ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΡΙΣΠΕΡΙΔΟΝΗΣ ΕΛΕΖΟΓΛΟΥ ΘΡΑΣΥΒΟΥΛΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΡΙΣΠΕΡΙΔΟΝΗΣ ΕΛΕΖΟΓΛΟΥ ΘΡΑΣΥΒΟΥΛΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην Βιομηχανική Φαρμακευτική - Ανάλυση Φαρμάκων ΠΑΤΡΑ 2009

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΡΙΣΠΕΡΙΔΟΝΗΣ ΕΛΕΖΟΓΛΟΥ ΘΡΑΣΥΒΟΥΛΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην Βιομηχανική Φαρμακευτική - Ανάλυση Φαρμάκων ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Χ. ΚΟΝΤΟΓΙΑΝΝΗΣ Καθηγητής Κ. ΑΥΓΟΥΣΤΑΚΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Π. ΚΛΕΠΕΤΣΑΝΗΣ Επίκουρος Καθηγητής - Επιβλέπων

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα ερευνητική διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην Βιομηχανική Φαρμακευτική Ανάλυση Φαρμάκων κατά τα έτη στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή κ. Παύλου Κλεπετσάνη, ο οποίος μου παρείχε πολύτιμη υποστήριξη και βοήθεια αλλά και καθοδήγηση πάνω στην διαδικασία αυτή και όχι μόνο και τον ευχαριστώ βαθύτατα. Ευχαριστώ, θερμά, επίσης τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Κωνσταντίνο Αυγουστάκη για τις χρήσιμες συμβουλές και παρατηρήσεις του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συναδέλφους μου στο εργαστήριο φαρμακευτικής τεχνολογίας που θήτευσαν αυτά τα χρόνια για την φιλία και συμπαράστασή τους. Ευχαριστώ θερμά το Ερευνητικό Ινστιτούτο Χημικής Μηχανικής και Διεργασιών Υψηλής Θερμοκρασίας (Ε.Ι.ΧΗ.Μ.Υ.Θ.) για την χρήση του εξοπλισμού για τον χαρακτηρισμό των στερεών (Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, Διαφορικό Θερμιδόμετρο Σάρωσης και Περίθλαση Ακτίνων-Χ) καθώς και για μικροκατασκευές στο Μηχανουργείο και το Ηλεκτροτεχνείο. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου για την διαρκή στήριξη και την ενθάρρυνσή τους, στοιχεία χωρίς τα οποία δεν θα ήταν δυνατή η ολοκλήρωση του πονήματος που κρατάτε στα χέρια σας.

4 Αφιερώνεται στην οικογένειά μου

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5 ABSTRACT 9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13 A. ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ Ιστορική αναδρομή Παραγωγή των κυκλοδεξτρινών Δομή Φυσικές κυκλοδεξτρίνες Τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες Μεθυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες Υδροξυαλκυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες Ιοντικές κυκλοδεξτρίνες Σχηματισμός συμπλόκων κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ουσίες Σταθερά σχηματισμού των συμπλόκων έγκλεισης Διάγραμμα διαλυτότητας φάσεων Σύμπλοκα έγκλεισης με στοιχειομετρία 1: Μηχανισμοί συμπλοκοποίησης Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις - Αλληλεπιδράσεις Van der Waals Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις Δεσμοί υδρογόνου Απελευθέρωση μορίων ύδατος πλούσιων σε ενθαλπία Αλληλεπίδραση φόρτισης-μεταφοράς Προσδιορισμός θερμοδυναμικών παραμέτρων Σταθερά συμπλοκοποίησης και θερμοκρασία Παρασκευή στερεών συμπλόκων κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ουσίες Μέθοδος της συγκαταβύθισης Μέθοδος της λειοτρίβησης Μέθοδος της λυοφιλοποίησης Μέθοδος της ξήρανσης των συμπλόκων Μέθοδος ξηρού μίγματος Μέθοδοι ανάλυσης και χαρακτηρισμού των συμπλόκων έγκλεισης 44 1

6 6.1. Περίθλαση των ακτίνων Χ (XRD) Θερμικές Μέθοδοι Θερμοστατικές Μέθοδοι Διαφορική θερμική ανάλυση Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) Προσδιορισμός του σχηματισμού του συμπλόκου Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) Εφαρμογές των κυκλοδεξτρινών στη χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων Αύξηση της διαλυτότητας βιοδραστικών ενώσεων Σταθερότητα Επίδραση στη βιοδιαθεσιμότητα των βιοδραστικών ενώσεων Επίδραση στην ασφάλεια των βιοδραστικών ενώσεων Περιορισμός της πτητικότητας Κατεύθυνση των χημικών αντιδράσεων Κάλυψη της δυσάρεστης γεύσης βιοδραστικών μορίων Αντιμετώπιση προβλημάτων ασυμβατότητας Χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων από του στόματος Επίδραση επιφανειοδραστικών ενώσεων στην διαλυτότητα δυσδιάλυτων στο νερό βιοδραστικών ενώσεων 8.1 Γενικά Διαλυτοποίηση με μεταβολή του ph και ταυτόχρονη επίδραση επιφανειοδραστικής ένωσης-πρότυπο ισορροπίας 8.3 Ολική διαλυτότητα 68 Β. ΡΙΣΠΕΡΙΔΟΝΗ 70 Σκοπός της μελέτης 73 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 79 Α. Υλικά και όργανα 80 Α.1. Υλικά/Αντιδραστήρια 80 Α.2. Όργανα-Συσκευές 80 Β. Ποσοτικός προσδιορισμός της ρισπεριδόνης 82 Γ. Παρασκευή στερεών συμπλόκων ρισπεριδόνης με κυκλοδεξτρίνες 84 Γ.1. Μέθοδοι παρασκευής 84 2

7 Α) Παρασκευή φυσικών μιγμάτων (physical mixtures) 84 Β)Παρασκευή μιγμάτων με τη μέθοδο της πάστας (kneading or paste method) 84 Γ) Παρασκευή λυοφιλοποιημένων συμπλόκων (freeze-drying) 85 Δ) Παρασκευή στερεών με την μέθοδο της συγκαταβύθισης ή συνεξάτμισης (coprecipitation or co-evaporation) Γ.2. Ανάλυση στερεών μιγμάτων κυκλοδεξτρινών με ρισπεριδόνη 86 Α) Χαρακτηρισμός και ταυτοποίηση των στερεών μιγμάτων 86 Α1) Περίθλαση ακτίνων-χ (X-RD) 87 Α2) Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) 87 Α3) Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) 87 Α4) Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) 88 Β) Προσδιορισμός της σύστασης των στερεών συμπλόκων 88 Δ. Προσδιορισμός της διαλυτότητας της ρισπεριδόνης σε υδατικά διαλύματα κυκλοδεξτρινών Δ.1. Υπολογισμός της σταθεράς συμπλοκοποίησης 91 Δ.2. Υπολογισμός θερμοδυναμικών παραμέτρων 91 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ- ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αποτελέσματα ανάλυσης στερεών συμπλόκων Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC) Περίθλαση Ακτίνων Χ (XRD) Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) Επίδραση κυκλοδεξτρινών στην διαλυτότητα της ρισπεριδόνης Διαγράμματα διαλυτότητας Υπολογισμός σταθερών συμπλοκοποίησης Υπολογισμός θερμοδυναμικών σταθερών Επίδραση επιφανειοδραστικών ενώσεων στην διαλυτότητα της ρισπεριδόνης 115 ΣΥΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 117 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 118 3

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες αποτελούμενοι από μόρια α-d-γλυκοπυρανόζης συνδεδεμένα με α-1 4 γλυκοζιτικούς δεσμούς. Λόγω στερεοχημικών περιορισμών οι κυκλοδεξτρίνες δεν έχουν απόλυτα κυλινδρικό σχήμα αλλά μοιάζουν περισσότερο με κόλουρο κώνο. Αποτέλεσμα της χαρακτηριστικής των δομής είναι η δημιουργία μιας υδρόφιλης εξωτερικής επιφάνειας και μιας υδρόφοβης εσωτερικής κοιλότητας. Στην εσωτερική κοιλότητα μπορούν να εισέλθουν, μερικά ή ολικά, υδρόφοβα μόρια τα οποία αλληλεπιδρώντας μέσω ασθενών διαμοριακών αλληλεπιδράσεων σχηματίζουν σύμπλοκα έγκλεισης. Ο σχηματισμός συμπλόκων έγκλεισης βιοδραστικών ενώσεων με κυκλοδεξτρίνες αυξάνει την διαλυτότητα δυσδιάλυτων στο νερό βιοδραστικών ενώσεων, βελτιώνει την βιοδιαθεσιμότητά τους, αυξάνει την σταθερότητά τους και μειώνει σημαντικά τυχόν παρενέργειές των. Μια ακόμη τεχνική που χρησιμοποιείται για την αύξηση της διαλυτότητας δυσδιάλυτων στο νερό βιοδραστικών ενώσεων είναι η διαλυτοποίησή τους στο εσωτερικό μικυλλίων επιφανειοδραστικών ενώσεων. Η τεχνική αυτή προσφέρει ανάλογα πλεονεκτήματα όπως και η συμπλοκοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων με τις κυκλοδεξτρίνες και χρησιμοποιείται ήδη σε εμπορικά σκευάσματα. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της φύσης και της συγκέντρωσης κυκλοδεξτρινών (β-cd, Μe-β-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD) στην διαλυτότητα της βιοδραστικής ένωσης ρισπεριδόνη (risperidone). Επίσης, προσδιορίσθηκε η μέθοδος παρασκευής ενώσεων έγκλεισης της ρισπεριδόνης με τις παραπάνω κυκλοδεξτρίνες χρησιμοποιώντας κατάλληλες τεχνικές χαρακτηρισμού των σχηματιζόμενων στερεών. Ακόμη, μελετήθηκε η διαλυτοποίηση της ρισπεριδόνης σε μικύλλια τριών επιφανειοδραστικών ενώσεων (SDS, Brij35, Cremophor EL). Η ρισπεριδόνη είναι μια αντιψυχωσική βιοδραστική ένωση που ανήκει σε μια νέα κατηγορία ενώσεων τα παράγωγα της benzisoxazole. Η φαρμακολογική δράση της εστιάζεται στους υποδοχείς της D2 (dopamine) και 5-ΗΤ2 (serotonin) στον εγκέφαλο. Πρόκειται για μια δυσδιάλυτη στο νερό βιοδραστική ένωση με αποτέλεσμα να δημιουργούνται προβλήματα στις φαρμακοτεχνικές μορφές της. Είναι ασθενής βάση με δύο στάδια πρωτονίωσης με συνέπεια η διαλυτότητά της να μειώνεται με την αύξηση του ph. Παρασκευάσθηκαν στερεά μίγματα της ρισπεριδόνης με τις κυκλοδεξτρίνες (β-cd, Μe-β-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD) χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνικές 5

9 (απλή ανάμιξη, λειοτρίβηση με τον σχηματισμό πάστας, συγκαταβύθιση και λυοφιλοποίηση) προκειμένου να προσδιορισθεί η τεχνική ή οι τεχνικές που οδηγούν στο σχηματισμό συμπλόκου έγκλεισης. Για την μελέτη των στερεών μιγμάτων και την πιστοποίηση του σχηματισμού συμπλόκων έγκλεισης μεταξύ της ρισπεριδόνης και των υπό μελέτη κυκλοδεξτρινών χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές α) Περίθλαση Ακτίνων-Χ, β) Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης και γ) Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης. Επίσης μελετήθηκε η στερεοχημεία των σχηματιζόμενων συμπλόκων της ρισπεριδόνης με τις υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες με την τεχνική του Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR). Για την παρασκευή των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε ο δευτεριωμένος διαλύτης d 6 -DMSO. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες διαλυτότητας της ρισπεριδόνης σε υδατικά διαλύματα παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων των β-cd, Μe-β-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD σε θερμοκρασίες 25, 30 και 35 C σε διαλύματα PBS με ph=10. Η μελέτη της επίδρασης των επιφανειοδραστικών ενώσεων έγινε στους 25 C και σε ph=10. Οι τεχνικές της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης και περίθλασης ακτίνων- Χ είναι οι καταλληλότερες για την μελέτη και τον χαρακτηρισμό των στερεών συμπλόκων της ρισπεριδόνης με τις κυκλοδεξτρίνες. Συγκεκριμένα, η απουσία της ισχυρής ενδόθερμης κορυφής που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της ρισπεριδόνης στα θερμογραφήματα των στερεών μιγμάτων που παρασκευάσθηκαν με την μέθοδο της συγκαταβύθισης αποτελεί σαφή ένδειξη για τον σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης της ρισπεριδόνης με τις κυκλοδεξτρίνες. Ανάλογα, στα φάσματα περίθλασης ακτίνων-x η απουσία των χαρακτηριστικών κορυφών της ρισπεριδόνης στα μίγματα που παρασκευάσθηκαν με την μέθοδο της συγκαταβύθισης αποτελεί μια επιπλέον ένδειξη για τον σχηματισμό συμπλόκων ενώσεων μεταξύ της ρισπεριδόνης και των υπό μελέτη κυκλοδεξτρινών. Αντίθετα, η τεχνική της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης δεν αποτελεί από μόνη της ασφαλή τεχνική για την ταυτοποίηση των συμπλόκων έγκλεισης μεταξύ τη ρισπεριδόνης και των κυκλοδεξτρινών. Από την μελέτη των φασμάτων NMR των διαλυμάτων που περιείχαν σε διάφορες αναλογίες ρισπεριδόνη και τις υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες προσδιορίσθηκε η στερεοχημεία των σχηματιζόμενων συμπλόκων. Από την μελέτη των ισοθέρμων διαλυτότητας διαπιστώθηκε ότι: α) η διαλυτότητα της ρισπεριδόνης αυξάνει με την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης σε όλες τις θερμοκρασίες για όλες τις κυκλοδεξτρίνες που μελετήθηκαν και β) οι 6

10 ισόθερμοι διαλυτότητας είναι της μορφής A L στην οποία όλα τα σχηματιζόμενα σύμπλοκα είναι ευδιάλυτα και έχουν στοιχειομετρία 1:1. Στους 25 C, την μεγαλύτερη συμπλεκτική ικανότητα παρουσίασε η β- CD. Οι Me-β-CD και HP-β-CD παρουσίασαν μικρότερη συμπλεκτική ικανότητα ενώ η συμπλεκτική ικανότητα για την HP-γ-CD ήταν σημαντικά μειωμένη. Με βάση την συμπλεκτική ικανότητά τους, οι υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες μπορούν να ταξινομηθούν με την ακόλουθη σειρά: β-cd > Me-β-CD > HP-β-CD >> HP-γ-CD Η αύξηση της θερμοκρασίας δεν επηρέασε την μορφή των ισοθέρμων διαλυτότητας, επηρέασε την διαφορά της συμπλεκτικής ικανότητας των β-cd και Me-β-CD. Στους 30 C, η συμπλεκτική ικανότητα της Me-β-CD ήταν ελάχιστα μικρότερη από αυτή της β-cd ενώ στους 35 C έγινε λίγο μεγαλύτερη σε σύγκριση με την β-cd. Για τις άλλες δύο κυκλοδεξτρίνες HP-β-CD και HP-γ-CD διατηρήθηκε η ίδια κατάσταση και στις δύο θερμοκρασίες. Από την κλίση των ισοθέρμων διαλυτότητας προσδιορίσθηκαν οι σταθερές σχηματισμού των συμπλόκων έγκλεισης της ρισπεριδόνης με τις υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες. Η διαφοροποίηση της συμπλεκτικής ικανότητας των β-cd, Me-β-CD, HP-β-CD και HP-γ-CD μπορεί να αποδοθεί α) στο διαφορετικό μέγεθος της υδρόφοβης κοιλότητας και β) στην διαφορετική υδροφοβικότητα των υποκατεστημένων κυκλοδεξτρινών. Από την μεταβολή των σταθερών σχηματισμού των συμπλόκων με την αύξηση της θερμοκρασίας υπολογίσθηκε η μεταβολή της ενθαλπίας (ΔΗ) και η μεταβολή της εντροπίας (ΔS) για τον σχηματισμό των συμπλόκων. Σε όλες τις κυκλοδεξτρίνες υπολογίσθηκε αρνητική μεταβολή της ενθαλπίας και θετική αλλά μικρή μεταβολή της εντροπίας. Οι μεταβολές αυτές συνδέονται άμεσα με την απελευθέρωση των μορίων νερού υψηλής ενθαλπίας που βρίσκονται στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης και με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην ρισπεριδόνη και στην κυκλοδεξτρίνη. Οι δύο αυτές αλληλεπιδράσεις ευνοούν τον σχηματισμό και την σταθερότητα των σχηματιζόμενων συμπλόκων. Τέλος, από τα πειράματα διαλυτότητας της ρισπεριδόνης παρουσία των επιφανειοδραστικών (SDS, Brij35 και Cremophor EL) διαπιστώθηκε ότι α) την μεγαλύτερη αύξηση διαλυτότητας προκάλεσε το SDS και β) η διαλυτοποιητική ικανότητα του Brij35 ήταν λίγο μικρότερη από αυτή του Cremophor EL. 7

11 ABSTRACT Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides composed of a-d-glucopyranose units connected with a-1 4 glucosidic bonds. Because of stereochemical restrictions, cyclodextrins do not have absolutely a cylindrical shape but they resemble a truncated cone. As a result of their characteristic structure is the formation of a hydrophilic external surface and a hydrophobic internal cavity. In the internal cavity can enter partly or wholly hydrophobic molecules which by interacting through weak intermolecular interactions form inclusion complexes. The inclusion complex formation of bioactive compounds, improves their bioavailability, enhances their stability and reduces considerably the side effects after administration. Another technique which is used for increasing the solubility of water sparingly soluble bioactive compounds is their solubilization in the micelles of surfactants. This technique offers analogous advantages such as the complexation of bioactive compounds with cyclodextrins and is used already in commercial drugs. In this study, the influence of the nature and concentration of cyclodextrins (β- CD, Μe-β-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD) was studied on the solubility of the bioactive compound risperidone. It was also determined the inclusion compounds preparation method of risperidone with the above cyclodextrins by using appropriate characterization techniques of the formed solids. In addition, the solubilization of risperidone in micelles of three surfactant compounds (SDS, Brij35, Cremophor EL) was studied. Risperidone is an antipsychotic bioactive compound which belongs to a new chemical class, the benzisoxazole derivatives. Its pharmacological action focuses on the D2 (dopamine) and 5-HT2 (serotonin) receptors in the brain. It is about a water sparingly soluble bioactive compound resulting in problems on its pharmaceutical formulations. It is a weak base, with two protonization stages, and as such its solubility decreases with ph increase. Risperidone solid mixtures with the cyclodextrins (β-cd, Μe-β-CD, HP-β- CD, HP-γ-CD) were prepared by using different techniques (physical mixture, kneading, coprecipitation, lyophilisation) in order to determine the technique or the techniques that lead to the formation of inclusion complex. For the study of solid mixtures and the assessment of inclusion complex formation between the risperidone and the cyclodextrins under investigation the following techniques were used: a) X- Ray Diffraction (XRD) b) Differential Scanning Calorimetry (DSC) and c) Scanning 9

12 Electron Microscopy (SEM). Furthermore, the stereochemistry of the formed inclusion complexes of risperidone with the specific cyclodextrins was also assessed with the technique of Nuclear Magnetic Resonance (NMR). As a solvent for the preparation of the solutions it was used the deuterated solvent d 6 -DMSO. Solubility studies in aqueous solutions of risperidone with the cyclodextrins were performed in 25, 30 and 35 C in PBS (phosphate buffered saline) at ph=10. The study of the influence of the surfactant compounds (SDS, Brij35, Cremophor EL) was realised at 25 C and ph=10. The techniques of DSC and XRD are the most appropriate for the investigation and characterization of solid complexes of risperidone with cyclodextrins. Particularly, the absence of the strong endothermic peak which corresponds to the melting point of risperidone in the DSC thermograms of the solid mixtures which were prepared by the coprecipitation method constitutes a clear indication of the inclusion complex formation of risperidone with the cyclodextrins. Accordingly, in the XRD spectra the absence of the characteristic peaks of risperidone in the mixtures prepared by the coprecipitation method comprises an additional indication for the formation of inclusion complexes between risperidone and the cyclodextrins under investigation. On the contrary, the SEM does not constitute per se a safe method for the identification of the inclusion complexes between risperidone and the cyclodextrins. The stereochemistry of the formed inclusion compounds was assessed through the spectra received by the application of NMR on solutions which contained risperidone and the specific cyclodextrins in different proportions. In particular, it was determined which part of risperidone molecule enters the hydrophobic cavity of cyclodetxrin. The study of solubility isotherms showed that: a) solubility of risperidone increases with the concentration of cyclodextrins at all temperatures studied, for all the cyclodextrins studied and b) solubility isotherms have a graphical representation of the A L type, which shows that all formed complexes are water soluble with 1:1 stoichiometry. At 25 C, β-cd presented the greatest complexive ability, Me-β-CD and HP-γ- CD presented a smaller complexive ability whereas that of HP-γ-CD was significantly 10

13 decreased. Based on the complexive ability, the cyclodextrins under discussion can be classified in the following order: β-cd>me-β-cd>hp-β-cd>> HP-γ-CD The temperature increase did not affect the solubility isotherms but affected the difference of complexation ability of β-cd and Me-β-CD. At 30 C, the complexation ability of Me-β-CD was slightly smaller than β-cd s, whereas at 35 C became slightly greater compared to that of β-cd. For the other two cyclodextrins; namely HP-β-CD and HP-γ-CD the same behavior was maintained at both temperatures. From the gradient of the solubility isotherms the inclusion complex formation constants were determined. The differentiation of the complexation ability of cyclodextrins can be attributed a) to the different size of the hydrophobic cavity and b) to the different hydrophobicity of the substituted cyclodextrins. The enthalpy change (ΔH) and the entropy change (ΔS) during complex formation were calculated from the change of the complexation constants with the increase of the temperature. In all of the cyclodextrins it was found negative enthalpy change and positive but small entropy change. These alterations are directly connected to the release of high enthalpy water molecules which are located in the cyclodextrin s hydrophobic cavity and to hydrophobic interactions among risperidone and cyclodextrin. These two interactions favor the complex formation and stability. Finally, from the solubility experiments of risperidone in the presence of surfactant compounds SDS, Brij35 and Cremophor EL, it was established that a) the greatest solubility increase was caused by the SDS and b) the solubilization ability of Brij35 was a little smaller than Cremophor s one. 11

14 13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

15 Α.Κυκλοδεξτρίνες 1. Ιστορική αναδρομή Η πρώτη επιστημονική εργασία στην οποία αναφέρεται η προσεκτική παρατήρηση μερικών άγνωστων κρυσταλλικών ουσιών στη ζύμωση του αμύλου δημοσιεύθηκε το Δεκαπέντε χρόνια αργότερα ο Αυστριακός μικροβιολόγος Franz Schardinger, μελετώντας τους μικροοργανισμούς που προκαλούν την αλλοίωση των τροφίμων, απομόνωσε ένα μικροοργανισμό (Bacillus macerans) ο οποίος παρήγαγε δύο διακριτές κρυσταλλικές ουσίες σε καλλιέργειες που περιείχαν άμυλο. Επειδή οι ιδιότητές τους ήταν παρόμοιες με εκείνες των ήδη γνωστών προϊόντων αποικοδόμησης του αμύλου, των δεξτρινών, ονόμασε τις ουσίες αυτές α- και β- δεξτρίνη. Οι Villers (1891) και Schardinger (1911) ανακάλυψαν την α- και β- δεξτρίνη αντίστοιχα, ενώ η χημική δομή των παρέμενε άγνωστη μέχρι το 1936 όταν προσδιορίσθηκε από τον Freudenberg και τους συνεργάτες του. Στις αρχές της δεύτερης περιόδου ο Freudenberg και οι συνεργάτες του, βασιζόμενοι στα δικά τους πειράματα αλλά και στις παρατηρήσεις των Karrer και Miekeley κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι δεξτρίνες του Schardinger αποτελούνται από μονάδες μαλτόζης και περιέχουν μόνο α-(1-4)-γλυκοζιτικούς δεσμούς και υπέθεσαν την κυκλική δομή των κρυσταλλικών δεξτρινών. Την διετία ανακαλύφθηκε η γ-κυκλοδεξτρίνη και προσδιορίσθηκε η δομή της. Στις αρχές της δεκαετίας του 50, οι ομάδες των Freunch και Cramer εργάσθηκαν εντατικά στην ενζυμική παραγωγή κυκλοδεξτρινών, στην απομόνωση των καθαρών συστατικών και στον προσδιορισμό των χημικών και φυσικών ιδιοτήτων τους. Η ομάδα του French ανακάλυψε ότι υπάρχουν κυκλοδεξτρίνες μεγαλύτερου μεγέθους, ενώ η ομάδα του Cramer ασχολήθηκε με την ικανότητα των κυκλοδεξτρινών να σχηματίζουν σύμπλοκα. Το πρώτο ουσιαστικό άρθρο για τις κυκλοδεξτρίνες δημοσιεύτηκε το 1953 απο τον Freunch και ακολούθησαν οι μονογραφίες των Thoma και Stewart το 1965 και του Caesar το Όμως μια λανθασμένη δημοσίευση του Freunch σχετικά με την τοξικότητα των κυκλοδεξτρινών στον άνθρωπο αποθάρρυνε πολλούς επιστήμονες από την παρασκευή προϊόντων με κυκλοδεξτρίνη για ανθρώπινη χρήση. Μέχρι το τέλος της δεκαετίας του 60 είχε διευκρινιστεί τόσο η παρασκευή των 14

16 κυκλοδεξτρινών στο εργαστήριο, όσο και οι φυσικές και χημικές ιδιότητες αυτών αλλά και οι ιδιότητες σχηματισμού συμπλόκων. Μετά από μια σειρά τοξικολογικών μελετών που απέδειξαν την ασφάλεια των κυκλοδεξτρινών για θεραπευτική χρήση στον άνθρωπο, οι δημοσιεύσεις παρουσίασαν σημαντική αύξηση, με τον αριθμό τους να φτάνει στις το Σύμφωνα με τα δεδομένα της CycloLab, ο συνολικός αριθμός των δημοσιεύσεων σήμερα φτάνει τις και ο μέσος αριθμός τους ανά ημέρα αυξήθηκε από 2,2 το 1990 σε 4,4 το [Szejtli (2004, Loftsson (2007)] Σχήμα 1: Ο αριθμός των δημοσιεύσεων που σχετίζονται με τις κυκλοδεξτρίνες από το 1980 έως σήμερα. Το πρώτο παγκόσμιο συνέδριο κυκλοδεξτρινών έγινε το 1981 και από τότε μέχρι σήμερα επαναλαμβάνεται κάθε δύο χρόνια. Το τελευταίο συνέδριο, 14ο στην σειρά, έγινε στο Kyoto (Japan) το Επίσης, το κόστος παραγωγής των κυκλοδεξτρινών έχει μειωθεί σημαντικά. Ενδεικτικά, αναφέρεται ότι το Kg β- CD κόστιζε 2000 $, ενώ σήμερα κοστίζει μόλις μερικά $. 2. Παραγωγή των κυκλοδεξτρινών Η παραγωγή των κυκλοδεξτρινών είναι μία σχετικά απλή διεργασία η οποία περιλαμβάνει την κατεργασία του αμύλου με μία σειρά ενζύμων. Το βασικότερα των ενζύμων αυτών είναι η γλυκοσυλο-τρανσφεράση των κυκλοδεξτρινών (CGTase) η οποία παράγεται από μικροοργανισμούς, όπως είναι ο Bacillus macerans, η Klebsiella 15

17 oxytaca και o Bacillus circulans. Σήμερα, με τη βοήθεια της γενετικής μηχανικής έχει αναπτυχθεί μία σειρά ενζύμων τα οποία χρησιμοποιούνται για την βιομηχανική παραγωγή κυκλοδεξτρινών. Το πρώτο βήμα στη παραγωγή των κυκλοδεξτρινών είναι η ρευστοποίηση του αμύλου είτε με θέρμανση είτε με προσθήκη της α-αμυλάσης. Στη συνέχεια, προστίθεται η CGTάση. Η CGTάση μπορεί να συνθέσει όλους τους τύπους των φυσικών κυκλοδεξτρινών, επομένως το προϊόν της ενζυμικής μετατροπής είναι ένα μείγμα α-, β- και γ-κυκλοδεξτρίνης σε αναλογία που εξαρτάται από το ένζυμο που χρησιμοποιείται κάθε CGΤάση έχει τη δική της χαρακτηριστική αναλογία. Ο διαχωρισμός των τριών βασικών φυσικών κυκλοδεξτρινών στηρίζεται στη διαφορετική υδατοδιαλυτότητα των μορίων: η β-κυκλοδεξτρίνη έχει πολύ μικρή υδατοδιαλυτότητα (18,5 g/l) και μπορεί να ανακτηθεί εύκολα με κρυστάλλωση, ενώ οι περισσότερο διαλυτές α-cd και γ-cd (145 και 232 g/l αντίστοιχα) διαχωρίζονται με τη βοήθεια χρωματογραφικών τεχνικών. Επίσης, κατά τη διάρκεια της ενζυμικής μετατροπής μπορεί να προστεθεί ένας «παράγοντας συμπλοκοποίησης» ώστε να σχηματιστεί σύμπλοκο με την επιθυμητή κυκλοδεξτρίνη, το οποίο στη συνέχεια καθιζάνει. Ο σχηματισμός του συμπλόκου κατευθύνει την μετατροπή του αμύλου προς τη κατεύθυνση της σύνθεσης της επιθυμητής κυκλοδεξτρίνης, αυξάνοντας έτσι την περιεκτικότητα της κυκλοδεξτρίνης αυτής στο τελικό μείγμα. Στο τελικό στάδιο η κυκλοδεκτρίνη ανακτάται με φυγοκέντρηση και διαχωρίζεται από τον «παράγοντα συμπλοκοποίησης». Οι κυριότεροι παράγοντες που χρησιμοποιούνται είναι το τολουένιο, η ακετόνη και η δεκανόλη. Η προσθήκη τολουενίου ευνοεί την μετατροπή προς την β-cd, η προσθήκη 1-δεκανόλης προς την α-cd και η κυκλοεξαδεκανόλη προς την γ-cd. H τελική καθαρότητα των προϊόντων είναι της τάξης του 99% [Biwer et al (2002), Szerman (2006), Sjejtli (1998)]. 3. Δομή Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολικοσακχαρίτες αποτελούμενοι από μόρια α-d-γλυκοπυρανόζης που συνδέονται με α-(1-4) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Το σχήμα τους δεν είναι κυλινδρικό αλλά μοιάζει περισσότερο με το σχήμα κόλουρου κώνου γεγονός που οφείλεται στην απουσία ελεύθερης περιστροφής των δεσμών που 16

18 συνδέουν τις μονάδες γλυκοπυρανόζης. Κάθε μονάδα γλυκοπυρανόζης έχει 3 υδροξυλομάδες. Δύο από αυτές είναι δευτερεύουσες και εντοπίζονται στον άνθρακα 2 και 3 και μία είναι πρωτεύουσα στη θέση C-6. Οι υδροξυλομάδες αυτές καθιστούν υδρόφιλη την εξωτερική επιφάνεια των κυκλοδεξτρινών και είναι υπεύθυνες για την διαλυτότητά τους στο νερό. Οι πρωτεύουσες υδροξυλομάδες εντοπίζονται στο στενό άκρο του κώνου, ενώ οι δευτερεύουσες στο ευρύτερο άκρο. Το εσωτερικό των κυκλοδεξτρινών είναι υδρόφοβο, λόγω της παρουσίας των αιθερικών οξυγόνων στο Ο-4 και των υδρογόνων που είναι προσαρτημένα στους άνθρακες C-3 και C-5, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μια κοιλότητα για τον εγκλωβισμό υδρόφοβων μορίων [Loftsson (2005), Szejtli (1998), Saenger et al (1998)]. Σχήμα 2: Η διαμόρφωση των μονάδων γλυκοπυρανόζης έχει σαν αποτέλεσμα η εξωτερική επιφάνεια των κυκλοδεξτρινών να είναι υδρόφιλη και η εσωτερική υδρόφοβη. Σχήμα 3: Η χημική δομή και η χαρακτηριστική δομή του κόλουρου κώνου της α- κυκλοδεξτρίνης. 17

19 3.1 Φυσικές κυκλοδεξτρίνες (Natural cyclodextrins) Οι πιο γνωστές φυσικές κυκλοδεξτρίνες είναι οι α-, β-, γ- κυκλοδεξτρίνη. Η α- κυκλοδεξτρίνη αποτελείται από 6 μόρια γλυκοπυρανόζης, η β-κυλοδεξτρίνη από 7 και η γ-κυκλοδεξτρίνη από 8. Έχουν επίσης παρασκευασθεί κυκλοδεξτρίνες με 9, 10, 11, 12 και 13 μονάδες γλυκοπυρανόζης που ονομάζονται δ, ε, ζ, η, θ κυκλοδεξτρίνες, αντίστοιχα. Κυκλοδεξτρίνες με λιγότερες από 6 μονάδες γλυκοπυρανόζης δεν μπορεί να υπάρξουν λόγω των παραπάνω στερεοχημικών περιορισμών [Szejtli (1996)]. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται τα βασικότερα χαρακτηριστικά των φυσικών κυκλοδεξτρινών (α-, β- και γ-). Πίνακας 1: Τα βασικά χαρακτηριστικά της α-, β- και γ- κυκλοδεξτρίνης α-cd β-cd γ-cd Αριθμός μονάδων γλυκοπυρανόζης Μοριακό βάρος Διαλυτότητα στο νερό (g/100 ml) 14,5 1,85 23,2 Διάμετρος κεντρικής κοιλότητα (Å) 4,7-5,3 6,0 6,5 7,5 8,3 Ύψος του κώνου (Å) 7,9 ± 0,1 7,9 ± 0,1 7,9 ± 0,1 Διάμετρος εξωτερικής περιφέρειας (Å) 14,6 ± 0,4 15,4 ± 0,4 17,5 ± 0,4 3.2 Τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες (Modified cyclodextrins) Ο αριθμός των τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών που έχουν παραχθεί και μελετηθεί είναι μεγάλος. Οι τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες παράγονται με την αντίδραση χημικών μορίων με τις υδροξυλομάδες των κυκλοδεξτρινών. Οι υδροξυλομάδες στον C-6 έχουν την μεγαλύτερη ικανότητα αντίδρασης, ενώ οι υδροξυλομάδες στον C-3 έχουν την μικρότερη. Παρόλα αυτά, μεταβάλλοντας τις συνθήκες της αντίδρασης, όπως το ph, την θερμοκρασία και τα αντιδραστήρια, μπορούμε να κατευθύνουμε την αντίδραση προς μία συγκεκριμένη πορεία και να πετύχουμε την εκλεκτική υποκατάσταση μίας συγκεκριμένης ομάδας. Κάθε μονάδα γλυκοπυρανόζης έχει 3 ελεύθερες υδροξυλομάδες, επομένως η α-κυκλοδεξτρίνη έχει 18 ελεύθερες υδροξυλομάδες που μπορούν να υποκατασταθούν, η β-κυκλοδεξτρίνη έχει 21 και η γ-κυκλοδεξτρίνη έχει 24. Έτσι, με την υποκατάσταση του ατόμου 18

20 υδρογόνου ή της υδροξυλομάδας από διάφορες ομάδες όπως άλκυλο-, υδροξυάλκυλο, καρβοξυλοάλκυλο-, άμινο-, θείο- γλυκόσυλο-, αλλά και άλλες ομάδες, μπορούν να παραχθούν μια σειρά από παράγωγα με χημικές αντιδράσεις [Jicsinszky et al (1996), Loftsson & Brewster (1996)]. Επειδή κατά την παραγωγή των τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών παράγονται διάφορα παράγωγα και ισομερή, η ονοματολογία πρέπει να είναι σαφής και να περιλαμβάνει τουλάχιστον την πρόδρομη κυκλοδεξτρίνη και τον τύπο και τον αριθμό των υποκαταστατών. Οι υποκαταστάτες συνήθως δηλώνονται με μία συντόμευση, πριν την αρχική κυκλοδεξτρίνη. Στη συντόμευση αυτή όμως μπορεί να φανεί και η ακριβής θέση του υποκαταστάτη, αν αυτό χρειαστεί. Για παράδειγμα, η υδροξυλομάδα του υδροξυπρόπυλο- υποκαταστάτη μπορεί να βρίσκεται σε ένα από τους τρεις άνθρακες της προπυλικής αλυσίδας. Ως εκ τούτου, αν έχει ενωθεί με τον C-2, το παράγωγο θα συμβολίζεται ως 2HP-β-CD. Όταν θέλουμε να συμβολίσουμε τον αριθμό των υποκαταστατών που συνδέονται με την πρόδρομη κυκλοδεξτρίνη, ο αριθμός ακολουθεί τον υποκαταστάτη. Έτσι η HP4-β-CD υποδηλώνει μία β- κυκλοδεξτρίνη με 4 υδροξυπρόπυλο- ομάδες. Ο αριθμός αυτός ονομάζεται μοριακός βαθμός υποκατάστασης (molar degree of substitution, MS) και εκφράζει το μέσο αριθμό αλκυλομάδων στο δακτύλιο της κυκλοδεξτρίνης. Βέβαια στο παράδειγμα της ΗP4-β-CD τέσσερις υδροξυπρόπυλο- υποκαταστάτες μπορεί να έχουν συνδεθεί σε τέσσερις διαφορετικές υδροξυλομάδες γύρω από το δακτύλιο της β-κυκλοδεξτρίνης ή μία μόνο υδροξυλομάδα μπορεί να έχει υποκατασταθεί από μία αλυσίδα με τέσσερις υδροξυπρόπυλο- ομάδες. Ένας άλλος όρος που χρησιμοποιείται είναι ο βαθμός υποκατάστασης (degree of substitution, DS) που εκφράζει το μέσο αριθμό των υποκατεστημένων υδροξυλομάδων των μονάδων γλυκοπυρανόζης και μπορεί να πάρει τιμές από 0 έως 3. Οι βασικές τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες που χρησιμοποιούνται ως έκδοχα στις φαρμακομορφές είναι όλες παράγωγα της β-κυκλοδεξτρίνης: 1. Τυχαία μεθυλιωμένα παράγωγα με μέσο MS = 14 (Μ14-β-CD). 2. Δύο διαφορετικά υδροξυπρόπυλο- παράγωγα, το ένα με μέσο μοριακό βαθμό υποκατάστασης ίσο με 3 ((2ΗP)3-β-CD) και το άλλο με μέσο μοριακό βαθμό υποκατάστασης ίσο με 7 ((2ΗP)7-β-CD). 3. Σουλφο-βούτυλο αιθερικά παράγωγα με μέσο MS = 7 (SBE7-β-CD). 4. Γλυκόσυλο- και μαλτόσυλο- κυκλοδεξτρίνες, οι οποίες περιέχουν μόνο μόρια γλυκόζης (G 1 -β-cd) ή μαλτοσακχαρίτες όπως η μαλτόζη (G 2 -β-cd) συνδεδεμένα 19

21 απευθείας με α-(1-6) γλυκοζιτικό δεσμό στο μόριο της κυκλοδεξτρίνης [Mosher και Thompson]. Η παραγωγή τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών έχει σαν στόχο: 1. Να αυξήσει την υδατοδιαλυτότητα των κυκλοδεξτρινών και των συμπλόκων τους: Οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες έχουν μικρή διαλυτότητα στο νερό. Η β- κυκλοδεξτρίνη έχει τη μικρότερη υδατοδιαλυτότητα λόγω της περισσότερο άκαμπτης δομής της που οφείλεται στους δεσμούς υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ της υδροξυλομάδας του C-2 μιας μονάδας γλυκοπυρανόζης και της υδροξυλομάδας του C-3 της γειτονικής ομάδας, σχηματίζοντας έτσι επτά ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου που εμποδίζουν την αλληλεπίδραση της κυκλοδεξτρίνης με τα μόρια του νερού σχηματισμός διαμοριακών δεσμών υδρογόνου. Αυτή η «ζώνη δεσμών υδρογόνου» δεν είναι πλήρης στις υπόλοιπες φυσικές κυκλοδεξτρίνες και γι αυτό ευνοείται η αλληλεπίδραση αυτών με τα μόρια του νερού. 2. Να βελτιώσει τη σύνδεση-αλληλεπίδραση των εγκλωβιζόμενων μορίων με τις κυκλοδεξτρίνες. Η προσθήκη των ομάδων αυξάνει την χωρητικότητα της υδρόφοβης κοιλότητας με αποτέλεσμα μεγαλύτερο μέρος του μορίου να εισέρχεται σε αυτή και να αλληλεπιδρά αυξάνοντας με τον τρόπο αυτό την συνολική ενέργεια αλληλεπίδρασης. 3. Να εκλύσει συγκεκριμένες καταλυτικές ομάδες στη θέση σύνδεσης. 4. Να σχηματίσει αδιάλυτες δομές που περιέχουν κυκλοδεξτρίνες, όπως τα πολυμερή, με στόχο την εφαρμογή τους στη χρωματογραφία [Szetli (2004)]. Σχήμα 4: Οι δεσμοί υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ της υδροξυλομάδας του C-2 μιας μονάδας γλυκοπυρανόζης και της υδροξυλομάδας του C-3 της γειτονικής ομάδας γλυκοπυρανόζης, στο μόριο της β-κυκλοδεξτρίνης. 20

22 Οι μέθοδοι για την εκλεκτική υποκατάσταση των κυκλοδεξτρινών χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: 1. Οι σύντομες μέθοδοι στις οποίες αξιοποιείται η χημεία των κυκλοδεξτρινών ώστε να παραχθεί το επιθυμητό παράγωγο με τον πιο σύντομο τρόπο. 2. Οι μακροσκελείς μέθοδοι στις οποίες λαμβάνουν χώρα μία σειρά από βήματα προστασίας και αποπροστασίας των κυκλοδεξτρινών ώστε να φτάσουμε στο προσδιορισμό των κατάλληλων συνθηκών της αντίδρασης. 3. Η μέθοδος της βαριάς κατά την οποία οι κυκλοδεξτρίνες αντιδρούν χωρίς καμία εκλεκτικότητα και δίνουν ένα μίγμα προϊόντων από το οποίο το επιθυμητό παράγωγο απομονώνεται από τα υπόλοιπα ισομερή με χρωματογραφικές μεθόδους [Khan et al (1998)]. 3.3 Μεθυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες Η προσθήκη του μέθυλο-υποκαταστάτη στις υδροξυλομάδες των κυκλοδεξτρινών αυξάνει σημαντικά την υδατοδιαλυτότητα της τροποποιημένης κυκλοδεξτρίνης σε σχέση με αυτή της αρχικής. Η υδατοδιαλυτότητα αυξάνεται όσο αυξάνεται ο αριθμός των υποκαταστατών έως ότου τα 2/3 των υδροξυλομάδων να υποκατασταθούν και μειώνεται όσο οι υποκαταστάτες αυξάνονται περαιτέρω. Έτσι, οι κυκλοδεξτρίνες που περιέχουν 14 μεθόξυ-ομάδες έχουν την μεγαλύτερη διαλυτότητα, ενώ οι κυκλοδεξτρίνες με 21 μεθόξυ-ομάδες παρουσιάζουν τη μικρότερη διαλυτότητα, η οποία όμως είναι σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή της μη μεθυλιωμένης κυκλοδεξτρίνης [ Szetli (1992), Szente and Szetli (1999)]. Οι πιο γνωστές εμπορικά μεθυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες είναι οι : DM14-β- CD [επτάκις (2,6-δι-ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεκτρίνη] (DIMEB) και η 2,3,6-ΤΜ21-β-CD [επτάκις (2,3,6-τρι-ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεξτρίνη] (TRIMEB), των οποίων η διαλυτότητα στο νερό είναι 57g/100ml και 31g/100ml αντίστοιχα, σε σχέση με 1,8g/100ml που είναι η υδατοδιαλυτότα της β-κυκλοδεξτρίνης. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και μίγμα τυχαία μεθυλιωμένων β-κυκλοδεξτρινών. Βρέθηκε ότι η Μ14-β-CD αύξησε τη διαλυτότητα 26 βιοδραστικών ενώσεων σε σχέση με την β-cd και ο βαθμός της αύξησης ήταν 80% σε σχέση με τη καθαρή 2,6-DM-β-CD. 21

23 Σχήμα 5: Η χημική δομή της επτάκις (2,6-δι-ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεκτρίνη (DIMEB) Η μεθυλίωση όμως αυξάνει και την ικανότητα συμπλοκοποίησης των κυκλοδεξτρινών καθώς η υποκατάσταση των υδροξυλομάδων στις θέσεις 2 και 6 αυξάνει την υδροφοβικότητα της εσωτερικής κοιλότητας. Η σταθερά συμπλοκοποίησης της 2,6-DM14-β-CD με πολλές βιοδραστικές ενώσεις είναι κατά μέσο όρο 5 φορές μεγαλύτερη από αυτή της β-cd. Παρόλα αυτά, η μεθυλίωση των υδροξυλομάδων στη θέση 3 μειώνει σημαντικά την ικανότητα συμπλοκοποίησης της κυκλοδεξτρίνης [Szetli (1992)]. Πίνακας 2: Παραδείγματα της αύξησης της διαλυτότητας βιοδραστικών ενώσεων σε υδατικά διαλύματα 10g/100ml μετά από συμπλοκοποίηση με τη DIMEB ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΗ ΕΝΩΣΗ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΝΕΡΟ mg/ml (S 1 ) ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ DIMEB mg/ml (S 2 ) S 2 / S 1 π-αμινο βενζοϊκό οξύ 4, π-υδροξυ βενζοϊκό οξύ 5, ναφθόλη 0, ναφθόλη 0,62 12,5 20 τολουένιο 0,44 9,6 22 υδροκορτιζόνη 0, διγοξίνη 0,27 22,2 81 μεθυλοτετοστερόνη 0,071 13,7 193 προγεστερόνη 0,

24 3.4 Υδροξυαλκυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες Οι υδροξυαλκυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες παράγονται μετά από κατεργασία των κυκλοδεξτρινών με οξείδια των αλκυλενίων και υποκατάσταση των ελεύθερων υδροξυλομάδων στις θέσεις C-2, C-3 και C-6 κάθε μονάδας γλυκοπυρανόζης. Το DS στις υδροξυαλκυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες επηρεάζει τόσο την ικανότητά τους να σχηματίζουν σύμπλοκα όσο και τη διαλυτότητά τους. Το πιο γνωστό παράγωγο είναι η (2HP)-β-CD η οποία παρασκευάζεται μετά από κατεργασία της β-cd με οξείδιο του προπυλενίου και είναι γνωστή με τα εμπορικά ονόματα Molecusol TM και Encapsin TM. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα τόσο στις πρωτεύουσες όσο και στις δευτερεύουσες υδροξυλομάδες και παράγεται ένα μίγμα απο ισομορφές της (2HP)-β-CD που οδηγεί σε ένα προϊόν που είναι άμορφο, μη κρυσταλλικό που έχει μεγάλη διαλυτότητα στο νερό και είναι 27 φορές πιο υδατοδιαλυτό από τη β-cd. Η ευρεία χρησιμοποίηση της ΗP-β-CD σε φαρμακομορφές τόσο σε ανθρώπους όσο και σε ζώα οφείλεται στην ικανότητά της να σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με πάρα πολλές βιοδραστικές ενώσεις, στην ασφάλειά της τόσο για παρεντερική όσο και για per os χορήγηση και στην ιδιότητά της να σχηματίζει διαλυτά σύμπλοκα τύπου A L [(Sjetli (1992), Szente and Szetli (1999), Sjetli (2004)]. 3.5 Ιοντικές κυκλοδεξτρίνες Οι ιοντικές κυκλοδεξτρίνες παράγονται μετά από υποκατάσταση των υδροξυλομάδων των κυκλοδεξτρινών με υποκαταστάτες που ιονίζονται εύκολα. Η ικανότητα συμπλοκοποίησης των παραγομένων κυκλοδεξτρινών επηρεάζεται από το ph του διαλύματος, τον βαθμό υποκατάστασης και τις ιονίζουσες ομάδες με αποτέλεσμα στερικά και ηλεκτρονιακά φαινόμενα να επηρεάζουν την ικανότητα αυτή. Οι ιοντικές κυκλοδεξτρίνες διακρίνονται σε ανιονικές και κατιονικές. Τα κυριώτερα παράγωγα των ανιονικών κυκλοδεξτρινών είναι τα σουλφαλκυλαιθερο παράγωγα: Η σουλφοπροπυλοαιθυλο-β-cd (SPΕ-β-CD) και η σουλφοβουτυλοαιθυλο-β-cd (SBE-β-CD) παράγονται μετά από αντίδραση της β-cd σε αλκαλικό υδατικό διάλυμα με propane-sultone και butane-sultone αντίστοιχα. Τα ευρύτερα παραγόμενα παράγωγα της SBE-β-CD είναι άμορφα και έχουν μεγάλη 23

25 υδατοδιαλυτότητα (>50mg/ml). H SBE7-β-CD χρησιμοποιείται σε κλινικά πειράματα για παρεντερική χορήγηση φαρμάκων και είναι γνωστή με το εμπορικό όνομα Captisol ΤΜ [Mosher και Thompson, Stella and Rajewski (1991), Szente and Szetli (1999), Okimoto και συνεργάτες (1996), Hirayama και συνεργάτες (1999)]. Σχήμα 6: Η χημική δομή της SBE-β-κυκλοδεξτρίνης R= -(CH 2 ) 4 SO 3 Na ή Η Πίνακας 3: Η γενική δομή των κυκλοδεξτρινών και των κυριοτέρων παραγώγων τους με φαρμακευτικό ενδιαφέρον [Stella and Rajewski, (1997)]. Κυκλοδεξτρίνη Συντομογραφία R n α-κυκλοδεξτρίνη α-cd Η 4 β-κυκλοδεξτρίνη β- CD Η 5 γ-κυκλοδεξτρίνη γ- CD Η 6 6-ο-γλυκόσυλ-β-κυκλοδεξτρίνη G-β-CD Γλυκόσυλ- ή Η 5 6-ο-μαλτόσυλ-β-κυκλοδεξτρίνη M-β-CD Μαλτόσυλ- ή Η 5 Διμεθυλιωμένη-β-κυκλοδεξτρίνη DM-β-CD CH 3 ή H 5 Τριμεθυλιωμένη-β-κυκλοδεξτρίνη TM-β-CD CH 3 ή H 5 Τυχαίως μεθυλ-β-κυκλοδεξτρίνη RM-β-CD CH 3 ή H 5 2-Υδρόξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη HP-β-CD CH 2 CHOHCH 3 ή H 5 Υδροξυβουτενύλ-β-κυκλοδεξτρίνη Hben-β-CD CH 2 CHOHCHCH 2 ή H 5 Σουλφοβουτυλαίθερ-βκυκλοδεξτρίνη SBE-β-CD (CH 2 ) 4 SO 3 Na ή H 5 * Τα παράγωγα μπορούν να έχουν διαφορετικό DS της 2,3 ή 6 θέσης της γλυκοπυρανόζης 24

26 4. ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ Η βασικότερη ιδιότητα των κυκλοδεξτρινών είναι η ικανότητά τους να εγκλωβίζουν στην υδρόφοβη κοιλότητά τους είτε ολόκληρα μόρια υδρόφοβων βιοδραστικών ενώσεων είτε υδρόφοβα τμήματα των ενώσεων αυτών, σε υδατικά διαλύματα. [Masson (2003)] Σχήμα 7: Σχηματική απεικόνιση του σχηματισμού συμπλόκου έγκλεισης βιοδραστικής ένωσης/κυκλοδεξτρίνης (σύμπλοκο σαλικυλικού οξέος : β- κυκλοδεξτρίνης) Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται ονομάζονται σύμπλοκα έγκλεισης καθώς σε αυτά δεν σχηματίζονται πραγματικοί χημικοί δεσμοί μεταξύ των μορίων. Η σταθερότητα των συμπλόκων αυτών οφείλεται σε: 1. Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, 2. Δυνάμεις Van der Waals, 3. Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, 4. Δεσμούς υδρογόνου και 5. Στην απομάκρυνση μορίων νερού πλούσιων σε ενθαλπία από την υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης. 4.1 ΣΤΑΘΕΡΑ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ Η σταθερά συμπλοκοποίησης ή σταθερά σχηματισμού συμπλόκου είναι μια σταθερά που προσδιορίζεται πειραματικά μετρώντας τη μεταβολή μιας φυσικοχημικής ιδιότητας (διαλυτότητα, απορρόφηση) του βιοδραστικού μορίου με 25

27 αλλαγές της συγκέντρωσης του φαρμάκου ή/και της κυκλοδεξτρίνης. Η τιμή της σταθεράς αυτής, με μονάδα το M -1, αποτελεί μέτρο της ικανότητας συμπλοκοποίησης των διαφόρων κυκλοδεξτρινών. Για απλούστευση, το S θα συμβολίζει το εγκλωβιζόμενο μόριο (guest molecule) και το L θα συμβολίζει το ξενιστή (host molecule), δηλαδή την κυκλοδεξτρίνη. Έτσι, ο σχηματισμός ενός συμπλόκου έγκλεισης περιγράφεται από τη γενική εξίσωση: ms + nl S m L n (1.1) όπου m και n είναι ο αριθμός των μορίων της δραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης, αντίστοιχα. Η σταθερά ισορροπίας δίνεται από την σχέση: Κ= [ SmLn] m n [ S] [ L] 1.2) Η στοιχειομετρική αναλογία των συμπλόκων που σχηματίζονται διαφέρει και εξαρτάται από το τύπο της κυκλοδεξτρίνης και από το μέγεθος και τις φυσικοχημικές ιδιότητες του φαρμάκου. Η απλούστερη και συχνότερα απαντούμενη στοιχειομετρική αναλογία είναι ίση με 1:1, οπότε το σύμπλοκο συμβολίζεται S:L. S + L SL (1.3) Κ = [ SL] 1:1 [ S][ L] (1.4) Όταν όμως η κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης είναι αρκετά μεγάλη δύο μόρια φαρμάκου μπορούν να εγκλωβιστούν, οπότε σχηματίζεται σύμπλοκο με στοιχειομετρία 2:1 (S 2 L) σπανιώτερη περίπτωση. S + SL S 2 L (1.5) [ SL] [ S][ SL] Κ = 2 (1.6) 2:1 Αντίστοιχα, αν το μόριο του φαρμάκου είναι πολύ μεγάλο και κατά προτίμηση γραμμικό (itraconazole, linoleic acid) τότε απαιτούνται περισσότερα από ένα μόρια κυκλοδεξτρίνης για να το εγκλωβίσουν οπότε σχηματίζονται σύμπλοκα μεγαλύτερης τάξης ως προς την κυκλοδεξτρίνη (1:2 για το SL 2, 1:3 για το SL 3 ) εκτός από το σύμπλοκο με στοιχειομετρία 1:1. [ SL2 ] SL + L SL 2 όπου η σταθερά δίνεται από την σχέση Κ 1:2 = (1.7) [ SL][ L] ή 2 S + L 2 SL 2 για την ολική σταθερά σχηματισμού Κ = [ SL ] 1:2 [ S][ L ] (1.8) 2 26

28 4.2 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΦΑΣΕΩΝ Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης και της στοιχειομετρίας του συμπλόκου είναι η μελέτη της διαλυτότητας φάσεων [Higuchi and Connors(1965)]. Είναι η απλούστερη τεχνική και περιλαμβάνει αρχικά την προσθήκη σταθερής ποσότητας βιοδραστικής ουσίας (Substrate) σε μία σειρά από περιέκτες (vials) ανάλογα με την φυσιολογική διαλυτότητα της. Σε κάθε περιέκτη προστίθεται σταθερός όγκος υδατικού διαλύματος προοδευτικά αυξανόμενης συγκέντρωσης σε κυκλοδεξτρίνη (Ligand). Οι περιέκτες σφραγίζονται και αναδεύονται σε σταθερή θερμοκρασία μέχρι να αποκατασταθεί ισορροπία. Στη συνέχεια, τα αιωρήματα διηθούνται για την απομάκρυνση του στερεού και τα διηθήματα αναλύονται και προσδιορίζεται η ολική συγκέντρωση του υποστρώματος ανεξάρτητα από την μοριακή κατάστασή του χρησιμοποιώντας κατάλληλη αναλυτική τεχνική. Ακολούθως κατασκευάζεται ένα διάγραμμα φάσεως ή ισόθερμος διαλυτότητας με τη γραφική παράσταση της ολικής συγκέντρωσης του υποστρώματος [S] ως προς τη συγκέντρωση του υποκαταστάτη που προστέθηκε στο σύστημα [Connors (1987)]. Σημαντικό μεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ο μεγάλος χρόνος για την αποκατάσταση της ισορροπίας (από 3 μέχρι 10 ημέρες) γιαυτό απαιτούνται προκαταρκτικά πειράματα για τον προσδιορισμό του (λήψη δειγμάτων έως ότου η συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας να παραμένει σταθερή). Τα διαγράμματα φάσεως διακρίνονται σε δύο γενικούς τύπους: 1. Στα διαγράμματα τύπου Α, τα οποία χαρακτηρίζονται α) από το σχηματισμό ευδιάλυτων συμπλόκων μεταξύ κυκλοδεξτρίνης και βιοδραστικής ένωσης και β) από την συνεχή αύξηση της διαλυτότητας της βιοδραστικής ένωσης όσο αυξάνεται η συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης. Τα διαγράμματα τύπου Α διακρίνονται σε 3 επιμέρους κατηγορίες: Α L type: στα διαγράμματα αυτά το σύμπλοκο εμφανίζει πρώτης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης και πρώτης ή μεγαλύτερης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση της βιοδραστικής ένωσης (SL, S 2 L, S 3 L, S m L). Το διάγραμμα αυτό παριστά μια γραμμική σχέση ανάμεσα στη συγκέντρωση του υποκαταστάτη και τη συνολική συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας στο διάλυμα. Α p type: στα διαγράμματα αυτά εμφανίζεται θετική απόκλιση από τη γραμμική σχέση και το σχηματιζόμενο σύμπλοκο εμφανίζει πρώτης τάξης σχέση με 27

29 τη συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας και δεύτερης ή μεγαλύτερης τάξης σχέση με τη κυκλοδεξτρίνη (SL 2, SL 3, SL n ). Α N type: στα διαγράμματα αυτά εμφανίζεται αρνητική απόκλιση από τη γραμμική σχέση. Η αρνητική απόκλιση από την γραμμική σχέση οφείλεται είτε στην συσσωμάτωση των μορίων της κυκλοδεξτρίνης είτε σε αλλαγές στις ιδιότητες του διαλύτη. Σχήμα 8: Γραφική απεικόνιση των διαφόρων τύπων ισοθέρμων διαλυτότητας κατά Higuchi και Connors 2. Στα διαγράμματα τύπου Β, τα οποία χαρακτηρίζονται από το σχηματισμό συμπλόκων περιορισμένης διαλυτότητας. Τα σύμπλοκα αυτά καταβυθίζονται όταν η συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης ξεπεράσει μία ορισμένη τιμή. Τα δυσδιάλυτα αυτά σύμπλοκα έχουν ενδιαφέρον σε συστήματα βραδείας αποδέσμευσης βιοδραστικών ενώσεων. Στην ισόθερμο Β s το τμήμα xy υποδεικνύει το σχηματισμό ενός ευδιάλυτου συμπλόκου που αυξάνει τη συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας και είναι παρόμοιο με τα διαγράμματα τύπου Α. Στο σημείο y όμως, η ευθεία οριζόντια γραμμή υποδεικνύει ότι παρά το σχηματισμό συμπλόκου, η συνολική συγκέντρωση της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ουσίας παραμένει σταθερή, επομένως το σύμπλοκο που σχηματίζεται καταβυθίζεται αφού το διάλυμα είναι κορεσμένο ως προς αυτό. Στο τελευταίο τμήμα της ισοθέρμου παρατηρείται απότομη μείωση της συγκέντρωσης της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ουσίας λόγω του σχηματισμού δυσδιάλυτων συμπλόκων ανώτερης τάξεως με τα μόρια της κυκλοδεξτρίνης. Η ισόθερμος Β Ι είναι παρόμοια με τη B s με τη διαφορά ότι το σύμπλοκο που σχηματίζεται είναι περισσότερο δυσδιάλυτο σε σχέση με το σύμπλοκο στην 28

30 περίπτωση της ισοθέρμου B S και δεν παρατηρείται αύξηση της διαλυτότητας της βιοδραστικής ουσίας με την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης [Connors (1987)] Σύμπλοκα έγκλεισης με στοιχειομετρία 1:1 Βασικός στόχος των διαγραμμάτων φάσεων είναι ο προσδιορισμός της στοιχειομετρίας και ο υπολογισμός των σταθερών σχηματισμού των σχηματιζόμενων συμπλόκων. Έστω ότι έχουμε το σχηματισμό ενός συμπλόκου με στοιχειομετρία 1:1. Οι ολικές ποσότητες υποστρώματος (S) και υποκαταστάτη (L) (εξισώσεις ισοζυγίων μάζας) είναι: [S] t = [S] f + [S] b (1.9) [L] t = [L] f + [L] b [L] f = [L] t - [L] b (1.10) όπου [S] t και [L] t συμβολίζεται η συνολική, [S] f και [L] f η ελεύθερη και [S] b και [L] b η δεσμευμένη ποσότητα της βιοδραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης, αντίστοιχα. Επειδή όμως η ελεύθερη ποσότητα του υποστρώματος είναι ίση με την υδατοδιαλυτότητα (S 0 ) αυτού, η σχέση (1.9) λαμβάνει την μορφή: [S] t = S 0 + [S] b (1.11) Δεχόμενοι ότι το σύμπλοκο που σχηματίζεται έχει στοιχειομετρία 1:1 συνεπάγεται ότι η συγκέντρωση της δεσμευμένης βιοδραστικής ουσίας θα ισούται με τη συγκέντρωση της δεσμευμένης κυκλοδεξτρίνης και εκείνη με τη σειρά της θα ισούται με τη συγκέντρωση του συμπλόκου που σχηματίζεται. Δηλαδή: [S] b = [L] b = [SL] (1.12) Με βάση την αντίδραση S + L SL η σταθερά συμπλοκοποίησης θα ισούται με: Κ 1:1 = [SL] / [S] f [L] f Κ 1:1 = [SL] / S 0 [L] f (1.13) Από τις σχέσεις (1.10), (1.11) και (1.13) συνεπάγεται ότι: Κ [ SL] [ SL] = Κ = S ([ L] [ L ]) S ([ L] [ SL]) 1:1 1:1 0 t b 0 t Λύνοντας την εξίσωση (1.14) ως προς [SL] έχουμε: K1:1 S0 [ L] t [ SL] = 1+ K S 1:1 0 (1.14) (1.15) Επομένως, η γραφική παράσταση της συγκέντρωσης της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ουσίας έναντι της συνολικής συγκέντρωσης της κυκλοδεξτρίνης, δηλαδή η ισόθερμος διαλυτότητας, δίνει μια ευθεία γραμμή που τέμνει τον άξονα y 29

31 στο σημείο S 0. Από την κλίση της ευθείας μπορεί εύκολα να υπολογιστεί η σταθερά K 1:1 καθώς: K1:1[ S0 ] Κ λση ί = K [ S ] + 1 1:1 0 κλíση Επομένως, K1:1 = S0 (1 κλíση) (1.16) (1.17) Η τιμή της Κ 1:1 είναι συνήθως μεταξύ 50 και 2000 Μ -1 και η μέση τιμή για την α-, β-, γ- κυκλοδεξτρίνη είναι 129, 490 και 355 Μ -1 αντίστοιχα. Αυτή όμως η σχέση ισχύει μόνο όταν η κλίση είναι μικρότερη της μονάδας. Και αυτό γιατί τα διαγράμματα Α L είναι αυτά στα οποία το σύμπλοκο εμφανίζει πρώτης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση του υποκαταστάτη και πρώτης ή μεγαλύτερης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος (SL, S 2 L, S 3 L, S m L). Έτσι, αν η αντίδραση έχει τη μορφή : ms + L S m L (1.18) τότε με κατάλληλη τροποποίηση των ισοζυγίων μάζας για την ολική βιοδραστική ένωση και την ολική κυκλοδεξτρίνη έχουμε τις εξισώσεις: [L] f = [L] t - [S m L] (1.19) [S m L] = ([S] t [S] 0 ) / m (1.20) και τελικά προκύπτει ότι: mks L [ St ] = + S 1+ KS m 0 t m 0 0 (1.21) Επομένως, η γραφική παράσταση του S t ως προς L t για το σχηματισμό ενός διαλυτού συμπλόκου S m L δίνει ευθεία γραμμή (διάγραμμα τύπου Α L ) που τέμνει τον άξονα y στο σημείο S 0 και η κλίση της δίνεται από τη σχέση: mks κλίση = (1.22) 1 + KS Για παράδειγμα στην περίπτωση σχηματισμού συμπλόκου με στοιχειομετρία 2:1 η κλίση δίνεται από την σχέση: m 0 m 0 2S K Slope = SK : :1 (1.23) όπου Κ 2:1 είναι η σταθερά συμπλοκοποίησης του συμπλόκου. Στη περίπτωση αυτή η κλίση του διαγράμματος φάσεως είναι πάντα μικρότερη από την τιμή δύο. 30

32 Όταν η σχέση ανάμεσα στη συγκέντρωση της διαλυμένης βιοδραστικής ουσίας και τη συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης δεν είναι γραμμική σχηματίζεται σύμπλοκο υψηλότερης τάξης. Πιο συχνά εμφανίζεται σύμπλοκο με στοιχειομετρία 1:2, δηλαδή ένα σύμπλοκο δεύτερης τάξης ως προς την κυκλοδεξτρίνη, όπου ένα μόριο βιοδραστικής ουσίας δεσμεύεται από δύο μόρια κυκλοδεξτρίνης. Ο σχηματισμός του συμπλόκου γίνεται σε δύο στάδια, με βάση τις αντιδράσεις: S + L SL και SL + L SL 2 Οι σταθερές συμπλοκοποίησης των επιμέρους συμπλόκων [SL] και [SL 2 ] συμβολίζονται Κ 1:1 και Κ 1:2, αντίστοιχα και δίνονται από τη σχέσεις: K 1:1 = [ SL] [ S][ L] και [ SL ] K 2 1:2 = [ SL][ L] Σημειώνεται ότι εάν η σταθερά Κ 1:2 δίνεται ως ολική σταθερά σχηματισμού δηλαδή ως Κ 1:2 = [SL 2 ]/[S][L] 2 τότε σε αυτή τη περίπτωση η τιμή της διαφέρει. Με βάση τα ισοζύγια μάζας για την βιοδραστική ένωση και την κυκλοδεξτρίνη έχουμε: [S] t = S 0 + [SL] + [SL 2 ] (1.24) [L t ] = [L f ] + [SL] + 2[SL] 2 (1.25) Από τις παραπάνω εκφράσεις των σταθερών το ισοζύγιο μάζας για την ολική βιοδραστική ένωση λαμβάνει την μορφή : [S t ] = [S 0 ] + K 1:1 [S 0 ] [L f ] + K 1:1 K 1:2 [S 0 ] [L f ] 2 (1.26) Ανάλογα το ισοζύγιο μάζας για την ολική κυκλοδεξτρίνη έχει την μορφή : [L t ] = [L f ] + K 1:1 [S 0 ] [L f ] + 2 K 1:1 K 1:2 [S 0 ] [L f ] 2 (1.27) και λύνοντας την δευτεροβάθμια εξίσωση ως προς την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης έχουμε: 1/ 2 b + ( b 2 + alt ) L = (1.28) 2a όπου a = 2K1:1 K1:2S 0 και b = 1+ K1:1S 0 Η τιμή της Κ 1:2 είναι συνήθως 10 έως 500 Μ -1 και σημαντικά μικρότερη από την τιμή της Κ 1:1. Αντίστοιχα, αν το σύμπλοκο που σχηματίζεται είναι τρίτου βαθμού ως προς την κυκλοδεξτρίνη η ολική συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης δίνονται από τις σχέσεις: 3 [ S ] = [ S ](1 + K [ L ] + K K [ L ] + K K K [ L ] ) T 2 0 1:1 f 1:1 1:2 f 1:1 1:2 1:3 f 2 3 [ L t ] = [ Lf ] + [ S0 K1:1[ Lf ] + 2[ S0] K1:1K 1:2[ Lf ] + 3[ S0] K1:1 K1:2K1:3 [ Lf ] 31