Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών Βιολογική Τεχνολογία

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών Βιολογική Τεχνολογία Πρότυπα έκφρασης των ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης (OB-R) και άμεσες in vitro επιδράσεις της ανασυνδυασμένης λεπτίνης σε ανθρώπινες αιματοποιητικές καρκινικές σειρές και σε κύτταρα ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία. Δερβίλη Ζωή ΠΑΤΡΑ 2009

2 Πρόλογος: Η ολοκλήρωση της μεταπτυχιακής μου εργασίας υπήρξε μια ιδιαίτερα επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία. Στο τέλος όμως αυτής της προσπάθειας ένιωσα ιδιαίτερη ικανοποίηση, γιατί μπόρεσα μέσα από αυτή να διακρίνω όλα εκείνα τα εφόδια με τα οποία με προίκισαν τα χρόνια της φοίτησής μου στο Πανεπιστήμιο Πατρών. 2

3 Την επιμονή λοιπόν που έμαθα να δείχνω, στην προσπάθειά μου να διευρύνω τις γνώσεις μου σε βάθος και με ακρίβεια, την οφείλω σε όλους τους καθηγητές μου, που αυτά τα χρόνια αποτέλεσαν για μένα πρότυπο επιστημόνων. Γι αυτό τους ευχαριστώ όλους. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την υπεύθυνη γι αυτή την εργασία, Καθηγήτρια κα Μουζάκη Αθανασία, τόσο για την ευκαιρία που μου έδωσε να συνεργαστώ μαζί της, όσο και για τις γνώσεις που μου προσέφερε. Ακόμη, την Λέκτορα του τμήματος Βιολογίας κα Κεφαλιακού Μαρίνα, καθώς και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του τμήματος Ιατρικής κα Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία, που αποτέλεσαν μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της ερευνητικής ομάδας, τον Τάσο Γεωργακόπουλο, την Κοκώνα Χατζαντώνη, την Άννα-Λίζα Δελαστίκ, τον Ιωάννη Παναγούλια, την Μαρία Ρόδη, την Παναγιώτα Σπαντιδέα για την άψογη συνεργασία, καθώς και όλα τα μέλη του εργαστηρίου για το υπέροχο κλίμα στον εργαστηριακό χώρο. Το μεγαλύτερο όμως ευχαριστώ το χρωστώ στους γονείς μου και τον Αποστόλη, που όλα αυτά τα χρόνια με στήριξαν σε όλες μου τις προσπάθειες και με βοήθησαν με τον δικό τους, μοναδικό τρόπο 3

4 Περιεχόμενα 1 Εισαγωγή Γενικά 1.2 Φυσική ανοσία 4

5 1.3 Επίκτητη ανοσία 1.4 Κύτταρα του Ανοσοποιητικού Συστήματος Λεμφική σειρά Μυελική σειρά 1.5 Κυτταροκίνες Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) Ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Ιντερλευκίνη-10 (IL-10) Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) Παράγοντας Νέκρωσης Όγκου-a (TNF-a) 1.6 Αιμοποιητικές ανωμαλίες Αιματοποίηση και βλαστοκύτταρα ή προγονικά κύτταρα Τα καρκινικά βλαστοκύτταρα στις μυελοειδείς ανωμαλίες Τα καρκινικά βλαστοκύτταρα στις λεμφοειδείς ανωμαλίες 1.7 Το μόριο της λεπτίνης Η ανακάλυψη του μορίου της λεπτίνης Ο ρόλος της λεπτίνης στο ανοσοποιητικό σύστημα Οι υποδοχείς της λεπτίνης Η εσωτερικοποίηση του υποδοχέα της λεπτίνης Τα βασικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος της λεπτίνης Ο JAK/STAT καταρράκτης μεταγωγής σήματος Το MAPK (mitogen-activated protein kinase) μονοπάτι μεταγωγής σήματος Σκοπός Υλικά και μέθοδοι 2.1 Ασθενείς και κυτταρικές σειρές Ασθενείς Κυτταρικές σειρές 2.2 Κυτταρικές καλλιέργειες 2.3 Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 2.4 Ποσοτικός προσδιορισμός κυτταροκινών με τη μέθοδο CBA 2.5 SDS-PAGE και Western Immunoblotting Ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Επώαση της μεμβράνης με αντισώματα Εμφάνιση της μεμβράνης με χρήση ECL Διαλύματα 3 Αποτελέσματα 3.1 Έκφραση των κυτταροκινών Παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ανασυνδυασμένης λεπτίνης 3.2 Έκφραση των OB-R ισομορφών Επίδραση της ανασυνδυασμένης λεπτίνης στην έκφραση του

6 γονιδίου της λεπτίνης 3.3 Έκφραση των JAK-2 και phosphojak-2 4 Συμπεράσματα-συζήτηση Βιβλιογραφία 73 Εισαγωγή 6

7 1.1 Γενικά: Η ανοσολογία είναι μια σχετικά νέα επιστήμη, η προέλευση της οποίας συνήθως αποδίδεται στον Edward Jenner, ο οποίος ανακάλυψε το 1796 τον εμβολιασμό και τις ευεργετικές του επιδράσεις. Οι ανακαλύψεις του Koch και άλλων μεγάλων μικροβιολόγων του 19ου αιώνα, επέκτειναν την στρατηγική του εμβολιασμού σε άλλες ασθένειες και έδωσαν ώθηση στην επιστήμη της ανοσολογίας. Η άμυνα έναντι παθογόνων στοιχείων, μεσολαβείται από την πρώιμη δράση της φυσικής ή εγγενούς μη ειδικής ανοσίας, και τη μετέπειτα δράση της επίκτητης ή ειδικής ανοσίας. 1.2 Φυσική ανοσία: Η φυσική ανοσία συμπεριλαμβάνει μηχανισμούς που προϋπάρχουν της μόλυνσης, έχουν δυνατότητα άμεσης δράσης έναντι των μικροβίων και λειτουργούν με τον ίδιο τρόπο κατά επαναλαμβανόμενων μολύνσεων. 7

8 Οι βασικοί μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας συμπεριλαμβάνουν: 1. Φυσιολογικούς και χημικούς φραγμούς, όπως τα επιθήλια και αντιμικροβιακά συστατικά που παράγονται σε επιθηλιακές επιφάνειες, το ph, και τη θερμοκρασία του σώματος. 2. Διαλυτούς παράγοντες, όπως συστατικά του συμπληρώματος και πρωτεΐνες οξείας φάσεως. 3. Κύτταρα, όπως φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα και μακροφάγα) και ΝΚ κύτταρα. 4. Μεταβιβαστές, όπως τις κυτταροκίνες που είναι πρωτεΐνες που ρυθμίζουν και συντονίζουν πολλές από τις δραστηριότητες των κυττάρων της φυσικής ανοσίας. Η φυσική ανοσία αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού και η παθογένεια των μικροβίων σχετίζεται ως ένα βαθμό με τη δυνατότητα προσπέλασης των μηχανισμών της. Οι μηχανισμοί αυτοί ενεργοποιούνται από δομές που είναι κοινές μεταξύ των διαφόρων μικροβίων και δεν διακρίνουν τις ιδιαίτερες διαφορές μεταξύ των ξένων συστατικών. Προστατεύουν τον οργανισμό από τα εξωγενή παθογόνα μέχρι να αναπτυχθούν και να δράσουν οι μηχανισμοί της ειδικής ανοσίας, επηρεάζουν την εξέλιξη της ειδικής ανοσιακής απάντησης και συμμετέχουν στην αντιμετώπιση του αντιγόνου κατά τη δραστική φάση της ειδικής ανοσιακής απάντησης. 1.3 Ειδική ή επίκτητη ανοσία: Σε αντίθεση με τη φυσική ανοσία, περισσότερο εξελιγμένοι αμυντικοί μηχανισμοί ενεργοποιούνται με την έκθεση σε παθογόνους παράγοντες, αυξάνοντας την έκταση και τη δυνατότητα της αμυντικής τους δράσης μετά από κάθε επιτυχή έκθεση σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Επειδή αυτή η μορφή ανοσίας αναπτύσσεται ως αντίδραση στη μόλυνση και προσαρμόζεται σε αυτή, ονομάζεται ειδική ή επίκτητη ανοσία. Η ειδική ανοσία διακρίνεται: Α) Στη χυμική ανοσία, που μεσολαβείται από τα μόρια του αίματος που εξυπηρετούν την ειδική αναγνώριση και την εξουδετέρωση των αντιγόνων, τα αντισώματα, που παράγονται από τα Β κύτταρα. Η χυμική ανοσία αποτελεί τον κατ εξοχήν προστατευτικό μηχανισμό έναντι εξωκυττάριων μικροβίων και των τοξινών τους. 8

9 Β) Στην κυτταρική ανοσία, που μεσολαβείται από τα Τ κύτταρα, τα οποία συνήθως συνεργάζονται με τα φαγοκύτταρα για την καταστροφή των μικροβίων. Η κυτταρική ανοσία εξυπηρετεί την καταστροφή ενδοκυττάριων μικροβίων, όπως είναι οι ιοί και ορισμένα βακτήρια, προάγοντας την ενδοκυττάρια καταστροφή τους ή τη λύση των μολυσμένων κυττάρων. Τα χαρακτηριστικά της ειδικής ανοσίας είναι: 1. Ειδικότητα: Εξασφαλίζει ειδική ανοσιακή απάντηση για κάθε αντιγόνο και για την ακρίβεια, για καθένα από τα επιμέρους δομικά στοιχεία των πολύπλοκων πρωτεϊνικών και πολυπεπτιδικών αντιγόνων. 2. Ετερογένεια: Επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστημα να αντιδρά σε μια τεράστια ποικιλία αντιγόνων, αφού αυτό διαθέτει ένα ρεπερτόριο λεμφοκυττάρων περίπου 109 διαφορετικών αντιγονικών ειδικοτήτων. 3. Μνήμη: Αυξάνει την έκταση και την ικανότητα της ανοσιακής απάντησης στην επαναλαμβανόμενη έκθεση στο αντιγόνο. 4. Αυτορύθμιση: Επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστημα να επανέρχεται σε κατάσταση ηρεμίας μετά από την αντιμετώπιση του κάθε αντιγονικού ερεθίσματος και το καθιστά ικανό να ανταπεξέρχεται αποτελεσματικότερα στα διαδοχικά ερεθίσματα που δέχεται ο οργανισμός. 5. Διάκριση ιδίου από ξένο ή ανοχή: Αποτρέπει την δυνητική αντίδραση έναντι κυττάρων και ιστών του ίδιου του οργανισμού και οδηγεί στην παραγωγή μιας τεράστιας ποικιλίας λεμφοκυτταρικών κλώνων ειδικών για τα ξένα αντιγόνα. Ο τρόπος δράσης της χυμικής και της κυτταρικής ανοσίας φαίνεται διαγραμματικά στο σχήμα που ακολουθεί: 9

10 Εικόνα 1. Tρόπος δράσης της κυτταρικής και της χυμικής ανοσίας. 1.4 Κύτταρα του Ανοσοποιητικού Συστήματος: Απαντώνται ως κυκλοφορούντα κύτταρα του αίματος ή της λέμφου, συναρθροισμένα στα λεμφικά όργανα ή διάσπαρτα σε όλους τους ιστούς του οργανισμού, εκτός από το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα. Αυτή η κατανομή, καθώς και η δυνατότητα να κυκλοφορούν μεταξύ αίματος, λέμφου και ιστών, είναι κριτικής σημασίας για την έγερση ανοσιακής απάντησης σε κάθε σημείο που δυνητικά αποτελεί πύλη εισόδου παθογόνων εξωγενών παραγόντων. Όλα τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος παράγονται στο μυελό των οστών από το πολυδύναμο αρχέγονο κύτταρο. 10

11 1.4.1 Λεμφική σειρά: Α. Λεμφοκύτταρα: Τα κύτταρα αυτά έχουν τον κύριο λόγο σε όλες τις επίκτητες ανοσοποιητικές απαντήσεις επειδή αναγνωρίζουν ειδικά συγκεκριμένα παθογόνα είτε βρίσκονται μέσα σε κύτταρα του ξενιστή, είτε έξω, στα υγρά του σώματος ή στο αίμα. Αποτελούν το 20-30% των εμπύρηνων κυττάρων του αίματος και με βάση το μέγεθός τους διακρίνονται στα μικρά και στα μεγάλα λεμφοκύτταρα: 1. Μικρά λεμφοκύτταρα: Η διάκριση των υποπληθησμών επιτυγχάνεται με βάση την αναγνώριση συγκεκριμένων συνδυασμών πρωτεϊνών (CD, clusters of differentiation), που εκφράζουν στη μεμβράνη τους. Οι συνδυασμοί αυτοί χαρακτηρίζουν το στάδιο διαφοροποίησης και τις διάφορες λειτουργίες που εξυπηρετούν οι συγκεκριμένες ομάδες λεμφοκυττάρων. Β κύτταρα: Παράγονται και ωριμάζουν στο μυελό των οστών και ευθύνονται για την παραγωγή των ανοσοσφαιρινών. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Β λεμφοκυττάρων είναι μόρια ανοσοσφαιρινών συνδεδεμένα στη μεμβράνη τους. Η αλληλεπίδραση των αντιγόνων με τις μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες, οδηγεί στην ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων και τη διαφοροποίησή τους σε πλασματοκύτταρα, που εκκρίνουν διαλυτές ανοσοσφαιρίνες, τα αντισώματα. Τ κύτταρα: Παράγονται στο μυελό των οστών και στη συνέχεια μεταναστεύουν στο θύμο και ωριμάζουν. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων (TCRs, T Cell Receptors), είναι ειδικά μεμβρανικά μόρια, διαφορετικά αλλά δομικά ανάλογα με τις ανοσοσφαιρίνες. Τα Τ λεμφοκύτταρα δεν αναγνωρίζουν διαλυτά αντιγόνα, αλλά μόνο αντιγονικά πεπτίδια που παρουσιάζονται στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, συνδεδεμένα με πρωτεϊνες του Μείζωνος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (MHC). Οι σημαντικότεροι υποπληθυσμοί στους οποίους διακρίνονται είναι: i) Βοηθητικά: Κατά κανόνα φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD4 και απαντούν στον αντιγονικό ερεθισμό με έκκριση κυτταροκινών που προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση τόσο των ίδιων των Τ λεμφοκυττάρων, όσο και των Β λεμφοκυττάρων και των μακροφάγων. Οι κυτταροκίνες προκαλούν επίσης τη συνάρθροιση και 11

12 ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων που συμμετέχουν στη διεργασία της φλεγμονής. ii) Κυτταροτοξικά: Χαρακτηρίζονται από την παρουσία του μορίου CD8 στην επιφάνειά τους και είναι ικανά να προκαλούν την άμεση λύση των κυττάρων που παράγουν ξένα αντιγόνα. iii) Κατασταλτικά: Η φύση και η λειτουργία των κατασταλτικών λεμφοκυττάρων δεν είναι πλήρως διευκρινισμένη και είναι αμφίβολο αν αποτελούν διακεκριμένο υποπληθυσμό Τα λεμφοκυττάρων. Ίσως πρόκειται για κύτταρα που κάτω από διαφορετικές συνθήκες λειτουργούν ως κατασταλτικά, αναστέλλοντας την ανοσιακή απάντηση. Κύτταρα Μνήμης: Μερικά από τα Β και τα Τ λεμφοκύτταρα, διαφοροποιούνται σε λεμφοκύτταρα μνήμης μετά την επαφή τους με το αντιγόνο. Αυτά επιβιώνουν για μεγάλα χρονικά διαστήματα χωρίς να απαιτείται η παρουσία αντιγονικού ερεθίσματος και βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας, μέχρι να ξαναέλθουν σε επαφή με το αντιγόνο. 2. Μεγάλα Λεμφοκύτταρα ή Φυσικά Κυτταροκτόνα (ΝΚ): Η έκφραση της δράσης αυτής της ομάδας λεμφοκυττάρων δεν προϋποθέτει ειδική αναγνώριση του αντιγόνου και δεν συνοδεύεται από ανάπτυξη μνήμης. Γι αυτό το λόγο μπορούν να καταταχθούν στη φυσική ανοσία. Λειτουργούν με στόχο τη λύση κυττάρων διαφόρων όγκων ή κυττάρων μολυσμένων με ιούς χωρίς εμφανή αντιγονικό ερεθισμό. Επίσης, μεσολαβούν την εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταροτοξικότητα, δηλαδή τη λύση κυττάρων καλυμμένων με IgG Μυελική σειρά: Β. Μονοπύρηνα Φαγοκύτταρα: Πρόκειται για κύτταρα μυελικής προέλευσης με κύρια λειτουργία τους τη φαγοκυττάρωση. Τα μακροφάγα εξυπηρετούν διαφορετικές λειτουργίες στους διάφορους ιστούς και έχουν ανάλογη μορφολογία και ονομασία (κύτταρα Kupffer, μικρογλοιακά κ.α.), ενώ εξελίσσονται σε διαφορετικούς τύπους μετά την ενεργοποίησή τους (επιθηλιοειδή, πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα κ.α.). Η ικανότητά τους να φαγοκυτταρώνουν ξένες ουσίες (μικρόβια, μακρομόρια), τα καθιστά τον κυριότερο 12

13 κυτταρικό μεσολαβητή της φυσικής ανοσίας. Πέρα από αυτό όμως, συμμετέχουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα στη φάση της αναγνώρισης της ειδικής ανοσιακής απάντησης, υφίστανται την επίδραση των κυτταροκινών που εκκρίνουν τα Τ βοηθητικά κύτταρα στη φάση της ενεργοποίησης, με αποτέλεσμα να διεγείρονται και να εκδηλώνουν αποτελεσματικότερα τη φαγοκυτταρική και κυτταροκτόνο δράση τους. Ταυτόχρονα, εκκρίνουν πρωτεϊνικούς και αυξητικούς, προκαλούν άμεσα την καταστροφή παθογόνων που έχουν καλυφθεί (οψωνοποιηθεί) από τα αντισώματα, ενώ έχουν τη δυνατότητα να φαγοκυτταρώνουν νεκρά ή αλλοιωμένα κύτταρα του ίδιου του οργανισμού. Γ. Κοκκιοκύτταρα ή Κύτταρα Φλεγμονής: Συμμετέχουν ενεργά στη δραστική φάση της ανοσιακής απάντησης, διαδραματίζοντας καθοριστικό ρόλο στις διεργασίες της φλεγμονής και γενικότερα της φυσικής ανοσίας. Αποτελούν το 50-70% των κυττάρων του αίματος απ όπου μεταναστεύουν στους ιστούς κατά την εξέλιξη τυχόν ιστικής βλάβης ή λοίμωξης, και διακρίνονται στις παρακάτω ομάδες: Ουδετερόφιλα: Αποτελούν το μεγαλύτερο πληθυσμό των κυκλοφορούντων κοκκιοκυττάρων, απαντούν ταχύτατα στα διάφορα χημειοτακτικά ερεθίσματα, ενώ στους ιστούς ενεργοποιούνται υπό την επίδραση των κυτταροκινών που παράγονται από τα μακροφάγα και εκδηλώνουν φαγοκυτταρική δραστηριότητα. Ηωσινόφιλα: Διαθέτουν φαγοκυτταρική ικανότητα, και έχουν ειδικότητα στην καταστροφή μικροοργανισμών (παράσιτα) που είναι ανθεκτικοί στα λυτικά ένζυμα των ουδετερόφιλων και των μακροφάγων. Βασεόφιλα: Τα βασεόφιλα δεν έχουν φαγοκυτταρική ικανότητα, αλλά εκδηλώνουν τη δράση τους με την έκκριση δραστικών ουσιών που περιέχονται στα κυτταροπλασματικά τους κοκκία για τη μεσολάβηση της άμεσης υπερευαισθησίας. Δ. Ιστιοκύτταρα: Αποτελούν κύτταρα της μυελικής σειράς, που εγκαταλείπουν το μυελό των οστών ως αδιαφοροποίητα πρόδρομα κύτταρα. Ανευρίσκονται σε διάφορους ιστούς όπου και διαφοροποιούνται μετά τη μετανάστευσή τους και διαθέτουν μεγάλο αριθμό κυτταροπλασματικών κοκκίων που περιέχουν ισταμίνη και άλλες δραστικές ουσίες που αποτελούν μεσολαβητές της αλλεργικής φλεγμονής. 13

14 Ε. Δενδριτικά: Πρόκειται για μια ετερογενή ομάδα αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων που προέρχονται από ένα κοινό προγονικό κύτταρο και αντιπροσωπεύουν διαφορετικές εξελικτικές βαθμίδες μιας ενιαίας κυτταρικής σειράς. Το κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι εκφράζουν στην επιφάνειά τους μεγάλο αριθμό MHC μορίων κλάσεως II, με αποτέλεσμα να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιγονοπαρουσίαση και στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Τα δενδριτικά κύτταρα ανευρίσκονται στα μη λεμφικά όργανα και τους ιστούς, στα όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος, στο αίμα και στη λέμφο. Στα μη λεμφικά δενδριτικά κύτταρα περιλαμβάνονται τα κύτταρα του Langerhans της επιδερμίδας και τα διάμεσα δενδριτικά κύτταρα διαφόρων οργάνων (π.χ. καρδιά, πνεύμονες, νεφροί, γαστρεντερικός σωλήνας). Η εικόνα που ακολουθεί, παρουσιάζει συνοπτικά τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και την προέλευσή τους. Εικόνα 2. Κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. 1.5 Κυτταροκίνες: 14

15 Οι κυτταροκίνες αποτελούν ετερογενές μείγμα μικρομοριακών (ΜΒ<30 ή 80 kda) πρωτεϊνών, οι οποίες παράγονται από διάφορα κύτταρα του οργανισμού σε απάντηση επαγωγικών ερεθισμάτων και διεγείρουν ή αναστέλλουν τη λειτουργία των κυττάρων, δρώντας επ αυτών κατά ενδοκρινή ή παρακρινή τρόπο. Οι κυτταροκίνες προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς μεγάλης συγγένειας που βρίσκονται στη μεμβράνη των κυττάρων-στόχων, προκαλώντας βιοχημικές αλλαγές που είναι υπεύθυνες για την αλλοίωση της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων αυτών. Οι κυτταροκίνες μπορούν να διακριθούν σε Th1 και Th2, ανάλογα με τον κυτταρικό πληθυσμό Τ βοηθητικών κυττάρων από τον οποίο εκφράζονται και εκκρίνονται. Τα Th1 Τ λεμφοκύτταρα παράγουν IL-2, IFN-γ, TFN-β, IL-3, GM-CSF και TNF-α. Αυτά τα κύτταρα επάγουν την οψωνοποίηση, την ενεργοποίηση των μακροφάγων και την καθυστερημένου τύπου αντίδραση υπερευαισθησίας. Τα Τh2 Τ λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζονται από την παραγωγή ΙL-4, ΙL-5, ΙL-6, ΙL-9, ΙL-10, ΙL-13, GM-CSF και ΤNF-α. Τα Th2 κύτταρα συμβάλλουν στην χυμική ανοσία, στην ενεργοποίηση της αύξησης και διαφοροποίησης των μαστοκυττάρων και των ηωσινόφιλων και στην παραγωγή IgA αντισωμάτων. Τα Th1 κύτταρα σχετίζονται με την κυτταρική ανοσία και τα Th2 κύτταρα με την παραγωγή αντισωμάτων και τις αλλεργικές αντιδράσεις. Οι Th1 κυτταροκίνες παρεμποδίζουν την δράση των Th2 κυτταροκινών και το αντίθετο. Οι κυτταροκίνες ελέγχουν την ένταση και τη διάρκεια της ανοσοαπόκρισης με τη διέγερση ή την αναστολή της ενεργοποίησης, του πολλαπλασιασμού ή και της διαφοροποίησης διαφόρων κυττάρων, καθώς επίσης και με το να ρυθμίζουν την έκκριση αντισωμάτων ή άλλων κυτταροκινών. Οι κυτταροκίνες που εκκρίνονται από 15

16 ένα λεμφοκύτταρο όταν αυτό ενεργοποιηθεί, μπορούν να επηρρεάσουν και να ενεργοποιήσουν ένα ολόκληρο δίκτυο αλληλεπιδρώντων κυττάρων, όπως φαίνεται στην Εικόνα 3. Εικόνα 3. Οι κυτταροκίνες σαν κρίκοι επικοινωνίας των κυττάρων εντός του ανοσοποιητικού συστήματος και μεταξύ αυτών και άλλων κυττάρων. Ο τρόπος δράσης των κυτταροκινών που μελετήθηκαν στο πειραματικό κομμάτι της εργασίας, παρατίθενται πιο κάτω: Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) Η IL-2 είναι η κυτταροκίνη, η οποία κατεξοχήν ευθύνεται για τη μετάπτωση των Τ λεμφοκυττάρων από τη G1 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου. Παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα, και σε μικρότερες ποσότητες από τα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα. Λειτουργεί ως αυτοκρινής ή παρακρινής διεγέρτης του πολλαπλασιασμού των Τ και Β λεμφοκυττάρων. Επάγει την παραγωγή άλλων κυτταροκινών, κυρίως IFN-γ και IL-1, από τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα και εμφανίζει συνεργική δράση με άλλες, αναφορικά με τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, προς κύτταρα που εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνη. Αυξάνει τη δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων και την κυτταροτοξική ικανότητα των μακροφάγων. Φαίνεται να έχει έμμεση δράση στη φλεγμονή μέσω της επαγωγής της σύνθεσης IFN-γ και IL Ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Κύρια κυτταρική πηγή της IL-4 είναι ο υποπληθυσμός Th2 των CD4+ Τα λεμφοκυττάρων, επί των οποίων, καθώς και επί των βασεόφιλων κυττάρων των ιστών, ασκεί αυτοκρινή δράση αυξητικού παράγοντα. Στην πραγματικότητα, η παραγωγή της IL-4 αποτελεί κριτήριο κατάταξης των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων στον υποπληθυσμό των Th2, ενώ το αντίστοιχο κριτήριο κατάταξης στον υποπληθυσμό Th1 είναι η παραγωγή της IFN-γ. Βασική της λειτουργία είναι η ρύθμιση των αλλεργικών αντιδράσεων. Επάγει την ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, στα οποία αυξάνει την έκφραση της κλάσης ΙΙ HLA αντιγόνων, και αναστέλλει την ενεργοποίηση των μακροφάγων. 16

17 1.5.3 Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Η IL-6 συντίθεται από τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τους ινοβλάστες και άλλα κύτταρα, υπό την επίδραση της IL-1 και σε μικρότερο βαθμό του TNF. Πρόκειται για τον κυριότερο αυξητικό παράγοντα των ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων, στα οποία δρα κατά το απώτερο στάδιο διαφοροποίησής τους, καθώς και άλλων λεμφικών και μυελικών κυττάρων. Η κυριότερη όμως δράση της σε σχέση με την παθογένεια της σήψης, είναι η διέγερση των ηπατοκυττάρων για την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης. Η κατασταλτική δράση της IL-6 στη φλεγμονή ενδέχεται να οφείλεται και στην καταστολή παραγωγής άλλων κυτταροκινών, όπως του TNF. Η ανοσοκατασταλτική και αντιφλεγμονώδης δράση της πιθανόν να σχετίζεται με τη ρυθμιστική της επίδραση στη λειτουργία του υποθαλαμοϋποφυσιακού άξονα Ιντερλευκίνη-10 (IL-10) Η IL-10 παράγεται από τα Th2 βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, καθώς και από μερικά ενεργοποιημένα μακροφάγα. Η βιολογική της δράση έγκειται στην αναστολή της παραγωγής κυτταροκινών (TNF, IL-1, IL-12, χημειοκίνες) από τα μακροφάγα και στην αναστολή των επικουρικών λειτουργειών των μακροφάγων κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) Παράγεται από τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα που εκκρίνουν IL-2 και από όλα σχεδόν τα CD8+ Τ λεμφοκύτταρα. Μικρό μέρος της παραγωγής της αποδίδεται στα ΝΚ κύτταρα. Τα ΝΚ κύτταρα αντιπροσωπεύουν μια ανεξάρτητη από τα Τα λεμφοκύτταρα οδό ενεργοποίησης των μακροφάγων και κατά συνέπεια η παραγωγή IFN-γ από τα ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα αποτελεί το πρωταρχικό γεγονός κινητοποίησης του πλέγματος των κυτταροκινών μετά την έκθεση του οργανισμού σε βακτηριακά προϊόντα. In vivo, η βασική παραγωγή της IFN-γ είναι εξαιρετικά χαμηλή. Η IFN-γ, είναι ο κυριότερος ενεργοποιητής των μακροφάγων. Η παρουσία της εξασφαλίζει τις συνθήκες που απαιτούνται για την επαγωγή της ενεργοποίησης των μακροφάγων από τα Τ λεμφοκύτταρα. Είναι επίσης ενεργοποιητής ενδοθηλιακών κυττάρων. Προάγει την προσκόλληση των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων στο ενδοθήλιο και επιφέρει μορφολογικές αλλοιώσεις που 17 επιτρέπουν την εξαγγείωση των

18 λεμφοκυττάρων. Επίσης, επάγει τη σύνθεση, από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, παραγόντων της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος Παράγοντας Νέκρωσης Όγκου-α (TNF-a) Ο γενετικός τόπος του ΤNF-α (και του TNF-β), εδράζεται, στενά συνδεδεμένος, εντός του MHC. Ο TNF-α παράγεται από τα ενεργοποιημένα από τους πολυσακχαρίτες (LPS) των Gram αρνητικών βακτηρίων μακροφάγα, τα Τ και τα ΝΚ κύτταρα. Αν και οι ΤNF (α και β) παράγονται ως εκκριτικές πρωτεϊνες, μεμβρανικές μορφές τους έχουν απομονωθεί και χαρακτηρισθεί και πιθανόν να παίζουν σημαντικό ρόλο στις διακυτταρικές κυτταροτοξικές αλληλεπιδράσεις. Η βιολογική του δράση είναι συνάρτηση της ποσότητας στην οποία παράγεται. Σε μικρές συγκεντρώσεις λειτουργεί ως παρακρινής ή αυτοκρινής ρυθμιστής των λευκοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυξάνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης στο ενδοθήλιο, ενεργοποιεί τα πολυμορφοπύρηνα προς καταστροφή των μικροβίων και διεγείρει την παραγωγή κυτταροκινών όπως της IL-1, IL-6, χημειοκινών, αλλά και του ίδιου του TNF, από τα μονοπύρηνα. Στην περίπτωση που το ερέθισμα παραγωγής του TNF-α είναι ισχυρότερο, παρατηρείται αύξηση της παραγωγής του και δίοδός του στο αίμα, με αποτέλεσμα την πρόκληση συστηματικών εκδηλώσεων. Περαιτέρω αύξηση έχει ως αποτέλεσμα τοξικά φαινόμενα, όπως μείωση της συσταλτικότητας του μυοκαρδίου κ.α. 1.6 Αιμοποιητικές ανωμαλίες Αιματοποίηση και βλαστοκύτταρα ή προγονικά κύτταρα: Η αιματοποίηση είναι μία ευαίσθητα ρυθμιζόμενη διαδικασία, η οποία καταλήγει στην παραγωγή ποικίλων τύπων κυττάρων του αίματος με λειτουργίες που εκτείνονται από τη μεταφορά οξυγόνου μέχρι την ανοσία. Η συντήρηση αυτού του συστήματος απαιτεί τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSC) στο μυελό των οστών που οδηγούν στη δημιουργία καθορισμένων προγονικών κυττάρων, τα οποία με τη σειρά τους διαιρούνται και διαφοροποιούνται σε λειτουργικά εξειδικευμένα κύτταρα. Τα HSC είναι ενήλικα βλαστοκύτταρα, ικανά να υποστούν αυτο-ανανέωση, ή απόπτωση, και να δώσουν προγονικά κύτταρα για όλες τις αιμοποιητικές σειρές. Καθώς τα HSC διαιρούνται, πρώτα σχηματίζουν κοινούς λεμφοειδείς και μυελοειδείς προγόνους, που διαφοροποιούνται περαιτέρω σε Β, Τ, ή ΝΚ κύτταρα στη λεμφοειδή σειρά ή σε προγόνους κοκκιοκυττάρων/ μονοκυττάρων, μεγακαρυοκυττάρων και ερυθροκυττάρων 18

19 στη μυελοειδή σειρά. Τα ανθρώπινα HSC χαρακτηρίζονται από τυπικά πρότυπα πρωτεϊνικής έκφρασης. Είναι CD34+ και CD38-. Η αιματοποίηση εξαρτάται από το μικροπεριβάλλον που παρέχεται στις κοιλότητες του μυελού των οστών. Τα HSC και οι προγόνοι τους εμπεριέχονται σε ένα πολύπλοκο δίκτυο μη αιμοποιητικών κυττάρων, όπως είναι οι ινοβλάστες, οι οστεοβλάστες και τα λιπώδη κύτταρα, τα οποία εκτός του ότι παρέχουν μηχανική αντοχή είναι επίσης πηγή παραγόντων απαραίτητων για την επίτευξη σωστής αιματοποίησης. Δυσλειτουργίες που επηρεάζουν τα μη αιμοποιητικά κύτταρα είναι πιθανό να οδηγήσουν σε αποτυχία αιματοποίησης με συνέπεια η τελευταία να μεταφερθεί σε άλλα όργανα όπως το ήπαρ ή ο σπλήνας (M. F. Fey, 2007). Λεπτομερής χαρακτηρισμός των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων, των καθορισμένων αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, και των διαφοροποιημένων κυττάρων του αίματος θέτουν τα θεμέλια για την κατανόηση των αιμοποιητικών ανωμαλιών, την προέλευση των κυττάρων τους, και τα χαρακτηριστικά των καρκινικών βλαστοκυττάρων (Reya T., 2001). Μάλιστα, η σύγχρονη ιδέα των ανθρώπινων καρκινικών βλαστοκυττάρων αρχίζει από μελέτες οξείας μυελογενούς λευχαιμίας (Lapidot T., et al., 1994). Η ιδέα του καρκινικού βλαστοκυττάρου βασίζεται στην ιδέα ότι οι όγκοι ενός συγκεκριμένου ιστού εμφανίζονται συχνά «να προσπαθούν» να επαναλάβουν την κυτταρική ετερογένεια που βρίσκεται στους αρχικούς ιστούς, και έτσι υπάρχουν κύτταρα στον όγκο που μοιάζουν με βλαστοκύτταρακαι δίνουν τους ποικίλους τύπους κυττάρων. Μια θεμελιώδης δοκιμή για αυτήν την υπόθεση είναι εάν τα κύτταρα όγκων μπορούν να χωριστούν σε εκείνα που έχουν τη δυνατότητα να αναπαραγάγουν τον όγκο, και εκείνα που δεν κατέχουν αυτήν την δυνατότητα. Αυτή η κυτταρική ιεραρχία έχει σαφώς καταδειχθεί στην οξεία μυελογενή λευχαιμία, όπου κάποιες AMLs κατέχουν κύτταρα με ένα μοναδικό ανοσοφαινότυπο που είναι σε θέση να αρχίσουν τα λευχαιμίες στα ανοσοανεπαρκή ποντίκια όπου τα περισσότερα κύτταρα είναι ανίκανα να αρχίσουν μια λευχαιμία (Bonnet D., 1997). Επιπλέον, τα κύτταρα που αρχίζουν λευχαιμίες δίνουν επίσης κύτταρα που έχουν χάσει την δραστηριότητα έναρξης όγκου και επαναλαμβάνουν έτσι την κυτταρική ετερογένεια που βρίσκεται στον αρχικό όγκο. Η επίδειξη αυτού του τύπου λειτουργικής ιεραρχίας και κυτταρικής ετερογένειας προσδιορίζει την παρουσία ενός λευχαιμικού βλαστοκυττάρου Τα καρκινικά βλαστοκύτταρα στις μυελοειδείς ανωμαλίες: 19

20 Τα φυσιολογικά αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα έχουν ιδιότητες αυτο-ανανέωσης, οι οποίες χάνονται καθώς τα κύτταρα εξειδικεύονται κατά τη διάρκεια της μυελοειδούς ανάπτυξης, δίνοντας προορισμένα προγονικά κύτταρα που ενώ παραμένουν πολυδύναμα, δεν κατέχουν πλέον τις μακροπρόθεσμες ιδιότητες αυτο-ανανέωσης (Εικόνα 4). Εικόνα 4: Φυσιολογική αιμοποιητική ανάπτυξη και AML. Οι τρέχουσες μελέτες προτείνουν ότι τα ανθρώπινα HSC βρίσκονται σε έναν πληθυσμό κυττάρων που είναι CD34+/CD38, και ότι τα CD34+CD38+ κύτταρα περιέχουν πληθυσμούς που είναι καθορισμένοι να δώσουν συγκεκριμένες μυελοειδείς μοίρες. Οι αρχικές μελέτες που κατέδειξαν την παρουσία βλαστοκυττάρων οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) σκιαγράφησαν τον ανοσοφαινότυπο της κυτταρικής επιφάνειας ως CD34+/CD38, προτείνοντας έτσι ομοιότητες μεταξύ κανονικών και AML βλαστοκυττάρων. Περαιτέρω χαρακτηρισμός έχει δείξει ότι σε πολλές περιπτώσεις τα AML βλαστικά κύτταρα εκφράζουν επίσης αντιγόνα όπως CD123 (IL3R) που δεν απαντώνται κανονικά στα ανθρώπινα HSC (Jordan CT., 2002). Επίσης, τα πειραματικά στοιχεία προτείνουν ότι τα AML βλαστοκύτταρα μπορούν να αποκριθούν 20

21 διαφορετικά σε συγκεκριμένα μικρά μόρια (αναστολείς NFKB και παρθενολίδη) παρέχοντας στοιχεία ύπαρξης διαφορών μεταξύ των κανονικών και των ανθρώπινων βλαστοκυττάρων που μπορούν να δημιουργηθούν για θεραπευτικούς σκοπούς (Guzman ML., 2005). Λεπτομερείς μελέτες καθορισμένων με σαφήνεια προτύπων AML καταδεικνύουν επίσης φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ των κανονικών και ανθρώπινων βλαστοκυττάρων, ενισχύοντας την υπόθεση τα AML βλαστοκύτταρα να έχουν φαινοτυπικές, και ενδεχομένως λειτουργικές διαφορές που να μπορούν να χειραγωγηθούν με σκοπό τη στόχευση συγκεκριμένων AML βλαστοκυττάρων. Μελέτες σε χρόνιες μυελογενείς λευχαιμίες (CML) παρέχουν επίσης πληροφορίες ως προς τις ιδιότητες των ανθρώπινων λευχαιμικών βλαστοκυττάρων. Υποστηρίζεται ευρέως ότι το καρκινικό βλαστοκύτταρο στη χρόνια φάση της CML είναι παρόμοιο, εάν όχι ίδιο, με το φυσιολογικό HSC. Μια σχετική ερώτηση είναι ποια κύτταρα αποτελούν το κύτταρο προέλευσης της λευχαιμίας και τα λευχαιμικά βλαστοκύτταρα. Δεδομένου ότι τα κανονικά HSC κατέχουν απεριόριστες ιδιότητες αυτο-ανανέωσης, και η χρόνια φάση της CML αρχίζει από τα HSC, είναι σαφές ότι κανονικά HSC μπορεί να δώσουν μυελοειδείς λευχαιμίες. Εντούτοις, η ερώτηση προκύπτει ως προς το εάν περισσότερο εξειδικευμένα μυελοειδή κύτταρα μπορούν να δώσουν AML (Εικόνα 4). Θα μπορούσε να φανεί, βασιζόμενο σε μελέτες CML, ότι τα λευχαιμικά βλαστοκύτταρα μπορούν να έχουν ένα ανοσοφαινότυπο πιο σύμφωνο με τα εξειδικευμένα μυελοειδή κύτταρα, εντούτοις αυτές οι λευχαιμίες προέρχονται πιθανόν από ένα HSC που έχει ελαττωματικό το BCRABL ογκογονίδιο. Μπορεί η AML να αρχίσει άμεσα από ένα καθορισμένο προγονικό μυελοειδές κύτταρο; Οι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι λευχαιμίες μπορούν να αρχίσουν από τους κοινούς μυελοειδές προγόνους ή τους προγόνους των μακροφάγων κοκκιοκυττάρων (Krivtsov AV., 2006, Cozzio A., 2003). Εντούτοις, μόνο ορισμένα ογκογονίδια όπως εκείνα που περιλαμβάνουν το γονίδιο MLL στο χρωμόσωμα 11q23 έχουν αυτήν την δραστηριότητα ενώ άλλα, όπως το BCR-ABL δεν έχουν αυτή την ικανότητα (Huntly BJ, 2004). Το γεγονός ότι η λευχαιμία μπορεί να αρχίσει από ένα κύτταρο που στερείται την εγγενή αυτο-ανανέωση παρέχει μια ευκαιρία να καθοριστούν τα μονοπάτια που είναι αρμόδια για αυτές τις ιδιότητες. Οι μελλοντικές μελέτες θα καθορίσουν εάν η AML μπορεί να αρχίσει από τα ανθρώπινα προγονικά 21

22 μυελοειδή κύτταρα, και επιπλέον εάν οι λευχαιμίες που αρχίζουν από κύτταρα διαφορετικής προέλευσης έχουν διαφορετική θεραπευτική έκβαση Τα καρκινικά βλαστοκύτταρα στις λεμφοειδείς ανωμαλίες: Η ικανότητα αυτο-ανανέωσης στους περισσότερους ιστούς χάνεται καθώς τα κύτταρα προχωρούν μέσω των φυσιολογικών σταδίων διαφοροποίησής τους (παραδείγματος χάριν, τα κύτταρα αίματος της μυελοειδούς σειράς πέρα από το επίπεδο του αιμοποιητικού βλαστοκυττάρου δεν έχουν πλέον την ικανότητα αυτοανανέωσης). Μια αξιοσημείωτη εξαίρεση στη συνδεδεμένη με τη διαφοροποίηση απώλεια αυτο-ανανέωσης είναι το λεμφικό σύστημα, όπου η ικανότητα αυτοανανέωσης συντηρείται μέχρι το στάδιο λεμφοκυττάρων μνήμης, προκειμένου να διατηρηθεί ισόβια ανοσομνήμη (Fearon DT., 2001, Luckey CJ., 2006). Η σωματική υπερμετάλλαξη χρησιμεύει ως ένας δείκτης για το στάδιο της διαφοροποίησης στο οποίο προκύπτουν οι ανωμαλίες των Β κυττάρων. Σε αντίθεση με τις μυελοειδείς ανωμαλίες (Jones RJ., 2004), αλλά σε συμφωνία με τη συντηρημένη ικανότητα αυτοανανέωσης της σειράς, τα πρότυπα μετάλλαξης των ανοσοσφαιρνών (Ig) δείχνουν ότι οι ανωμαλίες των Β κυττάρων μπορούν να προκύψουν από κύτταρα σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησης των Β κυττάρων (Εικόνα 5). 22