Σχέσεις Δομής-Λειτουργίας στους μεταφορείς πουρινών μυκήτων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αφορά στη μελέτη διαμεμβρανικών

Transcript

1 Περίληψη της διδακτορικής διατριβής Σχέσεις Δομής-Λειτουργίας στους μεταφορείς πουρινών μυκήτων Η παρούσα διδακτορική διατριβή αφορά στη μελέτη διαμεμβρανικών μεταφορέων πουρινών κάνοντας χρήση του μη παθογόνου, νηματοειδούς ασκομύκητα Aspergillus nidulans. Οι μύκητες διαθέτουν διαμεμβρανικούς μεταφορείς εξειδικευμένους για την πρόσληψη πουρινών και πυριμιδινών από το θρεπτικό τους υπόστρωμα. Η μελέτη των μεταφορέων αυτών και η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών εξειδικευμένης αναγνώρισης και πρόσληψης πουρινών, πυριμιδινών και αναλόγων τους παρουσιάζει έντονο βιολογικό ενδιαφέρον λόγω της σημασίας των ουσιών αυτών στον μεταβολισμό των κυττάρων. Μέχρι σήμερα, τέσσερις μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων, οι UapA, UapC, AzgA και FurD, έχουν χαρακτηριστεί στον A. nidulans και δύο, οι Fur4p και Fcy2p, στον S. cerevisiae. Οι μεταφορείς αυτοί ανήκουν σε τρεις εξελικτικά διακριτές οικογένειες συμμεταφορέων H+/ νουκλεοτιδικών βάσεων. Ο UapA και ο UapC είναι πρότυπα μέλη της ευρέως διαδεδομένης οικογένειας μεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων - ασκορβικού οξέος ΝΑΤ και αποτελούν υψηλής/μέτριας μεταφορικής ικανότητας και συνάφειας μεταφορείς ξανθίνης, ουρικού οξέος, αλλοπουρινόλης, οξυπουρινόλης και διαφόρων αναλόγων ξανθίνης. Ο UapC μεταφέρει επίσης με πολύ χαμηλή συνάφεια και απόδοση αδενίνη και υποξανθίνη. Ο AzgA ορίζει μια διακριτή εξελικτικά οικογένεια και αποτελεί έναν υψηλής απόδοσης και συγγένειας μεταφορέα αδενίνης, γουανίνης και υποξανθίνης, ο οποίος προσλαμβάνει επιπλέον 8-αζαξανθίνη και πουρίνη. Ομόλογα των UapA / UapC και AzgA δεν απαντώνται στον S. cerevisiae. Οι FurD και Fur4p είναι μέλη της οικογένειας μεταφορέων NCS1/PRT (Nucleobase Cation Symporter 1/ Purine Related Transporters) και αναγνωρίζουν και μεταφέρουν με υψηλή συγγένεια και απόδοση ουρακίλη και 5-φθοροουρακίλη. Ο Fcy2p ανήκει επίσης στην οικογένεια NCS1/PRT, αλλά εμφανίζει τελείως διαφορετική εξειδίκευση από τους Fur4p/FurD,

2 μεταφέροντας αδενίνη, γουανίνη, υποξανθίνη, κυτοσίνη και 5-φθοροκυτοσίνη, με υψηλή συγγένεια και απόδοση. Πρόσφατα, ομόλογα γονίδια/πρωτεΐνες κλωνοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν στην Candida albicans (Xut1p, μεταφορέας ξανθίνης, ομόλογος των UapA/UapC και Fcy21p, ομόλογος του Fcy2p) και τον Aspergillus fumigatus (AfUapC, AfAzgA). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι περισσότεροι μύκητες διαθέτουν παράλογα της οικογένειας NCS1/PRT, τα οποία στην πλειοψηφία των περιπτώσεων είναι άγνωστης λειτουργίας. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής μελετήθηκαν οι σχέσεις δομήςλειτουργίας του μεταφορέα UapA, ο οποίος προβλέπεται ότι αποτελείται από δώδεκα διαμεμβρανικά τμήματα α-έλικας (TMSs). Από προηγούμενες μελέτες είχαν ταυτοποιηθεί τρεις περιοχές του μεταφορέα ιδιαιτέρως σημαντικές για τη λειτουργία, την εξειδίκευση και την τοπογένεσή του. Η πρώτη είναι μια εκτεταμένη αμφιφιλική περιοχή μεταξύ των TMS8 και TMS9, και περιλαμβάνει και την συναινετική αλληλουχία υπογραφή της οικογένειας μεταφορέων ΝΑΤ. Η δεύτερη εντοπίζεται στo TMS12 του μεταφορέα, ενώ η τρίτη αφορά στην περιοχή του TMS1 και τις εκατέρωθεν θηλειές του. Αρχικά μελετήθηκε συστηματικά με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση ο ρόλος του απόλυτα συντηρημένου αμινοξέος N409 του UapA, το οποίο βρίσκεται στην αλληλουχία υπογραφή της οικογένειας μεταφορέων ΝΑΤ. Από φυσιολογικές και κινητικές αναλύσεις των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών διαπιστώθηκε ότι το αμινοξύ Ν409 είναι απολύτως απαραίτητο για τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης, και θα μπορούσε να θεωρηθεί ένα από τα αμινοξέα του ενεργού κέντρου του μεταφορέα όπου επιτελείται η αναγνώριση και δέσμευση των υποστρωμάτων, χωρίς ωστόσο να συμμετέχει άμεσα σε επαφές με τα υποστρώματα. Πιθανώς ο ρόλος του να σχετίζεται με την δομή, πλαστικότητα και ευκαμψία του ενεργού κέντρου του μεταφορέα και γενικότερα φαίνεται να εμπλέκεται με τις απαραίτητες για τη μεταφορά του υποστρώματος «κινήσεις» της πρωτεΐνης. Επιπλέον, με τη βοήθεια της GFP (Green Fluorescent Protein) διαπιστώθηκε ότι η αδυναμία πρόσληψης ουρικού

3 οξέος-ξανθίνης των μεταλλαγμένων μορφών του UapA δεν οφείλεται σε ελαττωματική στόχευση του μεταφορέα στη μεμβράνη, αλλά είναι αποτέλεσμα προβλήματος στη λειτουργία του αυτή καθαυτή. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε συστηματική ανάλυση μεταλλαγών στην φαινυλαλανίνη 528 (F528), η οποία βρίσκεται στην καρδιά του TMS12, καθώς και συνδυασμών τους με μεταλλαγές στην γλουταμίνη 408 (Q408) της αλληλουχίας-υπογραφής της οικογένειας ΝΑΤ. Από τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι οι μεταλλαγές στην Q408 και στην F528 αλληλεπιδρούν γενετικά με εξειδικευμένο τρόπο, καθορίζοντας τόσο την ικανότητα ανάπτυξης σε διαφορετικά θρεπτικά μέσα, όσο και τα κινητικά χαρακτηριστικά του μεταφορέα. Παράλληλα, διαπιστώθηκε ότι η απαλοιφή του TMS12 οδηγεί σε μη λειτουργικά μόρια μεταφορέα UapA, γεγονός όμως το οποίο οφείλεται στη συγκράτηση της πρωτεΐνης στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ). Επομένως, δεν είναι γνωστό αν η λειτουργία του μεταφορέα αυτή καθαυτή επηρεάζεται από την έλλειψη του TMS12. Επιπλέον, με τη βοήθεια χιμαιρικών μορίων στα οποία το TMS12 του UapA είχε αντικατασταθεί από το αντίστοιχο τμήμα των ομόλογων μεταφορέων UapC και YgfO (ομόλογος μεταφορέας της Escherichia coli), προέκυψε το συμπέρασμα ότι παρ όλη την εν μέρει σημασία της αμινοξικής σύστασης του TMS12 στον καθορισμό των κινητικών χαρακτηριστικών του μεταφορέα, οι βασικοί καθοριστές της αναγνώρισης και μεταφοράς των υποστρωμάτων των μεταφορέων της οικογένειας ΝΑΤ εντοπίζονται εκτός του TMS12. Τέλος, μελετήθηκε συστηματικά με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση η ασπαραγίνη 71, η οποία τοποθετείται πέντε αμινοξέα πριν την προβλεπόμενη έναρξη του TMS1 του μεταφορέα. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν ότι το αμινοξύ αυτό δεν είναι απαραίτητο για τη λειτουργία και την τοπογένεση του μεταφορέα, συμμετέχει ωστόσο, μάλλον έμμεσα, στο λεπτό καθορισμό της εξειδίκευσής του. Παράλληλα, από τη μελέτη χιμαιρικού μεταφορέα, στον οποίο το TMS1 του UapA είχε αντικατασταθεί από το αντίστοιχο τμήμα του ομόλογου μεταφορέα UapC, διαπιστώθηκε ότι στην εν λόγω

4 περιοχή εντοπίζονται στοιχεία βασικά για την αναδίπλωση ή/και τη στόχευση του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη. Στο δεύτερο σκέλος της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε λειτουργικός χαρακτηρισμός ενός νέου μεταφορέα πουρινών-κυτοσίνης του A. nidulans, ο οποίος ονομάστηκε FcyB. Με in silico αναλύσεις ανιχνεύθηκαν πέντε ομόλογα του Fcy2p του S. cerevisiae στον A. nidulans. Δεδομένου ότι στον A. nidulans η πρόσληψη αδενίνης, γουανίνης και υποξανθίνης πραγματοποιείται μέσω του μεταφορέα AzgA, κρίθηκε ενδιαφέρουσα η διερεύνηση του ρόλου αυτών των γονιδίων στον A. nidulans. Για το σκοπό αυτό κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ένα από τα ομόλογα Fcy2p του A. nidulans, το fcyb, το οποίο εμφανίζει το υψηλότερο ποσοστό ομολογίας με τους μεταφορείς πουρινών-κυτοσίνης του S. cerevisiae και της C. albicans Fcy2p/Fcy21p, καθώς και το αντίστοιχο γονίδιο (AffcyB) του παθογόνου μύκητα Aspergillus fumigatus. Από τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι ο FcyB είναι ένας χαμηλής απόδοσης, υψηλής συγγένειας, μεταφορέας κυτοσίνης πουρίνης, ο οποίος χρησιμοποίει παρόμοιες μοριακές αλληλεπιδράσεις για την αναγνώριση των υποστρωμάτων του με τους μεταφορείς Fcy2p/Fcy21p του Σακχαρομύκητα. Εξάλειψη του fcyb δεν επηρεάζει την αύξηση, την ανάπτυξη, την αναπαραγωγή ή την γενική πρόσληψη πουρινών, αλλά εκμηδενίζει την εναπομένουσα αύξηση σε πουρίνες μεταλλαγμένων στελεχών ΔazgA ΔuapC ΔuapA, στα οποία απουσιάζουν όλοι οι γνωστοί μεταφορείς πουρινών, και επίσης προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιμυκητιακό ανάλογο 5- φθοροκυτοσίνη. Μελέτες σε επίπεδο μεταγραφικής ρύθμισης έδειξαν ότι η μεταγραφή του γονιδίου fcyb επάγεται κατά τη διάρκεια της εκβλάστησης, αλλά μειώνεται δραματικά σε σταθερά χαμηλά επίπεδα κατά τη βλαστητική ανάπτυξη. Η μεταγραφική επαγωγή από πουρίνες μέσω του μεταγραφικού παράγοντα UaY είναι μέτρια, ενώ η αμμωνία καταστέλλει τη μεταγραφή του μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από τον μεταγραφικό παράγοντα AreA. Η χρήση στελέχους που εκφράζει

5 τη χιμαιρική πρωτεΐνη Fcy6-GFP, επιβεβαίωσε τη χαμηλή της έκφραση στην πλασματική μεμβράνη κατά τη βλαστητική φάση της ανάπτυξης, αλλά αποκάλυψε υψηλά επίπεδα έκφρασης στα φυλετικά και αφυλετικά διαμερίσματα. Επιπλέον, η FcyB-GFP οδηγείται σε καταστροφή μέσω ενδοκύτωσης σε απόκριση σε αμμωνία ή παρουσία κυτοσίνης. Το προφίλ της έκφρασης του μεταφορέα Fcy6 υποστηρίζει ότι ο κύριος ρόλος του είναι η ανίχνευση κυτοσίνης και πουρινών. Τέλος, η ετερόλογη έκφραση του ομόλογου γονιδίου (Affcy6) του παθογόνου μύκητα Aspergillus fumigatus στον A. nidulans, έδειξε ότι το γονίδιο αυτό επιτελεί την ίδια λειτουργία και στον οργανισμό αυτό.