9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ

Transcript

1 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΙΚΡΟΔΟΡΥΦΟΡΙΚΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΤΟΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΓΑΥΡΟ (Engraulis encrasicolus) ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΟΜΗΣ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΤΟΥ Πακάκη Β., Μαγουλάς Α., Κασαπίδης Π. Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών, vpakakis@edu.biology.uoc.gr, magoulas@her.hcmr.gr, kasapidi@her.hcmr.gr Περίληψη Ο ευρωπαϊκός γαύρος (Engraulis encrasicolus) αποτελεί σημαντική πλουτοπαραγωγική πηγή για την αλιεία της Μεσογείου και του ΒΑ Ατλαντικού. Η μελέτη της γενετικής δομής των πληθυσμών του μπορεί να συμβάλει καθοριστικά στη διάκριση και ορθή διαχείριση των ιχθυοαποθεμάτων του. Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν 12 μικροδορυφορικοί γενετικοί δείκτες, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της γενετικής δομής 11 πληθυσμιακών δειγμάτων γαύρου που καλύπτουν το μεγαλύτερο μέρος της γεωγραφική του εξάπλωσης. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι όλα σχεδόν τα πληθυσμιακά δείγματα του γαύρου, που προέρχονται από διαφορετικές θαλάσσιες λεκάνες, διαφέρουν μεταξύ τους. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν την έντονη γενετική διαφοροποίηση του γαύρου που είχε αποκαλυφθεί κυρίως με βάση το μιτοχονδριακό DNA και προσφέρουν νέα στοιχεία για τη διαλεύκανση της πολύπλοκης εξελικτικής του ιστορίας. Λέξεις κλειδιά: μικροδορυφορικό DNA, ιχθυοαπόθεμα, εμπλουτισμένη γενωμική βιβλιοθήκη. Characterization of microsatellite dna markers in the european anchovy (Engraulis encrasicolus) and study of the its genetic population structure Pakaki V., Magoulas A., Kasapidis P. Institute of Marine Biology and Genetics, Hellenic Centre for Marine Research, vpakakis@edu.biology.uoc.gr, magoulas@her.hcmr.gr, kasapidi@her.hcmr.gr Abstract European anchovy (Engraulis encrasicolus) is an important fishery in the Mediterranean and NE Atlantic. The elucidation of its genetic population structure can greatly assist the delineation and management of its stocks. In the current study 12 microsatellite DNA markers were developed and used to study the genetic structure of 11 samples that cover the larger part of the species distribution. Statistical analyses showed that almost all samples, which represent different oceanic basins, differ from each other. These results confirm the strong genetic structure of anchovy revealed by other genetic markers (mainly by mitochondrial DNA) and offer new clues for the elucidation of the complex evolutionary history of the species. Keywords: microsatellite DNA, fish stock, enriched genomic library. 1. Εισαγωγή Ο ευρωπαϊκός γαύρος (E. encrasicolus) εξαπλώνεται στη Μεσόγειο, τη Μαύρη Θάλασσα και τον Ανατολικό Ατλαντικό από τις ακτές της Σκανδιναβίας μέχρι τις ακτές της Δυτικής Αφρικής και αποτελεί σημαντική πλουτοπαραγωγική πηγή για την ελληνική και την παγκόσμια αλιεία. Είναι μικρό πελαγικό ψάρι, σχηματίζει κοπάδια, είναι μεταναστευτικό και πολλαπλώς ωοτόκο είδος με πελαγικά αυγά και λάρβες (Whitehead, 1984). Οι γενετικές μέθοδοι μπορεί να είναι εξαιρετικά χρήσιμα εργαλεία στην αλιευτική διαχείριση, επιτρέποντας την αναγνώριση γενετικά διαφοροποιημένων πληθυσμών, που αναφέρονται και ως γενετικά αποθέματα (genetic stocks) (Ovenden, 1990), δηλαδή μονάδες που είναι λίγο πολύ αναπαραγωγικά απομονωμένες η μία από την άλλη και θα αντιδράσουν ανεξάρτητα σε περίπτωση -800-

2 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ υπερεκμετάλλευσης. Η πρώτη κατηγορία γενετικών δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν εκτεταμένα σε τέτοιου είδους μελέτες ήταν τα αλλοένζυμα, που όμως παρουσιάζουν μια σειρά από μειονεκτήματα όπως ο χαμηλός πολυμορφισμός, η αδυναμία διάκρισης διαφορετικών αλληλομόρφων με παρόμοια ηλεκτροφορητική κινητικότητα, καθώς και το ότι απαιτούνται σχετικά μεγάλες ποσότητες φρέσκου ιστού (Ashburner, 1991). Η επινόηση τεχνικών ανάλυσης του DNA όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) επέτρεψε τη ανάπτυξη γενετικών δεικτών που αποκαλύπτουν τον πολυμορφισμό στο επίπεδο του γενετικού υλικού. Το ζωικό μιτοχονδριακό DNA είναι ένας δείκτης που χρησιμοποιείται ευρέως σε πληθυσμιακές μελέτες, όμως λόγω της μητρικής του κληρονομικότητας, ουσιαστικά δείχνει την εξελικτική ιστορία των μητρικών γενεαλογικών γραμμών. Ο πλέον χρησιμοποιούμενος γενετικός δείκτης, σήμερα, σε τέτοιου είδους μελέτες, είναι το μικροδορυφορικό DNA, που είναι μικρές, επαναλαμβανόμενες, απλές αλληλουχίες μήκους 2-6 βάσεων, όπως για παράδειγμα (CA/GT) n. Oι μικροδορυφορικοί τόποι αποτελούν πολύ χρήσιμους γενετικούς δείκτες επειδή είναι άφθονοι, ιδιαίτερα πολυμορφικοί, η ανάλυσή τους γίνεται με τη χρήση της τεχνικής PCR και μέσω αυτόματων γενετικών αναλυτών, δεν υπόκεινται συνήθως στη δράση της φυσικής επιλογής (εξελικτικά ουδέτεροι) και μπορούν να ανιχνεύσουν γενετικές διαφορές που έχουν συσσωρευθεί σε μικρή χρονική κλίμακα. Αρκετές γενετικές μελέτες έχουν διεξαχθεί στον ευρωπαϊκό γαύρο έως σήμερα, κυρίως με τη χρήση αλλοενζύμων και μιτοχονδριακού DNA. Με τη χρήση των αλλοένζυμων οι Spanakis et al. (1989) διαπίστωσαν σημαντική γενετική διαφοροποίηση του γαύρου μεταξύ πληθυσμών του Αιγαίου και του Ιονίου ενώ οι Bembo et al. (1996a; b) βρήκαν μεγάλη διαφοροποίηση μεταξύ δειγμάτων του Βισκαϊκού και της Μεσογείου. Οι Magoulas et al. (1996), μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA (RFLPs) του γαύρου, διαπίστωσαν την ύπαρξη δύο φυλογενετικών κλάδων, A και Β, που βρίσκονται σε διαφορετικές συχνότητες στους πληθυσμούς διαφορετικών θαλάσσιων λεκανών. Ο κλάδος A είναι ο μόνος που εμφανίζεται στη Μαύρη Θάλασσα, ενώ η συχνότητά του μειώνεται στο 85% στο Β. Αιγαίο και κάτω από 44% στην υπόλοιπη Μεσόγειο και στο Βισκαϊκό Κόλπο. Σε μια επόμενη μελέτη τους, οι Magoulas et al. (2006), βρήκαν ότι στον Ατλαντικό, από τις Αφρικανικές ακτές μέχρι την Πορτογαλία καθώς και στη θάλασσα του Αλποράν, επικρατεί ο κλάδος Α σε ποσοστό >80%. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα διέκριναν τέσσερις γενετικά διαφοροποιημένες πληθυσμιακές ομάδες: Μαύρη Θάλασσα, Αιγαίο, Κεντρική Μεσόγειο και Ατλαντικό και υποστήριξαν ότι ο Ατλαντικός και η Μεσόγειος ήταν οι περιοχές προέλευσης των κλάδων Α και Β, αντίστοιχα. Αντιθέτως, ο Grant (2005) υποστηρίζει ότι οι προγονικοί πληθυσμοί και των δύο κλάδων απομονώθηκαν στον Ατλαντικό απ όπου και εποίκησαν τη Μεσόγειο σε διαφορετικές χρονικές περιόδους. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μικροδορυφορικών δεικτών στο γαύρο και η χρήση τους για τη μελέτη της γενετικής δομής του είδους στη Μεσόγειο και τον Ατλαντικό. 2. Υλικά και Μέθοδοι Η ανάπτυξη των μικροδορυφορικών δεικτών έγινε με τη χρήση ενός τροποποιημένου πρωτόκολλου κατασκευής εμπλουτισμένης για μικροδορυφορικό DNA, γενωμικής βιβλιοθήκης (Tsigenopoulos et al., 2003). Από αυτή τη γενωμική βιβλιοθήκη έγινε επιλογή των κλώνων που περιείχαν μικροδορυφορική αλληλουχία, εξαγωγή του πλασμιδιακού DNA και αλληλούχησή του. Από τις αλληλουχίες που προέκυψαν επιλέχθηκαν βάσει κριτηρίων οι καλύτερες και ακολούθησε σχεδιασμός εκκινητών, βελτιστοποίησή των συνθηκών της PCR αρχικά σε πήκτωμα αγαρόζης, κατόπιν παραγγελία σημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές εκκινητών και τελική βελτιστοποίηση και έλεγχος των μικροδορυφορικών δεικτών για πολυμορφισμό με ηλεκτροφόρηση σε αυτόματο γενετικό αναλυτή ΑΒΙ3700. Οι γενετικοί δείκτες που επιλέχθηκαν τελικά, χρησιμοποιήθηκαν για τη γονοτύπηση 891 ενή

3 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ λικων άτομων γαύρου (E. encrasicolus) από 11 διαφορετικές περιοχές (Εικ.1). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων περιελάμβανε: τον έλεγχο για μηδενικά αλληλόμορφα (null alleles) (πρόγραμμα MicroChecker), τον έλεγχο για ισορροπία κατά Hardy-Weinberg, για ανισορροπία σύνδεσης των γενετικών τόπων και για γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμιακών δειγμάτων (πρόγραμμα Genepop), την εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων με βάση τις τιμές F ST μεταξύ ζευγών δειγμάτων (πρόγραμμα ARLEQUIN), την κατασκευή δενδρογράμματος με βάση τις τιμές F ST (πρόγραμμα MEGA), την ανάλυση της ιεραρχικής δομής των πληθυσμών - AMOVA (πρόγραμμα SAMOVA) και τον έλεγχο γενετικής απομόνωσης λόγω απόστασης (πρόγραμμα IBDWS). Εικ. 1: Γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων γαύρου: BAL: Βαλτική, GBIS: Βισκαϊκός, SPORT: Ν. Πορτογαλία, CA: Κανάρια Νησιά, MAL: Μάλαγα, ALG: Αλγερία, LION: Κόλπος των Λεόντων, ADR: Αδριατική, PAT: Πάτρα, KAV: Καβάλα, BS: Μαύρη Θάλασσα. 3. Αποτελέσματα Από τη γενωμική βιβλιοθήκη αναπτύχθηκαν τελικά 12 πολυμορφικοί μικροδορυφορικοί τόποι που χρησιμοποιήθηκαν σε τέσσερις multiplex αντιδράσεις PCR για τη γενετική ανάλυση των 11 πληθυσμιακών δειγμάτων γαύρου. Η ανάλυση των δειγμάτων έδειξε ότι οι περισσότεροι μικροδορυφορικοί τόποι βρίσκονται σε ισορροπία Hardy-Weinberg στους περισσότερους πληθυσμούς, εκτός από δύο τόπους (Ee5_245 και Ee5_376), που εμφανίζουν μεγάλο έλλειμμα ετεροζυγωτίας σε όλους τους υπό μελέτη πληθυσμούς, πιθανώς λόγω ύπαρξης μηδενικών αλληλομόρφων (Πίν. 1). Ο τόπος Ee2_407 εμφανίζει το μεγαλύτερο αριθμό αλληλομόρφων (Ν Α =60) ενώ ο τόπος Ee2_165b το μικρότερο (Ν Α =12). Ο συντελεστής πληθυσμιακής υποδιαίρεσης F SΤ κυμαίνεται από για τον τόπο Ee2_165b έως για τον τόπο Ee5_376, με μέση τιμή για όλους τους τόπους ίση με Ο έλεγχος για γενετική διαφοροποίηση (Fisher s exact tests) έδειξε ότι όλα σχεδόν τα ζεύγη των πληθυσμών εμφανίζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην κατανομή των αλληλικών τους συχνοτήτων, εκτός του Κόλπου των Λεόντων με την Πάτρα και το Βισκαϊκό, καθώς και της Μάλαγας με τη Ν. Πορτογαλία. Παρόμοια εικόνα εμφανίζουν και οι τιμές F ST μεταξύ των ζευγών δειγμάτων, όπου επιπλέον εμφανίζονται γενετικά μη διαφοροποιημένοι οι πληθυσμοί Βισκαϊκού Πάτρας, Αδριατικής - Κόλπου των Λεόντων, Αλγερίας Μάλαγας, Αλγερίας - Ν. Πορτογαλίας και Αδριατικής - Μαύρης Θάλασσας. Η μέγιστη τιμή F ST (0.051) εμφανίζεται μεταξύ των πληθυσμών της Βαλτικής και των Κανάριων Νήσων

4 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Πίνακας 1: Χαρακτηρισμός των 12 πολυμορφικών μικροδορυφορικών τόπων του ευρωπαϊκού γαύρου E. encrasicolus. Συντελεστές εγκαθίδρυσης (F IS ), (F ST ) και (F IT ) ανά γενετικό τόπο, N a : αριθμός αλληλομόρφων και (Hobs) μέση παρατηρούμενη και (Hexp) μέση αναμενόμενη ετεροζυγωτία. Μικροδ. Τόπος F IS F ST F IT N Α Hobs Hexp Ee2_ Ee2_091b Ee2_ Ee2_165b Ee2_ Ee2_ Ee2_ Ee2_483b Ee2_ Ee2_ Ee5_ Ee5_ Στο άρριζο ακτινωτό δενδρόγραμμα που κατασκευάστηκε με βάση τις γενετικές αποστάσεις F ST (Εικ. 2), η Βαλτική εμφανίζεται ως ο πιο απομακρυσμένος γενετικά πληθυσμός. Ο πληθυσμός των Κανάριων Νήσων διαχωρίζεται εμφανώς από τους υπόλοιπους πληθυσμούς αλλά συνδέεται σε σειρά με τους γεωγραφικά κοντινούς του. Οι πληθυσμοί του γαύρου της Μεσογείου (εκτός αυτών της Μάλαγας και της Αλγερίας) και της Μαύρης Θάλασσας ομαδοποιούνται, χωρίς όμως η διάταξή τους στο δένδρο να ανταποκρίνεται στη γεωγραφική τους εγγύτητα. Ο Βισκαϊκός ομαδοποιείται και αυτός μαζί με την προηγούμενη ομάδα και εμφανίζεται δίπλα στην Πάτρα και τον Κόλπο των Λεόντων. Εικ. 2: Άρριζο ακτινωτό δενδρόγραμμα µε τη μέθοδο Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbour Joining) χρησιμοποιώντας ως γενετικές αποστάσεις τις τιμές F ST. Τα κυκλικά διαγράμματα δείχνουν τη συχνότητα των δύο κλάδων του μιτοχονδριακού DNA (λευκό: κλάδος Α, μαύρο: κλάδος Β) σε κάθε πληθυσμό (δεδομένα από Magoulas et al., 2006 και αδημοσίευτα). Η συσχέτιση μεταξύ γεωγραφικών και γενετικών αποστάσεων ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.001, R 2 =0.405) γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη απομόνωσης λόγω απόστασης στους πληθυσμούς που εξετάστηκαν

5 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ 4. Συμπεράσματα - Συζήτηση Η γενετική ανάλυση δειγμάτων γαύρου με τη χρήση μικροδορυφορικών δεικτών επιβεβαίωσε την έντονη γεωγραφική δομή των πληθυσμών του, καθώς τα περισσότερα ζεύγη πληθυσμών που εξετάστηκαν εμφανίζονται γενετικώς διαφοροποιημένα. Πιο διαφοροποιημένοι εμφανίζονται οι πληθυσμοί από τα άκρα της κατανομής του γαύρου, ο πληθυσμός στην είσοδο της Βαλτικής που βρίσκεται στο βόρειο άκρο και ο πληθυσμός των Κανάριων Νήσων που βρίσκεται προς το νότιο δυτικό άκρο. Ο πληθυσμός της Βαλτικής είναι σχετικά πρόσφατος και διαφέρει σημαντικά από τον πλησιέστερό του στο Βισκαϊκό Κόλπο, από τον οποίο θεωρητικά θα μπορούσε να είχε προέλθει μέσω επέκτασης της κατανομής προς τα Βόρεια. Αντιθέτως, ο πληθυσμός των Κανάριων Νήσων εμφανίζει τη μικρότερη διαφοροποίηση με τους γεωγραφικά πλησιέστερους πληθυσμούς της Ν. Πορτογαλίας, Μάλαγας και Αλγερίας, οι οποίοι με τη σειρά τους δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση γεγονός που σημαίνει ότι υπάρχει αυξημένη γονιδιακή ροή μεταξύ τους. Μέσα στη Μεσόγειο, οι πληθυσμοί εμφανίζουν μικρή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ τους, που όμως σε αρκετές περιπτώσεις είναι στατιστικά σημαντική. Η έλλειψη γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ Πάτρας και Κόλπου των Λεόντων δείχνει ότι υπάρχει αυξημένη γενετική ροή μεταξύ Ιονίου και βορειοδυτικής Μεσογείου. Η γενετική ομοιότητα μεταξύ Μαύρης Θάλασσας και Αδριατικής μάλλον είναι τυχαία, αφού οι πληθυσμοί αυτοί είναι γεωγραφικά απομακρυσμένοι και σε επίπεδο μιτοχονδριακού DNA εμφανίζουν έντονη διαφοροποίηση. Επιπλέον, επιβεβαιώνεται ότι ο διαχωρισμός μεταξύ πληθυσμών Ατλαντικού και Μεσογείου βρίσκεται ανατολικά των στενών του Γιβραλτάρ, με τη θάλασσα του Αλμποράν να εντάσσεται γενετικά (και βιογεωγραφικά) στον Ατλαντικό. Τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται γενικά να συμφωνούν με αποτελέσματα προηγούμενων μελετών στο γαύρο βασισμένων στο μιτοχονδριακό DNA (Magoulas et al., 1996;Magoulas et al., 2006)(Εικ. 2). Είναι ενδιαφέρον ότι η γενετική ομοιότητα μεταξύ Βισκαϊκού και Δυτικής Μεσογείου που είχε βρεθεί με βάση το μιτοχονδριακό DNA επιβεβαιώνεται και με το μικροδορυφορικό DNA. Αντιθέτως, η ομοιότητα μεταξύ Μαύρης Θάλασσας, Β. Αιγαίου και των πληθυσμών του Ατλαντικού, που έχουν υψηλή συχνότητα κλάδου Α, δεν παρατηρήθηκε στο επίπεδο του μικροδορυφορικού DNA. Τα δεδομένα αυτά προσφέρουν μια νέα θεώρηση της εξελικτικής ιστορίας των πληθυσμών του γαύρου σε σχέση με τα αποτελέσματα του μιτοχονδραικού DNA. Φανερώνουν ότι οι πληθυσμοί Βισκαϊκού και Δυτικής Μεσογείου έχουν πρόσφατη προέλευση, πιθανώς λόγω επέκτασης προς τον ΒΑ Ατλαντικό πληθυσμών από τη Δ. Μεσογείο, που μπορεί να αποτελούσε παγετωνικό καταφύγιο του κλάδου Β. Στην περίπτωση της Μαύρης Θάλασσας και του Ατλαντικού, φαίνεται ο Ατλαντικός (Αφρικανικές ακτές;) να είναι η περιοχή προέλευσης του κλάδου Α. Από εκεί, άτομα με απλότυπο τύπου Α κινήθηκαν προς τα βόρεια και αντικατέστησαν του πληθυσμούς κλάδου Β των πορτογαλικών ακτών, αποκόπτοντας έτσι το Βισκαϊκό από τη Δ. Μεσόγειο. Στη συνέχεια εισήλθαν στη Δ. Μεσόγειο και διαχύθηκαν προς την Α. Μεσόγειο, αναμίχθηκαν με τους εκεί πληθυσμούς ενώ η Μαύρη Θάλασσα αποικήθηκε τυχαία μόνο από άτομα με απλότυπο Α, που όμως στο πυρηνικό επίπεδο δεν διέφεραν από τα υπόλοιπα άτομα της Μεσογείου. Το παραπάνω σενάριο αντικατοπτρίζει την πολύπλοκη εξελικτική ιστορία του γαύρου, χρειάζεται όμως ανάλυση περισσοτέρων δειγμάτων για την πληρέστερη διαλεύκανσή της. 5. Ευχαριστίες Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τη Βάσω Τερζόγλου και την Κατερίνα Οικονομάκη για τεχνική βοήθεια που προσέφεραν στο εργαστηριακό κομμάτι της μελέτης, καθώς και όλους όσους προσέφεραν δείγματα γαύρου για γενετική ανάλυση

6 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Ashburner, M., Mapping insect genomes. In: Insect Molecular Science. Crampton JM and Eggleston P edition. Academic Press, London. Bembo, D.G., Carvalho, G.R., Cingolani, N. & Pitcher, T.J., 1996a. Electrophoretic analysis of stock structure in Northern Mediterranean anchovies, Engraulis encrasicolus. ICES Journal of Μarine Science, 53: Bembo, D.G., Carvalho, G.R., Cingolani, N., Arneri, E., Giannetti, G. & Pitcher, T.J., 1996b. Allozymic and morphometric evidence for two stocks of the European anchovy Engraulis encrasicolus in Adriatic waters. Marine Biology, 126: Grant, S.W., Leslie, R.W. & Bowen, B.W., Molecular genetic assessment of bipolarity in the anchovy genus Engraulis. Journal of Fish Biology, 67: Magoulas, A., Castilho, R., Caetano, S., Marcato, S. & Patarnello, T., Mitochondrial DNA reveals a mosaic pattern pf phylogeographical structure in Atlantic and Mediterranean populations of anchovy (Engraulis encrasicolus). Molecular Phylogenetics and Evolution, 39: Magoulas, A., Tsimenides, N. & Zouros, E., Mitochondrial DNA Phylogeny and the Reconstruction of the Population History of a Species: The Case of the European Anchovy (Engraulis encrasicolus). Molecular Biology and Evolution, 13 (1): Ovenden, J.R., Mitochondrial DNA and marine stock assessment: a review. Australian Journal of Marine and Freshwater Research, 41: Spanakis, E., Tsimenides, N. & Zouros, E., Genetic differences between populations of sardine, Sardina pilchardus, and anchovy, Engraulis encrasicolus, in the Aegean and Ionian seas. Journal of Fish Biology, 35: Tsigenopoulos, C.S., Hellemans, B., Chistiakov, D.A. et al Eleven new microsatellites of the sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Molecular Ecology Notes, 3: Whitehead, P.J.P., Nelson, G. & Wongratana, T., FAO species catalogue, vol. 7, Clupeoid fishes of the world (suborder Clupeoidae), an annotated and illustrated catalogue of the herrings, sardines, pilchards, sprats, shads, anchovies and wolf-herrings. Part 2. Engraulididae, FAO Fish. Synops, 125: