ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΥ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΘΕΡΜΟΧΗΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΥ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΘΕΡΜΟΧΗΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ

2 ΘΕΡΜΟΧΗΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ Μετατροπή λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας σε αέριο σύνθεσης (syngas) Συνθήκες: υγρασία 5-20%, θέρμανση 550 o C σε αεροποιητή ρευστοποιημένης κλίνης κοκκώδους υλικού Ζυμωτική παραγωγή αιθανόλης Μετατροπή syngas σε αιθανόλη και οξικό οξύ από τους Clostridium carboxidivorans P7, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum Καταλυτική παραγωγή αιθανόλης Θέρμανση syngas στους 300 o C, 69 bar και καταλύτη δισουλφίδιο του μολυβδαινίου -> μίγμα αλκοολών Απόσταξη

3 ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΥ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΟΞΙΝΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ

4 Όξινη υδρόλυση Αραιό οξύ Πυκνό οξύ

5 Αραιό οξύ Υψηλή θερμοκρασία ( ο C) Υψηλή πίεση Χρόνος αντίδρασης (min-sec) Δυνατότητα συνεχούς λειτουργίας 1% θειικό οξύ σε αντιδραστήρα συνεχής ροής με χρόνο παραμονής 0.22 min και θερμοκρασία 510 Κ μετατρέπει καθαρή κυτταρίνη σε 50% σάκχαρα ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Υψηλό κόστος αντιδραστήρων, αποικοδόμηση του μεγαλύτερου μέρους των πεντοζών και μέρος των εξοζών με αντίστοιχη δημιουργία παρεμποδιστών Διεργασία 2 σταδίων: o C, 0,5-1,2% οξύ για απομάκρυνση ημικυτταρίνης και μετά στο στερεό o C και 2,5% οξύ

6 Δημιουργία παρεμποδιστών

7 Παραγωγή μορίων Βιοδιυληστήριο

8 Παραγωγή μορίων Βιοδιυληστήριο

9 Πυκνό οξύ HCl (41%, 2 ος Παγκόσμιος Πόλεμος) ή 30-40% H 2 SO 4 Hπια θερμοκρασία (περίπου ο C) Xαμηλή πίεση Χρόνος αντίδρασης (ώρες) Ασυνεχής λειτουργία Η διεργασία αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την υδρόλυση του 85-90% της θεωρητικής απόδοσης των εξοζών και πεντοζών χωρίς να καταστρέφονται. ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Η υψηλή συγκέντρωση οξέων προϋποθέτει την ανακύκλωση του οξέος, που είναι υψηλού κόστους ενεργοβόρο στάδιο. Χρειάζονται ειδικές κατασκευές υψηλού κόστους για την αποφυγή της διάβρωσης.

10 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ

11 Σκοπός προκατεργασίας Απομάκρυνση ημικυτταρίνης Μείωση κρυσταλλικότητας της κυτταρίνης Δυο ρεύματα στερεό (κυτταρίνη+λιγνίνη) και υγρό (ημικυτταρίνη)

12 Inbicon Υδροθερμική Επεξεργασία Η βιομάζα αναμειγνύεται συνεχώς με νερό και θερμαίνεται στους ο C για 5-15 min με σκοπό την καταστροφή της δομής της λιγνίνης ώστε να διευκολυνθεί η πρόσβαση της κυτταρίνης από τα ένζυμα. Απομάκρυνση μέρους των ημικυτταρινών και παρεμποδιστών που σχηματίζονται

13 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ 1) Θερμική 2) Με αραιό οξύ σε ήπιες συνθήκες 3) Αλκαλική 4) Οξειδωτική 5) Βιολογική

14 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ 1) Θερμική α. Εκτόνωση ατμού (αυτοϋδρόλυση) β. Εκτόνωση ατμού (όξινος καταλύτης) γ. Υδροθερμική δ. Έκρηξη αμμωνίας ε. Έκρηξη CO 2 ζ. Οξειδωτική

15 ΘΕΡΜΙΚΗ Προκατεργασία με εκτόνωση ατμού συνδιαζόμενη με αυτοϋδρόλυση Το λιγνινοκυτταρινούχο υλικό θερμαίνεται με υψηλής πίεσης ατμό σε θερμοκρασίες ο C από μερικά sec έως 10 min. Μετά το υλικό υφίσταται μια εκτονωτική αποσυμπίεση που σε συνδυασμό με την προκαλούμενη αυτοϋδρόλυση από τον σχηματισμό διάφορων οργανικών οξέων από τα υπάρχοντα οξικά οξέα του υλικού λόγω της θερμοκρασίας, προκαλείται μια μερική υδρόλυση και διαλυτοποίηση της ημικυτταρίνης καθώς και μία βελτίωση του δυναμικού αποικοδόμησης της κυτταρίνης. Μειονέκτημα αποτελεί η αποικοδόμηση των σακχάρων λόγω της υψηλής θερμοκρασίας και του χρόνου κατεργασίας

16 ΘΕΡΜΙΚΗ Προκατεργασία με εκτόνωση ατμού συνδιαζόμενη με αυτοϋδρόλυση Διάταξη προκατεργασίας εκτόνωσης ατμού του Εργαστηρίου Πράσινης Χημείας και Βιοδιυλιστηρίου του Lulea Technical University, Σουηδία

17 ΘΕΡΜΙΚΗ Προκατεργασία με εκτόνωση ατμού συνδιαζόμενη με αυτοϋδρόλυση Διάταξη προκατεργασίας εκτόνωσης ατμού του Εργαστηρίου Πράσινης Χημείας και Βιοδιυλιστηρίου του Lulea Technical University, Σουηδία

18 ΘΕΡΜΙΚΗ Προκατεργασία με εκτόνωση ατμού συνδιαζόμενη με την προσθήκη όξινου καταλύτη Το υλικό πριν την προκατεργασία εμποτίζεται με 0.5-6% (w/w) H 2 SO 4 ή SO 2 Για την αποφυγή σχηματισμού παρεμποδιστών -> Διεργασία 2 σταδίων: <180 o C για απομάκρυνση ημικυτταρίνης και μετά στο στερεό >210 o C Απαραίτητη η βιομάζα χαμηλής υγρασίας για τη σωστή διείσδυση του ατμού

19 ΘΕΡΜΙΚΗ Υδροθερμική προκατεργασία Νερό υψηλής θερμοκρασίας αντί για ατμό Χαμηλότερες συγκεντρώσεις Προσθήκη οξέος?

20 ΘΕΡΜΙΚΗ Έκρηξη αμμωνίας Υγρή αμμωνία σε υψηλή πίεση (>3Mpa) Ήπια θερμοκρασία (<100 o C) 2kg NH 3 / kg βιομάζας Ανακύκλωση Δε δημιουργούνται παρεμποδιστές

21 ΘΕΡΜΙΚΗ Έκρηξη CO 2 Αύξηση της πίεσης (παρόμοιες συνθήκες με προκατεργασία ατμού ή NH 3 Διάλυση CO 2 προς H 2 CO 3 -> αυτοϋδρόλυση Δε δημιουργούνται παρεμποδιστές Οικονομικότερη από NH 3

22 Αποτελέσματα θερμικής προκατεργασίας Μικροϊνίδια κυτταρίνης Αποδιάταξη μικροϊνιδίων Προκατεργασία άχυρου σίτου Kristensen et al. Biotechnology for Biofuels :5 doi: /

23 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ

24 NREL Η κυτταρίνη είναι ανθεκτική στην υδρόλυση

25 Ενζυμική Υδρόλυση Κυτταρίνης (ΣΥΝΕΡΓΗΤΙΣΜΟΣ)

26 Κυτταρινάσες έξω- ένδο- έξω- Εξωγλουκανάσες Δρουν στο μη αναγωγικό άκρο πχ. πχ. Ενδογλουκανάσες Δρουν στο μέσο Εξωγλουκανάσες Δρουν στο αναγωγικό άκρο πχ. Προϊόν - κελλοβιόζη Προϊόντα διαφορετικοί κελλολιγοσακχαρίτες Προϊόν - κελλοβιόζη

27 Κλασσικό μοντέλο δράσης κυτταρινασών β-γλυκοζιδάση Σημαντικός ο ρόλος της β-γλυκοζιδάσης αφού διασπά την κελλοβιόζη η οποία αποτελεί ισχυρό παρεμποδιστή των εξωγλουκανασών ενδογλουκανάση εξωγλουκανάση = γλυκόζη = κελλοβιόζη

28

29 Ενζυμική Υδρόλυση Κυτταρίνης (ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ) Οικογένειες ενζύμων: - Ενδογλουκανάσες - Κελλοβιοϋδρολάσες - β-γλυκοζιδάσες - Lytic Polysaccharides MonoOxygenases (LPMOs)

30 Σπουδαιότητα ανακάλυψης νέων ενζύμων

31 Εμπορικά Ένζυμα Celluclast (Μίγμα κυτταρινασών) Cellic Ctec (2009) Cellic CTec2 (2010) Cellic CTec3 (2012) (Μίγμα κυτταρινασών + LPMOs + Ημικυτταρινάσες) Novozym 188 (β-γλυκοζιδάση) Inbicon: η χρήση των LPMOs μείωσε το κόστος των ενζύμων κατά 35% με μελλοντικό στόχο τη μείωση κατά 65% μέσω βελτιστοποίησης της διεργασίας

32 Ιστορική αναδρομή της δράσης των κυτταρινασών Πρώτη αναφορά στη βιβλιογραφία του όρου κυτταρινάσες (cellulase) που περιγράφει την ενζυμική δράση της αποικοδόμησης της κυτταρίνης έγινε από τον Pringsheim (1912). Στο 2 ο Παγκόσμιο πόλεμο στις ζούγκλες του Νότιου Ειρηνικού (Νέα Γουϊνέα) απομονώθηκε ο μύκητας Trichoderma reesei ο οποίος κατάστρεφε τα ρούχα των στρατιωτών και απετέλεσε τον κύριο παραγωγό κυτταρινασών

33 Tαξινόμηση κυτταρινασών Περισσότερες από 120 οικογένειες γλυκοζυλ-υδρολασών έχουν περιγραφεί Οι κυτταρινάσες είναι μέλη των οικογενειών: 1,3,5,6,7,8,9,12,30,44,45,48,51,61,74 και 124

34 3D δομές κυτταρινασών

35 Ύπαρξη CAZy ενζύμων στα γονιδιώματα μυκήτων Nature Genetics 44, (2012)

36 Το Λιγνινοκυτταρινολυτικό σύστημα του Fusarium oxysporum Πάνω από 250 γονίδια σχετίζονται με ένζυμα που αποικοδομούν το κυτταρικό τοίχωμα των φυτών και τα οποία κατηγοριοποιούνται στην τράπεζα δεδομένων Carbohydrate Active enzymes (CAZy: Αριθμός Γονιδίων Οικογένειες Γλυκοζυλ-υδρολασών (GHs, CAZy) 230 GHs

37 Εφαρμογές κυτταρινασών (i) ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Εξαγωγή και διαύγαση χυμών φρούτων και λαχανικών (ενζυμικό κοκτέϊλ από κυτταρινάσες, ξυλανάσες, πηκτινάσες) Εξαγωγή ελαιόλαδου

38 Εφαρμογές κυτταρινασών (ii) ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗΝ ΥΦΑΝΤΟΥΡΓΙΑ Bio-stoning (denim fabrics) Bio-polishing (βαμβακερά και nondenim fabrics) Συστατικό απορρυπαντικών

39 Διαμόρφωση καταλυτικού κέντρου ενδογλουκανασών

40 Διαμόρφωση καταλυτικού κέντρου ενδογλουκανασών

41 Ενδογλουκανάση του Clostridium thermocellum

42 Διαμόρφωση καταλυτικού κέντρου εξωγλουκανασών

43 Διαμόρφωση καταλυτικού κέντρου εξωγλουκανασών

44 Μηχανισμός καταλυτικής δράσης των εξωγλουκανασών

45 Εξωγλουκανάση I from Trichoderma reesei

46 Οι εξωγλουκανάσες είναι «μετατοπιζόμενα» ένζυμα ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΣΤΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ

47 Ρόλος της μονάδας δέσμευσης υδατανθράκων (CBM)

48 Μηχανισμός καταλυτικής δράσης των εξωγλουκανασών High Speed Atomic Force Spectroscopy Traffic Jams Reduce Hydrolytic Efficiency of Cellulase on Cellulose Surface. Kiyohiko Igarashi, et al. Science 333, 1279 (2011)

49 Οι εξωγλουκανάσες είναι «μετατοπιζόμενα» ένζυμα Καταλυτική μονάδα (CD) Μονάδα δέσμευσης υδατανθράκων (CBM) Πεπτίδιο σύνδεσης

50 Διαμόρφωση καταλυτικού κέντρου LPMOs

51 Οι κυτταρινάσες δεν αποτελούν πλέον τον απαγορευτικό παράγοντα κόστους στην παραγωγή αιθανόλης

52 Το τρέχον κόστος των κυτταρινασών υπολογίζεται σε 0.03 με 0.08 ανά L παραγομένης αιθανόλης. Μελλοντικός στόχος είναι να προσεγγίσει το κόστος των αμυλασών που είναι 10 φορές μικρότερο. Για παράδειγμα, ενζυμικό φορτίο περίπου 25 mg μυκητιακής κυτταρινάσης απαιτούνται για την υδρόλυση 1 g προκατεργασμένης κυτταρίνης. Ο στόχος είναι βελτιωμένες καταλυτικά κυτταρινάσες να υδρολύουν την ίδια ποσότητα κυτταρίνης χρησιμοποιώντας το 1/10 του ενζυμικού φορτίου.

53 Ποιό συνηθισμένη ενζυμική δραστικότητα που χρησιμοποιείται στις βιομηχανικές διεργασίες ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης είναι εκείνη των 15 FPU ανα g κυτταρίνης. Οι ενζυμική σακχαροποίηση πραγματοποιείται σε σχετικά αραιά αιωρήματα >10-15% (w/v) με στόχο την καλύτερη ανάμειξη.

54 Υδρόλυση βιομάζας σε υψηλή συγκέντρωση Προβλήματα: -Παρεμποδιστές από προκατεργασία -Παρεμπόδιση από κελλοβιόζη -Προσρόφηση ενζύμων από τη κυτταρίνη Λύσεις: - Ξέπλυμα προκατεργασμένης βιομάζας - Προσθήκη β-γλυκοζιδάσης - Προσθήκη επιφανειοενεργών ουσιών Χρήση αναμικτήρων ελευθέρας πτώσεως (free fall mixer) για την υδρόλυση υποστρωμάτων έως 28%-30% (w/v). Αν πχ η προκατεργασμένη βιομάζα διαθέτει ~42% κυτταρίνη επιτρέπονται αποδόσεις αιθανόλης 5,5-6%. ΜΕΙΩΣΗ ΚΟΣΤΟΥΣ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ

55 (α) Αρχικό υλικό (β) t= cp (γ) t=1h cp (δ) t=6h

56 Χρησιμοποίηση όλων των σακχάρων = χαμηλότερο κόστος καυσίμων

57 Αγροτοβιομηχανική λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα Σύσταση (%, ξηρής βάσης) Κυτταρίνη Ημικυτταρίνη Λιγνίνη Τέφρα Βιομάζα Αραβ * > 1 Στέλεχος Αραβ Σπάδικες Αραβ Άχυρο ρυζιού Άχυρο σίτου Βαγάσση Σακχ. κάλαμου Switchgrass *περιέχει 20% άμυλο

58 ΗΜΙΚΥΤΤΑΡΙΝΗ Ξυλόζη Γλυκουρονικό οξύ Αραβινόζη Γαλακτόζη Φερουλικό οξύ Οξικό οξύ

59 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ Υ ΡΟΛΥΣΗΣ ΞΥΛΑΝΗΣ Ξυλανάση Γλυκουρονοζιδάση Ακετυλεστεράση Αραβινοφουρανοζιδάση Εστεράση του φερουλικού/κουμαρικού οξέος Ξυλοζιδάση

60 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ Υ ΡΟΛΥΣΗΣ ΞΥΛΑΝΗΣ Ξυλάνη (n+2) Ενδοξυλανάση Ξυλάνη (n) Ξυλοβιόζη β-ξυλοζιδάση Ξυλοζη Ξυλοζη

61 Ένδο-β-1,4-ξυλανάσες Ξυλανάσες GH10: μέγεθος μεταξύ 40 και 50 kda υιοθετούν αναδίπλωση (α/β)8 barrel Ξυλανάσες GH11: μέγεθος περίπου 20 kda υιοθετούν αναδίπλωση β- jelly roll

62 Τρόπος δράσης των ξυλανασών σε υποκατεστημένες ξυλάνες ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ 10 o O o O o o o o O o O o o OH O O HO HO OCH 3 OCH 3 ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ 11

63 Προϊόντα υδρόλυσης ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ 11 H 3 CO OH COOH HO O HO HO O OH HO O O O O HO O OH HO O O OH OH H 3 CO OH ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ 10 HO O COOH HO HO O O O HO O OH O HO O OH OH

64

65 Εργαλεία Λειτουργικής Γονιδιωματικής

66 Επαγωγή του λιγνινοκυτταρινολυτικού συστήματος του Neurospora crassa Transcriptome σε μίσχανθο και κυτταρίνη Avicel PNAS December 29, 2009 vol. 106 no (Α) Ανάλυση 769 γονιδίων (Β) Συσχέτιση επαγωγής γονιδίων σε επίπεδο μετάγραφου και πρωτεϊνης (C) Λειτουργική κατηγοριοποίηση 231 γονιδίων που επάγονται σημαντικά σε μίσχανθο

67 Επαγωγή του λιγνινοκυτταρινολυτικού συστήματος του Neurospora crassa Επαγωγή Εξωκυτταρικά ένζυμα τα οποία εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα παράγουν μεταβολίτες οι οποίοι σηματοδοτούν την παραγωγή ενζύμων αποικοδόμησης των κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτών. Εκμετάλλευση Ένζυμα και μεταφορείς των προϊόντων αποδόμησης που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του μύκητα. Κάποιοι PNAS December 29, 2009 vol. 106 no μεταβολίτες επηρεάζουν την γονιδιακή έκφραση

68 Επαγωγή του λιγνινοκυτταρινολυτικού συστήματος του Neurospora crassa PNAS May 8, 2012 vol. 109 no

69 Επαγωγή του λιγνινοκυτταρινολυτικού συστήματος

70 Διεργασίες Παραγωγής Αιθανόλης από Λιγνινοκυτταρινούχα Υλικά Διακριτή Υδρόλυση και Ζύμωση (SHF Separate Hydrolysis and Fermentation) Ταυτόχρονη Σακχαροποίηση και Ζύμωση (SSF Simultaneous Saccharification and Fermentation) Ενοποιημένη Βιοδιεργασία (CBP Consolidated BioProcess)

71 Διακριτή Υδρόλυση και Ζύμωση (SHF) ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΠΡΩΤΗ ΥΛΗ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΠΡΩΤΗ ΥΛΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟ ΚΛΑΣΜΑ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΠΡΩΤΗ ΥΛΗ ΠΕΝΤΟΖΕΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΣΑΚΧΑΡΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΣΑΚΧΑΡΟΠΟΙΗΣΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΑΠΟ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΤΩΝ ΕΞΟΖΕΣ ΜΙΓΜΑ ΕΞΟΖΩΝ ΚΑΙ ΠΕΝΤΟΖΩΝ ΖΥΜΩΣΗ ΖΥΜΩΣΗ ΥΨΗΛΟ ΚΟΣΤΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Βέλτιστες συνθήκες σταδίων Οι πεντόζες προτιμότερα σε ξεχωριστή ζύμωση **ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΤΕΣ**

72 Ταυτόχρονη Σακχαροποίηση και Ζύμωση (SSF) ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΠΡΩΤΗ ΥΛΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΣΑΚΧΑΡΟΠΟΙΗΣΗ ME TH ΧΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ ΚΑΙ ΗΜΙΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ + ΖΥΜΩΣΗ ΠΕΝΤΟΖΩΝ ΚΑΙ ΕΞΟΖΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Άμεση κατανάλωση των σακχάρων προς παραγωγή αιθανόλης μείωση της παρεμπόδισης από το προϊόν - οικονομία στα ένζυμα Μείωση κόστους υποδομής (αντιδραστήρες σακχαροποίησης/ζύμωσης) - ταχύτητα Δε μπορούμε να έχουμε τις βέλτιστες συνθήκες ενζυμικής δράσης (ph 4-5, o C) και ζύμωσης (ph 4-5, 30 o C), ιδιαίτερα για την ταυτόχρονη αξιοποίηση και πεντοζών. Παρουσία παρεμποδιστών από την προκατεργασία για κυτταρινάσες ή/και ζύμη

73 Ενοποιημένη Βιοδιεργασία (CBP) ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΠΡΩΤΗ ΥΛΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ ΚΑΙ ΗΜΙΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ + ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΣΑΚΧΑΡΟΠΟΙΗΣΗ + ΖΥΜΩΣΗ ΠΕΝΤΟΖΩΝ ΚΑΙ ΕΞΟΖΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Ιδανική βιοδιεργασία παραγωγής αιθανόλης αλλά οι μικροοργανισμοί που γνωρίζουμε έχουν μικρές αποδόσεις και χαμηλούς ρυθμούς (Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Monilia sp.)

74

75 Ζύμωση προϊόντων υδρόλυσης της λιγνινοκυτταρίνης Μέγιστη θεωρητική απόδοση: 0,51g EtOH / g σακχάρου, > 2 g/l/h Κυτταρίνη (εξόζη) n C 6 H 10 O 5 + n H 2 O n C 6 H 12 O 6 1 g g g Ημικυτταρίνη (πεντόζη) n C 5 H 8 O 4 + n H 2 O n C 5 H 10 O 5 1 g g g 3 C 5 H 10 O 5 5 C 2 H 5 OΗ + 5 CO 2 1g g g C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OΗ + 2 CO 2 1g g g Λαμβάνοντας υπόψη τις παραπάνω στοιχειομετρίες και βασιζόμενοι σε μία μέση σύσταση της ξυλώδους βιομάζας, που θεωρητικά περιέχει 42% κυτταρίνη και 21% ημικυτταρίνη η μέγιστη θεωρητική απόδοση σε αιθανόλη υπολογίζεται σε 0.32 g αιθανόλης ανά g ξύλου

76 ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Γλυκόζη Ριβουλόζη-5-Φ D-Ξυλουλόζη-5-Φ Ριβόζη-5-Φ Σεδοεπτουλόζη- 7-Φ Γλυκεραλδ.-3-Φ TKL TAL Φρουκτόζη-6-Φ Ερυθρόζη-4-Φ Γλυκεραλδ.-3-Φ TKL Γλυκεραλδ.-3-Φ Γλυκερόλη Πυροσταφυλικό Ακεταλδεΰδη ΑΙΘΑΝΟΛΗ Φρουκτόζη-6-Φ Γλυκόζη Γλυκόζη Γαλακτόζη Μανόζη 6PG 2-KDPG L-Aραβινόζη A B C L-Aραβιτόλη L-Ξυλουλόζη Ξυλιτόλη D-Ξυλόζη D-Ξυλουλόζη XR XK XI XDH Γλυκόζη Ριβουλόζη-5-Φ D-Ξυλουλόζη-5-Φ Ριβόζη-5-Φ Σεδοεπτουλόζη- 7-Φ Γλυκεραλδ.-3-Φ TKL TAL Φρουκτόζη-6-Φ Ερυθρόζη-4-Φ Γλυκεραλδ.-3-Φ TKL Γλυκεραλδ.-3-Φ Γλυκερόλη Πυροσταφυλικό Ακεταλδεΰδη ΑΙΘΑΝΟΛΗ Φρουκτόζη-6-Φ Γλυκόζη Γλυκόζη Γαλακτόζη Μανόζη 6PG 2-KDPG L-Aραβινόζη A B C L-Aραβιτόλη L-Ξυλουλόζη Ξυλιτόλη D-Ξυλόζη D-Ξυλουλόζη XR XK XI XDH ΜΟΝΟΠ. ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΩΝ ΠΕΝΤΟΖΩΝ ΓΛΥΚΟΛΥΣΗ ENTNER- DOUDOROFF

77 Αιθανόλη από γλυκόζη και ξυλόζη NADPH + CO 2 Γλυκόλυση Προκαρυωτικά συστήματα C6 ADP C3 Μονοπάτι Φωσφορυλιωμένων πεντοζών ATP 2 ADP ATP Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis NAD + Jeffries & Shi Adv Bioch Eng 65,118

78 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ XΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΥΛΙΚΑ Escherichia coli και Zymomonas mobilis Saccharomyces cerevisiae και Pichia stipitis

79 Saccharomyces cerevisiae Ο μικροοργανισμός αυτός ζυμώνει όλες τις εξόζες που προέρχονται από την λιγνινοκυτταρινούχο πρώτη ύλη, και παράγει αιθανόλη με απόδοση πλησίον της μέγιστης θεωρητικής απόδοσης που είναι 0.51 g αιθανόλης ανά g γλυκόζης αλλά δεν μπορεί να ζυμώσει τις πεντόζες που είναι το κύριο συστατικό σάκχαρο των ημικυτταρινών και αυτό κάνει περιοριστική τη χρήση του για λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα πλούσια σε ημικυτταρίνες.

80 Μεταβολική Μηχανική Ορισμός: Η βελτίωση της παραγωγής ενός προϊόντος ή των ιδιοτήτων ενός κυττάρου μέσω της τροποποίησης μιας συγκεκριμένης βιοχημικής αντίδρασης(-εων) ή την εισαγωγή νέας(-ων), με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA

81 Saccharomyces cerevisiae μεταβολισμός ξυλόζης Η εισαγωγή από την Pichia stipitis του γονιδίου XYL1 (αναγωγάση της ξυλόζης) και XYL2 (αφυδρογονάση της ξυλιτόλης) επέτρεψε στο S. cerevisiae να μεγαλώνει στη ξυλόζη και να παράγει σε χαμηλές συγκεντρώσεις αιθανόλη, 1.6 g αιθανόλης/l παράχθηκαν από 21.7 g ξυλόζης/l. (Σχήμα) χαμηλή απόδοση

82 Saccharomyces cerevisiae ΙΣΟΜΕΡΑΣΗ ΤΗΣ ΞΥΛΟΖΗΣ (Piromyces sp) 0,43 g EtOH/g ξυλόζης Αιτίες: -Συσσώρευση ξυλιτόλης - ανεπαρκές μονοπάτι φωσ. Πεντοζών - αδυναμία πεντοζών για ενεργοποίηση χαμηλότερων σταδίων της γλυκόλυσης

83 Zymomonas mobilis Μεταβολίζει τη γλυκόζη μέσω του μονοπατιού Entner- Doudoroff το οποίο ανά 1 mol γλυκόζης αποδίδει 2 mol πυροσταφυλικού, παράγοντας 1molATP. Για να μπορέσει να επιβιώσει με τόσο μικρή ενεργειακή απόδοση, ο μεταβολισμός του μικροοργανισμού επιταχύνεται τρομερά. Για αυτό το λόγο ο Z. mobilis κατέχει υψηλότατα επίπεδα ενεργότητας γλυκολυτικών και αιθανολοπαραγωγών ενζύμων με αποτέλεσμα εξαιρετικές αποδόσεις αιθανόλης που προσεγγίζουν εκείνη της θεωρητικής απόδοσης (0.47 g αιθανόλης ανα g γλυκόζης) και υψηλή ογκομετρική παραγωγικότητα (μεγαλύτερη από 3gL -1 hr -1 ).

84 Zymomonas mobilis μεταβολισμός ξυλόζης Σχετικά με την κατανάλωση της ξυλόζης, εφαρμόστηκε η εισαγωγή των ακόλουθων γονιδίων που ανήκουν στο βακτήριο E. coli, xyla (κωδικοποιεί το ένζυμο ισομεράση της ξυλόζης) και xylb (κωδικοποιεί το ένζυμο ξυλουλοκινάση) και που είναι υπεύθυνα για την εισαγωγή της ξυλόζης στο μονοπάτι των φωσφορυλιωμένων πεντοζών (Σχήμα) με την ταυτόχρονη εισαγωγή των γονιδίων talβ (κωδικοποιεί την τρανσαλδολάση) και tkta (κωδικοποιεί την τρανσκετολάση) τα οποία ενισχύουν την αποδοτικότητα του μονοπατιού των φωσφορυλιωμένων πεντοζών (Σχήμα). Το τροποποιημένο στέλεχος του Z. mobilis CP4(pZB5) αναπτύχθηκε σε ξυλόζη και παρήγαγε αιθανόλη με απόδοση 0.46 g αιθανόλης ανα g ξυλόζης και ογκομετρική παραγωγικότητα 0.57 g L -1 hr -1 ).

85 Escherichia coli Ο E. coli έχει την φυσική ικανότητα να καταναλώνει ένα μεγάλο εύρος υποστρωμάτων, μετατρέποντας εξόζες (γλυκόζη, μαννόζη, γαλακτόζη, φρουκτόζη), πεντόζες (ξυλόζη και αραβινόζη) και ουρονικά οξέα (γαλακτουρονικό οξύ, γλουκουρονικό οξύ) στο κεντρικό μεταβολίτη το πυροσταφυλικό. Αυτό το συστατικό εν συνεχεία μετατρέπεται σε ένα μίγμα αποτελούμενο σχεδόν από ίσα μέρη αιθανόλης, οξικού, γαλακτικού και φορμικού (H 2 O και CO 2 ). Κατά κανόνα οι ζυμώσεις γίνονται σε ph 7 και θερμοκρασίες μεταξύ 30 και 35 ο C. Η παρουσία οργανικών οξέων όπως είναι το οξικό και το γαλακτικό στο τελικό ζυμωτικό υλικό ταυτόχρονα με την αιθανόλη κάνει την χρησιμοποίηση του E. coli μια μη ελκυστική επιλογή για την παραγωγη αιθανόλης. Επίσης οι αποδόσεις παραγωγής αιθανόλης είναι χαμηλότερες από 0.2 g ανά g σακχάρων (γλυκόζης ή ξυλόζης).

86 Escherichia coli Η κύρια στρατηγική για την αύξηση της παραγωγής αιθανόλης από τον E. coli, με στόχο να καταστεί κατάλληλος για διεργασίες χρησιμοποίησης λιγνινοκυτταρινούχων υλικών σαν πρώτες ύλες για την παραγωγή αιθανόλης, ήταν να στραφούν οι ροές άνθρακα προς την παραγωγή αιθανόλης, σε βάρος εκείνων των ροών που οδηγούσαν στην παραγωγή παραπροϊόντων όπως το οξικό, ηλεκτρικό και γαλακτικό.

87 Escherichia coli Η εισαγωγή των γονιδίων pdc και adhb που κωδικοποιούν δύο ένζυμα που βρίσκονται στο τέλος της αλυσίδας της παραγωγής αιθανόλης, την αφυδρογονάση της αιθανόλης και την αποκαρβοξυλάση του πυροσταφυλικού, από τον Z. mobilis. Έτσι ενισχύθηκε ο E. coli με ένζυμα που ενισχύουν την ροή άνθρακα προς την αιθανόλη από ένα μικροοργανισμό που όπως αναφέρθηκε παραπάνω έχει υψηλότατες ενεργότητες αιθανολοπαραγωγών ενζύμων, επέτρεψαν στον E. coli να παράγει αιθανόλη και CO 2 από εξόζες και πεντόζες με υψηλή αποδοτικότητα.

88 Pichia stipitis ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Φυσιολογικά μεταβολίζει τη Γλυκόζη και Ξυλόζη ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Παρεμπόδιση από τις ουσίες που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της προκατεργασίας λιγνινοκυτταρινικών υποστρωμάτων. Συμμεταβολισμός γλυκόζης και ξυλόζης απαιτεί ΜΙΚΡΟΑΕΡΟΒΙΕΣ συνθήκες. Εισαγωγή του γονιδίου URA1 από τον S. cerevisiae που κωδικοποιεί το ένζυμο αφυδρογονάση του διυδροοροτικού οξέος επιτρέποντας τη χρήση του φουμαρικού οξέος αντί του οξυγόνου ως δέκτης e -

89 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ XΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΥΛΙΚΑ Βασικά Χαρακτηριστικά Δυνατότητα χρήσης μεγάλου εύρους υποστρωμάτων (πεντόζες-εξόζες) Υψηλή απόδοση αιθανόλης και αυξημένη ογκομετρική παραγωγικότητα Ελάχιστη παραγωγή παραπροϊόντων Υψηλή αντοχή σε αιθανόλη και παρεμποδιστές Αυξημένη αντοχή σε επίπονες διεργασίες Επιθυμητά Χαρακτηριστικά Ταυτόχρονο μεταβολισμό διαφορετικών σακχάρων Δυνατότητα υδρόλυσης κυτταρίνης και ημικυτταρίνης GRAS status Ελάχιστη απαίτηση για προσθήκη θρεπτικών ουσιών Αντοχή σε χαμηλές τιμές ph και υψηλές θερμοκρασίες

90 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ XΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΥΛΙΚΑ Βασικά Χαρακτηριστικά Δυνατότητα χρήσης μεγάλου εύρους υποστρωμάτων (πεντόζες-εξόζες) Υψηλή απόδοση αιθανόλης και αυξημένη ογκομετρική παραγωγικότητα Ελάχιστη παραγωγή παραπροϊόντων Υψηλή αντοχή σε αιθανόλη και παρεμποδιστές Αυξημένη αντοχή σε επίπονες διεργασίες Επιθυμητά Χαρακτηριστικά Ταυτόχρονο μεταβολισμό Μείωση της παραγωγής γλυκερόλης από το S. cerevisiae. Τροποποίηση της ζύμης οδήγησε σε 40% μείωση της γλυκερόλης αλλά ταυτόχρονα μειώθηκε κατά 45% ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης διαφορετικών σακχάρων Δυνατότητα υδρόλυσης κυτταρίνης και ημικυτταρίνης GRAS status Ελάχιστη απαίτηση για προσθήκη θρεπτικών ουσιών Αντοχή σε χαμηλές τιμές ph και υψηλές θερμοκρασίες

91 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ XΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΥΛΙΚΑ Βασικά Χαρακτηριστικά Δυνατότητα χρήσης μεγάλου εύρους υποστρωμάτων (πεντόζες-εξόζες) Υψηλή απόδοση αιθανόλης και αυξημένη ογκομετρική παραγωγικότητα Ελάχιστη παραγωγή παραπροϊόντων Υψηλή αντοχή σε αιθανόλη και παρεμποδιστές Αυξημένη αντοχή σε επίπονες διεργασίες Επιθυμητά Χαρακτηριστικά Ταυτόχρονο μεταβολισμό O S. cerevisiae είναι διαφορετικών σακχάρων ανθεκτικός μέχρι 21% (w/v) Δυνατότητα αιθανόλης υδρόλυσης κυτταρίνης ενώ η P. και stipitis ημικυτταρίνης μέχρι 12% (w/v). Άμεση σχέση με το είδος GRAS status των λιπιδίων που Ελάχιστη απαίτηση για προσθήκη συνιστούν την κυτταρική θρεπτικών ουσιών μεμβράνη. Αντοχή σε χαμηλές τιμές ph και υψηλές θερμοκρασίες

92 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ XΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΥΛΙΚΑ Βασικά Χαρακτηριστικά Επιθυμητά Χαρακτηριστικά Δυνατότητα χρήσης μεγάλου εύρους Ταυτόχρονο μεταβολισμό Δημιουργία παρεμποδιστών κατά την προκατεργασία υποστρωμάτων (πεντόζες-εξόζες) λιγνινοκυτταρινικών διαφορετικών υλικών (συνθήκες σακχάρων προκατεργασίας και συγκέντρωση στερεού). Υψηλή απόδοση αιθανόλης Προέρχονται και αυξημένη από: Δυνατότητα υδρόλυσης κυτταρίνης ογκομετρική παραγωγικότητα α) Αποικοδόμηση σακχάρων: και ημικυτταρίνης φουρφουράλη Ελάχιστη παραγωγή παραπροϊόντων (πεντόζες), υδροξυμεθυλοφουρφουράλη GRAS status (εξόζες) β) Ουσίες που απελευθερώνονται (οξικό, φορμικό) Υψηλή αντοχή σε αιθανόλη γ) Προϊόντα και αποικοδόμησης Ελάχιστη απαίτηση της λιγνίνης για προσθήκη παρεμποδιστές δ) Ανόργανες ουσίεςθρεπτικών ουσιών Αντιμετώπιση με α) λιγότερο έντονη προκατεργασία, Αντοχή σε χαμηλές τιμές ph και β) αποτοξίνωση Ca(OH) 2, γ) διαλείποντος έργου Αυξημένη αντοχή σε διεργασίες, επίπονες διεργασίες δ) χρήση υψηλές ενζύμων θερμοκρασίες πχ λακκασών

93

94

95 Μοντέλα παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά

96 Μοντέλα παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ 1. Παραγωγή 246,000 λίτρα βιοαιθανόλης ετησίως 2. Ανακοινώθηκε κόστος παραγωγής βιοαιθανόλης : 0,29 $ / λίτρο 3. Σχέδια για παραγωγή λίτρα βιοαιθανόλης ετησίως ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ 1. Περισσότερη ενέργεια ανά λίτρο βιοαιθανόλης από τον αραβόσιτο 2. Το κόστος υπολογίστηκε με το 1/10 του κόστους των ενζύμων 3. Χρηματοπιστωτικές δυσκολίες

97 Μοντέλα παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά

98 Inbicon Λιγνινοκυτταρινούχος αιθανόλη The new ethanol: Στο Kalundborg της Δανίας, παράγονται 5,3 εκατομμύρια λίτρα/έτος λιγνινοκυτταρινούχου αιθανόλης

99 Inbicon Υδροθερμική Επεξεργασία Η βιομάζα αναμειγνύεται συνεχώς με νερό και θερμαίνεται στους ο C για 5-15 min με σκοπό την καταστροφή της δομής της λιγνίνης ώστε να διευκολυνθεί η πρόσβαση της κυτταρίνης από τα ένζυμα. Απομάκρυνση μέρους των ημικυτταρινών και παρεμποδιστών που σχηματίζονται

100 Inbicon Διεργασία Σχηματικά