Μετάφραση (Translation)

Transcript

1 Μετάφραση (Translation) Πώς η γενετική πληροφορία που περιέχεται στα νουκλεοτίδια του mrna διερμηνεύεται προκειμένου να παραχθεί η γραμμική αλληλουχία των αμινοξέων στο μόριο της πρωτεΐνης; Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία

2 Μετάφραση Εισαγωγικές έννοιες Η μετάφραση συγκαταλέγεται μεταξύ των περισσότερο συντηρημένων διεργασιών σε όλους τους οργανισμούς. Απαιτεί την κατανάλωση σημαντικής ποσότητας ενέργειας. Σε ταχέως αυξανόμενα βακτηριακά κύτταρα έως το 80% της ενέργειας του κυττάρου καταναλώνεται στην πρωτεϊνοσύνθεση. Είναι μια πολύπλοκη βιοσυνθετική διεργασία. Η σύνθεση μιας πρωτεϊνικής αλυσίδας απαιτεί τη συντονισμένη δράση περισσότερων των 100 πρωτεϊνών και αρκετών μορίων RNA.

3 Μετάφραση Εισαγωγικές έννοιες Ενώ κατά τη μεταφορά της γενετικής πληροφορίας από το DNA στο mrna υπάρχει αμφιμονοσήμαντη αντιστοίχιση (ζευγάρωμα συμπληρωματικών βάσεων), η μεταφορά της πληροφορίας από το mrna στην πρωτεΐνη αφορά «ανόμοια» είδη μορίων (νουκλεοτίδια και αμινοξέα) και ακολουθεί μια σχέση 3:1, δηλαδή τρεις διαδοχικές νουκλεοτιδικές βάσεις αντιστοιχούν σε ένα αμινοξύ.

4 Πως επιτυγχάνεται η αντιστοίχιση νουκλεοτιδικών τριπλετών και αμινοξέων; Το 1955 ο Francis H. Crick πρότεινε ότι τα αμινοξέα, πριν την ενσωμάτωσή τους σε πολυπεπτίδια, πρέπει να συνδεθούν σ ένα ειδικό μόριο «προσαρμοστή» (adaptor), το οποίο είναι σε θέση να αναγνωρίζει και να αλληλεπιδρά άμεσα με τις νουκλεοτιδικές τριπλέτες του mrna. Επιπλέον, φαντάστηκε ότι το μόριο «προσαρμοστής» θα ήταν ένα μόριο RNA ικανό να αναγνωρίζει το mrna με βάση τους κανόνες της συμπληρωματικότητας των βάσεων. Δύο χρόνια αργότερα οι Zamecnik και Hoagland έδειξαν ότι πριν την ενσωμάτωσή τους σε πρωτεΐνες, τα αμινοξέα συνδέονται με μια κατηγορία μορίων RNA (15% του συνόλου του κυτταρικού RNA) που ονομάστηκαν μεταφορικά RNA (trna) επειδή τα προσδενόμενα σε αυτά αμινοξέα μεταφέρονται στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα.

5 Πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή Η μηχανή που είναι υπεύθυνη για τη μετάφραση από τη γλώσσα των mrna στη γλώσσα των πρωτεϊνών αποτελείται από τέσσερα κύρια συστατικά: mrna trna Αμινοάκυλο-tRNA-συνθετάσες ριβόσωμα

6 Το mrna: Αποτελεί το εκμαγείο της μετάφρασης και παρέχει την πληροφορία που πρέπει να διερμηνευτεί από την μεταφραστική μηχανή. Η περιοχή κωδικοποίησης πρωτεΐνης του mrna αποτελείται από μια διατεταγμένη σειρά μονάδων τριών νουκλεοτιδίων που ονομάζονται κωδικόνια και καθορίζουν τη σειρά των αμινοξέων. Τα μόρια trna: Παρέχουν τη φυσική διεπιφάνεια μεταξύ των αμινοξέων που προστίθονται στην αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα και των κωδικονίων στο mrna. Οι αμινοάκυλο-trna-συνθετάσες: Αποτελούν τα ένζυμα που συνδέουν τα αμινοξέα στα συγκεκριμένα μόρια trna που αναγνωρίζουν το κατάλληλο κωδικόνιο. Το ριβόσωμα: Ένα σύμπλοκο RNA και πρωτεϊνών πολλών megadaltons που συντονίζει τη σωστή ανάγνωση του mrna, την αναγνώριση των κωδικονίων από κάθε trna και καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ των αμινοξέων που προστίθενται στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσσίδα.

7 ΑΓΓΕΛΙΟΦΟΡΟ RNA O μηχανισμός της μετάφρασης αποκωδικοποιεί ένα μόνο μέρος της πληροφορίας του κάθε mrna. Η περιοχή κάθε mrna που κωδικοποιεί πρωτεΐνη αποτελείται από μια συνεχή, μη επικαλυπτόμενη σειρά κωδικονίων που ονομάζεται ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (open reading frame, ORF). To πρώτο και το τελευταίο κωδικόνιο ενός ORF είναι γνωστά ως κωδικόνια έναρξης και λήξης.

8 Κωδικόνιο έναρξης Καθορίζει το πρώτο αμινοξύ που πρόκειται να ενσωματωθεί στην νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Ορίζει το πλαίσιο ανάγνωσης για όλα τα επόμενα κωδικόνια. Επειδή κάθε κωδικόνιο είναι ευθέως παρακείμενο, αλλά όχι επικαλυπτόμενο με το επόμενο και επειδή κάθε κωδικόνιο έχει μήκος τριών νουκλεοτιδίων θεωρητικά οποιοδήποτε τμήμα mrna θα μπορούσε να μεταφραστεί σε τρία διαφορετικά πλαίσια ανάγνωσης. Ωστόσο, μόλις ξεκινήσει η μετάφραση καθορίζεται το πλαίσιο ανάγνωσης.

9 Κωδικόνια λήξης Είναι τρία (5 -UAG- 3, 5 -UGA- 3 και 5 -UAA- 3 ). Ορίζουν το τέλος του πλαισίου ανάγνωσης. Σηματοδοτούν τον τερματισμό της σύνθεσης του πολυπεπτιδίου.

10 Μονοκιστρονικά Πολυκιστρονικά mrna Ο αριθμός των ORFs ανά mrna είναι διαφορετικός μεταξύ ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών. Τα ευκαρυωτικά mrna σχεδόν πάντοτε περιέχουν ένα μονήρες ORF και είναι γνωστά ως μονοκιστρονικά mrna, ενώ Τα προκαρυωτικά mrna συχνά περιέχουν δύο ή περισσότερα ORFs και είναι γνωστά ως πολυκιστρονικά mrna.

11 ΜΕΤΑΦΟΡΙΚΟ RNA Το trna είναι ένα μικρό μόριο (μήκους ριβονουκλεοτιδίων) και χαρακτηρίζεται από δύο βασικές ιδιότητες: 1. Μεταφέρει ομοιοπολικά συνδεδεμένο ένα και μόνο αμινοξύ 2. Περιέχει μια συγκεκριμένη αλληλουχία τριών νουκλεοτιδίων, το αντικωδικόνιο (anticondon) που είναι συμπληρωματική του κωδικονίου (codon) του mrna. Έτσι, κάθε trna έχει τη δυνατότητα μεταφοράς ενός αμινοξέος και χαρακτηρίζεται από ένα συγκεκριμένο αντικωδικόνιο, το οποίο μπορεί να αναγνωρίζει ένα ή περισσότερα (όπως θα δούμε παρακάτω) κωδικόνια.

12 Χαρακτηριστικά της πρωτοταγούς δομής των trnas 1. Όλα τα trna καταλήγουν στο 3 άκρο τους με την αλληλουχία 5 -CCA-3, το 3 άκρο της οποίας αποτελεί τη θέση σύνδεσης με το αναγνωριζόμενο αμινοξύ. 2. Η παρουσία ασυνήθιστων βάσεων στην πρωτοταγή δομή τους. 3. Οι ασυνήθιστες βάσεις δημιουργούνται με ενζυμική τροποποίηση των φυσιολογικών βάσεων της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας. Για παράδειγμα, η ψευδοουριδίνη (ΨU ή ψ) προέρχεται από την ουριδίνη μέσω ισομερισμού της θέσης πρόσδεσης της ουρακίλης στη ριβόζη. Η διϋδροουριδίνη (D) μέσω ενζυμικής αναγωγής του διπλού δεσμού των θέσεων 5 και 6 της ουριδίνης. 4. Άλλες ασυνήθιστες βάσεις που απαντώνται στο trna περιλαμβάνουν την υποξανθίνη, τη θυμίνη την ινοσίνη και τη μεθυλογουανίνη.

13 Δευτεροταγής δομή των trna Όλα τα μόρια trna παρουσιάζουν ένα χαρακτηριστικό και ιδιαίτερα συντηρημένο πρότυπο μονόκλωνων και δίκλωνων περιοχών, το οποίο μπορεί να απεικονιστεί ως τριφύλλι. Εκτός από τα συνηθισμένα ζευγάρια βάσεων (κατά Watson-Crick) G:C, A:T, δεν είναι σπάνιες οι περιπτώσεις άτυπων ζευγαριών βάσεων, όπως G:U, G:ψ ή A:ψ. Τα άτυπα ζευγάρια αν και είναι λιγότερο σταθερά από θερμοδυναμική άποψη, διευκολύνουν και καθορίζουν το σχηματισμό της στερεοδιάταξης των trna μορίων. Η δευτεροταγής δομή του trna αναλύεται σε: Τέσσερες βασικούς βραχίονες (arms ή stems) Έναν επιπρόσθετο μεταβλητό βραχίονα (extra arm) Τρείς θηλιές (loops) 3

14 Ο βραχίονας δέκτης (acceptor stem) Ονομάζεται και αμινοξικός λόγω της θέσης πρόσδεσης του αμινοξέος. Σχηματίζεται από τις 7 πρώτες και τις 8 τελευταίες βάσεις του μορίου. Ο αριθμός των 7 ζευγαριών είναι συντηρητικός μεταξύ των διαφόρων trna, όπως και η εμφάνιση μιας αζευγάρωτης βάσης στο 3 άκρο. Στην αζευγάρωτη βάση προστίθεται μεταμεταγραφικά στα ευκαρυωτικά κύτταρα η συντηρητική αλληλουχία 5 -CCA-3 ενώ στα προκαρυωτικά η αλληλουχία αυτή υφίσταται σε επίπεδο γονιδίου. Στο 3 άκρο του CCA και συγκεκριμένα στο 2 ή 3 ΟΗ, συνδέεται το καρβοξυτελικό άκρο του αμινοξέος με το οποίο φορτίζεται το κάθε trna.

15 Ο βρόχος D Παίρνει το όνομά του από την παρουσία μια τροποποιημένης βάσης διϋδροουριδίνης (D). Ο βραχίονας D (D-arm) έχει τυπικό μήκος τεσσάρων ζευγών βάσεων η αλληλουχία των οποίων διαφέρει από trna σε trna, αλλά είναι συντηρητικοί η εμφάνιση μιας πυριμιδίνης στη θέση 11 που ζευγαρώνει με μια πουρίνη στη θέση 24. Το μήκος της θηλιάς D (D-loop) ποικίλει από 7 έως 11 βάσεις.

16 Ο βρόχος του αντικωδικονίου Όπως υπαινίσσεται το όνομά του περιέχει το αντικωδικόνιο, μια αλληλουχία τριών νουκλεοτιδίων υπεύθυνη για την αναγνώριση του κωδικονίου στο mrna. Αποτελεί την πλέον συντηρητική περιοχή του μορίου από πλευράς μήκους. Ο βραχίονας αποτελείται από 5 ζεύγη βάσεων και η θηλιά από 7 βάσεις, από τις οποίες οι 3 κεντρικές σχηματίζουν το αντικωδικόνιο. Το αντικωδικόνιο περιβάλλεται πάντοτε στο 3 άκρο από μια πουρίνη και στο 5 άκρο του από μια ουρακίλη.

17 Ο βρόχος ΤψC και ο μεταβλητός βραχίονας Ο βρόχος ΤψC παίρνει το όνομά του από την συντηρητική παρουσία της αλληλουχίας ΤψC στην θηλιά του, όπου ψ η ψευδοουρακίλη. Το μήκος του βραχίονα είναι 5 ζευγάρια βάσεων και το μήκος της θηλιάς 7 βάσεις, συντηρητικές ή ημισυντηρητικές, στο μεγαλύτερο ποσοστό τους. Ο μεταβλητός βραχίονας βρίσκεται μεταξύ του βρόχου του αντικωδικονίου και του ΤψC βρόχου και, όπως υπαινίσσεται από το όνομά του, ποικίλλει σε μέγεθος από 3 έως 21 βάσεις.

18 Τριτοταγής δομή των trna Η τριτοταγής δομή των trna είναι πρακτικά η μορφή του μορίου στο χώρο (στερεοδομή ή στερεοδιάταξη). Η δομή αυτή δεν θυμίζει το σχήμα του τριφυλλιού, αλλά το κεφαλαίο Ελληνικό γράμμα Γ ή το Λατινικό γράμμα L γι αυτό και στην ξένη βιβλιογραφία αναφέρεται ως «Lshaped» δηλαδή «L-μορφής». Τα δεδομένα για την τριτοταγή δομή των trna προέκυψαν από κρυσταλλογραφική ανάλυση (σκέδαση ακτίνων Χ) σε απομονωμένα trna μόρια (κυρίως του ζυμομύκητα. Τα κοινά δομικά χαρακτηριστικά που προέκυψαν από τις αναλύσεις αυτές μας επιτρέπουν την περιγραφή ενός γενικού προτύπου που ισχύει για όλα τα μόρια trna.

19 D TψC Η τριτοταγής δομή των trna είναι συμπαγής και αποτελείται σε γενικές γραμμές από δύο έλικες σε ορθή γωνία μεταξύ τους. Η πρώτη περιλαμβάνει τον βραχίονα δέκτη και τον ΤψC βρόχο, ενώ η δεύτερη τον D βραχίονα και τον βραχίονα του αντικωδικονίου.

20 Στη σταθεροποίηση της τριτοταγούς δομής των trna συμμετέχουν οι δεσμοί υδρογόνου που υπάρχουν στην δευτεροταγή δομή, αλλά και δεσμοί υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ βάσεων - με μη συμβατικούς δεσμούς Watson Crick - που ανήκουν σε διαφορετικές ελικοειδείς περιοχές φέροντας έτσι κοντά την μία στην άλλη στον τρισδιάστατο χώρο. Οι δεσμοί αυτοί είναι γνωστοί ως τριτοταγείς δεσμοί υδρογόνου (tertiary H bonds) και στην εμφάνισή τους εμπλέκονται πολλές από τις συντηρητικές θέσεις των trna.

21 ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΣΤΟ trna Τα trna μόρια στα οποία προσδένεται ένα αμινοξύ θεωρούνται φορτισμένα (charged) και τα trna που στερούνται του αμινοξέος αφόρτιστα (uncharged). Τα trna φορτίζονται με την πρόσδεση του κατάλληλου αμινοξέος μέσω ενός δεσμού ακυλίου μεταξύ της καρβοξυλομάδας του αμινοξέος και της 2 ή 3 υδροξυλομάδας της αδενοσίνης που προεξέχει από το βραχίονα δέκτη στο 3 άκρο του trna. Τα ένζυμα που καταλύουν την φόρτιση των trnas ονομάζονται αμινοάκυλοtrna συνθετάσες.

22 Όλες οι αμινοάκυλο-trna συνθετάσες φορτίζουν τα trna με μια διαδικασία δύο βημάτων. To πρώτο βήμα είναι η αδενυλυλίωση (adenylylation). Η αντίδραση αναφέρεται στην μεταφορά του ΑΜΡ στο αμινοξύ με ταυτόχρονη απελευθέρωση πυροφωσφορικού. Η επακόλουθη υδρόλυση του πυροφωσφορικού από την πυροφωσφατάση αποτελεί την κύρια κατευθυντήρια δύναμη για τη διεξαγωγή της αντίδρασης. Μέσω της αντίδρασης αυτής το αμινοξύ προσδένεται στο αδενυλικό οξύ μέσω ενός εστερικού δεσμού υψηλής ενέργειας, στον οποίο η καρβονυλική ομάδα του αμινοξέος προσδένεται στη φωσφορική ομάδα του ΑΜΡ.

23 To δεύτερο βήμα είναι η μεταφορά του αδενυλυλιωμένου αμινοξέος στο trna. Το αδενυλυλιωμένο αμινοξύ που παραμένει ισχυρά δεσμευμένο στην συνθετάση αντιδρά με το trna, με αποτέλεσμα την μεταφορά του αμινοξέος στο 3 άκρο του trna, μέσω του δεσμού υψηλής ενέργειας. Υπάρχουν δύο κατηγορίες trna συνθετασών. Τα ένζυμα της κατηγορίας Ι προσδένουν το αμινοξύ στο 2 -ΟΗ της αδενοσίνης του trna και γενικά είναι μονομερή, ενώ τα ένζυμα της κατηγορίας ΙΙ προσδένουν το αμινοξύ στο 3 -ΟΗ της αδενοσίνης του trna και τυπικά είναι διμερή ή τριμερή.

24

25 Μία και μόνο μία αμινοάκυλο-trna συνθετάση προσδένει κάθε αμινοξύ σε όλα τα κατάλληλα trna. Επειδή τα περισσότερα αμινοξέα προσδιορίζονται από περισσότερα του ενός κωδικόνια, μία αμινοάκυλο-trna συνθετάση μπορεί να αναγνωρίζει και να φορτίζει περισσότερα του ενός trna (γνωστά ως ισοδεκτικά [isoaccepting] trna). Ως εκ τούτου, οι περισσότεροι οργανισμοί έχουν 20 διαφορετικές trna συνθετάσες. Αυτό όμως δεν ισχύει πάντα, για παράδειγμα ορισμένα βακτήρια στερούνται της συνθετάσης φόρτισης του trna Gln με το σύστοιχο αμινοξύ. Έτσι, χρησιμοποιούν το ίδιο ένζυμο για τη φόρτιση τόσο του trna Gln όσο και του trna Glu με γλουταμινικό. Ένα δεύτερο ένζυμο στη συνέχεια μετατρέπει με αμίνωση την ομάδα του γλουταμινικού των φορτισμένων μορίων trna Gln σε γλουταμίνη.

26 2 η Διάλεξη

27 Πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή Η μηχανή που είναι υπεύθυνη για τη μετάφραση από τη γλώσσα των mrna στη γλώσσα των πρωτεϊνών αποτελείται από τέσσερα κύρια συστατικά: mrna trna Αμινοάκυλο-tRNA-συνθετάσες ριβόσωμα

28 Μονοκιστρονικά Πολυκιστρονικά mrna Ο αριθμός των ORFs ανά mrna είναι διαφορετικός μεταξύ ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών. Τα ευκαρυωτικά mrna σχεδόν πάντοτε περιέχουν ένα μονήρες ORF και είναι γνωστά ως μονοκιστρονικά mrna, ενώ Τα προκαρυωτικά mrna συχνά περιέχουν δύο ή περισσότερα ORFs και είναι γνωστά ως πολυκιστρονικά mrna.

29 Τριτοταγής δομή των trna Το γεγονός ότι οι θέσεις των βραχιόνων D και TψC βρίσκονται κοντά στην γωνία, υποχρεώνει τον βραχίονα δέκτη και την θηλιά του αντικωδικονίου στη μέγιστη δυνατή απομάκρυνση (~ 70Å). Η απομάκρυνση των δύο σημαντικών λειτουργικών περιοχών του trna, δεν είναι τυχαία, αφού το αντικωδικόνιο υποχρεώνεται να ζευγαρώσει με μια τριπλέτα του mrna που βρίσκεται προσδεδεμένη στην μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος, ενώ παράλληλα επιτρέπεται η γειτνίαση της αμινοακυλιωμένης ομάδας με την πεπτυδυλική τρανσφεράση (ενζυμική δράση της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος) που καταλύει τη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού.

30 Όλες οι αμινοάκυλο-trna συνθετάσες φορτίζουν τα trna με μια διαδικασία δύο βημάτων. To πρώτο βήμα είναι η αδενυλυλίωση (adenylylation). To δεύτερο βήμα είναι η μεταφορά του αδενυλυλιωμένου αμινοξέος στο trna.

31 Μία και μόνο μία αμινοάκυλο-trna συνθετάση προσδένει κάθε αμινοξύ σε όλα τα κατάλληλα trna. Επειδή τα περισσότερα αμινοξέα προσδιορίζονται από περισσότερα του ενός κωδικόνια, μία αμινοάκυλο-trna συνθετάση μπορεί να αναγνωρίζει και να φορτίζει περισσότερα του ενός trna (γνωστά ως ισοδεκτικά [isoaccepting] trna). Ως εκ τούτου, οι περισσότεροι οργανισμοί έχουν 20 διαφορετικές trna συνθετάσες. Αυτό όμως δεν ισχύει πάντα, για παράδειγμα ορισμένα βακτήρια στερούνται της συνθετάσης φόρτισης του trna Gln με το σύστοιχο αμινοξύ. Έτσι, χρησιμοποιούν το ίδιο ένζυμο για τη φόρτιση τόσο του trna Gln όσο και του trna Glu με γλουταμινικό. Ένα δεύτερο ένζυμο στη συνέχεια μετατρέπει με αμίνωση την ομάδα του γλουταμινικού των φορτισμένων μορίων trna Gln σε γλουταμίνη.

32 Εξειδίκευση της αναγνώρισης του trna. Ποια χαρακτηριστικά του μορίου του trna καθιστούν ικανή μια αμινοάκυλο-trna συνθετάση να διακρίνει και να φορτίζει το σωστό σύνολο των ισοδεκτικών trna ενός αμινοξέος από τα trna των άλλων 19 αμινοξέων; Γενετικές, βιοχημικές και κρυσταλλογραφικές μελέτες έδειξαν ότι οι προσδιοριστές της εξειδίκευσης συναθροίζονται σε δύο περιοχές του trna. Ι) τον βραχίονα δέκτη Σε ορισμένες περιπτώσεις αλλαγή μιας βάσης γνωστή ως βάση διαλογής- στο βραχίονα είναι αρκετή να μεταβάλλει την εξειδίκευση αναγνώρισης ενός trna από μια συνθετάση σε μια άλλη. ΙΙ) τον βρόχο του αντικωδικονίου Αν και θα περίμενε κανείς το αντικωδικόνιο το βασικό καθοριστικό χαρακτηριστικό της αναγνώρισης, οι προσδιοριστές της αναγνώρισης βρίσκονται και εκτός του αντικωδικονίου.

33 Ο σχηματισμός του αμινοάκυλο-trna είναι πολύ ακριβής. Παρά το σχετικά μικρό μέγεθος των αμινοξέων και την υψηλή δομική ομοιότητά τους σε κάποιες περιπτώσεις, η συχνότητα λανθασμένης φόρτισης είναι πολύ χαμηλή (<1:1000). Π.χ. Η τρυροσυλο-trna συνθετάση είναι σε θέση να διακρίνει αποτελεσματικά την τυροσίνη από την φαινυλαλανίνη, εξαιτίας του σχηματισμού ενός ισχυρού και ενεργειακά ευνοϊκού δεσμού υδρογόνου με την υδροξυλομάδα που υπάρχει στην τυροσίνη, αλλά όχι στην φαινυλαλανίνη.

34 Ορισμένες αμινοάκυλο-trna συνθετάσες χρησιμοποιούν ένα θύλακο επιμέλειας για να φορτίσουν τα μόρια trna με υψηλή ακρίβεια. Εκτός από τον καταλυτικό θύλακο για την αδενυλυλίωση, ορισμένες αμινοαάκυλο-trna συνθετάσες, φέρουν έναν κοντινό θύλακο επιμέλειας (μια βαθιά σχισμή στο ένζυμο), ο οποίος επιτρέπει τον έλεγχο της πιστότητας του προϊόντος της αντίδρασης αδενυλυλίωσης.

35 Σε περίπτωση αναγνώρισης και αδενυλυλίωσης από την συνθετάση ενός «λανθασμένου» αμινοξέος (συνήθως δομικά συγγενούς), το αδενυλυλιωμένο αυτό αμινοξύ δεν μπορεί να ταιριάξει στο θύλακο επιμέλειας, με αποτέλεσμα να υδρολύεται σε ελεύθερο αμινοξύ και ΑΜΡ.

36 H υψηλή πιστότητα των αμινοάκυλο-trna συνθετασών εξασφαλίζει την ακριβή αποκωδικοποίηση κάθε mrna. Γενετικά και βιοχημικά πειράματα υποστηρίζουν ότι το ριβόσωμα δεν είναι σε θέση να κάνει διάκριση μεταξύ των μορίων trna που είναι φορτισμένα με το σωστό αμινοξύ από εκείνα που είναι φορτισμένα με λανθασμένο αμινοξύ. Η κυστεΐνη που είναι προσδεδεμένη στο κυστεϋνυλο-trna Cys μπορεί να μετατραπεί σε αλανίνη μέσω χημικής αναγωγής και να δώσει αλανινο-trna Cys. Cys Όταν το προστίθεται σε ένα σύστημα ελεύθερο κυττάρων το αλανινο-trna Cys εισάγει αλανίνες στα κωδικόνια που προσδιορίζουν την ένθεση της κυστεΐνης. Cys

37 Ο ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Η αντιστοίχιση τριών διαδοχικών νουκλεοτιδίων (κωδικόνια) της γραμμικής άλληλουχίας του mrna με συγκεκριμένα αμινοξέα στη γλώσσα των 20 γραμμάτων των πρωτεϊνών. Αφού ένα κωδικόνιο μπορεί να σχηματιστεί με συνδυασμό των τεσσάρων νουκλεοτιδικών βάσεων, το αποτέλεσμα είναι να υπάρχουν 4 3 =64 διαφορετικοί συνδυασμοί, αριθμός κατά πολύ μεγαλύτερος του αριθμού των 20 αμινοξέων. Ποια από τα 64 κωδικόνια είναι υπεύθυνα για τον καθορισμό ενός αμινοξέος; Ποιοι είναι οι κανόνες που διέπουν τη χρήση τους; Πως αποκρυπτογραφήθηκε ο γενετικός κώδικας;

38 Ένα από τα ποιο εντυπωσιακά χαρακτηριστικά του κώδικα είναι ότι 61 από τις 64 δυνατές τριπλέτες ορίζουν ένα αμινοξύ, με τις εναπομένουσες τρεις να αποτελούν σήματα τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης.

39 Πως αποκρυπτογραφήθηκε ο κώδικας; Η συσχέτιση αμινοξέων με συγκεκριμένα κωδικόνια είναι ένα από τα μεγάλα επιτεύγματα στην ιστορία της μοριακής βιολογίας. Πραγματοποιήθηκε τη δεκαετία του 60 από τους Holley, Khorana και Nirenberg με την υιοθέτηση δύο μεθόδων in vitro μετάφρασης.

40 Μετάφραση συνθετικών πολυνουκλεοτιδίων H μέθοδος βασίζεται στην προσθήκη συνθετικών πολυνουκλεοτιδίων (αρχικά ομοπολυμερών) συγκεκριμένης αλληλουχίας σε κυτταρικό εκχύλισμα E. Coli το οποίο περιέχει όλα τα απαραίτητα και συνεπώς είναι σε θέση να ενσωματώνει ραδιενεργά αμινοξέα σε πρωτεΐνες.

41 Μετάφραση συνθετικών επαναλαμβανόμενων συμπολυμερών Μετά την πρώτη επιτυχή εφαρμογή της μεθόδου ακολούθησε η παρασκευή και η χρησιμοποίηση αρκετών άλλων συνθετικών συμπολυμερών από τον Khorana και έτσι ταυτοποιήθηκαν περίπου τα μισά από τα 64 κωδικόνια του γενετικού κώδικα.

42 Σύνδεση του trna σε καθορισμένα κωδικόνια τρινουκλεοτιδίων Η μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι η πρόσδεση ενός τρινουκλεοτιδίου σε ένα ριβόσωμα υποκινεί την πρόσδεση του αντίστοιχου αμινοάκυλο-trna. Έτσι, αν προστεθεί σε κατάλληλο κυτταρικό εκχύλισμα ένα συγκεκριμένο τρινουκλεοτίδιο και στη συνέχεια απομονωθεί το σύμπλοκο {τρινουκλεοτίδιοριβόσωμα-αμινοάκυλο trna} είναι δυνατή η ταυτοποίηση του αμινοξέος και κατ επέκταση, η ταυτοποίηση του κωδικονίου που αντιπροσωπεύει το τρινουκλεοτίδιο.

43 Προσδιορισμός κωδικονίων με δέσμευση των αμινοάκυλο-trna μορίων σε σύμπλοκα τρινουκλεοτιδίων-ριβοσώματος. Αν και τα 64 πιθανά τρινουκλεοτίδια συντέθηκαν στο σύνολό τους, δεν προσδιορίστηκαν όλα τα κωδικόνια με αυτόν τον τρόπο διότι ορισμένα τρινουκλεοτίδια δεσμεύονται λιγότερο αποτελεσματικά στο ριβόσωμα έναντι άλλων.

44 Ο γενετικός κώδικας υπόκειται σε τρεις κανόνες, οι οποίοι διέπουν τη διάταξη και χρήση των κωδικονίων στο mrna. 1. Τα κωδικόνια διαβάζονται με κατεύθυνση Τα κωδικόνια είναι μη επικαλυπτόμενα και το μήνυμα δεν περιέχει κενά. 3. Το μήνυμα μεταφράζεται σ ένα σταθερό πλαίσιο ανάγνωσης (reading frame), το οποίο ορίζεται από το κωδικόνιο έναρξης ως το κωδικόνιο λήξης.

45 Τρία κωδικόνια κατευθύνουν τον τερματισμό της αλυσίδας Τα κωδικόνια UAA, UAG και UGA δεν αντιστοιχούν σε κάποιο αμινοξύ και αντ αυτού δηλώνουν τον τερματισμό της αλυσίδας. Τα κωδικόνια λήξης δεν διαβάζονται από ειδικά trna, αλλά από συγκεκριμένες πρωτεΐνες, γνωστές ως παράγοντες απελευθέρωσης (release factors) δεδομένου ότι πυροδοτούν την απελευθέρωση της νέοσυντιθέμενης πρωτεΐνης.

46 Εκφυλισμός (degeneracy) Πολλά αμινοξέα ορίζονται από περισσότερα του ενός κωδικόνια, που ονομάζονται συνώνυμα (synonyms). Με εξαίρεση δύο αμινοξέα (Met και Trp), τα υπόλοιπα 18 έχουν από δύο έως έξι διαφορετικά κωδικόνια. Κύρια αιτία εμφάνισης συνώνυμων κωδικονίων είναι ο εκφυλισμός της τρίτης βάσης. Σε οκτώ οικογένειες συνώνυμων κωδικών το 3 ο νουκλεοτίδιο μπορεί να είναι οποιοδήποτε από τα τέσσερα. Εμφανίζονται 12 ζεύγη συνώνυμων κωδικονίων όπου το 3 ο νουκλεοτίδιο μπορεί να είναι οποιαδήποτε πουρίνη (A ή G) ή οποιαδήποτε πυριμιδίνη (U ή C). Γενικά, το 2 ο νουκλεοτίδιο των κωδικονίων είναι εξαιρετικά σημαντικό από άποψη καθορισμού αμινοξέος, αφού η αντικατάστασή του οδηγεί πάντοτε σε αμινοξική αλλαγή.

47 Σημασία του φαινομένου εκφυλισμού του κώδικα Η εμφάνιση συνώνυμων κωδικονίων στον γενετικό κώδικα, καθώς και η παρατηρούμενη ομοιότητα μεταξύ κωδικονίων που αντιστοιχούν σε αμινοξέα με παρόμοια φυσικοχημική συμπεριφορά (π.χ. Asp και Glu ή Leu και Ile) αυξάνουν τη σταθερότητα του γονιδιώματος περιορίζοντας τις πιθανές αρνητικές επιπτώσεις μιας σημειακής μεταλλαγής. Έτσι, I. Το 24,4% των απλών νουκλεοτιδικών αντικαταστάσεων ανά κωδικόνιο δεν οδηγεί σε αμινοξική αλλαγή (συνώνυμες ή σιωπηλές μεταλλαγές) II. Το υπόλοιπο 75,6% αφορά μη συνώνυμες μεταλλαγές από τις οποίες: το 71,4% ονομάζονται παρερμηνεύσιμες καθώς οδηγούν σε αντικατάσταση αμινοξέος, ενώ Το 4,2% ανερμηνεύσιμες γιατί δημιουργούν κωδικόνια λήξης. Ο εκφυλισμός του κώδικα εξηγεί επίσης πως μπορεί να υπάρξει μεγάλη ποικιλότητα στις αναλογίες ΑΤ/GC στο DNA διαφόρων οργανισμών χωρίς αντίστοιχα μεγάλες αλλαγές στην αναλογία των αμινοξέων στις πρωτεΐνες τους.

48 Ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν γενικευμένος Τα αποτελέσματα της ευρείας αλληλούχισης των γονιδιωμάτων έχουν επιβεβαιώσει σε σημαντικό βαθμό την αναμενόμενη γενικευμένη (universal) φύση του, ότι δηλαδή ο κώδικας είναι ίδιος σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και συνεπώς κάθε τριπλέτα βάσεων έχει την ίδια ερμηνεία. Η παγκοσμιότητα (ή καθολικότητα) του κώδικα βοήθησε σημαντικά: Στην κατανόησή μας αναφορικά με την εξέλιξη των ειδών καθιστώντας δυνατή την άμεση σύγκριση αλληλουχιών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μεταξύ όλων των οργανισμών για τους οποίους είναι διαθέσιμη η αλληλουχία του γονιδιώματος. Στην δημιουργία του πεδίου της γενετικής μηχανικής, επιτρέποντας την έκφραση κλωνοποιημένων αντιγράφων γονιδίων που κωδικοποιούν χρήσιμα πρωτεϊνικά προϊόντα σε διαφοερικούς οργανισμούς (π.χ. παραγωγή ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ινσουλίνης σε βακτήρια). Σύμφωνα όμως με τα σημερινά δεδομένα ένας ελαφρώς διαφορετικός από τον τυπικό (standard) γενετικό κώδικα χρησιμοποιείται στα μιτοχόνδρια καθώς και στα πυρηνικά γονιδιώματα ορισμένων προκαρυωτικών και πρωτοζώων.

49 Διαφορές μεταξύ του μιτοχονδριακού και του «τυπικού» γενετικού κώδικα. Η τριπλέτα UGA δεν είναι κωδικόνιο λήξης αλλά κωδικοποιεί την Trp. Η εσωτερική Met κωδικοποιείται όχι μόνο από το AUG αλλά και από το AUA (αντί Ile). Στα μιτοχόνδρια των θηλαστικών το AGA και AGG αντί της Arg ορίζουν λήξη, ενώ στα μιτοχόνδρια της μύγας των φρούτων ορίζουν την Ser.

50 3 η Διάλεξη

51 Ο ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Η αντιστοίχιση τριών διαδοχικών νουκλεοτιδίων (κωδικόνια) της γραμμικής άλληλουχίας του mrna με συγκεκριμένα αμινοξέα στη γλώσσα των 20 γραμμάτων των πρωτεϊνών.

52 Αποκρυπτογράφηση Τη δεκαετία το 60 με in vitro πειράματα: μετάφρασης συνθετικών πολυνουκλεοτιδίων συγκεκριμένης αλληλουχίας σε κυτταρικό εκχύλισμα E. Coli πρόσδεσης αμινοάκυλο-trnas σε τρινουκλεοτιδία παρουσία ριβοσωμάτων

53 Ιδιότητες του κώδικα Εκφυλισμός (degeneracy) Με εξαίρεση δύο αμινοξέα (Met και Trp), τα υπόλοιπα 18 έχουν από δύο έως έξι διαφορετικά κωδικόνια. Η παγκοσμιότητα ή (καθολικότητα) Σύμφωνα όμως με τα σημερινά δεδομένα ένας ελαφρώς διαφορετικός από τον τυπικό (standard) γενετικό κώδικα χρησιμοποιείται στα μιτοχόνδρια καθώς και στα πυρηνικά γονιδιώματα ορισμένων προκαρυωτικών και πρωτοζώων.

54 Φαινόμενο της αστάθειας Θεωρητικά θα περίμενε κανείς να υπάρχουν τόσα είδη διαφορετικών μορίων trna όσα και τα διαφορικά κωδικόνια. Έχει όμως αποδειχθεί ότι ο αριθμός των διαφορετικών trna μπορεί να είναι μικρότερος του 61. Συνεπώς δημιουργείται το ερώτημα πώς το αντικωδικόνιο ενός δεδομένου αμινοάκυλο-trna μπορεί να ζευγαρώσει με περισσότερα του ενός διαφορετικά κωδικόνια; Η απάντηση στο ερώτημα έρχεται από τη δυνατότητα της βάσης του πρώτου νουκλεοτιδίου του αντικωδικονίου να σχηματίζει κάτω από προϋποθέσεις δεσμούς υδρογόνου με τη βάση του τρίτου νουκλεοτιδίου του κωδικονίου, παρά το γεγονός ότι το ζευγάρωμα αυτό δεν υπακούει στον τυπικό κανόνα συμπληρωματικότητας. Το φαινόμενο της αναγνώρισης περισσοτέρων του ενός κωδικονίων από το ίδιο trna είναι γνωστό ως αστάθεια ή αρχή της ταλάντωσης (wobble concept).

55 Σε ορισμένα trna μία βάση του αντικωδικονίου δεν είναι μια από τις τέσσερες κανονικές, αλλά μια πέμπτη βάση η ινοσίνη (Ι), η οποία προκύπτει μέσω αντίδρασης απαμίνωσης της αδενίνης. Οι συζεύξεις που επιτρέπονται με βάση τους κανόνες της ταλάντωσης είναι εκείνες που δίνουν αποστάσεις ριβόζης-ριβόζης κοντά σε εκείνες των τυπικών ζευγών βάσεων A:U ή G:C. Συνδυασμοί ζεύξης με βάση την αρχή της ταλάντωσης.

56 Στην τρισδιάστατη δομή του trna, οι τρεις βάσεις του αντικωδικονίου καθώς και οι επόμενες δύο (3 ) βάσεις στο βρόχο, είναι όλες στραμμένες αδρά προς την ίδια κατεύθυνση με τις ακριβείς διαμορφώσεις τους να καθορίζονται σε μεγάλο βαθμό από τις αλληλεπιδράσεις επιστοίβασης (stacking interactions). Συνεπώς, η πρώτη βάση του ανικωδικονίου βρίσκεται στο τέλος των επιστοιβασμένων βάσεων και έτσι οι κινήσεις της έναντι των άλλων δύο βάσεων του αντικωδικονίου είναι λιγότερο περιορισμένες. Ως εκ τούτου της παρέχεται η δυνατότητα ταλάντωσης στην τρίτη θέση του κωδικονίου.

57 ΤΟ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Είναι η μακρομοριακή μηχανή που διευθύνει τον πολυμερισμό των αμινοξέων για τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Είναι μεγαλύτερο και πιο περίπλοκο από τη μινιμαλιστική μηχανή που απαιτείται για τη σύνθεση του DNA ή του RNA. Αποτελείται από τουλάχιστον τρία μόρια RNA και περισσότερες από 50 διαφορετικές πρωτεΐνες, με συνολική μοριακή μάζα των 2,5 megadaltons περίπου. Αποτελείται από μια μεγάλη και μια μικρή υπομονάδα. Η τυπική ταχύτητα πολυμερισμού κατά τη μετάφραση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς είναι της τάξης των 20 αμινοξέων/sec, ενώ αυτή των ευκαρυωτικών οργανισμών 2-4 αμινοξέα/sec.

58 Μέγεθος των ριβοσωμάτων Κατά σύμβαση, το μέγεθος των ριβοσωμάτων εκφράζεται σε μονάδες Svedberg (S) που αντιστοιχούν στην ταχύτητα καθίζησής τους όταν υποβληθούν σε υπερφυγοκέντριση. Προσέξτε ότι η τιμή 70S του άθικτου προκαρυωτικού ριβοσώματος είναι μικρότερη από το άθροισμα 30S και 50S των ριβοσωμικών υπομονάδων του. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η ταχύτητα καθίζησης καθορίζεται όχι μόνο από τη μάζα, αλλά και από το σχήμα ενός μορίου.

59 Σύνθεση του προκαρυωτικού ριβοσώματος

60 Σύνθεση του ευκαρυωτικού ριβοσώματος Σημείωση: Τα ριβοσώματα των οργανιδίων διαφέρουν από τα αντίστοιχα κυτταροπλασματικά, αλλά και από οργανισμό σε οργανισμό. Κατά κανόνα το μέγεθός τους κυμαίνεται μεταξύ του 60 και 70S.

61 Δομή του ευκαρυωτικού ριβοσώματος Το συστατικό RNA της 50S υπομονάδας (πάνω) παρουσιάζεται με γκρι χρώμα και οι πρωτεΐνες με μώβ. Στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα (κάτω) το RNA παρουσιάζεται με ανοιχτό μπλέ και το πρωτεϊνικό περιεχόμενο με σκούρο μπλε χρώμα. Παρατηρήστε ότι οι περισσότερες ριβοσωμικές πρωτεΐνες βρίσκονται στην περιφέρεια και όχι στο εσωτερικό του. Τα μόρια του RNA παίζουν και άλλους ρόλους πέραν εκείνου των δομικών συστατικών του ριβοσώματος. Οι βασικές λειτουργικές επικράτειες του ριβοσώματος (το ενεργό κέντρο της πεπτυδιλο-τρανφεράσης και το ενεργό κέντρο αποκωδικοποίησης) αποτελούνται είτε εξ ολοκλήρου είτε στο μεγαλύτερο ποσοστό από RNA.

62 Πολύσωμα Αν και ένα ριβόσωμα μπορεί να συνθέσει ένα μόνο πολυπεπτίδιο σε κάθε κύκλο μετάφρασης, κάθε mrna μπορεί να μεταφράζεται ταυτόχρονα από πολλά ριβοσώματα. Ένα mrna που φέρει πολλά ριβοσώματα ονομάζεται πολυριβόσωμα ή πολύσωμα. Ένα ριβόσωμα έρχεται σε επαφή με περίπου 30 νουκλεοτίδια του mrna, αλλά το μεγάλο μέγεθος του ριβοσώματος επιτρέπει μια πυκνότητα της τάξης 1 ριβόσωμα ανά 80 νουκλεοτίδια του mrna. Η δυνατότητα ενός mrna να μπορεί να δεσμεύσει πολλά ριβοσώματα και συνεπώς να διευθύνει την ταυτόχρονη σύνθεση πολλαπλών πολυπεπτιδίων, εξηγεί τη σχετικά περιορισμένη αφθονία των μορίων mrna στο κύτταρο (τυπικά αποτελούν το 1-5% του συνολικού RNA).

63 Η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα περιέχει το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης. Η αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού συμβαίνει μεταξύ του αμινοξικού καταλοίπου του καρβοξυτελικού άκρου του αυξανόμενου πολυπεπτιδίου και του εισερχόμενου αμινοξέος που πρόκειται να ενσωματωθεί. Για να σχηματιστεί ο πεπτιδικός δεσμός πρέπει τα 3 άκρα του πεπτιδυλο-trna και του αμινοάκυλο-trna να έρθουν πολύ κοντά πάνω στο ριβόσωμα. Αυτή η τοποθέτηση επιτρέπει στην αμινομάδα του αμινοάκυλο-trna να προσβάλλει την καρβοξυλομάδα του αμινοξέος που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο του πεπτιδίου που συνδέεται με το πεπτιδυλο-trna. Ο δεσμός μεταξύ του αμινοάκυλο-trna και του αμινοξέος δεν διασπάται, αλλά διασπάται αυτός μεταξύ του πεπτιδυλο-trna και της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, με αποτέλεσμα η αυξανόμενη αλυσίδα να μεταφέρεται από το πεπτιδυλο στο αμινοάκυλο-trna. Για το λόγο αυτό, η αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού καλείται αντίδραση της πεπτίδυλο-τρανσφεράσης.

64 Το ριβόσωμα έχει τρεις θέσεις δέσμευσης για το trna. Προκειμένου να πραγματοποιήσει την αντίδραση της πεπτίδυλο-τρανσφεράσης, το ριβόσωμα πρέπει να μπορεί να δεσμεύσει δύο τουλάχιστον trna ταυτόχρονα. Στην πραγματικότητα, το ριβόσωμα έχει τρεις θέσεις δέσμευσης trna, καλούμενες θέσεις Α, Ρ και Ε. Η θέση Α είναι η θέση δέσμευσης του αμινοάκυλοtrna. Η θέση Ρ είναι η θέση δέσμευσης του πεπτίδυλο-trna. Η θέση Ε είναι η θέση δέσμευσης του trna που απελευθερώνεται μετά τη μεταφορά της αυξανόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο αμινοάκυλο-trna. Οι θέσεις δέσμευσης trna σχηματίζονται στη διεπαφή μεταξύ της μεγάλης και της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος.

65 50S ριβοσωμική υπομονάδα. Τα trna των θέσεων Ε, Ρ και Α απεικονίζονται με κίτρινο, κόκκινο και πράσινο χρώμα αντίστοιχα, ενώ το κέντρο της πεπτίδυλο-τρανσφεράσης είναι κυκλωμένο. Παρατηρήστε τη στενή απόσταση μεταξύ των 3 άκρων των trna των θέσεων Α και Ρ. 70S ριβόσωμα. Τα trna των θέσεων Ε, Ρ και Α απεικονίζονται με κίτρινο, κόκκινο και πράσινο χρώμα αντίστοιχα.

66 To mrna εισέρχεται στο κέντρο αποκωδικοποίησης και εξέρχεται από αυτό μέσω δύο στενών διαύλων στην μικρή υπομονάδα. Ένας άλλος δίαυλος μέσω της μεγάλης υποομάδας παρέχει ένα μονοπάτι εξόδου για την νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Ο δίαυλος εισόδου είναι τόσο ευρύς όσο χρειάζεται προκειμένου να εισέλθει μέσω αυτού το mrna που βρίσκεται σε μονόκλωνη μορφή. Μεταξύ των διαύλων υπάρχει μια περιοχή που είναι προσβάσιμη για τα trna στις θέσεις Α και Ρ. Υπάρχει μια έντονη συστροφή στο mrna μεταξύ των δύο κωδικωνίων, η οποία διευκολύνει τη διατήρηση του σωστού πλαισίου ανάγνωσης, τοποθετώντας το διαθέσιμο κωδικόνιο της θέσης Α σε μια διακριτή θέση που εξασφαλίζει ότι το εισερχόμενο αμινοάκυλο trna δεν έχει πρόσβαση σε άλλες βάσεις παρακείμενες σ αυτό. Το μέγεθος του διαύλου εξόδου του πεπτιδίου περιορίζει τη χωροδιάταξη της αναπτυσσόμενης αλυσίδας, επιτρέποντας της μόνο δομές α-έλικας εντός του διαύλου. Άλλες δευτεροταγείς δομές (β-πτυχωτές επιφάνειες) αλλά και οι τριτοταγείς αλληλεπιδράσεις αναπτύσσονται μόνο μετά την έξοδο του πολυπεπτιδίου από την μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα.

67 Η αλληλεπίδραση μεταξύ των trna των θέσεων Α και Ρ και του mrna εντός του ριβοσώματος. Δύο όψεις της δομής του mrna και των trna όπως απαντώνται στο ριβόσωμα. Χάριν σαφήνειας δεν παρουσιάζεται το ριβόσωμα. Τα trna των θέσεων Ε-, Ρ- και Α- απεικονίζονται με κίτρινο, κόκκινο και πράσινο χρώμα, αντίστοιχα ενώ οι βάσεις του mrna που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση κωδικονίου αντικωδικονίου με μπλε χρώμα. Η έντονη συστροφή του mrna διακρίνει σαφώς το κωδικόνιο της θέσης Α από εκείνο της θέσης Ρ. Η στενή απόσταση μεταξύ των 3 άκρων των trna των θέσεων Α- και Ρ- (κάτω εικόνα) εξασφαλίζει την πραγματοποίηση της αντίδρασης της πεπτίδυλο-τρανσφεράσης.

68 ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ Για να ξεκινήσει επιτυχώς η μετάφραση πρέπει να λάβουν χώρα τρία γεγονότα: I. Το ριβόσωμα πρέπει να προσελκυθεί στο mrna II. Το ριβόσωμα πρέπει να τοποθετηθεί με ακρίβεια πάνω από το κωδικόνιο έναρξης. III. Ένα φορτισμένο trna πρέπει να τοποθετηθεί στη θέση Ρ του ριβοσώματος Η σωστή τοποθέτηση του ριβοσώματος πάνω από το κωδικόνιο έναρξης είναι κρίσιμη δεδομένου ότι το κωδικόνιο αυτό καθορίζει το πλαίσιο ανάγνωσης για τη μετάφραση του mrna.

69 Έναρξη της μετάφρασης στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Για να διευκολύνουν τη δέσμευση του ριβοσώματος, πολλά ORFs περιέχουν μια βραχεία αλληλουχία ανοδικά του κωδικονίου έναρξης που ονομάζεται θέση δέσμευσης ριβοσώματος (ribosome-binding site, RBS) ή αλληλουχία Shine-Dalgarno. Η RBS, τυπικά εδράζεται τρία έως εννέα ζεύγη βάσεων ανοδικά του κωδικονίου έναρξης και είναι συμπληρωματική σε μια αλληλουχία που βρίσκεται κοντά στο 3 άκρο του 16S rrna της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας. Ο πυρήνας αυτής της περιοχής του 16S rrna έχει την αλληλουχία 5 -CCUCC-3.

70 Η προκαρυωτική RBS πολύ συχνά είναι ένα υποσύνολο της αλληλουχίας 5 -AGGAGC- 3. Η έκταση της συμπληρωματικότητας, καθώς και το διάστημα RBS και του κωδικονίου έναρξης έχει ισχυρή επίδραση στο πόσο αποτελεσματικά μεταφράζεται ένα συγκεκριμένο ORF. Ο υψηλός βαθμός συμπληρωματικότητας και το κατάλληλο διάστημα επάγουν την ενεργό μετάφραση, ενώ Η περιορισμένη συμπληρωματικότητα και/ή η απόκλιση από το κατάλληλο διάστημα γενικά υποστηρίζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης.

71 Τo ειδικό trna για την έναρξη της μετάφρασης Στην τριπλέτα του κωδικονίου έναρξης (κατά κανόνα το AUG που αντιστοιχεί στη μεθειονίνη και σπανιότερα το GUG που αντιστοιχεί στην βαλίνη) ζευγαρώνει το αντικωδικόνιο ενός ειδικού trna (initiator trna), το οποίο μεταφέρει το πρώτο αμινοξύ της πεπτιδικής αλυσίδας που πρόκειται να συντεθεί. Το ειδικό trna της έναρξης δεν μπορεί να είναι το ίδιο με αυτό που χρησιμοποιείται στο στάδιο της επιμήκυνσης γιατί πρέπει να έχει δύο βασικές ιδιότητες: 1. Τη δυνατότητα αναγνώρισης του κωδικονίου έναρξης τη στιγμή κατά την οποία στο mrna είναι προσδεμένη μόνο η μικρή υπομονάδα, δηλαδή πριν σχηματιστεί το πλήρες 70S ριβόσωμα. 2. Να μπορεί να καταλάβει κατ ευθείαν τη θέση P του ριβοσώματος και όχι τη θέση Α την οποία καταλαμβάνουν τα φορτισμένα trna εισερχόμενα στο ριβόσωμα. Με άλλα λόγια το πρώτο trna πρέπει να μπορεί να παίξει το ρόλο του πεπτίδυλοtrna. To ειδικό trna της έναρξης είναι γνωστό ως trna της φορμυλιωμένης μεθειονίνης (trna f Met ) και χρησιμοποιείται μόνο στο στάδιο της έναρξης της μετάφρασης. Στο στάδιο της επιμήκυνσης η μεθειονίνη μεταφέρεται από το trna m Met.

72 Και οι δύο τύποι trna της μεθειονίνης αρχικά φορτίζονται με τη μεθειονίνη από την ίδια αμινοάκυλο-trna συνθετάση, αλλά μόνο στο trna f Met η μεθειονίνη τροποποιείται σε φορμυλομεθειονίνη. φ Το φορτισμένο με φορμυλο-μεθειονίνη trna f Met αναγνωρίζει το κωδικόνιο έναρξης AUG και λιγότερο αποτελεσματικά το κωδικόνιο GUG και συνεπώς σε όλες τις πρωτεΐνες η Ν-φορμυλομεθειονίνη είναι το πρώτο αμινοξύ που ενσωματώνεται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Ένα ένζυμο γνωστό ως αποφορμυλάση αφαιρεί την φορμυλομάδα από το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της σύνθεσής της ή και μετά από αυτή. Στην πραγματικότητα πολλές ώριμες προκαρυωτικές πρωτεΐνες δεν αρχίζουν ούτε με μεθειονίνη αφού ειδικές αμινοπεπτιδάσες αφαιρούν τη μεθειονίνη ή και ένα ή δύο επιπλέον αμινοξέα από το αμινοτελικό άκρο της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης.

73 Σύγκριση των δευτεροταγών δομών των trna f Met και trna m Met Η εξειδίκευση του fmet-trna f Met δεν οφείλεται στη φορμυλιωμένη μεθειονίνη, αλλά στα δομικά χαρακτηριστικά αυτού καθ αυτού του trna. Αυτά εμποδίζουν την πρόσδεσή του στη θέση Α του ριβοσώματος και του εξασφαλίζουν τις ειδικές ιδιότητες που αναφέραμε.

74 4 η Διάλεξη

75 Επισκόπηση των γεγονότων της μετάφρασης 1. ΕΝΑΡΞΗ: Η μετάφραση αρχίζει με τη σύνδεση του mrna και ενός εναρκτήριου trna με μια ελεύθερη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα.το σύμπλοκο αυτό στη συνέχεια προσελκύει μια μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα και η σύνθεση των πρωτεϊνών αρχίζει με αφετηρία το κωδικόνιο έναρξης στο 5 άκρο του mrna και κατεύθυνση προς το 3 άκρο του. 2. ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ: Καθώς το ριβόσωμα μετατίθεται από κωδικόνιο σε κωδικόνιο, τα φορτισμένα μόρια trna μεταφέρουν τα κατάλληλα αμινοξέα και σχηματίζεται ο πεπτιδικός δεσμός. 3. ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ: Όταν το ριβόσωμα συναντήσει ένα κωδικόνιο λήξης, η πεπτιδική αλυσίδα απελευθερώνεται και το ριβόσωμα διαχωρίζεται από το mrna στις υπομονάδες του.

76 Τα προκαρυωτικά mrna αρχικά προσελκύονται στη μικρή υπομονάδα. Το βακτηριακό mrna περιέχει δύο ειδικές περιοχές για την έναρξη της μετάφρασης: Η πρώτη είναι η αλληλουχία Shine- Dalgarno H δεύτερη είναι ο κωδικός έναρξης, που τοποθετείται σ εκείνο το σημείο της 30S υπομονάδας που αντιστοιχεί στη θέση Ρ του ριβοσώματος. Για την πρόσδεση της 30S υπομονάδας στο mrna απαιτούνται επιπλέον και πρωτεϊνικοί παράγοντες γνωστοί ως παράγοντες έναρξης (initiation factors, IF). Σ ένα mrna με το ιδανικό διάστημα μεταξύ της RBS και του εναρκτήριου κωδικονίου, η αλληλεπίδραση μεταξύ του 16S rrna και της RBS εξασφαλίζει την τοποθέτηση του AUG στη θέση Ρ. Η μεγάλη υπομονάδα συνδέεται με τη μικρή μόνο κατά την ολοκλήρωση του σταδίου της έναρξης της μετάφρασης, λίγο πριν το σχηματισμό του πρώτου πεπτιδικού δεσμού.

77 Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης στα προκαρυωτικά Η δέσμευση του fmet-trna f Met στην Ρ-θέση της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος απαιτεί τρεις πρωτεϊνικούς παράγοντες έναρξης (Initiator Factors, IF), οι οποίοι ονομάζονται IF1, IF2 και IF3, καθένας από τους οποίους εξυπηρετεί ένα κομβικό βήμα στη διαδικασία της έναρξης. Ο IF1 εμποδίζει το εναρκτήριο trna να δεσμευθεί με το τμήμα της 30S υπομονάδας που θα καταστεί μέρος της θέσης Α. Ο IF2 είναι μια GTPάση (πρωτεϊνη που δεσμεύει και υδρολύει GTP) που αλληλεπιδρά με τον IF1 υπερκαλύπτοντας τη θέση Α προς το μέρος Ρ προκειμένου να έρθει σε επαφή με το fmet-trna f Met. Τέλος, ο IF3 καταλαμβάνει το τμήμα της 30S υπομονάδας που θα γίνει η θέση Ε εμποδίζοντας την επανασύνδεσή της με την μεγάλη υπομονάδα μέχρι το σχηματισμό του 30S εναρκτήριου συμπλόκου. Έτσι, παρουσία των παραγόντων έναρξης, από τις τρεις πιθανές θέσεις δέσμευσης trna στη μικρή υπομονάδα, μόνο η θέση Ρ είναι σε θέσει να δεχθεί το fmet-trna f Met.

78 Σχηματισμός του 30S εναρκτήριου συμπλόκου. Ο IF3 συνδέεται με τη μικρή υπομονάδα στο τέλος ενός προηγούμενου κύκλου μετάφρασης, όταν το 70S ριβόσωμα διαχωρίζεται στις υπομονάδες του. Ακολουθεί η πρόσδεση των παραγόντων IF1 και IF2 που έχει προσδεδεμένο GTP. Με τους τρεις παράγοντες έναρξης δεσμευμένους στην μικρή υπομονάδα, ακολουθεί η δέσμευση του fmet-trna f Met με το mrna, οπότε και σχηματίζεται το εναρκτήριο σύμπλοκο της μετάφρασης 30S. Η δέσμευση του mrna στην 30S υπομονάδα διευκολύνεται από το ζευγάρωμα των βάσεων της RBS με το 16S rrna, ενώ η δέσμευση του fmet-trna f Met από την αλληλεπίδρασή του με τον IF2 καθώς και από το ζευγάρωμα των βάσεων μεταξύ του αντικωδικωνίου και του κωδικονίου έναρξης του mrna.

79 Σχηματισμός του εναρκτήριου συμπλόκου 70S. Αποτελεί το τελευταίο βήμα της έναρξης και περιλαμβάνει την ένωση της μεγάλης υπομονάδας. Όταν το κωδικόνιο έναρξης συνδεθεί με το fmet-trna f Met, η μικρή υπομονάδα υφίσταται μια αλλαγή διαμόρφωσης με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του IF3, χωρίς τον οποίο είναι δυνατή η σύνδεσή της με τη μεγάλη υπομονάδα. Η δέσμευση της 50S υπομονάδας διεγείρει την ενεργότητα GTΡάσης και το GTP υδρολύεται σε GDP, γεγονός που οδηγεί στην απελευθέρωση τόσο του IF2- GDP όσο και του IF1. Το καθαρό αποτέλεσμα της έναρξης είναι η τοποθέτηση ενός ακέραιου ριβοσώματος στην θέση έναρξης του mrna με το φορτισμένο εναρκτήριο trna στη θέση Ρ και μια κενή θέση Α που μπορεί να δεχθεί το φορτισμένο trna του επόμενου κωδικονίου.

80 Έναρξη της μετάφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Όπως στους προκαρυωτικούς και εδώ υπάρχει ένα κωδικόνιο έναρξης (AUG) και ένα ειδικό εναρκτήριο trna το trna i Met. Και στις δύο περιπτώσεις χρησιμοποιούνται παράγοντες έναρξης προκειμένου να σχηματιστεί το σύμπλοκο έναρξης του mrna με την μικρή ριβοσωμική υπομονάδα και το Met-tRNA i Met τοποθετημένα στη θέση Ρ. Ωστόσο η μέθοδος αναγνώρισης του mrna και του κωδικονίου έναρξης είναι διαφορετική, από αυτήν που περιγράψαμε στους προκαρυωτικούς οργανισμούς. Στα ευκαρυωτικά, η μικρή υπομονάδα πρώτα ενώνεται με το Met-tRNA i Met και στη συνέχεια προσελκύεται στη δομή του καπέλου που βρίσκεται στο 5 άκρο του mrna. Κατόπιν, «σαρώνει» το mrna κατά μήκος του με κατεύθυνση 5 3 έως ότου συναντήσει την πρώτη τριπλέτα AUG, την οποία αναγνωρίζει ως κωδικόνιο έναρξης, μια διαδικασία που ονομάζεται σάρωση (scanning). Το γεγονός ότι η 40S υπομονάδα πρέπει να ξεκινήσει από το 5 άκρο, συμφωνεί με την μονοσιστρονική φύση των ευκαρυωτικών mrna. Δηλαδή, αν τα ευκαρυωτικά mrna ήταν πολυσιστρονικά δεν θα μπορούσε να γίνει έναρξη της μετάφρασης στις εσωτερικές κωδικές περιοχές.

81 Αλληλουχία Kozak Η θέση έναρξης της μετάφρασης είναι μια αρκετά συντηρητική αλληλουχία (GCCRCCAUGG) που περιλαμβάνει τα τελευταία 6 νουκλεοτίδια της 5 μη μεταφραζόμενης περιοχής του mrna, το κωδικόνιο έναρξης καθώς και ένα ακόμα νουκλεοτίδιο). Η αλληλουχία αυτή αναφέρεται ως αλληλουχία Kozak. Πολλά ευκαρυωτικά mrna στερούνται αυτών των βάσεων, αλλά η παρουσία τους αυξάνει την αποδοτικότητα της μετάφρασης. Σημαντικότερες από τις βάσεις της αλληλουχίας Kozak θεωρούνται μια πουρίνη τρεις βάσεις ανοδικά του AUG και μια γουανίνη ευθέως καθοδικά. Αν μια από τις βάσεις αυτές αντικατασταθεί, η αποδοτικότητα της μετάφρασης ελαττώνεται περίπου 10 φορές.

82 Σχηματισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου 43S Καθώς το ευκαρυωτικό ριβόσωμα ολοκληρώνει έναν κύκλο μετάφρασης, διαχωρίζεται στις υπομονάδες του από τέσσερεις παράγοντες έναρξης (eif1, eif1a, eif3 και eif5 που προσδένονται στην 40S υπομονάδα. Παρατηρήστε ότι οι παράγοντες αυτοί δρουν κατ αναλογία με τους προκαρυωτικούς για να αποτρέψουν την πρόσδεση της 60S υπομονάδας, αλλά και του trnai στην θέση Α. Το Met-tRNA i Met συμπλοκοποιείται με τον eif2 που φέρει GTP σχηματίζοντας το ονομαζόμενο τριαδικό σύμπλοκο. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς το εναρκτήριο trna φορτίζεται με μεθειονίνη και όχι φορμυλομεθειονίνη. Ο eif2 τοποθετεί το Met-tRNA i Met στη θέση P της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας καταλήγοντας έτσι στο σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου 43S.

83 Σχηματισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου 48S Για τη σύνδεση του προεναρκτήριου συμπλόκου 43S στο mrna προς σχηματισμό του 48S συμπλόκου, εξελίσσεται μια παράλληλη αλληλουχία γεγονότων. Η διαδικασία αρχίζει με την πρόσδεση του παράγοντα eif4e στη δομή του καπέλου του mrna. Στη συνέχεια προσελκύονται οι παράγοντες eif4g και eif4a o οποίος έχει ενεργότητα ελικάσης. Η αλληλεπίδραση του eif4g με τον eif4ε έχει ιδιαίτερη σημασία και γι αυτό το συγκεκριμένο βήμα αποτελεί και σημείο ρύθμισης της μετάφρασης. Ακολουθεί η σύνδεση του παράγοντα eif4b, ο οποίος ενεργοποιεί την ελικάση του eif4a προκειμένου να αφαιρεθεί οποιαδήποτε δευτεροταγής δομή μπορεί να έχει σχηματιστεί στο άκρο του mrna. Τέλος, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραγόντων της ομάδας eif4 που είναι προσδεδεμένοι στο mrna και των παραγόντων έναρξης που είναι προσδεδεμένοι στη μικρή υπομονάδα έχουν ως αποτέλεσμα τη συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου 48S.

84 Σχηματισμός του συμπλόκου έναρξης 80S Η μικρή υπομονάδα που βρίσκεται συνδεδεμένη μαζί με τους παράγοντες έναρξης στο 5 άκρο του mrna, μετακινούνται με κατεύθυνση 5 3 σε μια διαδικασία εξαρτώμενη από υδρόλυση ΑΤΡ κάνοντας «σάρωση» μέχρι το κωδικόνιο έναρξης. Εκεί το σωστό ζευγάρωμα των βάσεων κωδικονίου με το αντικωδικόνιο του trnai οδηγεί σε αλλαγή της διαμόρφωσης του eif5, η οποία υποκινεί τον eif2 να υδρολύσει το GTP. Χωρίς GTP ο eif2 χάνει τη σύνδεσή του με το trnai και απομακρύνεται από τη μικρή υπομονάδα. Μαζί του απομακρύνονται και οι παράγοντες έναρξης eif1, eif3, eif5 και eif4b.

85 Η απομάκρυνση του eif2 και των άλλων παραγόντων έναρξης, επιτρέπει τώρα τη στρατολόγηση του παράγοντα eif5b, ο οποίος ρυθμίζεται από το GTP. Η αλληλεπίδραση του eif5b με το Met-tRNA i Met διεγείρει την σύνδεση της σωστά τοποθετημένης 40S υπομονάδας με την 60S υπομονάδα. Η δέσμευση της μεγάλης υπομονάδας, οδηγεί σε υδρόλυση του συνδεδεμένου στον eif5b GTP, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση τόσο του ίδιου, όσο και του τελευταίου εναπομείναντα παράγοντα έναρξης eif1a. Τελικό αποτέλεσμα ο σχηματισμός του συμπλόκου έναρξης 80S με το κωδικόνιο έναρξης και το Met-tRNA i Met τοποθετημένα στη θέση Ρ του ριβοσώματος και κενή τη θέση Α.

86 Οι παράγοντες έναρξης συγκρατούν τα ευκαρυωτικά mrna σε κύκλους Εκτός της πρόσδεσής του στο 5 άκρο των ευκαρυωτικών mrna, ο παράγοντας έναρξης eif4g αλληλεπιδρά και με την πρωτεΐνη που συνδέεται στην πολύ-α ουρά (poly A binding protein, PBP) του mrna. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την «κυκλοποίηση» του ευκαρυωτικού mrna και εξηγεί την συμβολή της πολύ(α) ουράς στην αποτελεσματική μετάφρασή του.

87 ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ Αμέσως μετά τον επιτυχή σχηματισμό του εναρκτήριου συμπλόκου ξεκινά η σύνθεση του πολυπεπτιδίου. Για τη σωστή προσθήκη του κάθε αμινοξέος πρέπει να λάβουν χώρα τρία γεγονότα: I. Το σωστό αμινοάκυλο-trna να φορτωθεί στη θέση Α του ριβοσώματος, όπως υπαγορεύεται από το κωδικόνιο της θέσης αυτής. II. Να σχηματιστεί ένας πεπτιδικός δεσμός μεταξύ του αμινοάκυλο-trna της θέσης Α και του πεπτίδυλο-trna που βρίσκεται στη θέση Ρ. III. Το προκύπτον πεπτίδυλο-trna στη θέση Α καθώς και το συνδεδεμένο μ αυτό κωδικόνιο πρέπει να μετατοπιστούν στη θέση Ρ. Για την επίτευξη και τον έλεγχο των γεγονότων αυτών απαιτούνται δύο βοηθητικές πρωτεΐνες γνωστοί ως παράγοντες επιμήκυνσης (elongation factors), o EF- Tu και ο EF-G. Και οι δύο παράγοντες χρησιμοποιούν την ενέργεια δέσμευσης και υδρόλυσης του GTP για την ενίσχυση της ταχύτητας και την ακρίβεια της λειτουργίας του ριβοσώματος.

88 Ο παράγοντας επιμήκυνσης EF-Tu απαιτείται για τη δέσμευση του αμινοάκυλο-trna στη θέση Α του ριβοσώματος. Τα αμινοάκυλο-rna δεν δεσμεύονται στο ριβόσωμα μόνα τους. Αμέσως μετά τη φόρτισή τους τα trna συνδέονται με τον παράγοντα EF-Tu και έτσι μεταφέρονται στη θέση Α του ριβοσώματος. Η δέσμευση του EF-Tu στο αμινοάκυλο-trna δεν του επιτρέπει να συμμετέχει στο σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Για το λόγο αυτό ο παράγοντας επιμήκυνσης πρέπει να απομακρυνθεί. Όταν λάβει χώρα η αλληλεπίδραση του σωστού συνδυασμού κωδικονίου αντικωδικονίου, η GTPάση του EF-Tu ενεργοποιείται χάρη στην αλληλεπίδραση του παράγοντα επιμήκυνσης με το κέντρο δέσμευσης παραγόντων που βρίσκεται στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Έτσι, το GTP υδρολύεται και ο EF-Tu απομακρύνεται. Τώρα το αμινοξύ του αμινοάκυλο-trna είναι σε θέση να συμμετάσχει στο σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού.

89 Μηχανισμοί ελέγχου της επιλογής του σωστού αμινοάκυλοtrna στη θέση Α του ριβοσώματος. To ποσοστό λαθών της μετάφρασης κυμαίνεται μεταξύ 10-3 και Η διαφορά ενέργειας μεταξύ ενός σωστά σχηματισμένου ζεύγους κωδικονίου αντικωδικονίου και εκείνης μεταξύ ενός σχεδόν ταιριαστού ζεύγους δεν αρκεί για να αιτιολογήσει αυτό το επίπεδο ακρίβειας. Τρεις τουλάχιστον διαφορετικοί μηχανισμοί συμβάλλουν σ αυτή την εξειδίκευση αποτρέποντας την επιλογή ενός σχεδόν ταιριαστού ζεύγους κωδικονίου αντικωδικονίου.

90 1 ος Μηχανισμός Δύο κατάλοιπα αδενίνης του 16S rrna που βρίσκεται εντός της θέσης Α της μικρής υπομονάδας, σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τη μικρή αύλακα κάθε σωστού ζεύγους βάσεων που αναπτύσσονται μεταξύ του αντικωδικονίου και των δύο πρώτων βάσεων του κωδικονίου στη θέση Α. Τα ζεύγη βάσεων που δεν ακολουθούν τον κανόνα κατά Watson-Crick, σχηματίζουν μια μικρή αύλακα που δεν μπορεί να αναγνωριστεί από αυτές τις βάσεις, με συνέπεια τη σημαντικά μειωμένη συγγένεια για τα λανθασμένα trna.

91 2 ος Μηχανισμός Η σωστή σωστή ζεύξη των βάσεων επιτρέπει στον EF-Tu που είναι δεσμευμένος στο αμινοάκυλο-trna, να αλληλεπιδράση με το κέντρο δέσμευσης του παράγοντα, επάγοντας τηνυδρόλυση του GTP και την απελευθέρωση του EF-Tu. Ακόμα και μια μόνο παραφωνία στη ζεύξη βάσεων κωδικονίου - αντικωδικονίου, αλλάζει τη θέση του EF-Tu, μειώνοντας την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με το κέντρο δέσμευσης του παράγοντα. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε αδυναμία υδρόλυσης του GTP και απελευθέρωση του συμπλόκου EF-Tu/tRNA.

92 3 ος Μηχανισμός Όταν το αμινοάκυλο-trna εισάγεται στη θέση Α σε σύμπλοκο με τον EF- Tu-GTP, το 3 άκρο του βρίσκεται μακριά από τη θέση του ενεργού κέντρου της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης. Για να συμμετέχει επιτυχώς στην αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, πρέπει να περιστραφεί στο ενεργό του ενζύμου που βρίσκεται στην μεγάλη υπομονάδα. Η διαδιακασία αυτή ονομάζεται προσαρμογή του trna. Η προσαρμογή του trna ασκεί μια πίεση στην αλληλεπίδραση κωδικονίου αντικωδικονίου και συνεπώς μόνο τα σωστά ζευγαρωμένα αμινοάκυλο-trna παραμένουν συνδεδεμένα με το ριβόσωμα, ενώ τα λανθασμένα ζευγαρωμένα trna διαχωρίζονται.

93 Δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού Αμέσως μετά την τοποθέτηση του σωστά φορτισμένου trna στη θέση Α ακολουθεί η περιστροφή του στο κέντρο της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης και η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. Ο πεπτιδικός δεσμός σχηματίζεται μέσω της νουκλεόφιλης προσβολής από την α- αμινομάδα του αμινοάκυλο-trna πάνω στον άνθρακα της καρβονυλομάδας του πεπτιδυλο- trna.

94 Το ριβόσωμα είναι ένα ριβοένζυμο Η αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού καταλύεται από το RNA και ειδικά το 23S rrna. Την άποψη αυτή υποστηρίζουν διάφορα πειραματικά δεδομένα, όπως: Όταν από τη μεγάλη υπομονάδα απομακρυνθούν οι πρωτεΐνες, αυτή εξακολουθεί σε μεγάλο βαθμό να εμφανίζει ικανότητα σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού. Δομικές μελέτες της μεγάλης υπομονάδας δείχνουν την απουσία αμινοξικών καταλοίπων στην περιοχή του ενεργού κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Αλλαγές του συντηρημένου καταλοίπου της Α2451 του 23S rrna του E. coli, μειώνουν σημαντικά το ρυθμό κατάλυσης του πεπτιδικού δεσμού.

95 Ρόλος της L27 ριβοσωμικής πρωτεΐνης Ο πρόσφατος προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής ολόκληρου του ριβοσώματος με προσδεδεμένα τα trna και το mrna, αποκάλυψε ότι το απώτατο αμινοτελικό άκρο (9 αμινοξέα) της ριβοσωμικής πρωτεΐνης L27 της μεγάλης υπομονάδας προεξέχει προς το κέντρο πεπτιδυλο-τρανσφεράσης και έρχεται σε απευθείας επαφή με το τέλος CCA του 3 άκρου του trna της P θέσης. Η παρατήρηση αυτή έθεσε το ερώτημα ενός πιθανού ρόλου της πρωτεΐνης L27 στην κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού. Πειραματικά δεδομένα από την εξάλειψη των 9 αμινοξέων του αμινοτελικού άκρου της L27 έδειξαν ότι τα προκύπτοντα ριβοσώματα είναι ενεργά σε πρωτεϊνοσύνθεση με μειωμένη όμως ενεργότητα πεπτιδυλο-τρανσφεράσης. Επιπλέον, σε πειράματα όπου σιωπήθηκε η έκφραση του γονιδίου της L27 ριβοσωμικής πρωτεΐνης αποδείχθηκε ότι τα κύτταρα E. coli ήταν σε θέση να αναπτύσσονται κανονικά. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις φαίνεται ότι αν και η L27 διευκολύνει, δεν είναι θεμελιώδης για το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Όπως και άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ο πιθανότερος ρόλος της είναι να συμμετέχει στη σωστή τοποθέτηση ενός ή περισσοτέρων από τα συστατικά μόρια RNA στο ενεργό κέντρο.