Εγγενώς μη Δομημένες Πρωτεΐνες

Transcript

1 Εγγενώς μη Δομημένες Πρωτεΐνες 1.1. Εγγενώς μη Δομημένες Πρωτεΐνες Κατά τη διά χει αυξηθεί το ερευνητικό ενδιαφέρον για τον τομέα των εγγενώς μη δομημένων πρωτεϊνών (intrinsically disorder proteins, IDPs). Οι IDPs δεν έχουν σταθερή τρισδιάστατη δομή υπό φυσιολογικές συνθήκες, ωστόσο είναι λειτουργικές (Dyson 2011). Μια πρωτεΐνη μπορεί να είναι ολόκληρη μη δομημένη (disordered), ή να περιέχει μικρές ή μεγάλες εγγενώς μη δομημένες περιοχές (intrinsically disordered regions, IDRs), όπως φαίνεται στην Εικόνα 1 (Uversky 2011a). Εικόνα 1. 1

2 Αναπαραστάσεις (Α) μιας δομημένης (ordered) και (B) μιας μη δομημένης (disordered) πρωτεΐνης. (Γ- ΣΤ) Αναπαραστάσεις πρωτεϊνών που περιέχουν μη δομημένες (disordered) περιοχές ( Αυτές οι ασυνήθιστες πρωτεΐνες είχαν παρατηρηθεί επανειλημμένα στο παρελθόν, αλλά θεωρούταν σπάνιες και περιορισμένης σημαντικότητας. Ωστόσο, στις αρχές του 21ου αιώνα, εκτεταμένη ανάλυση των βιβλιογραφικών δεδομένων έδειξε ότι αυτού του τύπου οι πρωτεΐνες δεν αποτελούν εξαιρέσεις αλλά απαντώνται ευρέως και συνιστούν μια ομάδα με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά (Uversky et al. 2000; Tompa 2002; Wright and Dyson 1999; Dunker et al. 2001). Διάφορα ονόματα χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή των IDPs στη διεθνή βιβλιογραφία: flexible (Pullen et al. 1975), mobile (Cary et al. 1978), floppy (Lee et al. 1985), rheomorphic (Sawyer and Holt 1993), natively denatured (Schweers et al. 1994), intrinsically denatured (Schweers et al. 1994), intrinsically unfolded (Weinreb et al. 1996), natively unfolded (Weinreb et al. 1996; Uversky et al. 2000), intrinsically unstructured (Wright and Dyson 1999; Tompa 2002), intrinsically disordered (Dunker et al. 2001) ο όρος που τελικά επικράτησε chameleon (Uversky 2003), 32 proteins (Uversky 2003), malleable (Fuxreiter et al. 2008), vulnerable (Chen et al. 2008), 4D (Tsvetkov et al. 2008), dancing proteins (Livesay 2010) και protein clouds (Dunker and Uversky 2010; Uversky 2011b). Τελικά, επικράτησε ο όρος disordered έναντι των unstructured και unfolded, καθώς μπορεί να υπάρχουν στοιχεία δευτεροταγούς δομής στις IDRs, ενώ όρος flexible σχετίζεται περισσότερο με περιοχές με υψηλό B- factor (παράγοντας θερμοκρασίας, αποτελεί μέτρο της θερμικής κίνησης ατόμων) σε κρυσταλλογραφικά προσδιορισμένες δομές (He et al. 2009). Εφαρμογή των αλγόριθμων πρόγνωσης των IDRs σε ολόκληρα γονιδιώματα έδειξαν ότι η φυσική τους αφθονία αυξάνει σημαντικά μεταξύ των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών οργανισμών (Schad et al. 2011). Τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι διαμερισματοποιημένα και συχνά συμμετέχουν στο σχηματισμό πολυκύτταρων οργανισμών, συνεπώς παρουσιάζουν αυξημένες ανάγκες για επικοινωνία και ρύθμιση, διεργασίες στις οποίες εμπλέκονται οι IDPs. Στο βασίλειο των Ευκαρυωτικών, οι αλγόριθμοι πρόγνωσης κατατάσουν το 20-30% των πρωτεϊνών στις IDPs, ενώ περισσότερες από το 50% των πρωτεϊνών περιέχουν μεγάλες IDRs (Oldfield et al. 2005b; Oldfield et al. 2005a). Επιπλέον, το 70% των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε διαδικασίες μεταγωγής σήματος περιέχουν IDRs (Iakoucheva et al. 2002). Αντίθετα, στα βασίλεια των Βακτηρίων και των Αρχαίων τα ποσοστά που παρατηρήθηκαν ήταν πολύ μικρότερα (Dunker et al. 2000) Αλληλουχία και Δομή των IDPs και IDRs Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η αμινοξική αλληλουχία μιας πρωτεΐνης καθορίζει την ικανότητά της να διπλωθεί σε δεδομένες περιβαλλοντικές συνθήκες (Anfinsen 1973). 2

3 Ο συνδυασμός χαμηλής μέσης υδροφοβικότητας και υψηλού καθαρού φορτίου αποτελεί σημαντικό παράγοντα που συντελεί στην απουσία συμπαγούς πρωτεϊνικής δομής (Uversky et al. 2000), καθώς το υψηλό καθαρό φορτίο είναι σημαντικό για τη δημιουργία εκτεταμένης στερεοδιάταξης (Mao et al. 2010). Η σύγκριση των IDPs με τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες αποκαλύπτει τις ιδιαίτερες αμινοξικές τους προτιμήσεις. Συγκεκριμένα, οι IDPs υστερούν σε αμινοξέα που θεωρούνται ότι ευνοούν το σχηματισμό σταθερής δομής (order- promoting residues), όπως ισολευκίνη, λευκίνη, βαλίνη, τρυπτοφάνη, τυροσίνη, φαινυλαλανίνη, κυστεΐνη και ασπαραγγίνη, ενώ διαθέτουν σε αφθονία αμινοξέα που θεωρούνται ότι ευνοούν την έλλειψη δομής (disorder- promoting residues), όπως αλανίνη, αργινίνη, γλυκίνη, γλουταμίνη, σερίνη, λυσίνη και προλίνη (Dunker and Obradovic 2001; Williams et al. 2001; Romero et al. 2001; Vacic et al. 2007a; Dunker et al. 2001). Πολλά άλλα χαρακτηριστικά των IDPs επιτρέπουν τη διάκρισή τους από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες. Για παράδειγμα, ο αριθμός των καταλοίπων που εντοπίζονται σε δεδομένη απόσταση (14Å (Williams et al. 2001) ή 8Å (Galzitskaya et al. 2006b)) από ένα συγκεκριμένο κατάλοιπο, ο οποίος αποτελεί μέτρο της πυκνότητας των αμινοξέων στο χώρο (packing density), είναι μικρότερος στις μη δομημένες (disordered) από ότι στις δομημένες (ordered) περιοχές των πρωτεϊνών. Η αυξημένη ευελιξία είναι επίσης χαρακτηριστικό των IDRs, και στο παρελθόν υπήρχε ταύτιση των όρων flexible και disordered, καθώς και οι δύο χρησιμοποιήθηκαν για να περιγράψουν λειτουργικές πρωτεΐνες με μη καθορισμένη τρισδιάστατη δομή υπό φυσιολογικές συνθήκες. Επιπλέον, η παρουσία β- κλώνων σχετίζεται αρνητικά με την εγγενή έλλειψη δομής (disorder), πιθανόν επειδή τα αμινοξέα που ευνοούν το σχηματισμό β- κλώνων μειώνουν την ευελιξία (Williams et al. 2001). Οι IDPs και οι IDRs διαφέρουν από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες και σε επίπεδο δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής, καθώς οι IDPs διαθέτουν χαρακτηριστικές και αναγνωρίσιμες δομικές ιδιότητες. Από δομική άποψη, οι IDPs και οι IDRs μπορούν να ομαδοποιηθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τις εκτεταμένες και τις συμπαγείς (Uversky and Dunker 2010; Uversky 2002a, b; Dunker and Obradovic 2001). Σύμφωνα με αυτή την κατηγοριοποίηση, οι IDPs μπορεί να είναι λιγότερο ή περισσότερο συμπαγείς και να διαθέτουν μικρότερο ή μεγαλύτερο ποσοστό ευέλικτης μη κανονικής δευτεροταγούς δομής και αλληλεπιδράσεων για το σχηματισμό τριτοταγούς δομής (Uversky and Dunker 2012). Η δομή των IDRs μπορούν να περιγραφεί με τη χρήση περιορισμένου αριθμού στερεοδιατάξεων (Choy and Forman- Kay 2001; Huang and Stultz 2008), ωστόσο δεν επικρατεί μια συγκεκριμένη στερεοδιάταξη. Ως αποτέλεσμα αυτής της εναλλαγής των στερεοδιατάξεων συναρτήσει του χρόνου (Uversky and Dunker 2010), η δομή των IDRs φαίνεται «θολή» και δίνει την εντύπωση ενός «σύννεφου» (protein cloud) (Uversky and Dunker 2012) Λειτουργία IDPs και IDRs 3

4 Οι βιολογικές λειτουργίες των IDPs και των IDRs συχνά εξαρτώνται από την απουσία σταθερής δομής και την ευελιξία (Uversky and Dunker 2010). Γενικά, οι IDPs εμπλέκονται στη ρύθμιση και τον έλεγχο κυτταρικών διεργασιών, στη μοριακή αναγνώριση και τη μεταγωγή σήματος, και συχνά περιέχουν θέσεις μετα- μεταφραστικών τροποποιήσεων (Dunker et al. 2002a; Iakoucheva et al. 2004). Οι IDPs ταξινομούνται σε επτά λειτουργικές τάξεις: molecular recognition effectors, molecular assemblers, chaperones, metal sponges, molecular recognition scavengers, modification sites και entropic chains (Tompa 2002). Molecular recognition effectors (τελεστές μοριακής αναγνώρισης): συμμετέχουν σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος και εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις υψηλής εξειδίκευσης και χαμηλής συνάφειας με πολλές πρωτεΐνες (binding partners). Molecular assemblers (μοριακοί συναρμολογητές): συγκεντρώνουν, ρυθμίζουν και σταθεροποιούν μοριακά σύμπλοκα. Chaperons (μοριακοί συνοδοί): βοηθούν το σωστό δίπλωμα πρωτεϊνών και RNA. Metal sponges (σπόγγοι μετάλλων): αποθηκεύουν και βοηθούν στην εξουδετέρωση βαρέων μετάλλων. Molecular recognition scavengers («οδοκαθαριστές» μοριακής αναγνώρισης): αποθηκεύουν και εξουδετερώνουν προσδέτες (ligands). Modification sites (θέσεις τροποποίησης): είναι θέσεις στις οποίες γίνεται τροποποίηση (προσθήκη χημικής ομάδας ή ενζυμική πέψη) μιας πρωτεΐνης. Entropic chains (εντροπικές αλυσίδες): συνδέουν δύο δομημένες (ordered) αυτοτελείς δομικές περιοχές (domains) και ρυθμίζουν τη μεταξύ τους απόσταση. Πιο πρόσφατα (Vucetic et al. 2007; Xie et al. 2007a; Xie et al. 2007b), μια εκτεταμένη ανάλυση αποκάλυψε τη θετική ή την αρνητική συσχέτιση συγκεκριμένων βιολογικών διαδικασιών, μοριακών λειτουργιών, κυτταρικών συστατικών, αναπτυξιακών διεργασιών, προσδέτων (ligands), μετα- μεταφραστικών τροποποιήσεων και ασθενειών με την εγγενή έλλειψη δομής (disorder). Οι IDPs σπάνια είναι υπεύθυνες για κατάλυση αντιδράσεων οι ίδιες, με ελάχιστες εξαιρέσεις (Uversky et al. 1996; Vamvaca et al. 2008; Pervushin et al. 2007; Woycechowsky et al. 2008), όπως είναι η GTPάση UreG του βακτηρίου Bacillus pasterii (Zambelli et al. 2005; Neyroz et al. 2006; Zambelli et al. 2012). Ορισμένα ένζυμα διαθέτουν IDRs που διπλώνουν καλύπτοντας τα υποστρώματα εξασφαλίζοντας τον αποκλεισμό του νερού από το ενεργό κέντρο (Fetrow 1995; Wang et al. 1999; Vandemeulebroucke et al. 2008; Malabanan et al. 2010; Yuzenkova and Zenkin 2010). Παρά την αρνητική τους συσχέτιση με καταλυτικές διαδικασίες (Xie et al. 2007b), οι IDPs είναι συχνά υπεύθυνες για πρόσδεση που δε συνοδεύεται από κατάλυση, για παράδειγμα σε νουκλεϊκά οξέα, μεταλλικά ιόντα, ομάδες αίμης, άλλα μικρά μόρια, πρωτεΐνες και 4

5 λιπίδια (Dunker et al. 2002a; Uversky et al. 2000). Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη της μυελίνης MBP (myelin basic protein) είναι μια περιφεριακή μεμβρανική πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τα λιπίδια των μεμβρανών μυελίνης του νευρικού συστήματος (Polverini et al. 1999). Αυτού του τύπου η μη καταλυτική πρόσδεση σχετίζεται με διαδικασίες ρύθμισης, αναγνώρισης, μεταγωγής σήματος, όπου είναι απαραίτητες οι αλληλεπιδράσεις υψηλής εξειδίκευσης - χαμηλής συνάφειας με πολλές πρωτεΐνες (binding partners) (Uversky and Dunker 2010). Oι IDPs εμπλέκονται σε πληθώρα διαμοριακών αλληλεπιδράσεων (Dunker et al. 2005; Uversky et al. 2005; Iakoucheva et al. 2002). Έτσι μια IDP προσδένεται σε πολλές πρωτεΐνες (binding partners) ή πολλές IDPs προσδένονται σε μία πρωτεΐνη (binding partner), όπως φαίνεται στην Εικόνα 2 (Dunker et al. 2005; Uversky et al. 2005) (one- to- many signaling και many- to- one signalling, αντίστοιχα (Romero et al. 1998)). Οι IDPs σχηματίζουν ασυνήθιστα σύμπλοκα (Uversky 2011b). Ορισμένα από αυτά είναι σχετικά στατικά και μοιάζουν με σύμπλοκα δομημένων (ordered) πρωτεϊνών. Άλλες IDPs δεν διπλώνουν (μερικά ή ολικά) ακόμα και όταν προσδένονται σε κάποιο μόριο, σχηματίζοντας τα μη δομημένα (disordered) σύμπλοκα. Τέτοια σύμπλοκα σχηματίζονται μέσω πολλαπλών περιοχών πρόσδεσης χαμηλής συνάφειας (Uversky 2011b; Nash et al. 2001; Mittag et al. 2010; Mittag et al. 2008; Tompa and Fuxreiter 2008). Οι IDPs λειτουργούν ως δημοφιλείς κόμβοι (hubs), δηλαδή πρωτεΐνες με πολλές αλληλεπιδράσεις στα δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών (Dunker et al. 2005; Uversky et al. 2005; Patil and Nakamura 2006; Ekman et al. 2006; Dosztanyi et al. 2006; Singh et al. 2007; Haynes et al. 2006; Singh and Dash 2007), ενώ έχει διαπιστωθεί αυξημένη εγγενής έλλειψη δομής (intrinsic disorder) στις πρωτεΐνες που είναι δημοφιλείς κόμβοι (hubs) σε σχέση με αυτές που δεν είναι (Patil et al. 2010a; Patil and Nakamura 2006). Οι δημοφιλείς κόμβοι (hubs) είναι ουσιώδεις για τη φυσιολογική λειτουργία και τη σταθερότητα των δικτύων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων σε οποιονδήποτε οργανισμό και η καταστροφή ενός δημοφιλούς κόμβου (hub) έχει θανάσιμες συνέπειες για τον οργανισμό αυτό (Jeong et al. 2001). Στους μη δομημένους (disordered) δημοφιλείς κόμβους (hubs), οι IDRs μπορούν να έχουν διττό ρόλο (Patil et al. 2010b): είτε χρησιμοποιούνται για να αλληλεπιδράσουν με πολλές πρωτεΐνες (binding partners) (Dunker et al. 2005) ή χρησιμεύουν ως εύκαμπτοι σύνδεσμοι λειτουργικών περιοχών, επιτρέποντάς τους να κινούνται χωρίς περιορισμούς και διευκολύνοντας ποικίλες αλληλεπιδράσεις (Dunker et al. 2005; Uversky et al. 2005). Λόγω των σημαντικών βιολογικών λειτουργιών που επιτελούν και του ρόλου τους ως δημοφιλείς κόμβοι (hubs) στα δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών, πολλές IDRs εμπλέκονται σε ασθένειες (Uversky et al. 2008; Midic et al. 2009), όπως ο καρκίνος, τα καρδιαγγειακά νοσήματα, οι νευροεκφυλιστικές παθήσεις και οι αμυλοειδώσεις. Επίσης, ορισμένες πρωτεΐνες παθογόνων μικροβίων και ιών είναι IDPs (Uversky et al. 2008; Uversky et al. 2006; Uversky et al. 2009; Iakoucheva et al. 2002; Mohan et al. 2008; Cheng et al. 2006a; Xue et al. 2010b; Goh et al. 2008a, b, 2009). Η έλλειψη δομής φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο σε πληθώρα ασθενειών (disorder in diseases, D2) (Uversky et al. 2008). 5

6 Παραδείγματα αποτελούν η πρωτεΐνη MeCP2, η οποία σχετίζεται με αναπτυξιακές ανωμαλίες (Ghosh et al. 2010; Yang et al. 2011), η πρωτεΐνη της μυελίνης MBP (myelin basic protein), η οποία σχετίζεται με το αυτοάνοσο νόσημα σκλήρυνση κατά πλάκας (Homchaudhuri et al. 2010), και η πρωτεΐνη tau που σχετίζεται με τη νόσο Alzheimer (Narayanan et al. 2010). Σύμφωνα με τα παραπάνω, οι IDPs αποτελούν πολύ ελκυστικούς στόχους φαρμάκων (Dunker and Uversky 2010). Χρησιμοποιούνται δύο κυρίως προσεγγίσεις για το σχεδιασμό φαρμάκων που στοχεύουν IDPs και IDRs. Πρώτον, παρεμποδίζεται η αλληλεπίδραση της IDR με μια συγκεκριμένη δομημένη (ordered) πρωτεΐνη, με τη βοήθεια ενός φαρμάκου που δρα ανταγωνιστικά και προσδένεται στο τμήμα της δομημένης (ordered) πρωτεΐνης που αλληλεπιδρά με την IDR (Cheng et al. 2006b). Δεύτερον, το φάρμακο στοχεύει απευθείας την IDR, υποχρεώνοντάς την να υιοθετήσει μια δομή διαφορετική από εκείνη που θα αποκτούσε στο σύμπλοκο, εμποδίζοντας έτσι την αλληλεπίδραση (Hammoudeh et al. 2009; Metallo 2010). Εικόνα 2. Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης p53 με 14 διαφορετικά μακρομόρια. Ξεκινώντας από το σύμπλοκο της p53 με το DNA πάνω αριστερά, και ακολουθώντας τη φορά των δεικτών του ρολογιού παρουσιάζονται τα εξής σύμπλοκα: (i) p53 - DNA (PDB ID: 1TSR), (ii) p53-53bp1 6

7 (PDB ID: 1GZH), (iii) p53 - GCN5 (PDB ID: 1Q2D), (iv) p53 ομοτετραμερές (PDB ID: 3SAK), (v) p53 - SET9 (PDB ID: 1XQH), (vi) p53 - κυκλίνη A (PDB ID: 1Η26), (vii) p53 - σιρτουίνη (PDB ID: 1ΜΑ3), (viii) p53 - CBP (PDB ID: 1JSP), (ix) p53 s100ββ (PDB ID: 1DT7), (x) p53 αντιγόνο SV40 (PDB ID: 2H1I), (xi) p53 53BP2 (PDB ID: 1YCS), (xii) p53 PH (PDB ID: 2GS0), (xiii) p53 MDM2 (PDB ID: 1YCR) και (xiv) p53 RPA70 (PDB ID: 2B3G). Στο κεντρικό διάγραμμα, η πρόγνωση για IDRs εντός της πρωτεΐνης p53 (Uversky 2011a) Μέθοδοι Εντοπισμού IDPs και IDRs Η δομική ανάλυση των IDPs παρουσιάζει ορισμένες δυσκολίες, καθώς δεν είναι δυνατός ο καθορισμός μιας μοναδικής δομής για μια απομονωμένη IDP με κρυσταλλογραφία ακτίνων X και οι IDRs εντός δομημένων (ordered) πρωτεϊνών απουσιάζουν στις πειραματικά προσδιορισμένες δομές. Συνεπώς, οι δομικές μελέτες των IDPs στηρίζονται σε βιοφυσικές μεθόδους, οι οποίες παρέχουν πληροφορίες για τη σταθερότητα της στερεοδομής, το σχήμα, τις πιθανές δευτεροταγείς δομές, τις πρόσκαιρες αλληλεπιδράσεις και την κινητικότητα συγκεκριμένων περιοχών των IDPs. Συχνά είναι απαραίτητη μια πολυπαραμετρική προσέγγιση και η χρήση πολλών διαφορετικών τεχνικών για τον πλήρη καθορισμό των δομικών χαρακτηριστικών μιας IDP. Πολλές από τις τεχνικές που χρησιμοποιούνται αναπτύχθηκαν αρχικά για την ανάλυση των δομημένων (ordered) πρωτεϊνών και τα δεδομένα που προκύπτουν θα πρέπει να αξιολογούνται εξαιρετικά προσεκτικά για την αποφυγή λαθών, καθώς είναι η απουσία χαρακτηριστικών των δομημένων (ordered) πρωτεϊνών που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι μια πρωτεΐνη είναι IDP. Κάποιες από τις πιο δημοφιλείς τεχνικές για την ανάλυση των IDPs και των IDRs περιγράφονται παρακάτω: Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ Σε πειράματα προσδιορισμού της δομής πρωτεϊνών με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, η αυξημένη ευελιξία των ατόμων στις μη δομημένες (disordered) περιοχές έχει ως αποτέλεσμα την μη συναφή σκέδαση των ακτίνων Χ, καθιστώντας αυτές «αόρατες» ως μη ηλεκτρονιόπυκνες (missing density). Επίσης, ο B- factor ή παράγοντας θερμοκρασίας αποτελεί μέτρο της θερμικής κίνησης μεμονωμένων ατόμων ή ομάδων ατόμων ενός δείγματος. Ταλαντώσεις των ατόμων οδηγούν σε υψηλότερους B- factors, υποδηλώνοντας μεγαλύτερη ευελιξία και πιθανή έλλειψη δομής (disorder). Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού καταγράφει απορρόφηση ενέργειας που σχετίζεται με μεταπτώσεις πυρήνων μεταξύ γειτονικών πυρηνικών ενεργειακών σταθμών και χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της τρισδιάστατης δομής πρωτεϊνών σε διάλυμα. Βάσει του συντονισμού και των χημικών μετατοπίσεων, μπορεί να δώσει ακριβείς πληροφορίες σχετικά με τη δομή και την κινητικότητα των IDPs και IDRs, καθώς και τον προσωρινό σχηματισμό στοιχείων κανονικής δευτεροταγούς δομής. Επίσης, 7

8 επιτρέπει τον εντοπισμό των αλληλεπιδράσεων μεγάλης εμβέλειας (long- range interactions) των IDPs. Επιπλέον, η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού εντός του κυττάρου αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για το δομικό χαρακτηρισμό των IDPs στο φυσικό τους περιβάλλον. Άλλες διαθέσιμες τεχνικές φασματοσκοπίας παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τη δευτεροταγή ή τριτοταγή δομή της πρωτεΐνης: Φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού Η φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού ανιχνεύει την παρουσία ή την απουσία δευτεροταγούς δομής σε μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Τα φάσματα των IDPs εμφανίζουν μια μεγάλη αρνητική κορυφή στα 200 nm, καθώς και μια τιμή κοντά στο 0 στα 220 nm, και διαχωρίζονται έτσι από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες. Οπτικός στροφικός διασκεδασμός Ο οπτικός στροφικός διασκεδασμός μετράει τη μεταβολή της οπτικής περιστροφής του γραμμικά πολωμένου φωτός που προκαλείται από μια πρωτεΐνη σε διαφορετικά μήκη κύματος ακτινοβολιας, παρέχοντας έτσι πληροφορίες για την παρουσία και τα ποσοστά δευτεροταγούς δομής. Η απουσία καθορισμένης δευτεροταγούς δομής υποδηλώνει ότι η υπό μελέτη πρωτεΐνη πιθανόν να είναι μη δομημένη (disordered). Φασματοσκοπία Raman Η φασματοσκοπία Raman εξετάζει τα ενεργειακά επίπεδα ταλάντωσης των μορίων του δείγματος και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της παρουσία δευτεροταγούς δομής και το φάσμα Raman μιας μη διπλωμένης πρωτεΐνης διαφέρει από εκείνο μιας δομημένης πρωτεΐνης. Φασματοσκοπία υπερύθρου Η φασματοσκοπία υπερύθρου παρέχει πληροφορίες για τις μοριακές ταλαντώσεις λειτουργικών ομάδων, οι οποίες οφείλονται στην έκταση και κάμψη των δεσμών, στην μεταβολή των γωνιών των δεσμών και σε άλλους τύπους κίνησης. Τα αποτελέσματα μπορούν να συγκριθούν με πειραματικά δεδομένα από καθορισμένες δευτεροταγείς δομές (α- έλικες και β- κλώνοι), έτσι ώστε να εντοπιστεί η απουσία τους στις IDPs. Χαρακτηριστικά που σχετίζονται με το φαινόμενο του φθορισμού μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την περιγραφή της ενδομοριακής κινητικότητας μιας IDP, δίνοντας ταυτόχρονα πληροφορίες για το πόσο συμπαγής είναι. Ενδογενής φθορισμός Τρία αμινοξέα φθορίζουν: η τρυπτοφάνη, η τυροσίνη και η φαινυλαλανίνη. Οι παράμετροι εκπομπής (ένταση και μήκος κύματος) εξαρτώνται κυρίως από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως ο διαλύτης και το ph. Για παράδειγμα, ένα πλήρως εκτεθιμένο στο 8

9 διαλύτη κατάλοιπο τρυπτοφάνης μιας IDP φθορίζει στα 350 nm, ενώ όταν βρίσκεται στο μη πολικό εσωτερικό μιας συμπαγούς πρωτεΐνης η εκπομπή μετατοπίζεται στο μπλε μήκος κύματος. Φθορίζων ιχνηθέτης Η άκαμπτη δομή μιας καλά διπλωμένης πρωτεΐνης δε θα επιτρέψει σε ένα φθορίζον μεγάλο υδρόφοβο μόριο να εισέλθει στον πυρήνα της, σε αντίθεση με τη μη συμπαγή δομή των IDPs. Η μεταβολή του περιβάλλοντος του ιχνηθέτη μετά την εισαγωγή του στον πυρήνα της πρωτεΐνης ανιχνεύεται ως αλλαγές στο φθορισμό του. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) Η τεχνική FRET καταγράφει τη μεταφορά ενέργειας μεταξύ δύο χρωμοφόρων και χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της απόστασής τους. Η ευελιξία και η έλλειψη δομής (disorder) παρατηρείται ως αλλαγή αυτής της απόστασης. Η αυξημένη ευελιξία των IDPs και των IDRs, καθώς και η διαφορετική από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες σταθερότητα της στερεοδιαμόρφωσής τους μπορεί να πιστοποιηθεί περαιτέρω: Ευαισθησία σε πρωτεάσες Οι IDPs παρουσιάζουν αυξημένους ρυθμούς πρωτεολυτικής αποικοδόμησης in vitro, λόγω της αυξημένης τους ευελιξίας που επιτρέπει την εύκολη πρόσβαση σε πρωτεάσες. Να σημειωθεί ότι η ημιζωή των πρωτεϊνών in vivo δεν εξαρτάται παρά ελάχιστα από την απουσία δομής (disorder) (Tompa et al. 2008). Στην πραγματικότητα, δεν υπάγονται όλες οι IDPs σε άμεση αποικοδόμηση, αλλά όλες (ή σχεδόν όλες) οι πρωτεΐνες που αποικοδομούνται γρήγορα είναι IDPs ή περιέχουν IDRs με σήματα αποικοδόμησης (Uversky and Dunker 2012). Ανοσοχημεία (χρήση αντισωμάτων) Οι ανοσοσφαιρίνες έναντι μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης μπορεί να είναι εξειδικευμένες για την πρωτοταγή, τη δευτεροταγή ή την τριτοταγή δομή της. Συνεπώς, είναι δυνατή η χρήση αντισωμάτων για την επιτυχή μελέτη της δομικής κατάστασης μιας πρωτεΐνης. Σταθερότητα σε ακραία ph Οι IDRs δεν υφίστανται εκτεταμένες δομικές αλλαγές με την αλλαγή του ph, λόγω των υψηλών ποσοστών φορτισμένων καταλοίπων που περιέχουν και της εκτεταμένης μορφής τους. Σταθερότητα σε ακραίες θερμοκρασίες Οι δομημένες (ordered) πρωτεΐνες αποδιατάσσονται σε υψηλές θερμοκρασίες, ενώ οι μη δομημένες (disordered) μπορεί να διπλωθούν λόγω αυξημένων υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Ανταλλαγή υδρογόνου δευτέριου 9

10 Ο ρυθμός ανταλλαγής μεταξύ δευτέριου στο διαλύτη και υδρογόνου στις αμινομάδες της πρωτεΐνης επηρεάζεται από τους δεσμούς υδρογόνου, την έκθεση των αμινομάδων στο διαλύτη και την ευελιξία της πρωτεΐνης. Αυξημένος ρυθμός ανταλλαγής υποδηλώνει περισσότερο ευέλικτη (και πιθανά μη δομημένη disordered) πρωτεΐνη. Οι IDPs έχουν αυξημένους υδροδυναμικούς όγκους και άλλες ιδιότητες που τις διαφοροποιούν από δομημένες (ordered) πρωτεΐνες αντίστοιχου μοριακού βάρους. SDS- PAGE Λόγω της αφθονίας πολικών αμινοξέων στη σύστασή τους, οι IDPs δεσμεύουν λιγότερο SDS από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα την ασυνήθιστη κινητικότητα τους σε πηκτώματα πολυακρυλαμίδης- SDS σε σύγκριση με δομημένες (ordered) πρωτεΐνες αντίστοιχου μοριακού βάρους. Ιξωδομετρία Το ιξώδες ενός δείγματος επηρεάζεται από το μοριακό βάρος, το σχήμα και τη στερεοδιαμόρφωση μια πρωτεΐνης. Συγκρίνοντας τη συμπεριφορά της πρωτεΐνης υπό μελέτη με εκείνη πρωτεϊνών γνωστής δομής και παρόμοιου μεγέθους, είναι δυνατόν να καθοριστεί η σχετική έλλειψη δομής (disorder) της πρωτεΐνης. Σκέδαση ακτίνων Χ Η ανάλυση των δεδομένων από πειράματα σκέδασης ακτίνων Χ με τη μορφή διαγραμμάτων Kratky (Kratky and Pilz 1972) παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την σφαιρικότητα και την ευελιξία μιας πρωτεΐνης. Σκέδαση νετρονίων Η σκέδαση νετρονίων από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει την υπό μελέτη πρωτεΐνη παρέχει πληροφορίες για το μέγεθος και το σχήμα μιας πρωτεΐνης. Σκέδαση φωτός (δυναμική, στατική) Στη μέθοδο αυτή, μια ακτίνα φωτός διαπερνάει ένα δείγμα και η σκέδαση της ακτίνας παρέχει πληροφορίες για την υδροδυναμική ακτίνα της πρωτεΐνης, η οποία εξαρτάται από το μέγεθος και τη στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης. Αναλυτική υπερφυγοκέντρηση Η υπερφυγοκέντρηση βασίζεται στην οπτικοποίηση της συμπεριφοράς ενός μακρομορίου σε πραγματικό χρόνο κατά τη διαδικασία της καθίζησης, επιτρέποντας τον εξαιρετικά ακριβή καθορισμό των υδροδυναμικών και των θερμοδυναμικών παραμέτρων μιας πρωτεΐνης. Τα δεδομένα αυτά συγκρίνονται με τα αντίστοιχα μιας σφαιρικής υδατοδιαλυτής πρωτεΐνης ίδιας μάζας. Η αναλυτική υπερφυγοκέντρηση είναι επίσης χρήσιμη στην καταγραφή αλλαγών στην στερεοδιαμόρφωση. 10

11 Ο ακριβής χαρακτηρισμός των IDPs απαιτεί την κατανόηση των ιδιοτήτων μεμονωμένων πρωτεϊνικών μορίων, με χρήση τεχνικών μικροσκοπίας. Μικροσκοπία ατομικής ισχύος Η μικροσκοπία ατομικής ισχύος υψηλής ταχύτητας (high- speed atomic force microscopy, AFM) επιτρέπει την άμεση οπτικοποίηση των βιολογικών δειγμάτων υπό φυσιολογικές συνθήκες και μπορεί να συλλάβει τις αλλαγές στη δομή των IDPs. Ηλεκτρονική μικροσκοπία με σκίαση Ένα πρωτεϊνικό δείγμα καλύπτεται από ένα βαρύ μέταλλο, όπως η πλατίνα, αποκαλύπτοντας τα χαρακτηριστικά της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης σε υψηλή ανάλυση Αλγόριθμοι Πρόγνωσης IDPs και IDRs Βάσει ενός πολύ μικρού αριθμού πρωτεϊνών, ο Williams πρότεινε μια πρώτη προσέγγιση για την αναγνώριση των IDPs βάσει της αμινοξικής τους αλληλουχίας (Williams 1979). Συγκεκριμένα, υπέθεσε ότι ο λόγος του αριθμού των φορτισμένων αμινοξέων προς τον αριθμό των υδρόφοβων αμινοξέων θα μπορούσε να αποτελέσει κριτήριο διαχωρισμού των IDPs από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες. Ωστόσο, τα καλά αποτελέσματα της μεθόδου στο αρχικό μικρό σύνολο δεδομένων δεν επαληθεύτηκαν σε μεγαλύτερα, καθώς αρκετές δομημένες (ordered) και μη δομημένες (disordered) πρωτεΐνες επικαλύπτονταν στο σχετικό διάγραμμα φορτίου υδροφοβικότητας (He et al. 2009). Αρχικά, στόχος ήταν ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών σε δομημένες (ordered) ή μη δομημένες (disordered). Στη συνέχεια, όταν έγινε κατανοητό ότι δομημένες (ordered) και μη δομημένες (disordered) περιοχές μπορεί να συνυπάρχουν στην ίδια πρωτεΐνη, οι αλγόριθμοι επικεντρώθηκαν στην πρόγνωση μη δομημένων (disordered) τμημάτων εντός μιας δομημένης (ordered) πρωτεΐνης. Ο πρώτος επίσημος αλγόριθμος πρόγνωσης που δημοσιεύτηκε βασιζόταν στην εξειδικευμένη αμινοξική σύσταση των IDPs και των IDRs (Romero et al. 1997). Στη συνέχεια, αυτοί οι αλγόριθμοι πρόγνωσης ονομάστηκαν PONDRs (Predictors of Naturally Disordered Regions). Ένας τυπικός αλγόριθμος PONDR χρησιμοποιεί ένα κυλιόμενο παράθυρο και αντλεί πληροφορίες από την αμινοξική σύσταση, την πολυπλοκότητα (complexity), καθώς και την υδροφοβικότητα, το καθαρό φορτίο και άλλα χαρακτηριστικά που προκύπτουν από την αλληλουχία της πρωτεΐνης. Οι πληροφορίες αυτές ζυγίζονται και συνδυάζονται με μη γραμμικό τρόπο μέσω τεχνητών νευρωνικών δικτύων (artificial neural networks, ANNs) ή support vector machines (SVMs). 11

12 Εικόνα 3. Σύγκριση του καθαρού φορτίου και της μέσης υδροφοβικότητας 250 δομημένων (λευκοί κύκλοι) και 91 εγγενώς μη δομημένων πρωτεϊνών (μαύροι ρόμβοι). Η ευθεία αναπαριστά το όριο μεταξύ δομημένων και μη δομημένων πρωτεϊνών. Αν και ο διαχωρισμός δεν είναι απολύτως ξεκάθαρος, οι μη δομημένες (disordered) πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερο απόλυτο καθαρό φορτίο και μικρότερη μέση υδροφοβικότητα από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες. Στο διάγραμμα φαίνονται επίσης σχηματικά οι δομές των μη δομημένων (disordered) πρωτεϊνών, οι οποίες είναι μη κανονικές με ελάχιστα στοιχεία δευτεροταγούς δομής, και των δομημένων (ordered) πρωτεϊνών, με εκτεταμένη κανονική δευτεροταγή δομή και καθορισμένη τριτοταγή δομή. Το 2000 έγινε ξανά μια προσπάθεια να χρησιμοποιηθούν το φορτίο και η υδροφοβικότητα για την πρόγνωση των IDPs και των IDRs, όπως φαίνεται στην Εικόνα 3 (Uversky et al. 2000). Αυτή η προσέγγιση βασίζεται στη λογική ότι το δίπλωμα μιας πρωτεΐνης καθορίζεται από την ισορροπία μεταξύ ελκτικών δυνάμεων (π.χ. υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων) και απωστικών δυνάμεων (π.χ. ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων). Έτσι, αντί για το ολικό φορτίο, θεωρήθηκε ότι το καθαρό φορτίο είναι πιο κατάλληλο για χρήση στο διάγραμμα φορτίου υδροφοβικότητας, το οποίο διαχωρίζει τις IDPs από τις δομημένες (ordered) πρωτεΐνες. Να σημειωθεί ότι το ολικό φορτίο μιας πρωτεΐνης υπολογίζεται ως το άθροισμα των φορτισμένων καταλοίπων λυσίνη, αργινίνη, ασπαρτικό και γλουταμικό, ενώ το καθαρό φορτίο ως το άθροισμα των θετικά φορτισμένων καταλοίπων λυσίνη και αργινίνη μείον το άθροισμα των αρνητικά φορτισμένων καταλοίπων ασπαρτικό και γλουταμικό. 12

13 Από τότε, έχουν κατασκευαστεί πολλοί αλγόριθμοι, όπως φαίνεται στην Εικόνα 4, οι οποίοι εκμεταλλεύονται τις ιδιαίτερες βιοχημικές ιδιότητες και την αμινοξική σύσταση των IDPs και των IDRs, χρησιμοποιώντας διαφορετικές υπολογιστικές τεχνικές. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται επιγραμματικά μερικοί από τους πιο σημαντικούς και ενδιαφέροντες αλγόριθμους πρόγνωσης για IDPs και IDRs, με χρονολογική σειρά. Οι διαθέσιμοι αλγόριθμοι συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα 1. ~ 2001 ~ PONDR VL- XT: εκπαιδεύτηκε με μεγάλες IDRs (VL: Variously characterized Long) και IDRs που εντοπίζονται στα άκρα των πρωτεϊνών (Χ- ray characterized Terminal regions), καθώς τα χαρακτηριστικά της έλλειψης δομής (disorder) μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με τη θέση της IDR στην αλληλουχία (Romero et al. 2001). Ιστοσελίδα: ~ 2003 ~ GlobPlot: βασίζεται στην προδιάθεση των αμινοξέων να συμμετέχουν σε δομημένα ή μη πρωτεϊνικά τμήματα και χρησιμοποιεί μια κλίμακα βασισμένη στην πιθανότητα ένα δεδομένο κατάλοιπο να βρίσκεται σε τυχαία (random coil) ή κανονική δευτεροταγή δομή (Linding et al. 2003b). Ιστοσελίδα: DisEMBL: αποτελείται από τρία τεχνητά νευρωνικά δίκτυα (artificial neural networks, ANN) και προβλέπει τρία είδη μη δομημένων περιοχών στις πρωτεΐνες, loops/coils (όπως ορίζονται από το DSSP), hot loops (θηλιές με υψηλό B- factor) και missing atom density regions (περιοχές που απουσιάζουν από τις κρυσταλλογραφικά προσδιορισμένες δομές της PDB (Linding et al. 2003a). Ιστοσελίδα: ~ 2004 ~ DISOPRED2: εκπαιδεύτηκε με ολόκληρες αλληλουχίες πρωτεϊνών, οι οποίες είχαν κρυσταλλογραφικά προσδιορισμένες δομές. Θεωρεί ως μη δομημένες (disordered) τις περιοχές που αποτελούνται από κατάλοιπα χωρίς συντεταγμένες (missing density residues) και χρησιμοποιεί support vector machines (SVMs) (Ward et al. 2004). Ιστοσελίδα: FoldUnfold: βασίζεται στην ιδέα ότι η δομή των πρωτεϊνών καθορίζεται από την ισορροπία μεταξύ της ενέργειας αλληλεπίδρασης και της εντροπίας. Περιοχές της πρωτεΐνης με 13

14 χαμηλή πυκνότητα πακεταρίσματος (packing density) αντιστοιχούν στις IDRs (Garbuzynskiy et al. 2004; Galzitskaya et al. 2006a). ~ 2005 ~ IUPred: βασίζεται στην ιδέα ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καταλοίπων είναι υπεύθυνες για την έλλειψη δομής (Dosztanyi et al. 2005a, b). Ιστοσελίδα: RONN: βασίζεται σε στοιχίσεις αμινοξικών αλληλουχιών, καθώς παρόμοιες αλληλουχίες θεωρείται ότι έχουν παρόμοια δομή και λειτουργία (Yang et al. 2005). Ιστοσελίδα: FoldIndex: προβλέπει την παρουσία IDRs σε μια αμινοξική αλληλουχία, εφαρμόζοντας τοπικά το διάγραμμα φορτίου - υδροφοβικότητας (Prilusky et al. 2005). Ιστοσελίδα: ~ 2006 ~ PONDR- VSL2: εξειδικεύεται τόσο σε μεγάλες όσο και σε μικρές (VSL: Variously characterized Short and Long) IDRs. Χρησιμοποιεί support vector machines (SVMs) (Peng et al. 2006). Ιστοσελίδα: Spritz: αποτελείται από δύο αλγόριθμους, για την πρόγνωση μικρών και μεγάλων IDRs, αντίστοιχα (Vullo et al. 2006). Ιστοσελίδα: ~ 2007 ~ PrDOS: αποτελείται από δύο αλγόριθμους, ένας από τους οποίους χρησιμοποιεί εξελικτική πληροφορία με τη μορφή πολλαπλών στοιχίσεων (Ishida and Kinoshita 2007). Ιστοσελίδα: bin/top.cgi POODLE- S: βασίζεται σε φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και εξελικτική πληροφορία με τη μορφή πολλαπλών στοιχίσεων. Χρησιμοποιεί επτά support vector machines (SVMs) και εξετάζει ξεχωριστά το αμινοτελικό άκρο, το καρβοξυτελικό άκρο και τις ενδιάμεσες περιοχές της αλληλουχίας (Shimizu et al. 2007a). Ιστοσελίδα: s.html POODLE- L: βασίζεται σε φυσικοχημικές ιδιότητες των αμινοξέων και αποτελείται από δέκα αλγόριθμους SVM δύο επιπέδων (Hirose et al. 2007). 14

15 Ιστοσελίδα: l.html POODLE- W: έχει εκπαιδευτεί με πληθώρα αλληλουχιών άγνωστης δομής και χρησιμοποιεί ένα Spectral Graph Transducer (SGT) (Shimizu et al. 2007b). Ιστοσελίδα: w.html ~ 2008 ~ OnD- CRFs: βασίζεται στην αμινοξική σύσταση και στην προβλεπόμενη δευτεροταγή δομή και χρησιμοποιεί Conditional Random Fields (CRF) (Wang and Sauer 2008). Ιστοσελίδα: crf DISOclust: βασίζεται στην ιδέα ότι τα δομημένα (ordered) κατάλοιπα είναι συντηρημένα, ενώ τα μη δομημένα (disordered) ποικίλουν ή λείπουν (McGuffin 2008). Ιστοσελίδα: MetaPrDOS: είναι συναινετικός αλγόριθμος πρόγνωσης, ο οποίος συνδυάζει τα αποτελέσματα των PrDOS, DISOPRED2, DisEMBL, DISPROT, DISpro, IUPred και POODLE- S (Ishida and Kinoshita 2008). Ιστοσελίδα: bin/meta/top.cgi ~ 2009 ~ CDF- it- all: είναι συνδυαστική μέθοδος που χρησιμοποιεί ένα τεχνητό νευρωνικό δίκτυο (artificial neural network, ANN), το οποίο βασίζεται στα αποτελέσματα των PONDR- VXLT, PONDR VSL2, PONDR VL3, TOP- IDP, IUPred και FoldIndex (Xue et al. 2009b). Ιστοσελίδα: MD: είναι συναινετικός αλγόριθμος πρόγνωσης, ο οποίος συνδυάζει τα αποτελέσματα των NORSnet, Ucon, PROFBval, DISOPRED2, IUPred και FoldIndex (Schlessinger et al. 2009). Ιστοσελίδα: ~ 2010 ~ PONDR- FIT: είναι συναινετικός αλγόριθμος πρόγνωσης, συνδυάζει τα αποτελέσματα των PONDR- VLXT, PONDR- VSL2, PONDR- VL3, FoldIndex, IUPred και TopIDP (Xue et al. 2010a). Ιστοσελίδα: fit.php ~ 2011 ~ 15

16 DisCon: συσσωρεύει και συνδυάζει πληροφορίες τόσο στο επίπεδο των αμινοξικών καταλοίπων όσο και ολόκληρης της αλληλουχίας, σχετικά με την την προβλεπόμενη δευτεροταγή δομή, την προσβασιμότητα στο διαλύτη και την ευελιξία. Χρησιμοποιεί επίσης εξελικτικές στοιχίσεις και δεδομένα για γνωστές δομικές αυτοτελείς περιοχές (Mizianty et al. 2011). Ιστοσελίδα: Εικόνα 4. Ο αριθμός των υπάρχοντων αλγόριθμων πρόγνωσης για IDPs και IDRs από το 1979 μέχρι το Παρατηρείται εκθετική αύξηση των αλγόριθμων την τελευταία δεκαετία, η οποία αντικατοπτρίζει το αυξημένο ενδιαφέρον για τις IDPs και τις IDRs. Πίνακας 1. Οι διαθέσιμοι αλγόριθμοι πρόγνωσης IDPs και IDRs. Αλγόριθμος Έτος Ιστοσελίδα Αναφορά PONDR VL- XT (Romero et al. 2001) GlobPlot (Linding et al. 2003b) DisEMBL (Linding et al. 2003a) DISOPRED (Ward et al. 2004) IUPred (Dosztanyi et al. 2005a, b) RONN (Yang et al. 2005) FoldIndex (Prilusky et al. 2005) 16

17 ex PONDR- VSL predictorvsl2.php (Peng et al. 2006) Spritz (Vullo et al. 2006) PrDOS bin/top.cgi (Ishida and Kinoshita 2007) POODLE- S s.html POODLE- L l.html POODLE- W w.html (Shimizu et al. 2007a) (Hirose et al. 2007) (Shimizu et al. 2007b) OnD- CRFs crf (Wang and Sauer 2008) DISOclust: SOclust/DISOclust_form.html MetaPrDOS bin/meta/top.cgi (McGuffin 2008) (Ishida and Kinoshita 2008) CDF- it- all (Xue et al. 2009b) MD (Schlessinger et al. 2009) PONDR- FIT fit.php DisCon on (Xue et al. 2010a) (Mizianty et al. 2011) Βάσεις Δεδομένων για IDPs και IDRs Λόγω της αφθονίας και της λειτουργικής σημαντικότητάς τους, εξειδικευμένες βάσεις δεδομένων όπως η DisProt, η MobiDB και η IDEAL είναι αφιερωμένες στις IDPs και στις IDRs. DisProt Η DisProt (Database of Protein Disorder) είναι μια βάση δεδομένων που παρέχει πληροφορίες για τις πρωτεΐνες που δε διαθέτουν σταθερή τρισδιάστατη δομή υπό φυσιολογικές συνθήκες, είτε στο σύνολο της αλληλουχίας τους, είτε σε ένα τμήμα τους. Οι εγγραφές της βασίζονται αποκλειστικά σε δημοσιευμένα πειραματικά δεδομένα. Περιέχει 684 IDPs και 1513 IDRs (release date: ). Η DisProt είναι αποτέλεσμα της 17

18 συνεργασίας μεταξύ του Κέντρου Υπολογιστικής Βιολογίας και Βιοπληροφορικής (Center for Computational Biology and Bioinformatics, School of Medicine, Indiana University) και του Κέντρου Πληροφορικής και Tεχνολογίας (Center for Information Science and Technology, Temple University) (Vucetic et al. 2005; Sickmeier et al. 2007). Ιστοσελίδα: MobiDB H MobiDB (Database of Protein Disorder and Mobility Annotations) στοχεύει στην επέκταση των πληροφοριών που εντοπίζονται στην DisProt και την PDB και στην παροχή μιας κεντρικής πηγής δεδομένων για τις IDPs και τις IDRs, η οποία θα καλύπτει πλήρως τη SwissProt. Σε περίπτωση απουσίας πειραματικών δεδομένων χρησιμοποιεί τρεις αλγόριθμους πρόγνωσης (Espritz, IUPred και DisEMBL). Έτσι επιτρέπει τόσο το χαρακτηρισμό μεμονωμένων πρωτεϊνών, όσο και τη δημιουργία συνόλων δεδομένων πρωτεϊνών με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. H MobiDB- xp περιέχει πειραματικά σχολιασμένες πρωτεΐνες και η MobiDB- full περιέχει σχολιασμένες πρωτεΐνες (release date: ) (Di Domenico et al. 2012). Ιστοσελίδα: mobidb.bio.unipd.it IDEAL H IDEAL (Intrinsically Disordered proteins with Extensive Annotations and Literature) παρέχει πληροφορίες για τις πειραματικά προσδιορισμένες IDPs και IDRs, προσδιορίζοντας τη θέση, τη δομή και τις λειτουργικές περιοχές τους (π.χ. περιοχές αλληλεπίδρασης ή μετα- μεταφραστικών τροποποιήσεων). Περιέχει 209 εγγραφές (release date: ) (Fukuchi et al. 2011). Ιστοσελίδα: u.ac.jp/ideal ComSin H ComSin περιέχει πρωτεϊνες των οποίων η δομή έχει προσδιοριστεί σε τόσο σε σύμπλοκο ( complex ) όσο και ως μονομερές ( single ). Η βάση δεδομένων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μελέτη των IDRs των πρωτεϊνών αυτών, και συγκεκριμένα για τον εντοπισμό πρωτεϊνικών τμημάτων που αποκτούν καθορισμένη δομή μέσω της δημιουργίας του συμπλόκου (disorder- to- order transition) και το αντίστροφο (order- to- disorder transition). Επίσης, παρέχει πληροφορία για τις γενικότερες δομικές αλλαγές που υφίστανται οι πρωτεΐνες κατά το σχηματισμό των συμπλόκων (Lobanov et al. 2010). Ιστοσελίδα: 18

19 1.7. Χαρακτηριστικά Μοριακής Αναγνώρισης Πολλές IDPs, μετά την αλληλεπίδρασή τους με κάποια πρωτεΐνη (binding partner), αποκτούν σταθερή δομή (disorder- to- order transition upon binding) (Dyson and Wright 2002; Dunker et al. 2001; Dunker and Obradovic 2001; Dunker et al. 2002b; Dunker et al. 2002a; Wright and Dyson 1999; Dyson and Wright 2005; Uversky et al. 2005). Αυτές οι μικρές περιοχές πρόσδεσης ονομάστηκαν χαρακτηριστικά μοριακής αναγνώρισης (Molecular Recognition Features (MoRFs) ή Molecular Recognition Elements (MoREs)) (Oldfield et al. 2005b). Όπως υποδηλώνει το όνομά τους, θεωρείται ότι εμπλέκονται στη μοριακή αναγνώριση, διαδικασία που αποτελεί το πρώτο βήμα στις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις (Mohan et al. 2006). Εικόνα 5. Οι τέσσερις κατηγορίες των MoRFs ανάλογα με τη δευτεροταγή δομή που αποκτούν μετά την αλληλεπίδρασή τους με κάποια άλλη πρωτεΐνη: (A) α- MoRF (PDB ID: 1H2S), (Β) β- MoRF (PDB ID: 2X9A), (Γ) i- MoRF (PDB ID: 3CHW) και (Δ) complex MoRF (PDB ID: 1XF6). Οι δομές των συμπλόκων οπτικοποιήθηκαν με τη βοήθεια του εργαλείου Chimera (Pettersen et al. 2004). Ta MoRFs έχουν μήκος από 10 έως 70 κατάλοιπα, αν και η πλειοψηφία τους κυμαίνεται από 10 έως 20 κατάλοιπα. Μετά την πρόσδεσή τους σε κάποια άλλη πρωτεΐνη (binding 19

20 partner), σχηματίζουν α- έλικες (α- MoRFs), β- κλώνους (β- MoRFs), μη κανονικές δομές (i- MoRFs) ή συνδυασμούς αυτών των στοιχείων (complex MoRFs), όπως φαίνεται στην Εικόνα 5. Σχεδόν τα μισά MoRFs κατηγοριοποιούνται ως i- MoRFs (Mohan et al. 2006). Η αμινοξική σύσταση των MoRFs μοιάζει με εκείνη των IDRs, καθώς είναι εμπλουτισμένα σε κατάλοιπα που θεωρούνται ότι ευνοούν την έλλειψη δομής (disorder- promoting), έχουν υψηλό καθαρό φορτίο και μειωμένη περιεκτικότητα σε αρωματικά κατάλοιπα. Ο εμπλουτισμός τους σε προλίνη σχετίζεται με την παρουσία ελίκων πολυ- προλίνης, η οποία είχε παρατηρηθεί και σε IDRs (Mohan et al. 2006; Syme et al. 2002). Οι έλικες πολυ- προλίνης (poly- L- proline II helix, PPII) είναι αριστερόστροφες, με βήμα 3.2Å, τρία κατάλοιπα ανά στροφή και γωνίες φ και ψ - 75ο και +145ο αντίστοιχα. Όπως υποδηλώνει το όνομά τους, παρατηρούνται συνήθως σε περιοχές πλούσιες σε προλίνη (Williamson 1994), αλλά και άλλες αλληλουχίες μπορούν να υιοθετήσουν αυτή τη δομή (Pappu and Rose 2002; Shi et al. 2002). Ωστόσο, τα MoRFs παρουσιάζουν αυξημένη περιεκτικότητα σε κυστεΐνη και φαινυλαλανίνη, κατάλοιπα που θεωρούνται ότι ευνοούν την καθορισμένη δομή στις πρωτεΐνες (order- promoting). Η αυξημένη κυστεΐνη εξηγείται λόγω των δισουλφιδικών δεσμών, καθώς το 15% των MoRFs συμμετέχει στο σχηματισμό ενός τουλάχιστον ενδομοριακού ή διαμοριακού δισουλφιδικού δεσμού. Τα MoRFs που πιθανά σταθεροποιούνται μέσω ενός ενδομοριακού δισουλφιδικού δεσμού, χωρίς να είναι απαραίτητη η αλληλεπίδρασή τους με κάποια άλλη πρωτεΐνη (binding partner), ονομάστηκαν ψευδο- MoRFs. Παρτηρήθηκε επίσης ότι η συντριπτική πλειοψηφία των MoRFs περιέχουν τουλάχιστον μια φαινυλαλανίνη, η οποία πιθανόν παίζει σημαντικό ρόλο στη μοριακή αναγνώριση καθώς η πλευρική της αλυσίδα εμπλέκεται σε ισχυρές και εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις (Mohan et al. 2006; Burley and Petsko 1985). Περαιτέρω μελέτες με στόχο τον χαρακτηρισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των MoRFs και των πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρούν (binding partners), έχουν δείξει ότι οι επιφάνειες αλληλεπίδρασης τους διαθέτουν μοναδική αμινοξική σύσταση, καθώς και διακριτές γεωμετρικές και φυσικοχημικές ιδιότητες (Vacic et al. 2007a). Τα γραμμικά μοτίβα των ευκαρυωτικών οργανισμών (Eukaryotic Linear Motifs (ELMs)) (Dinkel et al. 2012) και τα μικρά γραμμικά μοτίβα (Short Linear Motifs (SLiMs)) (Davey et al. 2010; Davey et al. 2012a; Davey et al. 2011), προκύπτουν από το κοινό μοτίβο μιας ομάδας αλληλουχιών που μπορεί να σχετίζεται με μια μοριακή λειτουργία, όπως είναι η αλληλεπίδραση με μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη (binding partner). Ουσιαστικά περιγράφουν τα ίδια στοιχεία πρόσδεσης με τα MoRFs (Hsu et al. 2012). Τόσο τα γραμμικά μοτίβα όσο και τα MoRFs αναφέρονται σε μικρά πρωτεϊνικά τμήματα, τα οποία εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις πεπτιδίου πρωτεΐνης (Trabuco et al. 2012). Τα γραμμικά μοτίβα συχνά εντοπίζονται εντός των IDRs και αποκτούν καλά καθορισμένη δομή μετά την αλληλεπίδρασή τους με άλλες πρωτεΐνες (Stein and Aloy 2008; Davey et al. 2012b), όπως και τα MoRFs. Επιπλέον, έχει διαπιστωθεί ότι τα MoRFs και τα γραμμικά μοτίβα 20

21 αλληλοεπικαλύπτονται σε σημαντικό βαθμό σε πρωτεϊνικές αλληλουχίες (Meszaros et al. 2012). Βάσει των παραπάνω παρατηρήσεων, έχουν προταθεί ορισμένοι αλγόριθμοι πρόγνωσης των MoRFs (Oldfield et al. 2005b; Cheng et al. 2007; Mohan et al. 2006; Dosztanyi et al. 2009; Disfani et al. 2012). Τα MoRFs συχνά εντοπίζονται σε δομημένες πρωτεϊνικές περιοχές που περιβάλλονται από μεγάλες περιοχές που έχουν προβλεφθεί ως μη δομημένες, όπως φαίνεται στην Εικόνα 6 (Mohan et al. 2006). Η διαπίστωση αυτή χρησιμοποιήθηκε τόσο στους πρώτους αλγόριθμους που αναπτύχθηκαν συγκεκριμένα για τα α- MoRFs (Cheng et al. 2007; Oldfield et al. 2005b), όσο και στο MoRFpred (Disfani et al. 2012), που μαζί με το ANCHOR (Dosztanyi et al. 2009) αποτελούν τους δύο νέους αλγόριθμους για την πρόγνωση των MoRFs. Πρόσφατα επίσης δημιουργήθηκε το SLiMpred (Mooney et al. 2012), το οποίο προβλέπει SLiMs. Και οι τρείς αλγόριθμοι, ANCHOR, MoRFpred και SLiMpred, είναι διαθέσιμοι στο διαδίκτυο. 21

22 Εικόνα 6. Πρόγνωση των MoRFs της πρωτεΐνης p53. Πραγματοποιήθηκε πρόγνωση για τα μη δομημένα τμήματα της πρωτεΐνης με τη βοήθεια του αλγόριθμου PONDR VL- XT. Οι μικρές περιοχές που προβλέπονται από τον αλγόριθμο ως δομημένες (ordered) και βρίσκονται εντός μεγαλύτερων περιοχών που προβλέπονται ως μη δομημένες (disordered) αντιστοιχούν στις θέσεις αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης p53 με άλλα μακρομόρια. Παρουσιάζονται τα εξής σύμπλοκα: (a) p53 MDM2 (PDB ID: 1YCR), (b) p53 - DNA (PDB ID: 1TSR), (c) p53 ομοτετραμερές (PDB ID: 3SAK) και (d) p53 s100ββ (PDB ID: 1DT7) (Mohan et al. 2006). ANCHOR Το ANCHOR είναι ένα εργαλείο πρόγνωσης εγγενώς μη δομημένων περιοχών που αποκτούν σταθερή δομή όταν προσδεθούν σε μια πρωτεΐνη (binding partner) (disorder- to- order transition upon binding). Ο αλγόριθμος αναγνωρίζει αυτές τις περιοχές εντός μιας 22

23 αμινοξικής αλληλουχίας βάσει τριών κριτηρίων: (1) βρίσκονται εντός IDRs σύμφωνα με τον αλγόριθμο πρόγνωσης IUPred (Dosztanyi et al. 2005a), (2) δεν σχηματίζουν αρκετές ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις για να διπλώσουν ανεξάρτητα και (3) πιθανόν κερδίζουν από ενεργειακή άποψη και σταθεροποιούνται μέσω της αλληλεπίδρασης με μια σφαιρική υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη (binding partner) (Dosztanyi et al. 2009; Meszaros et al. 2009). Ιστοσελίδα: MoRFpred Το MoRFpred, o πιο πρόσφατος αλγόριθμος για την πρόγνωση των MoRFs, χρησιμοποιεί support vector machines (SMVs) για να προβλέψει όλους τους τύπους των MoRFs. Εκμεταλλεύεται εξελικτική πληροφορία με τη μορφή πολλαπλών στοιχίσεων και επιλεγμένες φυσικοχημικές ιδιότητες των καταλοίπων, καθώς και προγνώσεις σχετικά με την έλλειψη δομής (disorder), την προσβασιμότητα του διαλύτη και τους B- factors (παράγοντες θερμοκρασίας). Θεωρείται ότι έχει καλύτερη απόδοση στην πρόγνωση από το ANCHOR (Disfani et al. 2012). Ιστοσελίδα: ws.ece.ualberta.ca/morfpred/index.html SLiMpred Το SLiMpred πραγματοποιεί πρόγνωση SLiMs, χρησιμοποιώντας τεχνικές μηχανικής μάθησης καθώς και δομικά, βιοφυσικά και βιοχημικά δεδομένα (Mooney et al. 2012). Ιστοσελίδα: Μεμβρανικές πρωτεΐνες Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τη λιπιδική διπλοστιβάδα και χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: τις διαμεμβρανικές, οι οποίες διαπερνούν τη λιπιδική διπλοστιβάδα μία ή περισσότερες φορές, τις περιφερειακές μεμβρανικές, οι οποίες συνδέονται μη ομοιοπολικά με τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ή με μεμβρανικά λιπίδια και τις αγκυροβολημένες, οι οποίες συνδέονται ομοιοπολικά με μεμβρανικά λιπίδια. Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν κατά προσέγγιση το 30% των γονιδιωμάτων (Krogh et al. 2001) και είναι υπεύθυνες για μια πληθώρα κυτταρικών λειτουργιών, όπως η μεταγωγή σήματος, η μεταφορά ουσιών, η επιφανειακή κυτταρική προσκόλληση, η ενζυμική κατάλυση και η παραγωγή ενέργειας (von Heijne 2007). Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες διακρίνονται σε α- ελικοειδείς (τα διαμεμβρανικά τμήματα είναι α- έλικες) και σε β- βαρέλια (τα διαμεμβρανικά τμήματα είναι β- κλώνοι) (Berg et al. 2002). Τα β- βαρέλια εντοπίζονται αποκλειστικά στην εξωτερική μεμβράνη των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, καθώς και στα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες. Χρησιμεύουν κυριώς 23

24 ως κανάλια παθητικής διάχυσης για τη μεταφορά μικρών μορίων. Πολλά β- βαρέλια χρησιμοποιούνται για την πρόσδεση βακτηριοφάγων ή βακτηριακών τοξινών, καθώς βρίσκονται εκτεθειμένα στην επιφάνεια των βακτηριακών κυττάρων (von Heijne 2007). Αντίθετα, οι α- ελικοειδείς διαμεμβρανικές πρωτεΐνες εντοπίζονται σε όλους τους τύπους μεμβρανών, ενώ είναι πολύ περισσότερες και παρουσιάζουν πολύ μεγαλύτερη ποικιλομορφία στις λειτουργίες τους από τα β- βαρέλια: μεταξύ άλλων δρουν ως υποδοχείς, μεταφορείς, κανάλια και ένζυμα. Σε μονοκύτταρους μικρο- οργανισμούς, όπως είναι το βακτήριο Escherichia coli και ο ζυμομύκητας Saccharomyces cerevisiae, 40-50% των διαμεμβρανικών πρωτεΐνών εμπλέκονται στη μεταφορά μικρών μορίων. Αντίθετα, στους πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, σημαντικότερο ρόλο παίζουν οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος. Έτσι, περίπου το 15% όλων των ανθρώπινων μεμβρανικών πρωτεϊνών είναι υποδοχείς συζευγμένοι με G- πρωτεΐνες (G- protein coupled receptors, GPCRs) (Fredriksson et al. 2003). Οι α- ελικοειδείς πρωτεΐνες διαπερνούν τη μεμβράνη μία φορά (single- spanning) ή περισσότερες φορές (multi- spanning). Όσες διαπερνούν τη μεμβράνη μία φορά κατηγοριοποιούνται περαιτέρω σε τέσσερις τύπους, Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και IV, βάσει του προσανατολισμού τους στη διπλοστιβάδα και των αλληλουχιών που κατευθύνουν την είσοδό τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο (Spiess 1995), όπως φαίνεται στην Εικόνα 7. Το μήκος των διαμεμβρανικών α- ελίκων ποικίλει, ανάλογα με το πάχος της λιπιδικής διπλοστιβάδας και τη γωνία που σχηματίζεται μεταξύ του επιπέδου της μεμβράνης και της α- έλικας. Έχει παρατηρηθεί ότι οι έλικες μπορεί να τσακίζουν εντός της μεμβράνης ή να εισέρχονται στη λίπιδική διπλοστιβάδα και να εξέρχονται από την ίδια πλευρά (re- entrant loops) (Heijne 2006). 24

25 Εικόνα 7. Σχηματική αναπαράσταση των οκτώ τύπων μεμβρανικών πρωτεϊνών: (1) διαμεμβρανική με ένα διαμεμβρανικό τμήμα τύπου I, (2) τύπου ΙΙ, (3) τύπου ΙΙΙ, (4) τύπου IV, (5) διαμεμβρανική με περισσότερα από ένα διαμεμβρανικά τμήματα, (6) αγκυροβολημένη σε λιπίδια, (7) αγκυροβολημένη σε φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (GPI) και (8) περιφεριακή. Οι διαμεμβρανικές α- έλικες αποτελούνται σε μεγάλο βαθμό από υδρόφοβα αμινοξέα όπως η λευκίνη, η ισολευκίνη, η αλανίνη, η βαλίνη και η φαινυλαλανίνη. Αυτά τα κατάλοιπα βρίσκονται κυρίως στις επιφάνειες της πρωτεΐνης που έρχονται σε επαφή με τα λιπίδια της μεμβράνης. Εκτός από τα υδρόφοβα, απαντώνται επίσης πολικά και φορτισμένα κατάλοιπα, οι πλευρικές ομάδες των οποίων πιθανά έχουν λειτουργική σημασία. Τέλος, τα αρωματικά κατάλοιπα τρυπτοφάνη και τυροσίνη είναι αυξημένα στα άκρα των διαμεμβρανικών τμημάτων, εκεί που οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τις υδρόφιλες κεφαλές των φωσφολιπιδίων της μεμβράνης (von Heijne 2007). Όσον αφορά τα εξωμεμβρανικά τμήματα των διαμεμβρανικών α- ελικοειδών πρωτεϊνών, παρατηρείται εμπλουτισμός του κυτταροπλασματικού τμήματος σε θετικά φορτισμένα κατάλοιπα, λυσίνη και αργινίνη, σε σχέση με το εξωκυττάριο τμήμα (Heijne 1986). Αυτή η κατανομή του φορτίου ( positive- inside rule ) ισχύει για τη συντριπτική πλειοψηφία των α- ελικοειδών πρωτεϊνών, ανεξαρτήτως οργανισμού ή μεμβρανικού συστήματος (Gavel et al. 1991; Sipos and von Heijne 1993; Nilsson et al. 2005). 25

26 Οι δυσλειτουργικές μεμβρανικές πρωτεΐνες μπορεί να αποτελούν την αιτία διάφορων ασθενειών. Για παράδειγμα, νευρολογικές και καρδιακές νόσοι προκαλούνται από ελαττωματικά κανάλια ιόντων (Abbott 2006; Hirose 2006; Nelson et al. 2006; Gargus 2006), η κυστική ίνωση οφείλεται στο λάθος δίπλωμα ενός μεταφορέα ιόντων χλωρίου (Riordan 2005), ενώ πρωτεΐνες των υπεροξυσωμάτων και των μιτοχονδρίων εμπλέκονται σε άλλες σοβαρές κληρονομικές ασθένειες (Suzuki et al. 2001). Επιπλέον, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν σημαντικούς στόχους φαρμάκων. Περίπου το 50% των φαρμάκων που κυκλοφορούν στην αγορά στοχεύει υποδοχείς συζευγμένους με G- πρωτεΐνες (G- protein coupled receptors, GPCRs), άλλους υποδοχείς, κανάλια ιόντων και μεταφορείς. Επίσης, πολλές κινάσες και φωσφατάσες, άλλοι σημαντικοί στόχοι φαρμάκων, είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες (Hopkins and Groom 2002). Όσον αφορά τα αντιβιοτικά, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες εμπλέκονται στην ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών βακτηρίων (McKeegan et al. 2002), καθώς τα β- βαρέλια στην εξωτερική μεμβράνη των βακτηρίων ελέγχουν την είσοδο των αντιβιοτικών ενώ οι αντλίες στην εσωτερική μεμβράνη είναι υπεύθυνες για την έξοδό τους από τα κύτταρα. Έχουν πραγματοποιηθεί λίγες μελέτες για την εγγενή έλλειψη δομής (intrinsic disorder) των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Μία από αυτές έδειξε ότι οι IDRs των α- ελικοειδών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και των διαμεμβρανικών β- βαρελιών έχουν εξειδικευμένη αμινοξική σύσταση σε σχέση με εκείνες των σφαιρικών υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών (Xue et al. 2009a). Μια άλλη μελέτη επιβεβαίωσε την αφθονία των IDRs σε ευκαρυωτικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, σε αντίθεση με τις βακτηριακές, και έδειξε ότι οι IDRs εντοπίζονται κυρίως στο κυτταροπλασματικό τμήμα των ανθρώπινων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών (Minezaki et al. 2007). Επίσης, η λειτουργική ανάλυση των MoRFs έδειξε ότι περίπου 20% των πρωτεϊνών που περιέχουν MoRFs είναι διαμεμβρανικές (Mohan et al. 2006) Πρωτεϊνικά Σύμπλοκα και Επιφάνειες Αλληλεπίδρασης Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα κατατάσσονται σε κατηγορίες ανάλογα με τη σύνθεση, τη συνάφεια (affinity) και το χρόνο ζωής τους σε (Ι) ομο- ολιγομερή και ετερο- ολιγομερή, (ΙΙ) υποχρεωτικά (obligate) και μη- υποχρεωτικά (non- obligate) και (ΙΙΙ) μόνιμα (permanent) και παροδικά (transient) (Nooren and Thornton 2003). (Ι) Ομο- ολιγομερή και ετερο- ολιγομερή σύμπλοκα Ένα σύμπλοκο μπορεί να αποτελείται από όμοιες ή διαφορετικές υπομονάδες: για παράδειγμα, ένα διμερές μπορεί να αποτελείται από δύο όμοιες πρωτεϊνικές υπομονάδες, οπότε ονομάζεται ομοδιμερές, ή από δύο διαφορετικές πρωτεϊνικές υπομονάδες, οπότε ονομάζεται ετεροδιμερές. Τα ομο- ολιγομερή είναι συμμετρικά και θεωρούνται 26