Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης

Transcript

1 Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης 1

2 Η γονιδιακή έκφραση μπορεί να ελέγχεται σε πολλά (6) επίπεδα 1-6 επίπεδα ελέγχου 2 Μεταγραφή και ιστοειδική έκφραση

3 Μεταγραφή και ιστοειδική έκφραση 1. Διαφοροποιημένα κύτταρα περιέχουν το ίδιο γονιδίωμα (DNA ), αλλά διαφέρουν στην έκφραση mrna και πρωτεΐνών (ιστο-ειδική έκφραση) 3 μικροσυστοιχίες

4 Aνάλυση μικροσυστοιχειών 4 το προφίλ μπορεί να αντιστραφεί

5 2. Το προφίλ έκφρασης ενός διαφοροποιημένου πυρήνα μπορεί να ανα-προγραμματισθεί από το περιβάλλον (κυτταροπλασματικό ή/και εξωκυττάριο) 5 το προφίλ μπορεί να μεταβάλλεται

6 3. Λειτουργικά όμοια κύτταρα ενός πολυκύτταρου οργανισμού μπορεί να αλλάζουν πρότυπο έκφρασης σε διάφορετικές συνθήκες, και ανάλογα, μονοκύτταροι οργανισμοί αλλάζουν πρότυπο έκφρασης αποκρινόμενοι σε αλλαγές του περιβάλλοντος Η έκφραση των πρωτεϊνών που καταβολίζουν λακτόζη στην E.coli επάγονται όταν στο περιβάλλον υπάρχει λακτόζη (και λείπει γλυκόζη). Θα συναντήσετε πολλές εκατοντάδες τέτοια παραδείγματα ρύθμισης Άμεση και μακροσκοπική ανίχνευση της β-γαλακτοσιδάσης στο εργαστήριο Οπερόνιο 6

7 Α. Tο οπερόνιο λακτόζης + lactose -> ON RNA pol. p o RNA starts z y a - lactose -> ΟFF RNA p: promoter o: operator galactosidase permease Οπερόνιο transacetylase Τι εξυπηρετεί το οπερόνιο?? Θυμηθείτε πώς μεταφράζεται ένα πολυκιστρονικό mrna!! 7 Lac repr. Cap

8 Ένας καταστολέας (lac repressor) και ένας ενεργοποιητής (CAP activator) καθορίζουν τη συχνότητα μεταγραφικής έναρξης RNA pol. Cap RNA starts i p o z y a CAP Lac Repressor galactosidase permease RNA transacetylase Cap: Catabolite Activator Protein Ενεργοποιητής καταβολικών οδών θέση δέσμευσης Cap lac I: lac Repressor (καταστολέας) lac operator (θέση δέσμευσης lac repressor) 8 Στερεοχημική παρεμπόδιση?

9 Aπουσία λακτόζης o καταστολέας lac (lac i) δεσμεύεται στο χειριστή (lac o) και παρεμποδίζει τη λειτουργία της RNA πολυμεράσης RNA pol. Στερεοχημική παρεμπόδιση δέσμευσης της Pol, ή της λειτουργίας της??? OFF - lactose i p o z y a Εξιδικευμένη πρόσδεση στο DNA απουσία λακτόζης Lac Repressor Παρουσία λακτόζης???? 9 DNA-aa interaction

10 Θυμηθείτε!! Η εξειδίκευση της δέσμευσης πρωτεϊνών στο DNA συνίσταται στην αναγνώριση - και ανάπτυξη δεσμών υδρογόνου- μεταξύ συγκεκριμένων βάσεων και αμινοξέων Η έλικα-στροφή-έλικα είναι ένα κοινό,, αλλά όχι το μοναδικό, μοτίβο ειδικής αναγνώρισης DNA. 10 Διμερής μορφή

11 Η διμερής μορφή μπορεί να αναγνωρίζει παλίνδρομες αλληλουχίες DNA 11 Lac repressor- lac operator

12 Δέσμευση του lac καταστολέα (lac i) στον lac χειριστή (lac o) Η μεγάλη C-περιοχή διμερίζει την πρωτεΐνη και η μικρή Ν-περιοχή αναγνωρίζει και δεσμεύεται στο DNA απουσία λακτόζης 5 TGTGTCGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACA 3 3 ACACAGCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT 5 Χ Χ Ο καταστολέας lac λειτουργεί ως μοριακός διακόπτης!! Η σταθερά διάστασης (Κd) του συμπλόκου καταστολέα-dna είναι ~10-13 Μ DNA-Pr DNA + Pr Kd = [DNA] [Pr] / [DNA-Pr] 12 Σύμπλοκο καταστ. -λακτόζης

13 Ο προσδέτης (λακτόζη/αλλολακτόζη) αποδεσμεύει τον καταστολέα από το DNA RNA pol. Στερεοχημική παρεμπόδιση OFF - lactose i p o z y a Lac Repressor ON + lactose i p o z y a RNA Lac Repressor Σύμπλοκο καταστολλέα - λακτόζης 13 camp

14 Κυκλικά νουκλεοτίδια συντίθενται από τριφωσφορικούς νουκλεοζίτες και λειτουργούν ως αγγελιοφόρα μόρια ATP Αδένυλ-κυκλάση φωσφοδιεστεράση ΑΜΡ PPj + camp 14 Cap

15 H δέσμευση της RNA pol. διεγείρεται από αλληλεπιδράσεις με την Cap (catabolite activator protein, ενεργοποιητής καταβολικών γονιδίων) Cap RNA pol. +Gl Glucose p o z y a low camp CAP Cap Συνεργατική σχέση Cap και RNA pol - Glucose high camp CAP p o z y a RNA 15 Cap structure

16 Η πρωτεΐνη CAP 1 ο ) δεσμέυει camp, 2 ο )δεσμεύεται μ στο DNA, 3 ο ) αλληλεπιδρά με την RNA πολυμεράση Σε ποιες περιοχές της πρωτεΐνης θα προκαλούσατε ούσα σημειακές μεταλλάξεις με στόχο τις επιμέρους Λειτουργίες της πρωτεΐνης Cap?? 16 Συνολική εικόνα

17 Συνολική εικόνα ρύθμισης του οπερονίου λακτόζης + γλυκόζη cap p o z y a + λακτόζη OFF + γλυκόζη cap p o z y a - λακτόζη OFF - γλυκόζη cap p o z y a - λακτόζη OFF - γλυκόζη cap p o z y a + λακτόζη ON H CAP ενεργοποιεί πολλά οπερόνια καταβολισμού δευτερευόντων σακχάρων π.χ. αραβινόζη (regulon) W operon 17

18 Β. To οπερόνιο της Τρυπτοφάνης ένζυμα βιοσύνθεσης Τρυπτοφάνης Τα ένζυμα βιοσύνθεσης τρυπτοφάνης καταστέλλονται παρουσία τρυπτοφάνης, ενώ τα ένζυμα αποικοδόμησης λακτόζης καταστέλλονται απουσία λακτόζης 18 W καταστολλέας

19 Ρύθμιση του οπερονίου τρυπτοφάνης Ο προσδέτης (τρυπτοφάνη) ρ φ προκαλεί δέσμευση του καταστολλέα στο DNA - τρυπτοφάνη + τρυπτοφάνη 19 ευκαρυώτες

20 H ευκαρυωτική μεταγραφική ρύθμιση είναι πιο πολύπλοκη λ διεργασία 1. Aριθμός γονιδίων ~ E. coli ~ yeast ~ human 2. Aνάπτυξηδιαφοροποίηση Κύτταρο-ειδικότητα Ομοιόσταση Πληθώρα συνδυασμών ρυθμιστικών μεταγραφικών παραγόντων 3. Χρωματίνη Ρυθμιστικά σύμπλοκα νουκλεοσωμικής ανάπλασης 20 EMSA footprint chip

21 Ανίχνευση ειδικών αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών-dna στο εργαστήριο 1. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 2. DNase footprinting 21

22 3. In vivo Chromatin Immunoprecipitation (Chip), Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης Μονιμοποίηση (cross link) Α Β γονίδιο 1 γονίδιο 2 Λύση κυττάρων Τεμαχισμός (μηχανικά ή ενζυμικά μέσα) Ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα ειδικά για την πρωτεΐνη Α Πρωτεόλυση PCR με εκκινητές ειδικούς για τον υποκινητή του γονιδίου 1 22 Μοντέλα συστήματα

23 Μοντέλα-συστήματα ρύθμισης π.χ. GAL στη ζύμη. Ανάλυση ενισχυτών και προαγωγέων, ειδικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών και γενικών μεταγραφικών παραγόντων/rna pol II ΤΒΡ Gal4: Πρωτεϊνική περιοχή δέσμευσης στο DNA και περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης 23 Ενισχυτές

24 Oι ενισχυτές διεγείρουν εξειδικευμένα τη μεταγραφή γαλ. β-γ Ο ενισχυτής ωθεί τη μεταγραφή της β- γαλακτοσιδάσης (γονίδιο μάρτυρας) σε ορισμένα μόνο μυικά κύτταρα του εμβρύου zebra fish Δομή ενισχυτή του γονιδίου της κινάσης κρεατίνης 24 Συνδυαστικό μοντέλο

25 Συνδυαστικός έλεγχος: Oι ενισχυτές διεγείρουν εξειδικευμένα τη μεταγραφή γιατί αναγνωρίζονται από συγκεκριμένους συνδυασμούς ενεργοποιητών και συν-ενεργοποιητών Kυτταρικός τύπος Α TATAA 1 Kυτταρικός τύπος Β TATAA 2 Kυτταρικός τύπος Γ TATAA 100 Αθροιστικό vs συνεργατικό (πολλαπλασιαστικό) αποτέλεσμα: = 100!!! Μια από τις λειτουργίες των συν-παραγόντων είναι η τροποποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων ιστονών και η αναδιάταξη της χρωματινικής δομής 25 Histones Νουκλεόσωμα

26 Ιστόνες (histones) και νουκλεοσωμική συγκρότηση Οι αμινοτελικές ουρές ιστονών προβάλλουν από τον νουκλεοσωμικό πυρήνα Βρείτε την ομολογία (% identity, % similarity) μεταξύ της Η3 του σακχαρομήκυτα και της Η3 του ανθρώπου. 26 Συμπύκνωση

27 Τα νουκλεοσώματα διατάσσονται σε αριστερόστροφη νουκλεοσωμική υπερέλικα x6 27 Ακετυλίωση

28 Η χρωματινική δομή επηρεάζεται απο χημικές τροποποιήσεις (ακετυλιώσεις, μεθυλιώσεις κ.α.) ) πλευρικών ομάδων αμινοτελικών αμινοξέων ιστονών Αφόρτιστη αμιδική ομάδα Αμινοτελικές ουρές ιστονών μπορεί να υφίσταται επίσης πολλαπλές μεθυλιώσεις καταλυόμενες από Μέθυλ- μεταφοράσες ιστονών Ποιά αντίδραση καταλύεται από μια απο-ακετυλάση ιστονών (HDAC) και ποιό το προβλεπόμενο αποτέλεσμα στη μεταγραφή?? 28 Ανάπλαση-δέσμευση πρωτείνης

29 H μεταγραφική ενεργοποίηση συχνά χρειάζεται ανάπλαση της χρωματίνης Τι δυνατότητα έχει μια ρυθμιστική πρωτεΐνη να δεσμευτεί ειδικά σε νουκλεοσωμικό DNA?? msec msec 250 msec Η ανάπλαση της χρωματίνης συντελείται με: Α) Χημικές τροποποιήσεις αμινοτελικών αμινοξέων ιστονών (ακετυλίωση, μεθυλίωση κ.α.) B) Σύμπλοκα ανάπλασης της χρωματινικής δομής α) Νουκλεοσωμική ολίσθηση, β) Αποσυγκρότηση και ανασυγκρότηση νουκλεοσωμάτων Οι «συσκευές» τροποποίησης ιστονών και ανάπλασης χρωματίνης καθοδηγούνται σε διάφορές χρωμοσωμικές θέσεις από μεταγραφικούς ενεργοποιητές στους ενισχυτές των αντιστοίχων γονιδίων 29 brahma

30 Οι «συσκευές» τροποποίησης ιστονών και ανάπλασης χρωματίνης καθοδηγούνται σε διάφορές χρωμοσωμικές θέσεις από μεταγραφικούς ενεργοποιητές στους ενισχυτές των αντιστοίχων γονιδίων Επιπλέον, ακετυλιωμένες λυσίνες μπορούν να αναγνωρισθούν από υπομονάδες των συμπλόκων αναδιάταξης χρωματίνης, αλλά και από άλλους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες (πχ TAF250) μέσω του μοτίβου brahma Estrogen 30

31 Παραδείγματα ρύθμισης μεταγραφικών ενεργοποιητών 1. Τα οιστρογόνα (πχ η οιστρόνη), οι θυροειδικές ορμόνες, τα ρετινοειδή κλπ δεσμεύονται και ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες γνωστούς ως πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών 31 ERE

32 Οι πυρηνικοί υποδοχείς στεροειδών ορμονών αναγνωρίζουν και δεσμεύονται σε αλληλουχίες DNA γνωστές ως «στοιχεία χ απόκρισης σε οιστρογόνα» ERE (estrogen response element) ΕRE: παλλίνδρομη αλληλουχία AGGTCANNNGACCT Οι πυρηνικοί υποδοχείς στεροειδών ορμονών συνίστανται από περισσότερες από δυο δομικά και λειτουργικά δικριτές περιοχές Zn 32 Δομικές αλλαγές

33 Η σύνδεση του προσδέματος (οιστραδιόλη) προκαλεί δομικές αλλαγές στον πυρηνικό υποδοχέα οιστρογόνου 33 SRC-1

34 Ο πυρηνικός υποδοχέας στεροειδών ορμονών- μετά τη σύνδεση του οιστρογόνου-μπορεί να «στρατολογεί» μεταγραφικούς συν-ενεργοποιητές Ανταγωνιστές και αγωνιστές Ο συν-ενεργοποιητής SRC-1 (steroid receptor co-activator) συνδέεται με τον υποδοχέα στερεοειδών ορμονών μέσω επαναλήψεων L-X-X-L-L 34

35 Ανταγωνιστές και αγωνιστές πυρηνικών υποδοχέων ορμονών Ανταγωνιστές πχ αντικαρκινικά φάρμακα (καρκ. μαστού) Αγωνιστές πχ αναβολικά (doping) 35 ταμοξιφαίνη

36 Η δομική αλλαγή με τη σύνδεση ταμοξιφαίνης (αντί για οιστραδιόλη) αποτρέπει τη σύνδεση του συν-ενεργοποιητή και αναστέλλει (πώς?) τη μεταγραφή 36 Επινεφρίνη

37 2. Δέσμευση προσδεμάτων (πχ επινεφρίνη) σε μεμβρανικούς υποδοχείς καταλήγει σε φωσφορυλίωση φ μεταγραφικών ενεργοποιητών (πχ χ CREB) και στρατολόγηση συν-ενεργοποιητών (πχ CBP) Επινεφρίνη 7ΤΜ Πρωτείνη G Αδενυλική κυκλάση camp Ενεργοποίηση ΡΚΑ Leucine Zipper Ser 192 Φωσφορυλίωση CREB Στρατολόγηση CBP Μεταγραφική ενεργοποίηση CREB PKA: Protein Kinase A CREB: camp Response Element Binding protein CBP: CREB Binding Protein 37 CBP

38 O συνενεργοποιητής CBP, ο οποίος συνδέεται με την φωσφορυλιωμένη μορφή του CREB, φέρει ενεργότητα ακετυλ-μεταφοράσης ιστονών (HAT), αλλά και περιοχή δέσμευσης ακετυλιωμένων ιστονών (περιοχή brm) 192 Μετα-μεταγραφική Ρύθμιση 38

39 Ρύθμιση σε μετα-μεταγραφικά στάδια 39 attenuation

40 Δομή μη τερματισμού Δομή τερματισμού Μηχανισμός εξασθένησης (attenuation) στο οπερόνιο τρυπτοφάνης (Ε. Coli) Έλλειψη W ακινητοποιεί το ριβόσωμα δίνοντας στο mrna δομή που επιτρέπει κίνηση της RNA πολ. 40 και σε άλλα οπερόνια

41 Aνάλογοι μηχανισμοί λειτουργούν και σε άλλα οπερόνια. 41 Fe

42 Μηχανισμός μεταφραστικής ρύθμισης στην ομοιόσταση Fe στα ζώα Η τρασφερρίνη μεταφέρει Fe στον ορό Ο υποδοχέας τρασφερρίνης είναι μεμβρανική πρωτεΐνη που εισάγει τρανσφερρίνη-fe μέσα στα κύτταρα Η φερριτίνη αποθηκεύει Fe (24 μόρια φερριτίνης-2400 Fe) Ρύθμιση: Χαμηλές συγκεντρώσεις Fe αυξάνουν τα επίπεδα του υποδοχέα τρανσφερρίνης και ελαττώνουν τα επίπεδα φερριτίνης, και αντιστρόφως 42 ΙRE-Binding Protein

43 ΙRE Iron Response Element - Στοιχείο απόκρισης στο σίδηρο ΙRE στο 5 UTR (μη μεταφράσιμη) του mrna της φερριτίνης Το ΙRE έχει δομή στελέχους-θηλιάς Το ΙRE δεσμεύεται από την IRE-BP (ΙRE-Binding Protein) η οποία εμποδίζει την έναρξη της μετάφρασης του mrna της φερριτίνης. φρρ Παρεμποδίζεται η σάρωση της μη μεταφράσιμης περιοχής του mrna από την 40S ριβοσωμική υπομονάδα?? 43 ΙRE-Binding Protein

44 Σε υψηλές συγκεντρώσεις Fe η IRE- BP δεσμεύει Fe, με τη μορφή συμπλόκου 4Fe-4S (iron-sulfur cluster). Η θέση δέσμευσης 4Fe-4S επικαλύπτεται με τη θέση δέσμευσης RNA, επομένως σε υψηλές συγκεντρώσεις Fe η IRE-BP αποδεσμεύεται από το IRE Η ΙRE-Binding g Protein είναι ομόλογη και έχει ενζυμική ενεργότητα- μιτοχονδριακής ακονιτάσης (Κύκλος του Krebs, ισομερίωση κιτρικού σε ισοκιτρικό μέσω ακονιτικού) 44 3 UTR υποδοχέα τρανσφερρίνης

45 Σε χαμηλές συγκεντρώσεις Fe η δέσμευση της ΙRE-BP στα ΙRE της 3 UTR του υποδοχέα τρανσφερίνης σταθεροποιεί το mrna, ενώ το απελευθερωμένο mrna -σε υψηλές συγκεντρώσεις Fe- είναι ασταθές 3 UTR mrna του υποδοχέα φερριτίνης ΙREs 45

46 Ασκήσεις Stryer Σελ , 3, 5, 8, 10, 12. Lehninger Kεφ. 28 1, 2, 3, 4, 9. Σκεφθείτε όλες τις δυνατές σημειακές μεταλλάξεις που θα επηρέαζαν τη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης Cap στο οπερόνιο λακτόζης. Σκεφθείτε τι θα συνέβαινε στο οπερόνιο της τρυπτοφάνης αν απουσίαζαν από το κύτταρο τα σύμπλοκα νουκλεοσωμικής αναδιάταξης. Εξηγείστε τα πλοενοκτήματα που εξασφαλίζει η παρουσία ακετυλομεταφοράσης ιστονών και περιοχής brm στο ίδιο μόριο μεταγραφικού συνενεργοποιητή. 46