ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑ- ΦΥΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑ- ΦΥΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΑΜΑΤΗ Π. ΚΑΣΜΑ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΦΥΤΟΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΙΝ VITRO KAI IN VIVO ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΙΩΑΝΝΗΣ ΝΙΩΠΑΣ Αναπληρωτής Καθηγητής ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΥΓΕΝΙΟΣ ΚΟΚΚΑΛΟΥ Αναπληρωτής Καθηγητής ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΙΖΙΡΙΑΝΑΚΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής 2

3 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τον επιβλέποντα Καθηγητή µου κ. Ιωάννη Νιώπα για τη βοήθεια, την υποµονή και την κατανόηση που έδειξε στη διάρκεια του µεταπτυχιακού καθώς και για το γεγονός ότι ήταν δίπλα µου συνεχώς σε οποιοδήποτε πρόβληµα προέκυπτε, εργαστηριακό ή θεωρητικό. Ακόµη, θα ήθελα να εκφράσω τις θερµές µου ευχαριστίες στον Αν. Καθηγητή κ. Κοκκάλου και στον Αν. Καθηγητή κ. Βιζιριανάκη για τις εύστοχες διορθώσεις τους, τους καθηγητές µου κατά τη διάρκεια του µεταπτυχιακού κ. Σουλελέ και κ. Λάζαρη για την υποµονή τους και την προθυµία τους να λύσουν κάθε απορία µου. Ένα µεγάλο ευχαριστώ στον συµφοιτητή µου Μάριο Σπανάκη για όλες τις ώρες που ήταν δίπλα µου στο εργαστήριο και σε όλους τους συµφοιτητές του ορόφου που βοήθησαν στη διπλωµατική µου, τη διευθύντρια του Βιοχηµικού Τµήµατος του Ιπποκράτειου Νοσοκοµείου Θεσσαλονίκης κ. Σοφιανού και ιδιαιτέρως την κ. Αθανασιάδου στο τµήµα της οποίας πραγµατοποιήθηκαν οι µετρήσεις των βιοχηµικών δεικτών, την Αν. Καθηγήτρια κ. Ζουρνατζή για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε παραχωρώντας µου πρόσβαση στα µηχανήµατα του εργαστηρίου της, τους Ιατρούς και τις Μαίες της Β Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής του Ιπποκράτειου Νοσοκοµείου Θεσσαλονίκης και τους συµφοιτητές της Φαρµακευτικής που προθυµοποιήθηκαν να συµµετέχουν ως εθελοντές, ενώ δεν πρέπει να παραλείψω τον κ. Αζακίδη για την ευγενική χορηγία της σπιρουλίνας. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στην οικογένεια µου για την επιβάρυνση τις ώρες που έλειπα από το σπίτι και ένα συγνώµη από τα παιδιά µου για τις ώρες που θα µπορούσα να τους έχω αφιερώσει. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ 2.1. Οξειδωτικές και Αντιοξειδωτικές Ουσίες Μηχανισµός Δράσης Ελευθέρων Ριζών Δράση σε Λιπίδια Δράση σε Νουκλεϊκά Οξέα Δράση σε Πρωτεΐνες Δράση στην Επικοινωνία των Κυττάρων ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΠΑΘΗΣΕΙΣ 3.1. Ελεύθερες Ρίζες, Γήρανση, Απόπτωση και Κυτταρικός Θάνατος Αθηροσκλήρωση Κάπνισµα και Ελεύθερες Ρίζες Ο Ρόλος των Ελευθέρων Ριζών στη Γυναικολογία και τη Μαιευτική Ηπατίτιδα C Παθήσεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος και Οξειδωτικό Στρες Οι Ελεύθερες Ρίζες στην Ψυχιατρική Αναπνευστικό Σύστηµα και Ελεύθερες Ρίζες ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ 4.1. Ένζυµα µε Αντιοξειδωτική Δράση Υπεροξειδική Δισµουτάση Καταλάση Υπεροξειδάση της Γλουταθειόνης... 4

5 Γλουταθειόνη Αναγωγάση της Γλουταθειόνης Μακροµοριακές Ενώσεις χωρίς Ενζυµατική Δράση Τρανσφερρίνη Φερριτίνη Σερουλοπλασµίνη Αλβουµίνη Υδρόφιλες Αντιοξειδωτικές Ουσίες Σχετικά Μικρού Μοριακού Βάρους Ασκορβικό Οξύ Ουρικό Οξύ Λιπόφιλες Αντιοξειδωτικές Ουσίες Σχετικά Μικρού Μοριακού Βάρους Βιταµίνη Ε (α-τοκοφερόλη) Συνένζυµο Q-10 (Ουβικινόνη) Καροτένια ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΗ 5.1. Γενικά Αντιοξειδωτική Δράση Φλαβονοειδών Σχέση Δοµής- Δράσης Φαινολικά Οξέα Βενζοϊκό Οξύ και Παράγωγα Κινναµωµικό Οξύ και Παράγωγα ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ 6.1. Λιπίδια Μέτρηση Ενώσεων που Αντιδρούν µε Θειοβαρβιτουρικό Οξύ Μέτρηση Ενώσεων που Αντιδρούν µε Ν-Μεθυλο-2- φαινυλινδόλιο... 5

6 Προσδιορισµός των Επιπέδων του 9- και 13-υδροξυοκταδεκανοϊκού οξέος Προσδιορισµός Αντιοξειδωτικής Ικανότητας Πλάσµατος Νουκλεϊκά οξέα Υδροξυ-2 -δεοξυγουανοσίδης Προσδιορισµός Ποσοστού Βλαβών DNA Προσδιορισµός των Επιπέδων των Ισοπροστανοειδών Μέτρηση Ελευθέρων Ριζών Απευθείας µε Immunospin Παγίδευση Αντιοξειδωτική Ικανότητα Ελευθέρων Ριζών Οξυγόνου Αντιοξειδωτική Ικανότητα Ελευθέρων Ριζών Υδροξυλίου Προσδιορισµός της Υπεροξειδάσης της Γλουταθειόνης Φασµατοσκοπικός Προσδιορισµός Κυτταροτοξικότητας Προσδιορισµός της Πρωτεΐνης GRP Προσδιορισµός της Πρωτεΐνης NF-kB Προσδιορισµός της Καταλάσης Προσδιορισµός της Υπεροξειδικής Δισµουτάσης Αντιοξειδωτική Μέθοδος Σχετιζόµενη µε την Τρολόξη Υδρόφιλο Ανάλογο της Βιταµίνης Ε Προσδιορισµός της Σύνδεσης Διενίων µε LDL Μέθοδος Προσδιορισµού Αναγωγής της 2,2-Διφαινυλο-1- πικρυλυδραζυλικής ρίζας Προσδιορισµός Χηµειοφωταύγειας µε Λουµινόλη ή 5-Αµινο- 2,3-διυδρο-1,4-φθαλαζινεδιόλη. 7. ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΔΙΑΙΤΕΣ 7.1. Εισαγωγή Σπιρουλίνα Γενικά Περιεκτικότητα... 6

7 Πρωτεΐνες Αµινοξέα Λιπαρά Οξέα Βιταµίνες Ιχνοστοιχεία Άλλες Ουσίες/Χρωστικές Δράσεις Daflon (Μίγµα Διοσµίνης/Εσπεριδίνης 450/50 mg)... ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 8. ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΙΟΣΜΕΤΙΝΗΣ ΚΑΙ ΕΣΠΕΡΕΤΙΝΗΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΟΥΡΩΝ ΜΕ ΑΕΡΙΟ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ : IN VIVO ΑΝΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΔΙΟΣΜΕΤΙΝΗΣ ΣΕ ΕΣΠΕΡΕΤΙΝΗ 8.1. Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι GC/MS Συνθήκες Πρότυπα Διαλύµατα Δείγµατα Ποιοτικού Ελέγχου Συλλογή Δειγµάτων Πλάσµατος και Ούρων Παρασκευή Δειγµάτων και Παραγωγοποίηση Φαρµακοκινητική Εκτίµηση Αποτελέσµατα Παραγωγοποίηση και GC/MS Ανάλυση Γραµµικότητα Ορθότητα και Ακρίβεια της Αναλυτικής Μεθόδου... 7

8 Ανάκτηση Διοσµετίνης και Εσπερετίνης από το Πλάσµα και τα Ούρα Κατώτερο Όριο Ποσοτικοποίησης Σταθερότητα των Δειγµάτων Κλινική Εφαρµογή Συµπέρασµα ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO 9.1. Αναγωγική Ικανότητα Πλάσµατος Υλικά και Μέθοδοι Δηµιουργία Πρότυπης Καµπύλης Απορρόφησης Προσδιορισµός Ενώσεων που Αντιδρούν µε το Θειοβαρβιτουρικό Οξύ Υλικά και Μέθοδοι Δηµιουργία Πρότυπης Καµπύλης Απορρόφησης Αντιοξειδωτική Δράση Φαινολικών Ενώσεων in vitro Υλικά και Μέθοδοι Κατασκευή Πρότυπων Καµπυλών Απορρόφησης Αποτελέσµατα In vivo Αντιοξειδωτική Ικανότητα Πλάσµατος Σκοπός Εθελοντές και Μέθοδοι Εθελοντές Σχεδιασµός της Μελέτης Συλλογή και Επεξεργασία Δειγµάτων Εκτίµηση της Αντιοξειδωτικής Ικανότητας του Πλάσµατος Βιοχηµικές Παράµετροι Αντιοξειδωτική Ικανότητα Πλάσµατος... 8

9 Μέθοδος Θειοβαρβιτουρικού Οξέος (TBARS) Στατιστική Επεξεργασία Αποτελέσµατα ΣΥΖΗΤΗΣΗ 11. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 12. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 9

10 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Χρησιµοποιώντας τον όρο οξειδωτικό στρες σε δικτυακές µηχανές αναζήτησης προκύπτουν περισσότερες από δικτυακές τοποθεσίες, γεγονός που φανερώνει το ενδιαφέρον της επιστηµονικής κοινότητας για την κατάσταση αυτή. Ο όρος οξειδωτική κατάσταση (oxidative status) άρχισε να χρησιµοποιείται στα τέλη της δεκαετίας του 60 όταν ο Harman [Harman, 1956] διατύπωσε τη θεωρία των ελευθέρων ριζών (free radical theory) ενώ η πρώτη οργανική ελεύθερη ρίζα (ΕΡ) που αποµονώθηκε ήταν το τριφαινυλοµεθύλιο από τον Moses Gomberg στα 1900 [Gomberg, 1900[. Σχήµα 1. Σχηµατισµός της ρίζας τριφαινυλοµεθυλίου (ένωση 2) από το τριφαινυλοχλωροµεθάνιο (ένωση 1) [Gomberg, 1900]. 10

11 Εικόνα 1. Moses Gomberg Σχήµα 2. Η ρίζα τριφαινυλοµεθυλίου παρουσία οξυγόνου µετατρέπεται σε υπεροξειδικό παράγωγο [Gomberg, 1900]. 11

12 2. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ 2.1. Οξειδωτικές και Αντιοξειδωτικές Ουσίες Ως αντιοξειδωτικές ορίζονται ουσίες που έχουν την ιδιότητα σε µικρή συγκέντρωση να εµποδίζουν τη δηµιουργία ή τη δράση οξειδωτικών ουσιών, ενώ ως οξειδωτική κατάσταση εννοούµε γενικά το σύνολο των µηχανισµών που διαθέτουν οι οργανισµοί για την προστασία από την επιβλαβή δράση ουσιών µε οξειδωτική δράση που παράγονται ενδογενώς ή εξωγενώς. Ως οξειδωτικές ουσίες ορίζονται γενικά µόρια ή µοριακά θραύσµατα που έχουν µονήρες ηλεκτρόνιο στο µόριο τους [Slater, 1984]. Αυτές συµβολίζονται συνήθως µε µια άνω τελεία µετά το µόριο της ένωσης R. Οι ελεύθερες ρίζες µπορούν να είναι θετικά ή αρνητικά φορτισµένες ή και ουδέτερες: R + OH R + + OH - O 2 + e - O 2 - O H 2 O HO 2 + OH - Οι ελεύθερες ρίζες µπορούν να παραχθούν µε διάσπαση ενός οµοιοπολικού δεσµού ή µε αντιδράσεις µεταφοράς ηλεκτρονίου: A:B A + B [Autor, 1982] A - : + B A + B - [Babior, 1982] 12

13 Τέτοιες αντιδράσεις συµβαίνουν κατά την απορρόφηση ακτινοβολίας από µοριακές ενώσεις ή κατά τη διάρκεια οξειδoαναγωγικών αντιδράσεων. Η πρόσπτωση ιονίζουσας ακτινοβολίας µπορεί να οδηγήσει στη δηµιουργία µίας πληθώρας ελευθέρων ριζών. Όσον αφορά υδατικά διαλύµατα, η ιονίζουσα ακτινοβολία οδηγεί στη δηµιουργία ελευθέρων ριζών H, OH και e aq που στη συνέχεια µπορούν να αντιδράσουν µε γειτονικά µόρια και να ξεκινήσουν την αλληλουχία οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Μη ιονίζουσα ακτινοβολία µε κατάλληλο µήκος κύµατος µπορεί να προκαλέσει τη διάσπαση οµοιοπολικών δεσµών (ο C-C δεσµός χρειάζεται περίπου 350 kj/mol για να διασπασθεί), ενώ ακτινοβολίες µε µεγαλύτερα µήκη κύµατος µπορούν να προκαλέσουν τη δηµιουργία ελευθέρων ριζών, αν δράσει ως διαµεσολαβητής κάποιο φωτοευαίσθητο µόριο το οποίο αρχικά θα ενεργοποιηθεί και στη συνέχεια θα οδηγήσει στη δηµιουργία ελευθέρων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες είναι µόρια εξαιρετικά ασταθή και έχουν την τάση να αντιδρούν ταχύτατα µε γειτονικά µόρια και να σταθεροποιούνται ενεργοποιώντας όµως µε τον τρόπο αυτό µία αλυσίδα αντιδράσεων που ως τελικό αποτέλεσµα µπορεί να έχει τη διάσπαση, την απενεργοποίηση, ή την τροποποίηση της διαµόρφωσης ενός σηµαντικού µορίου (για παράδειγµα ενός ενζύµου) ή την παραγωγή ενός νέου µορίου. Λόγω της µεγάλης αστάθειάς τους, οι ελεύθερες ρίζες δρουν στο άµεσό τους περιβάλλον και συνήθως αντιδρούν µε ένα ανενεργό µόριο και δεν ενεργοποιούν την αλυσίδα οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Με βάση τον ορισµό για τις ελεύθερες ρίζες, ως ελεύθερη ρίζα µπορούν να δράσουν µόρια ή µοριακά θραύσµατα αν αποκτήσουν ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στο µόριό τους. Συνηθέστερα το άτοµο που συµµετέχει στη δηµιουργία των ΕΡ είναι το οξυγόνο και οι αντίστοιχες ΕΡ ονοµάζονται Ενεργές Μορφές Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, 13

14 ROS). Οι κυριότερες από αυτές είναι το όζον, το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ), η ρίζα του υδροξυλίου (OH ), υπεροξείδια οργανικών οξέων (RCOOH ), άλκοξυ και υπεροξειδικές ρίζες (RO και ROO ), υποχλωριώδες οξύ, και υπεροξείδια του αζώτου. Πιο συγκεκριµένα, το ανιόν του υπεροξείδιου του οξυγόνου (O - 2 ) παράγεται κατά τις αντιδράσεις παραγωγής ενέργειας στον οργανισµό, όταν το Ο 2 προσλάβει ένα επιπλέον ηλεκτρόνιο (e - ). Ο ρυθµός παραγωγής του στον οργανισµό εξαρτάται από το ρυθµό παροχής οξυγόνου στα µιτοχόνδρια. Το O - 2 στη συνέχεια µπορεί να οδηγήσει στη δηµιουργία άλλων ελευθέρων ριζών και κυρίως ριζών υδροξυλίου µέσω της αντίδρασης Harber-Weiss. Η τελευταία αποτελείται από δύο επιµέρους αντιδράσεις. Κατά την πρώτη αντίδραση το ανιόν του υπεροξειδίου του οξυγόνου ανάγει τον τρισθενή σίδηρο σε δισθενή: Fe 3+ + O 2 - Fe 2+ + O 2 Η δεύτερη αντίδραση είναι γνωστή και ως αντίδραση Fenton, όπου ο δισθενής σίδηρος αντιδρά µε υπεροξείδιο του υδρογόνου προς ρίζα υδροξυλίου και ανιόν υδροξυλίου: Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH Αθροίζοντας τις δύο αντιδράσεις παίρνουµε την τελική αντίδραση που έχει ως εξής: O H 2 O 2 HO - + OH + O 2 14

15 Φαίνεται ότι ο σίδηρος στην όλη αντίδραση λειτουργεί καταλυτικά. Το O - 2 έχει την ικανότητα να αποσπά Fe 2+ από πρωτεΐνες και να οδηγεί µέσω της αντίδρασης Fenton στην παραγωγή ριζών υδροξυλίου (OH ). Το ατοµικό οξυγόνο αν και δεν αποτελεί ελεύθερη ρίζα αφ εαυτού, µπορεί όµως να οδηγήσει στην δηµιουργία ΕΡ. Σχηµατίζεται όταν ένα από τα δύο ασύζευκτα περιφερικά ηλεκτρόνια µεταπηδήσει σε ανώτερη ηλεκτρονική στιβάδα υπό την επίδραση ενέργειας. Το άτοµο είναι εξαιρετικά ασταθές και έχει την τάση να επανέρχεται στην αρχική του κατάσταση µε αποβολή ενέργειας. Σχηµατίζεται µέσα στο σώµα υπό την επίδραση υπεροξειδασών και λιποξυγενασών, αλλά και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του δέρµατος. Ισχυρή οξειδωτική δράση εµφανίζει και το όζον (τριατοµικό οξυγόνο, Ο 3 ). Το όζον, όπως είναι γνωστό, βρίσκεται στα ανώτερα επίπεδα της ατµόσφαιρας όπου δρα προστατευτικά απορροφώντας την υπεριώδη ακτινοβολία. Παράγεται από τη συνένωση µοριακού µε ατοµικό οξυγόνο κατά το παρακάτω σχήµα: Ο 2 + ½ Ο 2 Ο 3 Όταν βρίσκεται στα κατώτερα τµήµατα της ατµόσφαιρας, είναι αποτέλεσµα ρύπανσης και έχει ιδιαίτερα τοξική δράση. Γίνεται αντιληπτό σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις λόγω της δυσάρεστης αποπνικτικής οσµής (παρόµοια µε αυτήν µετά από καταιγίδα) και των συµπτωµάτων που προκαλεί από το αναπνευστικό σύστηµα. Εντός του οργανισµού, προσβάλλει κυρίως διπλούς δεσµούς δηµιουργώντας οζονίδια, τα οποία µε τη σειρά τους διασπώνται σε οργανικές ελεύθερες ρίζες και Η 2 Ο 2. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου παράγεται εντός του οργανισµού σε πολλές αντιδράσεις, όπως κατά την ενσωµάτωση ιωδίου στο µόριο της 15

16 θυροξίνης και κατά τη διαδικασία της λύσης των βακτηρίων που έχουν υποστεί φαγοκύτωση. Είναι λιποδιαλυτό και µπορεί να διαπερνά τις κυτταρικές µεµβράνες. Το ίδιο δεν είναι ιδιαίτερα δραστικό καθώς διασπάται από τη δράση της καταλάσης σε Η 2 Ο και οξυγόνο. Έχει όµως τη δυνατότητα να σχηµατίσει ρίζα υδροξυλίου κατά την αντίδραση Fenton, όπως αναφέρθηκε προηγουµένως. Οι ρίζες του υδροξυλίου είναι οι πιο δραστικές ελεύθερες ρίζες καθώς µπορούν να αλληλεπιδράσουν µε κάθε µόριο προκαλώντας τα επιβλαβή τους αποτελέσµατα. Έχουν χρόνο ηµίσειας ζωής περίπου 10-9 δευτερόλεπτα και σε βιολογικά συστήµατα παράγονται κυρίως µέσω της αντίδρασης Fenton. Προκαλούν υπεροξείδωση λιπιδίων, βλάβες στο DNA, σε πρωτεΐνες και σχεδόν σε κάθε µακροµόριο. Μοναδική προστασία έναντι στη δράση τους προσφέρουν κυτταρικά αντιοξειδωτικά ένζυµα όπως είναι η γλουταθειόνη. Η ρίζα του υπεροξυνιτριλίου (OONO ) παράγεται κατά την αλληλεπίδραση της ρίζας οξυγόνου και του µονοξειδίου του αζώτου. Είναι λιπόφιλη, µε πρόσληψη ενός πρωτονίου µετατρέπεται σε υπεροξυνιτρώδες οξύ το οποίο µπορεί να διασπαστεί σε ΝΟ 2 και OH. Το υποχλωριώδες οξύ παράγεται κυρίως από ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα κύτταρα µε τη δράση της µυελοϋπεροξειδάσης όταν το Η 2 Ο 2 αντιδράσει µε ιόντα χλωρίου: H 2 O 2 + Cl HOCl + OH Το υποχλωριώδες οξύ είναι ένα ασθενές οξύ αλλά εµφανίζει ισχυρή αντισηπτική δράση. Μπορεί να οδηγήσει στη δηµιουργία OH σύµφωνα µε τις παρακάτω αντιδράσεις : ΗΟCl Cl - + OH 16

17 ΗΟCl + O 2 - Cl - + OH + Ο 2 Άλλες ελεύθερες ρίζες είναι τα οργανικά υπεροξείδια (ROO ) που παράγονται όταν ελεύθερες ρίζες µικρού µοριακού βάρους αντιδρούν µε οργανικά µακροµόρια, ρίζα µονοξειδίου του αζώτου το οποίο έχει αγγειοδιασταλτική δράση, ρίζα νιτρικού υπεροξειδίου (OONO ) µε δράση και συµπεριφορά παρόµοια του υποχλωριώδους οξέος. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχουν ΕΡ στις οποίες το άτοµο που φέρει το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο δεν είναι το οξυγόνο αλλά κάποιο άλλο µόριο όπως άζωτο (φαινυλδιαζίνη), άνθρακας ( CCI 3 ), θείο (R-S ) και υδρογόνο (H ) Μηχανισµός Δράσης Ελευθέρων Ριζών Οι ελεύθερες ρίζες ενοχοποιούνται για µία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων. Λόγω όµως του ιδιαίτερα ασταθούς χαρακτήρα τους και του ελάχιστου χρόνου ζωής τους δεν είναι εύκολο να εξακριβωθεί ο µηχανισµός δράσης τους. Επίσης, σε πολλές περιπτώσεις δεν είναι εύκολο να αποσαφηνιστεί αν οι ελεύθερες ρίζες είναι η γενεσιουργός αιτία της διαταραχής ή το αποτέλεσµά της. Για παράδειγµα, είναι γνωστό ότι µε την πρόοδο της ηλικίας επιδεινώνεται η οξειδωτική κατάσταση [Beausejour et al., 2003] χωρίς όµως να µπορεί να διευκρινιστεί αν είναι η αύξηση της ηλικίας που προκαλεί την έκπτωση αυτή ή αν η αύξηση των ελευθέρων ριζών προκαλεί βλάβη µεταβολικών µηχανισµών µε συνέπεια τη γήρανση. 17

18 2.2.1 Δράση σε λιπίδια Είναι γνωστό ότι οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν οξείδωση των λιπαρών οξέων και παραγωγή ουσιών όπως µηλονική διαλδεΰδη, 4- υδροξυνονενόλη και F2 ισοπροστανοειδή, των οποίων η υπενδοθηλιακή συσσώρευση οδηγεί σε αθηρωµάτωση µε βλαπτικές συνέπειες. Η οξείδωση λιπιδίων της κυτταρικής µεµβράνης προκαλεί διαταραχή της διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης µε συνέπεια την απώλεια ουσιών διαµέσου αυτής [Schafer and Buettner, 2000] Δράση σε νουκλεϊκά οξέα Οι βάσεις του DNA είναι επίσης ιδιαίτερα ευαίσθητες στην επίδραση των ελευθέρων ριζών και το κύριο προϊόν είναι ο 8-υδροξυ-2- δεοξυγουανοσίδης [Kevin et al,, 2007]. Η οξείδωση του DNA µπορεί να προκαλέσει µεταλλάξεις, απαλοιφές και προσθήκες βάσεων, οι οποίες αφορούν τόσο το πυρηνικό όσο και το µιτοχονδριακό γενετικό υλικό. Ειδικά το µιτοχονδριακό DNA, λόγω της εγγύτητας στους µηχανισµούς παραγωγής ενέργειας και κατά συνέπεια και παραγωγής ελευθέρων ριζών και της µικρότερης αναγεννητικής και επιδιορθωτικής του ικανότητας, είναι πιο ευαίσθητο στη βλαπτική επίδραση των ΕΡ Δράση σε πρωτεΐνες Όσον αφορά τις πρωτεΐνες, είναι γνωστό ότι όλα τα αµινοξέα µπορούν να υποστούν τη δράση των ελευθέρων ριζών. Μια συχνή συνέπεια της οξείδωσης αµινοξέων είναι η δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών, γεγονός που µπορεί να έχει σαν συνέπεια την αλλαγή της διαµόρφωσης της 18

19 πρωτεΐνης και πιθανόν την απώλεια της δράσης της ή την έναρξη δράσης ενός αδρανούς µορίου. Είναι εύκολα αντιληπτό ότι η αλλαγή της διαµόρφωσης ενός ενζύµου µπορεί να σηµάνει τη διακοπή της δράσης του. Αν το ένζυµο αυτό συµµετέχει σε µία αλυσίδα αντιδράσεων, το αποτέλεσµα µπορεί να είναι η συσσώρευση ενός µεταβολικού προϊόντος µε πιθανή βλαπτική δράση. Αυτός φαίνεται να είναι ο µηχανισµός θανάτου νευρικών κυττάρων σε πολλές από τις λεγόµενες εκφυλιστικές παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος [Goswami et al., 2006]. Έτσι, έχει βρεθεί ότι στη χορεία του Huntington το οξειδωτικό στρες οδηγεί στην παραγωγή της µεταλλαγµένης πρωτεΐνης χαντινγκτίνης και επαγωγή µηχανισµών κυτταρικού θανάτου Δράση στην επικοινωνία των κυττάρων Η σηµαντικότερη µάλλον δράση των ελευθέρων ριζών είναι η διαταραχή που επέρχεται στην έκφραση µεταγραφικών παραγόντων. Οι ελεύθερες ρίζες παίζουν σηµαντικό ρόλο στην επικοινωνία των κυττάρων. Για να επιτευχθεί οµοιόσταση του κυττάρου είναι απαραίτητο να υπάρχει ισορροπία µεταξύ παραγωγής και κατανάλωσης ελευθέρων ριζών. Ένας µεγάλος αριθµός µορίων όπως κινάσες, φωσφατάσες και άλλοι µεταγραφικοί παράγοντες φαίνεται να επηρεάζονται από την ενδοκυττάρια οξειδωτική κατάσταση. Η έκθεση κυττάρων σε οξειδωτικές ουσίες που εξαντλούν τα αποθέµατα της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης, επάγει την G1 φάση του κυττάρου και οδηγεί σε πληθώρα αλλαγών σε πρωτεΐνες που σχετίζονται µε τον κυτταρικό κύκλο [Esposito et al., 2001]. 19

20 Η αλλαγή στη διαµόρφωση των µεταγραφικών παραγόντων επέρχεται κυρίως µέσω δηµιουργίας δισουλφιδικών δεσµών σε καίρια σηµεία, όπως σηµεία σύνδεσης µε άλλα µόρια, φωρφορυλίωσης ή αποφωσφορυλίωσης. Το αποτέλεσµα µπορεί να είναι η ενεργοποίηση ή η καταστολή του µεταγραφικού παράγοντα. Σχήµα 3. Συσχέτιση µεταξύ ΕΡ, ηλικίας και φλεγµονής. Αύξηση των ΕΡ προκαλεί µεταβολή οξειδωτικής κατάστασης και ενεργοποίηση µεταγραφικών οδών, επάγοντας γονίδια σχετιζόµενα µε φλεγµονώδεις διαδικασίες και τελικά την παραγωγή κυτοκινών και άλλων µεσολαβητών που σχετίζονται µε τη φλεγµονή. Δηµιουργείται µια κατάσταση χρόνιας φλεγµονής που οδηγεί σε γήρανση και σε νόσους που σχετίζονται µε αυτήν [Kregel et al., 2007]. Παραδείγµατα µεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται µε την οξειδωτική κατάσταση είναι η πρωτεΐνη p53, οι µεταγραφικοί 20

21 παράγοντες Forkhead, η ενεργοποιητική πρωτεΐνη 1 (AP-1) και ο πυρηνικός µεταγραφικός παράγοντας (NF-κΒ). Η πρωτεΐνη p53 έχει µοριακό βάρος 53-KDa και επηρεάζει την κυτταρική διαίρεση - ιδίως τη µεσόφαση - την κυτταρική γήρανση και απόπτωση. Οι ελεύθερες ρίζες εµποδίζουν τη σύνδεση της p53 µε το DNA [Jayaraman et al., 1997]. Οι παράγοντες Forkhead είναι µια οµάδα πρωτεϊνών µε µια κοινή περιοχή DNA. Βρίσκονται σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα και φαίνεται ότι παίζουν σηµαντικό ρόλο στη µεσόφαση, την απόκριση στο στρες, το χρόνο ηµίσειας ζωής και την απόπτωση των κυττάρων [Greer and Brunet, 2005]. Φαίνεται ότι το οξειδωτικό στρες προάγει τη φωσφορυλίωση και την αλλαγή της διαµόρφωσης των πρωτεϊνών Forkhead, ενώ ταυτόχρονα επάγει την Akt, µια κινάση σερίνης-θειονίνης, η οποία µε τη σειρά της είναι κατ εξοχήν υπεύθυνη για τη φοσφορυλίωσή τους [Furukawa-Hibi et al., 2005]. Επιπλέον, το οξειδωτικό στρες προάγει την ακετυλίωση λυσινο-πρωτεϊνών Forkhead από ακετυλάσες, γεγονός που καταλήγει τελικά σε απενεργοποίηση των πρωτεϊνών αυτών [Matsuzaki et al., 2005; Perrot and Rechler, 2005]. Η ενεργοποίηση του ΑΡ-1 εξαρτάται από την οξειδωτική κατάσταση και περιλαµβάνει και τη συµµετοχή του οξειδοαναγωγικού παράγοντα-1 (Ref-1). Ο Ref-1 έχει δύο διαφορετικές λειτουργίες: βοηθά στη διόρθωση βλαβών του DNA που προκαλούνται από ελεύθερες ρίζες, αλλά και επάγει τον ΑΡ-1 [Jayaraman et al., 1997]. Τέλος, ο NF-κΒ έχει µία υποµονάδα την ΙκΒ που είναι ο ρυθµιστής της δραστικότητας του. Όταν αυτή κάτω από συνθήκες στρες υποστεί φωσφορυλίωση, τότε αδρανοποιείται, αποσυντίθεται και το υπόλοιπο µόριο µεταφέρεται στον πυρήνα και δρα ως ενεργοποιητής µεταγραφής [Piette et al., 1997]. 21

22 Από όλα τα παραπάνω θα µπορούσαµε να συµπεράνουµε ότι η µεταβολή της οξειδοναγωγικής κατάστασης του οργανισµού επιφέρει περαιτέρω αλλαγές σε ενζυµικά συστήµατα και µπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση ή καταστολή των συστηµάτων αυτών, που µε τη σειρά τους µπορούν να έχουν ευεργετική ή επιβλαβή επίδραση σε κυτταρικό επίπεδο. Σχήµα 4. Οι ΕΡ παίζουν σηµαντικό ρόλο στην «επικοινωνία» των κυττάρων µέσω ενεργοποίησης ή καταστολής µεταγραφικών οδών. Στη µία περίπτωση η µεταβολή της οξειδωτικής κατάστασης στο κυτταρόπλασµα σηµατοδοτεί µεταβολές στον πυρήνα που προάγουν την έκφραση γονιδίων. Ως αποτέλεσµα, η ενεργοποίηση µεταγραφικών οδών µπορεί να έχει καθοριστική επίδραση στην επιβίωση του κυττάρου (απόπτωση, ανάπτυξη, παραγωγή κυτοκινών). Τελικά, η εξέλιξη του κυττάρου καθορίζεται από την ισορροπία µεταξύ αντιοξειδωτικών παραγόντων και παραγωγής ελευθέρων ριζών, καθώς και από τη δράση των προϊόντων έκφρασης των γονιδίων που επάγονται ή την έλλειψη άλλων που καταστέλλονται. Μέρος της διαδικασίας αυτής είναι η κυτταρική γήρανση και η έκπτωση των αντιοξειδωτικών µηχανισµών [Kregel et al., 2007]. 22

23 3. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΠΑΘΗΣΕΙΣ 3.1. Ελεύθερες Ρίζες, Γήρανση, Απόπτωση και Κυτταρικός Θάνατος Οι ΕΡ έχουν ενοχοποιηθεί από παλιά για την κυτταρική γήρανση και τελικά το θάνατο των κυττάρων. Έτσι, έχει βρεθεί ότι µπορούν να τροποποιήσουν µεταγραφικές οδούς, γεγονός που µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα την επαγωγή ή την καταστολή τους, να προκαλέσουν βλάβη σε πρωτεΐνες, µε αποτέλεσµα την αναστολή της δράσης τους, ή υπεροξείδωση λιπιδίων που αν εντοπίζονται στην κυτταρική µεµβράνη µπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της διαπερατότητάς της. Έχουν αναπτυχθεί αρκετές θεωρίες στην προσπάθεια κατανόησης της συσχέτισης της οξειδωτικής κατάστασης µε τη γήρανση ενώ παράλληλα έχει βρεθεί ότι αυξάνονται τα επίπεδα ελευθέρων ριζών και άλλων οξειδωτικών δεικτών µε την πρόοδο της ηλικίας [Barlow et al., 1999; Ito et al., 2004]. Οι επικρατέστερες είναι η θεωρία των µιτοχονδρίων και η θεωρία της επαγωγής έκφρασης προφλεγµονωδών γονιδίων. Σύµφωνα µε την πρώτη, κατά την αλυσίδα παραγωγής ενέργειας στα µιτοχόνδρια συµβαίνει διαφυγή ηλεκτρονίων τα οποία οδηγούν στην παραγωγή ελευθέρων ριζών. Οι τελευταίες προκαλούν ένα συνεχή κύκλο βλαβών στην αλυσίδα ενέργειας αρχικά και έκπτωση της µιτοχονδριακής λειτουργίας στη συνέχεια [Wallace, 2005]. Πράγµατι, έχει βρεθεί ότι αυξάνεται ο βαθµός της βλάβης στο µιτοχονδριακό DNA µε την πρόοδο της ηλικίας [Hamilton et al., 2001]. Κατά τη δεύτερη θεωρία, οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν επαγωγή µεταγραφικών οδών που οδηγούν σε κυτταρική γήρανση και θάνατο. Η επαγωγή αυτή γίνεται µέσω υπερέκφρασης προφλεγµονωδών γονιδίων και η κατάσταση αυτή επιδεινώνεται µε την πρόοδο της ηλικίας. 23

24 Η πρωτεΐνη p53 µαζί µε την πρωτεΐνη Rb (Retinoblastoma tumor suppressor protein) παίζουν σηµαντικό ρόλο στους µηχανισµούς κυτταρικής γήρανσης. Και οι δύο παραπάνω πρωτεΐνες αυξάνονται σε κύτταρα που βρίσκονται σε φάση γήρανσης [Kulju and Lehman, 1995; Narita et al., 2003]. Οι ΕΡ µπορούν να προκαλέσουν απευθείας επαγωγή των παραπάνω πρωτεϊνών ή έµµεσα µέσω βλάβης του DNA και βράχυνσης των τελοµεριδίων [Bar-Or et al., 2001; von Zglinicki et al., 1995]. Σχήµα 5. Εξωγενείς παράγοντες, όπως άγχος, διατροφή και τρόπος ζωής αλλά και ενδογενείς παράγοντες οδηγούν σε παραγωγή ελευθέρων ριζών. Τα αντιοξειδωτικά συστήµατα του οργανισµού εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες και επιδιορθώνουν µέρος των βλαβών που προκύπτουν από τη δράση τους στο DNA, πρωτεΐνες και λιπίδια. Η περίσσια ΕΡ προκαλεί αφενός βλάβες σε κυτταρικά οργανύλια µε πιο ευαίσθητα τα µιτοχόνδρια και τα υπεροξυσωµάτια και αφετέρου µεταβολές στην έκφραση γονιδίων. Οι συνέπειες στο κύτταρο µπορεί να είναι γήρανση, θάνατος ή φλεγµονώδης απόκριση, ενώ συστηµατική απάντηση µπορεί να εκδηλωθεί µε δυσλειτουργία οργάνων, γήρανση και εκδήλωση φλεγµονωδών και αυτοάνοσων νοσηµάτων [Kregel and Zhang, 2007]. Παρόµοια, οι ΕΡ επιδρούν και στους µηχανισµούς απόπτωσης. Κατά τον ενδογενή µηχανισµό απόπτωσης, το ερέθισµα για την έναρξη της 24

25 απόπτωσης ξεκινά ενδοκυττάρια και περιλαµβάνει µία αλυσίδα αλλαγών σε διάφορα µόρια, µε τελικό αποτέλεσµα τη µεταβολή του δυναµικού της µιτοχονδριακής µεµβράνης και την απελευθέρωση αποπτωτικών παραγόντων. Στον εξωγενή µηχανισµό, το ερέθισµα είναι η σύνδεση ενός εξωκυττάριου µορίου στο µεµβρανικό υποδοχέα και στη συνέχεια την ενεργοποίηση πρωτεασών. Οι ΕΡ επηρεάζουν και τους δύο µηχανισµούς απόπτωσης. Στον ενδογενή, στόχος των ΕΡ γίνονται οι πρωτεΐνες της µιτοχονδριακής µεµβράνης µε αποτέλεσµα µεταβολή της διαπερατότητας [Le Bras, 2005]. Στον εξωγενή, οι ΕΡ επηρεάζουν την έκφραση πολλών µεταγραφικών οδών και µπορούν να επάγουν τη δράση ενζύµων. Ένα παράδειγµα είναι η ρυθµίζουσα την απόπτωση κινάση-1 η οποία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη σε µεταβολές της οξειδωτικής κατάστασης [Goldman et al., 2004; Tobiume et al., 2001; Ueda et al., 2002]. Τελευταία, έχει βρεθεί µια πρωτεΐνη, η p66 Shc, που φαίνεται ότι είναι ο συνδετικός κρίκος µεταξύ της µεταβολής της οξειδωτικής κατάστασης και της κυτταρικής απόπτωσης. Η p66 Shc επηρεάζεται από την οξειδωτική κατάσταση, οδηγεί στην παραγωγή Η 2 Ο 2, και θεωρείται ότι σηµατοδοτεί την κυτταρική απόπτωση [Migliaccio et al., 2006; Giorgio et al., 2005; Migliaccio et al., 1999]. Ποντίκια που δεν φέρουν το γονίδιο της p66 Shc ζουν κατά µέσο όρο 30% περισσότερο, ενώ κύτταρα που δεν έχουν το γονίδιο της πρωτεΐνης αυτής (p66 Shc-/- ) παρουσιάζουν αντοχή σε συνθήκες οξειδωτικού στρες [Migliaccio et al., 1999; Napoli et al., 2003] Αθηροσκλήρωση Με τον όρο αθηροσκλήρωση εννοούµε την εναπόθεση λιπιδίων στο εσωτερικό των αγγείων που οδηγεί σε προοδευτική απόφραξη αυτών. 25

26 Έχει βρεθεί ότι η οξειδωµένη χαµηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (LDL) κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεση της αθηροσκλήρωσης. H οξειδωµένη LDL οδηγεί στη δηµιουργία αφρωδών κυττάρων [Brown et al., 1979]. Στα αρχικά στάδια η LDL εναποτίθεται υπενδοθηλιακά και παγιδεύεται εκεί, και στη συνέχεια µε τη επίδραση ελευθέρων ριζών, παραγοµένων από µυϊκά κύτταρα και µονοπύρηνα λευκά αιµοσφαίρια, οξειδώνεται. Η οξειδωµένη LDL οδηγεί στην παραγωγή χηµειοτακτικής πρωτεΐνης-1 των µονοκυττάρων (MCP-1), η οποία µε τη σειρά της οδηγεί στη συσσώρευση µονοπύρηνων. Τα τελευταία ενδοκυτταρώνουν την οξειδωµένη LDL και µετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Ο παραπάνω µηχανισµός αποτελεί την οξειδωτική θεωρία της αθηρογένεσης και παρουσιάζεται σχηµατικά παρακάτω: Σχήµα 6. Υπενδοθηλιακή εναπόθεση LDL, οξειδωτική µετατροπή, ενδοκυττάρωση από µακροφάγα και δηµιουργία αφρωδών κυττάρων [Aviram and Fuhrman, 1998]. 26

27 3.3. Κάπνισµα και Ελεύθερες Ρίζες Το κάπνισµα επηρεάζει καθοριστικά την οξειδωτική κατάσταση αυξάνοντας τον αριθµό των ελευθέρων ριζών. Αρκεί να σκεφτεί κανείς ότι ένα τσιγάρο οδηγεί στη δηµιουργία ελευθέρων ριζών. Το κάπνισµα συντελεί στη δηµιουργία ελευθέρων ριζών τόσο µε άµεση προσφορά όσο και από επαγωγή φλεγµονωδών οδών που αυξάνουν την παραγωγή ΕΡ [Church and Pryor, 1985]. Έχει βρεθεί ότι στους καπνιστές είναι επηρεασµένος ολόκληρος ο αντιοξειδωτικός µηχανισµός. Η δυσµενής επίδραση του καπνίσµατος µπορεί εύκολα να αναδειχθεί. Γενικά, στους καπνιστές βρίσκονται σε αυξηµένα επίπεδα ενώσεις που παράγονται από τη δράση ΕΡ, αλλά και αντιοξειδωτικά συστήµατα του οργανισµού βρίσκονται γενικά επηρεασµένα. Έτσι, δείκτες οξείδωσης λιπιδίων όπως µηλονική διαλδεΰδη και υδροξυνονενάλη ουσίες που αντιδρούν µε θειοβαρβιτουρικό οξύ, δείκτες οξείδωσης πρωτεϊνών όπως η νιτροτυροσίνη και δείκτες βλάβης DNA, όπως ο 8- υδροξυδεοξυγουανοσίδης έχουν βρεθεί σε αυξηµένα επίπεδα [Burke and FitzGerald, 2003]. Ακόµη, η LDL των καπνιστών είναι πιο ευαίσθητη σε οξείδωση σε σχέση µε µη καπνιστές [Gouaze et al., 1998]. To µονοξείδιο του αζώτου (NO) αποτελεί σηµαντικό ρυθµιστή της αρτηριακής πίεσης. Παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και προκαλεί αγγειοδιαστολή. Καπνιστές έχουν χαµηλότερα επίπεδα ΝΟ, γεγονός που οφείλεται στην κατανάλωσή του από τις ελεύθερες ρίζες - και κυρίως τα υπεροξείδια - αλλά και στη βλάβη που προκαλείται στο ενδοθήλιο. Έχει βρεθεί ότι το κάπνισµα αυξάνει την απόπτωση των κυττάρων του ενδοθηλίου [Raveendran et al., 2005] και οδηγεί σε µειωµένη παραγωγή ΝΟ και προστακυκλίνης. Παράλληλα, προκαλεί 27

28 ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και της φλεγµονώδους αντίδρασης στους πνεύµονες, αύξηση της δράσης της µυελοϋπεροξειδάσης του πλάσµατος και ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων. Φαίνεται ότι µία σειρά από βιολογικούς δείκτες επηρεάζονται στους καπνιστές. Έτσι, τα επίπεδα του ινωδογόνου που αποτελεί παράγοντα κινδύνου για καρδιοπάθεια και του χαλκού - συµµετέχει ως προοξειδωτικό σε αντιδράσεις - βρίσκονται αυξηµένα σε καπνιστές. Τα επίπεδα του ψευδάργυρου από την άλλη µεριά, που λειτουργεί προστατευτικά, είναι ελαττωµένα [Keen et al., 1987]. Το ασκορβικό οξύ, βασικό αντιοξειδωτικό του οργανισµού, έχει βρεθεί ελαττωµένο τόσο σε ενεργητικούς όσο και σε παθητικούς καπνιστές, ανεξάρτητα από τις διαιτητικές τους συνήθειες [Schectman et al., 1989]. Έχει επίσης παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα της βιταµίνης Ε βρίσκονται σε χαµηλότερα επίπεδα, γεγονός όµως που σχετίζεται περισσότερο µε την ελάττωση της πρόσληψής της από τα τρόφιµα. Τα επίπεδα του φυλλικού οξέος είναι σαφώς ελαττωµένα, γεγονός που οφείλεται κυρίως στον αυξηµένο καταβολισµό του σε συνθήκες οξειδωτικού στρες [Hoefel, 1977]. Ακόµη, αντιοξειδωτικά ένζυµα όπως η υπεροξειδική δισµουτάση και η αναγωγάση της γλουταθειόνης εµφανίζουν µικρότερη δραστικότητα [Chow et al., 1986]. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η βλαπτική δράση του τσιγάρου δεν έγκειται µόνο στην επίδραση των ΕΡ που βρίσκονται στα πτητικά συστατικά του και την πίσσα, αλλά βλαπτική επίδραση έχει και η νικοτίνη. Η τελευταία - συνεπικουρούµενη από το Cu - αυξάνει το βαθµό οξείδωσης της LDL [Gouaze et al., 1998] και προάγει την αθηροσκλήρωση σε ποντίκια [Heeschen et al., 2001]. Τέλος, σηµαντική είναι η επίδραση του καπνού στη γονιµότητα. Το κάπνισµα επιβραδύνει κατά δύο µήνες τη σύλληψη γόνιµων ζευγαριών [Zenzes, 1995], συντελεί στη πρώιµη έναρξη εµµηνόπαυσης περίπου 28

29 κατά δύο έτη [Adeno and Gallagher, 1982], αυξάνει την πιθανότητα αυτόµατων εκτρώσεων [Armstrong et al.,1992; Windham et al., 1992] και ελαττώνει τη συνολική γονιµότητα [Howe et al., 1985]. Στον άνδρα, επηρεάζει όλες τις παραµέτρους αξιολόγησης της ποιότητας του σπέρµατος, ελαττώνει τον αριθµό σπερµατοζωαρίων ανά ml, αυξάνει τις ελεύθερες ρίζες και τα λευκοκύτταρα στο σπέρµα και καταστρέφει τις αντιοξειδωτικές αντιστάσεις του σπέρµατος, καθιστώντας τα σπερµατοζωάρια ευάλωτα στη δράση των ΕΡ. Οι κυτταροπλασµατικές µεµβράνες των τελευταίων περιέχουν µεγάλες ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων [Alvarez and Storey, 1995] ιδιαίτερα ευαίσθητων στη δράση των ΕΡ και το κυτταρόπλασµά τους περιέχει σχετικά µικρές ποσότητες αντιοξειδωτικών ενζύµων [De Lamirande and Gagnon, 1995; Sharma and Agarwal, 1996; Sikka et al., 1995; Sikka, 2001]. Πράγµατι, οι ΕΡ προκαλούν βλάβες του DNA των σπερµατοζωαρίων, γεγονός που φαίνεται από τα αυξηµένα επίπεδα 8- υδροξυδεοξυγουανοσίδη [Loft et al., 2003]. Τέλος, παιδιά µε καπνιστές πατέρες έχουν 4πλάσια πιθανότητα εµφάνισης καρκίνου [Ji et al., 1997] ενώ το 14% των παιδικών καρκίνων αποδίδεται στο κάπνισµα των γονέων και ειδικότερα του πατέρα [Sorahan et al., 1997]. Παρόµοια είναι η δράση των ΕΡ στο γυναικείο γεννητικό σύστηµα. Ωάρια καπνιστριών περιέχουν µικρότερες ποσότητες αντιοξειδωτικών ενζύµων λόγω κατανάλωσης από τις ελεύθερες ρίζες, έχουν αυξηµένους δείκτες βλάβης DNA και εµφανίζουν σε µεγαλύτερη συχνότητα ανευπλοειδίες σε σχέση µε µη καπνίστριες και ταυτόχρονα είναι και υπογόνιµες. 29

30 3.4. Ελεύθερες Ρίζες στη Γυναικολογία και τη Μαιευτική Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι ελεύθερες ρίζες διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο τόσο σε φυσιολογικές όσο και παθολογικές διεργασίες µε κυριότερη δράση την επαγωγή ή την αναστολή µεταγραφικών οδών. Οι ΕΡ επηρεάζουν όλη την αναπαραγωγή ζωή της γυναίκας και επιπλέον συµµετέχουν σε ένα µεγάλο βαθµό στη διαδικασία της εµµηνόπαυσης κυρίως λόγω των εκφυλιστικών επιδράσεων που ασκούν στα κύτταρα λόγω διαταραχής στη διαπερατότητα της κυτταρικής µεµβράνης µηχανισµός που ευθύνεται σε µεγάλο βαθµό για την ατρησία και επακόλουθη νέκρωση των ωοθυλακίων [De Bruin et al., 2002]. Κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, οι ΕΡ που παράγονται από τον πλακούντα λόγω αυξηµένης µιτοχονδριακής δραστηριότητας, παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση του τροφοβλαστικού ιστού και του νεοσχηµατιζόµενου αγγειακού δικτύου. Αυξηµένη και µη αντιρροπούµενη παραγωγή ΕΡ έχει παρατηρηθεί σε κυήσεις που επιπλέκονται µε προεκλαµψία µια κατάσταση που εµφανίζει υπέρταση, λευκωµατουρία και οιδήµατα και επιβράδυνση της ενδοµήτριας ανάπτυξης [Myatt and Cui, 2004]. Ο ρόλος των ΕΡ στην προεκλαµψία δεν έχει ακόµη αποσαφηνιστεί καθώς από τη µια µεριά έχουν βρεθεί ελαττωµένα επίπεδα ΝΟ, αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου και αυξηµένα επίπεδα δεικτών που σχετίζονται µε οξειδωτικό στρες, χωρίς όµως να έχει εξακριβωθεί ο µηχανισµός δηµιουργίας προεκλαµψίας, µε αποτέλεσµα όλες οι θεραπείες να κατευθύνονται στην αντιµετώπιση των συµπτωµάτων και όχι του αιτίου, αλλά και οι αντιοξειδωτικές θεραπείες να αποδεικνύονται αναποτελεσµατικές. Ακόµη, υψηλότερα επίπεδα 30

31 οξειδωτικών δεικτών έχουν βρεθεί σε πρόωρους τοκετούς [Mocatta et al., 2004] και πρόωρη ρήξη εµβρυικών µεµβρανών [Wall et al., 2002] καθώς και σε τοκετούς που περατώθηκαν κολπικά σε σχέση µε καισαρικές τοµές [Fainaru et al., 2002]. Ο ρόλος των ΕΡ στην υπογονιµότητα και τη γονιµότητα δεν είναι ξεκάθαρος. Ως υπογονιµότητα ορίζεται µη επιτυχής σύλληψη για 12 συνεχόµενους κύκλους. Φαίνεται ότι το µικροπεριβάλλον της ωοθήκης διατηρεί σταθερή την οξειδοαναγωγική κατάσταση κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού κύκλου, αν και έχει βρεθεί ότι αντιοξειδωτικά ένζυµα όπως η υπεροξειδική δισµουτάση παρουσιάζουν κυκλικές διακυµάνσεις [Sugino et al., 1996]. Υπογόνιµες γυναίκες στις οποίες τελικά επετεύχθη εγκυµοσύνη, βρέθηκε ότι παρουσίαζαν υψηλότερα επίπεδα ΕΡ και υπεροξειδίων των λιπιδίων σε σχέση µε αυτές στις οποίες δεν επετεύχθη [Attaran et al., 2000]. Θα µπορούσε έτσι να χρησιµοποιηθεί ο προσδιορισµός των επιπέδων των ελευθέρων ριζών στο υγρό της διαφανούς ζώνης κατά την ωοληψία ως προγνωστικός δείκτης επιτυχούς εξωσωµατικής γονιµοποίησης. Οι ΕΡ επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων και ένα ελάχιστο επίπεδο είναι απαραίτητο για την επιτυχή εµφύτευση της βλαστοκύστης [Pasqualotto et al., 2004]. Από την άλλη πλευρά, υπερπαραγωγή ΕΡ οδηγεί στα αντίθετα αποτελέσµατα. Το οξειδωτικό στρες οδηγεί σε ανεπάρκεια ωχρινικής φάσης [Garcia-Pardo et al., 1999] και αδυναµία υποστήριξης της κύησης [Agarwal and Allamaneni, 2004]. Ένας ακόµη πολύ σηµαντικός παράγοντας υπογονιµότητας είναι η ποιότητα των ωοθυλακίων. Ωοθυλάκια υπογόνιµων γυναικών παρουσίασαν αυξηµένη ποσότητα 8- υδροξυ-2-δεοξυγουανοσίδη, ενός ευαίσθητου δείκτη της βλάβης του DNA λόγω των ΕΡ [Seino et al., 2002]. Παρόµοια, αυξηµένα επίπεδα 8- υδροξυ-2-δεοξυγουανοσίδη βρίσκονται στην κοκκώδη στιβάδα γυναικών 31

32 µε ενδοµητρίωση, γεγονός που µπορεί να συµβάλλει µέσω βλάβης ωοθυλακίων στη συνολική εικόνα υπογονιµότητας. Τέλος, οι ελεύθερες ρίζες µπορούν να βλάψουν τα ωοκύτταρα τόσο στα ωοθυλάκια όσο και στην περιτοναϊκή κοιλότητα, τα σπερµατοζωάρια στο περιτόναιο και το γονιµοποιηµένο ωάριο στον ωαγωγό [Guerin et al., 2001; Isaksson and Tiitinen, 2004] Ηπατίτιδα C Ο ρόλος των ελευθέρων ριζών στην πορεία της ηπατίτιδας C και την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκίνου έχει γίνει αντικείµενο έρευνας τα τελευταία χρόνια. Η ηπατίτιδα C οφείλεται σε λοίµωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C. Το µεγαλύτερο ποσοστό των φορέων θα αναπτύξουν χρόνια ηπατίτιδα και από αυτούς το 20-30% θα αναπτύξουν κίρρωση του ήπατος, η οποία χαρακτηρίζεται από ηπατοκυτταρική νέκρωση και ανάπτυξη αναγεννητικών οζιδίων. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη ηπατίτιδας C είναι η λοίµωξη µε τον ιό της ηπατίτιδας C. Κατά την πορεία της νόσου, φαίνεται ότι η ηπατοκυτταρική νέκρωση σχετίζεται µε αυξηµένη παραγωγή ΕΡ, προϊόντων οξείδωσης λιπιδίων και πρωτεϊνών [Farinati et al., 1995]. Σε ενίσχυση των παραπάνω, έχουν βρεθεί αυξηµένα επίπεδα 8-υδροξυ-2-δεοξυγουανοσίδη - προϊόν βλάβης του DNA από ΕΡ - τόσο σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα C και κίρρωση του ήπατος, όσο και σε ασθενείς θετικούς σε ιό της ηπατίτιδας C µε φυσιολογικά επίπεδα τρανσαµινασών [Cardin et al., 2001]. Αυτό υποδηλώνει ότι οι θετικοί στον ιό της ηπατίτιδας C ασθενείς µε φυσιολογικά επίπεδα τρανσαµινασών παρουσιάζουν κάποιο βαθµό 32

33 ηπατοκυτταρικής βλάβης [Puoti et al., 1997; Persico et al., 2000]. Ακόµη, δείκτες οξειδωτικού στρες θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως δείκτες εξέλιξης της νόσου αλλά και απόκρισης στη θεραπεία [Mahmood et al., 2004; Sumida et al., 2000]. Έχει προταθεί ότι η πρωτεΐνη του πυρήνα του ιού µπορεί να προκαλέσει συσσώρευση ΕΡ, µεταβολή µεταγραφικών µονοπατιών και ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκίνου [Koike et al., 2008]. Η υπερπαραγωγή ΕΡ συνεπάγεται υπερέκφραση κυτοκινών, οι οποίες µε τη σειρά τους εµποδίζουν την κυτταρική απόπτωση, πιθανότατα µέσω του NF-kb. Ακόµη, µπορεί να οδηγήσει σε υπερέκφραση πρωτοογκογονιδίων όπως το c-myc, που βρίσκεται περισσότερο σε κιρρωτικά κύτταρα απ ότι σε φυσιολογικά, και άλλων γονιδίων όπως το p-53 προκαλώντας παραγωγή µεγαλύτερου αριθµού ΕΡ. Ένας παράγοντας του οποίου η δράση δεν έχει ακόµα αποσαφηνιστεί είναι ο ρόλος των οιστρογόνων στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικής βλάβης. Πειράµατα σε ποντίκια έδειξαν αυξηµένα επίπεδα 8-υδροξυ-2- δεοξυγουανοσίδη µε χορήγηση οιστρογόνων [Han and Liehr, 1995]. Τα οιστρογόνα επηρεάζουν το µηχανισµό κυτταρικής διαίρεσης επάγοντας το γονίδιο της κυκλίνης D1 και της ρυθµίζουσας τη φάση G1 πρωτεΐνης [Altucci et al., 1996]. Άλλοι µηχανισµοί που φαίνεται να συµβάλλουν στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκίνου είναι µεταβολή στην έκφραση γονιδίων, αύξηση κυτοκινών, αυξηµένα επίπεδα σιδήρου που παρατηρούνται σε πολλές περιπτώσεις, διαφυγή ηλεκτρονίων από µιτοχόνδρια, µειωµένη ηπατική αντιοξειδωτική δράση λόγω ηπατοκυτταρικής βλάβης, αλκοόλ και φάρµακα που χρησιµοποιούνται στη θεραπεία της νόσου. 33

34 Σχήµα 7. Η λοίµωξη µε τον ιό της ηπατίτιδας C και η ηπατοκυτταρική νέκρωση σχετίζεται µε αύξηση των ΕΡ και µεταβολή της αντιοξειδωτικής κατάστασης που έχει σαν συνέπεια, µέσω ενδογενών και εξωγενών παραγόντων, ενεργοποίηση µεταγραφικών οδών που οδηγούν σε αστάθεια του γενετικού υλικού, ανισσοροπία µεταξύ απόπτωσης και κυτταρικού πολλαπλασιασµού, διευκολύνοντας την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Σηµαντικοί παράγοντες στην εξέλιξη της νόσου παίζουν ο σίδηρος που στους ασθενείς αυτούς είναι σε αυξηµένα επίπεδα και οι ορµόνες του φύλου που αυξάνουν γενικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Οι ΕΡ σχετίζονται µε αυξηµένη δραστηριότητα τελοµεράσης, ενεργοποίηση της p53 και της οδού της β- κατενίνης, έκφραση πρωτο-ογκογονιδίων όπως το c-myc και προϊόντων επίδρασης των ΕΡ στο γενετικό υλικό, όπως ο 8-υδροξυ-2-δεοξυγουανοσίδης [Farinati et al., 1995]. Θα µπορούσε να λεχθεί ότι η υπερπαραγωγή ΕΡ, σε βαθµό που δεν µπορεί να αντισταθµιστεί από την αναγεννητική και επιδιορθωτική ικανότητα του ήπατος, αποτελεί το συνδετικό κρίκο µεταξύ λοίµωξης µε τον ιό της ηπατίτιδας C και ανάπτυξής ηπατοκυτταρικού καρκίνου αλλά και εξωηπατικών εκδηλώσεων. 34

35 Σχήµα 8. Αυξηµένη παραγωγή ΕΡ σε επίπεδο ηπατοκυττάρου µπορεί να οδηγήσει σε ηπατοκυτταρική νέκρωση και κίρρωση, χρόνια ηπατίτιδα, βλάβη του γενετικού υλικού, ευκολότερη εµφάνιση τοξικών επιδράσεων φαρµάκων, µείωση της απορρόφησης θρεπτικών συστατικών, καθώς και εξωηπατικές εκδηλώσεις, όπως συστηµατική εµφάνιση οξειδωτικού στρες, διαβήτη, µυοκαρδιοπάθειας και εγκεφαλοπάθειας [Choi et al., 2006] Παθήσεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος και Οξειδωτικό Στρες Η δηµιουργία και η δράση ΕΡ φαίνεται ότι παίζει σηµαντικό - αν όχι γενεσιουργό - ρόλο στην παθοφυσιολογία των εκφυλιστικών παθήσεων του κεντρικού νευρικού συστήµατος. Η συσχέτιση παθήσεων του κεντρικού νευρικού συστήµατος και οξειδωτικού στρες φαίνεται από την σύγχρονη εµφάνισή τους καθώς και από δείκτες που εµφανίζονται ταυτόχρονα στις παραπάνω καταστάσεις [Benzi and Moretti, 1995]. Τα νευρικά κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευάλωτα στη δράση ελευθέρων ριζών γιατί έχουν χαµηλά επίπεδα αντιοξειδωτικών εφεδρειών και κυρίως γλουταθειόνης, οι µεµβράνες των νευρικών κυττάρων περιέχουν µεγάλες ποσότητες λιπιδίων και επίσης ο µεταβολισµός των νευρικών κυττάρων 35

36 είναι αποκλειστικά αερόβιος και περιλαµβάνει κατανάλωση µεγαλύτερων ποσοτήτων οξυγόνου [Smith et al., 1995]. Σε ασθενείς µε νόσο Alzheimer, έχει βρεθεί ότι υπάρχει συσχέτιση µεταξύ εναπόθεσης σιδήρου και βλαβών της νόσου [Loeffler et al., 1995; Markesbery, 1997]. Όπως είναι γνωστό, ο σίδηρος είναι το πιο σηµαντικό µέταλλο που συµµετέχει σε οξειδωτικές αντιδράσεις. Χορήγηση σιδηροδεσµευτικών ουσιών όπως δεσφεροξαµίνη ελαττώνει την εναπόθεση σιδήρου. Στους ίδιους ασθενείς, έχουν βρεθεί αυξηµένα ποσά της σιδηροδεσµευτικής πρωτεΐνης p97 και υποστηρίζεται ότι η πρωτεΐνη αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως δείκτης πορείας της νόσου [Kennard et al., 1997]. Ακόµη σε ασθενείς µε νόσο Alzheimer έχουν βρεθεί αυξηµένα προϊόντα υπεροξείδωσης λιπιδίων, µιτοχονδριακού και πυρηνικού DNA και πρωτεϊνών [Mecocci et al., 1994]. Όσον αφορά την οξείδωση λιπιδίων, έχει βρεθεί ότι αλδεΰδες που παράγονται κατά τη διαδικασία αυτή δρουν τοξικά in vitro σε καλλιέργειες νευρικών κυττάρων του ιππόκαµπου [Mark et al., 1997], επηρεάζοντας τη λειτουργία ενζύµων που διασπούν το ATP, αντλιών ασβεστίου και άλλων ιόντων [Markesbery, 1997]. Ειδικά για τη νόσο Alzheimer, οι ΕΡ προκαλούν συσσώρευση αµυλοειδούς που είναι και η κύρια βλάβη στη νόσο αυτή, αλλά επιπρόσθετα το αµυλοειδές προκαλεί περαιτέρω παραγωγή ΕΡ [Dyrks et al., 1997]. Τελευταία, έχει διαπιστωθεί ότι το ίδιο το αµυλοειδές µπορεί να διασπαστεί και τµήµατά του να δράσουν τα ίδια ως ΕΡ προκαλώντας οξείδωση λιπιδίων [Hensley et al., 1994]. In vitro µελέτες έχουν δείξει ότι η επιβλαβής αυτή δράση του αµυλοειδούς µπορεί να ανασταλεί από αντιοξειδωτικές ουσίες καθώς και ουσίες που δρουν σιδηροδεσµευτικά. Σε ασθενείς µε σύνδροµο Down, όπου η εκφυλιστική διεργασία είναι παραπλήσια µε τη νόσο Alzheimer, έχει παρατηρηθεί ότι η κυτταρική απόπτωση συσχετίζεται µε παραγωγή προϊόντων υπεροξείδωσης λιπιδίων 36

37 και η διαδικασία αυτή µπορεί να ανασταλεί από την καταλάση και άλλα αντιοξειδωτικά συστήµατα [Busciglio and Yankner, 1995]. Ο ίδιος παθογενετικός µηχανισµός ενοχοποιείται και στην περίπτωση τη αταξίας Friedreich. Η τελευταία κληρονοµείται µε αυτοσωµατικό υπολειπόµενο τρόπο, εµφανίζεται µε συχνότητα περίπου 1/50000, ενώ τα κυριότερα συµπτώµατα αφορούν διαταραχές λόγου, όρασης και ακοής, µυϊκή αδυναµία και διαταραχές βάδισης. Παράλληλα, µπορεί να εµφανιστούν αρρυθµίες, µυοκαρδιοπάθεια, διαβήτης και σκολίωση. Η βλάβη αφορά τα περιφερικά νεύρα και καθοριστικής σηµασίας θεωρείται η µιτοχονδριακή διαταραχή που οδηγεί σε ελαττωµένη παραγωγή ΑΤΡ και διαρροή ΕΡ κατά την αλυσίδα παραγωγής ενέργειας [Calabrese et al., 2005]. Παρόµοια, η χορεία του Huntington είναι µια εκφυλιστική νόσος του κεντρικού νευρικού συστήµατος. Κληρονοµείται µε κυρίαρχο αυτοσωµατικό τρόπο και εµφανίζεται µε κινητικές, γνωσιακές και ψυχιατρικές εκδηλώσεις. Οφείλεται σε συσσώρευση παθολογικής µορφής µιας πρωτεΐνης, της χαντινγκτίνης, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο IT15. Σε ασθενείς µε χορεία Huntington υπάρχει µια επανάληψη της αλληλουχίας CAG στο 5 άκρο του γονιδίου IT15. Πράγµατι βρέθηκε ότι οι ΕΡ προκαλούν αύξηση της συσσώρευσης µεταλλαγµένης χαντινγκτίνης και επαγωγή του κυτταρικού θανάτου [Goswami et al., 2006] Οι Ελεύθερες Ρίζες στην Ψυχιατρική Υπάρχουν σαφής ενδείξεις ότι οι ΕΡ ενοχοποιούνται για τη γένεση ή την εξέλιξη πολλών ψυχιατρικών παθήσεων µε µηχανισµό όµοιο µε τις άλλες ασθένειες. Έτσι, ασθενείς µε διπολική διαταραχή εµφανίζουν αυξηµένα 37

38 επίπεδα δεικτών βλάβης του DNA ειδικά σε περιόδους έξαρσης [Arehart- Treichel, 2007]. Σε ασθενείς µε σχιζοφρένεια, έχουν βρεθεί αυξηµένα επίπεδα προϊόντων οξείδωσης λιπιδίων στο πλάσµα, τα ερυθρά αιµοσφαίρια και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό [McCreadie et al., 1995; Herken et al., 2001; Lohr et al., 1990]. Επιπλέον έχει βρεθεί αυξηµένη δραστηριότητα ενζύµων που σχετίζονται µε οξειδωτικό στρες όπως είναι η υπεροξειδική δισµουτάση [Reddy et al., 1991; Yao et al., 1998; Zhang et al., 2003]. Η προσθήκη αντιοξειδωτικών τροφίµων στην καθηµερινή δίαιτα βοηθά στη βελτίωση ορισµένων από τα συµπτώµατα της σχιζοφρένειας [Zhang et al., 2003a; Zhang et al., 2003b] Αναπνευστικό Σύστηµα και Ελεύθερες Ρίζες Οι ελεύθερες ρίζες παίζουν σηµαντικό ρόλο στη δηµιουργία και την εξέλιξη παθήσεων του αναπνευστικού συστήµατος. Είναι γνωστή η συµβολή των ΕΡ στη εµφάνιση κρίσεων άσθµατος και χρόνιας βρογχίτιδας. Το άσθµα είναι µια χρόνια πνευµονοπάθεια που χαρακτηρίζεται από κρίσεις παροδικής απόφραξης των αεροφόρων οδών που υποχωρούν αυτόµατα ή µε τη χρήση βρογχοδιασταλτικών φαρµάκων. Υπάρχουν ενδείξεις ότι, όπως πολλές ακόµη παθήσεις, το άσθµα οφείλεται σε ανισορροπία µεταξύ οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών ουσιών. Έχει βρεθεί ελαττωµένη αντιοξειδωτική ικανότητα πλάσµατος και αυξηµένο ποσοστό οξείδωσης λιπιδίων σε ασθενείς µε άσθµα, χρόνια βρογχίτιδα και στους καπνιστές [Rahman et al., 1996]. Ουδετερόφιλα λευκά αιµοσφαίρια ασθµατικών βρίσκονται σε ενεργή φάση και παράγουν ΕΡ, κυρίως Ο. 2, οι οποίες µε τη σειρά τους προκαλούν βλάβη του 38

39 πνευµονικού παρεγχύµατος [Kanazawa et al., 1991]. Για τα λευκοκύτταρα αυτά έχει βρεθεί ότι παράγουν µεγαλύτερες ποσότητες ΕΡ σε σχέση µε τα ενεργοποιηµένα ουδετερόφιλα µη ασθµατικών [Neijens et al., 1984]. Μη ενεργοποιηµένα ουδετερόφιλα ασθµατικών έχουν µικρότερη αντιοξειδωτική ικανότητα σε σχέση µε αντίστοιχα υγιών. Αντίστοιχα, η χρόνια βρογχίτιδα χαρακτηρίζεται από βήχα και απόχρεµψη τρεις τουλάχιστον µήνες για δυο συνεχόµενα χρόνια. Χαρακτηρίζεται από προοδευτική επιδείνωση της αναπνευστικής λειτουργίας και συσχετίζεται θετικά µε το κάπνισµα. Συνήθως, εµφανίζεται µε τη µορφή εξάρσεων και υφέσεων. Το οξειδωτικό στρες παίζει σηµαντικό ρόλο στη παθογένεια της χρόνιας βρογχίτιδας [Sahin et al., 2001]. Κατά την περίοδο των κρίσεων, υπάρχει ανισορροπία µεταξύ οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών παραγόντων στα τελικά βρογχιόλια, γεγονός που αντικατοπτρίζεται στο πλάσµα µε µειωµένη αντιοξειδωτική ικανότητα και αυξηµένα προϊόντα οξείδωσης λιπιδίων σε σχέση µε υγιείς [Rahman et al., 2000]. 39

40 4. ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ Ως αντιοξειδωτικές δρουν ενώσεις οι οποίες έχουν την ιδιότητα σε µικρές συγκεντρώσεις να αναστέλλουν τη δηµιουργία ή να εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες (σαρωτές). Ο ορισµός των αντιοξειδωτικών ουσιών είναι αρκετά ασαφής, γεγονός που υποδηλώνει ότι µία πληθώρα ουσιών µπορούν να δράσουν ως αντιοξειδωτικά. Δεν υπάρχει ένας ενιαίος τρόπος κατάταξης των αντιοξειδωτικών ουσιών. Ένας λειτουργικός τρόπος διακρίνει τις τελευταίες σε ένζυµα, µη ενζυµικές πρωτεΐνες και µικρού µοριακού βάρους µόρια χωρίς ενζυµική δράση. Η τελευταία κατηγορία µπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε υδρόφιλες και λιπόφιλες ενώσεις [Keaney and Vita, 1995] Ένζυµα µε Αντιοξειδωτική Δράση Υπεροξειδική Δισµουτάση Επιδρά και ελαττώνει τον χρόνο ηµίσειας ζωής των ΕΡ οξυγόνου. Υπάρχουν τρεις µορφές υπεροξειδικής δισµουτάσης. Η πρώτη περιέχει χαλκό και ψευδάργυρο και βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων και των ερυθρών αιµοσφαιρίων. Η δεύτερη περιέχει µαγγάνιο και βρίσκεται στα µιτοχόνδρια και η τρίτη είναι µία υψηλού ΜΒ υπεροξειδική δισµουτάση και εντοπίζεται στο πλάσµα και στους πνεύµονες. 40

41 Καταλάση Το µόριο είναι ένα τετραµερές που αποτελείται από 4 δακτυλίους πορφυρίνης µε ένα άτοµο σιδήρου στο κέντρο. Κάθε µία από τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποτελείται από περίπου 500 αµινοξέα [Boon et al., 2007]. Διασπά το Η σε νερό και οξυγόνο, βρίσκεται στα υπεροξυσωµάτια, τα αιµοπετάλια και τα ερυθρά αιµοσφαίρια [Loew, 1900] Υπεροξειδάση της Γλουταθειόνης Είναι ένα ένζυµο που βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα και τα µιτοχόνδρια των κυττάρων [Van Kuijk et al., 1987]. Δρα σε οργανικά υπεροξείδια που απελευθερώνονται από τη δράση φωσφολιπασών καθώς και στο Η [Thomas et al., 1990]. Καταλύει τη µετατροπή της γλουταθειόνης στη διµερή της µορφή [Grisham, 1992]: GSH= γλουταθειόνη, GSSG= διµερές γλουταθειόνης, ROOH= οργανικό υπεροξείδιο Γλουταθειόνη Είναι ένα τριπεπτίδιο που αποτελείται από L-κυστεΐνη, L-γλουταµικό οξύ και γλυκίνη [Ben, 1930]. Βρίσκεται στον πυρήνα, το κυτταρόπλασµα και τα µιτοχόνδρια και είναι ένα από τα σηµαντικότερα αντιοξειδωτικά συστήµατα του οργανισµού [Masella et al., 2005]. Οπως αναφέρθηκε παραπάνω η γλουταθειόνη αλληλεπιδρά µε οργανικά υπεροξείδια και 41

42 µετατρέπεται στην οξειδωµένη διµερή της µορφή. Παίζει πρωτεύοντα ρόλο στη διατήρηση της αντιοξειδωτικής κατάστασης του πυρήνα του κυττάρου από την οποία εξαρτάται η έκφραση ή η καταστολή γονιδίων [Valko et al., 2007]. Ο λόγος της ανηγµένης προς την οξειδωµένη µορφή χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της αντιοξειδωτικής κατάστασης του οργανισµού [Nogueira et al., 2004]. Η οξειδωµένη µορφή της γλουταθειόνης σε µεγάλες συγκεντρώσεις µπορεί να προκαλέσει βλάβες σε άλλα ενζυµικά συστήµατα του οργανισµού. Η γλουταθειόνη συµµετέχει στην αντιοξειδωτική άµυνα µέσω πολλαπλών µηχανισµών. Εξουδετερώνει ρίζες υδροξυλίου, οξυγόνου και υπεροξειδίου του υδρογόνου και οργανικών υπεροξειδίων µε τη συνέργεια της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. Συµµετέχει στη µεταφορά αµινοξέων διαµέσου µεµβρανών και επαναφέρει άλλες αντιοξειδωτικές ουσίες στην ανηγµένη τους µορφή, όπως είναι το ασκορβικό οξύ και η α-τοκοφερόλη [Masella et al., 2005] Αναγωγάση της Γλουταθειόνης Είναι µια φλαβοπρωτεΐνη που καταλύει τη µετατροπή του διµερούς της γλουταθειόνης στην ανηγµένη της µορφή [Pai and Schulz, 1983]. Στην αντίδραση αυτή ένα µόριο νικοτιναµινο-αδενινο-φωσφοδινουκλεοτίδιου (NADPH) διασπά την GSSG [Mannervik and Carlberg, 1985]. Μετατροπή της GSSG από το NADPH. Την αντίδραση καταλύει η αναγωγάση της γλουταθειόνης. 42