ENZYWELL. CYTOMEGALOVIRUS IgG AVIDITY. REF (24 tests)

Transcript

1 /GK 1/16 ZYWELL CYTOMEGALOVIRUS IgG AVIDY REF (24 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Italy Modifications apportées à la révision courante Τροποποιήσεις που εισήχθησαν στην τρέχουσα διόρθωση Chapitre Κεφάλαιο

2 /GK 2/16 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. UTILISATION / ΥΠΟΔΕΙΚΝΥΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 2. INTERET CLINIQUE / ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3. PRINCIPE / ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 4. CONTU DU K ET PREPARATION D REACTIFS / ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΚΙΤ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 5. MODAL DE CONSERVATION ET STABILE D REACTIFS / ΤΡΟΠΟΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 6. PRECAUTIONS D UTILISATION / ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 7. ECHANTILLONS / ΕΙΔΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ 8. PROCEDURE / ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 9. SCHEMA D ANALYSE / ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 10. VALIDATION DU TT / ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΤΕΣΤ 11. INTERPRETATION DU TT / ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 12. LIM DU TT / ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ 13. SSIBLE ET SPECIFICE DIAGNOSTIQU / ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ 14. PRECISION / ΑΚΡΙΒΕΙΑ 15. ROLUTION D PROBLEM / ΟΔΗΓΟΣ ΕΠΙΛΥΣΗΣ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ 16. BIBLIOAPHIE / ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

3 3/16 INSTRUCTIONS POUR L'EMPLOI ZYWELL CYTOMEGALOVIRUS IgG AVIDY REF (Français) 1. UTILISATION METHODE IMMUNOZYMATIQUE POUR LA DETERMINATION DE L AVIDE D ANTICORPS IgG ANTICYTOMEGALOVIRUS DANS LE SERUM HUMAIN. 2. INTERET CLINIQUE Le cytomégalovirus est un virus herpétique qui se transmet dans les situations de rapports humains étroits. La plupart des sujets atteints restent asymptomatiques. Le virus, au contraire, est très dangereux pour les patients immunodéprimés, chez lesquels le virus peut aboutir à la mort. Les femmes séronégatives qui contractent la maladie pendant la grossesse, peuvent la transmettre au fœtus. Dans 95 % des cas, cela se produit sans autres conséquences, mais le nouveauné peut présenter des symptômes, comme l ictère, l hépatosplénomégalie ou un retard du développement psychomoteur. C'est la raison pour laquelle il est très important de connaître l état immunitaire de la patiente et d'observer l éventuelle séroconversion. Quelquefois, il ne suffit pas de déterminer seulement les anticorps IgM, parce que la présence de ces anticorps peut être due à la persistance des IgM ou à la réinfection asymptomatique due au cytomégalovirus, sans représenter un risque pour le fœtus. C'est la raison pour laquelle il est utile de doser l avidité des anticorps IgG, puisqu il a été démontré que ce paramètre est bas pendant la phase aiguë et qu'il augmente avec le temps. La présence d'anticorps à basse avidité indique donc une infection récente ou en cours. L avidité des IgG dans le sérum peut être dosée en utilisant ce kit ELISA. 3. PRINCIPE Le test se base sur le principe ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). L antigène, constitué de Cytomégalovirus partiellement purifié et inactif, est lié à la phase solide (puits de la barrette 1x8). A travers l incubation dans le sérum humain dilué, les immunoglobulines spécifiques se lient à l antigène. L échantillon est versé dans deux puits (ou 4 si on effectue le test en double) et on le laisse incuber. Après un lavage de la phase solide, on met le Tampon Avidité dans un puits et la solution de lavage dans l autre. Le premier tampon entraîne la dissociation du lien entre l antigène et les anticorps et cette dernière sera proportionnelle à l avidité des anticorps. Après des lavages permettant d'éliminer les protéines qui ne se sont pas liées, on effectue l incubation avec le conjugué constitué d anticorps monoclonaux antiigg humaines marqués à la peroxydase HRP. Le conjugué qui ne s est pas lié est éliminé et l'on ajoute le substrat spécifique pour l enzyme. La couleur qui apparaît dépend de la concentration en anticorps spécifiques dans le sérum examiné qui sont encore liés à l antigène sur la phase solide. Le rapport entre la densité optique du puits où l'on a incubé le tampon de lavage est exprimé en pourcentage et il constitue la mesure de l avidité du sérum examiné viaàvis de l antigène du cytomégalovirus. 4. CONTU DU K ET PREPARATION D REACTIFS Le kit permet de réaliser 24 réactions. Porter les réactifs à température ambiante avant l'utilisation. MT PLATE MICROPLAQUE 3 x 16 puits sensibilisés avec le Cytomégalovirus Utilisation : Découper le sachet du côté opposé au code (C, suivi par le numéro du lot) qui sert à son identification. Sortir le support et les barrettes nécessaires du papier d emballage et placer les barrettes non utilisées dans le sachet en plastique avec le gel de silice. Chasser l air du sachet et le fermer en exerçant une pression sur la fermeture. CONJ CONJUGUE 1 x 12 ml Composition : Anticorps monoclonaux antiigg marqués à la peroxydase, dans un tampon phosphate contenant 0.05 % de phénol et 0.02 % de bronidox.. Préparation : Prêt à l emploi.

4 4/16 CONTROL LOW CONTROLE A BASSE AVIDE 1 x 2.5 ml Composition : Sérum humain contenant IgG anticmv à basse avidité, dilué dans un tampon phosphate à 0.01 mol/l avec 1 % de BSA et 0.09 % d azide de sodium. Il se présente sous une forme liquide et il est prêt à l emploi sans autre dilution. CONTROL HIGH CONTROLE A HAUTE AVIDE 1 x 2.5 ml Composition : Sérum humain contenant des IgG anticmv à haute avidité, dilué dans un tampon phosphate à 0.01 mol/l avec 1 % de BSA et 0.09 % d azide de sodium. Il se présente sous une forme liquide et il est prêt à l emploi sans autre dilution. AVIDY BUF TAMPON D AVIDE 1 x 10 ml Composition : Urée en solution saline tamponnée contenant du phénol (0.05 %) et du Bronidox (0.02 %), prête à l usage sans autre dilution. En présence de cristaux, chauffer la solution à 37 C pour les solubiliser. WASH BUF 10x TAMPON DE LAVAGE 10X (PF93603) 1 x 100 ml LOTS INTERCHANGEABL Composition : Solution saline tamponnée, concentrée 10 fois ; contient 0.5 % de brij. Préparation : Diluer à 1/10 avec de l eau distillée pour obtenir un tampon de lavage prêt à l emploi. En présence de cristaux : chauffer la solution à 37 C pour les solubiliser, puis réaliser la dilution. SAMP DIL 2 DILUANT 2 (PF93611) 1 x 100 ml LOTS INTERCHANGEABL Pour diluer les échantillons de sérum. Composition : Solution protéique, additionnée d azide de sodium 0.09 % et de méthylorange en guise de colorant. SUBS TMB SUBSTRAT (PF93619 ) 1 x 12 ml Prêt à l emploi LOTS INTERCHANGEABL Composition : Tétraméthylbenzidine (à 0.26 mg/ml) et peroxyde d hydrogène ( H 2 O 2 à 0.01 %) stabilisé dans un tampon citrate ( à 0.05 mol/l). ph = 3.8. H 2 SO M SOLUTION D ARRET (PF93602) 1 x 16 ml LOTS INTERCHANGEABL Composition : H 2 SO 4 ( à 0.3 mol/l ) en solution prête à l emploi. SACHET POLYETHYLE (1) FEUILL ADHIV (2) MATERIEL NECSAIRE MAIS NON FOURNI Incubateur à 37 C Lecteur de microplaques (longueur d onde 450 ou à 450/620 nm, avec linéarité jusqu à 2.000) Laveur de microplaques (pas indispensable) capable de fournir des volumes de µl Eau distillée ou désionisée Verrerie normale de laboratoire (éprouvettes, pipettes, etc...) Micropipette pour le prélèvement précis de 10, 100, 1000 µl de solution Gants à jeter Compteminutes Solution 5 % de sodium hypochlorite Récipients pour les matériaux potentiellement infectieux Papier absorbant 5. MODAL DE CONSERVATION ET STABILE D REACTIFS Conserver les réactifs à 28 C. La date de péremption est imprimée sur chaque flacon et sur l étiquette apposée sur la confection. Les réactifs ont une stabilité limitée après l aperture et/ou la préparation REACTIF CONDIONS MICROPLAQUE 5 semaines à 2/8 C, sachet en polythène. CONTROL 5 semaines à 2/8 C. CONJUGUE 5 semaines à 2/8 C. SUBSTRAT jusqu à péremption à 2/8 C, 1 semaine à 15/30 C, dans l'obscurité. DILUANT jusqu à péremption à 2/8 C. TAMPON DE LAVAGE prêt à l emploi 2 semaines à 2/8 C, 5 jours à 15/30 C.

5 5/16 TAMPON D AVIDE SOLUTION D ARRET jusqu à péremption à 2/8 C. jusqu à péremption à 2/8 C. 6. PRECAUTIONS D UTILISATION POUR DIAGNOSTIC IN VRO. ATTTION : Ce kit contient des matériaux d origine humaine. Bien que tous les produits d origine humaine aient subi un contrôle de dépistage négatif, concernant les anticorps antivih 1 et 2, les anticorps antivhc et l Ag HBs en utilisant des méthodes approuvées par la FDA, ils doivent être maniés comme étant des produits potentiellement infectieux. Elimination des résidus: les échantillos de serum et les reactifs usages doivent être traités come des déchets infectés, et donc éliminés conformément aux dispositions de loi en vigueur. Precautions et avertissements pour la securite personnelle 1. Ne pas pipeter avec la bouche. Porter des gants à jeter et des protections pour les yeux quand on manie des échantillons et pendant le test. Se laver soigneusement les mains une fois que le test est terminé. 2. Les réactifs suivants contiennent de faibles concentrations de substances nocives ou irritantes : a) Le tampon de lavage contient des détergents b) Le conjugué et les contrôles contiennent du phénol c) Le substrat est acide. d) Le sérum de contrôle contient 0.09 % d azide de sodium en guise de conservateur. Les azides peuvent réagir avec les métaux des canalisations et donner ainsi naissance à des composés explosifs. En cas de contact d'un réactif avec la peau ou les yeux, les laver à grande eau. 3. Les instruments que ne sont pas à jeter doivent être stérilisés après l emploi, de préférence en autoclave pendant 1 h à 121 C. Les matériaux à jeter doivent être mis en autoclave ou incinérés. 4. L acide sulfurique contenu dans la solution d arrêt et l acide chlorhydrique utilisé pour laver la verrerie sont corrosifs ; ces substances doivent être utilisées avec prudence. En cas de contact avec la peau ou les yeux, les laver à grande eau. 5. Les matériaux liquides à jeter, neutralisés avec une solution alcaline, doivent être désinfectés avec de l'hypochlorite de sodium en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 1 % au moins. Une exposition à l'hypochlorite de sodium 1 % pendant 30 minutes suffit pour garantir une désinfection efficace. 6. En cas de renversement accidentel de matériaux potentiellement infectieux, essuyer immédiatement avec du papier absorbant et nettoyer le plan de travail avec, par exemple, de l hypochlorure de sodium (1 %), avant de continuer le test. En présence d un acide, on pourra utiliser l'hypochlorite de sodium seulement après avoir essuyé la zone. Tous les matériaux utilisés pour nettoyer un renversement accidentel doivent être éliminés comme étant potentiellement infectieux. Avertissements analytiques 1. Porter tous les réactifs et les échantillons à la température ambiante (1830 C) avant l emploi. Remettre les réactifs à la température de conservation immédiatement après l emploi. Il est très important de contrôler la température d incubation des microplaques. Le thermostat ne doit pas descendre au dessous de 35 C ni au dessus de 39 C. Ouvrir le sachet contenant les barrettes après l'avoir laissé 30 minutes à la température ambiante. 2. Ne pas utiliser les réactifs audelà de la date de péremption. Eviter la contamination microbienne des réactifs parce que la validité peut se réduire et que les résultats peuvent être erronés. 3. Ne pas changer le procédé, ni remplacer les réactifs avec ceux d autres producteurs ou d autres lots, à moins qu il ne soit précisé que le réactif est interchangeable parmi différents lots. Les temps d incubation ne doivent pas être réduits. 4. Toute la verrerie utilisée pour le test doit être lavée soigneusement avec de l acide chlorhydrique (2M) et rincée à l eau distillée ou désionisée. 5. N'exposer les réactifs ni à une forte lumière, ni aux vapeurs d hypochlorure pendant leur conservation ou pendant les phases d incubation. 6. Eviter le dessèchement des puits pendant le test. 7. Eviter la contamination croisée entre les réactifs. Il est important d'utiliser des pipettes «dédiées». 8. Eviter de toucher ou d éclabousser le bord du puits avec le conjugué. Ne pas souffler sur les microplaques. 9. Les dosages immunoenzymatiques présentent parfois un «effet de bord» («edge effect») ; cet effet peut être minimisé en augmentant l humidité pendant les phases d incubation. Les microplaques doivent être couvertes avec le couvreplaque et incubées à 37 C ou au bainmarie. Autrement, on peut faire incuber les plaques dans une analyseur approprié. Ne pas utiliser d incubateurs à CO 2.

6 6/ Avant de lire la microplaque, veiller à ce que le fond de la microplaque soit propre et sec et qu il n y ait aucune bulle d air à la surface du liquide. 11. Des échantillons fortement hémolysés, du sérum non complètement coagulé ou des échantillons présentant une contamination microbienne peuvent entraîner des résultats erronés. 12. L utilisation du kit avec des instruments automatiques doit être validée par l utilisateur. 13. Lire attentivement les modes d'emploi des instruments utilisés ; en particulier, il faut prêter attention : à l'installation et aux avertissements spécifiques aux principes opérationnels, aux instructions, précautions, risques aux spécifications du producteur et aux performances de l instrument à la maintenance et à l'assistance technique. 7. TYPE D ECHANTILLON ET CONSERVATION L échantillon peut se constituer par sérum prélevé normalement en observant toutes les précautions prévues dans le laboratoire. Les sérums frais peuvent être utilisés encore au bout de 4 jours à Pour un stockage plus long, congeler les sérums à 20 C. Peut subir jusqu à un maximum de troi décongelations. Éviter l'utilisation de l'espace de congélateur à dégivrage automatique pour le stockage des échantillons. Les sérums décongelés doivent être bien agités avant l'utilisation. Les échantillons présentant une contamination microbienne peuvent fausser les résultats. Si la contamination est perceptible à l œil nu, l échantillon doit être éliminé. En outre, il n'est pas possible d'utiliser les échantillons fortement lipémiques, ictériques, hémolysés ou contaminés. L échantillon ne peut pas se constituer de plasma humain. 8. PROCEDURE Préparer le nombre nécessaire de barrettes. Préparation de la solution tamponnée de lavage : Diluer la solution de lavage concentrée (par exemple : 100 ml ml d eau distillée). Exécution Laisser un puits vide pour effectuer le blanc (seulement le substrat). Diluer les échantillons 1 :301 en versant 5 µl de sérum dans 1,5 ml de diluant ; distribuer 100 µl de chaque échantillon dilué dans au moins deux puits, et 100 µl du contrôle à basse avidité et du contrôle à haute avidité en double. Couvrir les puits avec la feuille de protection. Incuber pendant 60 minutes à 37 C. Laver pendant 30 secondes (300 µl), répéter la phase de lavage 4 fois. Ajouter dans un puits des échantillons, du contrôle, 100 µl de solution de lavage, et dans l autre puits 100 µl du tampon d avidité ; incuber à 37 C pendant 10 minutes. Aspirer le tampon et effectuer 4 lavages pendant 30 secondes. Ajouter 100 µl du conjugué dans chaque puits et faire incuber 45 à 37 C, en couvrant les puits avec la feuille de protection. Laver la plaque encore 4 fois comme il est mentionné précédemment. Distribuer le substrat (100 µl / puits). Incuber 15 minutes à température ambiante. Ajouter 100 µl de solution d arrêt. Lire la densité optique à 450 nm ou à 450/620 nm dans les 30 minutes. 9. SCHEMA D ANALYSE 1e ETAPE Mettre 100 µl de sérum dilué/contrôle en double dans les puits de la barrette. Incuber pendant 60 minutes à 37 C. Laver 4 fois pendant 30 secondes (300 µl) 2e ETAPE Pour chaque échantillon et contrôle, verser 100 µl de solution de lavage dans un puits et 100 µl de tampon d avidité dans l autre. Incuber pendant 10 minutes à 37 C. Laver pendant 30 seconde à 4 reprises (300 µl) 3e ETAPE Mettre 100 µl de conjugué dans chaque puits Incuber pendant 45 minutes à 37 C. Laver 4 fois. 4e ETAPE Mettre 100 µl de substrat dans les puits. Incuber pendant 15 minutes à la température ambiante.

7 7/16 5e ETAPE Ajouter la solution d arrêt, 100 µl dans chaque puits. Lire la densité optique à 450 nm dans les 30 minutes. 10. VALIDATION DU TT La O.D. du blanc doit être Les contrôles à basse et à haute avidité dans les puits incubés avec la solution de lavage doivent avoir une valeur de O.D. > Le pourcentage d avidité du contrôle bas, calculé comme il est indiqué dans le paragraphe "Interprétation des Resultats", doit être inférieur à 35 %. Celui du contrôle haut doit être supérieur à 50 %. 11. INTERPRETATION D RULTATS Le pourcentage d avidité des échantillons est exprimé et calculé en faisant le rapport entre les O.D. trouvées dans les puits contenant le tampon d avidité et ceux qui contiennent la solution de lavage, après avoir soustrait la valeur du blanc. O.D. avec le tampon d avidité O.D. blanc O.D. avec la solution de lavage O.D. blanc x100 = % d avidité Quand ce rapport est supérieur à 40 %, il y a présence d'igg anticmv à haute avidité ; si le rapport est inférieur à 30%, il y a présence d'igg anticmv à basse avidité. Si le pourcentage est compris entre 30 et 40 %, nous avons la présence d'igg anticmv de moyenne avidité (Borderline). Dans ce cas, l interprétation du test est incertaine. On ne peut effectuer le calcul que sur les échantillons présentant une O.D. du puits lavé avec la solution de lavage Attention : Si la O.D. du puits de référence est supérieure à il faut refaire le test en diluant 1/1000. Si la O.D. du puits de référence est < 0.400, refaire le test en diluant l échantillon 1/101. Répéter le test si le résultat est une avidité moyenne. Dans tous les cas, il est conseillé de répéter le test au bout de 2 à 3 semaines afin d évaluer toute éventuelle variation de l avidité. 12. LIM DU TT La présence des IgG à haute avidité (surtout dans les sujets transplantés), même si elle n'exclut pas la possibilité d'une infection récente, indique fortement qu'une infection est survenue au moins 5 mois auparavant. Inversement, la présence des IgG à basse avidité indique fortement qu'une infection est survenue au cours des 4 mois précédents. Chez les nouveaunés, une basse avidité n est pas l'indice d une infection en cours. Le résultat du test doit toujours être évalués en conjonction avec les données de l'histoire du patient et / ou d'autres examens diagnostiques. 13. SSIBILE ET SPECIFICE DIAGNOSTIQU Dans une expérimentation externe, 100 échantillons ont été analysés avec deux kits disponibles dans le commerce pour la détermination des IgG et des IgM anticmv. Le tableau clinique de chaque sujet était connu. Le taux d avidité calculé a été associé à la phase de l infection. Des 100 sérums examinés, 14 appartenaient à des sujets ayant une infection aiguë, 15 à patients greffés (7 avec une infection aiguë). Les autres provenaient de patients ayant eu une infection dans le passé. Le taux d avidité chez les 14 patients ayant une infection aiguë variait de 6 (minimum ) à 3540 (maximum) (infections primaires avancées). Dans les infections passées, l avidité variait de 50 à 100 ( 70 dans 61 % des cas). Les sujets greffés montraient de hautes valeurs d avidité, mais le résultat était faussé par l administration des gammaglobulines, fréquente chez ces patients.

8 8/ PRECISION Tab.1 Précision dans la série (n=6) Echantillon % moyenne avidité D.S. CV % Basse avidité Basse Avidité Tab.2 Précision entre séries Echantillon % moyenne avidité D.S. CV % S S S ROLUTION D PROBLEM PROBLEME CAUS POSSIBL ACTION/CONTROLE Session non valable (tous Absence d un ou de plusieurs Contrôler le processus. négatifs) réactifs, ou ajout des réactifs en Contrôler s il y a une solution inutilisée. ordre erroné Plaque non réactive Refaire le test. Contrôler le code imprimé sur le sachet de la plaque (lire les instructions pour l emploi). Contrôler s il y a de l humidité sur la plaque inutilisée. (Le gel de silice doit présenter une couleur jaune pâle). Refaire le test. Session non valable (tous positifs) Contamination du substrat Prélever une nouvelle quantité de substrat. Lavage insuffisant S assurer que la pipette fonctionne correctement. Précision insuffisante Lavage incomplet des puits S assurer que la pipette fonctionne correctement. Aspiration insuffisante des puits S assurer que la pipette fonctionne correctement. Erreur de pipetage S assurer que la pipette fonctionne correctement Développement insuffisant de la couleur Ajout des réactifs trop long Présence de bulles d air Parcours optique pas propre Temps ou température d incubation non correct Volume incorrect du substrat ajouté à la plaque Eviter le dessèchement de la plaque après la phase de lavage. Ajouter immédiatement les réactifs. Eviter la formation de bulles d air pendant le pipetage. Contrôler la source lumineuse et la présence d impuretés. Essuyer le fond de la plaque avec du papier. Vérifier le contrôle de la température et du temps d incubation Suivre attentivement les instructions d utilisation. Contrôler le fonctionnement de la pipette. 16. BIBLIOAPHIE 1. L. GrangeotKeros, M.J. Mayaux, P. Lebon et él. Value of CMV IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Inf. Dis. 175: 944 (1997). 2. N.K. Blackburn, T.G. Besselaar et él. Differentiation of primary cytomegalovirus infection from reactivation using the urea denaturation test for measuring antibody avidity. J. Med. Virol. 33: 6 (1991). 3. G.B. Wisdom. Enzymeimmunoassay. Clin. Chem. 22: 1243 (1976). 4. H.E. Prince, M. LapèNixon Role of Cytomegalovirus (CMV) IgG Avidity testting in diagnosing primary CNV infection during pregnancy. Clinical and Vaccine Immunology 21: 10 (2014),

9 GK 9/16 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ZYWELL CYTOMEGALOVIRUS IgG AVIDY REF (Ελληνικά) 1. ΥΠΟΔΕΙΚΝΥΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ AVIDY ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgG ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΓΑΛΟΪΟΥ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο κυτταρομεγαλοϊός είναι ένας ιός έρπητα που μεταδίδεται με στενή ανθρώπινη επαφή. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων προσβάλλεται με ασυμπτωματική μορφή. Ο ιός, αντίθετα, είναι πολύ επικίνδυνος για τους υπό ανοσοκαταστολή ασθενείς, στους οποίους μπορεί να αποβεί θανατηφόρος. Οι οροαρνητικές γυναίκες που προσβάλλονται από την ασθένεια κατά την διάρκεια της εγκυμοσύνης, μπορούν να την μεταδώσουν στο έμβρυο. Στο 95% των περιπτώσεων αυτό γίνεται χωρίς συνέπειες αλλά στα συμπτωματικά νεογνά μπορεί να προκληθεί ίκτερος, ηπατοσπληνομεγαλία και καθυστέρηση στην ψυχοκινητική ανάπτυξη. Γι αυτό τον λόγο έχει μεγάλη σημασία να είναι γνωστή η ανοσολογική κατάσταση της ασθενούς και να παρακολουθείται μια ενδεχόμενη ορομετατροπή. Σε μερικές περιπτώσεις η ανίχνευση μόνο των αντισωμάτων IgM, δεν είναι αρκετή, επειδή η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να οφείλεται σε παραμένοντα IgM ή σε ασυμπτωματική επαναλοίμωξη από κυτταρομεγαλοϊό, χωρίς να υπάρχει κίνδυνος για το έμβρυο. Γι αυτό έχει σημασία ο προσδιορισμός του βαθμού της avidity (ισχύς δεσμού αντιγόνουαντισώματος) των IgG επειδή έχει αποδειχθεί ό,τι αυτή είναι χαμηλή κατά την οξεία φάση ενώ αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου. Γι αυτό η παρουσία αντισωμάτων IgG με χαμηλή avidity είναι ένδειξη πρόσφατης ή σε εξέλιξη, λοίμωξης. Η avidity των IgG στον ορό μπορεί να προσδιοριστεί με αυτό το κιτ ELISA. 3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Το τεστ βασίζεται στην μέθοδο ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). Το αντιγόνο, αποτελούμενο από κυτταρομεγαλοϊό μερικώς κεκαθαρμένο και αδρανοποιημένο, συνδέεται με τη στερεά φάση. Μέσω επώασης με αραιωμένο ανθρώπινο ορό, οι ειδικές ανοσοσφαιρίνες συνδέονται με το αντιγόνο. Το δείγμα τοποθετείται σε δύο κυψελίδες (ή σε τέσσερις για τα τεστ εις διπλούν) και αφήνεται στην επώαση. Μετά την έκπλυση της στερεάς φάσης, στη μία κυψελίδα τοποθετείται το ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού και στην άλλη διάλυμα έκπλυσης. Το πρώτο ρυθμιστικό διάλυμα θα προκαλέσει τον διαχωρισμό του δεσμού αντιγόνου και αντισώματος και αυτός θα είναι ανάλογος της avidity των αντισωμάτων. Μετά από εκπλύσεις για να απομακρυνθούν οι πρωτεΐνες που δεν αντέδρασαν, γίνεται η επώαση με το συζυγές, που αποτελείται από ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα αντι IgG σεσημασμένα με υπεροξειδάση ραφανίδων. Απομακρύνεται το συζυγές που δεν αντέδρασε και προστίθεται το ειδικό υπόστρωμα για το ένζυμο. Το χρώμα που σχηματίζεται είναι ανάλογο προς την συγκέντρωση των ειδικών αντισωμάτων που βρίσκονται στον υπό εξέταση ορό συνδεδεμένα με το αντιγόνο που έχει συνδεθεί με την στερεά φάση. Ο λόγος μεταξύ της οπτικής πυκνότητας της κυψελίδας στην οποίαν έχει επωασθεί το αποκολλητικό ρυθμιστικό διάλυμα και της κυψελίδας στην οποίαν έχει επωασθεί το ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης, είναι εκφρασμένος σε εκατοστιαίο ποσοστό και αποτελεί τον βαθμό της avidity του υπό εξέταση ορού έναντι του αντιγόνου του Κυτταρομεγαλοϊού. 4. ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΚΙΤ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Τα αντιδραστήρια καλύπτουν 24 τεστ. Φέρτε τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. MT PLATE ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΙΔΙΟ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΓΑΛΟΪΟ 3 x 16 κυψελίδες Χρήση: Ανοίξτε το περίβλημα των ταινιών (strips) από την αντίθετη πλευρά που αναγράφεται ο κωδικός (C ακολουθούμενο από τον αριθμό της παρτίδας) που χρησιμεύει για την ταυτοποίησή της, πάρτε την βάση και τοποθετήστε όσες ταινίες χρειάζονται. Βάλτε πάλι πίσω στη σακούλα από πολυαιθυλένιο, που περιέχει γέλη πυριτίας, τις ταινίες που δεν χρησιμοποιήσατε, αφαιρέστε τον αέρα και σφραγίστε την πιέζοντας το ειδικό σύστημα κλεισίματος.

10 GK 10/16 CONJ ΣΥΖΥΓΕΣ 1 x 12 ml Περιεχόμενο: διάλυμα ανθρώπινων μονοκλωνικών αντισωμάτων αντιigg σεσημασμένων με υπεροξειδάση, σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει φαινόλη 0,05% και Bronidox 0,02%. Έτοιμο για χρήση χωρίς επιπλέον διάλυση. CONTROL LOW ΕΛΕΓΧΟΣ ΧΑΜΗΛΗΣ AVIDY 1 x 2.5 ml Περιεχόμενο: Ανθρώπινος ορός με IgG αντιcmv χαμηλής avidity σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0.01 mol/l με BSA 1% και αζίδιο νατρίου 0,09%, υγρός, έτοιμος για χρήση χωρίς επιπλέον διάλυση. CONTROL HIGH ΕΛΕΓΧΟΣ ΥΨΗΛΗΣ AVIDY 1 x 2.5 ml Περιεχόμενο: Ανθρώπινος ορός με IgG αντιcmv υψηλής avidity σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0.01 mol/l με BSA 1% και αζίδιο νατρίου 0,09%, υγρός, έτοιμος για χρήση χωρίς επιπλέον διάλυση. AVIDY BUF ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ (BUFFER) AVIDY 1 x 10 ml Περιεχόμενο: Ουρία σε ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει φαινόλη (0.05%) και Bronidox (0.02%), έτοιμη για χρήση. Αν παρατηρήσετε κρυστάλλους, διαλύστε τους στους 37 C πριν από την χρήση. WASH BUF 10x ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΣΗΣ 1 x 100 ml ΚΟΙΝΟ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΠΑΡΤΙΔΕΣ Περιεχόμενο: Ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) συμπυκνωμένο 10 φορές, που περιέχει Brij 0.5% p/v. Προετοιμασία: Αραιώστε σε αναλογία 1:10 με αποσταγμένο νερό για να παρασκευάσετε το ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης έτοιμο για χρήση. Αν σχηματιστούν κρύσταλλοι, διαλύστε τους στους 37 C πριν την αραίωση. SAMP DIL 2 ΔΙΑΛΥΤΗΣ 2 (PF93611) 1 x 100 ml ΚΟΙΝΟΣ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΠΑΡΤΙΔΕΣ Χρησιμοποιείται για την αραίωση των δειγμάτων. Περιεχόμενο: Αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) με πρωτεΐνες,, αζίδιο του νατρίου και χρωστική ουσία (πορτοκαλί του μεθυλίου). SUBS TMB ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ 1 x 12 ml Έτοιμο για χρήση ΚΟΙΝΟ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΠΑΡΤΙΔΕΣ Περιεχόμενο: Τετραμεθυλβενζιδίνη και H 2 O 2 σταθεροποιημένα σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα με ph 3,8. H 2 SO M ΔΙΑΛΥΜΑ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗΣ 1 x 16 ml ΚΟΙΝΟ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΠΑΡΤΙΔΕΣ Διάλυμα H 2 SO mol/l έτοιμο για χρήση. ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗ ΤΑΙΝΙΑ (2). ΣΑΚΟΥΛΑ ΑΠΟ ΠΟΛΥΑΙΘΥΛΕΝΙΟ (1). ΑΛΛΟ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΣΥΝΟΔΕΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ. Επωαστήριο σε 37 C Αναγνώστης μικροπλακιδίων (μήκος κύματος 450 ή 450/620 nm, με γραμμικότητα μέχρι Ο.Π. 2,000) Συσκευή έκπλυσης μικροπλακιδίων (μη απαραίτητη) ικανότητας µl Απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό Γάντια μίας χρήσης Χρονόμετρο Διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 5% Δοχεία για την απόρριψη των δυνητικά μολυσματικών υλικών. Απορροφητικό χαρτί Στάνταρντ υάλινος εξοπλισμός εργαστηρίου: κύλινδροι, δοκιμαστικοί σωλήνες, κ.λ.π. Μικροπιπέτες που αναρροφούν με ακρίβεια όγκους 10, 100, 1000 µl διαλύματος 5. ΤΡΟΠΟΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκεύονται στους 2/8 C. Η ημερομηνία λήξης είναι τυπωμένη σε κάθε σετ και στην εξωτερική ετικέτα της συσκευασίας. Τα Αντιδραστήρια έχουν περιορισμένη διάρκεια σταθερότητας μετά το άνοιγμα και/ή την προετοιμασία ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΙΔΙΟ 5 εβδομάδες στους 2/8 C μέσα στην σακούλα από πολυαιθυλένιο ΟΡΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ 5 εβδομάδες στους 2/8 C ΣΥΖΥΓΕΣ 5 εβδομάδες στους 2/8 C ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ μέχρι τη λήξη του σε 2/8 C, 1 εβδομάδα σε 15/30 C στο σκοτάδι ΔΙΑΛΥΤΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ μέχρι τη λήξη του σε 2/8 C

11 GK 11/16 ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΣΗΣ έτοιμο για χρήση 2 εβδομάδες σε 2/8 C, 5 ημέρες σε 15/30 C ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ (BUFFER) AVIDY μέχρι τη λήξη του σε 2/8 C. ΔΙΑΛΥΜΑ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗΣ μέχρι τη λήξη του σε 2/8 C 6. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ IN VRO. Προσοχή: Αυτή η συσκευασία περιέχει υλικά ανθρώπινης προέλευσης που έχουν περάσει από έλεγχο και έχουν βρεθεί αρνητικά, σε εγκεκριμένα από την FDA τεστ, τόσο όσον αφορά την ανίχνευση του HbsAg όσο και για τα αντισώματα αντιhiv1, αντιhiv2 και αντιhcv. Επειδή κανένα διαγνωστικό τεστ δεν προσφέρει απόλυτη εγγύηση απουσίας μολυσματικών παραγόντων, κάθε υλικό ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρείται ως δυνητικά μολυσματικό. Χρησιμοποιείτε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα παίρνοντας όλες τις προφυλάξεις που προβλέπονται από τους κανονισμούς ασφαλείας του εργαστηρίου. Διαχείριση των κατάλοιπων: τα δείγματα του ορού και ο αντιδραστηρια που χρησιμοποιήθηκαν πρέπει να αντιμετωπίζονται ως κατάλοιπα δυνητικά μολυσματικά και να απορρίπτονται σύμφωνα με τις ισχύουσες διατάξεις. Οδηγίες για την προσωπική σας ασφάλεια 1. Μην κάνετε αναρρόφηση με το στόμα. Χρησιμοποιείτε γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε τα δείγματα. Πλένετε πολύ καλά τα χέρια σας μετά από κάθε ανάλυση. 2. Η περιεκτικότητα των παρακάτω αντιδραστηρίων σε βλαβερές ή ερεθιστικές ουσίες, είναι χαμηλή: α) το ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης περιέχει ουσίες καθαρισμού β) το συζυγές περιέχει φαινόλη γ) το υπόστρωμα είναι όξινο δ) Οι βαθμονομητές περιέχουν Αζίδιο Νατρίου (0,09%) το οποίο μαζί με τον χαλκό και τον μόλυβδο μπορεί να σχηματίσει ισχυρά εκρηκτικά αζιδικά ιζήματα μετάλλων. Αν ένα αντιδραστήριο έρθει σε επαφή με το δέρμα ή με τα μάτια, ξεπλύνατε με άφθονο νερό. 3. Οι συσκευές που δεν είναι μίας χρήσης, πρέπει να αποστειρώνονται, κατά προτίμηση στον κλίβανο, για 1 h σε 121 C, ενώ το υλικό μίας χρήσης πρέπει να μπαίνει στον κλίβανο ή να αποτεφρώνεται. 4. Το θειικό οξύ, που περιέχεται στο Stop Solution και το υδροχλωρικό οξύ που χρησιμοποιείται για το ξέπλυμα του υάλινου εξοπλισμού, είναι διαβρωτικά και γι αυτό πρέπει να χρησιμοποιούνται με προσοχή. Σε περίπτωση που έρθουν σε επαφή με το δέρμα ή με τα μάτια, ξεπλύνατε με άφθονο νερό. 5. Εξουδετερωμένα οξέα και άλλα υγρά απόβλητα πρέπει να απολυμαίνονται προσθέτοντας υποχλωριώδες νάτριο, τόσο όσο χρειάζεται ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι τουλάχιστον 1%. Μια έκθεση σε υποχλωριώδες νάτριο 1% για 30 λεπτά, υπό κανονικές συνθήκες, είναι αρκετή για να γίνει μία αποτελεσματική απολύμανση. 6. Τυχόν χυμένα υγρά, δυνητικά μολυσματικά, πρέπει να καθαρίζονται αμέσως με απορροφητικό χαρτί και η επιφάνεια να απολυμαίνεται, για παράδειγμα με υποχλωριώδες νάτριο 1%, πριν να συνεχίσετε την διαδικασία ανάλυσης. Αν τα υγρά περιείχαν ένα οξύ, τότε στεγνώστε πολύ καλά την επιφάνεια πριν χρησιμοποιήσετε το υποχλωριώδες νάτριο. Όλα τα υλικά, που χρησιμοποιήθηκαν για να καθαριστούν τυχόν χυμένα υγρά, πρέπει να απορρίπτονται ως δυνητικά μολυσματικά απόβλητα. Μην βάζετε στον κλίβανο υλικά που περιέχουν υποχλωριώδες νάτριο. Οδηγίες για την ανάλυση 1. Πριν από την χρήση φέρτε τα αντιδραστήρια και τα δείγματα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (1830 C) Βάλτε και πάλι τα αντιδραστήρια στη συνιστώμενη θερμοκρασία αποθήκευσης, αμέσως μετά τη χρήση. Η σωστή θερμοκρασία είναι πολύ σημαντικός παράγοντας για την επώαση των ταινιών. Βεβαιωθείτε ό,τι ο θερμοστάτης δεν κατεβαίνει κάτω από τους 35 C και δεν ανεβαίνει πάνω από τους 39 C. Ανοίξτε την σακούλα με τις ταινίες (strip) αφού την έχετε αφήσει τουλάχιστον μισή ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 2. Μην χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια μετά την ημερομηνία λήξης τους. Να αποφεύγετε την μικροβιακή μόλυνση των αντιδραστηρίων γιατί αυτό έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της αποτελεσματικότητας του προϊόντος και μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. 3. Μην αλλάξετε την όλη Διαδικασία και μην αντικαταστήσετε τα αντιδραστήρια με άλλα διαφορετικής μάρκας ή με άλλα από διαφορετικές παρτίδες, εκτός και αν το αντιδραστήριο είναι κοινό σε όλες τις παρτίδες. Μην μειώνετε τον υποδεικνυόμενο χρόνο επώασης. 4. Όλος ο υάλινος εξοπλισμός πρέπει να απολυμαίνεται προσεκτικά με υδροχλωρικό οξύ 2M και να ξεπλένεται με αποσταγμένο ή με απιονισμένο νερό. 5. Μην εκθέτετε τα αντιδραστήρια σε ισχυρό φωτισμό ούτε σε υποχλωριώδεις ατμούς, τόσο κατά την αποθήκευσή τους όσο και κατά την επώασή τους. 6. Οι κυψελίδες δεν πρέπει να ξεραίνονται, κατά την διάρκεια των τεστ.

12 GK 12/16 7. Να αποφεύγετε την διασταυρούμενη μόλυνση μεταξύ των αντιδραστηρίων. Χρησιμοποιείτε πάντοτε τις ειδικές πιπέτες. 8. Μην ακουμπάτε το χείλος της κυψελίδας με το συζυγές. Μην φυσάτε πάνω στα μικροπλακίδια. 9. Οι ανοσοενζυμικές αναλύσεις μπορεί να παρουσιάσουν καμιά φορά στα άκρα ένα ειδικό φαινόμενο ("edge effect"), το οποίο μπορεί να ελαχιστοποιηθεί αυξάνοντας τον βαθμό υγρασίας κατά την επώαση. Τα πλακίδια πρέπει να καλύπτονται με το ειδικό κάλυμμα και να επωάζονται στους 37 C ή σε ζεστό υδατόλουτρο, τοποθετώντας τα πάνω σε ένα υποστήριγμα, ή στη συσκευή επώασης. Ως εναλλακτική λύση τα πλακίδια μπορεί να επωαστούν σε έναν κατάλληλο αναλύτη. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευτείτε το εγχειρίδιο χρήσης της συσκευής. Μην χρησιμοποιείτε συσκευές επώασης που λειτουργούν με CO Πριν από την ανάγνωση του πλακιδίου, βεβαιωθείτε ό,τι ο πυθμένας του είναι καθαρός και στεγνός και ό,τι δεν υπάρχουν φυσαλίδες αέρα στην επιφάνεια του υγρού. 11. Τα δείγματα που παρουσιάζουν ισχυρή αιμόλυση, οροί με ατελή πήξη, ή δείγματα που παρουσιάζουν μικροβιακή μόλυνση, μπορεί να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. 12. Η χρήση ενός κιτ με αυτόματες συσκευές, πρέπει να ελεγχθεί και να επικυρωθεί από τον χρήστη. 13. Διαβάστε με προσοχή το εγχειρίδιο χρήσης κάθε συσκευής που χρησιμοποιείτε, και ειδικά τα εξής σημεία: εγκατάσταση και ειδικές προδιαγραφέςi λειτουργική αρχή, οδηγίες, προφυλάξεις, κίνδυνοι προδιαγραφές του κατασκευαστή και λειτουργικές αποδόσεις της συσκευής συντήρηση και τεχνική υποστήριξη 7. ΕΙΔΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Το δείγμα αποτελείται από ορό που προέρχεται από αίμα που έχει συλλεχθεί με φλεβική λήψη και έχει περάσει από όλες τις διαδικασίες που προβλέπονται από τους βασικούς κανονισμούς των εργαστηρίων. Ο νωπός ορός μπορεί να διατηρηθεί για 4 ημέρες στους 2/8 C, ενώ για μεγαλύτερη χρονική περίοδο καταψύξτε στους 20 C. Το δείγμα μπορεί να αποψυχθεί το πολύ 3 φορές. Αποφεύγετε τη χρήση αυτοαποψυχόμενων ψυγείων για τη συντήρηση των δειγμάτων. Μετά από την απόψυξη και πριν να το ρίξετε στην κυψελίδα, ανακινήστε το καλά.. Η μικροβιακή μόλυνση μπορεί να επηρεάσει σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα του δείγματος, και να δώσει λανθασμένα αποτελέσματα. Δείγματα με ισχυρή αιμόλυση, με ίκτερο, λιπαιμικά ή μολυσμένα, δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Το τεστ δεν μπορεί να γίνει πάνω σε ανθρώπινο πλάσμα αίματος. 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Προετοιμάστε τις απαραίτητες ταινίες Προετοιμάστε το ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης αραιώνοντας το Wash Buffer 10x (100 ml ml H 2 O) Αφήστε μία κυψελίδα για το τυφλό δείγμα. Αραιώστε τα δείγματα σε αναλογία 1:301 μοιράζοντας 5 µl ορού σε 1,5 ml διαλύτη, μοιράστε 100 µl από κάθε αραιωμένο δείγμα σε δύο κυψελίδες τουλάχιστον και 100 µl Διαλύματος Ελέγχου Χαμηλής Avidity και 100 µl Διαλύματος Ελέγχου Υψηλής Avidity εις διπλούν. Καλύψτε τις κυψελίδες με προστατευτικό κάλυμμα και επωάστε για 60' σε 37 C. Μετά από 4 εκπλύσεις διάρκειας 30" η κάθε μία (300 µl), ρίξτε σε μία κυψελίδα, τόσο των δειγμάτων όσο και των διαλυμάτων ελέγχου, το Wash Buffer και στην άλλη το Ρυθμιστικό Διάλυμα Avidity και επωάστε για 10' σε 37 C. Αφαιρέστε το ρυθμιστικό διάλυμα με αναρρόφηση και κάνετε 4 εκπλύσεις των 30". Προσθέστε 100 µl συζυγούς σε κάθε κυψελίδα και επωάστε και πάλι για 45' στους 37 C, σκεπάζοντας και πάλι τις κυψελίδες με το προστατευτικό κάλυμμα. Κάνετε στη συνέχεια 4 εκπλύσεις, όπως περιγράφηκε προηγούμενα και στη συνέχεια προσθέστε το Υπόστρωμα 100 µl/κυψελίδα καθώς και σε εκείνη του τυφλού δείγματος. Μετά από 15' σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, διακόψτε την ενζυμική αντίδραση με 100 µl Stop Solution. Διαβάστε την Ο.Π. στα 450 nm ή στα 450/620 nm μέσα σε 30'. 9. ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ STEP 1 STEP 2 STEP 3 Βάλτε 100 µl di αραιωμένου δείγματος /διαλύματος ελέγχων εις διπλούν στις κυψελίδες της ταινίας. Επωάστε 60 λεπτά στους 37 C Κάνετε 4 εκπλύσεις (300 µl) Για κάθε δείγμα/ διάλυμα ελέγχου, ρίξτε στη μία κυψελίδα 100 µl Wash Buffer και στην άλλη κυψελίδα 100 µl Ρυθμιστικό Διάλυμα Avidity, και επωάστε για 10' στους 37 C. Κάνετε 4 εκπλύσεις (300 µl) Ρίξτε 100 µl συζυγούς σε κάθε κυψελίδα

13 GK 13/16 STEP 4 STEP 5 Επωάστε 45 λεπτά στους 37 C Κάνετε 4 εκπλύσεις Ρίξτε 100 µl Υποστρώματος σε κάθε μία κυψελίδα, συμπεριλαμβανομένης και εκείνης του τυφλού Επωάστε για 15 σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Προσθέστε 100 µl Stop Solution Διαβάστε την Ο.Π. στα 450 nm μέσα σε 30 λεπτά. 10. ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΤΕΣΤ Η Ο.Π. του τυφλού δείγματος πρέπει να είναι Οι οροί ελέγχου υψηλής και χαμηλής avidity στις κυψελίδες που έχουν επωαστεί με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης (Wash Buffer) πρέπει να έχουν Ο.Π. > Το ποσοστό avidity του ορού ελέγχου χαμηλής avidity πρέπει να είναι μικρότερο από 35%, ενώ το ποσοστό avidity του ορού ελέγχου υψηλής avidity πρέπει να είναι μεγαλύτερο από 50%, εφόσον έχουν υπολογιστεί όπως περιγράφεται στην ενότητα «Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμασίας». 11. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΤΕΣΤ Το ποσοστό avidity των δειγμάτων εκφράζεται και υπολογίζεται από το λόγο οπτικής πυκνότητας της κυψελίδας με ρυθμιστικό διάλυμα Avidity και της κυψελίδας με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης, αφού αφαιρεθεί η τιμή τυφλού δείγματος και από τις δύο αυτές τιμές. Ο.Π. ρυθμιστικού διαλύματος Avidity Ο.Π. τυφλού Ο.Π. ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης Ο.Π. τυφλού x 100 = % Avidity Αν αυτός ο λόγος είναι μεγαλύτερος από 40%, υποδεικνύει παρουσία IgG έναντι CMV με υψηλή avidity, ενώ όταν είναι μικρότερος από 30% υποδεικνύει παρουσία IgG έναντι CMV με χαμηλή avidity. Όταν το ποσοστό είναι μεταξύ 30% και 40%, υποδεικνύεται παρουσία IgG έναντι CMV μέτριας avidity (οριακό). Σε αυτή την περίπτωση, το αποτέλεσμα της δοκιμασίας θεωρείται διφορούμενο. Ο υπολογισμός μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο για δείγματα που έχουν Ο.Π. στην κυψελίδα που έχει εκπλυθεί με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης Προειδοποίηση: Αν η Ο.Π. της κυψελίδας αναφοράς είναι μεγαλύτερη από 2.000, επαναλάβετε τη δοκιμασία αραιώνοντας κατά 1/1000. Αν η Ο.Π. της κυψελίδας αναφοράς είναι < 0.400, επαναλάβετε τη δοκιμασία αραιώνοντας το δείγμα κατά 1/101. Αν το αποτέλεσμα υποδεικνύει μέτρια avidity, επαναλάβετε τη δοκιμασία. Σε κάθε περίπτωση, συνιστάται να επαναλάβετε τη δοκιμασία μετά από 23 εβδομάδες, ώστε να εκτιμηθεί ενδεχόμενη μεταβολή της avidity. 12. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ Η παρουσία IgG υψηλής λειτουργικής συγγένειας (avidity) (ειδικά σε άτομα που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση), παρά το γεγονός ότι δεν αποκλείει πρόσφατη λοίμωξη, αποτελεί ισχυρή ένδειξη λοίμωξης από Κυτταρομεγαλοϊού τουλάχιστον 5 μήνες πριν. Αντιθέτως, η παρουσία IgG χαμηλής λειτουργικής συγγένειας αποτελεί ισχυρή ένδειξη λοίμωξης τους 4 προηγούμενους μήνες. Στα νεογνά μία χαμηλή τιμή της avidity δεν είναι δείγμα οξείας λοίμωξης σε εξέλιξη. Το αποτέλεσμα του τεστ πρέπει ωστόσο να συνεκτιμηθεί μαζί με τα δεδομένα που προέρχονται από το ιστορικό του ασθενή ή/και από άλλες διαγνωστικές αναλύσεις. 13. ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Κατά τη διάρκεια εξωτερικού πειραματισμού, αναλύθηκαν 100 οροί με δύο κιτ της αγοράς, για τον προσδιορισμό των IgG και των IgM αντικυτταρομεγαλοϊού. Τα κλινικά συμπτώματα όλων των ασθενών ήταν γνωστά. Το ποσοστό % της υπολογισμένης avidity συσχετίστηκε με την φάση της λοίμωξης. Από τους 100 ορούς που αναλύθηκαν, 14 προέρχονταν από ασθενείς με οξεία λοίμωξη, 15 προέρχονταν από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση (7 με οξεία λοίμωξη) και οι υπόλοιποι οροί από ασθενείς με προγενέστερες λοιμώξεις.

14 GK 14/16 Το ποσοστό % της υπολογισμένης avidity στους 14 ασθενείς με οξεία λοίμωξη, κυμαινόταν από 6 το κατώτερο μέχρι 3540 το ανώτερο (πρωτογενείς λοιμώξεις προχωρημένης μορφής), ενώ στις προγενέστερες λοιμώξεις η avidity κυμαινόταν από 50 μέχρι 100 (μεγαλύτερη ή ίση με 70 στο 61% των περιπτώσεων). Οι ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση έδειχναν υψηλές τιμές avidity. Το αποτέλεσμα αλλοιώθηκε επειδή είχαν χορηγηθεί γσφαιρίνες, διαδικασία πολύ κοινή σε ασθενείς αυτής της κατηγορίας. 14. ΑΚΡΙΒΕΙΑ Πίν.1 Ακρίβεια κατά την ανάλυση (n=6) Δείγμα % Μέσης Avidity D.S. CV% Χαμηλή Avidity Υψηλή Avidity Πίν.2 Ακρίβεια μεταξύ αναλύσεων Δείγμα % Μέσης Avidity D.S. CV% S S S ΟΔΗΓΟΣ ΕΠΙΛΥΣΗΣ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΠΙΘΑΝΗ ΑΙΤΙΑ ΤΟΥ ΣΦΑΛΜΑΤΟΣ ΤΙ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΚΑΝΕΤΕ Κύκλος ανάλυσης άκυρος (όλα αρνητικά) Κύκλος ανάλυσης άκυρος (όλα θετικά) Δεν προστέθηκαν ένα ή περισσότερα αντιδραστήρια ή προστέθηκαν σε λανθασμένη σειρά. Το πλακίδιο δεν αντιδρά Μόλυνση του υποστρώματος Ανεπαρκής έκπλυση Χαμηλό επίπεδο ακρίβειας Ανεπαρκής αναρρόφηση των κυψελίδων Ανεπαρκής θερμοκρασία Λανθασμένη αναρρόφηση Τα αντιδραστήρια τοποθετούνται με πολύ αργό ρυθμό Υπάρχουν φυσαλίδες αέρα Η οπτική διαδρομή δεν είναι διαυγής Λανθασμένος ο χρόνος ή η θερμοκρασία της επώασης Η ποσότητα του υποστρώματος που έχει προστεθεί, δεν είναι αρκετή. Ελέγξτε και πάλι την όλη διαδικασία. Ελέγξτε μήπως δεν έχει προστεθεί κάποιο αντιδραστήριο. Επαναλάβατε το τεστ. Ελέγξτε των κωδικό στον φάκελο του πλακιδίου (βλ. οδηγίες χρήσης σημείο 4 περί λανθασμένου κωδικού). Ελέγξτε αν υπάρχουν ίχνη υγρασίας στο πλακίδιο που δεν αντιδρά. ( Η γέλη πυριτίας πρέπει να έχει χρώμα κίτρινο ώχρα). Επαναλάβατε το τεστ.. Πάρτε μία νέα ποσότητα υποστρώματος Βεβαιωθείτε ό,τι η συσκευή έκπλυσης λειτουργεί σωστά. Βεβαιωθείτε ό,τι η συσκευή έκπλυσης λειτουργεί σωστά Ελέγξτε τη λειτουργία της πιπέτας. Να αποφεύγετε την ξήρανση του πλακιδίου μετά την έκπλυση. Προσθέστε αμέσως τα αντιδραστήρια Να αποφεύγετε τον σχηματισμό φυσαλίδων κατά την αναρρόφηση. Ελέγξτε αν η φωτεινή πηγή είναι καθαρή. Καθαρίστε το πλακίδιο με ένα χαρτομάντιλο Ελέγξτε τον θερμοστάτη και τον χρόνο επώασης. Ακολουθήστε πιστά τις οδηγίες χρήσης Ελέγξτε τη λειτουργία της πιπέτας

15 GK 15/ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. L. GrangeotKeros, M.J. Mayaux, P. Lebon et al. Value of CMV IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Inf. Dis. 175: 944 (1997). 2. N.K. Blackburn, T.G. Besselaar et al. Differentiation of primary cytomegalovirus infection from reactivation using the urea denaturation test for measuring antibody avidity. J. Med. Virol. 33: 6 (1991). 3. G.B. Wisdom. Enzymeimmunoassay. Clin. Chem. 22: 1243 (1976). 4. H.E. Prince, M. LapèNixon Role of Cytomegalovirus (CMV) IgG Avidity testting in diagnosing primary CNV infection during pregnancy. Clinical and Vaccine Immunology 21: 10 (2014),

16 16/16 Date of manufacture Fecha de fabricación Data di fabbricazione Date de fabrication Ημερομηνία Παραγωγής Data de fabrico Use By Fecha de caducidad Utilizzare entro Utiliser jusque Ημερομηνία λήξης Prazo de validade Caution,consult accompanying documents Atención,ver instrucciones de uso Attenzione, vedere le istruzioni per l'uso Manufacturer Fabricante Fabbricante Contains sufficient for <n> tests Contenido suficiente para <n> ensayos Contenuto sufficiente per "n" saggi Attention voir notice d'instructions Προειδοποίηση, συμβουλευτείτε τα συνοδά έντυπα Atenção, consulte a documentação incluída Fabricant Κατασκευαστής Fabricante Contenu suffisant pour "n"tests Περιεχόμενο επαρκές για «ν» εξετάσεις Conteúdo suficiente para n ensaios Temperature limitation Límite de temperatura Limiti di temperatura Limites de température Περιορισμοί θερμοκρασίας Limites de temperatura Consult Instructions for Use Consulte las instrucciones de uso Consultare le istruzioni per l'uso Consulter les instructions d'utilisation Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Consulte as instruções de utilização Biological risks Riesgo biológico Rischio biologico Risques biologiques Βιολογικοί κίνδυνοι Risco biológico Catalogue number Número de catálogo Numero di catalogo Référence du catalogue Αριθμός καταλόγου Referência de catálogo In Vitro Diagnostic Medical Device Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositivo medicodiagnostico in vitro Dispositif médical de diagnostic in vitro In Vitro Διαγνωστικό Ιατροτεχνολογικό προϊόν Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Batch code Código de lote Codice del lotto Code du lot Αριθμός Παρτίδας Código do lote Diesse Diagnostica Senese Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Italy Tel