Δοµή και ιδιότητες του DNA

Transcript

1 Δοµή και ιδιότητες του DNA Βακτηριακό χρωµόσωµα Ευκαρυωτικό χρωµόσωµα και χρωµατίνη 10/03/2015 1

2 Tο βακτηριακό γονιδίωµα περιέχεται σε ένα κυκλικό DNA µήκους 1300 µm εντός του βακτηριακού κυττάρου. Στην περίπτωση του E.coli έχει διαστάσεις 1Χ3 µm, συνεπώς είναι πολύ σφιχτά αναδιπλωµένο µέσα στο κύτταρο. Tο βακτηριακό χρωµόσωµα περιέχει: πολλές θηλιές από υπερελικωµένο DNA στο κέντρο του µια συµπαγή δοµή από RNA και πρωτείνες Σταδιακή πέψη του βακτηριακού χρωµοσώµατος µε DΝάση, RΝάση και τρυψίνη έχει σαν αποτέλεσµα µια κεντρική ελάχιστη δοµή 45±10 bp. Οι θηλιές αυτές λειτουργούν σαν σκαλωσιά-ικρίωµα (scaffold). 10/03/2015 2

3 Tο ευκαρυωτικό DNA είναι οργανωµένο σε γραµµικά χρωµοσώµατα που περιέχουν dsdna και πρωτείνες (ιστόνες) και βρίσκεται αποκλειστικά στον πυρήνα. Οι ιστόνες (histones) Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4 είναι µικρές βασικές πρωτεϊνες, θετικά φορτισµένες (υψηλό ποσοστό R, K) και δηµιουργούν ιοντικούς δεσµούς µε το αρνητικά φορτισµένο DNA. Οι ιστόνες είναι άψογα σχεδιασµένες για τη λειτουργία τους και ως εκ τούτου είναι πολύ συντηρηµένες µε κορωνίδα την H4. H H4 είναι 100Χ πιο συντηρηµένη από τα πλέον συντηρηµένα µόρια που είναι αιµοσφαιρίνη και κυτόχρωµα c. Σύµπλοκο: DNA + ιστόνες = νουκλεόσωµα => χρωµατίνη Γιατί τα σπερµατοζάρια δεν έχουν ιστόνες? 10/03/2015 3

4 Εκτός των ιστονών, το πυρηνικό DNA περιέχει και άλλες, µη βασικές, πρωτεϊνες γνωστές ως µη ιστόνες (non-histone DNA binding proteins) όµως υπάρχουν σε µικρή ποσότητα. Οι πρωτείνες αυτές είναι: Πρωτείνες για αντιγραφή, µεταγραφή και επιδιόρθωση του DNA Πρωτείνες που σχετίζονται µε την µετάπτωση της χρωµατίνης από την ενεργό στην ανενεργό κατάσταση HMG (high mobility group) πρωτείνες που είναι κυρίως µεταγραφικοί παράγοντες. 10/03/2015 4

5 Η αλληλεπίδραση πρωτεϊνών µε DNA γίνεται µέσω δεσµών υδρογόνου και δεν επηρεάζει το ζευγάρωµα των βάσεων. Οι δεσµοί υδρογόνου σχηµατίζονται µεταξύ των βάσεων που εκτίθενται στη µικρή αλλά κυρίως µεγάλη αύλακα του DNA και συγκεκριµένων αµινοξέων που σχηµατίζουν χαρακτηριστικά δοµικά µοτίβα (DNA binding domains) 10/03/2015 5

6 ΗTH: helix turn helix είναι ένα επίσης σηµαντικά διαδεδοµένο πρωτεϊνικό µοτίβο που αλληλεπιδρά µε την µεγάλη αύλακα του DNA σχηµατίζουν χαρακτηριστικά µοτίβα (DNA binding domains) 10/03/2015 6

7 Leucine-Zipper: είναι ένα επίσης σηµαντικά διαδεδοµένο πρωτεϊνικό µοτίβο που αλληλεπιδρά µε την µεγάλη αύλακα του DNA. 10/03/2015 7

8 Η µελέτη του νουκλεοσώµατος είναι µια πειραµατικά δύσκολη διαδικασία. Δοµική περιγραφή του νουκλεοσώµατος έχει επιτευχθεί µε ηλεκτρονική µικροσκοπία και Χ-ray ανάλυση σε κρυστάλους νουκλεοσώµατος. Δυναµική περιγραφή του νουκλεοσώµατος µπορούµε έµµεσα να επιτύχουµε µε ενζυµικές αντιδράσεις που αποκόπτουν ελεύθερο DNA (µικροκοκκική νουκλεάση) και διαχωρισµό των τµηµάτων µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. 10/03/2015 8

9 Ξεδιπλωµένο ανθρώπινο DNA έχει µήκος ~2 m και χωράει στον πυρήνα που έχει διάµετρο 10-6 m, οπότε είναι σηµαντικά συµπυκνωµένο. Η βασική µονάδα δοµής του DNA στον πυρήνα είναι το νουκλεόσωµα. Το νουκλεοσώµατα σχηµατίζουν χάντρες διαµέτρου nm συνδεδεµένες µε γυµνό DNA που λέγεται συνδετικό DNA (linker DNA) συνολικού µήκους 200 bp, όπως µετρήθηκε από πειράµατα πέψης. 10/03/2015 9

10 Οι πυρήνες των νουκλεοσωµάτων (core particles) φτιάχνονται απο 146 bp αριστερόστροφα τυλιγµένες γύρω από ενα πρωτεϊνικό οκταµερές ιστονών 2Χ(Η2Α, Η2Β, Η3, Η4). Το νουκλεόσωµα αποτελείται από περίπου ίσες µάζες DNA και ιστονών (συµπεριλαµβανοµένης της H1). Το µοριακό βάρος του νουκλεοσώµατος είναι 262 kd. Η ιστόνη Η1 αλληλεπιδρά µε το συνδετικό DNA και σταθεροποιεί τα νουκλεοσώµατα το ένα κοντά στο άλλο. 10/03/

11 Σε ένα συµµετρικό µοντέλο για το νουκλεόσωµα, το τετραµερές Η32 Η42 παρέχει τον πυρήνα του σχήµατός του. Μόνο ένα διµερές Η2A H2B µπορεί να φανεί στην κάτοψη, γιατί το άλλο βρίσκεται κρυµµένο από κάτω. Οι Ν-τελικές ουρές των ιστονών είναι ευέλικτες και προεξέχουν από το νουκλεόσωµα, προβάλλοντας ανάµεσα από τις στροφές του DNA. 10/03/

12 Η χρωµατίνη που ελευθερώνεται από λυµένους πυρήνες αποτελείται από µια συµπαγώς οργανωµένη σειρά σωµατίων (ΕΜ). 10/03/2015 Κατά την πέψη χρωµατίνης µε µικροκοκκική νουκλεάση, αποδεσµεύονται µεµονωµένα νουκλεοσώµατα. 12

13 Κάθε πολυµερές νουκλεοσωµάτων περιέχει πολλαπλάσια ενός µοναδιαίου µήκους DNA. 10/03/

14 Η µικροκοκκική νουκλεάση µειώνει το µήκος των µονοµερών του νουκλεοσώµατος σε διακριτά βήµατα. Αρχικά, η µικροκοκκική νουκλεάση κόβει το DNA που συνδέει διαδοχικά νουκλεοσώµατα. Τα µονονουκλεοσώµατα τυπικά έχουν ~200 bp DNA. Το «ψαλίδισµα» µειώνει το µήκος του DNA πρώτα σε ~165 bp και µετά παράγει τα πυρηνικά σωµάτια µε 146 bp. 10/03/

15 Η µικροκοκκική νουκλεάση πέπτει τη χρωµατίνη στους πυρήνες των κυττάρων, παράγοντας µια σειρά ζωνών DNA που µπορούν να διαχωριστούν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα ακρυλαµίδης. 10/03/

16 Το νουκλεόσωµα είναι ένας κύλινδρος, µε το DNA οργανωµένο σε δύο στροφές γύρω από την επιφάνειά του. Τοµή νουκλεοσώµατος στην οποία φαίνεται πως οι δύο στροφές του DNA βρίσκονται κοντά η µία στην άλλη. 10/03/

17 Οι αλληλουχίες του DNA που βρίσκονται σε διαφορετικές στροφές γύρω από το νουκλεόσωµα µπορεί να είναι κοντά µεταξύ τους. 10/03/

18 Η κρυσταλλική δοµή του πυρηνικού οκταµερούς των ιστονών παρουσιάζεται σε ένα χωροπληρωτικό µοντέλο (space filling model). Το τετραµερές Η32 Η42 απεικονίζεται άσπρο και τα διµερή Η2A H2B µπλε. Μόνο ένα διµερές Η2A H2B είναι ορατό στην κάτοψη, διότι το άλλο είναι κρυµµένο από κάτω. Η πιθανή πορεία του DNA φαίνεται στην κάτοψη ως στενός σωλήνας (ένα τέταρτο της πραγµατικής διαµέτρου του DNA) και στην πλευρική άποψη ως δέσµη παράλληλων γραµµών µε εύρος 20 Å. 10/03/

19 In vitro, το DNA µπορεί να: αλληλεπιδρά άµεσα µε ένα πλήρες (διασυνδεδεµένο) οκταµερές ιστονών ή να συναρµολογειθεί αρχικά µε ένα τετραµερές Η32 Η42 και στη συνέχεια να προστεθούν δύο διµερή Η2A H2B. 10/03/

20 Εάν τα οκταµερή των ιστονών παρέµεναν συντηρηµένα, τότε κατά την αντιγραφή ενός αρχικά βαριού οκταµερούς, παρουσία ελαφρών αµινοξέων, τα παλιά και τα καινούρια οκταµερή θα δηµιουργούσαν ζώνες διαφορετικής πυκνότητας κατά την αναλυτική φυγοκέντριση. Συντηρητικός µηχανισµός 10/03/

21 Τα νουκλεοσώµατα µπορούν να αποκτήσουν ακόµη πιο συµπαγή µορφή διαµέτρου 30 nm δηµιουργώντας µια σωληνοειδή δοµή µε 6 νουκλεοσώµατα ακτινωτά διαταγµένα ανά στροφή. Το ινίδιο των 30 nm µπορεί να έχει µια ελικοειδή σπείρα 6 νουκλεοσωµάτων ανά στροφή, µε ακτινωτή οργάνωση. 10/03/

22 Σε µοντέλλα µεταφασικών χρωµοσωµάτων οι θηλιές που σχηµατίζουν τα σωληνοειδή είναι προσκολληµένες σε ένα κεντρικό πυρήνα που ονοµάζεται ικρίωµα (σκαλωσιά) (scaffold). 10/03/

23 Τα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης µπορούν να προωθήσουν την ολίσθηση των νουκλεοσωµάτων κατά µήκος του DNA, να εκτοπίσουν ολοκληρωτικά τα νουκλεοσώµατα από το DNA ή να αλλάξουν την απόσταση διαδοχικών νουκλεοσωµάτων. 10/03/

24 Το νεο-αντιγραφόµενο DNA ενσωµατώνεται αµέσως σε νουκλεoσώµατα. 10/03/