Geminin cc-like σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ΔΗΜΑΚΗ ΜΑΡΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2008

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου Geminin και της συγγενικής πρωτεΐνης Geminin cc-like σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ΔΗΜΑΚΗ ΜΑΡΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Λυγερού Ζωή Επίκουρος καθηγήτρια Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Τμήμα Ιατρικής Παν/μιο Πατρών 2

3 ΠΑΤΡΑ 2008 Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή κ. Λυγερού Ζωή Επίκουρος Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Ταραβήρας Σταύρος Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Μοσχονάς Νικόλαος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Επταμελής εξεταστική επιτροπή κ. Λυγερού Ζωή Επίκουρος Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Ταραβήρας Σταύρος Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Μοσχονάς Νικόλαος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Αθανασιάδου Αγλαϊα Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Μουζάκη Αθανασία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών κ. Συνετός Διονύσιος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών κ Χαμπαίος Ιωάννης Λέκτορας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών 3

4 wx ÑÜÉyâÇw á 4

5 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Παν/μίου Πατρών. Μια τέτοια πολυετής προσπάθεια απαιτεί τη συμμετοχή πολλών ανθρώπων, στην οποία ο καθένας συμβάλλει με το δικό του τρόπο. Την περάτωση του συγκεκριμένου εγχειρήματος καθοδήγησαν, στήριξαν αλλά και διαμόρφωσαν αρκετοί άνθρωποι τους οποίους θα ήθελα θερμά να ευχαριστήσω. Πρωτίστως, αισθάνομαι την επιθυμία να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κ. Λυγερού Ζωή, για την πολύτιμη καθοδήγησή της, τις ουσιαστικές συνθήκες που εξασφάλισε και το ερευνητικό περιβάλλον που δημιούργησε προκειμένου να έρθει σε πέρας το παρόν εγχείρημα. Η ξεκάθαρη επιστημονική της σκέψη και αντίληψη αποτελούν για εμένα πρότυπα μίμησης. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω το σύμβουλο καθηγητή μου, κ. Ταραβήρα Σταύρο, Επίκουρο Καθηγητή του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας για τις εξαιρετικά χρήσιμες συμβουλές, την καθοδήγηση και τη σημαντική αρωγή του στην εκπόνηση αυτής της διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Μοσχονά Νικόλαο και την Καθηγήτρια κ. Αθανασιάδου Αγλαΐα για τη συμμετοχή τους στην τριμελή συμβουλευτική και την επταμελή εξεταστική επιτροπή μου, αντίστοιχα, αλλά κυρίως για την ουσιαστικές συμβουλές και παρατηρήσεις τους που ως μέλη του Εργαστηρίου Βιολογίας εξέφρασαν κατά τη διάρκεια των ενδοεργαστηριακών μας συναντήσεων. Επίσης, ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Μουζάκη Αθανασία, τον Καθηγητή κο. Συνετό Διονύσιο και το Λέκτορα κ. Χαμπαίο Ιωάννη για τις χρήσιμες συμβουλές και τα σχόλια τους ως μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. Για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά την τρίμηνη επίσκεψή μου στο Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας (EMBL) στη Χαϊδελβέργη ευχαριστώ ιδιαιτέρως τον εκεί επιβλέποντά μου κ. Wittbrodt Jochen, καθώς και το διδάκτορα Souren Marcel. Ήταν μεγάλη χαρά για εμένα να γνωρίσω ανθρώπους όπως η Επίκουρος Καθηγήτρια κ. Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία, ο Επίκουρος Καθηγητής κ. Ζαρκάδης Ιωάννης και ο Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Σπάθας Διονύσιος, που ως μέλη Δ.Ε.Π. 5

6 του Εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας εκτός από δάσκαλοι υπήρξαν σημαντικοί ηθικοί υποστηρικτές σε αυτή την πορεία. Φυσικά, όλα αυτά τα χρόνια, ανεκτίμητη πηγή καθημερινής δύναμης και ενέργειας αλλά και πολύτιμοι συνεργάτες ήταν για εμένα οι μεταπτυχιακοί φοιτητές του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας και του γειτονικού Εργαστηρίου Φαρμακολογίας. Για την ιδιαίτερα σημαντική στήριξη και βοήθειά τους αλλά πολύ περισσότερο για τις αμέτρητες ώρες που εντός ή εκτός εργαστηρίου μοιραστήκαμε από την αρχή της παράλληλης εργαστηριακής μας πορείας, ευχαριστώ τους φίλους μου Ηλιού Μαρία, Ρούκο Βασίλη και Κοταντάκη Πανωραία. Ένα ξεχωριστό ευχαριστώ οφείλω στη φίλη μου Ξουρή Γεωργία, για την πολύτιμη στήριξη και βοήθειά της σε επιστημονικό και προσωπικό επίπεδο όλα αυτά τα χρόνια. Επίσης, για το πολύ ευχάριστο κλίμα και την άψογη συνεργασία μας, θα ήθελα θερμά να ευχαριστήσω όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές με τους οποίους είχα τη χαρά να συνεργαστώ: τη Σιρινιάν Χαρούλα, τη Σπέλλα Μάγδα, τον Καραντζέλη Νικόλα αλλά και τα νεότερα μέλη: Συμεωνίδου Ελεάννα, Σταθοπούλου Νάνσυ, Καραμήτρο Δημήτρη, Πεφάνη Δάφνη, Τσουτσάνη Τάσο, Κωτσαντή Παναγιώτη, Βερναρδή Σπύρο και Κυρούση Χριστίνα. Θεωρώ ότι δεν είχαμε απλά μια άψογη ερευνητική συνεργασία, αλλά πολλά όμορφα κοινά βιώματα, που θα μείνουν ανεξίτηλα χαραγμένα στις μνήμες μας. Τέλος, θα ήθελα εκ βαθέων να ευχαριστήσω τους γονείς μου και τον αδερφό μου, τον Πολυκράτη Απόστολο και πολύ οικεία σε εμένα πρόσωπα, για όλα όσα οι λέξεις δε θα είναι ποτέ αρκετές για να περιγράψουν. Δημάκη Μαρία Ιούλιος 2008 Πάτρα 6

7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εισαγωγή

8 Εισαγωγή ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Omnis cellula e cellula. Το κυτταρικό αυτό δόγμα, που διατυπώθηκε για πρώτη φορά το 1858 από το Γερμανό Rudolf Virchow, μεταφέρει το μήνυμα για τη διαιώνιση της ζωής. Τα κύτταρα δημιουργούνται από προϋπάρχοντα κύτταρα και όλοι οι οργανισμοί, από τα μονοκύτταρα βακτήρια μέχρι τα πολυκύτταρα θηλαστικά αποτελούν προϊόντα μιας επαναλαμβανόμενης διαδικασίας κυτταρικής ανάπτυξης και διαίρεσης. Η αναπαραγωγή ενός κυττάρου πραγματοποιείται μέσω μιας επακριβώς ρυθμιζόμενης διαδοχής γεγονότων που περιλαμβάνουν το διπλασιασμό και την ίση κατανομή των συστατικών του κυττάρου στα δύο θυγατρικά κύτταρα. Ο κύκλος του διπλασιασμού και της διαίρεσης είναι γνωστός σαν κυτταρικός κύκλος και αποτελεί το μηχανισμό αναπαραγωγής των κυττάρων όλων των οργανισμών. Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτικών κυττάρων διακρίνεται στη μεσόφαση και τη μίτωση. Η μεσόφαση αποτελεί το διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ δύο διαδοχικών μιτώσεων και περιλαμβάνει τις φάσεις G1, S και G2. Εικόνα Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου 11

9 Εισαγωγή 1.1 Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου Προκειμένου να διατηρηθεί η ακεραιότητα της γενετικής πληροφορίας από γενιά σε γενιά απαιτείται η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου τόσο στο χώρο όσο και στο χρόνο. Στη διάσταση του χρόνου, θα πρέπει να διασφαλίζεται ότι η μίτωση δεν ξεκινά χωρίς να έχει προηγουμένως ολοκληρωθεί η αντιγραφή του DNA καθώς και η επιδιόρθωση οποιασδήποτε υπάρχουσας βλάβης στο DNA και επιπλέον να διασφαλίζεται ότι η εκ νέου αντιγραφή του γενετικού υλικού έπεται της μίτωσης. Προβλήματα κατά τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και των σημείων ελέγχου αυτού (checkpoints) οδηγούν σε γονιδιωματική αστάθεια και προδιάθεση για καρκίνο. Ο κυτταρικός κύκλος είναι στα βασικά του σημεία όμοιος σε όλους τους ευκαρυώτες. Έτσι, μελέτες σε πολλούς κατώτερους οργανισμούς έχουν συμβάλλει στην κατανόηση του τρόπου με τον οποίο ελέγχονται και συντονίζονται τα γεγονότα του κυτταρικού κύκλου και στον άνθρωπο. Τα σχετικά μεγάλα γονιδιώματα των ευκαρυωτικών οργανισμών αντιγράφονται από πολλαπλές θέσεις έναρξης της αντιγραφής σε πολλά χρωμοσώματα, καλούμενες αφετηρίες της αντιγραφής. Η εξέλιξη ενός συστήματος ελέγχου των πολλαπλών αφετεριών αντιγραφής, ώστε όλες να ενεργοποιούνται επακριβώς μια φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο, υπήρξε ένα σημαντικό βήμα στην εξέλιξη των ευκαρυωτικών κυττάρων, επειδή απομάκρυνε τον περιοριστικό παράγοντα του μεγέθους του γονιδιώματος που μπορεί να αντιγραφεί από μια μοναδική αφετηρία αντιγραφής. Σημαντικό ρόλο στην ενορχήστρωση των γεγονότων του κυτταρικού κύκλου διαδραματίζει μια οικογένεια υψηλά συντηρημένων κινασών, των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών ή CDKs, στη διαδοχική ενεργοποίηση των οποίων συναρτήσει του χρόνου στηρίζεται η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (Nishitani and Lygerou, 2002; Nurse et al., 1976). Οι γενικές αρχές από τις οποίες διέπεται η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου είναι οι ακόλουθες: α. η ενεργοποίηση των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών καθοδηγείται από την κυμαινόμενη έκφραση των κυκλινών και τη δέσμευση τους με τις κινάσες β. η ενεργότητα ενός συμπλόκου κυκλίνης CDK εγκαθιδρύει τις συνθήκες που απαιτούνται για την ενεργοποίηση του επόμενου συμπλόκου 12

10 Εισαγωγή γ. η καταστροφή των κυκλινών διασφαλίζει την κατεύθυνση του κυτταρικού κύκλου δ. η παρεμπόδιση της δράσης των συγκροτημένων συμπλόκων κυκλίνηςκινάσης (είτε με φωσφορυλίωση είτε με δέσμευση ανασταλτικών πρωτεϊνών) σταματά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου όταν απαιτείται Κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (CDKs) Οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες αποτελούν τους κύριους ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου. Πρόκειται για μια οικογένεια κινασών σερίνης-θρεονίνης, που ετεροδιμερίζονται με μέλη της οικογενείας των κυκλινών και ενεργοποιούνται σε συγκεκριμένα σημεία του κυτταρικού κύκλου. Από μόνες τους είναι ανενεργές και αποκτούν ενεργότητα μόνο κατά τη σύνδεσή τους με τις κατάλληλες κυκλίνες. Επομένως, στο σύμπλοκο που σχηματίζεται η κυκλίνη έχει ρυθμιστικό ρόλο, ενώ η κινάση έχει καταλυτική ενεργότητα (Harper and Adams, 2001). Στον άνθρωπο μέχρι στιγμής είναι γνωστές 9 κινάσες (Takizawa and Morgan, 2000) από τις οποίες ενεργές κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι οι εξής: κατά την G1 η CDK4, η CDK6, και η CDK2, κατά την S η CDK2 και κατά τις φάσεις G2 και M η CDK1. Η CDK7 δρα σε συνδυασμό με την κυκλίνη H ως ενεργοποιητική κινάση των CDKs (CDK activating kinase: CAK) (Fisher and Morgan, 1994). Στις υπόλοιπες CDKs δεν έχει αποδοθεί μέχρι στιγμής σημαντικός ρόλος στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλο (Rickert et al., 1996). Μετά την ενεργοποίησή τους, οι CDKs φωσφορυλιώνουν τα υποστρώματά τους διεγείροντας έτσι τις μετέπειτα διαδικασίες του μοριακού μονοπατιού στο οποίο συμμετέχουν (Pines, 1995a; Pines, 1995b) Κυκλίνες Τα επίπεδα των CDKs παραμένουν σταθερά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε αντίθεση με αυτά των ενεργοποιητικών τους πρωτεϊνών, των κυκλινών, τα οποία παρουσιάζουν (όπως υποδηλώνει και το όνομά τους) κυκλική διακύμανση, ενεργοποιώντας έτσι περιοδικά τις CDKs (Kroll et al., 1998; Pines, 1991). Διαφορετικές κυκλίνες απαιτούνται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου 13

11 Εισαγωγή (Πίνακας 1). Οι 3 κυκλίνες τύπου D (D1, D2, D3) προσδένονται στις CDK4 και CDK6 και τα σύμπλοκα CDK-cyclin D είναι απαραίτητα για την είσοδο στη G1 (Polyak et al., 1994a). Αντίθετα με τις άλλες κυκλίνες, η κυκλίνη D δεν εκφράζεται περιοδικά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου αλλά συντίθεται εφόσον υπάρχουν ερεθίσματα από αυξητικούς παράγοντες (Assoian and Zhu, 1997). Οι κυκλίνες τύπου D λειτουργούν στην είσοδο και έξοδο των κυττάρων από τον κύκλο και παίζουν ρόλο στη σύνδεση μιτογόνων σημάτων με τον κυτταρικό κύκλο. Ένα κεντρικό μόριο στη σύνδεση μιτογόνων ερεθισμάτων με τη μηχανή του κυτταρικού κύκλου είναι το προϊόν του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Rb. H φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Rb από συμπλέγματα CDK4/κυκλίνης D επιτρέπει την ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων της φάσης S του κυτταρικού κύκλου (όπως τα γονίδια των κυκλινών Α και Ε, των CDK2 και CDK1) από το μεταγραφικό παράγοντα E2F (Cook et al., 2004; Ortega et al., 2002; Polyak et al., 1994a; Taya, 1997). Η κυκλίνη Ε εκφράζεται κατά τη G1, συνδέεται με τη CDK2 και ρυθμίζει τη μετάβαση από την G1 στην S (Ohtsubo et al., 1995). Η κυκλίνη Α προσδένεται στη CDK2 και το σύμπλοκο αυτό απαιτείται κατά την S φάση (Girard et al., 1991; Walker and Maller, 1991). Προς το τέλος της G2 και την αρχή της Μ, το σύμπλοκο κυκλίνης Α-CDK1 και κυκλίνης Β-CDK1 προάγουν την είσοδο στην Μ (Arellano and Moreno, 1997; King et al., 1994). Η ύπαρξη διαφορετικών συμπλεγμάτων CDKs/κυκλινών με διαφορετική ειδικότητα υποστρώματος σχετίζεται με την ανάγκη ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών σε μια ποικιλία φυσιολογικών συνθηκών και τη δυνατότητα απόκρισης σε ποικίλα θετικά και αρνητικά ερεθίσματα, καθώς και το συντονισμό του κύκλου με μονοπάτια διαφοροποίησης και απόπτωσης. Έως τώρα έχουν βρεθεί 16 κυκλίνες, αλλά όπως και με τις CDKs, δε σχετίζονται όλες με τον κυτταρικό κύκλο (Ando et al., 2005; Peng et al., 1998; Rickert et al., 1996). Οι κυκλίνες Α και Β περιέχουν αλληλουχία αποικοδόμησης (destruction box) και οι κυκλίνες D και E φέρουν την αλληλουχία PEST [πρωτεϊνικό τμήμα πλούσιο σε προλίνη (P), γλουταμικό οξύ (E), σερίνη (S), θρεονίνη (T)]. Οι παραπάνω πρωτεϊνικές αλληλουχίες απαιτούνται για την αποδοτική διαμεσολαβούμενη από ουβικουϊτίνη πρωτεόλυση των κυκλινών στο τέλος κάθε φάσης του κυτταρικού κύκλου (Glotzer et al., 1991; Rechsteiner and Rogers, 1996). 14

12 Εισαγωγή CDK Cyclin Φάση του κυτταρικού κύκλου CDK4 Cyclin D1,D2,D3 G1 CDK6 Cyclin D1,D2,D3 G1 CDK2 Cyclin E Μετάβαση από G1 σε S CDK2 Cyclin A S CDK1 Cyclin A Μετάβαση από G2 σε M CDK1 Cyclin B M CDK7 Cyclin H CAK (σε όλες τις φάσεις) Πίνακας 1.1. Κυκλίνες και κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες που συμμετέχουν σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου Στους εξελικτικά κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου εξασφαλίζεται με την ύπαρξη μιας και μόνο CDK (Cdc2 στον S. pombe και της ομόλογης Cdc28 στον S. cerevisiae). Συγκεκριμένα, στον S.cerevisiae, η μετάβαση από τη φάση G1 στην S ελέγχεται με τη σύνδεση της Cdc2 με τις κυκλίνες G1 ή Clns, ενώ η προαγωγή της φάσης S εξασφαλίζεται από το σύμπλοκο της Cdc28 με τις κυκλίνες τύπου B Clb5 και Clb6. Τέλος, η μετάβαση από τη φάση G2 στη φάση M επιτυγχάνεται με το σχηματισμό συμπλόκου της Cdc2 με τις μιτωτικές κυκλίνες (Clb1, Clb2, Clb3 και Clb4) (Nurse et al., 1976) Ρύθμιση των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών Οι κύριοι μηχανισμοί ρύθμισης της δράσης των συμπλόκων κινασών/κυκλινών αφορούν: α) Θετικές ή αρνητικές φωσφορυλιώσεις και αποφωσφορυλιώσεις από άλλες κινάσες ή φωσφατάσες Η πρόσδεση της κυκλίνης απαιτείται αλλά δεν είναι από μόνη της ικανή προκειμένου να ενεργοποιήσει την κινάση. Η ενεργότητα των συμπλόκων κινασών/κυκλινών προϋποθέτει τη φωσφορυλίωση της κινάσης σε ένα συγκεκριμένο κατάλοιπο σερίνης ή θρεονίνης. Η φωσφορυλίωση αυτή γίνεται από άλλες κινάσες (τις CAKs ή CDKs Activating Kinases). Για παράδειγμα η πλήρης ενεργοποίηση 15

13 Εισαγωγή της CDK1 απαιτεί τη φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 161 (Τ172 για στην CDK4 και Τ160 στην CDK2), που προκαλείται από το σύμπλοκο CDK7-κυκλίνης Η που έχει δράσης CAK. Αυτές οι φωσφορυλιώσεις προκαλούν αλλαγή στη διαμόρφωση του μορίου και ενισχύουν έτσι την πρόσδεση στις κυκλίνες (Jeffrey et al., 1995; Paulovich and Hartwell, 1995). Το σύμπλοκο υπόκειται και σε αρνητική φωσφορυλίωση: φωσφορυλίωση στα κατάλοιπα Thr14/Thr15 της κινάσης κρατούν το σύμπλοκο ανενεργό. Η φωσφορυλίωση αυτή πραγματοποιείται από τις κινάσες Μik1/Wee 1 και η αφαίρεση της αδρανοποιητικής φωσφορικής ομάδας από τη φωσφατάση Cdc25 απαιτείται για την ενεργοποίηση της CDK (Perez et al., 2006). β) Μοριακοί αναστολείς των συμπλόκων κυκλινών/κινασών (CKIs): Η ενεργότητα των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών μπορεί να ανασταλεί από πρωτεΐνες-αναστολείς του κυτταρικού κύκλου, τους καλούμενους αναστολείς των CDKs (CKIs), οι οποίοι είτε προσδένονται μόνο στη CDK είτε στο σύμπλοκο CDKκυκλίνης ρυθμίζοντας την ενεργότητα της CDK. Υπάρχουν δύο διακριτές οικογένειες CKIs: η οικογένεια INK4 και η CIP/KIP (Polyak et al., 1994a). α) Στους αναστολείς της οικογενείας INK4 (Inhibitors of Kinase 4) περιλαμβάνονται οι: p15 (INK4b), p16 (INK4a), p18 (INK4c), p19 (INK4d), οι οποίοι αναστέλλουν ειδικά τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες της φάσης G1 (CDK4, CDK6). Αυτοί οι CKIs σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα με τη CDK πριν την πρόσδεση στην κυκλίνη, αποτρέποντας τη δέσμευση με την κυκλίνη D (Carnero and Hannon, 1998). Οικογένεια CKI Λειτουργία Μέλη της οικογένειας INK4 Cip/Kip Απενεργοποίηση CDKs της G1 φάσης (CDK4, CDK 6) Απενεργοποίηση συμπλόκου CDK2-κυκλίνης Α της G1 φάσης και του συμπλόκου CDK1- κυκλίνης Β p15 (ΙΝΚ4b) p16 (ΙΝΚ4a) p18 (ΙΝΚ4c) p19 (ΙΝΚ4d) p21 (Waf1, Cip1) p27 (Cip2) p57 (Kip2) Πίνακας 1.2. Οι δύο οικογένειες αναστολέων των CDKs και οι λειτουργίες τους 16

14 Εισαγωγή β) Η οικογένεια αναστολέων CIP/KIP (Cyclin/Kinase Inhibitory Proteins) περιλαμβάνει τους αναστολείς p21 (Waf1, Cip1), p27 (Cip2), p57 (Kip2), οι οποίοι αναστέλλουν σύμπλοκα CDK/κυκλινών (Harper et al., 1995; Lee et al., 1995; Polyak et al., 1994b; Quaglia et al., 2006). Αναστέλλουν τα σύμπλοκα CDK CDK2- κυκλίνης Α της φάσης G1 και σε μικρότερο βαθμό τα σύμπλοκα CDK1-κυκλίνης Β (Hengst et al., 1998). Το p21 επίσης αναστέλλει τη σύνθεση του DNA μέσω της πρόσδεσής του στο PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) (Pan et al., 1995; Waga et al., 1997). Οι CKIs ρυθμίζονται τόσο από ενδογενή όσο και από εξωγενή σήματα: το p21 υφίσταται μεταγραφικό έλεγχο από το p53, μέσω πρόσδεσης του p53 στον υποκινητή του p21 οπότε και ενεργοποιείται η μεταγραφή του τελευταίου (el- Deiry et al., 1993). Επιπλέον, η έκφραση και η ενεργοποίηση αντίστοιχα των αναστολέων p15 και p27 αυξάνεται σε απόκριση στον αυξητικό παράγοντα TGF-β, συνεισφέροντας στην αναστολή της ανάπτυξης (Girard et al., 1991; Hannon and Beach, 1994; Lee et al., 1995). γ) Μεταγραφική ρύθμιση των κυκλινών Η θετική και η αρνητική ρύθμιση που επιτελείται με τις φωσφορυλιώσεις και τις αποφωσφορυλιώσεις των συμπλόκων κινασών/κυκλινών, επηρεάζει τις κυκλίνες και σε επίπεδο μεταγραφής. Συγκεκριμένα, σύμπλοκα κινασών/κυκλινών που εκφράζονται νωρίς κατά τον κύκλο ρυθμίζουν έμμεσα τη μεταγραφή κυκλινών που εμφανίζονται αργότερα στον κύκλο, ενεργοποιώντας τους κατάλληλους μεταγραφικούς παράγοντες ενώ παράλληλα αναστέλλουν και τη δική τους μεταγραφή (Zwicker et al., 1995). δ) Ρύθμιση των κυκλινών μέσω πρωτεόλυσης: CDKs APC: δύο αντίθετες δυνάμεις Ο ευκαρυωτικός κυτταρικός κύκλος χαρακτηρίζεται από την περιοδική συσσώρευση και ουβικουϊτίνο-εξαρτώμενη αποικοδόμηση των κυκλινών. Το SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) και το APC (Anaphase Promoting Complex) αποτελούν τις δύο μεγάλες ομάδες λιγασών ουβικουϊτίνης, οι οποίες με τη δράση τους, στοχεύουν πρωτεΐνες-κλειδιά, η αποικοδόμηση των οποίων είναι αναγκαία για τη μετάβαση από την G1 στην S και από την M στην G1 αντίστοιχα. Οι μιτωτικές CDKs, που απαιτούνται για την είσοδο στη μίτωση, ενεργοποιούν το APC/C, μια Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης. Η πρώτη μορφή του APC/C που δρα ρυθμίζεται από την 17

15 Εισαγωγή πρωτεΐνη Cdc20. Το APC/C Cdc20 απαιτείται για τον αποχωρισμό των αδελφών χρωματίδων και ξεκινά τη διαδικασία της πρωτεόλυσης των κυκλινών. Το Cdc20 μπορεί να ενεργοποιήσει το APC/C που έχει υπερφωσφορυλιωθεί από την M-CDK και πιστεύεται ότι το APC/C Cdc20 προωθεί την απενεργοποίησή της Μ-CDK με το να μειώνει τα επίπεδα της κυκλίνης. Μια δεύτερη μορφή του APC/C, που ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη Cdh1, ενεργοποιείται μετά την εξαρτώμενη από το Cdc20 απενεργοποίηση των CDK. Το APC/C Cdh1 όχι μόνο συμβάλλει στην πρωτεόλυση των κυκλινών αλλά επίσης στοχεύει το Cdc20 για πρωτεόλυση, ολοκληρώνοντας την απενεργοποίηση του APC/C Cdc20. Η ενεργότητα του APC/C κατά τη μίτωση ρυθμίζεται από διάφορα δίκτυα, όπως το σημείο ελέγχου σχηματισμού της ατράκτου, το δίκτυο FEAR (Cdc fourteen early anaphase release) και το δίκτυο MEN (mitotic exit network). Τα δύο τελευταία περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση της Cdc14, μιας φωσφατάσης, η οποία αποφωσφορυλιώνει μια σειρά υποστρωμάτων των CDKs και προάγει την έξοδο από τη μίτωση. Κατά τη G1, οι CDKs διατηρούνται σε ανενεργή μορφή τόσο από το APC/C Cdh1 όσο και τους CKIs. Συνήθως οι κυκλίνες της G1 δεν αποτελούν υποστρώματα του APC/C. Η ενεργοποίηση των CDKs στην G1 είναι απαραίτητη προκειμένου να απενεργοποιηθεί το APC/C Cdh1 και να στοχευθούν οι CKIs για αποικοδόμηση από μια δεύτερη Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης, την SCF. Αυτές οι διαδικασίες από κοινού προάγουν την ενεργοποίηση των CDKs της φάσης S. Μετέπειτα, ενεργοποιούνται οι CDKs της μίτωσης και αναστέλλουν τη μεταγραφή των κυκλινών της G1. Εικόνα Τα σύμπλοκα κυκλινών-cdks που συμμετέχουν σε κάθε στάδιο του κυτταρικού κύκλου ανωτέρων ευκαρυωτικών οργανισμών. 18

16 Εισαγωγή ε) Η αλλαγή στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό ως μέσο ρύθμισης Ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου αποτελεί έναν άλλο τρόπο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και συνεισφέρει στη σωστή πρόοδο των φάσεων. Η σωστή χρονικά έκφραση των μορίων είναι πολύ σημαντική και αναγκαία συνθήκη για την εκδήλωση της δράσης τους αλλά αυτή από μόνη της απουσία του σωστού εντοπισμού, δεν είναι ικανή και επαρκής για τη δράση του μορίου. Το φαινόμενο της αλλαγής του ενδοκυτταρικού εντοπισμού είναι ευρέως διαδεδομένο σε ρυθμιστικά μόρια του κυτταρικού κύκλου, τόσο σε μόρια κυκλινών, όπως οι κυκλίνες Α και Β1, αλλά και σε άλλα των οποίων η απουσία από τον πυρήνα διασφαλίζει τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κρίσιμες καταστάσεις όπου θα πρέπει π.χ. να επιδιορθωθούν βλάβες στο DNA. Ο τρόπος αυτός ρύθμισης παρουσιάζεται εκτενέστερα στο κεφάλαιο Αντιγραφή του DNA Σημεία έναρξης της αντιγραφής Η πλήρης και ακριβής αντιγραφή του γενετικού υλικού απαιτείται για τη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος σε όλους τους οργανισμούς. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η βασική λειτουργία της αντιγραφής του DNA πραγματοποιείται από ένα δίκτυο πρωτεϊνών, που συνεργάζονται μεταξύ τους προκειμένου να διπλασιάσουν τη γενετική πληροφορία του κυττάρου γρήγορα και με ακρίβεια. Τα γεγονότα της αντιγραφής ξεκινούν από πολλαπλές αφετηρίες αντιγραφής στα μεγάλα γονιδιώματα των ευκαρυωτικών οργανισμών. Οι αλληλουχίες που απαιτούνται για να καθορίσουν τις αφετηρίες της αντιγραφής διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ευκαρυωτικών οργανισμών. Στο μονοκύτταρο ευκαρυώτη S. cerevisiae,3-4 αλληλουχίες αποτελούμενες από bp εντός τμημάτων DNA, μεγέθους bp στο γονιδίωμα του μύκητα, μπορούν να δράσουν ως αφετηρίες. Αυτές οι αλληλουχίες περιλαμβάνουν τα υψηλά συντηρημένα στοιχεία Α (Αelements ή ARS consensus sequence, ACS) και τα λιγότερο καλά συντηρημένα στοιχεία Β (B-elements) (Bell, 1995). Σε άλλους οργανισμούς, τα στοιχεία που απαιτούνται για να κατευθύνουν την έναρξη της αντιγραφής είναι πιο πολύπλοκα. Στον S. pombe, απαιτούνται στοιχεία συνολικού μήκους bp, τα οποία 19

17 Εισαγωγή φέρουν πλούσιες σε αδενίνη και θυμίνη αλληλουχίες μήκους bp (Clyne and Kelly, 1995; Dubey et al., 1994). Στα μετάζωα, οι αφετηρίες είναι λιγότερο καλά καθορισμένες (Bell, 1995; Bielinsky et al., 2001), ενώ κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης μπορεί να εναλλάσσονται οι αφετηρίες που χρησιμοποιούνται. Σε διαφορετικές υποπεριόδους της φάσης S πυροδοτούνται διαφορετικές αφετηρίες της αντιγραφής, δημιουργώντας ένα «πρόγραμμα αντιγραφής», όπου διαφορετικά τμήματα του χρωμοσωμικού υλικού αντιγράφονται σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές. Σε κύτταρα με μικρότερης διάρκειας S φάση, όπως τα εμβρυϊκά, συνήθως ενεργοποιούνται αφετηρίες σε μικρότερη απόσταση. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι άλλοι παράγοντες, εκτός από την αλληλουχία του DNA, όπως η χρωματινική δομή, παίζουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό των αφετηριών της αντιγραφής Το σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής Πώς γνωρίζει το κύτταρο εάν έχει ήδη αντιγράψει ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA στην S φάση; Τί διασφαλίζει την αυστηρή εναλλαγή των φάσεων S και M; Το 1988, οι Blow και Laskey διατύπωσαν το μοντέλο αδειοδότησης της αντιγραφής βασισμένοι σε in vitro πειράματα με ωοκύτταρα Xenopus. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, η έναρξη της αντιγραφής σε μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος κατά τη φάση S απαιτεί την προηγούμενη αδειοδότηση της περιοχής για αντιγραφή. Η αδειοδότηση απαιτεί τη μετάβαση από τη μίτωση και αποτρέπεται η έναρξη της αντιγραφής στον ίδιο κυτταρικό κύκλο. Πειράματα μελέτης της δομής της χρωματίνης in vivo στο ζυμομύκητα S.cerevisiae έδειξαν ότι οι αφετηρίες της αντιγραφής εναλλάσσονται μεταξύ δύο διακριτών καταστάσεων (Diffley, 2001). Κατά τη G1 όλες οι αφετηρίες βρίσκονται στην προ-αντιγραφική κατάσταση (pre- Replicative state). Αντίθετα από τη στιγμή της έναρξης της αντιγραφής μέχρι το πέρασμα από τη μίτωση οι αφετηρίες περνούν στη μετα-αντιγραφική κατάσταση (post-replicative state). Η προ-αντιγραφική και μετα-αντιγραφική κατάσταση καθορίζεται από τη στρατολόγηση διαφορετικών πρωτεϊνών στις αφετηρίες αντιγραφής. Στις αφετηρίες της αντιγραφής, στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, σχηματίζεται σταδιακά ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, που θα καταλήξει στη συγκρότηση της 20

18 Εισαγωγή διχάλας αντιγραφής του DNA. Προϋπόθεση για την έναρξη της αντιγραφής του γενετικού υλικού σε κάθε θέση του γονιδιώματος αποτελεί η δημιουργία του προαντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) στις αφετηρίες της αντιγραφής κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τη διαδοχική στρατολόγηση ενός μεγάλου αριθμού παραγόντων της αντιγραφής, όπως οι πρωτεΐνες ORC (Origin Recognition Complex: Σύμπλοκο Αναγνώρισης Αφετηριών), Cdc6/18, Cdt1 και MCM2-7. Η μετάβαση στην S φάση περιλαμβάνει τη διαδοχική προσέλκυση επιπρόσθετων παραγόντων στα σημεία έναρξης της αντιγραφής, οι οποίοι διευκολύνουν το ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA, στρατολογούν τις αντιγραφικές πολυμεράσες και επάγουν την πυροδότηση των αφετηριών. Το προτεινόμενο μοντέλο της αδειοδότησης περιλαμβάνει τα εξής γεγονότα (Diffley and Labib, 2002), (Εικόνα 1.2): 1. Εξαμερή σύμπλοκα των πρωτεϊνών ORC (Origin Recognition Complex), καταλαμβάνουν τις αφετηρίες της αντιγραφής. Στις ζύμες, οι ORC1-6 παραμένουν προσδεδεμένες στην χρωματίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ενώ στα μετάζωα κάποιες από τις υπομονάδες (πχ. Orc1) αποδεσμεύονται από το DNA μετά την έναρξη της S. 2. Μετά τη μίτωση, οι πρωτεΐνες Cdc6 και Cdt1, στρατολογούνται στη χρωματίνη, όπου και δεσμεύονται ανεξάρτητα η μια από την άλλη. 3. Με τη σειρά τους, οι παράγοντες αυτοί προσελκύουν στις αφετηρίες τις έξι υπομονάδες του συμπλόκου των MCM πρωτεϊνών, ολοκληρώνοντας έτσι τη δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου και κατ επέκταση τη διαδικασία της αδειοδότησης 4. Με την πρόσδεση των πρωτεϊνών Cdc45, Sld3 και πιθανόν και άλλων παραγόντων, το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο μετατρέπεται σε προ-εναρκτήριο σύμπλοκο (preinitiation complex ή pre-ic). Τελικά, πρωτεΐνες κι ένζυμα που σχετίζονται άμεσα με τη διαδικασία της αντιγραφής, όπως οι DNA πολυμεράσες, οι παράγοντες Sld2, GINS και η RPA προσελκύονται επίσης στις θέσεις αυτές. 5. Κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S, δύο κινάσες, η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση της S φάσης (S-CDK) και η DDK (Dbf4-dependent Kinase), αναλαμβάνουν την ενεργοποίηση των αφετηριών. Η δράση τους σχετίζεται με τη φωσφορυλίωση πολλών συστατικών των συμπλόκων στις αφετηρίες, γεγονός το οποίο συνεπάγεται πιθανή αλλαγή στη στερεοδιαμόρφωση του συμπλόκου, που διευκολύνει την 21

19 Εισαγωγή προσέλευση και άλλων παραγόντων, την προσέλκυση ενζύμων πολυμερισμού και τελικά την πυροδότηση της έναρξης της αντιγραφής. Εικόνα Η αδειοδότηση της αντιγραφής από το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου μέχρι την έναρξη της αντιγραφής (τροποποίηση από Forsburg, 2004). 22

20 Εισαγωγή Τα συστατικά του προ-αντιγραφικού συμπλόκου ORC1-6 (Origin Recognition Complex)- σύμπλεγμα αναγνώρισης αφετηριών Πρόκειται για ένα σύμπλοκο 6 συντηρημένων κατά την εξέλιξη πρωτεϊνών, που ανακαλύφθηκαν στο ζυμομύκητα S. cerevisiae, και μπορούν να αναγνωρίζουν και να προσδένονται ειδικά στις αφετηρίες της αντιγραφής με ATP-εξαρτώμενο τρόπο (Bell and Stillman, 1992). Η πρόσδεση του ORC συμπλόκου στις αφετηρίες αποτελεί το πρώτο βήμα της συγκρότησης του προ-αντιγραφικού συμπλόκου, καθώς η παρουσία τους είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την επακόλουθη πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM. Στο σακχαρομύκητα το σύμπλοκο των ORC πρωτεϊνών προσδένεται ειδικά σε ένα διμερές στοιχείο εντός αφετηριών της αντιγραφής και παραμένει προσδεδεμένο καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ακόμα και κατά τη μίτωση (Diffley and Labib, 2002). Στους ανώτερους ευκαρυώτες, in vitro βιοχημικά δεδομένα σε εκχυλίσματα ωοκυττάρων Xenopus (Romanowski et al., 2000) δείχνουν σταθερή δέσμευση των υπομονάδων ORC, ενώ in vivo κινητική ανάλυση σε ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια φέρνει στην επιφάνεια τη δυναμική φύση της αλληλεπίδρασης αυτής κατά τη μεσόφαση (McNairn et al., 2005). Cdc6/18 Το γονίδιο CDC6 (Cdc18 στον S. pombe) ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στον S. cerevisiae ύστερα από μελέτη γενετικής σάρωσης (screening) γονιδίων απαραίτητων για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (Hartwell et al., 1973). Λίγο αργότερα αναγνωρίστηκε ως ένας παράγοντας απαραίτητος για τη σωστή έναρξη της αντιγραφής (Hartwell, 1976; Nurse et al., 1976). To Cdc6 είναι μέλος της οικογένειας των ΑΑΑ+ ATPασών. Για την πρόσδεσή του στη χρωματίνη απαιτείται η παρουσία των πρωτεϊνών ORC ενώ αυτό με τη σειρά του απαιτείται για τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών MCM στο DNA (Cocker et al., 1996). Η ρύθμιση του Cdc6 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι ιδιαίτερα αυστηρή και πραγματοποιείται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο. 23

21 Εισαγωγή Μύκητες Στο σακχαρομύκητα και το σχιζοσακχαρομύκητα τα επίπεδα του mrna αλλά και της πρωτεΐνης Cdc6 είναι αυξημένα κατά την G1 ενώ μετά τη μετάβαση στη φάση S κατόπιν φωσφορυλίωσης από CDK η πρωτεΐνη αποικοδομείται (Nishitani and Nurse, 1997; Piatti et al., 1995) από το σύστημα ουβικουϊτίνης (Baum et al., 1998). Ανώτερα ευκαρυωτικά Στα θηλαστικά η ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdc6/Cdc18 διαφοροποιείται σε σχέση με το ζυμομύκητα. Ένα μέρος της πρωτεΐνης Cdc6/18 παραμένει σταθερά προσδεδεμένο πάνω στη χρωματίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Fujita et al., 1999; Mendez and Stillman, 2000). Μετά την αρχή της φάσης S, το σύμπλοκο κυκλίνης Α/CDK2 φωσφορυλιώνει το διαλυτό κλάσμα της πρωτεΐνης Cdc6/Cdc18 οπότε και εξάγεται στο κυτταρόπλασμα (Jiang et al., 1999), ενώ μέρος της πρωτεΐνης Cdc6/18 στο τέλος της μίτωσης αποικοδομείται από το σύστημα APC (Petersen et al., 2000), γεγονός που διασφαλίζει ότι δε θα πυροδοτηθούν αφετηρίες αντιγραφής λανθασμένα. Κατά την είσοδο στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση G0, το Cdc6 φωσφορυλιώνεται από το σύμπλοκο κυκλίνης Ε-CDK2 και η τροποποίηση αυτή παρεμποδίζει την αποικοδόμησή του από το APC/C. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η συσσώρευση του παράγοντα αδειοδότησης Cdc6 κατά την είσοδο στη G1, νωρίτερα από τους αναστολείς Geminin και κυκλίνη Α (Εικόνα 1.4) (Mailand and Diffley, 2005). Αυτός ο μηχανισμός ρύθμισης της πρωτεϊνικής σταθερότητας ανοίγει ένα χρονικό παράθυρο πριν τη φάση S, που επιτρέπει τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Εικόνα Οι αντίθετες δράσεις του APC και της κυκλίνης Ε-CDK2 στη σταθερότητα του Cdc6 και τη συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου κατά την επανείσοδο στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση ηρεμίας G0 (τροποποίηση από Ayad, 2005). 24

22 Εισαγωγή Cdt1 (Cdc10-dependent transcript 1) Αρχικά αναγνωρίστηκε στο σχιζοσακχαρομύκητα S. pombe, ως στόχος του μεταγραφικού παράγοντα Cdc10, ο οποίος είναι απαραίτητος για την μετάβαση G1/S. Γενετική αφαίρεση του Cdt1 οδηγεί σε παρεμπόδιση της αντιγραφής του DNA και ελαττωματικό σημείο ελέγχου κατά την S φάση (Hofmann and Beach, 1994). Οι παράγοντες Cdt1 και Cdc6 αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και συνεργάζονται για τη «φόρτωση» του εξαμερούς συμπλόκου Mcm2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής (Nishitani et al., 2000). Απουσία ενός εκ των δύο αυτών παραγόντων οδηγεί σε αδυναμία πρόσδεσης του συμπλόκου MCM στην χρωματίνη, χωρίς να επηρεάζεται η πρόσδεση των ORCs (Maiorano et al., 2000; Nishitani et al., 2000). Η δέσμευσή τους στην χρωματίνη έπεται αυτής του συμπλέγματος των Orc1-6, ενώ στον S. pombe δεσμεύονται ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλο στη χρωματίνη (Nishitani et al., 2000). Αντίστοιχα πειράματα σε κύτταρα θηλαστικών έδειξαν ότι για τη δέσμευση των MCM στις αφετηρίες, απαιτείται τόσο ο παράγοντας Cdc6 όσο και ο Cdt1 (Cook et al., 2004). Ο παράγοντας Cdt1 αλληλεπιδρά in vitro με τις MCM πρωτεΐνες, και συγκεκριμένα με την υπομονάδα MCM2 στα θηλαστικά (Cook et al., 2004) και το σύμπλεγμα των MCM 4, 6, 7 στον ποντικό (Yanagi et al., 2002). Υπερέκφραση του Cdt1 στον S. pombe, συνδυαζόμενη με σταθερή έκφραση του Cdc6, οδηγεί το κύτταρο σε συνεχείς κύκλους διπλασιασμού, χωρίς να παρεμβάλλεται μίτωση (Nishitani et al., 2000). Στο C. elegans, υπερέκφραση του Cdt1, μέσω παρεμπόδισης της φυσιολογικής αποικοδόμησής του από την Cul-4 κατά τη φάση S, οδηγεί σε συνεχή διπλασιασμό του γονιδιώματος (Zhong et al., 2003). Εξωγενής προσθήκη μόνο του Cdt1 σε εκχυλίσματα Xenopus που βρίσκονται στη φάση G2 είναι ικανή να πυροδοτήσει υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος (Maiorano et al., 2005), αποδεικνύοντας ότι ο παράγοντας Cdt1 αποτελεί μόριο-κλειδί στη ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής. Τέλος, σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές η υπερέκφραση του Cdt1 από μόνη της επαρκεί για να προκαλέσει επαναδιπλασιασμό του γονιδιώματος (Vaziri et al., 2003), αναδεικνύοντας έτσι τη σημασία ενός αυστηρού ελέγχου στο Cdt1. 25

23 Εισαγωγή Τρόποι ρύθμισης του Cdt1 Στα θηλαστικά και στο σχιζοσακχαρομύκητα S. pombe, ο παράγοντας Cdt1 είναι παρόν κατά την G1 και με την είσοδο των κυττάρων στη φάση S πρωτεολύεται μέσω ουβικουϊτινο-εξαρτώμενης αποικοδόμησης από το 26 S πρωτεάσωμα (Li and Blow, 2005; Nishitani et al., 2004; Nishitani et al., 2001). Στον S. pombe, ο SpCdt1 υπόκειται σε μεταγραφική ρύθμιση από το Cdc10 (Hofmann and Beach, 1994), ενώ στα θηλαστικά έχει δειχθεί ρύθμιση από το μεταγραφικό παράγοντα E2F (Yoshida and Inoue, 2004). Στον S. cerevisiae μόνο έχει παρατηρηθεί έλεγχος της ενεργότητας του ScCdt1 μέσω αλλαγής της ενδοκυτταρικής του εντόπισης. Η πρωτεΐνη μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα μετά την πυροδότηση της αντιγραφής, γεγονός, το οποίο συμπίπτει χρονικά με την αύξηση της ενεργότητας των CDKs (απαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής), προσφέροντας έτσι μια επιπλέον δικλείδα ασφαλείας για την αποφυγή της επαναπυροδότησης της αντιγραφής μετά την S (Tanaka and Diffley, 2002). Στα μετάζωα υφίσταται ένας επιπλέον μηχανισμός ρύθμισης του Cdt1, από μία μικρή πρωτεΐνη, τη Geminin (Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Συνοπτικά, οι μηχανισμοί ρύθμισης του Cdt1 σε κατώτερους και ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.2 και στην Εικόνα 1.4. Οργανισμός Πρωτεόλυση μέσω Μεταφορά στο κυτταρόπλασμα Αναστολή από τη Μεταγραφική ρύθμιση ουβικουϊτινυλίωσης κατά τη φάση S Geminin S. cerevisiae S. pompe (από Cdc10) Άνθρωπος (από E2F) Πίνακας 1.3. Ρύθμιση του Cdt1 σε ζύμες και άνθρωπο. Η πρωτεΐνη Cdt1 αλληλεπιδρά με δυναμικό τρόπο με τη χρωματίνη από το τέλος της τελόφασης και κατά τη διάρκεια της G1 (Xouri et al., 2007), οπότε έχει προταθεί ότι λαμβάνει χώρα η αδειοδότηση της αντιγραφής (Dimitrova et al., 2002; Okuno et al., 2001). Οι δυναμικές αυτές αλληλεπιδράσεις μπορεί να έχουν μικρή ή μεγαλύτερη 26

24 Εισαγωγή διάρκεια ζωής (Xouri et al., 2007) και η συμπεριφορά αυτή ανταποκρίνεται στο μοντέλο συνεχούς σάρωσης του γονιδιώματος από τις προσδενόμενες στη χρωματίνη πρωτεΐνες, οι οποίες βρίσκονται σε δυναμική αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη προς αναζήτηση της κατάλληλης θέσης δέσμευσης (Phair et al., 2004). Εικόνα 1.5. Σχηματική αναπαράσταση του τρόπου ρύθμισης των παραγόντων Cdc6 και Cdt1 σε κατώτερους και ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. (Τροποποίηση από Maiorano and Mechali, 2002). MCMs (minichromosome maintenance) Πρόκειται για μία οικογένεια 6 πρωτεϊνών (MCM2-7) με καθοριστικό ρόλο στην έναρξη της αντιγραφής. Σύμφωνα με το διαμορφωμένο μοντέλο για την αδειοδότηση της αντιγραφής, είναι οι τελευταίες πρωτεΐνες που πρέπει να προσδεθούν στην χρωματίνη, προκειμένου να αδειοδοτηθεί η χρωματίνη για τον επόμενο κύκλο αντιγραφής και πιστεύεται ότι έχουν δράση ελικάσης (Aparicio et al., 1997; Ishimi, 1997). Τα μέλη αυτής της οικογένειας παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα στην αλληλουχία τους, ιδιαίτερα σε μία κεντρική περιοχή του μορίου τους έκτασης 240 αμινοξέων, όπου περιέχεται ένα μοτίβο GXXGXGKS/T (όπου G: γλυκίνη και Χ: είτε σερίνη είτε αλανίνη ανάλογα με το είδος της πρωτεΐνης MCM) (Kearsey and Labib, 27

25 Εισαγωγή 1998), το οποίο αποτελεί και περιοχή δέσμευσης του ATP. Πιστεύεται ότι δρουν σχηματίζοντας έναν εξαμερή δακτύλιο, μεγέθους 600 kda, γύρω από την διπλή έλικα του DNA στην περιοχή των αφετηριών της αντιγραφής, με πιθανή ενεργότητα ελικάσης. Διαδραματίζουν έτσι, καθοριστικό ρόλο τόσο στην αδειοδότηση της αντιγραφής όσο και στη φάση επιμήκυνσης της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας (Labib et al., 2000; Prokhorova and Blow, 2000). Οι πρωτεΐνες ΜCΜ συνδέονται και αποσυνδέονται από τη χρωματίνη ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου (Οgana T., et al.1996). Συγκεκριμένα, η πρόσδεσή τους στη χρωματίνη πραγματοποιείται στο τέλος της μίτωσης και διαμεσολαβείται από τις πρωτεΐνες Cdc6/18 και Cdt1, ενώ αποδεσμεύονται από αυτήν όταν ολοκληρώνεται η αντιγραφή μιας γονιδιωματικής περιοχής. Αυτή ακριβώς η διαδικασία δέσμευσης-αποδέσμευσης των πρωτεϊνών MCM από την χρωματίνη είναι που καθιστά τα κύτταρα ικανά να αντιγράφουν το γενετικό τους υλικό αποκλειστικά και μόνο κατά τη διάρκεια της φάσης S. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η πρόσδεση στη χρωματίνη ενός άλλου μέλους της οικογένειας των MCM, της hmcm8, συμβαίνει πρώιμα κατά τη διάρκεια της φάσης G1 και προηγείται της πρόσδεσης του συμπλόκου hmcm2-7 (Volkening and Hoffmann, 2005). Σακχαρομύκητας Στο σακχαρομύκητα S. cerevisiae ενδιαφέρον παρουσιάζει η ρύθμιση που υφίστανται οι πρωτεΐνες MCM σε επίπεδο ενδοκυτταρικής κατανομής συναρτήσει της φάσης του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, είναι πυρηνικές κατά την G1, ενώ με την έναρξη της S μεταφέρονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Dalton and Whitbread, 1995; Nguyen et al., 2000; Young et al., 1997). Πιθανόν ύστερα από έντονη φωσφορυλίωσή τους από τις CDK, που συμπίπτει με την έναρξη της S, να στοχεύονται για έξοδο από τον πυρήνα (Kimura et al., 1996; Musahl et al., 1995; Schulte et al., 1995; Todorov et al., 1998). Έχει, επίσης, δειχθεί ότι ενώ οι Β κυκλίνες μόνες τους πυροδοτούν τις αφετηρίες της αντιγραφής, δρώντας από κοινού με τις κυκλίνες της G1 φάσης οδηγούν την υπομονάδα MCM4 εκτός πυρήνα (Labib et al., 1999). Άνθρωπος Έξι MCM πρωτεΐνες (HsMcm2-7) έχουν βρεθεί και στον άνθρωπο βάσει της ομολογίας των αλληλουχιών τους με τις MCM των υπολοίπων ειδών. Εισαγωγή αντί- 28

26 Εισαγωγή νοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων έναντι του mrna του HsMCM7 γονιδίου σε ανθρώπινα κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S από τη G0 (Fujita et al., 1996). Ομοίως, πειράματα εισαγωγής αντισωμάτων εναντίον των HsMCM2 και HsMCM3 σε G1 πυρήνες είχε σαν αποτέλεσμα αναστολή της έναρξης της S στο 50% της καλλιέργειας. Έτσι, διαπιστώθηκε η συμμετοχή των MCM πρωτεϊνών στη διαδικασία έναρξης της αντιγραφής του DNA και στα θηλαστικά. Σε αντίθεση με τo σακχαρομύκητα S. cerevisiae, η ενδοκυτταρική εντόπιση των HsMCM δε φαίνεται να μεταβάλλεται. Παραμένουν πυρηνικές καθ όλη τη διάρκεια του κύκλου, ενώ αποδεσμεύονται από την χρωματίνη κι ελευθερώνονται στο πυρηνόπλασμα με την έναρξη της S (Fujita et al., 1996; Kimura et al., 1996; Todorov et al., 1998). Στο ακόλουθο σχήμα συνοψίζονται -σύμφωνα με τα προηγούμενα- οι τρόποι ρύθμισης των συστατικών του προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Εικόνα 1.6. Γενικό σχήμα ρύθμισης των συστατικών του προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Α. Με τη δράση του APC απομακρύνονται αναστολείς του προαντιγραφικού συμπλόκου, όπως οι κυκλίνες και η Geminin. Οι CKIs επίσης αναστέλλουν τις CDKs. Οι CDKs γενικά αναστέλλουν τα περισσότερα από τα συστατικά του προ-αντιγραφικού συμπλόκου ενώ η Geminin αναστέλλει το Cdt1 στα μετάζωα. Β. Στις ζύμες, η ρύθμιση πραγματοποιείται κυρίως μέσω των CDKs. C. Στα μετάζωα η Geminin είναι ιδιαίτερα σημαντική ενώ οι CDKs παίζουν δευτερεύοντα ρόλο (Mailand and Diffley, 2005). 29

27 Εισαγωγή Geminin: αρνητικός ρυθμιστής του Cdt1 Η Geminin, μία μικρή πρωτεΐνη μεγέθους 25 kda περίπου, ανακαλύφθηκε αρχικά στο Xenopus laevis ως υπόστρωμα του APC (Anaphase Promoting Complex), του πρωτεολυτικού συμπλόκου, που δραστηριοποιείται κατά τη μετάβαση από τη μετάφαση στην ανάφαση (McGarry and Kirschner, 1998). Το όνομά της προέρχεται από τη λέξη gemini που σημαίνει δίδυμος και αρχικά δόθηκε επειδή βρέθηκαν δύο ομόλογά της (geminin L και geminin H) στο Xenopus, τα οποία είναι 89% ίδια σε αμινοξικό επίπεδο και φαίνεται να έχουν ίδιες ιδιότητες. Επιπλέον, η αποκάλυψη του διττού της ρόλου, τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και κατά τον κυτταρικό κύκλο, αποτελούν μια επιπλέον επιβεβαίωση του ονόματός της. Η Geminin έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο, στο Xenopus (McGarry and Kirschner, 1998), στη Drosophila (Quinn et al., 2001), στον ποντικό (Yanagi et al., 2002), στο C. elegans (Yanagi et al., 2005), ενώ ακόμα δεν υπάρχει καμία ένδειξη για ομόλογό της στο ζυμομύκητα. Πιστεύεται ότι ο έλεγχος της αντιγραφής του DNA έχει εξελιχθεί από τους μύκητες ως τα ανώτερα θηλαστικά με την επιπρόσθετη ρύθμιση του Cdt1 από την Geminin. Είναι επίσης πιθανό να υπάρχει η Geminin στους μύκητες αλλά να μην έχει ταυτοποιηθεί ακόμα. Το ομόλογο του Cdt1 στο σακχαρομύκητα εμφανίζει μονο 12% ομολογία με το Xenopus Cdt1 και αντίστοιχα και για τη Geminin ενδεχομένως το πιθανό ορθόλογο να μοιράζεται πολύ χαμηλό ποσοστό ομολογίας με τα αντίστοιχα των ανώτερων ευκαρυωτικών (Tanaka and Diffley, 2002). Πρόσφατα, ανακαλύφθηκε στο φυτό Arabidopsis, (Wildwater et al., 2007) μόριο, το οποίο αν και δεν εμφανίζει ομοιότητα με τη Geminin, φαίνεται να αλληλεπιδρά με το Cdt1 και ενδεχομένως να αποτελεί μόριο με παρόμοια λειτουργία με τη Geminin. 30

28 Εισαγωγή Δομικά χαρακτηριστικά στοιχεία του μορίου Περιοχή 50 περίπου αμινοξέων, προς το αμινοτελικό άκρο, κατέχει ρόλο στη δημιουργία του νευρικού δίσκου κατά τα πρώτα στάδια της εμβρυογένεσης (Kroll et al., 1998; Quinn et al. 2001). Στο αμινοτελικό άκρο του μορίου (αα 23-31) ανευρίσκεται μία αλληλουχία 9 αμινοξέων, που καλείται αλληλουχία αποικοδόμησης (destruction box) (Xenopus: RRTLKVIQP), η οποία ομοιάζει με τη συναινετική αλληλουχία (consensus sequence) στόχευσης των μιτωτικών κυκλινών για αποικοδόμηση (RxALGVIxN). Η περιοχή αυτή απαιτείται για την αναγνώρισή της από το APC και την ουβικουϊτινο-εξαρτώμενη πρωτεόλυσή της (McGarry and Kirschner, 1998). Κεντρικά του μορίου εντοπίζεται μια συντηρημένη περιοχή 35 περίπου αμινοξέων, (αα στη XGeminin και αα στην ανθρώπινη Geminin), με προβλεπόμενη δομή σπειροειδούς σπειράματος (Lupas et al., 1991). Το μοτίβο αυτό απαιτείται για την αλληλεπίδραση με άλλα πρωτεϊνικά μόρια. Στους μοριακούς συνοδούς της Geminin συγκαταλέγεται πλειάδα παραγόντων, όπως το Cdt1 με ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αλλά και μεταγραφικοί παράγοντες όπως το Brg1 (το οποίο δεν αλληλεπιδρά με τη Geminin μέσω του σπειροειδούς σπειράματος της) (Seo et al., 2005a) και το Six3 (Del Bene et al., 2004), οι πρωτεΐνες Hox, μέλη των polycomb πρωτεϊνών (Luo et al., 2004) και δύο νέα μόρια με δομή σπειροειδούς σπειράματος, τα ERNI και BERT (Papanayotou et al., 2008), με ρόλους στη νευρογένεση και τη διαφοροποίηση. Σημαντικό βήμα για την εκδήλωση της βιολογικής δράσης της Geminin αποτελεί ο ομοδιμερισμός της, ο οποίος επίσης απαιτεί την περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος του μορίου. Δεδομένα από την ανάλυση της κρυσταλλικής δομής της Geminin στο Xenopus, δείχνουν ότι η δομή σπειροειδούς σπειράματος του μορίου εκτείνεται αμινοτελικά της προβλεπόμενης δομής σπειροειδούς σπειράματος καθώς και ότι η επιφάνεια του σπειροειδούς σπειράματος περιλαμβάνει ένα άθροισμα αρνητικά φορτισμένων καταλοίπων γλουταμικού οξέος, τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με τον παράγοντα 31

29 Εισαγωγή Cdt1. Πιστεύεται ότι τα αρνητικά αυτά κατάλοιπα μιμούνται τον αρνητικά φορτισμένο σκελετό του DNA και έτσι αλληλεπιδρούν με το Cdt1. Επιπλέον, στην πρόσδεση του Cdt1 στη Geminin συμμετέχει η περιοχή της Geminin στον ποντικό. Προτείνεται, επομένως, διμερής αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων Geminin-Cdt1, η οποία είναι απαραίτητη για την παρεμπόδιση της αντιγραφής (Saxena et al., 2004). Μεταξύ των αμινοξέων 50 και 116 υπάρχουν αθροίσματα βασικών αμινοξέων για τα οποία έχει αρχικά διατυπωθεί η άποψη ότι μπορεί να έχουν δράση σηματοδοτικής αλληλουχίας πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) ή να αποτελούν θέσεις πρόσδεσης ουβικουϊτίνης (McGarry & Kirschner, 1998). Πειράματα επιβεβαίωσαν την παρουσία NLS ενεργότητας μεταξύ των αμινοξέων 60 και 62 της Geminin στο Xenopus (Benjamin et al., 2004; Yoshida et al., 2005) όπως επίσης και μεταξύ των αμινοξέων (Yoshida et al., 2005). Στην Geminin στον άνθρωπο περιέχεται ένα άθροισμα βασικών αμινοξέων στις θέσεις Πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης έχουν περιγραφεί κυρίως καρβοξυτελικά του μορίου από την κινάση CK2, αλλά και από τις κινάσες PKC και GSK3 στο αμινοτελικό άκρο (Kulartz et al., 2004). Οι πρωτεϊνες Brg1/Brm1, οι καταλυτικές υπομονάδες του συμπλόκου αναδιάταξης της χρωματίνης SWI/SNF, έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με τη Geminin μέσω αρνητικά φορτισμένων στο καρβοξυτελικό τμήμα του μορίου (aa ). Η αλληλεπίδραση αυτή προτείνεται ότι είναι καθοριστική για την ισορροπία πολλαπλασιασμού-διαφοροποίησης κατά την ανάπτυξη. Κατά την απόπτωση η Geminin υφίσταται κατάτμηση στις θέσεις Asp169 και Asp204 από την κασπάση-3 (Roukos et al., 2007). Η συνολική ομοιότητα της Geminin του ανθρώπου και του ποντικού με αυτήν του Xenopus είναι 45%, ενώ τα αμινοξέα γύρω από το σπειροειδές σπείραμα και η αλληλουχία αποικοδόμησης παρουσιάζουν υψηλότερο βαθμό συντήρησης μεταξύ των ομολόγων (89% και 91% αντίστοιχα) από τις υπόλοιπες περιοχές. Η εξελικτική συντήρηση αυτών των μοτίβων μεταξύ των ομολόγων αναδεικνύει τη σημασία τους για τη λειτουργία της πρωτεΐνης. 32

30 Εισαγωγή GSK3 PKC XGemL MNSNMKQRSDVENPSMSIKNYIVDKTNEALAPRRTLKVIQQSASGCLVGRTKEPAKNSTK 60 XGemH MNTNKKQRLDMEKPTMSIKNYFVDKTNESLAPRRTLKVIQPSASGCLVGRTKEPVKNSTK 60 cgem MNSKMKQSLNVENPSGSLQKYLTD-TACSAAPRRTLKMIQPSAKGFLVGRCNE-KKSSVK 58 hgem MNPSMKQKQ--EEIKENIKN SSVPRRTLKMIQPSASGSLVGRENELSAGLSK 49 mgem MNLSMKQKQ--EGAQENVKN SPVPRRTLKMIQPSADGSLVGRENELPKGLFK 50 **. ** *.::: :.******:** **.* **** :*. * XGemL RKLWNDQLTSKKAKVEVAVDPEHQ--ENKDCPSEAYDLMVKETPTCLYWKDVAEERRKAL 118 XGemH RKLWNDQLTSKKAKVEVAVDPEHR--ENKDCSSEAYDLMVKETPTCLYWKEVAEERRKAL 118 cgem RKLWNNRLTSSACKAEASVDKEQEN-ENTDDVIQAIDLIKKS-PSSQYWKEVAEERRKAL 116 hgem RKHRNDHLTSTTSSPGVIVPESSENKNLGGVTQESFDLMIKENPSSQYWKEVAEKRRKAL 109 mgem RKLWDDQLASQTSSCG---PEANENKDVGDLTQEAFDLISKENPSSQYWKEVAEQRRKAL 107 ** :::*:*... :. :: **: *. *:. ***:***:***** XGemL YEALQENEKLHQEIELKDEEIARLKQENDELMELAGHVQYMANMIERLTGNAPQSLEDLK 178 XGemH YEALQENEKLHKEIELKDEEIARLKQENDELMELAGHVQYMANMIERLTGNAPRSLEDLK 178 cgem YEVLQENEKLHKEIEQKDGEIARLKEENEELMSLAEHVHYLTSMIERLTGQESDNLEALE 176 hgem YEALKENEKLHKEIEQKDNEIARLKKENKELAEVAEHVQYMAELIERLNGEPLDNFESLD 169 mgem YEALKENEKLHKEIEQKDSEIARLRKENKDLAEVAEHVQYMAEVIERLSNEPLDNFESPD 167 **.*:******:*** ** *****::**.:*.:* **:*::.:****..:.:*. XGemL NLDLE-EARFEDEA---ESRIEDETDMTQPSSSDQNMDKQTV 216 XGemH DLDLE-EARFEDEADMAEARIEDETDMARPSNSDQNMDAHTV 219 cgem SLALD-ESNQET hgem NQEFDSEEETVEDSLVEDSEIGTCAEGTVSSSTDAKPCI mgem SQEFDSEEEAVEYSELEDSGAGTCAEETVSSSTDARPCT :: *. CK2 CK2 CK2 CK2 CK2 Εικόνα 1.7. Πολλαπλή στοίχιση των αμινοξικών αλληλουχιών των ορθολόγων της Geminin από τα αμφίβια μέχρι τα θηλαστικά. Απεικόνιση περιοχών με λειτουργική σημασία στη νευρογένεση (μπλε πλαίσιο), δομικών χαρακτηριστικών μοτίβων (σπειροειδές σπείραμα) (μαύρο πλαίσιο), θέσεων φωσφορυλίωσης στο μόριο της Geminin. (XGemH και XGemL: μορφές H και L της Geminin στο αμφίβιο Xenopus, cgem: Geminin στην όρνιθα, hgem: Geminin στον άνθρωπο, mgem: Geminin στον ποντικό). Χρωματικός κώδικας αμινοξέων: κόκκινο: μικρά και υδρόφοβα αμινοξέα, συμπεριλαμβάνονται και τα αρωματικά εκτός από Y, μπλε: όξινα αμινοξέα, ροζ: βασικά αμινοξέα, πράσινο: αμινοξέα με υδροξύλιο και αμινομάδα εκτός από Q, γκρι: άλλα Βιολογική σημασία της Geminin α. Ρόλος στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας Η βιολογική σημασία της Geminin μελετήθηκε αρχικά στο σύστημα του Xenopus όπου τόσο in vitro -με προσθήκη Geminin σε εκχύλισματα- όσο και in vivo -μετά από ένεση ανασυνδυασμένου μορίου (από κλωνοποίηση) σε έμβρυα- παρατηρήθηκε αναστολή της αντιγραφής του DNA (McGarry and Kirschner, 1998). Προσθήκη της Geminin σε εκχυλίσματα ωαρίων Xenopus παρεμποδίζει τη δέσμευση των MCM 33

31 Εισαγωγή πρωτεϊνών στη χρωματίνη κατά τη G1, αναστέλλοντας την αντιγραφή του DNA, όπως συμβαίνει κατά την αφαίρεση του Cdt1 από τα εκχυλίσματα στο Xenopus. Η αναστολή της αντιγραφής του DNA από την Geminin έγκειται στην πρόσδεσή της στο Cdt1 και στην παρεμπόδιση της ενσωμάτωσης παραγόντων αδειοδότησης όπως είναι οι πρωτεΐνες MCM στη χρωματίνη. Προσθήκη περίσσειας Cdt1 αντιστρέφει την ανασταλτική δράση της Geminin, γεγονός το οποίο υποδηλώνει ότι η προκαλούμενη από την Geminin αναστολή διαμεσολαβείται από Cdt1 (Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Πιστεύεται ότι ο παράγοντας Cdt1 είναι ανενεργός όταν προσδένεται σε περίσσεια Geminin και ότι μπορεί να συμμετέχει στη δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) στο τέλος της μίτωσης όπου τα επίπεδα της Geminin είναι χαμηλά λόγω αποικοδόμησής της, ή η Geminin διατηρείται σε ανενεργή κατάσταση μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων (Hodgson et al., 2002; Li and Blow, 2004a; Li and Blow, 2004b). Αφαίρεση της Geminin από έμβρυα Xenopus προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου εξαρτώμενο από την Chk1 κατά την G2 (McGarry, 2002) χωρίς εμφανή δεύτερο κύκλο αντιγραφής (McGarry and Kirschner, 1998). Στο Xenopus επομένως φαίνεται να υπάρχουν επιπλέον συστήματα ελέγχου που παρεμποδίζουν τον επαναδιπλασιασμό του DNA. Αντίθετα, αποσιώπηση του μορίου στη Drosophila οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος που συνοδεύεται από πυρήνες αυξημένου μεγέθους και ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από την Chk1 (Mihaylov et al., 2002). Αυτός ο φαινότυπος μπορεί να αντιστραφεί με αποσιώπηση του Cdt1, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι η ισορροπία μεταξύ Geminin-Cdt1 είναι απαραίτητη για τη γονιδιωματική σταθερότητα. Στα θηλαστικά, όπως και στη Drosophila, η αφαίρεση της Geminin οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος και σχηματισμό γιγαντιαίων πυρήνων σε κύτταρα με φυσιολογικό ή μεταλλαγμένο p53 (Zhu et al., 2004) αλλά όχι σε όλους τους κυτταρικούς τύπους (Ballabeni et al., 2004). Επιπλέον, ενεργοποιούνται οι κινάσες Chk1 και Chk2, οι οποίες φωσφορυλιώνουν το Cdc25C οδηγώντας το εκτός πυρήνα αποτρέποντας έτσι την ενεργότητα της κυκλίνης Β-Cdc2 και την είσοδο στη μίτωση (Zhu et al., 2004). Επομένως, από τα παραπάνω φαίνεται ότι η Geminin κατέχει σημαντικό ρόλο στην παρεμπόδιση του επαναδιπλασιασμού του DNA κατά τις φάσεις S και G2 στους πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. 34