ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΕΙΔΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BRACHIONUS ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΠΕΤΗΡΙΔΑ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΣΠΥΡΙΔΩΝ ΠΑΠΑΚΩΣΤΑΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΕΙΔΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BRACHIONUS ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 «Η έγκριση της παρούσας διατριβής υπό του Τμήματος Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)»

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCIENTIFIC ANNALS OF THE SCHOOL OF BIOLOGY OF THE FACULTY OF SCIENCES SPIRIDON PAPAKOSTAS BIOLOGIST DETERMINATION OF THE GENETIC STRUCTURE OF BRACHIONUS POPULATIONS WITH THE USE OF MOLECULAR MARKERS DOCTORATE THESIS SUBMITTED TO THE SCHOOL OF BIOLOGY OF THE FACULTY OF SCIENCES ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI THESSALONIKI 2008

4 Με τη δύναμη της πίστης ό,τι οραματιστείς, μπορείς να το πραγματοποιήσεις αρκεί πρώτον να έχεις όραμα «βλέπω πράγματα που δεν υπάρχουν και λέω γιατί όχι» και δεύτερον να έχεις πίστη «αν είχατε πίστη θα λέγατε βουνό πήγαινε και θα σας υπάκουε» τα υπόλοιπα είναι θέμα χρόνου

5 Επιβλέπων: Αμπατζόπουλος Θεόδωρος, Αναπληρωτής Καθηγητής Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Σίνης Απόστολος, Καθηγητής Τριανταφυλλίδης Κωνσταντίνος, Καθηγητής Αμπατζόπουλος Θεόδωρος, Αναπληρωτής Καθηγητής Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Θωμόπουλος Γεώργιος, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Σκούρας Ζαχαρίας, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Χιντήρογλου Χαρίτων, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Αμπατζόπουλος Θεόδωρος, Αναπληρωτής Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Γιάγκου Μηνάς, Αναπληρωτής Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Μιχαλούδη Ευαγγελία, Λέκτορας (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Τριανταφυλλίδης Αλέξανδρος, Λέκτορας (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης)

6

7 Στην οικογένειά μου, Μάνθο Ελένη Ιωάννα Στους καθηγητές μου του Τμήματος Βιολογίας και ιδιαίτερα τους, Αμπατζόπουλο Θεόδωρο Τριανταφυλλίδη Κωνσταντίνο Τριανταφυλλίδη Αλέξανδρο

8

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η βιοποικιλότητα ενός μεγάλου αριθμού πληθυσμών τροχοζώων του γένους Brachionus. Η παρουσία κρυπτικών ειδών στο γένος οδήγησε στη χρησιμοποίηση γενετικών μεθόδων για την ταυτοποίηση ενός σημαντικού αριθμού ατόμων Brachionus από τους πληθυσμούς που εξετάστηκαν. Παράλληλα, διερευνήθηκε η επίδραση συγκεκριμένων αβιοτικών παραμέτρων στην ανάπτυξη, στην εξέλιξη και στη σταθερότητα των πληθυσμών των κρυπτικών ειδών. Τέλος, εξετάστηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις των κρυπτικών ειδών με τη χρήση ακολουθιών DNA. Οι γενετικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στον τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. και συγκεκριμένα στο ερευνητικό εργαστήριο του Αναπληρωτή Καθηγητή Θεόδωρου Ι. Αμπατζόπουλου και το κοινό ερευνητικό εργαστήριο του Καθηγητή Κωνσταντίνου Τριανταφυλλίδη και της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας Αναστασίας Κουβάτση. Η συλλογή των τροχοζώων και των αβγών διάπαυσης από τα δείγματα από τη λίμνη Κορώνεια έγινε στο εργαστήριο Ιχθυολογίας του τομέα Ζωολογίας του τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε από ένα ερευνητικό πρόγραμμα που αφορούσε τη γενετική μελέτη τροχοζώων του γένους Brachionus (Ευρωπαϊκή Ένωση, ROTIGEN Q5RS ). Για την εκπόνηση της διατριβής χρειάστηκαν 4,5 χρόνια καθημερινής προσπάθειας. Το μικρό μέγεθος των τροχοζώων του γένους Brachionus, ο μεγάλος αριθμός των δειγμάτων που χρειάστηκε να μελετηθούν και ο χειρισμός μικροποσοτήτων γενετικού υλικού ήταν από τα σημεία που αύξησαν το βαθμό δυσκολίας της διατριβής. Σε όλες τις περιπτώσεις, κάθε εμπόδιο υπερκεράστηκε και οι στόχοι του διδακτορικού επιτεύχθηκαν σε βαθμό που ξεπέρασε τις πιο αισιόδοξες από τις προβλέψεις και τις πιο απαιτητικές από τις προσδοκίες. Κάτι τέτοιο βέβαια δε θα ήταν δυνατό να συμβεί αν δεν υπήρχαν γύρω μου άνθρωποι που με τις συμβουλές τους, τον τρόπο σκέψης τους, το παράδειγμα και την γενικότερη παρουσία τους με βοήθησαν να ξεπεράσω τις οποιεσδήποτε δυσκολίες, να θέσω στόχους και κατευθυντήριες γραμμές στη δουλειά μου και τελικά να απολαύσω αυτό το υπέροχο ταξίδι γνώσης και πνευματικής ωρίμανσης που λέγεται διδακτορικό. Έτσι, θα ήθελα να ευχαριστήσω: Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Θεόδωρο Ι. Αμπατζόπουλο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση της διδακτορικής διατριβής και που έκτοτε ήταν

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ πάντα δίπλα μου με αγάπη, υπομονή και κατανόηση. Οι εύστοχες παρατηρήσεις και συμβουλές του, τόσο στο πειραματικό μέρος όσο και κατά τη διάρκεια της συγγραφής της διατριβής, βελτίωσαν σημαντικά την εικόνα του τελικού αποτελέσματος. Πάνω απ όλα όμως τον ευχαριστώ γιατί μου έδειξε ένα τρόπο σκέψης και δουλειάς ο οποίος αποτελεί για μένα υποθήκη για το μέλλον. Τον Καθηγητή Κωνσταντίνο Τριανταφυλλίδη για τη δυνατότητα που μου έδωσε να διεξάγω ένα μεγάλο μέρος των γενετικών αναλύσεων στο εργαστήριό του. Παράλληλα τον ευχαριστώ για το ειλικρινές του ενδιαφέρον απέναντί μου όλα τα χρόνια της συνεργασίας μου μαζί του. Τον Καθηγητή Απόστολο Σίνη για τις πολύτιμες συμβουλές του κατά τη συγγραφή της διατριβής. Οι εύστοχες παρατηρήσεις του βελτίωσαν σημαντικά την εικόνα του τελικού κειμένου. Το Λέκτορα Αλέξανδρο Τριανταφυλλίδη για τη συνέχεια και τη συνέπεια που βίωσα στο πλαίσιο της συνεργασίας μου μαζί του. Οι ιδέες του ήταν πάντοτε αέρας ανανέωσης και οι παρατηρήσεις του θεώρηση από νέες οπτικές γωνίες, οι οποίες επηρέασαν θετικά την εξέλιξη της διατριβής. Τη Λέκτορα Ευαγγελία Μιχαλούδη για την ευχάριστη συνεργασία που είχα μαζί της όλα αυτά τα χρόνια, ιδιαίτερα όσον αφορά το κομμάτι της λίμνης Κορώνειας. Την ευχαριστώ θερμά για τη λεπτομερή εξέταση του κειμένου της διατριβής, για την ενθάρρυνση και γιατί με βοήθησε να δω τα τροχόζωα Brachionus σε ένα πλαίσιο ευρύτερο από εκείνο του αυστηρά γενετικού. Τους Καθηγητές Γεώργιο Θωμόπουλο, Ζαχαρία Σκούρα, Χαρίτων Χιντήρογλου και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Μηνά Γιάγκου που με τις παρατηρήσεις βελτίωσαν το κείμενο της διατριβής. Από τα εργαστήρια στα οποία δούλεψα, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αναστασία Κουβάτση για τη θερμή φιλοξενία της, τους μεταδιδακτορικούς ερευνητές Ηλία Καππά και Αθανάσιο Μπαξεβάνη για τη συμπαράστασή τους και το πλήθος των παρατηρήσεων και των εποικοδομητικών επιστημονικών συζητήσεων που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια, τη μεταδιδακτορική ερευνήτρια Νικολέττα Καραΐσκου και το διδάκτορα Παναγιώτη Δεληγιαννίδη για το ευχάριστο κλίμα και τη συμπαράσταση στις δύσκολες στιγμές και τους υποψήφιους διδάκτορες Καλλιόπη Βασιλειάδου, Στεφανία Μανιάτση, Πανωραία Αλεξανδρή και Κωνσταντίνο Ρούσκα για το πολύ καλό επίπεδο συνεργασίας αλλά και για την υπομονή και την κατανόησή τους.

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Τέλος, από το προσωπικό μου περιβάλλον θέλω εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου απέναντι στην οικογένειά μου, τους γονείς μου Μάνθο και Ελένη και την αδερφή μου Ιωάννα. Χωρίς την αγάπη τους, την ηθική και οικονομική τους συμπαράσταση η παρούσα διατριβή θα ήταν αδύνατο να πραγματοποιηθεί. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους στενούς μου φίλους Μάριο Σακκά, Χλόη Ασαρίδου και Στέλιο Στυλιανού που ήταν πάντα δίπλα μου όταν τους είχα ανάγκη. Πιστεύω ότι το σύνολο των ανθρώπων που ανέφερα είναι εκείνο που πραγματικά έδωσε ζωή και ομορφιά στο παρόν διδακτορικό. Σπύρος Παπακώστας Ιανουάριος 2008

12 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικό μέρος Ειδικό μέρος ΤΑΞΙΝΟΜΙΚΗ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΟΥ BRACHIONUS ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BRACHIONUS ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ (ΚΥΚΛΙΚΗ ΠΑΡΘΕΝΟΓΕΝΕΣΗ) ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BRACHIONUS ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ - ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΙΔΩΝ BRACHIONUS ΣΤΑ ΕΚΚΟΛΑΠΤΗΡΙΑ ΤΟ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑ B. PLICATILIS Σκοπός της εργασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικό ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ...26 Εργαστηριακοί πληθυσμοί...27 Πληθυσμοί εκκολαπτηρίων...29 Φυσικοί πληθυσμοί ΚΑΤΑΤΕΘΕΙΜΕΝΕΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ DNA Μέθοδοι γενετικής ταυτοποίησης ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA) ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)...35 Ενίσχυση της περιοχής COI...37 Ενίσχυση της περιοχής 16S...38 Ενίσχυση μικροδορυφορικών περιοχών ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΜΗΚΟΥΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΩΝ ΠΡΟΤΥΠΩΝ (RFLP)...40 Κατασκευή «χάρτη περιορισμού» περιοχής COI...41 Κατασκευή «χάρτη περιορισμού» περιοχής 16S ΕΥΡΕΣΗ ΓΕΝΟΤΥΠΩΝ ΣΤΟΥΣ ΜΙΚΡΟΔΟΡΥΦΟΡΙΚΟΥΣ ΤΟΠΟΥΣ ΕΥΡΕΣΗ ΠΡΩΤΟΔΙΑΤΑΞΗΣ Γενετικός χαρακτηρισμός πληθυσμών Brachionus...45 Εργαστηριακοί πληθυσμοί...47 Πληθυσμοί εκκολαπτηρίων...47 Φυσικοί πληθυσμοί Μελέτη φυλογενετικών σχέσεων ειδών/βιοτύπων Brachionus με βάση την πρωτοδιάταξη του DNA ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΓΙΣΤΗΣ ΦΕΙΔΩΛΟΤΗΤΑΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΓΙΣΤΗΣ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΚΑΤΑ BAYES ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γενετικοί δείκτες και μοριακές τεχνικές ΠΕΡΙΟΧΗ COI - «ΧΑΡΤΗΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ» ΠΕΡΙΟΧΗ 16S - «ΧΑΡΤΗΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ»...67 i

13 ΜΙΚΡΟΔΟΡΥΦΟΡΙΚΟ DNA Γενετικός χαρακτηρισμός πληθυσμών Brachionus...72 Εργαστηριακοί πληθυσμοί...72 Πληθυσμοί εκκολαπτηρίων...78 Φυσικοί πληθυσμοί...86 Σχέσεις πληθυσμών εκκολαπτηρίων και φυσικών πληθυσμών με βάση τα αποτελέσματα γενοτύπησης στους μικροδορυφορικούς τόπους ΜΕΛΕΤΗ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΣΤΟ ΓΕΝΟΣ BRACHIONUS ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΠΡΩΤΟΔΙΑΤΑΞΗ ΤΟΥ DNA ΠΕΡΙΟΧΗ COI ΠΕΡΙΟΧΗ 16S ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η χρησιμότητα των γενετικών δεικτών COI, 16S και του μικροδορυφορικού DNA στη μελέτη των κρυπτικών ειδών Brachionus Η ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΔΕΙΚΤΗ COI ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΡΥΠΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ BRACHIONUS Η ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΔΕΙΚΤΗ 16S ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΡΥΠΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ BRACHIONUS Η ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΔΟΡΥΦΟΡΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΡΥΠΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ BRACHIONUS Καθορισμός της γενετικής σύστασης πληθυσμών Brachionus ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΙ ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ Επίδραση του θρεπτικού μέσου στον ανταγωνισμό μεταξύ διαφορετικών κλώνων Brachionus ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ ΕΚΚΟΛΑΠΤΗΡΙΩΝ Γενετική ταυτοποίηση των μαζικών καλλιεργειών του εκκολαπτηρίου MRS ΦΥΣΙΚΟΙ ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ Μελέτη των πληθυσμών Brachionus της λίμνης Κορώνειας ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ελληνική Βιβλιογραφία Διεθνής Βιβλιογραφία A. ΠΕΡΙΛΗΨΗ B. ABSTRACT ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ερωτηματολόγιο που διανεμήθηκε στα εκκολαπτήρια Γενότυποι δειγμάτων B. PLICATILIS S.S B. SP. AUSTRIA ii

14 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Γενικό μέρος Σύμφωνα με τον Mayr (2001), το κατώτερο επίπεδο έμβιας οργάνωσης που εξελίσσεται είναι ο πληθυσμός. Πρώτος ο Δαρβίνος εισήγαγε την έννοια της πληθυσμιακής σκέψης, παρατηρώντας ότι οι ζωντανοί οργανισμοί σχηματίζουν ποικιλόμορφους πληθυσμούς. Βασική αρχή της Δαρβινικής θεώρησης είναι ότι η εξέλιξη αποτελεί ένα πληθυσμιακό φαινόμενο που συμβαίνει βαθμιαία και συνεχώς. Επομένως, η εξέλιξη μπορεί να θεωρηθεί ως «η γενετική ανανέωση των ατόμων ενός πληθυσμού από γενιά σε γενιά» (Mayr 2001). Η καταγραφή και ερμηνεία της πληθυσμιακής ποικιλομορφίας είναι εκείνη που τελικά οδήγησε στην περιγραφή της φυσικής επιλογής ως μια από τις εξελικτικές δυνάμεις (Mayr 2001). Παράλληλα, η ανάπτυξη μεθόδων γενετικής ανάλυσης ξεκινώντας από τον Mendel έως και σήμερα, αύξησε τη διακριτική ικανότητα θεώρησης των πληθυσμιακών συστημάτων και οδήγησε στη δημιουργία ενός ξεχωριστού κλάδου στη σύγχρονη επιστήμη της βιολογίας, της πληθυσμιακής γενετικής. Ο φαινότυπος πλέον ενός ατόμου (ή μιας πληθυσμιακής ομάδας) είναι αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης του γενοτύπου του (ή των συχνοτήτων των αλληλομόρφων της ομάδας), με το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται. Η γενετική μελέτη των πληθυσμών οδήγησε τελικά στην περιγραφή πρόσθετων εξελικτικών δυνάμεων, όπως είναι οι μεταλλάξεις και η τυχαία γενετική παρέκκλιση (Wright 1931, Kimura 1955, Ohta 1982). Η ανάπτυξη της μοριακής βιολογίας προσέφερε αφθονία γενετικών δεικτών και τεχνικών με τις οποίες έγινε εφικτή σε μεγάλο βαθμό η παρατήρηση και η περιγραφή της εξέλιξης των πληθυσμών των οργανισμών και η προσέγγιση των δυνάμεων που την προκαλούν. Εύστοχα λοιπόν αναφέρει ο Avise (2004) ότι η «εξέλιξη γίνεται ακόμη περισσότερο αντιληπτή με τη χρήση μοριακών δεικτών», συμπληρώνοντας τον Dobzhansky (1973) στο ότι «τίποτα στη βιολογία δεν έχει νόημα παρά μόνο κάτω από το πρίσμα της εξέλιξης». Bασικός στόχος της πληθυσμιακής γενετικής είναι η εύρεση κατάλληλων γενετικών δεικτών για το χαρακτηρισμό πληθυσμών οργανισμών, προκειμένου να περιγραφεί η γενετική δομή τους και να μελετηθούν οι μηχανισμοί που επηρεάζουν την εξέλιξή τους (Hartl & Clark 1989). Αυτού του είδους η γενετική προσέγγιση των πληθυσμιακών ομάδων, κυρίως μέσα από τη δυνατότητα εύκολης και γρήγορης απόκτησης ακολουθιών DNA, έχει 1

15 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην περιγραφή ενός σημαντικού και ολοένα αυξανόμενου αριθμού «κρυπτικών» ειδών (Baker & Bradley 2006, Bickford et al. 2007). Ως κρυπτικά χαρακτηρίζονται συνήθως δύο ή περισσότερα γενετικά διακριτά είδη που εξαιτίας της μορφολογικής τους ομοιότητας, αρχικά κατατάσσονταν μαζί (Bickford et al. 2007). Είναι συνεπώς εξορισμού σαφές ότι η μελέτη τέτοιων ειδών μπορεί να γίνει αποτελεσματικότερη κυρίως με τη χρήση γενετικών δεικτών. Νέοι ορίζοντες έχουν ανοιχθεί για τους επιστήμονες μέσα από την αποκάλυψη της παρουσίας κρυπτικών ειδών σε αρκετές περιπτώσεις οργανισμών. Έτσι, συχνά διερευνάται με ιδιαίτερο ενδιαφέρον ο βαθμός και το επίπεδο της μορφολογικής ομοιότητας μεταξύ των κρυπτικών ειδών (Fontaneto et al. 2007), όπως επίσης και η οικολογία τους (Ortells et al. 2003). Παράλληλα, η ύπαρξη κρυπτικών ειδών έχει οδηγήσει σε επανεξέταση της έννοιας της βιοποικιλότητας, του αριθμού των υπό εξαφάνιση ειδών αλλά και των διαχειριστικών πρακτικών που εφαρμόζονται (Agapow et al. 2004). Σε αυτό το πλαίσιο η παρατηρούμενη βιοποικιλότητα ορισμένων οικοσυστημάτων διαπιστώνεται να είναι μεγαλύτερη από εκείνη που αρχικά θεωρούνταν, επιβάλλοντας μια περισσότερο στοχευμένη και προσεκτική διαχείρισή τους (Mathews 2006). Εξετάζονται επίσης με ενδιαφέρον οι διαδικασίες οι οποίες οδήγησαν στο σχηματισμό των κρυπτικών ειδών. Έχει διαπιστωθεί σε πολλές περιπτώσεις πως τα κρυπτικά είδη αναπτύχθηκαν σε συμπατρία (Baker & Bradley 2006 και αναφορές εκεί). Από την άλλη, έχουν αναφερθεί κρυπτικά είδη που ενώ είναι γεωγραφικά απομονωμένα μπορούν να δημιουργήσουν γόνιμα υβρίδια στο πλαίσιο εργαστηριακών πειραμάτων (Baker & Bradley 2006, Suatoni et al. 2006). Τέτοια αποτελέσματα έχουν οδηγήσει στην επανεξέταση της έννοιας του είδους στους οργανισμούς αυτούς. Έτσι, υπάρχουν ερευνητές που προτείνουν πως η φυλογενετική (Agapow et al. 2004) ή η γενετική (Baker & Bradley 2006) έννοια του είδους μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικότερα στην περίπτωση των κρυπτικών ειδών. Συνοψίζοντας λοιπόν, φαίνεται ότι η χρήση μεθόδων γενετικής ανάλυσης πληθυσμών αύξησε τη διακριτική ικανότητα των χρησιμοποιούμενων μεθοδολογιών. Νέα είδη αποκαλύπτονται στη θέση εκείνων που μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ως ένα. Η βιοποικιλότητα και οι διαδικασίες εξέλιξης των οργανισμών αντιμετωπίζονται σήμερα με μεγαλύτερη ακρίβεια. Τα κρυπτικά είδη αποκτούν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, μια και η μελέτη τους οδηγεί τους επιστήμονες στην καλύτερη κατανόηση πολλών από τις παραπάνω διαδικασίες, οι οποίες θα μας βοηθήσουν στην εφαρμογή 2

16 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποτελεσματικότερων διαχειριστικών πρακτικών σ ένα οικοσύστημα που σήμερα δοκιμάζεται από έντονα φαινόμενα περιβαλλοντικών αλλαγών. Στο πλαίσιο αυτό, τα τροχόζωα του γένους Brachionus μπορούν να θεωρηθούν ως μια ομάδα οργανισμών με ιδιαίτερο ενδιαφέρον όσον αφορά μελέτες βιοποικιλότητας, μια και πρόσφατα αποκαλύφθηκε η παρουσία αρκετών κρυπτικών ειδών στο γένος (Gomez et al. 2002a). Επιπλέον, τα είδη Brachionus : α) χαρακτηρίζονται από εναλλαγή μεταξύ δύο τύπων αναπαραγωγής (παρθενογένεση και αμφιγονία), β) διακρίνονται από τη δημιουργία ανθεκτικών αβγών διάπαυσης με σημαντική ικανότητα διασποράς, γ) εντοπίζονται τόσο σε μόνιμες όσο και σε εφήμερες υδατοσυλλογές, δ) επιτυγχάνουν υψηλούς ρυθμούς αύξησης αποτελώντας έτσι σημαντικό συστατικό των υδάτινων οικοσυστημάτων στα οποία απαντώνται, ε) έχουν σχεδόν παγκόσμια κατανομή, στ) έχουν ιδιαίτερη οικονομική σημασία για τον άνθρωπο, μια και χρησιμοποιούνται ως ζωντανή τροφή στους ιχθυογεννητικούς σταθμούς. Τα παραπάνω έχουν στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στην έρευνα των οργανισμών αυτών. Όπως μάλιστα αναφέρουν οι Wallace et al. (2006), οι περισσότερες από τις γνώσεις για ολόκληρο το φύλο τροχόζωα βασίζονται στα αποτελέσματα των ερευνών σε λίγα μόλις γένη και κυρίως στο γένος Brachionus, το οποίο για το λόγο αυτό χαρακτηρίζεται ως το «ινδικό χοιρίδιο» των τροχοζώων Ειδικό μέρος Τα τροχόζωα αποτελούν μια ταξινομική ομάδα μικροσκοπικών κυρίως υδρόβιων ασπόνδυλων οργανισμών, στην οποία έχουν περιγραφεί περισσότερα από 1850 είδη (Segers 2002). Σε γενικές γραμμές τα τροχόζωα χαρακτηρίζονται από τα εξής βασικά μορφολογικά χαρακτηριστικά: α) την κορώνα ή στεφάνη (corona) που βρίσκεται στο πρόσθιο μέρος του σώματος, φέρει τις βλεφαρίδες κίνησης (trochus) και χρησιμεύει στην κολύμβηση και στην πρόσληψη τροφής, β) τη μασητική συσκευή (mastax) η οποία είναι μια περίπλοκη κατασκευή που φέρει μεταξύ άλλων γνάθους (trophi) και γ) στις περιπτώσεις των γενών που έχουν σκληρό εξωτερικό περίβλημα, 3

17 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ το σωματικό τοίχωμα (lorica) το οποίο δίνει σταθερό σχήμα στο συγκυτιακό εσωτερικό των τροχοζώων (Ruttner-Kolisko 1974, Wallace et al. 2006). Αν και υπάρχουν ορισμένες αντικρουόμενες απόψεις όσον αφορά την κατάταξη των τροχοζώων σε κλάσεις, αναγνωρίζονται στο Φύλο τρεις βασικοί κλάδοι (Wallace & Colburn 1989, Segers 2002, Sorensen 2002, Wallace 2002): α) Η Κλάση Seisonidea (ή Pararotatoria) που αποτελείται από συνολικά τρία είδη που ομαδοποιούνται σε δύο γένη και είναι επιζωικοί συμβιωτικοί οργανισμοί με αμφιγονική αναπαραγωγή. β) Η (Υπο)Κλάση Bdelloidea (κατά άλλους Κλάση Eurotatoria) που περιλαμβάνει περίπου 400 είδη. Χαρακτηριστικό γνώρισμα της ομάδας είναι ο αποκλειστικά παρθενογενετικός τρόπος αναπαραγωγής (Mark Welch & Meselson 2000). γ) Η (Υπο)Κλάση Monogononta (κατά άλλους Κλάση Eurotatoria), στην οποία ανήκει το Brachionus, περιλαμβάνει περισσότερα από 1400 γνωστά είδη και όπως προκύπτει και από το όνομά τους έχουν μια γονάδα σε σχέση με τις προηγούμενες δύο ομάδες που έχουν δύο γονάδες. Αναπαράγονται τόσο με παρθενογένεση όσο και με αμφιγονία (κυκλική παρθενογένεση). Με βάση κυρίως τη μορφολογία των γνάθων (trophi - γενικά στα τροχόζωα απαντώνται εννέα βασικοί τύποι trophi) αλλά και ορισμένα μορφολογικά χαρακτηριστικά (π.χ. σχήμα σώματος, δομή κορώνας κ.ά.), τα Monogononta διακρίνονται σε τρεις τάξεις, τις: Flosculariaceae (trophi τύπου malloramate), Colothecacea (trophi τύπου uncinate) και Ploima (trophi τύπων cardate, forcipate, incudate, virgate, malleate). Στην τελευταία ανήκει το γένος Brachionus (trophi τύπου malleate) (Wallace et al. 2006). Στενή φυλογενετική σχέση με τις παραπάνω τρεις κλάσεις που αναφέρθηκαν, έχει και η κλάση Acanthocephala που περιλαμβάνει υποχρεωτικά ενδοπαράσιτα με περίπλοκους κύκλους ζωής. Πρόσφατα, μοριακά κυρίως, δεδομένα συνηγορούν στην κοινή κατάταξη των τεσσάρων παραπάνω ταξινομικών ομάδων κάτω από την ονομασία Syndermata (Garcia-Varela & Nadler 2006), ενώ τόσο μορφολογικά όσο και μοριακά δεδομένα δικαιολογούν τη διάκριση των Monogononta και την ομαδοποίηση των υπόλοιπων τριών (υπο)κλάσεων κάτω από την ονομασία Hemirotifera (Sorensen & Giribet 2006). 4

18 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΑΞΙΝΟΜΙΚΗ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΟΥ BRACHIONUS Σύμφωνα με τον Segers (2002), στο γένος Brachionus υπάρχουν 55 καταγεγραμμένα είδη. Ωστόσο, όπως έχει ήδη αναφερθεί και θα παρουσιαστεί αναλυτικότερα και παρακάτω, στο γένος έχει διαπιστωθεί η ύπαρξη κρυπτικών ειδών. Συνεπώς, ο πραγματικός αριθμός των ειδών ενδέχεται να είναι μεγαλύτερος. Η ταξινομική κατάταξη του γένους Brachionus έχει ως εξής (σύμφωνα με τον Segers 2002): Φύλο: Rotifera (Cuvier 1817) Κλάση: Eurotatoria (De Ridder 1957) Υπόκλαση: Monogononta (Plate 1889) Υπέρταξη: Pseudotrocha (Kutikova 1970) Τάξη: Ploima (Hudson & Gosse 1886) Οικογένεια: Brachionidae (Ehrenberg 1838) Γένος: Brachionus (Pallas 1766) Στο γένος Brachionus η ταξινομική διάκριση μεταξύ των ειδών του γένους βασίζεται κυρίως: α) στο σχήμα και στα μορφολογικά χαρακτηριστικά του σώματος, β) στη δομή του ποδίσκου προσκόλλησης, και γ) στη δομή της περιοχής της στεφάνης (Ruttner-Kolisko 1974). Η μορφολογική διάκριση μεταξύ των βασικών ομάδων του γένους μπορεί να γίνει εύκολα με παρατήρηση των οργανισμών σε οπτικό μικροσκόπιο ή ακόμη σε στερεοσκόπιο με κατάλληλη μεγέθυνση. Η αποκάλυψη της παρουσίας κρυπτικών ειδών στο γένος έχει οδηγήσει στην εφαρμογή και τεχνικών ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, προκειμένου να διαπιστωθούν οι ενδεχόμενες μορφολογικές διαφορές μεταξύ των κρυπτικών ειδών (Ciros-Perez et al. 2001, Μills 2006, Fontaneto et al. 2007). 5

19 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BRACHIONUS * Το σώμα των τροχοζώων του γένους Brachionus είναι ωοειδές, νωτοκοιλιακά πλατυσμένο. Το μέγεθος των ώριμων ατόμων κυμαίνεται από 120 μm μέχρι περίπου 500 μm στα θηλυκά, ενώ είναι πολύ μικρότερο στα αρσενικά των αντίστοιχων ειδών (Ruttner-Kolisko 1974, Voigt & Koste 1978). Στο εσωτερικό τους παρατηρείται μια ευρύχωρη κοιλότητα (ψευδοκοίλωμα). Όπως και τα υπόλοιπα τροχόζωα, έτσι και τα είδη Brachionus χαρακτηρίζονται: α) από την παρουσία συγκυτιακών σχηματισμών (εξαφάνιση των μετά-εμβρυικών κυτταρικών μεμβρανών με αποτέλεσμα ορισμένα όργανα να καταλήγουν να είναι πολυπύρηνα, π.χ. η γονάδα - Εικόνα 1.1) και β) από την απουσία κυτταρικής διαίρεσης στα ώριμα άτομα (ευτέλεια - eutely). Έτσι, ο αριθμός των κυττάρων τους, από τη στιγμή που αυτά σχηματιστούν κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, παραμένει σταθερός καθόλη τη διάρκεια της ζωής τους (αναφέρεται η παρουσία περίπου κυττάρων - Mills 2006). Όσον αφορά τη γενικότερη μορφολογία τους, τα τροχόζωα του γένους Brachionus μπορούν να διακριθούν σε τρία τμήματα: α) το πρόσθιο που αποτελείται κυρίως από τη στεφάνη, β) το τμήμα του σώματος που περιέχει την πλειονότητα των εσωτερικών οργάνων του οργανισμού και γ) το οπίσθιο, κύριο χαρακτηριστικό του οποίου είναι ο ποδίσκος προσκόλλησης (Εικόνα 1.1). Η στεφάνη αποτελείται από πέντε διακριτούς λοβούς μεταξύ των οποίων υπάρχουν αισθητήρια τριχίδια (Ruttner-Kolisko 1974). Αισθητήριες κεραίες υπάρχουν και σε άλλες περιοχές του σώματος και περιέχουν μηχανοϋποδοχείς και χημειοϋποδοχείς. Στην πρόσθια περιοχή υπάρχουν επίσης και υποδοχείς φωτεινών ερεθισμάτων (οπτική κηλίδα - Εικόνα 1.1Α). Επιπλέον, στην περιοχή της στεφάνης των ειδών Brachionus κατά κανόνα υπάρχουν έξι, τέσσερις ή δύο άκανθες. Ο αριθμός και το σχήμα αυτών των ακανθών αλλά και η γενικότερη μορφολογία της περιοχής συνεξετάζονται κατά τη διάκριση των διαφορετικών ειδών Brachionus (Εικόνες 1.1B, Γ & Δ αλλά και Ciros-Perez et al. 2001). * Οι πληροφορίες της Ενότητας αυτής προέρχονται από τους Wallace et al. (2006), εκτός και αν αναφέρεται αλλιώς. 6

20 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A B Γ Δ 100 μm Εικόνα 1.1: Μορφολογία και ανατομία του Brachionus. A) Σχηματική απεικόνιση των κύριων δομών του Brachionus sp. (από Wallace et al. 2006). b = κύστη απεκκριτικού συστήματος, bf = κοιλότητα εισόδου τροφής και υγρών, c = στεφάνη, cng = cingulum [η περιοχή κάτω από τη στεφάνη που καθορίζει τη συντονισμένη κίνηση των βλεφαρίδων (Clement 1987)], da = νωτιαία αισθητήρια κεραία, e = αβγό, es = οισοφάγος, ey = οπτική κηλίδα, f = ποδίσκος προσκόλλησης, fg = αδένας ποδίσκου προσκόλλησης, la = πλευρική αισθητήρια κεραία, mas = μασητική συσκευή, mu = μυς, p = πέος, pr = πρωτονεφρίδιο, psc = ψευδοκοίλωμα, sc = αισθητήρια τριχίδια, st = στομάχι, t = άκρα ποδίσκου προσκόλλησης, te = όρχις, tr = γνάθος, tro = βλεφαρίδες κίνησης, v = γονάδα. Β) Νωτιαία σχηματική απεικόνιση της εξωτερικής μορφολογίας των ειδών B. plicatilis sensu stricto (s.s.) (1), B. ibericus (2) και B. rotundiformis (3) (από Ciros-Perez et al. 2001). Σημειώνεται η παρουσία έξι ακάνθων στην πρόσθια περιοχή. Γ) Νωτιαία σχηματική απεικόνιση της εξωτερικής μορφολογίας του είδους B. calyciflorus (από Ruttner-Kolisko 1974). Παρατηρείται η παρουσία τεσσάρων ακανθών στην πρόσθια περιοχή. Δ) Κοιλιακή (πάνω) και πλευρική (κάτω) απεικόνιση της μορφολογίας του είδους B. angularis (από Kuczynski 1991). Figure 1.1: Morphology and anatomy of Brachionus. A) Schematic presentation of the main structures of Brachionus sp. (from Wallace et al. 2006). b = bladder of the excretory system, bf = buccal funnel, c = corona, cng = cingulum [the area under the corona that contributes to the coordinated movement of the trochus (Clement 1987)], da = dorsal antenna, e = egg, es = esophagus, ey = eye spot, f = foot, fg = foot gland, la = lateral antenna, mas = mastax, mu = muscle, p = penis, pr = protonephridium, psc = pseudocoel, sc = sensory cirri, st = stomach, t = toes, te = testis, tr = trophus (a jaw-like apparatus that is part of the mastax), tro = trochus, v = vitellarium. B) Dorsal view of the external morphology of the species B. plicatilis sensu stricto (s.s.) (1), B. ibericus (2) and B. rotundiformis (3) (from Ciros-Perez et al. 2001). The presence of six spines to the anterior area is noted. Γ) Dorsal view of the external morphology of the species B. calyciflorus (from Ruttner-Kolisko 1974). Note the presence of four spines in the anterior area. Δ) Ventral (up) and lateral (down) view of the morphology of the species B. angularis (from Kuczynski 1991). 50 μm Το σώμα εξωτερικά μπορεί να είναι λείο ή να φέρει επιφανειακές γραμμώσεις (Voigt & Koste 1978). Το εξωτερικό περίβλημα των ειδών Brachionus είναι διαπερατό στο φως και επομένως το σύνολο των εσωτερικών οργάνων του οργανισμού είναι 7

21 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ορατό κατά τη μικροσκοπική του παρατήρηση. Έτσι μπορούν εύκολα να παρατηρηθούν αρκετά από τα τμήματα του πεπτικού, του απεκκριτικού και του αναπαραγωγικού συστήματος (Εικόνα 1.1Α). Χαρακτηριστικό του πεπτικού συστήματος είναι η μασητική συσκευή (mastax) με τις γνάθους (trophi - Ruttner- Kolisko 1974, Voigt & Koste 1978). Μεταξύ των κύριων δομών που μπορούν να παρατηρηθούν στην περιοχή του σώματος είναι ακόμη ο οισοφάγος και το στομάχι του πεπτικού όπως επίσης και το πρωτονεφρίδιο του απεκκριτικού και η γονάδα του αναπαραγωγικού συστήματος (Εικόνα 1.1Α). Η γονάδα στα είδη Brachionus περιλαμβάνει συνολικά οκτώ πυρήνες (Voigt & Koste 1978). Τέλος, να σημειωθεί πως η περιοχή του σώματος αλλά και γενικότερα ολόκληρος ο οργανισμός διατρέχεται από ένα σχετικά απλό νευρικό (κεντρικό και περιφερικά γάγγλια και βλ. παραπάνω υποδοχείς ερεθισμάτων) και ένα σχετικά σύνθετο μυϊκό δίκτυο (βλ. και Santo et al. 2005), τα οποία αναλαμβάνουν κυρίως την κίνηση αλλά και την απόκριση του οργανισμού στα περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Στην οπίσθια περιοχή, κύριο χαρακτηριστικό είναι ο ποδίσκος προσκόλλησης με τον οποίο ο οργανισμός μπορεί να προσκολληθεί σε σταθερά υποστρώματα, ενώ έχει αναφερθεί και επιζωική προσκόλλησή του (Voigt & Koste 1978, ιδιαίτερα για το B. rubens βλ. Iyer & Rao 1993). Ο ποδίσκος προσκόλλησης στα είδη Brachionus καταλήγει σε δύο άκρα που συχνά αναφέρονται και ως «δάκτυλα» (toes - Εικόνα 1.1Α & Γ). Στην άκρη αυτών των «δακτύλων» καταλήγει ο αδένας του ποδίσκου προσκόλλησης με το έκκριμα του οποίου επιτυγχάνεται η προσκόλληση (Εικόνα 1.1Α). Η δομή του ποδίσκου προσκόλλησης έχει ταξινομική αξία στη διάκριση μεταξύ των ειδών του γένους Brachionus (Voigt & Koste 1978), ενώ θα πρέπει επίσης να αναφερθεί πως κατά την ελεύθερη κολύμβηση του ζώου ο ποδίσκος αναδιπλώνεται. Να σημειωθεί, τέλος, ότι δίπλα από το άνοιγμα του ποδίσκου προσκόλλησης μεταφέρονται και τα (αμικτικά) αβγά του ζώου (Εικόνα 1.1Α & Γ). Τα αρσενικά άτομα των ειδών Brachionus, όπως φαίνεται και από την Εικόνα 1.1Α, είναι πολύ μικρότερα (περισσότερο από 50%) σε μέγεθος από τα αντίστοιχα θηλυκά. Το φαινόμενο αναφέρεται ως «νανισμός του άρρενος» (male dwarfism) και στο Φύλο των Τροχοζώων απαντάται μόνο στην (Υπο)Κλάση Monogononta (Ricci & Melone 1998). Στην πρόσθια περιοχή, η στεφάνη των αρσενικών χαρακτηρίζεται από την παρουσία δύο σειρών κινητήριων βλεφαρίδων σε αντίθεση με τη μια των θηλυκών, ενώ έχουν ακόμη και ιδιαίτερα μεγάλα σε μήκος αισθητήρια τριχίδια (Gilbert & Williamson 1983). Το μικρό μέγεθος και ο μεγαλύτερος αριθμός βλεφαρίδων θεωρούνται οι κυριότεροι λόγοι της μεγαλύτερης ταχύτητας που 8

22 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ μπορούν να αναπτύξουν τα αρσενικά σε σχέση με τα θηλυκά (Gilbert & Williamson 1983). Στα αρσενικά απουσιάζει η μασητική συσκευή (mastax) (Diaz et al. 2006), ενώ το πεπτικό σύστημα, στο σύνολό του, είναι υποτυπώδες και έχει χάσει το λειτουργικό του ρόλο. Τα περισσότερα από τα υπόλοιπα συστήματα είναι επίσης υποτυπώδη (απεκκριτικό) ή απλούστερα σε δομή και οργάνωση (νευρικό, μυϊκό) (Gilbert & Williamson 1983). Συνέπεια των παραπάνω είναι τα αρσενικά άτομα να παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερο μέσο όρο ζωής σε σχέση με τα αντίστοιχα θηλυκά (King & Miracle 1980). Όσον αφορά το αναπαραγωγικό σύστημα, αυτό περιλαμβάνει περίπου 30 σπερματοζωάρια (Ricci & Melone 1998) και ένα εκτατό πέος (Ruttner-Kolisko 1974) που προεκβάλλει μαζί με τον ποδίσκο προσκόλλησης στο οπίσθιο μέρος του ζώου (βλ. Εικόνα 1.1Α αλλά και Amsellem & Clement 1980). Τα αρσενικά, όπως θα παρουσιαστεί αναλυτικότερα και παρακάτω, παίρνουν μέρος στην αμφιγονική αναπαραγωγή και συνεπώς εμφανίζονται κυκλικά και ευκαιριακά σε φυσικούς πληθυσμούς ειδών Brachionus, κάτω από την επίδραση συγκεκριμένων περιβαλλοντικών ερεθισμάτων (Ricci & Melone 1998). Η ευκαιριακή και σύντομη παρουσία τους, σε συνδυασμό με το μικρό τους μέγεθος και την ταχύτητα κίνησής τους είναι μεταξύ των βασικότερων παραγόντων που κάνουν δύσκολη τη μελέτη τους. Σε φυσικούς πληθυσμούς η παρουσία τους διαπιστώνεται συνήθως με διαρκείς και υψηλής συχνότητας δειγματοληψίες (Ricci & Melone 1998). Κλείνοντας, να σημειωθεί ότι στο γένος Brachionus έχουν παρατηρηθεί σε ορισμένες περιπτώσεις σημαντικές αποκλίσεις του μεγέθους αλλά και της γενικότερης εξωτερικής μορφολογίας μεταξύ των ατόμων του ίδιου είδους ως απόκριση σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα όπως η θερμοκρασία, η διαθεσιμότητα τροφής και η παρουσία θηρευτών (ένα φαινόμενο που ορισμένες φορές αναφέρεται καταχρηστικά και ως κυκλομόρφωση - cyclomorphosis βλ. και Sharma & Saksena 1984). Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση που έχει περιγραφεί στο B. calyciflorus στο οποίο παρατηρείται η ανάπτυξη ενός ζευγαριού πρόσθετων ακανθών, παρουσία των αρπακτικών τροχοζώων του γένους Asplanchna. Οι προεξοχές αυτές φαίνεται ότι προστατεύουν το B. calyciflorus από τη θήρευση (Gilbert & Waage 1967). Tέτοια φαινόμενα μορφολογικής διαφοροποίησης πρέπει να εξετάζονται με προσοχή στο πλαίσιο της ακριβέστερης και πληρέστερης περιγραφής ειδών του γένους Brachionus. 9

23 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ (ΚΥΚΛΙΚΗ ΠΑΡΘΕΝΟΓΕΝΕΣΗ) Τα τροχόζωα του γένους Brachionus, όπως και τα υπόλοιπα μέλη της (Υπο)Κλάσης Monogononta, είναι κυκλικά παρθενογενετικοί οργανισμοί. Κατά την παρθενογενετική φάση, ένα διπλοειδές παρθενογενετικό (amictic) θηλυκό άτομο παράγει με μίτωση ένα επίσης διπλοειδές (amictic) αβγό. Το τελευταίο αναπτύσσεται σ ένα νέο παρθενογενετικό θηλυκό, γενετικά όμοιο με εκείνο από το οποίο προήλθε (Gilbert 2003a, Wallace et al Εικόνα 1.2). Μέσα από διαδοχικούς παρθενογενετικούς κύκλους οι πληθυσμοί των ειδών Brachionus μπορούν να επιτύχουν υψηλούς ρυθμούς αύξησης, τους υψηλότερους μάλιστα γνωστούς μεταξύ των μεταζώων (Sarma et al. 1999). Περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως ο συνωστισμός (Snell et al. 2006, Wallace et al. 2006), μπορούν να αλλάξουν τον τρόπο αναπαραγωγής από παρθενογένεση σε αμφιγονία. Ως συνέπεια τέτοιων ερεθισμάτων, τα τροχόζωα εκκρίνουν μια πρωτεΐνη μοριακού μεγέθους 39 kda (παράγοντας επαγωγής μίξης), η οποία φαίνεται πως αλληλεπιδρά με το ώριμο θηλυκό άτομο πριν την ωρίμανση των αβγών του (Snell et al. 2006). Η ειδικότητα του παράγοντα επαγωγής μίξης έχει βρεθεί χαμηλή μεταξύ στενά συγγενικών ειδών (Stelzer & Snell 2006), αν και κάτι τέτοιο δε φαίνεται να ισχύει πάντα (Gilbert 2003b). Σε κάθε περίπτωση, μετά την επίδραση τέτοιων ερεθισμάτων, τα διπλοειδή αμικτικά αβγά δίνουν γένεση πλέον σε διπλοειδή αμφιγονικά (mictic) θηλυκά. Τα τελευταία, ενώ δεν παρουσιάζουν μορφολογική διαφοροποίηση σε σχέση με τα παρθενογενετικά θηλυκά (Gilbert 2003a), επιτελούν ωστόσο μειωτικές διαιρέσεις και: α) Σε περίπτωση που δε γονιμοποιηθούν, δημιουργούν απλοειδή μικτικά αβγά που εκκολάπτονται σε αρσενικά άτομα, και τα οποία γεννιούνται γεννητικά ώριμα (Ricci & Melone 1998). Τα απλοειδή αβγά φαίνεται να είναι κατά κανόνα μικρότερα σε μέγεθος από τα αντίστοιχα διπλοειδή, κάτι που δείχνει να είναι απόρροια των μειωτικών διαιρέσεων που συμβαίνουν κατά την παραγωγή τους (Ricci & Melone 1998). β) Σε περίπτωση που γονιμοποιηθούν από κάποιο αρσενικό άτομο δημιουργούν διπλοειδή διαπαυσιακά αβγά (resting eggs) (Εικόνα 1.2). Η διαδικασία της γονιμοποίησης στο Brachionus μπορεί να χωριστεί σε πέντε διακριτά στάδια (Gomez & Serra 1995, Wallace et al. 2006): 1) Συνάντηση ενός αρσενικού με ένα θηλυκό Brachionus. 2) Το αρσενικό κολυμπάει γύρω από το θηλυκό, το οποίο μένει σχετικά ακίνητο. Στη διάρκεια του σταδίου αυτού το αρσενικό «εξερευνά» την εξωτερική επιφάνεια του θηλυκού με την περιοχή της στεφάνης του, 3) μετά την 10

24 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ πάροδο λίγων δευτερολέπτων το αρσενικό εισάγει το πέος του στο ψευδοκοίλωμα του θηλυκού διαμέσου της περιοχής της στεφάνης, οπότε και στο σημείο αυτό, 4) λαμβάνει χώρα η μεταφορά του σπέρματος και μετά 5) το θηλυκό και το αρσενικό χωρίζουν. Ο μέσος χρόνος της όλης διαδικασίας κρατάει λιγότερο από δύο λεπτά [ενδεικτικά αναφέρεται πως οι Diaz et al. (2006) τον προσδιόρισαν στα 71,4 δευτερόλεπτα]. Τυχαίες συναντήσεις αρσενικών και θηλυκών διαφορετικών ειδών Brachionus μπορούν να συμβούν, αλλά συνήθως διαρκούν πολύ λίγο (π.χ. ο μέσος χρόνος των μη ολοκληρωμένων προσπαθειών βρέθηκε να διαρκεί 12,4 δευτερόλεπτα - Diaz et al. 2006). Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αναγνώρισης του θηλυκού από το αρσενικό του ίδιου είδους φαίνεται να έχει μια πρωτεΐνη μοριακού μεγέθους 29 kda στην επιφάνεια του σώματος των θηλυκών (Snell et al. 1995). Να σημειωθεί ακόμη ότι και στις σπάνιες περιπτώσεις που οι προσυζευκτικοί μηχανισμοί αναπαραγωγικής απομόνωσης παρακαμφθούν και πραγματοποιηθεί τελικά η γονιμοποίηση, φαίνεται πως υπάρχουν και μετασυζευκτικοί μηχανισμοί που αποτρέπουν την εκκόλαψη των υβριδίων (Snell 1989, Suatoni et al., 2006). Παρθενογενετικό (amictic) θηλυκό (2n) ΑΜΕΣΗ ΕΚΚΟΛΑΨΗ ΜΙΤΩΣΗ ΠΑΡΘΕΝΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΘΥΣΤΕΡΗΜΕΝΗ ΕΚΚΟΛΑΨΗ Διπλοειδές (amictic) αβγό (2n) ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟ ΕΡΕΘΙΣΜΑ (βλ. Κείμενο) Αμφιγονικό (mictic) θηλυκό (2n) ΜΕΙΩΣΗ ΜΕΙΩΣΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΟΧΙ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Απλοειδές (mictic) αβγό (n) ΑΜΦΙΓΟΝΙΑ Αρσενικό (n) Αβγό διάπαυσης (2n) (resting egg) Εικόνα 1.2: Ο αναπαραγωγικός κύκλος των τροχοζώων Brachionus. 2n: διπλοειδές άτομο ή αβγό, n: απλοειδές άτομο ή αβγό (φωτογραφίες από Mills 2006). Figure 1.2: The reproductive cycle of Brachionus rotifers. 2n: diploid individual or egg, n: haploid individual or egg (photographs from Mills 2006). 11

25 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μετά από μια περίοδο διάπαυσης (dormancy), η οποία μπορεί να διαφέρει μεταξύ των ειδών, τα διαπαυσιακά αβγά γίνονται δεκτικά σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα που μπορούν να προκαλέσουν την εκκόλαψή τους σε διπλοειδή, παρθενογενετικά αναπαραγόμενα, θηλυκά (Wallace et al. 2006). Συνεπώς, από τα παραπάνω μπορεί να διαπιστωθεί ότι ο καθορισμός του φύλου στο γένος Brachionus [αλλά και γενικότερα στα τροχόζωα της (Υπο)Κλάσης Monogononta] είναι γενετικός. Όλα τα διπλοειδή έμβρυα αναπτύσσονται σε θηλυκά άτομα και όλα τα απλοειδή σε αρσενικά (Gilbert & Williamson 1983). Tα νεοεκκολαφθέντα από τα αβγά διάπαυσης θηλυκά άτομα έχουν όλα τους τα κύτταρα και είναι αρχικά μικρότερα σε μέγεθος. Στη συνέχεια αυξάνονται εξαιτίας της αύξησης του όγκου του κυττάρων τους. Ακολούθως, ξεκινούν να αναπαράγονται παρθενογενετικά. Σημειώνεται ότι στην αρχή είναι λιγότερο δεκτικά σε ερεθίσματα που επάγουν αμφιγονική αναπαραγωγή, τουλάχιστο μέχρι να συμπληρώσουν έναν αριθμό παρθενογενετικών κύκλων (Snell et al. 2006). Τα διαπαυσιακά αβγά στο γένος Brachionus χαρακτηρίζονται από ανάγλυφη εξωτερική επιφάνεια και περιβάλλονται από τρία προστατευτικά τοιχώματα. Είναι μεγαλύτερα σε μέγεθος από τα διπλοειδή αμικτικά αβγά και περιέχουν περισσότερα ενεργειακά αποθέματα. Για το λόγο αυτό η παραγωγή τους έχει ιδιαίτερο ενεργειακό κόστος για το αμφιγονικό θηλυκό το οποίο δε μπορεί να παράγει μεγάλο αριθμό τους (Ricci 2001). Εξοπλισμένα επομένως σε ικανοποιητικό βαθμό, τα αβγά διάπαυσης μπορούν να αντέξουν δριμείες περιβαλλοντικές συνθήκες (π.χ. χαμηλές θερμοκρασίες, ξηρασία) για μεγάλο χρονικό διάστημα (Garcia-Roger et al. 2006). Τέλος, με τη μορφή των διαπαυσιακών αβγών θεωρείται πως τα τροχόζωα αυτά μπορούν να έχουν ικανοποιητική διασπορά με μέσα μεταφοράς τον αέρα, τα υδάτινα ρεύματα, τα ζώα (κυρίως παρυδάτια πτηνά) ή και γενικότερα τις ποικίλες ανθρωπογενείς επεμβάσεις (βλ. Mills 2006) ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BRACHIONUS Τα τροχόζωα του γένους Brachionus εντοπίζονται κατά κύριο λόγο σε εσωτερικά υδάτινα οικοσυστήματα σε όλες τις ηπείρους της γης με εξαίρεση την Ανταρκτική και γενικότερα τις περιοχές των πόλων (Wallace et al. 2006). Ο Mills (2006), κάνοντας μια εκτεταμένη ανασκόπηση 139 δημοσιεύσεων που αναφέρονται στο B. plicatilis, βρήκε πως φυσικοί πληθυσμοί του έχουν αναφερθεί σε οικοσυστήματα τα οποία αφορούν στην πλειονότητά τους ηπειρωτικές υδάτινες μάζες (λίμνες και εφήμερες υδατοσυλλογές) αλλά και υδάτινα ρεύματα (ποτάμια, ρυάκια και 12

26 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ κανάλια), όπως και παραλιακά υδάτινα συστήματα που ωστόσο δε συνδέονται άμεσα με το νερό των ωκεανών ή των θαλασσών. Διαπιστώνεται δηλαδή ότι τα είδη του γένους ζουν και αναπτύσσονται σ ένα μεγάλο εύρος περιβαλλοντικών συνθηκών και κυρίως σε εσωτερικές υδατοσυλλογές. Μεταξύ των κύριων αβιοτικών παραμέτρων που έχουν μελετηθεί και έχουν βρεθεί πως επηρεάζουν την παρουσία αλλά και την κατανομή των ειδών Brachionus είναι η θερμοκρασία, η αλατότητα (ή η ιοντική σύσταση του νερού), το ph και το διαλυμένο στο νερό οξυγόνο (Miracle et al. 1987, Gomez et al. 1995, Ortells et al. 2003, Wallace et al. 2006). Ως σύνολο, το γένος Brachionus είναι ικανό να επιβιώσει σ ένα μεγάλο εύρος των παραπάνω παραμέτρων. Ενδεικτικά αναφέρεται η παρουσία φυσικών πληθυσμών σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 4 o C (Michaloudi & Kostecka 2004) μέχρι και πάνω από 30 o C (Torres-Orozco & Zanatta 1998, Aka et al. 2000), ενώ εγκλιματισμός με ικανοποιητική αύξηση έχει επιτευχθεί ακόμη και σε θερμοκρασίες 40 o C στο εργαστήριο (Wallace et al. 2006). Παρόμοια, οι τιμές της αλατότητας στις οποίες μπορούν να αναπτυχθούν τα Brachionus μπορούν να είναι της τάξεως ακόμη και του 1 gl -1 (1 ppt) για ορισμένα είδη (Wallace et al. 2006, Santangelo et al. 2007), ενώ είναι αξιοσημείωτο πως έχει αναφερθεί παρουσία πληθυσμών Brachionus και σε εξαιρετικά υψηλές αλατότητες της τάξεως των 300 ppt (Wen et al. 2005). Όσον αφορά το ph, στις περισσότερες περιπτώσεις οι φυσικοί πληθυσμοί των ειδών Brachionus βρίσκονται σ ένα εύρος τιμών μεταξύ 7 και 11 (Mills 2006, Wallace et al. 2006). Ωστόσο, έχουν αναφερθεί πληθυσμοί και σε υδάτινα περιβάλλοντα υψηλής οξύτητας με ph 3 ή και λιγότερο (Deneke 2000). Τέλος, έχουν βρεθεί είδη Brachionus που είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά ακόμη και σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις διαλυμένου στο νερό οξυγόνου (< 1 mgl -1, Aka et al. 2000). Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό και με δεδομένα άλλων ερευνών (Duggan et al. 2002, Παντελιδάκης 2005), προτείνουν ότι τα τροχόζωα του γένους Brachionus μπορεί να είναι ιδιαίτερα άφθονα σε ευτροφικές συνθήκες. Παρά το γεγονός ότι το γένος Brachionus ως σύνολο παρουσιάζει ικανότητα προσαρμογής σ ένα ευρύ φάσμα αβιοτικών συνθηκών, τα επιμέρους είδη σε αρκετές περιπτώσεις φαίνονται περισσότερο ή λιγότερο εξειδικευμένα σε ένα στενότερο εύρος τιμών των περιβαλλοντικών παραμέτρων. Έτσι, έχει διαπιστωθεί πως στις υψηλότερες θερμοκρασίες αναπτύσσονται καλύτερα τα μικρότερα σε μέγεθος είδη (π.χ. B. ibericus, B. rotundiformis, βλ. Εικόνα 1.1Β), ενώ στις χαμηλότερες, τα μεγαλύτερου μεγέθους είδη (π.χ. το είδος B. plicatilis s.s., βλ. Εικόνα 1.1Β) (Fielder et al. 2000, Lubzens et al. 2001, Ortells et al. 2003). Μάλιστα, η αρνητική συσχέτιση 13

27 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεγέθους σώματος - θερμοκρασίας επιβεβαιώνεται και από ανάλογες παρατηρήσεις σε κλωνικές καλλιέργειες ειδών Brachionus (Serra & Miracle 1987). Επίσης, υπάρχουν είδη που προτιμούν χαμηλές τιμές αλατότητας (π.χ. B. angularis, B. urceolaris, B. calyciflorus) σε σχέση με άλλα που προτιμούν πιο υψηλές (π.χ. Β. quadridentatus, B. plicatilis) (Miracle et al. 1987, Santangelo et al. 2007). Ακόμη, έχει βρεθεί ότι ορισμένα είδη μπορούν να αναπτυχθούν κατά κύριο λόγο σε αλκαλικά περιβάλλοντα (π.χ. B. calyciflorus) σε αντίθεση με άλλα που έχουν βρεθεί σε νερά υψηλής οξύτητας (B. sericus) (Mitchell 1992, Deneke 2000). Τέλος, σε συνδυασμό με τις παραπάνω αβιοτικές παραμέτρους, το διαλυμένο στο νερό οξυγόνο φαίνεται επίσης να επηρεάζει σε κάποιο βαθμό την κατανομή των διαφορετικών ειδών Brachionus. Έτσι, το B. plicatilis s.s. βρέθηκε να προτιμά σχετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις οξυγόνου σε σύγκριση με τα μικρότερου μεγέθους είδη (B. ibericus, B. rotundiformis - Gomez et al. 1995, Ortells et al. 2003). Πρέπει ωστόσο να σημειωθεί ότι μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν ειδικές έρευνες που να σχετίζουν το εύρος ανθεκτικότητας σε οξυγόνο των ειδών Brachionus με την αναπνευστική φυσιολογία τους και το αναπαραγωγικό τους δυναμικό (Wallace et al. 2006). Η εφαρμογή ορισμένων μοριακών τεχνικών που επέτρεψαν την ενίσχυση και ανάλυση γενετικού υλικού από μικρές ποσότητες DNA, οδήγησε στην παραπέρα εξέταση, σε μοριακό επίπεδο, της οικολογίας των τροχοζώων Brachionus (Gomez 2005). Έτσι, η ανακάλυψη και γενετική περιγραφή ορισμένων κρυπτικών ειδών (βλ. παρακάτω) επέτρεψε την ακριβέστερη περιγραφή των περιβαλλοντικών προτιμήσεων αρκετών ειδών που μέχρι πρόσφατα ήταν άγνωστα. Έγινε ακόμη δυνατή η μελέτη των παρθενογενετικά αναπτυσσόμενων κλωνικών σειρών σε φυσικούς πληθυσμούς του είδους B. plicatilis s.s., οπότε και διαπιστώθηκε πως συμβαίνουν και φαινόμενα επιλογής μεταξύ των κλώνων («επιλογή κλώνων» - clonal selection, Gomez & Carvalho 2000). Βρέθηκε, επίσης, πως γειτονικοί πληθυσμοί ειδών Brachionus μπορεί να χαρακτηρίζονται από μεγάλο βαθμό γενετικής διαφοροποίησης κάτι που αρχικά φάνηκε παράδοξο με βάση τη δυνατότητα παθητικής διασποράς μέσω των αβγών διάπαυσής τους (Gomez et al. 2000, 2002b, 2007). Τα φαινόμενα αυτά σε συνδυασμό με αντίστοιχες παρατηρήσεις σε πληθυσμούς του κλαδοκερωτού, επίσης κυκλικά παρθενογενετικού, γένους Daphnia (De Meester 1996), οδήγησαν τελικά στην υιοθέτηση της «υπόθεσης του μονοπωλίου» (monopolisation hypothesis - De Meester et al. 2002). Σύμφωνα με αυτή, τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να ερμηνευτούν μέσα από φαινόμενα ανάπτυξης τοπικά προσαρμοσμένων ιδρυτικών πληθυσμών (Gomez 2005, Mills et al. 2007). Οι πληθυσμοί αυτοί εμφανίζονται 14

28 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανθεκτικοί στις μεταναστεύσεις άλλων πληθυσμών, τόσο λόγω προσαρμογής στο περιβάλλον που ζουν όσο και λόγω αριθμητικού πλεονεκτήματος (dilution effect of immigrant genotypes). Επομένως, ο παρατηρούμενος οικολογικός («επιλογή κλώνων») αλλά και έως ένα βαθμό τυχαίος (ιδρυτικά φαινόμενα) πληθυσμιακός ενδημισμός (regional endemism - Gomez et al. 2000, 2007, Mills et al. 2007), φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη διακριτών, συμπατρικά αναπτυσσόμενων κρυπτικών ειδών Brachionus (Gomez 2005). Πρέπει όμως να γίνουν πρόσθετες μελέτες προκειμένου να ελεγχθούν οι παραπάνω υποθέσεις. Η τροφή είναι από τις βιοτικές παράμετρους που επιδρούν σημαντικά στην οικολογία των ειδών Brachionus. Οι βλεφαρίδες της στεφάνης χρησιμεύουν για να οδηγήσουν σωματίδια τροφής στη στοματική περιοχή των τροχοζώων. Η οικονομική σημασία της καλλιέργειας των ειδών Brachionus στις υδατοκαλλιέργειες (βλ. παρακάτω) προσέλκυσε από νωρίς το ερευνητικό ενδιαφέρον ως προς τις διατροφικές συνήθειες και τις προτιμήσεις των τροχοζώων αυτών (βλ. Snell et al. 1983a). Έτσι, το είδος και το μέγεθος της τροφής έχουν καθοριστική επίδραση στην επιβίωση και τους ρυθμούς ανάπτυξης των διαφορετικών ειδών Brachionus (Wallace et al. 2006). Σε γενικές γραμμές, τα είδη Brachionus αναπτύσσονται καλύτερα όταν καταναλώνουν χλωροφύκη (Snell et al. 1983a, Korstad et al. 1989, Heerkloβ & Hlawa 1995). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι μπορούν να καταναλώσουν σε μικρότερο βαθμό βακτήρια αλλά και πρωτόζωα (Starkweather & Kellar 1983, Mohr & Adrian 2002, Temerova et al. 2002). Τέλος, κύτταρα ζύμης χρησιμοποιούνται αρκετά συχνά ως διατροφική βάση στην καλλιέργεια των τροχοζώων στα εκκολαπτήρια (Lubzens et al. 2001). Τέλος, τα είδη Brachionus αποτελούν λεία για ορισμένους οργανισμούς, ενώ με άλλους έχει βρεθεί πως ανταγωνίζονται για πόρους του περιβάλλοντος. Έτσι, στους θηρευτές των τροχοζώων αυτών συγκαταλέγονται ορισμένοι ζωοπλαγκτικοί οργανισμοί, όπως άλλα τροχόζωα (π.χ. Asplanchna - Urabe 1992) και καρκινοειδή (όπως κάποια κωπήποδα - Brandl 2005). Όταν υπάρχουν θηρευτές, έχει παρατηρηθεί σε αρκετές περιπτώσεις πως ορισμένα είδη Brachionus γίνονται πιο ακανθώδη προκειμένου να προστατευτούν (βλ. παραπάνω κυκλομόρφωση αλλά και Gilbert & Waage 1967, Wallace et al. 2006). Σημαντικοί θηρευτές των ειδών Brachionus αποτελούν επίσης οι προνύμφες πολλών ειδών ψαριών, γεγονός στο οποίο οφείλεται κατά κύριο λόγο η οικονομική σπουδαιότητα της καλλιέργειας των τροχοζώων αυτών από τον άνθρωπο (Lubzens et al. 2001). Σημαντικοί ανταγωνιστές των ειδών Brachionus είναι ορισμένα πρωτόζωα (π.χ. βλεφαριδωτά - Cheng et al. 2004) αλλά 15

29 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ και καρκινοειδή (συνήθως κλαδοκερωτά - Gilbert 1985, Hurtado-Bocanegra et al. 2002) ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ - ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΙΔΩΝ BRACHIONUS ΣΤΑ ΕΚΚΟΛΑΠΤΗΡΙΑ Η χρησιμοποίηση των τροχοζώων του γένους Brachionus ως τροφή σε προνύμφες Engraulis mordax (γαύρος - Theilacker & McMaster 1971), αλλά και λίγο αργότερα σε προνύμφες Pagrus major (φαγκρί - Watanabe et al. 1983), έδωσε νέες προοπτικές στις προσπάθειες καλλιέργειας αρκετών ειδών ψαριών ιδιαίτερης οικονομικής σημασίας. Από τότε, ορισμένα είδη Brachionus χρησιμοποιούνται στην καλλιέργεια ολοένα και περισσότερων ειδών ψαριών (Lubzens et al. 1989). Σήμερα, η παγκόσμια άνθιση της ιχθυοκαλλιεργητικής βιομηχανίας οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στην παράλληλη επιτυχία αύξησης της απόδοσης και της σταθερότητας των μαζικών καλλιεργειών ειδών του γένους Brachionus (Lubzens et al. 2001). Χαρακτηριστικό είναι πως οι καθημερινές ανάγκες ενός ιχθυογεννητικού σταθμού σε τροχόζωα μπορούν να ξεπεράσουν το ένα δισεκατομμύριο άτομα (Lubzens et al. 2001). Για την καλλιέργεια της τσιπούρας (Sparus aurata), το εκκολαπτήριο Maricoltura di Rosignano Solvay (MRS, Τοσκάνη, Ιταλία) μπορεί να χρειαστεί μέχρι και 1,3 δισεκατομμύρια τροχόζωα σε καθημερινή βάση (Τ. De Wolf, προσωπική επικοινωνία). Από τα δεδομένα αυτά, είναι επομένως εμφανής η ιδιαίτερη οικονομική σημασία του γένους Brachionus. Στις ιχθυοκαλλιέργειες, η συνήθης τακτική περιλαμβάνει τη χορήγηση τροχοζώων για χρονικό διάστημα από 10 μέχρι και 30 ημέρες, από τη στιγμή που ανοίξει το στόμα των προνυμφών των ψαριών. Στα πλεονεκτήματα της καλλιέργειας και χρήσης των τροχοζώων ως τροφής συμπεριλαμβάνονται τα εξής (Lubzens 1987, Lubzens et al. 1989, 2001): α) έχουν σχετικά μικρό μέγεθος ( μm, με το κατώτερο όριο να είναι και μικρότερο για τα νεαρά θηλυκά ορισμένων ειδών - Ruttner-Kolisko 1974), και επομένως μπορούν να καταναλωθούν ακόμη και από προνύμφες με πολύ μικρό στοματικό άνοιγμα, β) είναι πλαγκτικοί οργανισμοί με σχετικά μικρή κολυμβητική ταχύτητα και επομένως μπορούν να θηρευτούν εύκολα από τις προνύμφες, γ) χαρακτηρίζονται από υψηλούς ρυθμούς αύξησης και αναπαραγωγής, γεγονός που επιτρέπει τη σχετικά γρήγορη απόκτηση μεγάλων αριθμών τους, 16

30 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ δ) μπορούν να καλλιεργηθούν σε υψηλές συγκεντρώσεις (βλ. παρακάτω), κάτι που διευκολύνει το χειρισμό τους, ε) η διατροφική τους αξία (π.χ. περιεχόμενο σε πρωτεΐνες ή λιπαρά οξέα) μπορεί να προσαρμοστεί με κατάλληλη δίαιτα («βιοενσωμάτωση» - Watanabe et al. 1983, Coutteau & Sorgeloos 1997, Arimoro 2006, Srivastava et al. 2006) στις ανάγκες των αναπτυσσόμενων προνυμφών, ενώ τέλος, στ) μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ως φορείς μεταφοράς θρεπτικών στοιχείων (Watanabe et al. 1983), αντιμικροβιακών παραγόντων, ουσιών που μπορούν να δράσουν ως εμβόλια αλλά και προβιοτικών βακτηρίων (Makridis et al. 2000). Για να ικανοποιηθούν οι απαιτήσεις των ιχθυογεννητικών σταθμών σε τροχόζωα είναι απαραίτητη προηγουμένως η καλλιέργειά τους σε ικανοποιητικές συγκεντρώσεις. Σε γενικές γραμμές μπορούν να διακριθούν τρείς διαφορετικές προσεγγίσεις για την απόκτηση υψηλής συγκέντρωσης καλλιεργειών Brachionus [οι πληροφορίες για τις παρακάτω τρεις κατηγορίες καλλιεργειών προέρχονται από Lubzens et al. (2001), εκτός και αν αναφέρεται διαφορετικά]: α) Ασυνεχείς καλλιέργειες (batch cultures): Αυτός ο τύπος καλλιέργειας γίνεται με τον ενοφθαλμισμό μιας σχετικά μικρής ποσότητας τροχοζώων σε νερό (κατάλληλης αλατότητας, ph, θερμοκρασίας κ.ά.), στο οποίο έχουν προηγουμένως αναπτυχθεί τα μικροφύκη (green water). Μετά την κατανάλωση του συνόλου των φυκών, το μεγαλύτερο μέρος των τροχοζώων συλλέγεται και χορηγείται στις προνύμφες των καλλιεργούμενων ψαριών. Ένα μικρό ποσό της καλλιέργειας ενοφθαλμίζεται σε νέο καλλιεργητικό μέσο, σε επανάληψη του προηγούμενου κύκλου. Σήμερα, η δυνατότητα χρησιμοποίησης συντηρημένου και υψηλής συγκέντρωσης θρεπτικού μέσου (π.χ. συμπυκνωμένα κατεψυγμένα μικροφύκη, τεχνητές τροφές με βάση κύτταρα ζύμης), έχει επιτρέψει την αύξηση της συγκέντρωσης των καλλιεργούμενων τροχοζώων. Έτσι, αυτά καλλιεργούνται πλέον σε δεξαμενές μεγάλου όγκου (π.χ L - mass culture tanks) σε αρχικές συγκεντρώσεις της τάξεως των 10 2 τροχόζωα ml -1. Μετά την πάροδο ωστόσο δύο με τριών ημερών, η συγκέντρωσή τους κατά κανόνα αυξάνεται στα τροχόζωα ml -1. Στο σημείο αυτό το μεγαλύτερο μέρος της καλλιέργειας συλλέγεται (ολοκληρώνεται ένας κύκλος -batch- της καλλιέργειας), ενώ σε αυτό που παραμένει προστίθεται όγκος, ίσος με εκείνον που αφαιρέθηκε, νέου καλλιεργητικού μέσου με 17