Κεφάλαιο 4. Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής

Transcript

1 Κεφάλαιο 4. Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Σύνοψη Περίληψη Η μέθοδος της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής βασίζεται στην έλξη ανάμεσα σε αντίθετα φορτισμένα σωματίδια και εφαρμόζεται για ιόντα ή ενώσεις που μπορούν να ιονίζονται, όπως οξέα, βάσεις κ.λπ. και για ενώσεις που αντιδρούν με ιοντικές ομάδες όπως π.χ. χημικές ενώσεις, λιπίδια, πρωτεΐνες κ.λπ. Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο φορτίο του ιόντος της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το ph, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία. Οι διαχωρισμοί που βασίζονται στην ανταλλαγή ιόντων λαμβάνουν χώρα, κυρίως, σε στήλες οι οποίες αποτελούνται από έναν ιοντοανταλλάκτη (π.χ. ρητίνη). Υπάρχουν δυο τύποι ιοντοανταλλάκτη: ο κατιοντοανταλλάκτης, ο οποίος φέρει αρνητικά φορτισμένες ομάδες, οι οποίες έλκουν θετικά φορτισμένα ιόντα, και ο ανιοντοανταλλάκτης, ο οποίος φέρει θετικά φορτισμένες ομάδες που θα έλξουν αρνητικά φορτισμένα ιόντα. Είναι φανερό ότι, τα μόρια ουσιών που κάτω από ορισμένες συνθήκες χρωματογραφίας, είτε δεν έχουν φορτίο ή έχουν ομώνυμο φορτίο με τη ρητίνη, εκλούονται πρώτα, ενώ ουσίες τα μόρια των οποίων έχουν φορτία αντίθετα μ' αυτά του ανταλλάκτη (ρητίνης) εκλούονται αργότερα. Οι ενώσεις που συγκρατήθηκαν στη στήλη θα εκλουσθούν με διαλύματα αυξανόμενης συγκέντρωσης άλατος. Όσες ενώσεις συγκρατούνται ασθενώς θα εκλουσθούν πρώτα, ενώ όσες συγκρατούνται ισχυρά θα εκλουσθούν σε υψηλότερες συγκεντρώσεις άλατος. Προαπαιτούμενη γνώση Για την καλύτερη κατανόηση των πρωτοκόλλων που ακολουθούν θα πρέπει ο εκπαιδευόμενος να γνωρίζει βασικά θέματα βιοχημείας που αφορούν στη δομή και λειτουργία των πρωτεϊνών. Προτείνονται τα εξής συγγράμματα:1) Berg M.J., Tymoczko L.J., Stryer L. Βιοχημεία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2005, κεφ. 3, 4. 2) Χατζηϊωάννου Π. Θ. Ενόργανη ανάλυση. Εκδόσεις Ιδιωτική, Μέρος τέταρτο: Τεχνικές διαχωρισμού και χρωματογραφικές τεχνικές αναλύσεως. 4.1 Καθαρισμός πρωτεΐνης Εισαγωγή Η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι η πιο κοινά χρησιμοποιούμενη μέθοδος χρωματογραφίας για τον καθαρισμό πρωτεϊνών. Η δημοτικότητά της οφείλεται στην υψηλή αναλυτική της ικανότητα, στη σχετική ευκολία χρήσης και την επαναληψιμότητά της, καθώς και στη διαθεσιμότητα και το χαμηλό κόστος των υλικών της. Η αρχή της ιοντοανταλλαγής επιτρέπει στην πρωτεΐνη να δεσμευτεί ακόμα και αν εφαρμόζεται ένας μεγάλος όγκος διαλύματος, κάνοντας αυτή τη μέθοδο ιδιαίτερα χρήσιμη ως αρχικό βήμα καθαρισμού της πρωτεΐνης από το αρχικό εκχύλισμα. Για διαχωρισμούς όπου η ταχύτητα είναι σημαντική (όπως η αφαίρεση των πρωτεασών από ένα αρχικό εκχύλισμα ή ο καθαρισμός πρωτεϊνών με δραστικότητα περιορισμένης διάρκειας), η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής προσφέρει ραγδαίους ρυθμούς ροής. Αυτές οι ιδιότητες κάνουν τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής πολύτιμο εργαλείο στους περισσότερους καθαρισμούς και έξοχο σημείο έναρξης για ένα πρωτόκολλο καθαρισμού. Η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής απαιτεί η πρωτεΐνη να διαθέτει ένα καθαρό φορτίο κάτω από συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Ως αποτέλεσμα, η πρωτεΐνη θα απομακρύνει ένα ιόν χαμηλής μοριακής μάζας από το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής, δημιουργώντας έτσι δεσμό στο σημείο αυτό. Μια αλλαγή στις πειραματικές συνθήκες (όπως η αύξηση της συγκέντρωσης του ιόντος ή η μείωση του καθαρού συνολικού φορτίου της πρωτεΐνης) θα προκαλέσει μια άλλη ανταλλαγή ιόντων, απελευθερώνοντας αυτή τη φορά την πρωτεΐνη από το υπόστρωμα της ιοντοανταλλαγής (Sheehan & FitzGerald, 1996). Όταν το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης είναι γνωστό, μια αρχική στρατηγική διαχωρισμού μπορεί εύκολα να αναπτυχθεί. Από την άλλη, όταν γνωρίζουμε λίγα για την πρωτεΐνη, μερικά πρωταρχικά πειράματα ιοντοανταλλαγής μπορούν να αποκαλύψουν πολλά σχετικά με τις βιοφυσικές ιδιότητες της πρωτεΐνης ανοίγοντας τον δρόμο για τον επακόλουθο καθαρισμό.

2 Αρχές ιοντοανταλλαγής Γιατί είναι σημαντική η γνώση του ισοηλεκτρικού σημείου στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής; Ο διαχωρισμός και ο καθαρισμός των πρωτεϊνών με τη χρήση της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής βασίζεται κυρίως στις διαφορές των ιοντικών ιδιοτήτων των αμινοξέων που βρίσκονται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. Τα εκτεθειμένα κατάλοιπα αργινίνης, ιστιδίνης και λυσίνης είναι γενικά θετικά φορτισμένα, ενώ τα κατάλοιπα ασπαρτικού και γλουταμικού οξέος έχουν αρνητικό φορτίο σε ουδέτερο ph. Έτσι, σε συγκεκριμένο ph, μια πρωτεΐνη διαθέτει ένα συνολικό καθαρό φορτίο. Σε χαμηλότερο ph, το καθαρό φορτίο θα είναι πιο αρνητικό. Το ph, όπου τα θετικά φορτία ισοδυναμούν με τα αρνητικά φορτία (με άλλα λόγια, το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης είναι μηδέν) καθορίζει το ισοηλεκτρικό σημείο (pl) αυτής. Στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής, όταν διαχωρίζουμε μια πρωτεΐνη, της οποίας το ισοηλεκτρικό σημείο είναι γνωστό, επιλέγουμε ένα ph το οποίο να απέχει ~1 μονάδα από το pl αυτής. Σε αυτό το ph, η πρωτεΐνη θα έχει αρκετά υψηλό αριθμό φορτίων, για να δεσμευτεί στη στήλη ιοντοανταλλαγής, χωρίς όμως να είναι τόσο ισχυρά δεσμευμένη ώστε να απαιτούνται ακραίες συνθήκες έκλουσης (όπως μία σημαντική αλλαγή στο ph). Πώς ένας ιοντοανταλλάκτης δεσμεύει την πρωτεΐνη; Υποθέτοντας ότι η πρωτεΐνη διαθέτει ένα καθαρό συνολικό φορτίο, ένας ιοντοανταλλάκτης χρειάζεται ένα φορτίο για να δεσμεύσει την πρωτεΐνη αυτή. Οι ιοντοανταλλάκτες τυπικά αποτελούνται από φορτισμένες (ιοντοανταλλαγής) ομάδες, προσαρτημένες σε ένα μη διαλυτό υλικό (υπόστρωμα). Αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες είναι δυνατόν να διαχωριστούν με χρωματογραφία σε θετικά φορτισμένη διαιθυλο-αμινοαιθυλο-κυτταρίνη (DEAE κυτταρίνη). Αντίθετα, θετικά φορτισμένες πρωτεΐνες είναι δυνατόν να διαχωριστούν σε αρνητικά φορτισμένη καρβοξυμεθυλο-κυτταρίνη (CM-κυτταρίνη) (πίνακας 4.1). Το υλικό του υποστρώματος του ιοντοανταλλάκτη είναι συνήθως ένα πολυμερές όπως η αγαρόζη, η κυτταρίνη, η ρητίνη ή το ακρυλαμίδιο (Bollag, 1994). Τύπος ιοντοανταλλάκτη Ασθενής, ανιόντος Ισχυρός, ανιόντος Ασθενής, κατιόντος Ισχυρός, κατιόντος Ιοντοανταλλάκτης (χημικός τύπος) Carboxymethyl (-O-CH2COO ) Sulfopropyl (-O-CH2CHOHCH2OCH2CH2CH2SO3 ) Diethylaminoethy (-O-CH2CH2N+H(CH2CH3)2 Quaternary Ammonium (-O-CH2N+(CH3)3) Ονομασία CM Cellulose Sepharose SP Fast Flow Sepharose DEAE Cellulose Sepharose Εύρος pη Q Sepharose 2-9 Χωρητικότητα ιοντοανταλλάκτη 0,09-0,13 mmol (Cl - )/ml 0,18 0,25mmol (Cl - )/ml 0,11 0,16mmol (Cl - )/ml 0,18 0,25mmol (Cl - )/ml Πίνακας 4.1 Τύποι ιοντοανταλλακτών. Ανιονικοί ανταλλάκτες χρησιμοποιούνται για την απομόνωση-διαχωρισμό μορίων με θετικό συνολικό φορτίο και αντίστροφα. Ποια είναι η διαδικασία για τον καθαρισμό της πρωτεΐνης; Ο μηχανισμός με τον οποίο επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός σε έναν ιοντοανταλλάκτη είναι τύπου αντιστρεπτής αλληλεπίδρασης. Η ανταλλαγή ιόντων γίνεται σε δυο βασικά στάδια: 1. προσθήκη και δέσμευση των ουσιών στον ιοντοανταλλάκτη, 2. διαδοχική αποδέσμευση κάθε ουσίας από τον ιοντοανταλλάκτη. Ο διαχωρισμός γίνεται επειδή τα προς διαχωρισμό μόρια έχουν διαφορετικές ηλεκτρικές ιδιότητες και απελευθερώνονται από τους ιοντοανταλλάκτες όταν μεταβληθεί το ph ή η συγκέντρωση των αλάτων του διαλύματος έκλουσης. Αρχικά, οι πρωτεΐνες που δεν έχουν καμία συγγένεια με το υπόστρωμα εκλούονται κατά τη διάρκεια της φόρτωσης του προς διαχωρισμό διαλύματος στη στήλη. Έπειτα, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αφαιρούνται σε ένα στάδιο έκλουσης. Η βασική αρχή της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής είναι ότι τα φορτισμένα

3 μόρια προσδένονται στους ιοντοανταλλάκτες με μία ισχύ ανάλογη με το φορτίο τους και κατά τρόπο αντιστρεπτό. Η έκλουσή τους γίνεται και πάλι ανάλογα με το φορτίο τους, κατά τρόπο ανταγωνιστικό, ο οποίος επιτυγχάνεται με τη μεταβολή της ιονικής ισχύος ή του ph του περιβάλλοντος. Για παράδειγμα, οι πρωτεΐνες που είναι αρνητικά φορτισμένες κοντά σε ουδέτερο ph θα προσδεθούν σε ένα θετικά φορτισμένο υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής. Η αντίδραση πρόσδεσης έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση ενός ιόντος από τον ιοντοανταλλάκτη. Εάν εφαρμοστεί μια πιο υψηλή συγκέντρωση του ιόντος (για παράδειγμα Cl - 0,3 Μ), μια πρωτεΐνη με χαμηλό καθαρό φορτίο θα αποδεσμευτεί. Για να αφαιρέσουμε μια άλλη πρωτεΐνη με υψηλότερο καθαρό φορτίο, μπορεί να απαιτηθεί Cl - 0,5 Μ. Με την προοδευτική αύξηση της συγκέντρωσης του ιόντος, μπορεί να επιτευχθεί ένας πλήρης διαχωρισμός πρωτεϊνών. Μια χρήσιμη εναλλακτική στρατηγική για τον καθαρισμό, είναι να επιλέξουμε συνθήκες, όπου η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει δεν δεσμεύεται στο υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής, ενώ δεσμεύονται μη επιθυμητά μόρια (Sheehan & FitzGerald, 1996). Ποιες στρατηγικές έκλουσης πρωτεΐνης είναι διαθέσιμες; Μια πρωτεΐνη προσδένεται αντιστρεπτά σε στήλη ιοντοανταλλαγής, μέσω ηλεκτροστατικών δυνάμεων. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη στρατηγική για τη διακοπή της ηλεκτροστατικής δύναμης μεταξύ της πρωτεΐνης και του ιοντοανταλλάκτη, είναι η αύξηση της συγκέντρωσης του άλατος του διαλύματος έκλουσης. Τα ιόντα του διαλύματος έκλουσης, όπως το Na + ή το Cl -, είναι ιόντα μικρής μοριακής μάζας που σε χαμηλές συγκεντρώσεις, μπορούν να απομακρυνθούν από τον ιοντοανταλλάκτη από μια πρωτεΐνη και τα οποία, σε υψηλές συγκεντρώσεις, μπορούν αποτελεσματικά να ανταγωνιστούν την πρωτεΐνη για τη θέση πρόσδεσης στον ιοντοανταλλάκτη και να την εκτοπίσουν. Επιπλέον της αποτελεσματικότητας και του χαμηλού κόστους, η έκλουση άλατος είναι απλή στην εκτέλεση και μπορεί εύκολα να αναπαραχθεί. Υπάρχουν δύο μέθοδοι για την εκτέλεση της έκλουσης άλατος. Η σταδιακή έκλουση, όπου η συγκέντρωση του άλατος αυξάνεται με ευδιάκριτα βήματα και η βαθμιδωτή έκλουση, όπου χρησιμοποιείται ένας δείκτης βαθμίδωσης ώστε να δημιουργηθεί μια ομαλή (συνεχής) αύξηση της συγκέντρωσης του άλατος (Bollag, 1994). Πώς επηρεάζεται η έκλουση από τα διάφορα ιόντα; Για έναν συγκεκριμένο ιοντοανταλλάκτη, όπως για παράδειγμα ο DEAE, μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα ιόντα (Cl -, PO 4 3-, HCO 3- ) για την έκλουση της δεσμευμένης πρωτεΐνης. Τα ιόντα αυτά έχουν διαφορετικό βαθμό συγγένειας για κάθε ιοντοανταλλάκτη. Έτσι, όταν μια πρωτεΐνη αποτυγχάνει να αποδεσμευτεί από μια στήλη ιοντοανταλλαγής με ένα συγκεκριμένο ιόν, τότε αυτή μπορεί να αποδεσμευτεί με τη χρήση ενός πιο ισχυρού ιόντος. Είναι άλλες στρατηγικές έκλουσης χρήσιμες; Μια εναλλακτική μέθοδος έκλουσης είναι η μεταβολή του ph του ρυθμιστικού διαλύματος έτσι ώστε να μειωθεί το σθένος της πρωτεϊνικής δέσμευσης. Όταν χρησιμοποιούμε έναν ανιοντοανταλλάκτη το σθένος του δεσμού της πρωτεΐνης ελαττώνεται μειώνοντας το ph (το ίδιο αποτέλεσμα έχει η αύξηση του ph σε έναν κατιοντοανταλλάκτη). Η ελάττωση του σθένους σύνδεσης οφείλεται στη μείωση του καθαρού φορτίου της πρωτεΐνης, καθώς το ph του ρυθμιστικού διαλύματος πλησιάζει το pi της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη είναι όλο και λιγότερο ισχυρά δεσμευμένη στο υπόστρωμα και τελικά εκλούεται από τη στήλη. Αντίθετα, η «χρωματοεστίαση» είναι ένας τύπος χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής που στηρίζεται στον διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση τη διαφορά των ισοηλεκτρικών σημείων. Οι Giri (1990), Li and Hutchens (1992) και Roe (1989) παρέχουν χρήσιμες περιγραφές και πρωτόκολλα χρωματοεστίασης. Οι μεταβολές του ph μπορούν να προκαλέσουν προσωρινές αλλαγές στην ιοντική ισχύ της στήλης και συνεπώς, η αλλαγή του ph του ρυθμιστικού διαλύματος είναι μια σπάνια χρησιμοποιούμενη μέθοδος έκλουσης στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Ποιο ρυθμιστικό διάλυμα θα πρέπει να χρησιμοποιήσω; Το ρυθμιστικό διάλυμα ιοντοανταλλαγής πρέπει να επιλεγεί προσεκτικά, αφού ένα ασθενές ρυθμιστικό διάλυμα θα επιτρέψει διακυμάνσεις του ph οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν τον βαθμό συγγένειας. Το ρυθμιστικό διάλυμα του πειράματος θα πρέπει να επιλεγεί έτσι ώστε να παρέχει επαρκές εύρος μιας μονάδας της κλίμακας του ph, μακριά από το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης. Επίσης, το ρυθμιστικό διάλυμα οφείλει να έχει το

4 ίδιο φορτίο με τον ιοντοανταλλάκτη (για παράδειγμα, HTris + με έναν ανταλλάκτη DEAΕ). Διαφορετικά, τα ιόντα του ρυθμιστικού διαλύματος μπορούν να προσδεθούν στον ιοντοανταλλάκτη σε ενεργές θέσεις, μειώνοντας τη χωρητικότητα της στήλης και πιθανώς προκαλώντας τοπικές διακυμάνσεις του ph. Ο πίνακας 4.2 παρέχει κάποιες προτάσεις ρυθμιστικών διαλυμάτων για χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (Jungbauer & Hahn, 2009). pka Κλίμακα ph Ρυθμιστικό Διάλυμα Για Ανταλλαγή Κατιόντος 3,8 3,4-4,2 Γαλακτικό οξύ 4,8 4,4-5,2 Οξικό οξύ 6,2 5,8-6,6 MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) 6,6 6,2-7,0 ADA (N-2-Acetamidoiminodiacetic acid) 7,2 6,8-7,6 MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) Για Ανταλλαγή Ανιόντος 6,0 5,6-6,4 Ιστιδίνη 7,8 7,4-8,2 Triethanolamine 8,1 7,7-8,5 Tris 8,8 8,4-9,2 Diethanolamine 9,9 9,1-9,9 Ethanolamine Πίνακας 4.2 Ρυθμιστικά διαλύματα για χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Βασικό κριτήριο επιλογής είναι το φορτίο των ομάδων που είναι ακινητοποιημένες στο υλικό του υποστρώματος. Βλέπε επίσης Scopes (1994) και Roe (1989) Γενικές οδηγίες Όταν ξεκινά ο καθαρισμός της πρωτεΐνης με τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής, οι πιο σημαντικές αποφάσεις είναι: 1. η επιλογή του καταλληλότερου υποστρώματος ιοντοανταλλαγής και του ρυθμιστικού διαλύματος για τον διαχωρισμό, 2. ο καθορισμός του τρόπου έκλουσης της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει. Σε αυτήν την ενότητα παρέχουμε κάποιες κατευθυντήριες γραμμές για αυτές τις αποφάσεις. Επιλογή κατάλληλου υποστρώματος και ρυθμιστικού διαλύματος Όταν το ισοηλεκτρικό σημείο είναι γνωστό Το υπόστρωμα της ιοντοανταλλαγής επιλέγεται ανάλογα με το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης κάτω από τις συνθήκες της χρωματογραφίας. Εάν η πρωτεΐνη είναι αρνητικά φορτισμένη, θα προσδεθεί σε ένα θετικά φορτισμένο υπόστρωμα, ενώ μια πρωτεΐνη που είναι θετικά φορτισμένη θα προσδεθεί σε ένα αρνητικά φορτισμένο υπόστρωμα. Για παράδειγμα, μια πρωτεΐνη με pi 6,9 θα είναι αρνητικά φορτισμένη πάνω από το ph αυτό και αρνητικά φορτισμένη κάτω απ αυτό. Το ισοηλεκτρικό σημείο φανερώνει πόσο ισχυρά αρνητικά ή θετικά φορτισμένη θα είναι μια πρωτεΐνη σε συγκεκριμένο ph. Για να αποφύγουμε συνθήκες κάτω από τις οποίες η πρωτεΐνη, που μας ενδιαφέρει, δεσμεύεται πολύ ισχυρά ή πολύ ασθενώς στη στήλη, η καλύτερη επιλογή για τη διαδικασία καθαρισμού είναι ένα ph περίπου μια μονάδα κάτω η πάνω από το pi. Έτσι, για μια πρωτεΐνη με pi 6,9, συνιστώνται τα ρυθμιστικά διαλύματα με ph 5,9 (και υπόστρωμα ανταλλαγής κατιόντος όπως το CM Sepharose CL-6B) ή με ph 7,9 (με υπόστρωμα ανταλλαγής ανιόντος όπως το DEAE Sepharoseb CL-6B).

5 Το δεύτερο σημείο που μας ενδιαφέρει όταν επιλέγουμε ένα ρυθμιστικό διάλυμα είναι η σταθερότητα της πρωτεΐνης. Στο παράδειγμά μας, η πρωτεΐνη αποδιατάσσεται κάτω από ph 6 και έτσι ένα ρυθμιστικό διάλυμα με ph 7,9 είναι ιδανικό (για παράδειγμα Tris). Πειράματα μικρής κλίμακας μπορούν να επιβεβαιώσουν ότι οι πειραματικές συνθήκες δεν βλάπτουν τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης. Συμβουλευτείτε τον Πίνακα 4.2 για συγκεκριμένα ρυθμιστικά διαλύματα. Όταν το ισοηλεκτρικό σημείο δεν είναι γνωστό Ο πιο κοινός τρόπος για να καθορίσουμε ένα ισοηλεκτρικό σημείο είναι μέσω της ισοηλεκτρικής εστίασης. Να σημειωθεί ότι τα ισοηλεκτρικά σημεία που υπολογίζονται από την ακολουθία των αμινοξέων είναι συχνά διαφορετικά από το pi που μπορεί να καταγραφεί στην IF και η διαφορά μπορεί να είναι μία μονάδα ph. Εάν η πρωτεΐνη δεν είναι καθαρή και η ισοηλεκτρική εστίαση δεν είναι δυνατή, συστήνεται ένας καθορισμός των συνθηκών του ph. Η διαδικασία παρακάτω μπορεί να βοηθήσει στον καθορισμό του ph το οποίο είναι κατάλληλο για καθαρισμό με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Καθορίζοντας το κατάλληλο ph για τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής 1. Προετοιμάστε 9 δοκιμαστικούς σωλήνες, με τον καθένα να περιέχει 1 ml του ιοντοανταλλάκτη (π.χ. DEAE Sepharose CL-6B). 2. Εξισορροπήστε τον πρώτο σωλήνα με 0,5 Μ ρυθμιστικού διαλύματος ph 5 που να περιέχει 10 mm NaCl, επαναλαμβάνοντας τη διαδικασία δέκα φορές με 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος τη φορά. Εξισορροπήστε τον δεύτερο σωλήνα με ρυθμιστικό διάλυμα ph 5,5, και συνεχίστε έτσι μέχρι να εξισορροπηθεί και ο ένατος δοκιμαστικός σωλήνας με ρυθμιστικό διάλυμα ph 9,0. 3. Αφαιρέστε την περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος, έτσι ώστε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος περίπου να καλύπτει το υπόστρωμα. 4. Προσθέστε 100 μl πρωτεϊνικού διαλύματος σε κάθε σωλήνα. 5. Αναδεύστε τον σωλήνα και αφήστε το υπόστρωμα να ηρεμήσει για λίγα λεπτά. 6. Ελέγξτε για παρουσία της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει εντός των υπερκείμενων υγρών με ένα πρωτόκολλο λειτουργικότητας αυτής. Οι καλύτερες συνθήκες για τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι εκείνες κάτω από τις οποίες η πρωτεΐνη δεσμεύεται, αλλά σε ένα ph όχι μακριά από εκείνο όπου η πρωτεΐνη αποδεσμεύεται. Αυτές οι συνθήκες θα πρέπει να επιτρέπουν τη δέσμευση της πρωτεΐνης χωρίς να απαιτούνται ιδιαίτερες προσπάθειες ώστε να εκλουστεί. Σε κάθε περίπτωση, μια δοκιμαστική έκλουση με πολύ υψηλές συγκεντρώσεις άλατος θα έπρεπε να πραγματοποιηθεί και να δοκιμαστεί η πρωτεϊνική λειτουργικότητα. Στην σπάνια περίπτωση που μια πρωτεΐνη δεν δεσμευθεί κάτω από τις συνθήκες ph που έχουν δοκιμαστεί, η διαδικασία θα πρέπει να επαναληφθεί με ένα υπόστρωμα ανταλλαγής κατιόντος (όπως το CM Sepharose CL-6B). Εάν η πρωτεΐνη δεν δεσμευθεί και πάλι στον ανταλλάκτη κατιόντος, ο καλύτερος τρόπος καθαρισμού για την πρωτεΐνη αυτή μπορεί να είναι με ένα απλό πέρασμα του διαλύματος που περιέχει την πρωτεΐνη κατευθείαν από ένα υπόστρωμα ανταλλαγής ανιόντων ακολουθούμενο από ένα υπόστρωμα κατιόντων (Scopes, 1994). Επιλέγοντας τις συνθήκες έκλουσης Η επιλογή της καταλληλότερης συγκέντρωσης ιόντων διαλύματος έκλουσης απλοποιεί κατά ένα μεγάλο μέρος τον καθαρισμό της πρωτεΐνης. Ένα δοκιμαστικό πείραμα θα πρέπει να εγγυάται την εύρεση της απαιτούμενης συγκέντρωσης άλατος ώστε να εκλούσει την επιθυμητή πρωτεΐνη στις συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος που ορίστηκαν παραπάνω. Ακολουθεί ένα τέτοιο πείραμα για την παραπάνω πρωτεΐνη: 1. Εξισορροπήστε 10 ml ιοντοανταλλάκτη DEAE-Sepharose CL-6B με 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος Tris (ph 7,9) που περιέχει 10 mm NaCl. 2. Διανείμετε σε 9 δοκιμαστικούς σωλήνες από 1 ml ιοντοανταλλάκτη. 3. Εξισορροπήστε τον δεύτερο σωλήνα με 0,1 Μ NaCl, επαναλαμβάνοντας τη διαδικασία δέκα φορές με 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris 50 mm (ph 7,9) που περιέχει 0,1 Μ NaCl.

6 4. Εξισορροπήστε με τον ίδιο τρόπο τον τρίτο σωλήνα με ρυθμιστικό διάλυμα Tris ph 7,9 που περιέχει 0,2 Μ NaCl. Εξισορροπήστε τον τέταρτο σωλήνα με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0,3 Μ NaCl και συνεχίστε με τον πέμπτο σωλήνα (0,4 Μ NaCl), τον έκτο σωλήνα (0,5 Μ), τον έβδομο (0,6 Μ), τον όγδοο (0,8 Μ) και τον ένατο (1,0 Μ NaCl). 5. Αφαιρέστε το ρυθμιστικό διάλυμα έτσι ώστε μόνο περίπου 1 ml του ρυθμιστικού διαλύματος να καλύπτει το υπόστρωμα. 6. Προσθέστε 100 μl του διαλύματος της πρωτεΐνης σε κάθε σωλήνα. 7. Αναδεύστε τον κάθε σωλήνα και αφήστε το υπόστρωμα να ηρεμήσει για λίγα λεπτά. 8. Ελέγξτε για παρουσία της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει εντός των υπερκείμενων υγρών. Η πρωτεΐνη θα πρέπει να εμφανίζεται στο υπερκείμενο υψηλών συγκεντρώσεων άλατος, ίσως 0,4 Μ. Εάν η πρωτεΐνη εμφανίζεται ήδη στο υπερκείμενο χαμηλών συγκεντρώσεων άλατος (κάτω από 0,1 Μ), ίσως είναι χρήσιμη η αλλαγή του ph έτσι ώστε να αυξηθεί το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης. Αντίστροφα, εάν η πρωτεΐνη παραμένει δεσμευμένη σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος, ένα ρυθμιστικό διάλυμα με ph πιο κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο της μπορεί να μειώσει τη συγγένεια πρόσδεσης. Επίσης, ένα διαφορετικό ιόν στο διάλυμα έκλουσης με υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης (όπως το PO 4 3- ) μπορεί να εκτοπίσει την πρωτεΐνη κάτω από πιο ήπιες συνθήκες. Εάν το δείγμα φορτωθεί σε μία στήλη με συγκέντρωση άλατος μόλις λίγο χαμηλότερη από αυτή που απαιτείται για την έκλουση, τότε οι μη επιθυμητές πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται πιο ασθενώς θα απομακρυνθούν κατά τη διάρκεια της έκπλυσης της στήλης, απλοποιώντας έτσι τη διαδικασία έκλουσης. Για παράδειγμα, εάν μια πρωτεΐνη εκλούεται στα 0,5 Μ NaCl, συνθήκες φόρτωσης 0,3 Μ NaCl μπορεί να έχουν το παραπάνω επιθυμητό αποτέλεσμα. Θυμηθείτε, όμως, ότι φορτώνοντας και εκπλένοντας μια στήλη με ρυθμιστικό διάλυμα που επιτρέπει επιλεκτική δέσμευση της πρωτεΐνης, μπορεί να οδηγήσει σε αργή, και πιθανώς μη ανιχνεύσιμη πρωτεϊνική διήθηση από τη στήλη. Συχνά, μια ισορροπία πρέπει να επιτυγχάνεται μεταξύ εκτενούς έκπλυσης η οποία μπορεί να οδηγεί σε αργή απώλεια της επιθυμητής πρωτεΐνης και της ταχείας έκπλυσης η οποία μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την παρουσία μη επιθυμητών στοιχείων στη στήλη. Μια πρωτεΐνη που έχει δεσμευθεί σε μια στήλη ιοντοανταλλαγής μπορεί να απελευθερωθεί με σταδιακή έκλουση ή με βαθμιδωτή έκλουση. Γενικά, η σταδιακή έκλουση προτιμάται λόγω της ευκολίας και της επαναληψιμότητας όταν δεν είναι απαραίτητα υψηλά τα επίπεδα διάλυσης ή εάν τα μη επιθυμητά στοιχεία εκλούονται σε μια άλλη, σημαντικά διαφορετική, συγκέντρωση ιόντων διαλύματος έκλουσης από ότι η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Η βαθμιδωτή έκλουση παρέχει συνήθως καλύτερο διαχωρισμό ανάμεσα σε κοντινά σημεία έκλουσης. Αφότου ξεκινήσει η εκροή από το άκρο της στήλης, ο συνολικός όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης, που πρέπει να χρησιμοποιηθεί για μια βαθμιδωτή έκλουση, θα πρέπει να είναι πέντε με δέκα όγκοι στήλης, ενώ τρεις με δέκα όγκοι στήλης θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν για κάθε συγκέντρωση άλατος σε κάθε βήμα βαθμίδωσης. Συνήθως, σε συγκεντρώσεις άλατος που πλησιάζουν το 1 Μ έχουν εκλουστεί όλες οι πρωτεΐνες από μια στήλη (Selkirk, 2004) Μέθοδοι Εξοπλισμός Βασική διάταξη χρωματογραφίας Μια βασική διάταξη χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής περιλαμβάνει τον εξοπλισμό που φαίνεται στην εικόνα 4.1. Ένα απλό σύστημα μπορεί να είναι κατάλληλο για προκαταρκτικές μελέτες, ενώ πιο σύνθετα συστήματα μπορούν να κάνουν συνήθεις ή συχνούς διαχωρισμούς πιο επαναλήψιμους και με λιγότερο έντονη εργασία. Παρόλα αυτά, για τους καθαρισμούς των περισσοτέρων πρωτεϊνών, η βασική διάταξη που περιγράφεται σ αυτήν την ενότητα παρέχει έξοχα αποτελέσματα.

7 Εικόνα 4.1 Βασική διάταξη χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής. 1. Στήλη. Γενικά, η στήλη αποτελείται από γυάλινο ή πλαστικό κύλινδρο με πορώδες στρώμα στο κάτω μέρος για να συγκρατεί το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής. Ένας ελάχιστος όγκος («νεκρό κενό») πρέπει να υπάρχει μεταξύ του πορώδους στρώματος και της εξόδου της στήλης, αφού ανάμειξη του δείγματος μπορεί να λάβει χώρα σε αυτό το σημείο, μειώνοντας έτσι τη διάλυση. Προσαρμογείς ροής για το πάνω μέρος της στήλης είναι εμπορικά διαθέσιμοι και μπορούν να είναι ιδιαιτέρως χρήσιμοι κατά τη διάρκεια της φόρτωσης του δείγματος ή του ρυθμιστικού διαλύματος. Οι προσαρμογείς είναι απαραίτητοι όταν εκτελούμε χρωματογραφία κάτω από θετική πίεση, για παράδειγμα όταν χρησιμοποιούμε συστήματα υψηλής απόδοσης (HPLC, High-performance liquid chromatography). Για διαχωρισμούς μεγάλων όγκων διαλυμάτων, το ύψος της στήλης θα πρέπει να είναι τέσσερις με πέντε φορές η διάμετρός της, ενώ για πιο γρήγορους, λιγότερο ακριβείς διαχωρισμούς, το ύψος μια ή δυο φορές μεγαλύτερο από αυτό της διαμέτρου είναι κατάλληλο. 2. Σωληνώσεις. Χρησιμοποιούνται εύκαμπτες σωληνώσεις για να διασυνδέσουν τη στήλη με τα δοχεία του ρυθμιστικού διαλύματος και με τον συλλέκτη κλασμάτων. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν υλικά όπως η σιλικόνη, το Teflon ή οι σωληνώσεις Tygon. 3. Συλλέκτης κλασμάτων. Ο συλλέκτης κλασμάτων δίνει τη δυνατότητα αυτόματης συλλογής σύμφωνα με τον χρόνο ή σύμφωνα με τον αριθμό των σταγόνων. Όταν συλλέγουμε κλάσματα σύμφωνα με τον χρόνο, οι διαφορές στον ρυθμό εκροής της στήλης θα καταλήξουν σε κλάσματα που περιέχουν μη ισοδύναμους όγκους (αυτή η επιπλοκή μπορεί να ξεπεραστεί με τη χρήση μιας περισταλτικής αντλίας). Οι όγκοι των κλασμάτων μπορούν επίσης να ποικίλουν όταν τα κλάσματα συλλέγονται με κριτήριο ορισμένο αριθμό σταγόνων, αφού ο όγκος κάθε σταγόνας μπορεί να ποικίλει, ανάλογα με τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυμα. 4. Ανιχνευτής UV. Ένας ανιχνευτής υπεριώδους μήκους κύματος μπορεί να μετρήσει την απορρόφηση του φωτός από τις πρωτεΐνες και τα πεπτίδια (για παράδειγμα, στα 280 ή 230 nm) καθώς αυτά εξέρχονται από τη στήλη. Έτσι, παράγεται άμεσα το προφίλ απορρόφησης του διαλύματος που εκλούεται από τη στήλη. Εναλλακτικά, τα μεμονωμένα κλάσματα μπορούν να μετρηθούν για απορρόφηση UV με ένα φασματοφωτόμετρο ή μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μια άλλη μέθοδο ανίχνευσης. 5. Μονάδα καταγραφής (Recorder). Το παραγόμενο χρωματογράφημα παρέχει μια καταγραφή της απορρόφησης που έχει μετρηθεί από τον ανιχνευτή UV. 6. Δεξαμενή ρυθμιστικού διαλύματος. Δεξαμενή που περιέχει το ρυθμιστικό διάλυμα ωσότου εισέλθει στη στήλη. Συχνά χρησιμοποιείται ένα πλατύστομο κύπελλο ή μια φιάλη Erlenmeyer. 7. Συσκευή βαθμίδωσης εκλούτη (για βαθμιδωτές εκλούσεις). Μπορεί να αγοραστεί εμπορικά ή να κατασκευαστεί με δυο πλατύστομα κύπελλα και κάποιες σωληνώσεις.

8 8. Περισταλτική αντλία. Μια αντλία μπορεί να επιταχύνει τη ροή του ρυθμιστικού διαλύματος μέσω της στήλης, όπως και να διατηρήσει τη ροή σε σταθερό ρυθμό. Ένα απλό σύστημα Για προκαταρκτικούς ελέγχους ή χαμηλής ανάλυσης διαχωρισμούς μικρών όγκων, μια απλή στήλη μπορεί να φτιαχτεί με μια πιπέτα Pasteur. Κλείστε την άκρη με λίγο υαλοβάμβακα και γεμίστε και τρέξτε τη στήλη όπως περιγράφηκε στις ενότητες παραπάνω. Κλάσματα του ενός χιλιοστόλιτρου μπορούν να συλλεγούν ακόμα και με το χέρι. Αυτοματοποιημένα συστήματα Τα αυτοματοποιημένα συστήματα χρωματογραφίας που λειτουργούν με μεγάλη πίεση είναι εξαιρετικά χρήσιμα για ερευνητές που συχνά χρησιμοποιούν τη στήλη χρωματογραφίας για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών (εικόνα 4.2). Αυτά τα συστήματα προσφέρουν αυξημένη ταχύτητα και γενικά μεγαλύτερη επαναληψιμότητα. Τα πρότυπα συστήματα χρωματογραφίας που περιγράφηκαν σε αυτό το κείμενο συνήθως επιτυγχάνουν ισοδύναμα επίπεδα καθαρισμού για προκαταρκτικούς καθαρισμούς πρωτεΐνης με χαμηλότερο κόστος. Εικόνα 4.2 Αυτοματοποιημένο σύστημα χρωματογραφίας. Διακρίνονται η βασική μονάδα που περιέχει και τη χρωματογραφική στήλη και ο αυτόματος συλλέκτης κλασμάτων Επιλέγοντας ένα υπόστρωμα Εάν η πρωτεΐνη που πρόκειται να καθαριστεί είναι αρνητικά φορτισμένη κάτω από τις πειραματικές μας συνθήκες, πρέπει να χρησιμοποιηθεί ένα υπόστρωμα ανταλλαγής ανιόντος και αντίστροφα, μια θετικά φορτισμένη πρωτεΐνη θα δεσμευτεί σε ένα υπόστρωμα ανταλλαγής κατιόντος. Για τα περισσότερα προκαταρκτικά πειράματα είναι κατάλληλος ένας ιοντοανταλλάκτης που βασίζεται στην αγαρόζη όπως ο DEAE- ή ο CM- Sepharose. Κάποιες από τις ιδιότητες που διακρίνουν τα υποστρώματα ιοντοανταλλαγής συζητούνται παρακάτω (Jungbauer & Hahn, 2009). Τύπος ανταλλάκτη Οι ιοντοανταλλάκτες μπορούν να είναι είτε ισχυροί είτε ασθενείς. Οι ισχυροί ιοντοανταλλάκτες παραμένουν πλήρως ιονισμένοι ασχέτως του χρησιμοποιουμένου ph ενώ οι ασθενείς ανταλλάκτες εξασθενούν σε ορισμένα ph. Έτσι, εάν οι συνθήκες χρωματογραφίας προϋποθέτουν συγκεκριμένο ph, απαιτείται ένας ισχυρός ιοντοανταλλάκτης. Ενώ οι περισσότεροι καθαρισμοί πρωτεΐνης στο παρελθόν βασίζονται σε ασθενείς ανταλλάκτες, οι ισχυροί ανταλλάκτες μπορεί να παρέχουν ισοδύναμα επίπεδα διαχωρισμού με μεγαλύτερη επαναληψημότητα αποτελεσμάτων.

9 Εναλλακτικό υπόστρωμα που λειτουργεί ως ιοντοανταλλάκτης είναι ο υδροξυαπατίτης. Τα υποστρώματα υδροξυαπατίτη δημιουργούν κρυσταλλικό φωσφορικό ασβέστιο και μπορούν να δεσμεύσουν όξινες ή/και βασικές πρωτεΐνες. Ιδιότητες ροής Αν και μια γρήγορη ροή μπορεί να μειώσει τον χρόνο ολοκλήρωσης της χρωματογραφίας, είναι προτιμότερο να χρησιμοποιούμε με μέτρια ροή, ώστε να είμαστε σίγουροι ότι το διάλυμα της πρωτεΐνης έχει τον απαραίτητο χρόνο ώστε να ισορροπήσει και να δεσμευτεί στον ιοντοανταλλάκτη. Υποστρώματα με μεγαλύτερο εύρος ροής μπορούν να δοκιμαστούν διαδοχικά, λαμβάνοντας όμως υπόψη ότι πιο γρήγοροι ρυθμοί ροής μπορούν να μειώσουν τα όρια της διάλυσης. Χωρητικότητα Η χωρητικότητα του υποστρώματος εκφράζει την ποσότητα της πρωτεΐνης που μπορεί να προσδεθεί σε έναν δοσμένο όγκο του υλικού του υποστρώματος. Γνωρίζοντας τη χωρητικότητα ενός υποστρώματος ιοντοανταλλαγής μπορούμε να προσδιορίσουμε την ποσότητα του υποστρώματος που θα χρησιμοποιήσουμε για τον όγκο του υπό ανάλυση-καθαρισμό διαλύματος. Σε περιπτώσεις όπου απαιτείται υψηλό ποσοστό διάλυσης είναι καλύτερο να χρησιμοποιούμε μόνο το 10 με 20 % της διαθέσιμης χωρητικότητας. Σημειώστε ότι η χωρητικότητα ενός υποστρώματος (ορισμένη σε mg πρωτεΐνης/ ml του υλικού υποστρώματος) είναι συνήθως μικρότερη για μια πρωτεΐνη μεγάλου μοριακού βάρους από ότι για μια πρωτεΐνη μικρότερου μοριακού βάρους. Αυτό συμβαίνει επειδή μια πρωτεΐνη μικρού μοριακού βάρους είναι ικανή να δεσμευθεί σε περισσότερα μόρια ιοντοανταλλάκτη, όπως αυτά που έχουν εισχωρήσει στους πόρους του υποστρώματος. Ιδιότητες διόγκωσης Κάποια υποστρώματα μπορούν να συμπιεστούν όταν βρίσκονται υπό πίεση ή μπορεί να διογκωθούν/ συρρικνωθούν κάτω από διαφορετικές ιοντικές συνθήκες (για παράδειγμα, το Sephadex). Αυτό μπορεί να δημιουργήσει την ανάγκη για μετακίνηση και αποθήκευση του υποστρώματος και την επανατοποθέτησή του για τον επόμενο διαχωρισμό. Τέτοιες ιδιαιτερότητες μπορούν να περιπλέξουν τη διαδικασία σε μία χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Τα νεότερα υλικά υποστρώματος ξεπερνούν κατά ένα μεγάλο μέρος αυτές τις δυσκολίες. Σταθερότητα του ph Εάν οι συνθήκες φόρτωσης ή έκλουσης της πρωτεΐνης απαιτούν τη χρήση εξειδικευμένων συστατικών στο ρυθμιστικό διάλυμα του ph, βεβαιωθείτε ότι επιλέξατε ένα υπόστρωμα το οποίο θα αντέξει αυτές τις συνθήκες. Επιπλέον, ένας ασθενής ιοντοανταλλάκτης μπορεί να ιονιστεί μόνο μερικώς σε ακραίο ph. Για αυτόν τον λόγο, χρησιμοποιήστε έναν ισχυρό ανταλλάκτη εάν οι πειραματικές συνθήκες τοποθετούνται προς τα όρια της κλίμακας του ph Προετοιμάζοντας το υπόστρωμα και στοιβάζοντας τη στήλη Πριν την έγχυση του δείγματος της πρωτεΐνης σε στήλη ιοντοανταλλαγής, είναι απαραίτητα τρία βήματα προετοιμασίας: 1. το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής θα πρέπει να διογκωθεί εάν πακετάρεται/στοιβάζεται σε ξηρή μορφή, 2. το υπόστρωμα πρέπει να στοιβαχτεί στη στήλη σωστά, 3. το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής πρέπει να εξισορροπηθεί με το ρυθμιστικό διάλυμα της στήλης. Εάν ο διαχωρισμός πρόκειται να εκτελεστεί στους 4 ο C (για να ελαχιστοποιηθούν οι απώλειες της ενζυμικής δραστικότητας), όλα τα υλικά θα πρέπει να έχουν ψυχθεί και αποθηκευτεί στους 4 ο C πριν το στοίβαγμα της στήλης και τα επακόλουθα βήματα (Williams & Frasca, 2001).

10 Διογκώνοντας το υπόστρωμα Τα υποστρώματα που τοποθετούνται στη στήλη υπό μορφή σκόνης πρέπει να εμποτιστούν/ενυδατωθούν με το ρυθμιστικό διάλυμα της στήλης πριν το στοίβαγμα αυτής. Ένα γραμμάριο ξηρού υποστρώματος μπορεί να διογκωθεί σε τελικό όγκο, από 5 έως και 50 ml διογκωμένου υλικού. 1. Επωάστε το ξηρό υπόστρωμα με περίπου 10 όγκους στήλης ρυθμιστικού διαλύματος (π.χ. 10 g υποστρώματος με 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος). 2. Ενυδατώστε βράζοντας για μια έως αρκετές ώρες ή επωάστε για αρκετές ώρες έως αρκετές ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου (συμβουλευτείτε τις οδηγίες του προμηθευτή). Προσέξτε να προσθέσετε περισσότερο ρυθμιστικό διάλυμα, καθώς είναι απαραίτητο όταν η ενυδάτωση/ανασύσταση πραγματοποιείται υπό βρασμό. 3. Αναδέψτε το εναιώρημα του υποστρώματος αρκετές φορές κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της διόγκωσης για να εξασφαλίσετε την πλήρη ενυδάτωση. 4. Αλλαγή του ρυθμιστικού διαλύματος αρκετές φορές κατά τη διάρκεια της διόγκωσης για να επιτραπεί η καλύτερη εξισορρόπηση του υποστρώματος. Η ανάδευση του υποστρώματος με μαγνητική ράβδο ανάδευσης δεν συνίσταται, αφού η ράβδος ανάδευσης μπορεί να τεμαχίσει το υπόστρωμα σε μικρότερα τμήματα («ψήγματα»). Στοιβάζοντας τη στήλη Πριν την επιστοίβαση της στήλης το υπόστρωμα θα πρέπει να εξισορροπηθεί με το ρυθμιστικό διάλυμα. Για να στοιβάξουμε τη στήλη, το εναιώρημα του υποστρώματος θα πρέπει να περιέχει έναν όγκο του υποστρώματος προς έναν όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος. Οι διαστάσεις της στήλης επιλέγονται σύμφωνα με τον βαθμό επιθυμητής διάλυσης. Για μεγαλύτερη διάλυση, συνίσταται μια αναλογία ύψους/πλάτους 4:1 ή 5:1, ενώ για έναν λιγότερο απαιτητικό διαχωρισμό, μια αναλογία 2:1 είναι επαρκής. Η επιστοίβαση του υποστρώματος ιοντοανταλλαγής μέσα σε μια στήλη πρέπει να γίνεται προσεκτικά. Το ακανόνιστο στοίβαγμα μπορεί να προκαλέσει περιορισμένο διαχωρισμό της πρωτεΐνης ή μικρή επαναληψιμότητα διαχωρισμού κατά τη σταδιακή έκλουση. Για να παρέχουμε επαρκή όγκο για τη σταδιακή έκλουση στη στήλη στοιβάγματος πρέπει να χρησιμοποιηθεί μια δεξαμενή στήλης (Williams & Frasca, 2001). 1. Εκπλύνετε το υπόστρωμα σε ένα πλατύστομο κύπελο με το ρυθμιστικό διάλυμα της στήλης. Αναδέψτε το εναιώρημα για ένα λεπτό και έπειτα ελέγξτε το ph. Εάν το ph έχει αλλάξει συγκριτικά με αυτό του αρχικού ρυθμιστικού διαλύματος της στήλης, απαιτείται επιπλέον εξισορρόπηση. Αφαιρέστε την περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος και προσθέστε νέο ρυθμιστικό διάλυμα στήλης επαναλαμβάνοντας τη διόγκωση του υποστρώματος και τον έλεγχο του ph. 2. Εάν χρησιμοποιείτε τη στήλη σε θερμοκρασία δωματίου, αφαιρέστε τον αέρα από το ρυθμιστικό διάλυμα και τα διαλύματα του υποστρώματος (εφαρμόστε συνθήκες κενού για μια ώρα). Αυτό το βήμα θα μειώσει την πιθανότητα μικρές φυσαλίδες αέρα να παγιδευτούν στο υπόστρωμα κατά τη διάρκεια του στοιβάγματος. Η διόγκωση του υποστρώματος κατά τη διάρκεια της αφαίρεσης του αέρα θα απελευθερώσει τις φουσκάλες που έχουν παγιδευτεί σε αυτό. 3. Προσθέστε μια μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος στη στήλη. 4. Ανοίξτε την έξοδο της στήλης για να επιτρέψετε σε κάποια ποσότητα του ρυθμιστικού διαλύματος να περάσει και έπειτα κλείστε την έξοδο. Αυτό θα αφαιρέσει τον αέρα από το νεκρό τμήμα στη βάση της στήλης. 5. Αναδέψτε το εναιώρημα του υποστρώματος με μια γυάλινη ράβδο, βεβαιώνοντας ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα μέσα σε αυτό. 6. Ανοίξτε την έξοδο της στήλης και προσθέστε περισσότερο ρυθμιστικό διάλυμα καθώς το υπόστρωμα στοιβάζεται.

11 7. Ένας προσαρμογέας ροής μπορεί να εφαρμοστεί στη στήλη καθώς το υπόστρωμα στοιβάζεται. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν εισέλθει φυσαλίδες αέρα στο σύστημα, διαφορετικά το εύρος ροής θα μειωθεί. Η στήλη μπορεί επίσης να βρίσκεται υπό κλίση κατά την τμηματική έγχυση του εναιωρήματος του υποστρώματος, εάν είναι επιμήκης. Σημειώστε ότι κάποια υποστρώματα (όπως το Sephadex) στοιβάζονται καλά σε στήλες μικρού εύρους ροής ενώ πολλά υποστρώματα μεγάλης απόδοσης (για παράδειγμα, το Sepharose Fast Flow) απαιτούν μεγάλο εύρος ροής. Συμβουλευτείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εξισορροπώντας το υπόστρωμα Μετά την επιστοίβαση, το υλικό του υποστρώματος θα πρέπει να εκπλυθεί πάλι με το ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε να ολοκληρωθεί η διαδικασία και να έρθει το υπόστρωμα στην τελική ισορροπία με το ph του ρυθμιστικού διαλύματος και τις ιοντικές συνθήκες για το ακόλουθο πείραμα. Γενικά, η έκπλυση με αρκετούς όγκους στήλης είναι επαρκής ώστε να επιτευχθεί η ισορροπία στα περισσότερα υποστρώματα. Για να βεβαιωθούμε ότι το υπόστρωμα έχει εξισορροπηθεί, συγκρίνουμε το ph και την αγωγιμότητα του ρυθμιστικού διαλύματος με αυτά του διαλύματος έκλουσης Έγχυση δείγματος Προετοιμάζοντας το δείγμα για έγχυση Ένα θολό πρωτεϊνικό διάλυμα θα πρέπει να καθαριστεί με υπερφυγοκέντριση ή με διήθηση μέσω ενός φίλτρου με πόρους μεγέθους 0,45 μm. Βεβαιωθείτε ότι, κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος καθαρισμού, δεν χάνεται η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Το δείγμα θα πρέπει να περιέχεται σε ρυθμιστικό διάλυμα μικρής ιοντικής ισχύος (κατά προτίμηση < 50 mm). Για να αλλάξετε το ρυθμιστικό διάλυμα, εφαρμόστε χρωματογραφία διήθησης πήγματος, διάλυση ή υπερδιήθηση. Εναλλακτικά, αραιώστε το διάλυμα της πρωτεΐνης για να μειώσετε την ιοντική ισχύ. Σημείωση: Εάν η συγκέντρωση του δείγματος της πρωτεΐνης είναι πολύ μεγάλη, η χρωματογραφία μπορεί να αποτύχει εξαιτίας του υπερβολικού τοπικού ph ή των διακυμάνσεων της συγκέντρωσης άλατος. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις πάνω από 10 mg/ml θα πρέπει να αποφεύγονται. Έγχυση δείγματος 1. Αποστραγγίστε τη στήλη μέχρι το ρυθμιστικό διάλυμα να φτάσει στην επίπεδη άνω επιφάνεια του υποστρώματος και κλείστε την έξοδο της στήλης. 2. Με μια πιπέτα, τοποθετήστε το δείγμα απαλά στην επίπεδη επιφάνεια. Αποφύγετε τυχόν αναταράξεις. 3. Ανοίξτε την έξοδο της στήλης μέχρι το δείγμα να εισέλθει στο υπόστρωμα και έπειτα κλείστε ξανά την έξοδο της στήλης. 4. Απαλά εγχύστε μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος στην επίπεδη επιφάνεια. 5. Ανοίξτε την έξοδο της στήλης, έτσι ώστε το ρυθμιστικό διάλυμα να εισέλθει στο υπόστρωμα (παρασύροντας μαζί του κάθε υπόλειμμα του διαλύματος του δείγματος) και έπειτα κλείστε την έξοδο όταν το υγρό φτάσει στην επίπεδη επιφάνεια. 6. Επαναπροσθέστε απαλά ρυθμιστικό διάλυμα στην επίπεδη επιφάνεια και έπειτα εφαρμόστε ψηλά τη δεξαμενή του ρυθμιστικού διαλύματος. 7. Η στήλη είναι τώρα έτοιμη για τη χρωματογραφική ανάλυση-απομόνωση και παραλαβή της πρωτεΐνης Σημείωση: Πρέπει να δοθεί προσοχή έτσι ώστε να μη δημιουργηθούν κενά μέσα στο υπόστρωμα όταν εγχέεται το δείγμα ή τα ρυθμιστικά διαλύματα αφού αυτό μπορεί να προκαλέσει ακανόνιστο διαχωρισμό της πρωτεΐνης. Μία ενδεδειγμένη τακτική είναι να μετακινούμε την πιπέτα αργά γύρω από την περίμετρο του τοιχώματος της στήλης κατά τη διάρκεια της έγχυσης, έτσι ώστε ένα ομαλό ρεύμα υγρού να ρέει προς την επίπεδη

12 επιφάνεια του υποστρώματος. Η χρήση ενός προσαρμογέα ροής μπορεί να απλοποιήσει τη διαδικασία της έγχυσης του δείγματος Έκπλυση της στήλης και έκλουση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει Η έκπλυση της στήλης αφαιρεί την αδέσμευτη πρωτεΐνη πριν την έκλουση της οποιασδήποτε δεσμευμένης πρωτεΐνης. Γενικά, 3 με 10 όγκοι στήλης ρυθμιστικού διαλύματος είναι επαρκείς για την έκπλυση της στήλης. Κατά τη διάρκεια των βημάτων έκπλυσης και έκλουσης είναι χρήσιμο να ελέγχεται το διάλυμα έκλουσης της στήλης με τη μέτρηση της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης ή της οπτικής απορρόφησης. Όταν ελάχιστες ποσότητες πρωτεΐνης εντοπίζονται κατά τη ροή του διαλύματος έκπλυσης, μπορεί να ξεκινήσει η πρωτεϊνική έκλουση με εφαρμογή του διαλύματος έκλουσης. Δύο τύποι έκλουσης είναι πιθανοί με μια στήλη ιοντοανταλλαγής: η σταδιακή έκλουση ή η βαθμιδωτή έκλουση. Σε μια σταδιακή έκλουση, διακριτές αυξήσεις στη συγκέντρωση των ιόντων (για παράδειγμα 0,1 Μ NaCl) προκαλούν την πρωτεϊνική έκλουση. Μια βαθμιδωτή έκλουση αποδεσμεύει τις πρωτεΐνες με μια βαθμιαία αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων (όπως από 0,02 Μ μέχρι 1,0 Μ NaCl). Ενώ μια βαθμιδωτή έκλουση γενικά δίνει έναν πιο ολοκληρωμένο διαχωρισμό μεταξύ των πρωτεϊνών, η σταδιακή έκλουση είναι συχνά μία πιο απλή και πιο ραγδαία διαδικασία, όμως μπορεί να καταλήξει σε ταυτόχρονη έκλουση αρκετών πρωτεϊνών, εξαιτίας μιας μεγάλης αύξησης της συγκέντρωσης των ιόντων στο διάλυμα έκλουσης. Συνιστούμε τη χρήση της βαθμιδωτής έκλουσης όταν ο καθαρισμός της πρωτεΐνης είναι σε εξέλιξη ή όταν μας ενδιαφέρει ο διαχωρισμός πρωτεϊνών που αποδεσμεύονται σε σχεδόν ίδιες συνθήκες. Επίσης, μια διαδικασία βαθμίδωσης θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για ένα προκαταρκτικό πείραμα ή αφού επαληθευθούν οι συνθήκες έκλουσης της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει (Williams & Frasca, 2001). Σταδιακή έκλουση (Εικόνα 4.2, step by step exclusion) 1. Εκπλύνετε τη στήλη με 3 έως 10 όγκους στήλης του πρώτου ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (για παράδειγμα, 20 mm Tris-HCl, 0,1 M NaCl). 2. Αφήστε το ρυθμιστικό διάλυμα να φτάσει στην επίπεδη άνω επιφάνεια του υποστρώματος πριν εφαρμόσετε ένα νέο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Αυτό θα διασφαλίσει ότι η συγκέντρωση του άλατος αυξάνεται με έναν καλά ορισμένο τρόπο. 3. Τοποθετήστε 3 με 10 όγκους στήλης του δεύτερου ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (π.χ. 20 mm Tris-HCl, 0,5 M NaCl). 4. Συνεχίστε με τα επόμενα ρυθμιστικά διαλύματα έκλουσης, αυξανόμενης αλατότητας-ιονικής ισχύος.

13 Εικόνα 4.3 Γενική αρχή λειτουργίας της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής. Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Η επιθυμητή πρωτεΐνη δεσμεύεται στη στήλη στο υλικό υποστρώματος προσδέτη. Οι υπόλοιπες πρωτεΐνες εκλούονται χωρίς να δεσμεύονται στο υπόστρωμα. Τροποποίηση της ιοντικής ισχύος του ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης αποδεσμεύει την επιθυμητή πρωτεΐνη. Έκλουση βαθμίδωσης (gradient exclusion) Ο συνολικός όγκος για μια βαθμιδωτή έκλουση θα πρέπει να είναι περίπου 5 με 10 όγκοι στήλης. 1. Το ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλότερης συγκέντρωσης ιόντων (20 mm Tris-HCl, 0,02 M NaCl) τοποθετείται στον βαθμιδωτό κατασκευαστή στην πλευρά που βρίσκεται πιο κοντά στη στήλη. Το ρυθμιστικό διάλυμα υψηλότερης συγκέντρωσης ιόντων (20 mm Tris-HCl, 1,0 M NaCl) τοποθετείται στην άλλη πλευρά του βαθμιδωτού κατασκευαστή. Το δοχείο για κάθε ρυθμιστικό διάλυμα θα πρέπει να είναι ίδιο και το ύψος των ρυθμιστικών διαλυμάτων θα πρέπει να είναι ίσο. Επιβεβαιώστε ότι καμία φυσαλίδα αέρα δεν θα εμποδίζει τη σύνδεση μεταξύ των δύο θαλάμων του ρυθμιστικού διαλύματος. 2. Ενεργοποιήστε τον μαγνητικό αναδευτήρα στην πλευρά του βαθμιδωτού παρασκευαστή βαθμίδωσης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση ιόντων και προσαρμόστε τον παρασκευαστή στη στήλη. 3. Ενεργοποιήστε τον συλλέκτη κλασμάτων και τη μονάδα εγγραφής Ανασύσταση/αναγέννηση και αποθήκευση του υποστρώματος της στήλης Μετά τον διαχωρισμό της πρωτεΐνης, η στήλη ιοντοανταλλαγής θα πρέπει να καθαριστεί και να προστεθούν σε αυτή αντιμικροβιακοί παράγοντες πριν την αποθήκευση. Με την ανασύσταση της στήλης αφαιρούνται μολυσματικά στοιχεία που είναι στενά συνδεδεμένα και προετοιμάζεται το υπόστρωμα για μελλοντικούς καθαρισμούς. Η ανασύσταση της στήλης είναι πιθανή εάν το υπόστρωμα παραμένει σταθερό μετά τη διόγκωση που προκαλείται από τις διακυμάνσεις της συγκέντρωσης των ιόντων (οι ιοντοανταλλάκτες Sephadex θα πρέπει να αφαιρούνται από τη στήλη πριν την ανασύσταση). Εάν ένα υπόστρωμα αντιστέκεται στη διόγκωση, τότε θα πρέπει να αφαιρείται από τη στήλη και να στοιβάζεται ξανά μετά την ανασύσταση. Το υπόστρωμα θα πρέπει επίσης να αφαιρείται από τη στήλη για ανασύσταση εάν συγκεντρώσει σημαντική ποσότητα κυτταρικών καταλοίπων κατά τη διάρκεια του καθαρισμού. Τα περισσότερα υποστρώματα ιοντοανταλλαγής αναγεννώνται με υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων (για παράδειγμα, 1 2 Μ NaCl). Πιο ανθεκτικοί μολυσματικοί παράγοντες όπως τα λιπίδια συχνά αφαιρούνται με χαμηλές συγκεντρώσεις βασικού διαλύματος (για παράδειγμα, 0,1 Μ NaOH) ή με ένα απορρυπαντικό. Συμβουλευτείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή πριν την αναγέννηση του υποστρώματος ιοντοανταλλαγής. Οι ανταλλάκτες ανιόντων μπορούν να αποθηκευτούν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει τον α- ντιμικροβιακό παράγοντα 0,002% hibitane (chlorhexidine), ενώ οι ανταλλάκτες κατιόντος μπορούν να αποθηκευτούν με ρυθμιστικά διαλύματα που να περιέχουν 0,02% αζίδιο του νατρίου ή 0,005% merthiolate (Thimerosal or mercuric thiosalicylate). Προειδοποίηση: μην αναμείξετε το αζίδιο του νατρίου με το merthiolate ή άλλο βαρύ μέταλλο κατιόντος, διότι υπάρχει κίνδυνος έκρηξης (Rozycki & Bartha, 1981). Κάποια υποστρώματα μπορεί να είναι αυτοκαθαριζόμενα, ώστε να εμποδίζεται η ανάπτυξη μικροβίων Προβλήματα και λύσεις Ο ρυθμός ροής της στήλης είναι αργός Λύσεις 1. Η έξοδος της στήλης είναι εν μέρει κλειστή. Προσπαθήστε να αποκαταστήσετε την ομαλή ροή. 2. Φυσαλίδες αέρα εμποδίζουν τη ροή του ρυθμιστικού διαλύματος. Αφαιρέστε τις φυσαλίδες με αύξηση της πίεσης της στήλης και χτυπώντας ελαφρά τον σωλήνα με τα δάκτυλα. Βεβαιωθείτε

14 ότι έχετε εξαερώσει τα ρυθμιστικά διαλύματα και αποφύγετε την είσοδο φυσαλίδων στο σύστημα. 3. Ίζημα εμποδίζει την είσοδο-ροή του δείγματος στην κορυφή του υποστρώματος. Απομακρύνετε το ίζημα με απόξεση. «Αναστοιβάξτε» το άνω τμήμα του υποστρώματος και αφήστε το να ηρεμήσει πριν συνεχίσετε με την έκλουση. Στο μέλλον, διηθήστε το δείγμα πιο προσεκτικά ή χρησιμοποιήστε απορρυπαντικά κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας. 4. Η στήλη έχει φράξει. Η στήλη πρέπει να αφαιρεθεί και να καθαριστεί, πιθανώς στο σημείο «εξόδου» του δείγματος από την στήλη. 5. Το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής είναι συμπιεσμένο. Αυτό μπορεί να συμβεί εάν ένα υπόστρωμα (όπως το Sephadex) διογκώνεται εξαιτίας της αλλαγής της συγκέντρωσης των ιόντων. Για πιθανές λύσεις βλέπε ενότητα «Επιλέγοντας ένα υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής». 6. Η στήλη είναι περιορισμένου εύρους-μικρής διατομής. Για ένα λεπτό υπόστρωμα πλέγματος (mesh matrix), μια αναλογία ύψους : πλάτους 2:1 είναι επαρκής για μια καλή ανάλυση. 7. Ο σωλήνας της αντλίας έχει διαρροή. Επιθεωρήστε τον σωλήνα και αντικαταστήστε τον εάν είναι απαραίτητο. 8. Η έξοδος του σωλήνα της αντλίας έχει φράξει. Αφαιρέστε τον σωλήνα και καθαρίστε ή αντικαταστήστε τον. 9. Έχουν αναπτυχθεί μικρόβια στο υπόστρωμα. Για πιθανές λύσεις βλέπε ενότητα «Αναδημιουργία και αποθήκευση της στήλης». Η πρωτεΐνη δεν δεσμεύεται στο υπόστρωμα. Λύσεις 1. Η αρχική συγκέντρωση ιόντων είναι πολύ μεγάλη. Αλλάξτε το αρχικό ρυθμιστικό διάλυμα με ένα με χαμηλότερη συγκέντρωση. 2. Το ph της στήλης μπορεί να έχει σχέση με τη δέσμευση. Βλέπε ενότητα «Επιλέγοντας ένα υπόστρωμα». Θυμηθείτε ότι ένα υπολογισμένο ισοηλεκτρικό σημείο μπορεί να είναι αξιοσημείωτα διαφορετικό από ένα πειραματικό. 3. Η στήλη μπορεί να μην έχει εξισορροπηθεί κατάλληλα. Βλέπε ενότητα «Προετοιμάζοντας το υπόστρωμα και στοιβάζοντας τη στήλη». 4. Η στήλη δεν έχει καθαριστεί κατάλληλα. Βλέπε ενότητα «Αναδημιουργία και αποθήκευση του υποστρώματος». Η απόδοση της στήλης σε καθαρή πρωτεΐνη είναι μικρή Οι περισσότεροι επιτυχημένοι καθαρισμοί ιοντοανταλλαγής έχουν αποδόσεις %. Οι ακόλουθες εξηγήσεις μπορούν να αιτιολογήσουν χαμηλότερες αποδόσεις. Λύσεις 1. Η πρωτεΐνη παραμένει δεσμευμένη στο υλικό της στήλης. Υψηλότερες συγκεντρώσεις ιόντων, ένα πιο ενεργό ιόν ή απορρυπαντικά μπορούν να δοκιμαστούν κατά την έκλουση. 2. Το ph του ρυθμιστικού διαλύματος δεν είναι κατάλληλο. Εάν το ph του ρυθμιστικού διαλύματος είναι σημαντικά διαφορετικό από το pl της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει, η πρωτεΐνη μπορεί να δεσμευτεί πολύ ισχυρά στο υπόστρωμα. 3. Το δείγμα έχει καθιζάνει. Αυτό μπορεί να προκληθεί από ένα ph πολύ κοντά στο pl, την έλλειψη άλατος στο ρυθμιστικό διάλυμα ή την υπερβολική αραίωση του δείγματος. 4. Το δείγμα χάθηκε κατά τη διάρκεια της διήθησης πριν τη μεταφορά του στη στήλη. Διασφαλίστε ότι η πρωτεΐνη δεν κολλά στο υλικό του φίλτρου όταν το πρωτεϊνικό διάλυμα καθαρίζεται με διήθηση. 5. Μια απαραίτητη πρωτεΐνη ή συμπαράγοντας έχουν χαθεί κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας. Για να ελέγξετε πιθανή έλλειψή τους, τα κλάσματα μπορούν να αναμειχθούν ξανά και να αποτιμηθεί η λειτουργικότητα του μορίου.

15 6. Οι πρωτεάσες μπορεί να πέπτουν την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Βλέπε Κεφάλαιο 1. Ο βαθμός διάλυσης της πρωτεΐνης είναι μικρός Λύσεις 1. Ο ρυθμός ροής του ρυθμιστικού διαλύματος είναι αυξημένος μειώνοντας έτσι τη διάλυση. Δοκιμάστε έναν πιο αργό ρυθμό ροής. 2. Ανεπαρκές μήκος στήλης, πιθανόν συνεπάγεται μη ικανοποιητικό διαχωρισμό. Δοκιμάστε μία περισσότερο επιμήκη στήλη. 3. Μεγάλη ποσότητα πρωτεΐνης μπορεί να έχει φορτωθεί στη στήλη. Προσπαθήστε να φορτώσετε λιγότερη πρωτεΐνη. 4. Η κλίση του βαθμιδωτή μπορεί να έχει γίνει πολύ απότομη. Δοκιμάστε έναν πιο ρηχό βαθμιδωτή. 5. Κάποιες αναμείξεις πρωτεΐνης επισυμβαίνουν όταν αφήνουμε τη στήλη. Βεβαιωθείτε ότι έχετε ελαχιστοποιήσει την απόσταση μεταξύ της στήλης και του συλλέκτη κλασμάτων. 6. Η στήλη δεν έχει στοιβαχτεί ορθώς. Ακαθόριστο στοίβαγμα, παρουσία ψηγμάτων, εφαρμογή ακατάλληλου ρυθμιστικού δείγματος και έκλουση μπορεί να οδηγήσει σε φτωχή διάλυση. Βλέπε παραπάνω ενότητες. 7. Η στήλη δεν έχει εξισορροπηθεί ορθώς. Βλέπε ενότητα «Προετοιμάζοντας το υπόστρωμα και στοιβάζοντας τη στήλη». 8. Μπορεί να έχουν αναπτυχθεί μικρόβια στη στήλη. Βλέπε ενότητα «Αναδημιουργία και αποθήκευση της στήλης». Το προφίλ της έκλουσης δεν είναι επαναλήψιμο Λύσεις 1. Η εξισορρόπηση της στήλης δεν έχει ολοκληρωθεί. Βλέπε ενότητα «Προετοιμάζοντας το υπόστρωμα και στοιβάζοντας τη στήλη». 2. Οι συνθήκες του ph ή του ιοντικού σθένους δεν είναι οι ίδιες με εκείνες από το προηγούμενο πείραμα. Αυτό μπορεί να είναι ιδιαίτερα επιβραδυντικό σε μια βαθμιδωτή έκλουση διότι πρέπει να μετρηθεί το ιοντικό σθένος (ή το ph) της έκλουσης. 3. Το δείγμα έχει καθιζάνει στο υπόστρωμα. Καθαρίστε τη στήλη για να αφαιρέσετε τυχόν υπολείμματα που μπορούν να προκαλούν την καθίζηση. 4. Το δείγμα έχει επηρεαστεί κατά την αποθήκευση. Ελέγξτε ξανά τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης και αλλάξτε τις συνθήκες αποθήκευσης εάν είναι απαραίτητο. Η πρωτεΐνη χάνει τη λειτουργικότητά της όταν απομονώνεται Λύσεις 1. Ένας συμπαράγοντας ή τμήμα του λειτουργικού συμπλόκου της πρωτεΐνης έχει χαθεί. Αναμείξτε ξανά τα κλάσματα και ελέγξτε τη λειτουργικότητα. 2. Η πρωτεΐνη δεν είναι σταθερή στο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Ερευνήστε εναλλακτικές συνθήκες έκλουσης. 3. Η ανάπτυξη μικροβίων στο υπόστρωμα αλλάζει την πρωτεΐνη κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας. Βλέπε ενότητα «Αναδημιουργία και αποθήκευση της στήλης». Η πρωτεΐνη αποκτά λειτουργικότητα κατά τον καθαρισμό Λύσεις

16 1. Οι συνθήκες καθαρισμού είναι διαφορετικές. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν συμβεί αλλαγές στον καθαρισμό. 2. Ένας αναστολέας έχει αφαιρεθεί κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας. Εάν επιθυμείτε, αναμείξτε ξανά τα κλάσματα για να ταυτοποιήσετε ότι περιέχουν τον παράγοντα αναστολής. 4.2 Συμπυκνώνοντας ένα πρωτεϊνικό διάλυμα Η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη συμπύκνωση ενός πρωτεϊνικού διαλύματος. Αφού το ισοηλεκτρικό σημείο των περισσοτέρων πρωτεϊνών είναι χαμηλότερο από ph 8, οι περισσότερες από αυτές θα δεσμευτούν σε ένα υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής με χαμηλή ιοντική ισχύ στο ph αυτό. Μία σύντομη έκπλυση με ένα διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης ιόντων θα εκλούσει σχεδόν όλες τις πρωτεΐνες, παρέχοντας έτσι, ένα απλό, πολύ γρήγορο βήμα συμπύκνωσης. Η ασυνεχής χρωματογραφία μπορεί να είναι μια χρήσιμη διαδικασία για συμπύκνωση της πρωτεΐνης (Selkirk, 2004). Ακολουθεί ένα πρωτόκολλο συμπύκνωσης ιοντοανταλλαγής: 1. Προετοιμάστε ένα υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής (χρησιμοποιήστε για παράδειγμα το DEAE Sepharose CL-6B) και στοιβάξτε τη στήλη ή συνεχίστε με ασυνεχή χρωματογραφία (βλέπε παρακάτω ενότητα). Χρησιμοποιήστε ένα ml υποστρώματος για κάθε 20 mg πρωτεΐνης που πρόκειται να συμπυκνωθούν. 2. Εξισορροπήστε το υπόστρωμα με 20 mm Tris-HCl (ph 8,0), 20 mm NaCl. 3. Εγχύστε το δείγμα. 4. Εκπλύνετε τη στήλη με 2 όγκους στήλης 20 mm Tris-HCl, 20 mm NaCl. 5. Εκλούστε το δείγμα με 20 mm Tris-HCl, 1 M NaCl. 4.3 Ασυνεχής χρωματογραφία Η ασυνεχής χρωματογραφία είναι μια διαδικασία όπου η δέσμευση, το πλύσιμο και η έκλουση της πρωτεΐνης εκτελούνται χωρίς να περιορίζουμε το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής σε μια στήλη. Γενικά, το υπόστρωμα επωάζεται με ανάδευση ή ανακίνηση σε ένα πλατύστομο κύπελλο ή μπουκάλι. Το ρυθμιστικό διάλυμα αφαιρείται με διήθηση ή φυγοκέντριση. Η διαδικασία αυτή είναι μια απλή και πολύ γρήγορη εναλλακτική όταν το επίπεδο της διάλυσης της πρωτεΐνης δεν μας απασχολεί ιδιαίτερα. Η ασυνεχής χρωματογραφία ενδείκνυται επίσης ως μία αποτελεσματική μέθοδος για τη συμπύκνωση πρωτεϊνικών διαλυμάτων. 1. Εξισορροπήστε το υπόστρωμα σε ένα πλατύστομο κύπελλο ή μια φιάλη Erlenmeyer, αναδεύοντας συχνά ώστε να διασφαλίσετε την πλήρη ισορροπία. 2. Αφαιρέστε το μεγαλύτερο μέρος του ρυθμιστικού διαλύματος με απόχυση, αφήνοντας αρκετό από αυτό έτσι ώστε το διάλυμα να μπορεί ακόμα να αναδεύεται. 3. Εγχύστε το δείγμα της πρωτεΐνης. 4. Αφήστε το δείγμα να δεσμευτεί επωάζοντας για μια ώρα. Αναδέψτε αρκετές φορές κατά τη διάρκεια της ώρας αυτής. 5. Διηθήστε το διάλυμα, προσέχοντας να μην αφυδατωθεί το υπόστρωμα ιοντοανταλλαγής. 6. Πλύνετε απαλά το υπόστρωμα με το αρχικό ρυθμιστικό διάλυμα. 7. Μεταφέρετε το υπόστρωμα μέσα σε ένα πλατύστομο κύπελλο ή μια φιάλη και επαναιωρήστε με ένα ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης ιόντων. 8. Διηθήστε το διάλυμα και ελέγξτε το διάλυμα έκλουσης για την παρουσία της επιθυμητής πρωτεΐνης. 9. Εάν είναι απαραίτητο, προσθέστε ένα ρυθμιστικό διάλυμα υψηλότερης συγκέντρωσης ιόντων στο διάλυμα και συνεχίστε ώσπου η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει να εκλουστεί από το υπόστρωμα της ιοντοανταλλαγής. Βιβλιογραφία