1. Ταξινόμηση μικρών GTPασών 2. Γενική σημασία των πρωτεϊνών Ras Ρύθμιση του κύκλου GTP/GDP στις μικρές G-πρωτεΐνες από τρία διαφορετικά μόρια

Transcript

1 10 ο Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μικρών μονομερών GTPασών 1. Ταξινόμηση μικρών GTPασών 2. Γενική σημασία των πρωτεϊνών Ras Ρύθμιση του κύκλου GTP/GDP στις μικρές G-πρωτεΐνες από τρία διαφορετικά μόρια 3. Δομή και βιοχημικές ιδιότητες των Ras Δομή της GTP- και GDP-συνδεδεμένης μορφής των Ras Υδρόλυση του GTP: Μηχανισμός και διέγερση από τις GAPs Δομή και βιοχημικές ιδιότητες των μεταλλαγμάτων των Ras Εντοπισμός των πρωτεϊνών Ras στη πλασματική μεμβράνη 4. Η GAP στη μεταγωγή σήματος των Ras Δομή των πρωτεϊνών Ras-GAP Λειτουργία των πρωτεϊνών Ras-GAP 5. Παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEFs) στη μεταγωγή σημάτων μέσω των πρωτεϊνών Ras Σημασία των GEFs Δομή και ενεργοποίηση των GEFs 6. Η Raf κινάση ως τελεστής στη μετάδοση σήματος από τις πρωτεΐνες Ras Δομή της Raf κινάσης Αλληλεπίδραση της Raf κινάσης με την πρωτεΐνη Ras Μηχανισμός ενεργοποίησης και ρύθμιση της Raf κινάσης 7. Υποδοχή και μετάδοση πολλαπλών σημάτων από την πρωτεΐνη Ras Πολλαπλά σήματα ενεργοποίησης των Ras Πολλαπλά μόρια τελεστές των Ras Πρωτεΐνη Ras ως κεντρικός σταθμός-διακόπτης 8. Ras και έλεγχος του κυτταρικού κύκλου 9. Ras και διαφοροποίηση Νευρικά κύτταρα Μυϊκά κύτταρα 10. Ras και απόπτωση 11. Το μονοπάτι των Ras-ΜΑΡΚ στη μάθηση και τη μνήμη

2 328 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών Πλαστικότητα των συνάψεων στα θηλαστικά 12. Πρωτεΐνες Rho/Rac/Cdc42: Δομή και δράση τους Ενεργοποίηση των Rho Ενεργοποίηση των Rac/Cdc42 Ενεργοποίηση πολλαπλών τελεστών από τις Rho Τελεστές της Cdc42 που εμπλέκονται στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης Ο ρόλος των Rac στην ενεργοποίηση της οξειδάσης του NADPH 13. Ο ρόλος των Rho στην ανάπτυξη ασθενειών Ο ρόλος των Rho στην πρόοδο του καρκίνου Οι Rho-GTPάσες στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες Άλλες ασθένειες που συνδέονται με τις Rho 14. Rho-GAPs και ρύθμιση της λειτουργίας τους Ρύθμιση της p190 Rho-GΑΡ μέσω φωσφορυλίωσης Ρύθμιση της n-χιμαιρίνης μέσω σύνδεσης με λιπίδια Ρύθμιση της CdGAP μέσω αλληλεπίδρασης με την ιντερσεκτίνη 15. Ran και πυρηνοκυτταροπλασματική μεταφορά 16. Διασταυρούμενα μονοπάτια ανάμεσα σε πολλές μικρές GTPάσες Ρύθμιση του κυτταροσκελετού ακτίνης στους ινοβλάστες

3 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ως G πρωτεΐνες ή GTPάσες ή πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεοτίδια της γουανίνης (guanine nucleotide binding proteins) χαρακτηρίζονται οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν το GTP και το υδρολύουν σε GDP. Οι πρωτεΐνες αυτές χωρίζονται σε δυο μεγάλες κατηγορίες, τις ετεροτριμερείς G πρωτεΐνες (Gαβγ) και τις μονομερείς ή μικρές G-πρωτεΐνες με μοριακό βάρος kda. 1. Ταξινόμηση των μονομερών G-πρωτεϊνών Το πρώτο γονίδιο μικρής G-πρωτεΐνης που ανακαλύφθηκε ήταν το γονίδιο ras (rat sarcoma), το οποίο ανακαλύφθηκε το 1978 σαν ογκογονίδιο, υπεύθυνο για την καρκινογόνο δράση των ρετροϊών Harvey και Kirsten, οι οποίο προκαλούν σάρκωμα στα τρωκτικά. O ιός Harvey (Ηα-MSV: murine sarcoma virus) ανακαλύφθηκε το 1964 από την Jennifer Harvey, και ο ιός Kirsten (Ki-MSV) από τον Werner Kirsten, το Το 1973 ο Ε.Μ. Scolnick ανακάλυψε ότι οι ιοί αυτοί φέρουν και DNA τρωκτικών. Το 1981 το γονιδίωμα των δύο ιών κλωνοποιήθηκε και βρέθηκε ότι το προϊόν των ιϊκών Η-ras και K-ras ογκογονιδίων ήταν μια πρωτεΐνη 21Κd, η οποία είχε την ικανότητα να συνδέει το GTP. Το 1982, από τρία διαφορετικά εργαστήρια, στο Harvard (Geoffrey Coopet et al), στο ΝΙΗ (Mariano Barbacid and Stuart Aaronson) και στο ΝΙΗ (Robert Weinberg et al) βρέθηκαν σε ανθρώπινους όγκους ογκογονίδια Η-ras και Κ-ras, ανάλογα των ιϊκών. Η μοριακή κλωνοποίηση των φυσιολογικών και των ογκογόνων ανθρώπινων H-ras γονιδίων έδειξε ότι οι λειτουργικές τους διαφορές ήταν αποτέλεσμα μιας μόνο σημειακής μετάλλαξης (Gly12), η οποία καθιστούσε τη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Ras ανίκανη να υδρολύσει το GTP, και συνεπώς βρισκόταν σε υπερενεργή κατάσταση. Το 1983, αναγνωρίστηκε ένα τρίτο ανθρώπινο ογκογονίδιο ras, το οποίο ονομάστηκε N-ras καθώς απομονώθηκε από όγκους ανθρώπινου νευροβλαστώματος. Το 1995, δημιουργήθηκε ένα knockout N-ras -/- ποντίκι, το οποίο ήταν βιώσιμο με μειωμένη ανοσοποιητική απόκριση. Το 1997, δημιουργήθηκε ένα knockout Κ-ras -/- ποντίκι, το οποίο δεν ήταν βιώσιμο, πέθανε την 12 η μέρα της κύησης λόγω δυσλειτουργίας του ήπατος και αναιμίας. Το 2000, δημιουργήθηκε ένα knockout Η-ras -/- ποντίκι, το οποίο δεν εμφάνιζε φαινοτυπικά καμιά δυσλειτουργία. Μέχρι σήμερα, περισσότερες από 100 μικρές G-πρωτεΐνες έχουν αναγνωριστεί, από τους ζυμομύκητες μέχρι τον άνθρωπο και αποτελούν μια υπεροικογένεια, την υπεροικογένεια των Ras πρωτεϊνών, τα μέλη της οποίας χωρίζονται σε 5 τύπους: Ras-πρωτεΐνες (Ras, Ral, Rap): έχουν μιτογόνο δράση, ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων και εμπλέκονται στη χημειοταξία. Rho πρωτεΐνες (Rho, Rac, Cdc42): ρυθμίζουν την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Rab-πρωτεΐνες (η μεγαλύτερη ομάδα με πάνω από 60 μέλη): ρυθμίζουν την ενδοκυτταρική κυκλοφορία κυστιδίων. Ran-πρωτεΐνες: ρυθμίζουν την πυρηνο-κυτταροπλασματική μεταφορά, καθώς και την οργάνωση των μικροσωληνίσκων κατά τη μεσόφαση. ARF πρωτεΐνες (Arf1-6, Arl1-7, Sar): ρυθμίζουν το σχηματισμό και την ενδομεταφορά των μεταφορικών κυστιδίων στη συσκευή Golgi.

4 330 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών Πίνακας 10.1 Ρυθμιστικές GTPάσες και οι πρωτεΐνες-τελεστές της υπεροικογένειας Ras των θηλαστικών Υπερ-Οικογένεια Ras GEF GAP Ras Αύξηση και πολλαπλασιασμός H-Ras N-Ras Ki-Ras A, B Ras-GEF, msos - - Ras-GAP, p120-gap - - Rap subfamily: Rap 1A, 1B, 2A, 2B RalB - Ral-GEF Rap1-GAP - Rho/Rac/Cdc42 Αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης Rho A, B, C Rac 1, 2 TC10 Dbl - - Bcr, αναφορές για τουλάχιστον άλλες Rab Ενδοκυτταρική κυκλοφορία κυστιδίων Ran Πυρηνοκυτταροπλασματική μεταφορά ARF Μεταφορά κυστιδίων στο Golgi 60 διαφορετικές Rab Ran, TC4 ARF1-6, Arl1-9, Sar MSS4 - RCC Γενική σημασία των πρωτεϊνών Ras Η ενδοκυτταρική μεταγωγή σημάτων χρησιμοποιεί κεντρικούς σταθμούς-διακόπτες που λαμβάνουν, διαμορφώνουν και διαβιβάζουν τα σήματα. Οι πρωτεΐνες Ras (επίσης γνωστές ως πρωτεΐνες p21 ras ) αποτελούν ένα σταθμό-διακόπτη ιδιαίτερης σπουδαιότητας για τις διαδικασίες αύξησης και διαφοροποίησης. Επεξεργάζονται τα σήματα που παραλαμβάνουν από υποδοχείς κινάσες τυροσίνης, υποδοχείς που συνδέονται με κινάσες τυροσίνης και από υποδοχείς που συνδέονται με G-πρωτεΐνες, και τα προωθούν στο εσωτερικό του κυττάρου (Εικόνα 10.1). Η γενική σημασία των πρωτεϊνών Ras στη ρύθμιση της αύξησης αναγνωρίστηκε στην αρχή της δεκαετίας του '80, όταν δείχθηκε ότι περίπου το 30% όλων των στερεών όγκων στους ανθρώπους παρουσίαζε μια μετάλλαξη στο γονίδιο Ras. Το ενδιαφέρον για τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών Ras εκδηλώθηκε όταν παρατηρήθηκε ότι ορισμένες θέσεις στην πρωτεΐνη Ras είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες σε ογκογόνες μεταλλάξεις. Η αντικατάσταση της Gly12 στην πρωτεΐνη Ras με οποιαδήποτε άλλο φυσικό αμινοξύ (εκτός από Pro) οδηγεί σε αύξηση της δυνατότητας της πρωτεΐνης Ras να δημιουργεί όγκους. Το μικρό τους μέγεθος και η προφανώς απλή τους λειτουργία έκανε τις πρωτεΐνες Ras ένα ιδανικό αντικείμενο έρευνας για τις σχέσεις δομής-λειτουργίας μιας κεντρικής σηματοδοτικής πρωτεΐνης Η πρωτεΐνη Ras είναι αυτήν την περίοδο η καλύτερα χαρακτηρισμένη σηματοδοτική πρωτεΐνη. Οι εκτενείς δομικές πληροφορίες που είναι

5 ΚΕΦΑΛΑΙΟ διαθέσιμες για την πρωτεΐνη Ras έχουν βοηθήσει στο να γίνουν κατανοητοί τόσο οι μοριακοί μηχανισμοί της μεταγωγής σήματος όσο και η αιτία των λαθών της ρύθμισης που οδηγούν σε δημιουργία όγκων. Υποδοχείς συνδεδεμένοι με κινάσες τυροσίνης Υποδοχείς κινάσες τυροσίνης Υποδοχείς συνδεδεμένοι με G-πρωτεΐνες τελεστές, πχ. Raf κινάση διαφοροποίηση, κυτταρικός πολλαπλασιασμός Εικόνα 10.1 Η πρωτεΐνη Ras ως ένας κεντρικός σταθμός-διακόπτης των σηματοδοτικών μονοπατιών. Η κύρια οδός για την ενεργοποίηση των Ras είναι μέσω των υποδοχέων κινασών τυροσίνης, οι οποίοι μεταφέρουν το σήμα μέσω πρωτεϊνών προσαρμογέων και παραγόντων ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEFs), στην πρωτεΐνη Ras. Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Ras μπορεί επίσης να ξεκινήσει από τους συνδεμένους με G-πρωτεΐνες υποδοχείς είτε από τους υποδοχείς που συνδέονται με κινάσες τυροσίνης. Δεν παρουσιάζονται όλα τα μονοπάτια διαβίβασης που συμβάλλουν στην ενεργοποίηση της Ras ούτε όλες οι αντιδράσεις των τελεστών της. Gβγ: βγ-σύμπλοκο των ετεροτριμερών G-πρωτεϊνών GAP: ενεργοποιητής GTPάσης GEF: παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης. Τα θηλαστικά έχουν τουλάχιστον τέσσερα διαφορετικά γονίδια Ras: H(αrvey)-ras, Ki(rsten)-rasA, Ki-rasB και το Ν(euroblastoma)-ras γονίδιο. Κάθε ένα από αυτά τα γονίδια μπορεί να μετατραπεί σε ογκογόνο από μια μετάλλαξη. Τα τέσσερα γονίδια έχουν στενή συγγένεια μεταξύ τους και οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν, είναι όλες πρωτεΐνες Ras. Τα περισσότερα από τα δομικά και βιοχημικά στοιχεία, είναι διαθέσιμα για την πρωτεΐνη Η-Ras, η οποία θα αναφέρεται στο εξής ως "πρωτεΐνη Ras" προς απλούστευση. Υποτίθεται ότι η βασική γνώση της δομής και της λειτουργίας της πρωτεΐνης Η-Ras αφορά και τις άλλες πρωτεΐνες Ras. Μετά από την ανακάλυψη της πρωτεΐνης Ras, γρήγορα εδραιώθηκε ότι οι πρωτεΐνες Ras αποτελούν μια οικογένεια μέσα σε μια ευρύτερη υπεροικογένεια, γνωστή σήμερα ως Ras υπεροικογένεια των μονομερών GTPασών. Τα μέλη της υπεροικογένειας των πρωτεϊνών Ras είναι ρυθμιστικές GTPάσες kda, οι οποίες είναι ενεργές ως μονομερή (βλπ Πίνακας 10.1). Τα μέλη της υπεροικογένειας των Ras είναι GTPάσες που μπορούν να υπάρξουν σε μια ανενεργό μορφή Ras GDP και μια ενεργό μορφή Ras GTP. Στη GTP-συνδεδεμένη κατάσταση, οι Ras αλληλεπιδρούν με τους επόμενους στόχους, τους τελεστές των Ras και τους ενεργοποιούν (Εικόνα 10.2). Οι τελεστές επικοινωνούν, στη συνέχεια, με άλλες σηματοδοτικές πρωτεΐνες τοποθετημένες παρακάτω στη σηματοδοτική αλυσίδα. Διακρίνονται λόγω της ισχυρής τους

6 332 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών συγγένειας με τη μορφή Ras GTP απ' ότι με τη μορφή Ras GDP. Η σύνδεση των τελεστών στην πρωτεΐνη Ras τερματίζεται με την υδρόλυση του GTP σε GDP. Οι πρωτεΐνες Ras λειτουργούν μέσω ενός μονοκατευθυνόμενου κύκλου GTPασών ως ρυθμιστικές GTPάσες. Η σηματοδοτική λειτουργία των πρωτεϊνών Ras και των συγγενικών με τις Ras πρωτεϊνών μπορεί να ρυθμιστεί από τρεις μηχανισμούς. Ras GDP Ανενεργή μορφή GTP GDP Ras GTP Ενεργή μορφή P i Ras GDP Ανενεργή μορφή Εικόνα 10.2 Οι πρωτεΐνες Ras στην ενεργή τους μορφή έχουν δεσμευμένο το GTP, ενώ στην ανενεργή τους μορφή το GDP. Ρύθμιση του κύκλου GTP/GDP στις μικρές G πρωτεΐνες από τρία διαφορετικά μόρια Απαραίτητη προϋπόθεση για την ενεργοποίηση των μικρών GTPασών στα κύτταρα είναι η αλληλεπίδρασή τους με μόρια, τα οποία επηρεάζουν τον κύκλο GTP/GDP. Τα μόρια, τα οποία ρυθμίζουν την κατάσταση ενεργοποίησης των μικρών G πρωτεϊνών είναι τριών ειδών: (i) ο GEF (guanine nucleotide exchange factor), ο οποίος διευκολύνει την ανταλλαγή του GDP από το GTP, την απομάκρυνση δηλ. του GDP από τη πρωτεΐνη G και τη δέσμευση (ii) στη θέση του, του GTP, η GAP (GTPase-activating protein), η οποία καταλύει την υδρόλυση του GTP, αυξάνει δηλαδή το ρυθμό υδρόλυσης, (iii) ο GDΙ (guanine nucleotide dissociation inhibitor), ένας αρνητικός ρυθμιστής, ο οποίος μπλοκάρει την απομάκρυνση του GDP από την ανενεργή μορφή της G-πρωτεΐνης, εμποδίζοντας τη δέσμευση του GTP. Οι Rho\ Rac\ Cdc42 πρωτεΐνες ελέγχονται από τον Rho GDI, ενώ οι Rab πρωτεΐνες από τον Rab GDI. Ο GDI επιδρά όχι μόνο στη ρύθμιση της ενεργοποίησης των μικρών G πρωτεϊνών, αλλά και στη μεταφορά τους ανάμεσα στο κυτταρόπλασμα και τη μεμβράνη. Οι πρωτεΐνες Ras έχουν την ικανότητα να συνδέονται με την πλασματική μεμβράνη μέσω μιας μεταμεταγραφικής τροποποίησης του C-τελικού τους άκρου. Η σύνδεση αυτή όμως εμποδίζεται με τη δημιουργία του συμπλόκου Ras-GDI. Η κάθε μικρή G πρωτεΐνη έχει τους δικούς της ρυθμιστές.

7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Μετα-μεταγραφική τροποποίηση των Ras που επιτρέπει τη σύνδεσή τους με τη μεμβράνη Εικόνα 10.3 Ρύθμιση του κύκλου GDP/GTP στις Ras πρωτεΐνες από τους GEF, GAP, GDI. Παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (Guanine nucleotide Exchange Factors) Η μετάβαση από την ανενεργή μορφή GDP, στην ενεργή μορφή GTP μπορεί να επιταχυνθεί από τις πρωτεΐνες που αναγκάζουν το συνδεδεμένο GDP να αποσυνδεθεί. Οι παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEFs) διαδραματίζουν έναν ουσιαστικό ρόλο στη μεταγωγή σήματος μέσω των πρωτεϊνών Ras. Η απώλεια δραστικότητάς τους λόγω μετάλλαξης έχει την ίδια επίδραση που έχει η απώλεια ολόκληρου του γονιδίου Ras στους κατώτερους οργανισμούς. Πρωτεΐνες που ενεργοποιούν τις GΤPάσες (GΤPase Activating Proteins) Η διάρκεια ζωής της ενεργής κατάστασης μπορεί να μειωθεί από τις ρυθμιστικές GΤPase Activating Proteins (GΑΡs). Η βασική λειτουργία των GAPs είναι να ρυθμίζουν αρνητικά τις Ras και τις συγγενικές με τις Ras πρωτεΐνες. Οι GΑPs παρουσιάζουν ειδίκευση για υποοικογένειες της Ras υπεροικογένειας. Επιπλέον, υπάρχουν διαφορετικές GΑPs για κάθε ξεχωριστή Ras και κάθε συγγενική των Ras πρωτεΐνη. Κατά συνέπεια, στα θηλαστικά, υπάρχουν τουλάχιστον εννέα διαφορετικές GΑΡs, οι οποίες παρουσιάζουν εξειδίκευση για την υποοικογένεια των πρωτεϊνών Rho. Θα είναι ενδιαφέρον να φανεί πώς η δραστηριότητα των GAPs είναι ρυθμισμένη και ισορροπημένη στο κύτταρο, και ποιες συγκεκριμένες λειτουργίες ανατίθενται σε κάθε μεμονωμένη GAP. Ανασταλτικοί παράγοντες διαχωρισμού νουκλεοτιδίων γουανίνης (Inhibitors of Guanine Nucleotide Dissociation) Για τις οικογένειες Rab και Rho/Rac, έχουν περιγραφεί πρωτεΐνες που δεσμεύονται στη GTP μορφή και αποτρέπουν το διαχωρισμό του GTP. Οι πρωτεΐνες με αυτά τα χαρακτηριστικά είναι γνωστές ως ανασταλτικοί παράγοντες διαχωρισμού νουκλεοτιδίων γουανίνης (GDIs). Οι GDIs εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα και συνδέονται στις Rasσυγγενικές πρωτεΐνες που είναι τροποποιημένες με ένα κατάλοιπο πρενυλίου. Η λειτουργία τους είναι πιθανώς να απομακρύνουν τις πρωτεΐνες Rab και Rho/Rac από τη μεμβράνη ώστε να βρεθούν στο κυτταρόπλασμα. Κατ' αυτόν τον τρόπο, οι GDIs μπορούν να αποτρέψουν

8 334 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών τον πρόωρο διαχωρισμό του συνδεδεμένου GDP καθώς και την πρόωρη ανταλλαγή νουκλεοτιδίου κατά τη διάρκεια της ενδοκυτταρικής μεταφοράς των GTPασών. 3. ομή και βιοχημικές ιδιότητες των πρωτεϊνών Ras Η πρωτεΐνη Ras είναι μια μονομερής GTPάση περίπου 188 αμινοξέων και 21 kda. Τα πρώτα 164 αμινοξέα είναι κοινά για όλες τις Ras, ενώ η περιοχή στο C-τελικό άκρο είναι τελείως διαφορετική, γι αυτό και ονομάζεται ετερογενής περιοχή. Στην θέση 186 βρίσκεται μια Cys, καλά διατηρημένη σε όλες τις Ras, η οποία φαρνεσυλιώνεται και βοηθά στη σύνδεση των Ras στη μεμβράνη. Επίσης, υπάρχει η περιοχή που λέγεται περιοχή τελεστή (effector domain), όπου συνδέονται οι διάφοροι τελεστές, η περιοχή στην οποία συνδέονται οι GEFs, και η περιοχή όπου συνδέεται το GTP. Εικόνα 10.4 Η δομή των πρωτεϊνών Ras. Η GTP-συνδεδεμένη μορφή αντιπροσωπεύει την ενεργή κατάσταση, ενώ η GDPσυνδεδεμένη μορφή είναι η ανενεργή. Η μετάβαση μεταξύ των ενεργών και ανενεργών μορφών πραγματοποιείται μέσω ενός μονοκατευθυνόμενου κύκλου. Υψηλής ανάλυσης κρυσταλλικές δομές υπάρχουν και για τις δύο μορφές της πρωτεΐνης Ras αλλά και για τις ογκογόνες μεταλλάξεις της. Η διάρκεια ζωής της ενεργούς Ras-GTP κατάστασης είναι μεγάλης σπουδαιότητας για τη σηματοδοτική λειτουργία της πρωτεΐνης Ras. Μόνο στη GTP μορφή μπορεί το σήμα να διαβιβαστεί στον τελεστή που ακολουθεί. Το διαθέσιμο χρονικό περιθώριο για τη μεταγωγή σημάτων καθορίζεται από το ρυθμό υδρόλυσης GTP. Ένας χαμηλός ρυθμός υδρόλυσης GTP και συνεπώς μια χρονικά εκτενέστερη ύπαρξη της ενεργούς GTP μορφής συσχετίζεται με μια υψηλή ένταση στη μεταγωγή σήματος. Η μείωση του χρονικού περιθωρίου από τη διέγερση της GTPάσης οδηγεί σε αποδυναμωμένη μεταγωγή σημάτων. Αν την εξετάσουμε απομονωμένη, η πρωτεΐνη Ras είναι ένα πολύ ανεπαρκές ένζυμο. Αφ' ενός, ο ρυθμός υδρόλυσης του GTP είναι πολύ χαμηλός και αφ' ετέρου, το σύμπλοκο της πρωτεΐνης Ras-GDP είναι πολύ σταθερό και διαχωρίζεται πολύ αργά. Οι σταθερές ταχύτητας και των δύο διαδικασιών είναι της τάξεως 10-4 sec -1. Και οι δύο αντιδράσεις μπορούν να

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ επιταχυνθούν κατά τη διαδικασία της μεταγωγής σήματος και έχουν μια αποφασιστική επίδραση στη μεταγωγή σημάτων μέσω των πρωτεϊνών Ras. Ενεργοποίηση GTPασης: Κάτω από την επιρροή της GAP, το ποσοστό υδρόλυσης GTP από την πρωτεΐνη Ras μπορεί να αυξηθεί 10 5 φορές. Οι πρωτεΐνες GAP ελέγχουν την κατάσταση δραστηριότητας της πρωτεΐνης Ras με το να μειώνουν δραστικά τη διάρκεια ζωής της ενεργούς μορφής GTP. Λόγω αυτής της ιδιότητας, λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης της πρωτεΐνης Ras. Επιτάχυνση της ανταλλαγής νουκλεοτιδίων: Οι GEFs, οι οποίοι προωθούν το διαχωρισμό του συνδεδεμένου GDP λειτουργούν ως θετικοί ρυθμιστές της πρωτεΐνης Ras. Ένα σημαντικό βήμα για την κατανόηση της μοριακής βάσης της λειτουργίας των Ras επιτεύχθηκε όταν αποκτήσαμε τις δομικές πληροφορίες, τα βιοχημικά και γενετικά στοιχεία για να απαντήσουμε στις ακόλουθες ερωτήσεις: Πώς η ενεργή GTP μορφή διαφέρει από την ανενεργή μορφή GDP; Ποιος είναι ο μηχανισμός για την υδρόλυση του GTP; Ποια κατάλοιπα της πρωτεΐνης Ras σχετίζονται με τη δράση GTPάσης; Ποιος είναι ο μηχανισμός της ενεργοποίησης των τελεστών, όπως η Raf κινάση; Ταιριάζει το γεγονός ότι οι ογκογόνες μεταλλάξεις ευνοούνται σε ιδιαίτερες θέσεις μέσα στο δομικό μοτίβο των Ras; ομή της GTP- και της GDP-συνδεδεμένης μορφής της πρωτεΐνης Ras Η πρωτεΐνη Ras, ως GTPάση, παρουσιάζει μια G-περιοχή χαρακτηριστική της υπεροικογένειας των GTPασών. Το μοτίβο αλληλουχίας που χαρακτηρίζει τις GTPάσες συμμετέχει στη δέσμευση του νουκλεοτίδιου και του Mg 2+. Τρία δομικά στοιχεία είναι ιδιαίτερα σημαντικά για τη λειτουργία-διακόπτη (switch) των Ras: οι βρόγχοι Ll, L2 και L4. Και οι τρεις βρόγχοι έρχονται σε επαφή με την γ-φωσφορική ομάδα του GTP. Η δομή της GTP-συνδεδεμένης μορφής της πρωτεΐνης Ras παρουσιάζεται στην Εικόνα Gly60 Thr35 βρόγχος Ρ (10-15) βρόγχος L2 (26-36) switch I βρόγχος L4 (59-64) switch II Εικόνα 10.5 Κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Ras σε σύμπλοκο με το ανάλογο του GTP, το GppNHp (βγ-imino-gtp). Η εικόνα παρουσιάζει το βρόγχο Ρ, στον οποίο βρίσκεται η Gly12, και τους βρόγχους L2 και L4, οι οποίοι έχουν μια λειτουργία διακόπτη στην υδρόλυση του GTP. Οι αριθμοί δίνουν τις θέσεις ακολουθίας των αμινοξέων στους βρόγχους.

10 336 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών Ο βρόγχος Ll, επίσης γνωστός ως βρόγχος Ρ, τυλίγεται γύρω από τη β- και γ-φωσφορική ομάδα. Η Gly12 βρίσκεται στον L1 βρόγχο. Αυτό το αμινοξύ αλλοιώνεται συχνά στις ογκογόνες μεταλλάξεις της πρωτεΐνης Ras (μετάλλαξη "hot spot"). Ο βρόγχος L2, γνωστός και ως βρόγχος τελεστής, είναι ιδιαίτερα σημαντικός για τη βιολογική δραστηριότητα της πρωτεΐνης Ras. Είναι ένα σημαντικό τμήμα της περιοχής τελεστή της Ras, όπου τα σήματα παραλαμβάνονται και διαδίδονται. Περιέχει τα αμινοξέα 32-36, τα οποία είναι σημαντικά για την αλληλεπίδραση με τη GAP. Η Thr35 του βρόχου L2 συμμετέχει σε δεσμούς υδρογόνου με τη γ- φωσφορική ομάδα και το Mg 2+, και βοηθά έτσι τη σωστή τοποθέτηση του συμπλόκου GTP Mg 2+ στο ενεργό κέντρο. Τα κατάλοιπα του βρόγχου αντιστοιχούν στην περιοχή switch Ι της Gα υπομονάδας. Ο βρόγχος L4 σχηματίζει και αυτός δεσμούς υδρογόνου με τη γ-φωσφορική ομάδα, μέσω της Gly60. Ο L4 αντιστοιχεί στην περιοχή switch ΙΙ της Gα υπομονάδας (κατάλοιπα 59-76). Περιέχει το ουσιαστικό για την κατάλυση κατάλοιπο Gln61 και συμμετέχει και αυτός στην αλληλεπίδραση με τη GAP. Σύγκριση της δομής της ενεργούς Ras με την ανενεργή, δείχνει τις σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωση των βρόγχων, κυρίως αλλαγές θέσης των περιοχών switch Ι και ΙΙ. Ως συνέπεια της υδρόλυσης του GTP, οι επαφές και των τριών βρόγχων με τη γ-φωσφορική ομάδα χάνονται (Εικόνα 10.6). Η switch Ι υποβάλλεται σε ένα δραστικό επαναπροσανατολισμό δεδομένου ότι ο δεσμός με την γ-φωσφορική ομάδα και το Mg 2+ χάνεται. Η αλληλεπίδραση του συντηρημένου κατάλοιπου Gly60 της περιοχής switch ΙΙ με τη γ- φωσφορική ομάδα χάνεται επίσης κατά τη διαδικασία της υδρόλυσης του GTP. Τα κατάλοιπα αποτελούν το κέντρο όπου συνδέονται οι τελεστές. Εικόνα 10.6 Δομικές αλλαγές της πρωτεΐνης Ras στη μετάβαση από την ενεργό Ras GppNHp δομή στην ανενεργό Ras GDP μορφή. Ένα μόριο ύδατος προσβάλλει πυρηνόφιλα τη γ-ρο 4 του GTP. Η γ-φωσφορική ομάδα του GTP είναι στενά συνδεδεμένη μέσω των αλληλεπιδράσεων σε Thr35 (L2 βρόγχος), Lys16 και Gly60 (L4 βρόγχος) και μέσω του συντονισμού με το ιόν Mg 2+. Στη GDP-μορφή, ο L2 βρόγχος και ο L4 βρόγχος υιοθετούν ευδιάκριτα διαφορετικές θέσεις. Υδρόλυση του GTP: Μηχανισμός και διέγερση από τις GAPs Στην υψηλής ανάλυσης κρυσταλλική δομή της GTP-μορφής της πρωτεΐνης Ras, ένα στενά συνδεδεμένο μόριο νερού είναι φανερά τοποθετημένο σε μια πολύ ευνοϊκή θέση για

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ την πυρηνόφιλη «προσβολή» πάνω στη γ-φωσφορική ομάδα. Το μόριο του νερού συνδέεται σε μια καθορισμένη θέση, με δεσμούς-η με την Gln61 και την Thr35. Η υδρόλυση του GTP πραγματοποιείται από μια «κατά μέτωπο» επίθεση του πυρηνόφιλου μορίου νερού στη γφωσφορική ομάδα, για την οποία προτείνεται μια πεντάγωνη διπυραμιδική μεταβατική κατάσταση. Ο ρυθμός υδρόλυσης του GTP στο σύμπλοκο Ras-GTP είναι πολύ χαμηλός, αλλά αυξάνεται πολλές τάξεις μεγέθους από την αντίστοιχη πρωτεΐνη GAP. Η μοριακή βάση αυτής της διέγερσης εξηγήθηκε από τον καθορισμό της δομής του συμπλόκου Ras-GAP. Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου ενός τμήματος του p120gap (GAP-334 στην Εικόνα 10.7) και Ras GDP AlF3 τερμάτισε μια μακροχρόνια συζήτηση σχετικά με το μηχανισμό της ενεργοποίησης των GTPασών (Εικόνα 10.7) A 10.7.B Gln61 Mg2+ Arg789 Εικόνα 10.7 Α) Διάγραμμα του συμπλόκου GAP334.Ras.GDP.AlF3. Β) Δομική άποψη της ενεργούς θέσης, με τα σημαντικά στοιχεία της κατάλυσης. Γ) Σχηματική άποψη της ενεργούς θέσης. Ο μηχανισμός υδρόλυσης του GTP μετά από διέγερση της Ras από τη GAP Γ

12 338 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών Τα δομικά στοιχεία δείχνουν ότι η GAP συμμετέχει ενεργά στην κατάλυση καθιστώντας διαθέσιμο ένα κατάλοιπο Arg, το οποίο βοηθά να σταθεροποιήσει τη μεταβατική κατάσταση της υδρόλυσης του GTP. Σε ένα δομικό στοιχείο της πρωτεΐνης GAP γνωστό ως βρόγχος δαχτύλου (finger loop), ένα καλά διατηρημένο κατάλοιπο, η Arg789, βρίσκεται ότι αλληλεπιδρά με το AlF 3, το οποίο παίρνει τη θέση της γ-φωσφορικής ομάδας στη μεταβατική κατάσταση της υδρόλυσης. Η Arg789 εξουδετερώνει το φορτίο της γ-φωσφορικής ομάδας και βοηθά στη σταθεροποίηση του L4 βρόγχου της Ras, ο οποίος είναι ένα μέρος της switch ΙΙ περιοχής. Σε αυτήν τη διαδικασία, στη Gln61 του L4 βρόχου αποδίδεται μια κεντρική λειτουργία στην υδρόλυση του GTP, δεδομένου ότι βρίσκεται σε μια ιδανική θέση για την ακριβή ευθυγράμμιση του μορίου του νερού και για τη σταθεροποίηση της μεταβατικής κατάστασης της υδρόλυσης GTP (Εικόνα 10.7B, Γ). Ο βαθμός στον οποίο η Gln6l χρησιμεύει επίσης ως μια βάση, που αφαιρεί ένα πρωτόνιο από το μόριο του νερού και το ενεργοποιεί πυρηνόφιλα, είναι ακόμα υπό συζήτηση. Ένα πρότυπο με αυξανόμενη αποδοχή υποθέτει ότι το αρνητικά φορτισμένο άτομο οξυγόνου της γ-φωσφορικής ομάδας εκτελεί τη λειτουργία μιας πυρηνοφιλικά ενεργοποιημένης βάσης στο μηχανισμό GTPάσης. Η παρατήρηση ότι η θέση 61 μετά από τη θέση 12 είναι η δεύτερη συχνότερη περιοχή των ογκογόνων μεταλλάξεων στους στερεούς όγκους είναι σύμφωνη με την κεντρική σημασία της Gln61 για την υδρόλυση GTP. Η Gln61 είναι ένα ιδιαίτερα συντηρημένο αμινοξύ μέσα στην υπεροικογένεια των GTPασών, ένα κατάλοιπο Gln σε μια ισοδύναμη θέση βρίσκεται επίσης στις α-υπομονάδες των ετεροτριμερών GTPασών. Εξαιρέσεις αποτελούν ο βακτηριακός παράγοντας επιμήκυνσης (EF-Tu) και η Rap GTPάση που έχουν την Ηis και Τhr/Ile, αντίστοιχα, στην ισοδύναμη θέση με την Gln61. Στην περίπτωση του EF- Tu, υποτίθεται ότι το κατάλοιπο Ηis είναι αρμόδιο για την ενεργοποίηση του μορίου νερού. ομή και βιοχημικές ιδιότητες των μεταλλαγμάτων των Ras Η σύγκριση των βιοχημικών ιδιοτήτων των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών Ras με την αγρίου τύπου Ras δείχνει ότι η αυξανόμενη διάρκεια ζωής της GTP-μορφής συσχετίζεται με την ογκογόνο δραστηριότητα. Οι ογκογόνες μεταλλάξεις της πρωτεΐνης Ras βρίσκονται ειδικότερα στις θέσεις 12, 13 και 61. Η θέση 12 είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στις αντικαταστάσεις αμινοξέων. Η αντικατάσταση Glyl2 με οποιοδήποτε αμινοξύ εκτός από Ρro οδηγεί στην ογκογόνα ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Ras. Ο ρυθμός υδρόλυσης του GTP σε ογκογόνες μεταλλάξεις είναι περίπου 90% χαμηλότερος από του άγριου τύπου. Είναι σημαντικό ότι ο χαμηλός ρυθμός υδρόλυσης του GTP δεν μπορεί να αυξηθεί από τις GΑΡs σε αντίθεση με την άγρια τύπου πρωτεΐνη. Όσον αφορά τη διάρκεια ζωής της ενεργοποιημένης κατάστασης GTP, υπάρχει επομένως μια μεγάλη διαφορά μεταξύ της άγριας πρωτεΐνης Ras και των ογκογόνων μεταλλαγμένων πρωτεϊνών Ras. Παρουσία της GΑΡ, οι ογκογόνες μεταλλάξεις της πρωτεΐνης Ras ξοδεύουν περίπου 10 5 φορές περισσότερο χρόνο στην ενεργοποιημένη κατάσταση απ ότι οι άγριου τύπου Ras και μπορούν να διαβιβάσουν ένα κυρίαρχο σήμα στην κατεύθυνση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, που ευνοεί το μετασχηματισμό όγκων. Η σύγκριση της άγριου τύπου δομής με τη δομή των ογκογόνων πρωτεϊνών Ras, στις οποίες η Gly12 αντικαθίσταται από άλλα αμινοξέα, παρουσιάζει μόνο μικρές δομικές αλλαγές στο ενεργό κέντρο. Αυτό δεν μας εκπλήσσει δεδομένου ότι η δραστηριότητα GTPάσης της Ras αλλάζει ελαφρώς στις ογκογόνες μεταλλάξεις. Μόνο όταν ανακαλύφθηκε η δομή του συμπλόκου GAP-Ras έγινε σαφής ο τρόπος με τον οποίο οι ογκογόνες μεταλλάξεις της G12 επηρεάζουν τη μεταγωγή σημάτων Ras. Η Gl2 του Ρ-βρόγχου βρίσκεται πολύ κοντά στην κύρια αλυσίδα του δαχτύλου Arg της πρωτεΐνης GAP και στη Gln61 της πρωτεΐνης Ras. Η αντικατάσταση της γλυκίνης από άλλα αμινοξέα θα οδηγούσε σε απώθηση

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Van der Waals και έτσι τη μετατόπιση του δαχτύλου Arg και της Gln61. Στην ογκογόνα μετάλλαξη G12 της πρωτεΐνης Ras, ο ενεργός ρόλος του δάχτυλου Arg στην υδρόλυση GTP, σύμφωνα με αυτό το πρότυπο, δεν είναι πλέον πιθανός. Η επίδραση των ογκογόνων μεταλλάξεων στη θέση 61 μπορεί επίσης να εξηγηθεί χρησιμοποιώντας το σύμπλοκο Ras-GAP. Η Gln6l έχει μια κεντρική λειτουργία στην υδρόλυση του GTP δεδομένου ότι έρχεται σε επαφή και συντονίζει το υδρολυτικό μόριο του νερού και το Ο-άτομο της γ-φωσφορικής ομάδας του GTP, σταθεροποιώντας έτσι τη μεταβατική κατάσταση. Αμινοξέα με άλλες πλευρικές αλυσίδες δεν μπορούν προφανώς να εκπληρώσουν αυτή τη λειτουργία, όπως παρουσιάζεται από την επίδραση των μεταλλάξεων στη Gln61, κατά την οποία η Gln61 αντικαθίσταται από άλλα αμινοξέα (εκτός από Glu). Εντοπισμός της πρωτεΐνης Ras στην πλασματική μεμβράνη Η λειτουργία της πρωτεΐνης Ras στην ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος είναι αχώριστα συνδεδεμένη με την πλασματική μεμβράνη. Οι πρωτεΐνες Ras αγκυροβολούν στην εσωτερική πλευρά της μεμβράνης των κυττάρων με τη βοήθεια άγκυρας λιπιδίων, όπως το φαρνεσύλιο και το παλμιτοΰλιο. Εικόνα 10.8 Λιπιδιακή «άγκυρα» της πρωτεΐνης Ras. Η τοποθέτηση της Ras στη μεμβράνη πραγματοποιείται μέσω μιας άγκυρας παλμιτοϋλίου και φαρνεσυλίου συνδεδεμένων σε κατάλοιπα Cys του C-τελικού άκρου της Ras. Η φαρνεσυλίωση της πρωτεΐνης Ras λαμβάνει χώρα στο C-τελικό άκρο της ακολουθίας CAAX (Α: αλειφατικό αμινοξύ, Χ: Ser ή Τhr). Το φαρνεσύλιο συνδέεται, με τη βοήθεια μιας φαρνεσυλοτρανσφεράσης (FTase), μέσω ενός θειοαιθερικού δεσμού με το κατάλοιπο Cys της ακολουθίας CAAX. Έπειτα, τα τελευταία τρία αμινοξέα αποκόπτονται από την CAAX ενδοπεπτιδάση και η καρβοξυλική ομάδα της C-τελικής φαρνεσυλιωμένης Cys υποβάλλεται σε μια μεθυλοεστεροποίηση με τη βοήθεια μιας μεθυλοτρανσφεράσης (Εικόνα 10.8). Οι δύο αυτές αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα στη μεμβράνη του ΕΔ. Ένα επιπλέον σήμα είναι απαραίτητο για την τοποθέτηση των Ras στην πλασματική μεμβράνη. Στην περίπτωση των N-Ras και H-Ras, το σήμα είναι η μονο- ή δυ-παλμιτοϋλίωση των κυστεϊνών, που βρίσκονται δίπλα στη φαρνεσυλιωμένη κυστεΐνη. Η αντίδραση παλμιτοϋλίωσης λαμβάνει χώρα στη

14 340 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών μεμβράνη του ΕΔ και καταλύεται από μια παλμιτοϋλο-τρανφρεράση. Στην περίπτωση της K- Ras το σήμα μετακίνησης είναι μια πολυβασική αλληλουχία εξαλυσίνης (ΚΚΚΚΚΚ) δίπλα στη φαρνεσυλιωμένη κυστεΐνη. Πολυβασική αλληλουχία εξαλυσίνης Εικόνα 10.9 Η ετερογενής καρβοξυτελική περιοχή των Ras (HVR: Hypervariable region). Διακρίνεται η κοινή για όλες τις Ras φαρνεσυλιωμένη Cys του C-τελικού άκρου και οι παλμιτοϋλιωμένες Cys των Η- και Ν-Ras. Από Abankwa D, Gorfe AA, Hancock JF. Ras nanoclusters: molecular structure and assembly. Semin Cell Dev Biol. 2007;18(5): Οι διαφορετικές λιπιδιακές άγκυρες προσανατολίζουν τις διάφορες ισομορφές των Ras σε διακριτές «μικροπεριοχές» της πλασματικής μεμβράνης, γνωστές ως nanoclusters. Η τροποποίηση του C-τελικού άκρου είναι απολύτως απαραίτητη για τη λειτουργία των πρωτεϊνών Ras. Οι άγκυρες λιπιδίων, αντίθετα, δεν έχουν καμία επιρροή στην καταλυτική δραστηριότητα Ras GTPάσης. Τουναντίον, το σημείο της μεμβράνης που συνδέεται η Ras έχει το ρόλο να τη φέρει πολύ κοντά στην εσωτερική πλευρά, δηλαδή πολύ κοντά στον τελεστή της, τη Raf κινάση. Εξάλειψη της σηματοδοτικής αλληλουχίας απαραίτητης για την προσθήκη των λιπιδίων στις Ras οδηγεί στην απώλεια της σηματοδοτικής λειτουργίας τους. Εξ αιτίας αυτού, μεγάλες προσπάθειες καταβάλλονται να αναπτυχθούν ανασταλτικοί παράγοντες φαρνεσυλίωσης και να χρησιμοποιηθούν θεραπευτικά ως ανασταλτικοί παράγοντες της μεταγωγής σήματος μέσω της πρωτεΐνης Ras στους όγκους. 4. Η GTPase activating Protein (GAP) στη μεταγωγή σήματος μέσω των Ras Οι πρωτεΐνες Ras έχουν μια πολύ αργή δραστηριότητα GTPάσης, και από μόνες τους, παραμένουν στην ενεργοποιημένη GTP μορφή για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα. Η απενεργοποίηση της πρωτεΐνης Ras ρυθμίζεται in vivo από εξειδικευμένες πρωτεΐνες GAPs, που επιφέρουν μια σημαντική αύξηση στο ρυθμό υδρόλυσης GTP. Οι εξειδικευμένες για την οικογένεια Ras, πρωτεΐνες GAPs είναι γνωστές ως πρωτεΐνες Ras-GAP. Υπάρχουν επίσης εξειδικευμένες πρωτεΐνες GAP και για τα άλλα μέλη της υπεροικογένειας Ras, που χαρακτηρίζονται από συντηρημένα στοιχεία της αλληλουχίας τους. Η σημασία των πρωτεϊνών Ras-GAP στη μεταγωγή σήματος έγινε γνωστή από τις ογκογόνες μεταλλάξεις

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ μετά από αντικατάσταση αμινοξέων των θέσεων 12, 13 και 61, μεταλλάξεις που αντιστέκονται στην επιρροή των GAPs και εμφανίζουν ιδιοσύστατη ενεργοποίηση. ομή της πρωτεΐνης Ras-GAP Πέντε πρωτεΐνες Ras-GAP είναι γνωστές στα θηλαστικά, από τις οποίες η πρωτεΐνη p120 και η νευροφιμπρομίνη (NFl) είναι καλύτερα χαρακτηρισμένες. H p120-gap ανακαλύφθηκε το 1987 (Trahey M, McCormick F. A cytoplasmic protein stimulates normal N-ras p21 GTPase, but does not affect oncogenic mutants. Science Oct 23;238(4826):542-5). Η δομή των περιοχών της p120-gap παρουσιάζεται στην Εικόνα Έχει υδρόφοβο αμινοτελικό άκρο, δύο SH2 περιοχές, μια SH3 περιοχή, μια περιοχή ομόλογη της πλεξτρίνης που την συγκρατεί στην μεμβράνη και μια περιοχή που είναι ομόλογη με τη Ca 2+ -δεσμευτική περιοχή της φωσφολίπασης A2. Η καταλυτική περιοχή για τη δραστηριότητα της GΑΡ βρίσκεται σε ένα τμήμα 250 αμινοξέων κοντά στο C-τελικό άκρο, στην οποία βρίσκονται επίσης τρία ιδιαίτερα συντηρημένα μοτίβα αλληλουχίας. Εικόνα Δομικές περιοχές της p120-gap. Έχει ένα υδρόφοβο Ν-τελικό άκρο, δυο περιοχές SH2, που περιβάλουν μια περιοχή SH3, μια περιοχή ΡΗ και μια περιοχή ομόλογη με την περιοχή της θέσης σύνδεσης του Ca 2+ στην φωσφολιπάση Α2. Η καταλυτική περιοχή της Ras-GAP βρίσκεται σε μια περιοχή 250αα, κοντά στο C-τελικό άκρο. Η πρωτεΐνη ΝF1 ανακαλύφθηκε το 1990 (Ballester R, Marchuk D, Boguski M, Saulino A, Letcher R, Wigler M, Collins F. The NF1 locus encodes a protein functionally related to mammalian GAP and yeast IRA proteins. Cell Nov 16;63(4):851-9). Η διεγερτική επίδραση της NF1 στη δραστηριότητα GTPάσης της πρωτεΐνης Ras είναι συγκρίσιμη με αυτήν της p120-gap. Η σημασία της NF1 για τη ρύθμιση της αύξησης υπογραμμίζεται από την παρατήρηση ότι οι μεταλλάξεις που οδηγούν στην απώλεια της καταλυτικής της δραστηριότητας έχουν βρεθεί στο γονίδιο της NF1 στους ασθενείς που πάσχουν από τύπου Ι νευροϊνωμάτωση του Recklinghausen. Λειτουργία της πρωτεΐνης Ras-GΑΡ Στις GAPs αποδίδεται γενικά η λειτουργία της αρνητικής ρύθμισης στη μεταγωγή σημάτων μέσω των Ras. Οι πρωτεΐνες GAP μπορούν να ελέγξουν την ένταση της μεταγωγής σημάτων μέσω των πρωτεϊνών Ras με τη μείωση της διάρκειας ύπαρξης της ενεργούς κατάστασης της πρωτεΐνης Ras και της μείωσης κατά συνέπεια του αριθμού πρωτεϊνών Ras στην ενεργή κατάσταση GTP. Στη ζύμη, αυτή η λειτουργία έχει αποδειχθεί ξεκάθαρα για τις πρωτεΐνες GAP IRAl και IRA2. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, οι πρωτεΐνες GAP μπορούν από μόνες να λειτουργήσουν ως ρυθμιστές με μια αρνητική επιρροή στη σηματοδοτική διαβίβαση των Ras. Η παρουσία των SH2 και SH3 περιοχών στην p120-gap δείχνει ένα ρόλο στο σηματοδοτικό μονοπάτι που αρχίζει από τους υποδοχείς κινάσες τυροσίνης. Στην πραγματικότητα, οι SH2 περιοχές καθοδηγούν την ειδική δέσμευση της p120-gap στην φωσφοτυροσίνη771 του υποδοχέα PDGF β-τύπου (βλπ Εικόνα 9.18, σελ.270). Στο στάδιο

16 342 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών αυτής της αλληλεπίδρασης, παρατηρείται επίσης φωσφορυλίωση τυροσίνης της pl20gap, της οποίας η φυσιολογική σημασία είναι άγνωστη. Λόγω αυτής της ανακάλυψης, είναι εύλογο ότι η ρύθμιση της δραστικότητας των GAPs που πραγματοποιείται με στόχο τη δραστηριοποίηση των GTPασών Ras, αρχίζει από τους ενεργοποιημένους υποδοχείς κινάσες τυροσίνης. Οι συνθήκες για αυτόν τον έλεγχο, καθώς και εάν άλλες σηματοδοτικές πρωτεΐνες εμπλέκονται στον έλεγχο της δραστηριότητας των GAPs, δεν είναι ακόμη πλήρως προσδιορισμένο. 5. Παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτίδιων γουανίνης (GEFs) στη μεταγωγή σημάτων μέσω των πρωτεϊνών Ras Η πρωτεΐνη Ras είναι ένας κεντρικός σταθμός-διακόπτης στην ενδοκυτταρική μεταγωγή σημάτων, η οποία λαμβάνει, διαμορφώνει και μεταφέρει τα σήματα παρακάτω. Η πρωτεΐνη Ras λαμβάνει, ειδικότερα, τα σήματα που προωθούν την αύξηση και τη διαφοροποίηση, τα οποία αρχίζουν από τους ενεργοποιημένους υποδοχείς κινάσες τυροσίνης και διαβιβάζονται μέσω της πλασματικής μεμβράνης στην πρωτεΐνη Ras. Η μεταγωγή σήματος μεταξύ του ενεργοποιημένου υποδοχέα και της Ras πραγματοποιείται μέσω των παραγόντων ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης, GEFs (guanine nucleotide exchange factors). Οι GEFs, μαζί με τις πρωτεΐνες-προσαρμογείς, διαμορφώνουν τη σύνδεση μεταξύ των ενεργοποιημένων υποδοχέων κινάσες τυροσίνης και της πρωτεΐνης Ras. Ο ρόλος των GEFs είναι να προωθήσουν το σήμα στην πρωτεΐνη Ras, μετατρέποντας την από την ανενεργό μορφή GDP του στην ενεργό GTP. Εκτός από τα σήματα των αυξητικών ορμονών, και άλλα σήματα, όπως τα σήματα Ca +2 υποβάλλονται σε επεξεργασία από το σταθμό-διακόπτη της Ras. Σημασία των GEFs Η σημασία των GEFs στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Ras έγινε γνωστή αρχικά στη ζύμη S. Cerevisiae, όπου ανακαλύφθηκε ότι η πρωτεΐνη CDC25 λειτουργεί ως παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων για την πρωτεΐνη Ras. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CDC25 επιταχύνει εξειδικευμένα την ανταλλαγή νουκλεοτίδιων στη Ras περίπου 1000-φορές, μια ικανότητα που δείχνει σαφώς ότι η πρωτεΐνη CDC25 είναι ένας ενεργοποιητής της Ras. Η λειτουργία της πρωτεΐνης CDC25 είναι επομένως συγκρίσιμη με τη λειτουργία των GPCR υποδοχέων που καταλύουν την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων στις ετεροτριμερείς G-πρωτεΐνες. Το ερώτημα για το ποια σηματοδοτική πρωτεΐνη προηγείται της Ras στους ανώτερους οργανισμούς ήταν ασαφές για πολύ καιρό. Οι γενετικές έρευνες στην Drosophila και το νηματώδη Caenorhabditis elegans έδειξαν ότι τουλάχιστον δύο τύποι πρωτεϊνών εμπλέκονται στην δημιουργία συνδέσμου μεταξύ του ενεργοποιημένου υποδοχέα κινάση τυροσίνης και της πρωτεΐνης Ras. Αυτές είναι οι πρωτεΐνες προσαρμογείς που περιέχουν SH2/SH3 περιοχές και οι παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτίδιων. Οι αντίστοιχες πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν στη συνέχεια στα θηλαστικά. Για τα θηλαστικά, η πρωτεΐνη προσαρμογέας, είναι η πρωτεΐνη Grb2 (Grb: growth factor receptor binding protein, πρωτεΐνη που δεσμεύεται στον υποδοχέα αυξητικών παραγόντων). Η πρωτεΐνη Grb2 υπάρχει στο κύτταρο σε ένα στενό σύμπλοκο με τον παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτίδιων γνωστό ως πρωτεΐνη SOS, λόγω της ομολογίας της με τον παράγοντα ανταλλαγής στην Drosophilα (Sos: son of sevenless λόγω του ρόλου αυτής της πρωτεΐνης στη μεταγωγή σήματος του γονιδίου sevenless στη Drosophila).

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Εικόνα Δομικές περιοχές της msos, ενός Ras εξειδικευμένου-gef. Η πρωτεΐνη msos-1 των θηλαστικών περιέχει μια περιοχή ομόλογη στην πλεξτρίνη (ΡΗ: pleckstrin homology), μια περιοχή πλούσια σε Pro (περιοχή αλληλεπίδρασης με την περιοχή SH3 της πρωτεΐνης Grb2) και μια καταλυτική περιοχή με τρία μοτίβα αλληλουχίας (1,2,3) χαρακτηριστικά για τους Ras-GEFs. ομή και ενεργοποίηση των GEFs Η δομή της πρωτεΐνης msos (m: mammalian) παρουσιάζεται στην Εικόνα Σύγκριση ακολουθίας με τον γνωστό Ras-GEFs αναγνώρισε μια κοινή περιοχή περίπου 200 αμινοξέων, στην οποία αποδόθηκε η δραστηριότητα ανταλλαγής νουκλεοτίδιων. Μέσα σε αυτήν την περιοχή, μπορούν να διακριθούν τρία ιδιαίτερα συντηρημένα στοιχεία ακολουθίας, χωρισμένα από μεταβλητά τμήματα. Άλλα δομικά στοιχεία περιλαμβάνουν μια περιοχή PH και μια περιοχή πλούσια σε Ρrο. Η ακολουθία αυτής της περιοχής λειτουργεί ως θέση δέσμευσης για την SH3 ομάδα της πρωτεΐνης Grb2. Το σύμπλοκο Grb2 και msos αποτελεί ένα σύνδεσμο μεταξύ των Ras και των ενεργοποιημένων υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Η πρωτεΐνη Grb2 έχει δύο SH2 περιοχές και μια SH3 περιοχή. Το σύμπλοκο Sos-Grb2 μπορεί να συμμετέχει στη μεταγωγή σημάτων Ras με δύο μονοπάτια. Σύμφωνα με το πρώτο μονοπάτι, η SH2 περιοχή της Grb2 δεσμεύεται στη φωσφοτυροσίνη του ενεργοποιημένου υποδοχέα, κα με αυτόν τον τρόπο το σύμπλοκο Grb2- msos, που είναι κυρίως εντοπισμένο στο κυτταρόπλασμα, έρχεται κοντά στην πλασματική μεμβράνη (Εικόνα 10.12). Σύμφωνα με το δεύτερο μονοπάτι, μια άλλη πρωτεΐνη προσαρμογέας, η πρωτεΐνη Shc, εμπλέκεται στη μεταγωγή σήματος. Η πρωτεΐνη Shc έχει μια περιοχή δέσμευσης φωσφοτυροσίνης και δεσμεύεται εξειδικευμένα, μέσω αυτής της περιοχής με υποδοχείς όπως ο υποδοχέας PDGF και ο υποδοχέας EGF. Η Shc πρωτεΐνη αυτοφωσφορυλιώνεται σ αυτήν τη διαδικασία. Τα κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης μπορούν επίσης να χρησιμεύσουν ως τα σημεία σύνδεσης για τη SH2 περιοχή της πρωτεΐνης Grb2, με την οποία το σύμπλοκο Grb2-Sos είναι συνδεμένο στη μεμβράνη. Όταν βρίσκεται στη μεμβράνη, η πρωτεΐνη Sos αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Ras, που επίσης συνδέεται στη μεμβράνη, και επάγει την ανταλλαγή νουκλεοτίδιων. Υποτίθεται ότι η τοποθέτηση του Grb2-Sοs από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη είναι το αποφασιστικό βήμα που οδηγεί στη δέσμευση της πρωτεΐνης Ras στον ενεργοποιημένο υποδοχέα. Η σύνδεση στη μεμβράνη και των δύο πρωτεϊνών είναι αρκετή για τη δραστηριοποίηση της μεταγωγής σήματος και για την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Ras. Ο ακριβής μηχανισμός της ανταλλαγής νουκλεοτιδίων έχει εξηγηθεί αναλυτικά. Η πρωτεΐνη CDC25 στη ζύμη δεσμεύεται στη GDP μορφή της πρωτεΐνης Ras και σχηματίζει ένα σύμπλοκο με την ελεύθερη από νουκλεοτίδια μορφή της πρωτεΐνης Ras. Το διμερές σύμπλοκο Ras-CDC25 μπορεί να διαχωριστεί από το GDP ή το GTP. Δεδομένου ότι υπάρχει μεγαλύτερη συγκέντρωση GTP, έναντι του GDP, στο κύτταρο, η ελεύθερη από νουκλεοτίδια μορφή της πρωτεΐνης Ras μετατρέπεται κατά προτίμηση στην ενεργό κατάσταση. Η κατευθυντήρια δύναμη για την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων είναι λοιπόν η υψηλή συγκέντρωση GTP στο κύτταρο. Με τη σταθεροποίηση της ελεύθερης από νουκλεοτίδια μορφής της πρωτεΐνης Ras, οι GEFs επιτρέπουν τη σύνδεση των νουκλεοτιδίων της γουανίνης που εμφανίζονται στην υψηλότερη συγκέντρωση στο κύτταρο, δηλαδή των GTP.

18 344 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών α) β) Εικόνα Πρότυπο της λειτουργίας του Grb2-mSos και της πρωτεΐνης προσαρμογέα Shc στη σηματοδότηση των Ras. Η Εικόνα παρουσιάζει μια ιδιαίτερα απλουστευμένη έκδοση των δύο γνωστών μονοπατιών με συμμετοχή του συμπλόκου Grb2-mSos στη μεταγωγή σημάτων μέσω της πρωτεΐνης Ras. Τα κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης ενός ενεργοποιημένου αυτοφωσφορυλιωμένου υποδοχέα (R*) μπορούν να χρησιμεύσουν ως σημεία σύνδεσης για τις περιοχές PTB της Shc (α) ή για τη SH2 περιοχή του Grb2-mSos (β). Σε περίπτωση που (α), η φωσφορυλίωση της Tyr της Shc εκτελείται από τον ενεργοποιημένο υποδοχέα, το σύμπλοκο Grb2-mSos δεσμεύει τα προσφάτως φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα Tyr και προχωρεί στη μεταγωγή σημάτων. Στην περίπτωση (β) το σύμπλοκο Grb2-SOS δρα άμεσα μεταξύ του υποδοχέα και της πρωτεΐνης Ras. Και στις δύο περιπτώσεις το Grb2-mSos στοχεύει στη μεμβράνη και από εκεί, μπορεί να καταλύσει την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων στην πρωτεΐνη Ras. Η βάση του μηχανισμού της ανταλλαγής νουκλεοτιδίων από τους GEFs μπορεί να εξηγηθεί από τις, υψηλής ανάλυσης, κρυσταλλικές δομές των GEFs και των μελών της υπεροικογένειας των Ras-GTPασών. Τα στοιχεία προτείνουν ότι η ανταλλαγή νουκλεοτιδίων προωθείται από τους GEFs με την εισαγωγή καταλοίπων στην περιοχή δέσμευσης νουκλεοτιδίων της πρωτεΐνης Ras, ώστε στερεοδομικά και ηλεκτροστατικά αναγκάζουν το νουκλεοτίδιο σε απομάκρυνση. Οι GEFs αλληλεπιδρούν με την περιοχή switch ΙΙ και προκαλούν την μετατόπιση της switch Ι ώστε να κάνει διαθέσιμη την περιοχή σύνδεσης νουκλεοτίδιων. Η ρύθμιση των GEFs ποικίλλει και δεν περιλαμβάνει μόνο αλληλεπιδράσεις μέσω καθορισμένων πρωτεϊνών-προσαρμογέων με ενεργοποιημένους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Υπάρχουν άλλοι Ras-GEFs που ελέγχονται από διαφορετικούς μηχανισμούς, συγκεκριμένα από δεύτερους αγγελιοφόρους. Οι Ras-GEFs στον εγκέφαλο (γνωστές ως RasGRF1) βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο της διακυλογλυκερόλης και του Ca 2+. Επιπλέον ένας παράγοντας ανταλλαγής που ενεργοποιείται από camp έχει περιγραφεί για την πρωτεΐνη Rap1, ο Epac (exchange protein directly activated by camp). Τα σήματα μπορούν επίσης να διαβιβαστούν στα μονοπάτια της Ras από GPCR υποδοχείς. Κατ' αυτόν τον τρόπο, η διέγερση των GEFs μπορεί να συμβεί άμεσα από το βγσύμπλοκο.

19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ H Raf κινάση ο κύριος τελεστής των πρωτεινών Ras Ποιες σηματοδοτικές πρωτεΐνες είναι οι επόμενες στη σειρά μετά από την πρωτεΐνη Ras; Η πρώτη γνώση αυτού του κεντρικού σημείου για τη λειτουργία της Ras προήλθε το 1984 μέσα από τις έρευνες που πραγματοποιήθηκαν για τη δομή και τη λειτουργία του ιϊκού ογκογονιδίου v-raf. Το γονίδιο v-raf κωδικοποιεί την 74 ΚDa πρωτεϊνική κινάση Ser/Thr, Raf (Mark GE, Rapp UR., Primary structure of v-raf: relatedness to the src family of oncogenes. Science 1984 Apr 20;224:285-9). Το όνομά της Raf (rapidly accelerated fibrosarcoma) προήλθε από την επιτάχυνση δημιουργίας ινοσαρκώματος που προκαλεί ο ιός MSV3611 που περιέχει το v-raf γονίδιο. Η διαφορά του ιϊκού γονίδιου v-raf από το κυτταρικό του αντίστοιχο γονίδιο, c-raf, εντοπίζεται στην απουσία αμινοξέων στο N-τελικό άκρο της κωδικοποιημένης πρωτεΐνης. Αυτό το τμήμα έχει μια αυτορυθμιζόμενη λειτουργία της δραστηριότητας πρωτεϊνικής κινάσης της πρωτεΐνης Raf. Η απώλεια της αυτορυθμιζόμενης περιοχής είναι υπεύθυνη για την ιδιότητα μετασχηματισμού που εμφανίζει η ιϊκή πρωτεΐνη. Οι εκτενείς γενετικές και βιοχημικές έρευνες γρήγορα έδειξαν ότι η κινάση Raf έχει μια λειτουργία τελεστή στο μονοπάτι της Ras, αμέσως μετά από την πρωτεΐνη Ras. Μέσω της Raf κινάσης, δημιουργείται ένας σύνδεσμος μεταξύ της μεταγωγής σήματος από τη Ras και των μονοπατιών των ΜΑΡΚ. Μία από τις λειτουργίες αυτού του συνδέσμου είναι η ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων, μεγάλης σπουδαιότητας για τον έλεγχο και τη συνέχεια του κυτταρικού κύκλου. Εντούτοις, η Raf κινάση δεν είναι το μόνο μόριο τελεστής της πρωτεΐνης Ras. Αντίθετα, υπάρχουν άλλα μόρια τελεστές που αλληλεπιδρούν με τη GTP μορφή της πρωτεΐνης Ras κατά τρόπο εξειδικευμένο και δημιουργούν συνδέσμους με άλλα μονοπάτια μεταγωγής σήματος. ομή της Raf κινάσης Τα θηλαστικά έχουν τουλάχιστον τρία διαφορετικά γονίδια για τις Raf κινάσες, τα γονίδια Α-raf, Β-raf, c-raf. Η δομή των κινασών Raf των θηλαστικών, της Drosophila (D-Raf) και του C. elegans (lin-45) παρουσιάζεται στην Εικόνα Οι Raf κινάσες έχουν τρεις κοινές, συντηρημένες περιοχές. Δύο από αυτές τις περιοχές, CR1 και CR2, είναι προς το Ν-τελικό άκρο και έχουν μια ρυθμιστική λειτουργία στη δραστηριότητα των Raf. Οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις σε αυτές τις περιοχές ενεργοποιούν τη δυνατότητα μετασχηματισμού της Raf κινάσης. Η CR1 περιοχή περιέχει την περιοχή δέσμευσης της Ras-GTP (RBD: Ras binding domain) και ένα τμήμα πλούσιο σε Cys με τη δυνατότητα να δεσμεύσει Zn 2+ (CRD: Cys rich domain). Ένα παρόμοιο δομικό στοιχείο βρίσκεται στη Ν-τελική περιοχή της πρωτεϊνικής κινάσης C. Διαγραφή της N-τελικής ακολουθίας και συγκεκριμένα της CR1 περιοχής, επιφέρουν την ιδιοσύστατη ενεργοποίηση της Raf κινάσης. Η CR2 περιοχή είναι πλούσια σε κατάλοιπα Ser/Τhr υπεύθυνα για την αρνητική ρύθμιση της κινάσης μέσω φωσφορυλίωσης από την ΡΚΑ. Περιέχει ένα καλά συντηρημένο, ιδιοσύστατα φωσφορυλιωμένο κατάλοιπο Ser (S259), υπεύθυνο για τη σύνδεση της Raf στις πρωτεΐνες Η CR3 περιοχή είναι υπεύθυνη για τη δραστικότητα κινάσης και περιέχει όλες τις θέσεις φωσφορυλίωσης υπεύθυνες για την ενεργοποίηση της Raf. Επίσης η CR3 περιοχή περιέχει ένα ακόμη συντηρημένο, ιδιοσύστατα φωσφορυλιωμένο κατάλοιπο Ser (S621) υπεύθυνο για τη σύνδεση της Raf στις πρωτεΐνες Η σύνδεση των πρωτεϊνών στις Raf, μέσω των S259 και S621, διατηρεί τις Raf σε μια διαμόρφωση αυτοαναστολής. Το κλειδί για την άρση της αυτοαναστολής είναι η φωσφατάση ΡΡ2, η οποία ενεργοποιείται από τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων και αποφωσφορυλιώνει την Ser259, και οδηγεί την Raf σε μια ανοιχτή διαμόρφωση που επιτρέπει τη σύνδεσή της στη Ras και στη μεμβράνη.

20 346 Μετάδοση μηνυμάτων μέσω των μονομερών G πρωτεϊνών Εικόνα Δομικές περιοχές των Raf κινασών των θηλαστικών (Raf-1 ή C-Raf, B-Raf και A- Raf), της Drosophila (D-Raf) και του C. elegans (lin-45). Στο αμινοτελικό άκρο διακρίνονται η CR1 και CR2 (control region) ρυθμιστικές περιοχές και στο καρβοξυτελικό άκρο η CR3 καταλυτική περιοχή κινάσης. Επίσης διακρίνονται οι θέσης φωσφορυλίωσης, η θέση σύνδεσης του ATP (K375) και το κατάλοιπο V600 της Β-Raf, το οποίο έχει βρεθεί μεταλλαγμένο στους ανθρώπινους όγκους. Από Leicht DT, Balan V, Kaplun A, Singh-Gupta V, Kaplun L, Dobson M, Tzivion G., Raf kinases: function, regulation and role in human cancer, Biochim Biophys Acta Aug;1773(8): Αλληλεπίδραση της Raf κινάσης με την πρωτεΐνη Ras Οι γενετικές και βιοχημικές έρευνες δείχνουν ότι η Raf κινάση έχει μια λειτουργία κεντρικού τελεστή στη μεταγωγή σημάτων μέσω των πρωτεϊνών Ras. Η Raf κινάση είναι αμέσως επόμενη από την πρωτεΐνη Ras στη σηματοδοτική αλυσίδα. Η ενεργοποιημένη GTP μορφή της πρωτεΐνης Ras αλληλεπιδρά με συγκεκριμένο τρόπο με τη Raf κινάση και έτσι μεσολαβεί στον εντοπισμό της Raf κινάσης στη μεμβράνη. Συνεπώς, η δραστηριότητα κινάσης της Raf διεγείρεται και το σήμα διαβιβάζεται περαιτέρω μέσω του καταρράκτη αντιδράσεων των ΜΑΡ πρωτεϊνικών κινασών. Η μεταγωγή σημάτων μεταξύ της πρωτεΐνης Ras και της κινάσης Raf βασίζεται σε μια συγκεκριμένη αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών, η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο από την ενεργοποιημένη, GTP-συνδεδεμένη μορφή της πρωτεΐνης Ras. Η ανενεργός, GDP μορφή της πρωτεΐνης Ras παρουσιάζει σημαντικά πιο αδύνατη σύνδεση στην Raf κινάση. Ο σχηματισμός του συμπλόκου δεν σχετίζεται με τη διέγερση της δραστηριότητας GTPάσης της πρωτεΐνης Ras, και έτσι υποτίθεται ότι η λήξη της μεταγωγής σημάτων εμφανίζεται μόνο στο διαχωρισμό της Raf κινάσης ή στην υδρόλυση του συνδεδεμένου GTP. Το δομικό στοιχείο της κινάσης c-raf που εμπλέκεται στο σχηματισμό του συμπλόκου με τη Ras βρίσκεται στη CR1 περιοχή, ενώ από την πλευρά της Ras, στο σχηματισμό του

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ συμπλόκου εμπλέκονται οι L2 και L4 βρόγχοι της περιοχής τελεστή (βλπ Κεφάλαιο 11. Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡΚινασών). Η κατανόηση της μοριακής αλληλεπίδρασης μεταξύ της Raf κινάσης και της πρωτεΐνης Ras προήλθε από την ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου της c-raf και μιας Ras-ομόλογης πρωτεΐνης, της πρωτεΐνη Rap1. Μηχανισμός της ενεργοποίησης και ρύθμισης της Raf κινάσης Ο μηχανισμός της ενεργοποίησης της Raf κινάσης από την Ras πρωτεΐνη δεν είναι πλήρως κατανοητός. Οι προκαταρκτικές πληροφορίες λήφθηκαν από πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε μια πρωτεϊνική σύντηξη της αλληλουχίας CAAX της πρωτεΐνης Κi- Ras η οποία λειτουργεί ως σήμα για τον εντοπισμό της στη μεμβράνη, με το C-τελικό άκρο της Raf κινάσης. Η παρουσία της παραπάνω αλληλουχίας της Ras στην κινάση Raf, οδηγεί στην ιδιοσύστατη ενεργοποίησή της, δηλ. η δραστηριότητα της Raf είναι ανεξάρτητη από την πρωτεΐνη Ras. Στην πρωτεΐνη Κi-Ras, η ακολουθία CAAX αντιπροσωπεύει ένα σήμα για τη φαρνεσυλίωση, το οποίο μαζί με τη βασική αλληλουχία εξαλυσίνης (ΚΚΚΚΚΚ), είναι επαρκής για να επιφέρει το μεμβρανικό εντοπισμό της πρωτεΐνης Κi-Ras. Από το αποτέλεσμα αυτό συμπεραίνουμε ότι μια σημαντική λειτουργία της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης Ras είναι να μεταφέρει την Raf κινάση στη μεμβράνη. Είναι ακόμα ασαφές πώς η δυνατότητα μεμβρανικής μετακίνησης της Raf κινάσης συνδέεται με την ενεργοποίησή της. Υποτίθεται ότι ο μεσολαβούμενος από τη Ras μεμβρανικός εντοπισμός της Raf κινάσης είναι το πρώτο βήμα που πρέπει να ακολουθηθεί από άλλα γεγονότα, όπως πρωτεϊνική φωσφορυλίωση, oλιγομερισμός και αλληλεπίδραση με άλλους συμπαράγοντες, για να επέλθει η πλήρης ενεργοποίησή της. Η πολυπλοκότητα της ρύθμισης της Raf κινάσης παρουσιάστηκε με την ανακάλυψη τριών πρωτεϊνών που μπορούν συγκεκριμένα να συνδεθούν με την Raf κινάση. Τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών βρίσκονται συνδεμένα με την Raf κινάση. Οι πρωτεΐνες αναγνωρίζουν και δεσμεύουν τα κατάλοιπα φωσφοσερίνης μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας. Όπως είδαμε οι πρωτεΐνες δεσμεύονται στα κατάλοιπα φωσφοσερίνης S259 και S621 της Raf κινάσης και με αυτόν τον τρόπο καθορίζουν μια ανενεργό διαμόρφωση. Άλλες πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τις Raf είναι οι μοριακοί «συνοδοί» (chaperones) hsp90 και p50. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι σημαντικές για τη διατήρηση της πρωτεϊνικής σταθερότητας και για τον κατάλληλο εντοπισμό της Raf κινάσης μέσα στο κύτταρο. Βλέπε επίσης και σελ Εικ.11.4 και Εικόνα Α. Σε κατάσταση ηρεμίας η Raf βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, συνδεδεμένη με την πρωτεΐνη , μέσω των καταλοίπων S259 και S621. Β. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα, αφενός ενεργοποιεί την Ras (Ras.GTP) και αφετέρου την φωσφατάση ΡΡ2Α, η οποία αποφωσφορυλιώνει την Ser259 της Raf, οδηγώντας στην αλλαγή της διαμόρφωσής της, γεγονός που επιτρέπει τη σύνδεση με τη μεμβράνη και την Ras. Από Anderson D., Role of lipids in the MAPK signalling pathway, Progress in Lipid Res. 2006, 45,