PapilloCheck PapilloCheck high-risk

Transcript

1 Η υγεία στα χέρια σας HPV DNA-Chip PapilloCheck PapilloCheck high-risk Οδηγίεςχρήσης Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 (PapilloCheck ) ή 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (PapilloCheck high-risk) σε τραχηλικά δείγματα Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Κατασκευάζεται στην Αυστρία ΚΙΝΔΥΝΟΣ 60

2 ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣΠΝΕΥΜΑΤΙΚΩΝΔΙΚΑΙΩΜΑΤΩΝ ΟδηγίεςχρήσηςκιτδοκιμασίαςPapilloCheck Η υγεία στα χέρια σας Copyright 2015 by Greiner Bio-One,, Τηλέφωνο: +49 (0) , Φαξ +49 (0) Σημείωση Με επιφύλαξη κάθε νόμιμου δικαιώματος. Οι πληροφορίες του παρόντος εγγράφου υπόκεινται σε τροποποίηση ανά πάσα στιγμή χωρίς προηγούμενη ειδοποίηση. Η αντιγραφή ή επανέκδοση του παρόντος εγγράφου με οποιονδήποτε τρόπο και σε οποιαδήποτε μορφή απαγορεύεται χωρίς την έγγραφη άδεια της Greiner-Bio-One GmbH. Δικαίωμαεμπορικούσήματος Οι χρησιμοποιούμενες επωνυμίες και οι ετικέτες αποτελούν ιδιοκτησία των αντίστοιχων κατόχων τους. Σημαντικέςπληροφορίεςγιατοχρήστη Για την ορθή χρήση του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck είναι σημαντικό ο χρήστης να διαβάσει προσεκτικά και να ακολουθεί τις οδηγίες αυτού του εγχειριδίου. Ο κατασκευαστής δεν αναλαμβάνει καμία ευθύνη για οποιαδήποτε χρήση αυτού του συστήματος δοκιμής η οποία δεν περιγράφεται στο παρόν έγγραφο και για τυχόν τροποποιήσεις του συστήματος δοκιμής από το χρήστη. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗΧΡΗΣΗ Το PapilloCheck είναι ένα διαγνωστικό κιτ και προορίζεται για χρήση στην ποιοτική ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου 24 τύπων του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων σε παρασκευές DNA από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα. Το κιτ προορίζεται για χρήση μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Το PapilloCheck high-risk είναι ένα διαγνωστικό κιτ και προορίζεται για χρήση στην ποιοτική ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου 14 τύπων υψηλού κινδύνου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (hrhpv) σε παρασκευές DNA από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα. Το κιτ προορίζεται για χρήση μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Το PapilloCheck πληροί τις προϋποθέσεις της Οδηγίας για τα ιατροτεχνολογικά βοηθήματα που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση (98/79/ΕΚ) και, επομένως, φέρει τη σήμανση συμμόρφωσης "CE". Οποιοδήποτε διαγνωστικό αποτέλεσμα παράγεται με τη χρήση του PapilloCheck θα πρέπει να ερμηνεύεται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. Τα κιτ δοκιμασίας PapilloCheck προορίζονται μόνο για εργαστηριακή χρήση, όχι για φαρμακευτικούς, οικιακούς ή άλλους σκοπούς. Αυτά τα προϊόντα προορίζονται αποκλειστικά για επαγγελματίες χρήστες, όπως ιατροτεχνίτες και ιατρούς, που έχουν εκπαιδευτεί στις τεχνικές της μοριακής βιολογίας. Εφόσον δεν υποδεικνύεται διαφορετικά, στις παρούσες οδηγίες χρήσης η ονομασία PapilloCheck χρησιμοποιείται και για τις δύο παραλλαγές, PapilloCheck και PapilloCheck high-risk. 2

3 Η υγεία ΓΛΩΣΣΑΡΙΟΣΥΜΒΟΛΩΝ στα χέρια σας el Κωδικός παρτίδας Να μην επαναχρησιμοποιηθεί IVD Ανάλωση έως την ημερομηνία λήξης Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης! Αριθμός καταλόγου Κατασκευαστής Μην χρησιμοποιείτε εάν η συσκευασία είναι κατεστραμμένη Όριο θερμοκρασίας Περιέχει επαρκές υλικό για <n> δοκιμασίες Εικονογράμματα GHS με τις προειδοποιητικές λέξεις ΚΙΝΔΥΝΟΣ ή ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ el Σήματα CE In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή Φυλάσσετε σε σκοτεινό μέρος Σημαντική σημείωση 3

4 Η υγεία ΠΙΝΑΚΑΣΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ στα χέρια σας 1. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑΚΙΤ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑΑΝΑΛΩΣΙΜΑ,ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣΚΑΙΥΛΙΚΟ ΜΕΤΑΦΟΡΑΚΑΙΦΥΛΑΞΗ ΟΔΗΓΙΕΣΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΑΠΟΡΡΙΨΗΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικάενημερωτικάστοιχεία ΤύποιτουHPVπουανιχνεύονταιμετοPapilloCheck Αρχήτηςδοκιμής ΣχεδίασητουτσιπPapilloCheck Διάταξη τσιπ PapilloCheck Μάρτυρες επάνω στο τσιπ ΟΔΗΓΙΕΣΓΙΑΤΗΡΟΗΕΡΓΑΣΙΩΝΤΟΥPAPILLOCHECK Γενικέςοδηγίες Διαχωρισμόςαιθουσών Προειδοποιήσειςκαιπροφυλάξεις Αποτροπή μόλυνσης Οδηγίες για το χειρισμό των τσιπ Γενικές προφυλάξεις Ασφάλεια κατά την εργασία ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑPAPILLOCHECK ΣυλλογήδειγμάτωνκαιεξαγωγήDNA Συλλογή δειγμάτων Εξαγωγή DNA Αλυσιδωτήαντίδρασηπολυμεράσης(PCR) Προετοιμασία συσκευής θερμικού κύκλου Κατεργασία oυρακίλης-n-γλυκοσυλάσης (UNG) Προετοιμασία αντίδρασης PCR Υβριδισμόςκαιπλύση Προετοιμασία και διευθέτηση Υβριδισμός Πλύση και στέγνωμα ΣάρωσηκαιαξιολόγησητουτσιπPapilloCheck ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΗΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ

5 Η υγεία στα χέρια σας 11.ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑΑΠΟΔΟΣΗΣΤΟΥPAPILLOCHECK ΑναλυτικήαπόδοσητουPapilloCheck Αναλυτική ευαισθησία Αναλυτική ειδικότητα τύποι HPV Αναλυτική ειδικότητα Οργανισμοί μη-hpv Επαναληπτικότητα(Ενδοεργαστηριακήαναπαραγωγιμότητα) Αναπαραγωγιμότητα Ευρωστία ΚλινικήαπόδοσητουPapilloCheck ΒΡΑΧΥΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟPAPILLOCHECK Αίθουσα2:PCR-Προετοιμασίατουμείγματοςαντίδρασης Αίθουσα2:PCR-ΠροσθήκηεκχυλισμένουDNA/αντίδρασηPCR Αίθουσα3:Υβριδισμός-Προετοιμασία/αντίδρασηυβριδισμού Αίθουσα3:Πλύσηκαιτοστέγνωμα/Σάρωση καιαξιολόγηση

6 Η υγεία 1. στα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑΚΙΤ χέρια σας Κιτ δοκιμασίαςpapillocheck και PapilloCheck high-risk 1 Περιεχόμενα Ποσότητα PapilloCheck (ΚΩΔ ) PapilloCheck PCR MasterMix 5 x PapilloCheck PCR MasterMix 2 5 x 300 µl Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών PapilloCheck, 5 x 12 Διατάξεις 1 x Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών PapilloCheck με 5 τσιπ PapilloCheck 3 σε 12 διατάξεις, για 60 δείγματα 1 Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού PapilloCheck 2 x Ρυθμιστικά διαλύματα υβριδισμού PapilloCheck 2 x µl Συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος Α PapilloCheck Συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος Β PapilloCheck 2 x Συμπυκνώματα ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης Α PapilloCheck 1 x Συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης Β PapilloCheck 2 x 40 ml 1 x 15 ml Φυλλάδιο Λήψη των οδηγιών χρήσης 1 PapilloCheck high-risk(κωδ ) PapilloCheck high-risk PCR MasterMix 5 x PapilloCheck high-risk PCR MasterMix 5 x 300 µl Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών PapilloCheck high-risk, 5 x 12 Διατάξεις Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού PapilloCheck high-risk Συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος Α PapilloCheck high-risk Συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος Β PapilloCheck high-risk 1 x Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών PapilloCheck high-risk με 5 τσιπ PapilloCheck high-risk 3 σε 12 διατάξεις, για 60 δείγματα 2 x Ρυθμιστικά διαλύματα υβριδισμού PapilloCheck high-risk 2 x Συμπυκνώματα ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης Α PapilloCheck high-risk 1 x Συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης Β PapilloCheck high-risk 1 2 x µl 2 x 40 ml 1 x 15 ml Φυλλάδιο Λήψη των οδηγιών χρήσης 1 1 Ένα κιτ δοκιμασίας PapilloCheck ή PapilloCheck high-risk επαρκεί για την ανάλυση 60 δειγμάτων. 2 Περιέχει όλα τα στοιχεία που απαιτούνται για την PCR εκτός από πολυμεράση Taq DNA και ουρακίλη-ν-γλυκοσυλάση. 3 Ένα τσιπ PapilloCheck περιέχει 12 μικροδιατάξεις PapilloCheck. Στο πλαίσιο αυτών των οδηγιών χρήσης οι λέξεις τσιπ και Maybachstr. αντικειμενοφόρος 2 πλάκα είναι συνώνυμες. 6

7 Η υγεία 2. στα ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑΑΝΑΛΩΣΙΜΑ,ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣΚΑΙΥΛΙΚΟ χέρια σας Το PapilloCheck συνιστάται για χρήση σε συνδυασμό με τα αναγραφόμενα αναλώσιμα, τον εξοπλισμό και το υλικό, και μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Αναλώσιμα GreinerBio-One-Αρ.Κατ. Ποσότητα Κιτ δοκιμασίας PapilloCheck 1 κιτ για 60 αντιδράσεις Κιτ δοκιμασίας PapilloCheck high-risk κιτ για 60 αντιδράσεις Κιτ συλλογής PapilloCheck κιτ για 50 δείγματα Κιτ εξαγωγής DNA ocheck / Παρασκευή με μία στήλη κιτ για 50 παρασκευές Αποστειρωμέναρύγχηφίλτρουμικροπιπέτας ελεύθερααπόdnase 4 0,5 µl - 10 µl 0,5 µl - 20 µl 10 µl - 100µL 10µL µl 100 µl µl Σωληνάριο πολυπροπυλενίου 50 ml 5 Σωληνάριο αντίδρασης 1,5 ml Πλαστικέςπιπέτεςγιααυτόματηπιπέτα Πιπέτα 10 ml Πιπέτα 25 ml Πιπέτα 50 ml ή ή ή /960 96/960 96/960 96/960 60/600 25/ /4000 1/200 1/200 1/200 4 Ορισμένα από τα αναφερόμενα μεγέθη ρυγχών είναι προαιρετικά ανάλογα με τις διαθέσιμες μικροπιπέτες. 5 Απαιτείται μόνο εάν δεν υπάρχει διαθέσιμη φυγοκέντριση αντικειμενοφόρων πλακών. 7

8 Η υγεία στα χέρια σας Αναλώσιμα GreinerBio-One-Αρ.Κατ. Ποσότητα CheckScanner Βασικό λογισμικό CheckReport Software Προσθήκη λογισμικού CheckReport Software PapilloCheck Προσθήκη λογισμικού CheckReport Software PapilloCheck high-risk Σύστημα υπολογιστή με λογισμικό CheckReport Software και προσθήκη PapilloCheck ή PapilloCheck high-risk Πακέτο εκκίνησης CheckScanner (CheckScanner, σύστημα υπολογιστή, λογισμικό CheckReport Software, προσθήκη PapilloCheck ή PapilloCheck high-risk) Θάλαμος υβριδισμού με θήκη αντικειμενοφόρων πλακών ocheck Μαγνητική λαβή θήκης αντικειμενοφόρων πλακών Πλαίσιο πλύσης ocheck Απαιτούμεναένζυμα Πολυμεράση Taq: Πολυμεράση DNA HotStarTaq 5 U/µl (Qiagen, , , , ) Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση: Ουρακίλη-DNA γλυκοσυλάση 1 U/µl (Thermo Scientifi c, αρ. EN0361, αρ. EN0362) Πρόσθετααπαιτούμενααναλώσιμα Νερό βαθμού PCR Αποσταγμένο νερό Γάντια μίας χρήσης DNA Away (Thermo Scientifi c, αρ. 7008, αρ. 7009, αρ. 7010) Χρησιμοποιείτε μόνο κατάλληλες και συμβατές με την PCR ταινίες 8 σωληναρίων, μονά σωληνάρια ή πλάκες που συνιστώνται από τον κατασκευαστή της χρησιμοποιούμενης συσκευής θερμικού κύκλου. Για τη βελτιστοποίηση της ροής εργασιών συνιστάται η χρήση ταινιών 8 σωληναρίων. Πρόσθετοςαπαιτούμενοςεξοπλισμός Μικροφυγόκεντρος για σωληνάρια αντίδρασης 1,5 και 2 ml Φυγόκεντρος για σωληνάρια πολυπροπυλενίου 50 ml Μικροφυγόκεντρος για μονά σωληνάρια αντίδρασης 0,2 ml ή ταινίες PCR 8 σωληναρίων Συσκευή θερμικού κύκλου PCR: Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH) Υδατόλουτρο (50 C) Μικροπιπέτες (διαφορετικά εύρη από μl) Πολυπιπέτα 8 καναλιών (εύρος: 5-50 μl), π.χ. Brand Transferpette -8 (Brand) Αυτόματη πιπέτα για γυάλινες και πλαστικές πιπέτες Αναδευτήρας τύπου Vortex Στατώ για διάφορα σωληνάρια αντίδρασης Χρονόμετρο Δοχείο αποβλήτων Πρόσθετο απαιτούμενο υλικό Υπολογιστής (για τις απαιτήσεις συστήματος ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης του CheckScanner και το λογισμικό CheckReport Software) 6 Για τη διαδικασία πλύσης του PapilloCheck απαιτούνται τρία πλαίσια πλύσης ocheck. 8

9 Η υγεία 3. στα ΜΕΤΑΦΟΡΑΚΑΙΦΥΛΑΞΗ χέρια σας Η μεταφορά του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Παρόλα αυτά, το κιτ πρέπει να φυλάσσεται αμέσως μετά την παραλαβή στους 4 έως και θα πρέπει να προστατεύεται από το φως. Φυλάσσετε πάντα το κουτί αντικειμενοφόρων πλακών με τα τσιπ PapilloCheck σε κλειστό ασκό με φερμουάρ που περιέχει αφυγραντικό υλικό. Όλα τα στοιχεία πρέπει να αποθηκεύονται στην αρχική συσκευασία του κιτ για την αποφυγή ανάμειξης των παρτίδων. Εφόσον φυλάσσεται σωστά, το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck και τα στοιχεία του μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέχρι την υποδεικνυόμενη ημερομηνία λήξης. Επιπλέον, υπό αυτές τις συνθήκες, η διάρκεια ζωής του δεν αποκλίνει από την ημερομηνία λήξης όταν ανοιχτεί το κιτ και τα στοιχεία του για πρώτη φορά. Η φύλαξη του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck στους 4 έως ενδέχεται να οδηγήσει σε ίζημα αλάτων στο Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού και το Ρυθμιστικό διάλυμα Β. Τα ιζήματα πρέπει να διαλύονται πριν τη χρήση μέσω εξισορρόπησης σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 25 C) και ανάμειξης και ανάδευσης του σωληναρίου/της φιάλης. Προϊόν Κιτ δοκιμασίας PapilloCheck Κιτ δοκιμασίας PapilloCheck high-risk Αποθήκευση 4 έως, προστατευμένο από το φως 4 έως, προστατευμένο από το φως 9

10 Η υγεία 4. στα ΟΔΗΓΙΕΣΑΣΦΑΛΕΙΑΣ χέρια σας Το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck προορίζεται μόνο για εργαστηριακή χρήση, όχι για φαρμακευτικούς, οικιακούς ή άλλους σκοπούς. Τα τσιπ DNA πρέπει να χρησιμοποιούνται σε περιβάλλον χωρίς σκόνη. Η εναπόθεση σκόνης και άλλων σωματιδίων στις αντικειμενοφόρες πλάκες ενδέχεται να οδηγήσει σε παραγωγή μη ικανοποιητικών ή μη έγκυρων αποτελεσμάτων.! Να φοράτε πάντα κατάλληλη εργαστηριακή ρόμπα, αναλώσιμα γάντια και προστατευτικά γυαλιά, και να ακολουθείτε τις οδηγίες ασφαλείας που δίνονται σε αυτή την ενότητα. Στοιχείασχετικάμετιςκανονιστικέςδιατάξεις: Τα ακόλουθα στοιχεία του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck περιέχουν επιβλαβείς ή επικίνδυνες ουσίες: Στοιχείοκιτ Ποσότητα επικίνδυνων ουσιών Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού PapilloCheck, θειοκυανική γουανιδίνη, 20-60%, αρ. CAS Ταξινόμηση σύμφωναμε τονκανονισμό (ΕΚ) αριθ.1272/2008 Οξεία τοξικότητα, από στόματος (κατηγορία 4), οξεία τοξικότητα, εισπνοή (κατηγορία 4), χρόνια τοξικότητα για το υδάτινο περιβάλλον (κατηγορία 3), διαβρωτική για το δέρμα (κατηγορία 1c) Εικονόγραμμα και προειδοποιητική λέξηghs ΚΙΝΔΥΝΟΣ H302 H332 H314 H412 P273 P280 P305+ P351+P338 EUH032 Δηλώσειςεπικινδυνότηταςκαιπροφυλάξεων Επιβλαβές σε περίπτωση κατάποσης. Επιβλαβές σε περίπτωση εισπνοής. Προκαλεί σοβαρά δερματικά εγκαύματα και οφθαλμικές βλάβες. Επιβλαβές για τους υδρόβιους οργανισμούς, με μακροχρόνιες επιπτώσεις. Να αποφεύγεται η ελευθέρωση στο περιβάλλον. Να φοράτε προστατευτικά γάντια/ προστατευτικά ενδύματα/ μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια / πρόσωπο. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Συμπληρωματικές πληροφορίες κινδύνου (ΕΕ): Σε επαφή µε οξέα ελευθερώνονται πολύ τοξικά αέρια. Ρυθμιστικό διάλυμα Β PapilloCheck, δωδεκυλοθειικό νάτριο, < 20%, αρ. CAS Ερεθισμός του δέρματος (κατηγορία 2), σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορία 1) ΚΙΝΔΥΝΟΣ H315 H318 P280 P305+ P351+P338 Προκαλεί ερεθισμό του δέρματος. Προκαλεί σοβαρή οφθαλμική βλάβη. Να φοράτε προστατευτικά ενδύματα/ μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια / πρόσωπο. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Μπορείτε να λάβετε την τρέχουσα έκδοση του Δελτίου δεδομένων ασφαλείας για αυτό το προϊόν από τον δικτυακό τόπο της Greiner Bio-One: Know-How&Services Download-Center 10

11 Η υγεία 5. στα ΑΠΟΡΡΙΨΗΑΠΟΒΛΗΤΩΝ χέρια σας Μετά την πλύση και το στέγνωμα του τσιπ του PapilloCheck, μπορείτε να απορρίψετε τα διαλύματα πλύσης I και II χωρίς ειδικές προφυλάξεις. Απορρίπτετε το χρησιμοποιημένο τσιπ, τα μη χρησιμοποιημένα στοιχεία του κιτ, καθώς και το μη χρησιμοποιημένο μείγμα υβριδισμού PapilloCheck με τα χημικά εργαστηριακά απόβλητα. Τηρείτε όλους τους εθνικούς, κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς σχετικά με την απόρριψη. 11

12 Η υγεία 6. στα ΕΙΣΑΓΩΓΗ χέρια σας 6.1 Γενικάενημερωτικάστοιχεία Η επίμονη λοίμωξη από τον καρκινογόνο ανθρώπινο ιό των θηλωμάτων (HPV) βρίσκεται σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις στον καρκίνο του τραχήλου τη δεύτερη συνηθέστερη μορφή καρκίνου στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο 7. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότεροι από 100 τύποι του HPV, εκ των οποίων 40 τύποι περίπου είναι σεξουαλικά μεταδιδόμενοι και μολύνουν τη γεννητική βλεννογόνο. Οι τραχηλικοί τύποι του HPV ταξινομούνται τόσο στην ομάδα υψηλού κινδύνου (HPV υψηλού κινδύνου, hrhpv) όσο και χαμηλού κινδύνου (HPV χαμηλού κινδύνου, lrhpv). Ενώ οι τύποι HPV υψηλού κινδύνου σχετίζονται με έναν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του τραχήλου, οι τύποι HPV χαμηλού κινδύνου προκαλούν κυρίως καλοήθη οξυτενή κονδυλώματα 8. Ωστόσο, ακόμη και στην ομάδα υψηλού κινδύνου, ο σχετικός κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου ή τραχηλικών ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων (CIN) εξαρτάται από τον τύπο 9. Το 70% περίπου όλων των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου συνδέονται με μια επίμονη λοίμωξη από τον τύπο HPV 16 ή 18. Οι συνηθέστεροι τύποι χαμηλού κινδύνου είναι οι HPV 6 και 11. Δεδομένης της σχεδόν απόλυτα αιτιολογικής σχέσης μεταξύ του καρκινογόνου HPV και του καρκίνου του τραχήλου, η δοκιμασία για hrhpv θεωρείται πλέον μέρος του βασικού ελέγχου για καρκίνο του τραχήλου ΤύποιτουHPVπουανιχνεύονταιμετοPapilloCheck Το PapilloCheck επιτρέπει την ταυτοποίηση 18 τύπων υψηλού κινδύνου και 6 τύπων χαμηλού κινδύνου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) (Πίνακας 1), ενώ το PapilloCheck highrisk επιτρέπει την ταυτοποίηση 14 τύπων υψηλού κινδύνου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (hrhpv) (Πίνακας 2). Πίνακας 1: Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το PapilloCheck HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 HPV 18 HPV 51 HPV 66 HPV 11 HPV 31 HPV 52 HPV 68 HPV 40 HPV 33 HPV 53 HPV 70 HPV 42 HPV 35 HPV 56 HPV 73 HPV 43 HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 / HPV 55* * Το PapilloCheck δεν επιτρέπει διαφοροποίηση μεταξύ του HPV 44 και του HPV 55. Πίνακας 2: Τύποι του hrhpv που ανιχνεύονται με το PapilloCheck high risk HPV 16 HPV 51 HPV 18 HPV 52 HPV 31 HPV 56 HPV 33 HPV 58 HPV 35 HPV 59 HPV 39 HPV 66 HPV 45 HPV 68 7 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9., Sexually Transmitted Infections 76: Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16: Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 124(3):

13 Η υγεία 6.3 στα Αρχήτηςδοκιμής χέρια σας Το PapilloCheck είναι ένα κιτ δοκιμασίας που βασίζεται σε μικροδιάταξη για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου ενός κλάσματος του γονιδίου E1 του γονιδιώματος του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV). Η διαδικασία δοκιμής συνοψίζεται στην Εικόνα 1. Πριν από την ανάλυση PapilloCheck πρέπει να εκτελεστεί εξαγωγή DNA από ένα δείγμα τραχηλικού επιχρίσματος. Η συλλογή δειγμάτων και η εξαγωγή DNA δεν αποτελούν μέρος του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck. Διατίθενται επίσης ειδικά προϊόντα για τη συλλογή δείγματος (κιτ συλλογής PapilloCheck ) και την εξαγωγή DNA (κιτ εξαγωγής DNA ocheck ) από την Greiner Bio-One, και μπορείτε να τα προμηθευτείτε ξεχωριστά (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο κεφάλαιο 2). Μετά από την εξαγωγή του ιικού και ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA από ένα τραχηλικό δείγμα, ένα κλάσμα 350 bp του ιικού γονιδίου E1 ενισχύεται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) παρουσία ενός σετ HPV-ειδικών υγρών πλήρωσης. Στην ίδια αντίδραση, ένα κλάσμα του ανθρώπινου γονιδίου μονού αντιγράφου ADAT1 (ανθρώπινη trna-ειδική αδενοσίνη δεαμινάση1) ενισχύεται για την παρακολούθηση της παρουσίας ανθρώπινου υλικού δείγματος στο τραχηλικό δείγμα (μάρτυρας δείγματος) και ένας εσωτερικός εκχυλισμένος μάρτυρας που βρίσκεται στο PapilloCheck PCR MasterMix ενισχύεται για την παρακολούθηση της απόδοσης του PCR (μάρτυρας PCR). Επιπλέον, το PapilloCheck PCR MasterMix περιέχει dutp. Συνεπώς, μπορεί να εξαλειφθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης μεταφοράς από προηγούμενες αντιδράσεις PCR μέσω της χρήσης κατεργασίας ουρακίλης-ν-γλυκοσυλάσης (UNG) (βλ. κεφάλαιο 8.2.2). Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR υβριδοποιούνται σε ειδικούς ανιχνευτές DNA και σε μάρτυρες σε τσιπ που είναι συνδεδεμένοι στην επιφάνεια του τσιπ του PapilloCheck. Κάθε τσιπ περιέχει 12 DNAμικροδιατάξεις, που επιτρέπουν ταυτόχρονη ανάλυση 12 τραχηλικών δειγμάτων. Κατά τον υβριδισμό, το δεσμευμένο DNA επισημαίνεται με φθορισμό και το αδέσμευτο DNA αφαιρείται στα επόμενα βήματα πλύσης. Η αποτελεσματικότητα του υβριδισμού παρακολουθείται (μάρτυρας υβριδισμού). Τέλος, το τσιπ PapilloCheck σαρώνεται, αναλύεται και αξιολογείται αυτόματα χρησιμοποιώντας το CheckScanner και το λογισμικό CheckReport Software αντίστοιχα (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο κεφάλαιο 2). Το CheckScanner είναι ένας δίχρωμος σαρωτής λέιζερ (μήκη κύματος διέγερσης 532 nm και 635 nm), που επιτρέπει την ανίχνευση του σήματος φθορισμού που παράγεται από την παρουσία των HPV-ειδικών προϊόντων ενίσχυσης καθώς και των μαρτύρων (βλ. κεφάλαιο 6.4.2). Το λογισμικό CheckReport Software επιτρέπει την οπτικοποίηση, ανάλυση και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων και εμφανίζει αυτόματα τις αντίστοιχες τιμές τόσο των ανιχνευμένων τύπων HPV όσο και των μαρτύρων σε μια λεπτομερή αναφορά. Η αναφορά υποδεικνύει με σαφήνεια την παρουσία ή απουσία ενός ή περισσότερων από τους 24 τύπους HPV ή τους 14 τύπους hrhpv που είναι ανιχνεύσιμοι και οι περιεκτικοί μάρτυρες επάνω στο τσιπ καθιστούν την ανάλυση εξαιρετικά αξιόπιστη. 13

14 Η υγεία στα χέρια σας 1.ΑντίδρασηPCR 2.Υβριδισμός 3.Πλύσηκαιστέγνωμα ή 4.Σάρωσηκαιανάλυση Εικόνα 1: Διαδικασία δοκιμής PapilloCheck 1. Αντίδραση PCR: Μετά από την εξαγωγή DNA, ένα κλάσμα 350 bp του ιικού γονιδίου E1 και κλάσματα δύο στόχων μαρτύρων ενισχύονται με PCR. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ενίσχυσης υβριδοποιούνται σε συμπληρωματικούς ανιχνευτές DNA στο τσιπ. 2. Υβριδισμός: Κάθε τύπος HPV ανιχνεύεται από έναν ειδικό ανιχνευτή DNA που υπάρχει σε πέντε αντίγραφα. Κατά τον υβριδισμό εισάγεται η σήμανση φθορισμού. 3. Πλύση και στέγνωμα: Το αδέσμευτο DNA αφαιρείται στα επόμενα βήματα πλύσης. 4. Σάρωση και ανάλυση: Το τσιπ PapilloCheck σαρώνεται, αναλύεται και αξιολογείται χρησιμοποιώντας το CheckScanner και το λογισμικό CheckReport Software. Δημιουργείται μια αναφορά που υποδεικνύει σαφώς την παρουσία ή απουσία ενός ή περισσότερων από τους τύπους HPV που μπορούν να ανιχνευτούν. 14

15 Η υγεία 6.4 στα ΣχεδίασητουτσιπPapilloCheck χέρια σας ΔιάταξητσιπPapilloCheck Κάθε τσιπ PapilloCheck ή PapilloCheck περιέχει 12 μικροδιατάξεις που καθορίζονται ως βοθρίο A1 - B6. Σε κάθε βοθρίο εναποτίθεται σε κηλίδες μια μονή μικροδιάταξη αποτελούμενη από διαφορετικού ανιχνευτές. Κάθε μονή μικροδιάταξη οριοθετείται μέσω ενός υπερυψωμένου χείλους. Κάθε ανιχνευτής εναποτίθεται σε κηλίδες σε πέντε αντίγραφα. Η διάταξη της μικροδιάταξης απεικονίζεται στην Εικόνα 2. Οι περιγραφόμενοι μάρτυρες σε τσιπ αναλύονται περαιτέρω στο κεφάλαιο μάρτυρας προσανατολισμού μάρτυρας PCR α) κόκκινο κανάλι (635 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 β) μάρτυρας υβριδισμού μάρτυρας δείγματος μάρτυρας προσανατολισμού μάρτυρας PCR γ) πράσινο κανάλι (532 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 μάρτυρας υβριδισμού HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 μάρτυρας δείγματος Εικόνα 2: Σχεδίαση του τσιπ PapilloCheck α) Σχηματική αναπαράσταση του τσιπ PapilloCheck. β) και γ) Εικόνες του λογισμικού CheckReport Software για τα δύο διαφορετικά μήκη κύματος διέγερσης που χρησιμοποιούνται για τη σάρωση [β) κόκκινο κανάλι: 635 nm, γ) πράσινο κανάλι: 532 nm] και σχηματικές αναπαραστάσεις της διάταξης μικροδιατάξεων του PapilloCheck. Οι ειδικοί ανιχνευτές τύπου HPV και οι μάρτυρες επάνω στο τσιπ υποδεικνύονται. 15

16 Η υγεία στα χέρια σας Μάρτυρεςεπάνωστοτσιπ Η σχεδίαση του τσιπ DNA του PapilloCheck ενσωματώνουν περιεκτικούς μάρτυρες επάνω στο τσιπ. Πολλά συστήματα ελέγχου παρακολουθούν όλα τα κρίσιμα βήματα τόσο της δοκιμής όσο και της επεξεργασίας του τσιπ, συμπεριλαμβανομένης της ποιότητας δείγματος και της εξαγωγής DNA (μάρτυρας δείγματος), της ποιότητας της αντίδρασης PCR (μάρτυρας PCR), της αποτελεσματικότητας του υβριδισμού (μάρτυρας υβριδισμού), καθώς και της ομοιογένειας κηλίδων και της ποιότητας εκτύπωσης (μάρτυρας προσανατολισμού και μάρτυρας εκτύπωσης). Εκτός από την παρουσία ή απουσία των τύπων HPV, το λογισμικό CheckReport Software εμφανίζει αυτόματα τις αντίστοιχες τιμές των μαρτύρων και τους ανιχνευμένους τύπους HPV σε μια λεπτομερή αναφορά. Για τη μέτρηση των διαφόρων μαρτύρων χρησιμοποιούνται και τα δύο μήκη κύματος διέγερσης του CheckScanner. Για το μάρτυρα της απόδοσης της δοκιμής (μάρτυρας δείγματος και PCR), χρησιμοποιείται το κόκκινο κανάλι (μήκος κύματος διέγερσης 635 nm), ενώ η ποιότητα του υβριδισμού και του τσιπ (μάρτυρας υβριδισμού, προσανατολισμού και εκτύπωσης) αποτιμάται στο πράσινο κανάλι (μήκος κύματος διέγερσης 532 nm). Μάρτυραςδείγματος Το PapilloCheck παρακολουθεί την ποιότητα του δείγματος ή/και την εξαγωγή DNA ενισχύοντας ένα κλάσμα του ανθρώπινου γονιδίου ADAT1 (ανθρώπινη trna-ειδική αδενοσίνη δεαμινάση1) μονού αντιγράφου. Εάν υπάρχει ανθρώπινο DNA σε επαρκή ποσότητα στο DNA που έχει εξαχθεί από τραχηλικό δείγμα, παράγεται ένα σήμα φθορισμού στις κηλίδες του μάρτυρα δείγματος. Σε περίπτωση απουσίας ή ανεπαρκούς ενίσχυσης ADAT1, το λογισμικό CheckReport Software υποδεικνύει ότι ο μάρτυρας δείγματος "απέτυχε". Αυτό έχει δύο διαφορετικές συνέπειες ανάλογα με το σήμα των κηλίδων του συγκεκριμένου παθογόνου. Εάν το δείγμα είναι θετικό για HPV, η ανάλυση παραμένει έγκυρη. Σε αυτήν την περίπτωση, η αποτυχία μάρτυρα δείγματος είναι άμεσο αποτέλεσμα του ανταγωνισμού μεταξύ του συνοδευτικού DNA και της περίσσειας DNA στόχου κατά τη διάρκεια της PCR. Εάν, αντιθέτως, το δείγμα είναι αρνητικό για HPV, το λογισμικό CheckReport Software υποδεικνύει ότι η ανάλυση "απέτυχε" λόγω της κακής συλλογής δείγματος (ανεπαρκής ποσότητα κυττάρων στο δείγμα ή/και της ανεπαρκούς εξαγωγής DNA. Σε αυτήν την περίπτωση, συνιστάται επανάληψη της ανάλυσης ξεκινώντας με την εξαγωγή DNA ή, εάν απαιτείται, λήψη νέου δείγματος (βλ. κεφάλαιο 9). ΜάρτυραςPCR Το PapilloCheck παρακολουθεί επίσης την απόδοση της αντίδρασης PCR. Η ενίσχυση ενός εσωτερικού εκχυλισμένου μάρτυρα που υπάρχει στο PapilloCheck PCR MasterMix παράγει ένα σήμα στις κηλίδες μάρτυρα PCR που βρίσκονται στο τσιπ PapilloCheck. Η ποιότητα της αντίδρασης ενίσχυσης αποτιμάται επίσης αυτόματα από το λογισμικό CheckReport Software. Εάν η απόδοση PCR είναι χαμηλότερη από ένα προκαθορισμένο κατώφλι, το λογισμικό CheckReport Software υποδεικνύει ότι ο μάρτυρας PCR "απέτυχε" και πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση (βλ. κεφάλαιο 9). Εάν η ποσότητα DNA του HPV στο δείγμα είναι πολύ υψηλή, το σήμα φθορισμού των κηλίδων μάρτυρα PCR μπορεί να είναι χαμηλό ή ακόμα και να απουσιάζει λόγω ανταγωνισμού κατά την αντίδραση PCR. Σε αυτή την περίπτωση, το σήμα φθορισμού για έναν τουλάχιστον HPV-ειδικό ανιχνευτή πρέπει να υπερβαίνει ένα προκαθορισμένο κατώφλι, προκειμένου θα θεωρηθεί έγκυρη η δοκιμασία. Μάρτυραςυβριδισμού Το PapilloCheck παρακολουθεί την αποτελεσματικότητα του υβριδισμού μέσω της χρήσης ενός ανιχνευτή με σήμανση φθορισμού που βρίσκεται μέσα στο Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού του PapilloCheck, το οποίο υβριδοποιεί τις ειδικές αλληλουχίες DNA στο τσιπ του PapilloCheck. Μια επαρκής αποτελεσματικότητα υβριδισμού οδηγεί σε σήματα φθορισμού σε κάθε κηλίδα διάταξης. Τα αποτελέσματα πέντε κηλίδων μάρτυρα υβριδισμού στο τσιπ του PapilloCheck αποτιμούνται επίσης από Maybachstr. το λογισμικό 2 CheckReport Software. 16

17 Η υγεία στα χέρια σας Μάρτυραςπροσανατολισμούκαιεκτύπωσης Οι κηλίδες μάρτυρα προσανατολισμού του τσιπ PapilloCheck παράγουν σήματα φθορισμού ανεξάρτητα από την αποτελεσματικότητα της διεργασίας υβριδισμού. Αυτές οι κηλίδες χρησιμοποιούνται από το λογισμικό CheckReport Software ως σημεία καθοδήγησης για σωστό εντοπισμό των κηλίδων, που αποτελεί προαπαιτούμενο για τη σωστή ανάλυση των σημάτων. Ο μάρτυρας εκτύπωσης στο τσιπ του PapilloCheck παρακολουθεί την παρουσία και των υβριδισμό των κηλίδων. Επιπλέον, η ποιότητα της διεργασίας εκτύπωσης παρακολουθείται από την παρουσία ενός πράσινου σήματος φθορισμού σε κάθε κηλίδα του τσιπ (μάρτυρας εκτύπωσης). 17

18 Η υγεία 7. στα ΟΔΗΓΙΕΣΓΙΑΤΗΡΟΗΕΡΓΑΣΙΩΝΤΟΥPAPILLOCHECK χέρια σας Η παρακάτω περιγραφή της ροής εργασιών ισχύει για την εφαρμογή των προϊόντων PapilloCheck και PapilloCheck high-risk. Ακολουθείτε τις οδηγίες για το PapilloCheck χρησιμοποιώντας μόνο τα στοιχεία του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck. Ακολουθείτε τις οδηγίες για το PapilloCheck high-risk χρησιμοποιώντας μόνο τα στοιχεία του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck high-risk. 7.1 Γενικέςοδηγίες Εάν στο εργαστήριο εφαρμόζονται οι τρέχουσες χρησιμοποιούμενες τεχνικές αιχμής στη μοριακή βιολογία, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι παρακάτω οδηγίες ώστε να διασφαλίζεται τόσο η μέγιστη ασφάλεια για το εργαστηριακό προσωπικό όσο και αποτελέσματα υψηλής ποιότητας. Η εκτέλεση τεχνικών μοριακής βιολογίας όπως η εξαγωγή DNA, η ενίσχυση και η ανίχνευση των προϊόντων ενίσχυσης απαιτούν κατάλληλα εξειδικευμένο προσωπικό. Επιπλέον, απαιτείται σαφής και καλά δομημένη ροή εργασιών ώστε να αποτρέπονται εσφαλμένα αποτελέσματα, όπως αυτά που προκύπτουν λόγω εξασθένισης ή μόλυνσης του DNA από τα προϊόντα ενίσχυσης. Για να διασφαλιστεί αυτό, απαιτείται ο διαχωρισμός των χώρων εξαγωγής, ενίσχυσης και ανίχνευσης, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο 7.2. Κάθε χώρος πρέπει να είναι εξοπλισμένος με ξεχωριστό εξοπλισμό, αναλώσιμα, εργαστηριακές ρόμπες και γάντια. Μην μεταφέρετε ποτέ εργαστηριακές ρόμπες, γάντια ή εξοπλισμό από τον ένα ξεχωριστό χώρο στον άλλο. 7.2 Διαχωρισμόςαιθουσών Εικόνα 3 απεικονίζει ένα παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο μπορεί να διαχωριστεί το εργαστήριο σε τρεις ευδιάκριτες περιοχές. Η μια περιοχή χρησιμοποιείται μόνο για την εξαγωγή DNA, η άλλη για την προετοιμασία και την εκτέλεση αντιδράσεων PCR και η τελευταία για τον υβριδισμό και την ανάλυση. Κάθε αίθουσα χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την εφαρμογή ή την τεχνική που υποδεικνύεται, προκειμένου να αποτρέπεται η μόλυνση των δειγμάτων. Η χρήση χρωματικού κώδικα θα μπορούσε να είναι ωφέλιμη στην αποφυγή τυχαίας μεταφοράς εξοπλισμού και αναλωσίμων από τη μία περιοχή στην άλλη. Αίθουσα 1 Αίθουσα 2 Αίθουσα 3 Εικόνα 3: Διαχωρισμός αιθουσών για χειροκίνητη επεξεργασία Αίθουσα 1: Ολόκληρη η διαδικασία εξαγωγής DNA πρέπει να εκτελείται σε αυτή την αίθουσα. Αίθουσα 2: Μέσα σε αυτήν την αίθουσα προετοιμάζεται και διαιρείται σε κλάσματα το μείγμα αντίδρασης για την αντίδραση PCR (ιδανικά κάτω από απαγωγό PCR). Η προσθήκη των δειγμάτων DNA που έχουν εξαχθεί στην αίθουσα 1 πρέπει να διενεργηθεί σε ξεχωριστό χώρο μέσα στην αίθουσα 2. Αίθουσα 3: Στην τρίτη αίθουσα του εργαστηρίου πραγματοποιούνται η αντίδραση υβριδισμού, τα βήματα πλύσης και το στέγνωμα του τσιπ. Επιπλέον, το CheckScanner σε συνδυασμό με το λογισμικό CheckReport Software χρησιμοποιείται για την τελική ανάλυση της δοκιμής PapilloCheck.! Δεν πρέπει να γίνεται ανταλλαγή εξοπλισμού ή αναλωσίμων μεταξύ των αιθουσών και των χώρων του εργαστηρίου. Συνεπώς, η ύπαρξη πολλαπλού εξοπλισμού και αναλωσίμων είναι απαραίτητη και θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τον εξοπλισμό του εργαστηρίου. 18

19 Η υγεία 7.3 στα Προειδοποιήσειςκαιπροφυλάξεις χέρια σας Αποτροπήμόλυνσης Σε όλη τη διάρκεια της διαδικασίας το προσωπικό πρέπει να φορά εργαστηριακέςρόμπες, ενώ για κάθε αίθουσα του εργαστηρίου απαιτούνται διαφορετικές εργαστηριακές ρόμπες. Καθαριότηταεργαστηρίου: Ο χώρος εργασίας πρέπει να απολυμαίνεται με DNA-AWAY (Thermo Scientifi c) ή άλλο κατάλληλο καθαριστικό διάλυμα πριν και μετά την εργασία. Το προσωπικό πρέπει να φορά γάντια σε κάθε βήμα της ανάλυσης και να τα αλλάζει συχνά, ιδιαίτερα κατά την εξαγωγή DNA. Σωληνάριαδείγματος: Μην αγγίζετε ποτέ το εσωτερικό του καπακιού του σωληναρίου αντίδρασης. Για να αποφύγετε τη διασταυρούμενη επιμόλυνση, πρέπει να ανοίγετε μόνο ένα σωληνάριο κάθε φορά. Αναρρόφησημεπιπέτα:Πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα ρύγχη φίλτρου μικροπιπέτας με συγκράτηση αερολυμάτων (αποστειρωμένα, ελεύθερα από DNase, RNase και ανθρώπινο DNA). Τα ρύγχη πιπέτας πρέπει να αντικαθίστανται πάντα μεταξύ των μεταφορών υγρού Οδηγίεςγιατοχειρισμότωντσιπ Τα τσιπ DNA θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε ένα περιβάλλον χωρίς σκόνη. Πρέπει να αποτρέπεται η εναπόθεση σκόνης και άλλων σωματιδίων στην επιφάνεια του τσιπ. Μην αγγίζετε τη ζώνη υβριδισμού στην επιφάνεια του τσιπ. Μόνο η επισημασμένη πλευρά του τσιπ προορίζεται για υβριδισμό. Μη χρησιμοποιείτε οποιουσδήποτε μαρκαδόρους για την ταυτοποίηση των τσιπ DNA, επειδή προκαλούν μη ειδικό φθορισμό στο τσιπ. Τα τσιπ DNA προορίζονται για μία μόνο χρήση. Τα υβριδοποιημένα τσιπ δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ξανά. Φυλάσσετε τα μη χρησιμοποιημένα τσιπ στην αρχική συσκευασία μέσα στον ασκό αποστολής με φερμουάρ που περιέχει αφυγραντικό υλικό Γενικέςπροφυλάξεις Κατά την άφιξή του, ελέγξτε τα στοιχεία του κιτ για βλάβη. Εάν ένα από τα περιεχόμενα είναι κατεστραμμένο (π.χ. οι φιάλες ρυθμιστικού διαλύματος), επικοινωνήστε με τον διανομέα της Greiner Bio-One της περιοχής σας. Μην χρησιμοποιείτε κατεστραμμένα περιεχόμενα του κιτ, καθώς η χρήση τους ενδέχεται να οδηγήσει σε κακή απόδοση του κιτ. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ μετά από την ημερομηνία λήξης. Μην αναμειγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Μην χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Χρησιμοποιείτε μόνο τα αντιδραστήρια/τον εξοπλισμό που παρέχονται και συνιστώνται από τον κατασκευαστή. Όλα τα στοιχεία εξοπλισμού, π.χ. συσκευές θερμικού κύκλου PCR ή πιπέτες, πρέπει να βαθμονομούνται/συντηρούνται τακτικά. Η αναρρόφηση με πιπέτα μικρής ποσότητας υγρού της κλίμακας μικρολίτρων αποτελεί πρόκληση. Συνεπώς, απαιτείται προσοχή ώστε η αναρρόφηση με την πιπέτα να γίνεται όσο το δυνατόν με μεγαλύτερη ακρίβεια. Για την αποφυγή μικροβιακής μόλυνσης των αντιδραστηρίων, απαιτείται προσοχή κατά την αφαίρεση κλασμάτων από τα σωληνάρια αντιδραστηρίων. Τα μη χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια και τα απόβλητα πρέπει να απορρίπτονται σύμφωνα με τις Frickenhausen ομοσπονδιακές και τις εθνικές οδηγίες. 19

20 Η υγεία στα χέρια σας Ασφάλειακατάτηνεργασία Να φοράτε πάντα κατάλληλη εργαστηριακή ρόμπα, αναλώσιμα γάντια και προστατευτικά γυαλιά! Τα κιτ προορίζονται μόνο για in vitro διαγνωστική χρήση και πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά από προσωπικό που έχει καταρτιστεί στην in vitro διαγνωστική εργαστηριακή πρακτική. Να είστε προσεκτικοί κατά το χειρισμό βιολογικών δειγμάτων που περιέχουν δυνητικά μολυσματικό ανθρώπινο υλικό. Για την ελαχιστοποίηση του κινδύνου μόλυνσης από δυνητικά μολυσματικό υλικό, συνιστάται να εργάζεστε υπό συνθήκες θαλάμου νηματικής ροής, μέχρι την ολοκλήρωση της λύσης των δειγμάτων. Να χειρίζεστε και να απορρίπτετε όλα τα βιολογικά δείγματα, όπως εάν υπήρχε πιθανότητα μετάδοσης μολυσματικών παραγόντων. Αποφεύγετε την άμεση επαφή με τα βιολογικά δείγματα καθώς και την εκτόξευση ή τον ψεκασμό τους. Να φοράτε πάντα εργαστηριακή ρόμπα, γάντια και γυαλιά ασφαλείας κατά την εργασία με ανθρώπινα δείγματα. Ποτέ μην αναρροφάτε με πιπέτα τα διαλύματα με το στόμα. Μην τρώτε, μην πίνετε, μην καπνίζετε και μην χρησιμοποιείτε καλλυντικά στους χώρους εργασίας. Πλένετε τα χέρια σας προσεκτικά μετά από το χειρισμό των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Μπορείτε να λάβετε την τρέχουσα έκδοση του Δελτίου δεδομένων ασφαλείας υλικών για αυτό το προϊόν από τον δικτυακό τόπο της Greiner Bio-One: Know-How&Services Download-Center 20

21 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ PAPILLOCHECK Το παρακάτω κεφάλαιο περιγράφει λεπτομερώς τα διαφορετικά βήματα εργασίας που οδηγούν τελικά στη δημιουργία μιας λεπτομερούς αναφοράς, που υποδεικνύει σαφώς την παρουσία ή απουσία ενός ή περισσότερων από τους τύπους HPV που μπορούν να ανιχνευτούν σε κάθε τραχηλικό δείγμα που αναλύεται. Η Εικόνα 4 εμφανίζει μια επισκόπηση των διαφόρων απαραίτητων βημάτων εργασίας. Επίσης, υποδεικνύει το αντίστοιχο υπο-κεφάλαιο που περιγράφει το συγκεκριμένο βήμα δοκιμής. Τα βήματα εργασίας πρέπει να εκτελούνται με τη σειρά που περιγράφεται σε αυτό το κεφάλαιο. Κάθε συγκεκριμένο πρακτικό βήμα υποδεικνύεται με ένα μπλε βέλος.! Η συλλογή δειγμάτων, η εξαγωγή DNA και η ανάλυση με το λογισμικό CheckReport Software δεν αποτελούν μέρος του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck. Συνεπώς, η περιγραφή αυτών των βημάτων εργασίας συνοψίζεται σε αυτό το κεφάλαιο. Για πιο λεπτομερείς πληροφορίες, ανατρέξτε στις αντίστοιχες οδηγίες χρήσης, π.χ. του κιτ συλλογής PapilloCheck, του κιτ εξαγωγής DNA ocheck και του λογισμικού CheckReport Software. 8.1 Συλλογή δειγμάτων και εξαγωγή DNA Συλλογή δειγμάτων Η συλλογή δειγμάτων δεν αποτελεί μέρος του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck. Διατίθεται επίσης ειδικό κιτ συλλογής για τραχηλικά δείγματα (Κιτ συλλογής PapilloCheck ) από την Greiner Bio-One (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο κεφάλαιο 2). Το PapilloCheck έχει επικυρωθεί με χρήση DNA που παρασκευάστηκε με το κιτ εξαγωγής DNA ocheck από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν με ένα από τα παρακάτω συστήματα ή μέσα συλλογής: Κιτ συλλογής PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, ) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) STM (Qiagen, Hilden, ). Easyfix (VWR, Radnor, PA, USA) Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, France) Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα κατάλληλα μέσα μεταφοράς ή τα συστήματα εξαγωγής DNA, επικοινωνήστε με τον τοπικό διανομέα της Greiner Bio-One ή συμβουλευτείτε το δικτυακό τόπο της Greiner Bio-One: Know-How & Services Download-Center 21

22 Κεφάλαιο Εξαγωγή DNA Κιτ εξαγωγής DNA ocheck Κεφάλαιο 8.2 PCR Κεφάλαιο Υβριδισμός Κεφάλαιο Πλύση και στέγνωμα ή Κεφάλαιο 8.4 Σάρωση και αξιολόγηση Εικόνα 4: Επισκόπηση των διαφόρων βημάτων εργασίας του PapilloCheck 22

23 8.1.2 Εξαγωγή DNA Η εξαγωγή DNA δεν αποτελεί μέρος του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck. Η εξαγωγή DNA πριν από την ανάλυση του PapilloCheck πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής DNA ocheck, το οποίο διατίθεται επίσης από την Greiner Bio-One (ανατρέξτε στο κεφάλαιο 2). Ακολουθήστε προσεκτικά τις οδηγίες χρήσης όταν χρησιμοποιείτε το κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Για εξαγωγή DNA με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck πρέπει να χρησιμοποιηθεί διάλυμα δείγματος 250 µl. Δείγματα ανθρώπινου τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία συλλέγονται με το κιτ συλλογής PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, ) σε μέσο συλλογής PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) σε Easyfix (VWR, Radnor, PA, USA) ή Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, France) μπορούν να υποβληθούν απευθείας σε επεξεργασία. Τα τραχηλικά δείγματα τα οποία συλλέγονται σε μέσο συλλογής Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) πρέπει να πλένονται πριν τη χρήση: φυγοκεντρίστε 250 µl του δείγματος για 5 λεπτά σε x g και επαναιωρήστε το ίζημα σε 250 µl αποσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, η ποσότητα 250 µl μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Τα τραχηλικά δείγματα τα οποία συλλέγονται σε μέσο συλλογής STM (Qiagen, Hilden, ) πρέπει να αραιώνονται: χρησιμοποιήστε 100 µl του δείγματος και προσθέστε 150 µl αποσταγμένο νερό. Η ποσότητα 250 µl του αραιωμένου δείγματος μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Γενικά, εάν το δείγμα του κολπικού επιχρίσματος φαίνεται να είναι υπερβολικά συμπυκνωμένο και ήδη συσσωματωμένο, το δείγμα πρέπει να αραιωθεί και να ομογενοποιηθεί πριν από την έναρξη της εξαγωγής DNA! Τα δείγματα τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία είναι πολύ αραιά και χωρίς ορατά κύτταρα πρέπει να συμπυκνώνονται για την επίτευξη υψηλότερης απόδοσης κυττάρων για την εξαγωγή DNA: φυγοκεντρίστε έως µl του δείγματος για 5 λεπτά σε x g και επαναιωρήστε το ίζημα σε 250 µl αποσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, η ποσότητα 250 µl μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το κιτ εξαγωγής DNA ocheck.! Αυτό το βήμα συγκέντρωσης είναι κατάλληλο μόνο για δείγματα τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία συλλέχθηκαν με το κιτ συλλογής PapilloCheck, σε μέσο συλλογής PreservCyt, Easyfix και Cyt-All ή σε μέσο συλλογής Surepath. Εάν χρησιμοποιήθηκε το μέσο συλλογής STM, δεν είναι δυνατή η συγκέντρωση με φυγοκέντριση. 8.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη μέθοδος, η οποία μπορεί να ανιχνεύσει εξαιρετικά μικρές ποσότητες DNA. Πρέπει να τηρούνται ειδικές προφυλάξεις προκειμένου να αποφεύγεται μόλυνση της αντίδρασης (βλ. κεφάλαιο 7). Απαιτείται πολυμεράση HotStarTaq και ουρακίλη-ν-γλυκοσυλάση, αλλά δεν παρέχονται με το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck και πρέπει να τα προμηθευτείτε χωριστά (βλ. κεφάλαιο 2).! Το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας πολυμεράση HotStarTaq από την Qiagen και ουρακίλη-n-γλυκοσυλάση από την Thermo Scientific (βλ. κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτών των ενζύμων είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η υποδεικνυόμενη απόδοση. 23

24 8.2.1 Προετοιμασία συσκευής θερμικού κύκλου Το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck έχει επικυρωθεί με τις ακόλουθες συσκευές θερμικού κύκλου: Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).! Η χρήση μιας από τις συσκευές θερμικού κύκλου που αναφέρονται παραπάνω είναι απολύτως απαραίτητη για την επίτευξη της υποδεικνυόμενης απόδοσης. Το πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου για την PCR του PapilloCheck συνοψίζεται στον Πίνακας 3. Πίνακας 3: Πρόγραμμα θερμικού κύκλου της PCR του PapilloCheck Χρόνος Θερμ. C Αρ. κύκλων 20 λεπτά 37 C 1 15 λεπτά 95 C 1 30 δευτερόλεπτα 25 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 30 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Κράτηση 10 C Επιπλέον, πρέπει να ρυθμιστούν οι ακόλουθες παράμετροι εκτέλεσης για κάθε συσκευή θερμικού κύκλου. Για μια περιγραφή του τρόπου ρύθμισης αυτών των παραμέτρων, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης της αντίστοιχης συσκευής θερμικού κύκλου. Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Ρυθμίστε τον όγκο αντίδρασης σε 26 µl, την ταχύτητα ράμπας σε "9600" και χρησιμοποιήστε θερμοκρασία καλύμματος 103 C. Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) Χρησιμοποιήστε το εργαλείο μετατροπής μεθόδου της συσκευής θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti για εισαγωγή στο πρόγραμμα PCR του PapilloCheck και επιλέξτε τη λειτουργία "9600 Emulation Mode (Λειτουργία προσομοίωσης 9600). Ρυθμίστε τον όγκο αντίδρασης σε 26 µl και τη θερμοκρασία του καλύμματος στους 103 C. peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Χρησιμοποιήστε το προ-προγραμματισμένο πρόγραμμα PCR του PapilloCheck "PapilloCheck.js" το οποίο παρέχεται μαζί με τη συσκευή θερμικού κύκλου. Συνήθως μπορείτε να ανοίξετε το πρόγραμμα από την ακόλουθη διαδρομή: local/scripts/greinerbioone/papillocheck.js Κατεργασία oυρακίλης-n-γλυκοσυλάσης (UNG) 11 Το PapilloCheck PCR MasterMix περιέχει dutp που ενσωματώνεται στα προϊόντα ενίσχυσης κατά τη διάρκεια της PCR του PapilloCheck, καθιστώντας τα προϊόντα PCR ευαίσθητα σε εξασθένιση από την UNG. Η UNG διασπά το προϊόν της PCR σε σημεία που έχει ενσωματωθεί υπόλειμμα deoxyuridylate. Τα διασπασμένα προϊόντα PCR δεν θα ενισχυθούν σε επόμενη αντίδραση. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια κατεργασία UNG για την εξάλειψη της επιμόλυνσης μεταφοράς από προηγούμενες αντιδράσεις PCR Η προμήθεια του PapilloCheck συνοδεύεται από περιορισμένη άδεια χρήσης σύμφωνα με τους Αριθμούς Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας Η.Π.Α. 5,035,996, 5,683,896, 5,945,313, 6,287,823 και 6,518,026 και τα αντίστοιχα ξένα διπλώματα ευρεσιτεχνίας. 24

25 Αραιώστε την ουρακίλη-n-γλυκοσυλάση 1:200 σε νερό βαθμού PCR. Χρησιμοποιήστε μια νέα αραίωση UNG για κάθε προετοιμασία αντίδρασης PCR του PapilloCheck (βλ. κεφάλαιο 8.2.3). Μην επαναχρησιμοποιείτε το αραιωμένο UNG. Αναμίξτε προσεκτικά την αραίωση UNG με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Η αρχική συγκέντρωση της ουρακίλης-n-γλυκοσυλάσης είναι 1 U/µL. Κατά συνέπεια, η συγκέντρωση της αραίωσης είναι 0,005 U/µL.! Το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας ουρακίλη-n-γλυκοσυλάση από την Thermo Scientific (βλ. κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτού του ενζύμου είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η υποδεικνυόμενη απόδοση. Προσθέστε 1 µl από αυτήν την αραίωση σε κάθε αντίδραση PCR του PapilloCheck (βλ. κεφάλαιο 8.2.3, Πίνακας 4). Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για να εξαλειφθεί η επιμόλυνση μεταφοράς της PCR. Φροντίστε να μην χρησιμοποιήσετε διάλυμα UNG με υψηλότερη συγκέντρωση, καθώς αυτό μπορεί να έχει αρνητικό αποτέλεσμα στην απόδοση της PCR και να οδηγήσει σε μειωμένη ευαισθησία του PapilloCheck. Γενικά, για κατεργασία UNG, το μείγμα αντίδρασης PCR επωάζεται για 20 λεπτά στους 37 C. Συνεπώς, το UNG αδρανοποιείται με ένα πρόσθετο βήμα επώασης διάρκειας 15 λεπτών στους 95 C. Αυτά τα δύο βήματα ενσωματώνονται ήδη στην PCR του PapilloCheck και αντιστοιχούν στα πρώτα δύο βήματα του προγράμματος της συσκευής θερμικού κύκλου (βλ. Πίνακας 3). Στο δεύτερο βήμα (15 λεπτά στους 95 C) προκύπτει τόσο η αδρανοποίηση της ουρακίλης-n-γλυκοσυλάσης όσο και η ενεργοποίηση της πολυμεράσης HotStarTaq.! Το ενσωματωμένο σύστημα UNG του PCR του PapilloCheck εξαλείφει μόνο τη μόλυνση μεταφοράς με προϊόντα PCR από προηγούμενες αντιδράσεις PCR. Δεν μπορούν να εξαλειφθούν άλλες μολύνσεις, που προκύπτουν για παράδειγμα κατά τη διάρκεια της παρασκευής δειγμάτων, εξαγωγής DNA ή προσθήκης εκχυλίσματος PCR. Συνεπώς, είναι απαραίτητο να τηρούνται οι οδηγίες και οι ειδικές προφυλάξεις για την πρόληψη μόλυνσης που περιγράφονται στο κεφάλαιο Προετοιμασία αντίδρασης PCR Με εξαίρεση την πολυμεράση HotStarTaq και την ουρακίλη-n-γλυκοσυλάση, το PapilloCheck περιέχει ήδη όλα τα στοιχεία για την εκτέλεση της αντίδρασης PCR (ρυθμιστικό διάλυμα PCR, MgCl 2, dntp, υγρά πλήρωσης, εκχυλισμένο μάρτυρα PCR). Γενικά, η διαδικασία προετοιμασίας PCR του PapilloCheck μπορεί να χωριστεί σε δύο μέρη: την προετοιμασία του τελικού κύριου μείγματος με την προσθήκη ενζύμων στο PapilloCheck PCR MasterMix και την προετοιμασία της τελικής αντίδρασης PCR με την προσθήκη DNA εξαγωγής ως εκχύλισμα.! Το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας πολυμεράση HotStarTaq από την Qiagen (βλ. κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτού του ενζύμου είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η υποδεικνυόμενη απόδοση. Η προετοιμασία του κύριου μείγματος εκτελείται ιδανικά σε προστατευόμενο περιβάλλον, π.χ. απαγωγός PCR, για την αποφυγή αντίδρασης μόλυνσης. Προετοιμάστε το τελικό κύριο μείγμα (που αποτελείται από PapilloCheck PCR MasterMix, πολυμεράση HotStarTaq και ουρακίλη-n-γλυκοσυλάση) για την απαιτούμενη ποσότητα των αντιδράσεων PCR, όπως περιγράφεται στον Πίνακας 4. 25

26 Για να αναλύσετε πολλαπλά δείγματα, το κύριο μείγμα θα πρέπει να παρασκευαστεί σε μια πατρίδα (στην ποσότητα που απαιτείται για όλες τις αναλύσεις). Για να ρυθμίσετε τις διακυμάνσεις όγκου κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, συνιστάται να αυξήσετε τον αριθμό αντιδράσεων (n) κατά 1 για κάθε τσιπ (=n+1), π.χ. παρασκευάστε έναν όγκο τελικού κύριου μείγματος για 13 αντιδράσεις ενίσχυσης εάν πρόκειται να δοκιμαστούν 12 δείγματα (βλ. Πίνακας 4). Χρησιμοποιείτε πάντα ένα φιαλίδιο PapilloCheck PCR MasterMix για τις αντιδράσεις ενός τσιπ.! Συνιστάται να συμπεριλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας για κάθε παρτίδα τελικού κύριου μείγματος που παρασκευάζεται. Ως αρνητικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης DNA του κατάλληλου κιτ εξαγωγής DNA ή νερό βαθμού PCR. Αναμίξτε καλά το τελικό κύριο μείγμα με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Διαιρέστε το τελικό κύριο μείγμα σε κλάσματα αναρροφώντας με πιπέτα 21 µl για κάθε αντίδραση PCR σε ένα σωληνάριο αντίδρασης PCR 0,2 ml λεπτού τοιχώματος. Διενεργήστε προσθήκη του εκχυλισμένου DNA σε ξεχωριστό χώρο εργασίας, στη συνέχεια προετοιμάστε το τελικό κύριο μείγμα (βλ. κεφάλαιο 7.2). Για την προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης, προσθέστε 5 µl DNA εξαγωγής σε κάθε τελικό κύριο μείγμα και αναμίξτε με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Ο συνολικός όγκος μίας αντίδρασης PCR είναι 26 µl. Τοποθετήστε τα σωληνάρια αντίδρασης στη συσκευή θερμικού κύκλου και ξεκινήστε την αντίδραση PCR χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου που περιγράφεται στο κεφάλαιο (Πίνακας 2).! Μετά από την ολοκλήρωση της PCR, τα προϊόντα ενίσχυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αμέσως για υβριδισμό ή να φυλάσσονται σε σκοτεινό μέρος στους -20 C για μία εβδομάδα. Πίνακας 4: Προετοιμασία της αντίδρασης PCR του PapilloCheck 1 αντίδραση 13 αντιδράσεις (1 τσιπ) 26 αντιδράσεις (2 τσιπ) 39 αντιδράσεις (3 τσιπ) 52 αντιδράσεις (4 τσιπ) PapilloCheck PCR MasterMix Πολυμεράση DNA HotStarTaq DNA (5 U/µL) Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση (Αραίωση 1:200, 0,005 U/µL) 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl 1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl Συνολικός όγκος πριν από την προσθήκη δείγματος DNA (Τελικό κύριο δείγμα) 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl DNA εξαγωγής από το τραχηλικό δείγμα (εκχυλισμένο DNA) Συνολικός όγκος ανά αντίδραση (τελική αντίδραση PCR) 5 µl 26 µl 26

27 8.3 Υβριδισμός και πλύση Προετοιμασία και διευθέτηση Ξεκινήστε με τις απαραίτητες προετοιμασίες για τα βήματα υβριδισμού και πλύσης τουλάχιστον 30 λεπτά πριν την έναρξη της διαδικασίας υβριδισμού, ώστε να διασφαλίσετε ότι όλα τα απαιτούμενα στοιχεία έχουν εξισορροπηθεί σε θερμοκρασία δωματίου Για να διαλύσετε δυνητικά ιζήματα στα ρυθμιστικά διαλύματα υβριδισμού και πλύσης, εκθέστε τα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και αναμίξτε καλά πριν από τη χρήση. Η φύλαξη του κιτ δοκιμασίας PapilloCheck στους 4 έως ενδέχεται να οδηγήσει σε ίζημα του SDS στο Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού και το Ρυθμιστικό διάλυμα Β. Αφήστε τα διαλύματα να εξισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια περιδινήστε το σωληνάριο ή αναδεύστε τη φιάλη μέχρι να διαλυθούν τυχόν ιζήματα. Προετοιμάστε το θάλαμο υβριδισμού του ocheck : Τοποθετήστε μια νέα υγρή χάρτινη πετσέτα μέσα στο Θάλαμο υβριδισμού και κλείστε το κάλυμμα για να δημιουργηθεί μια ατμόσφαιρα κορεσμένη από υγρασία. Για αποφυγή εξάτμισης του μικρού όγκου χρησιμοποιημένου μείγματος υβριδισμού επάνω στο τσιπ, η εκτέλεση του υβριδισμού πρέπει να διενεργηθεί σε ατμόσφαιρα με κορεσμό υγρασίας. Διατίθεται ειδικός Θάλαμος υβριδισμού για την ανάλυση PapilloCheck από την Greiner Bio-One (βλ. κεφάλαιο 2). Επωάστε την απαιτούμενη ποσότητα τσιπ PapilloCheck στον προετοιμασμένο Θάλαμο υβριδισμού σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά τουλάχιστον.! Η μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών του Θαλάμου υβριδισμού περιέχει μόνον ένα μαγνήτη στο ένα από τα δύο άκρα. Εάν πρόκειται να υβριδοποιηθούν παράλληλα λιγότερα από τέσσερα τσιπ PapilloCheck, φροντίστε να πληρώσετε τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών με τσιπ PapilloCheck από την αντίθετη πλευρά του μαγνήτη. Διαφορετικά, τα τσιπ PapilloCheck δεν θα καλυφτούν με υγρό κατά τη διαδικασία πλύσης. Παρασκευάστε τα διαλύματα πλύσης I, II και III σύμφωνα με τις παρακάτω οδηγίες. Προετοιμασία των διαλυμάτων πλύσης I, II και III: Προετοιμάστε το μείγμα διαλύματος πλύσης για τα διαλύματα πλύσης I, II και III που είναι κατάλληλα για τον αριθμό τσιπ του PapilloCheck που θα αναλυθούν, όπως φαίνεται στον Πίνακας 5. Διαιρέστε τρεις ίσες ποσότητες του μείγματος διαλύματος πλύσης σε τρία ξεχωριστά πλαίσια πλύσης ocheck και επισημάνετέ τα ως διάλυμα πλύσης I, II και III. Βεβαιωθείτε ότι κάθε πλαίσιο πλύσης ocheck περιέχει μια χαραγμένη κλίμακα, που υποδεικνύει τη σωστή ποσότητα διαλύματος πλύσης που απαιτείται για μέχρι 4 τσιπ. Χρησιμοποιήστε αυτή την κλίμακα για να ελέγξετε την ποιότητα του ρυθμιστικού διαλύματος. Προθερμάνετε το διάλυμα πλύσης II στους 50 C σε ένα υδατόλουτρο με ελεγχόμενη θερμοκρασία για 20 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. Βεβαιωθείτε ότι το επίπεδο πλήρωσης του υδατόλουτρου ισούται με το επίπεδο πλήρωσης του διαλύματος πλύσης II. Πίνακας 5: Προετοιμασία του μείγματος διαλύματος πλύσης Αριθμός τσιπ PapilloCheck Στοιχεία Αποσταγμένο νερό 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Ρυθμιστικό διάλυμα Α PapilloCheck 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Ρυθμιστικό διάλυμα Α PapilloCheck 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Συνολικός όγκος 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml 27