ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΤΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΤΩΝ Βιολογικός έλεγχος του λεπιδοπτέρου Sesamia nonagrioides L. σε καλλιέργεια γλυκού σόργου (Sorghum bicolor L.). Εργαστηριακή μελέτη της εντομοπαθογόνου δράσης τριών μυκήτων της τάξης Hypocreales καθώς και μελέτη της ενδοφυτικής και εντομοπαθογόνου συμπεριφοράς τους σε συνθήκες πεδίου. Διδακτορική διατριβή Σπυρίδων Δ. Μαντζούκας ΠΑΤΡΑ 2013

2

3 .. στη Θεανώ

4 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Πρόλογος i Περίληψη iii Abstract vi A. Εισαγωγή Α.1. Γλυκό Σόργο (Sorghum bicolor) Γενικά Βοτανική ταξινόμηση και προέλευση Κυριότεροι εχθροί της καλλιέργειας του Γλυκού Σόργου στην Ελλάδα 2 Α.2.Το έντομο Sesamia nonagrioides Βιολογία του εντόμου Μορφολογία του εντόμου Ταξινομική θέση του εντόμου Η Γεωγραφική Εξάπλωση του εντόμου Ζημία Αντιμετώπιση του Εντόμου 10 Α.3. Η βιολογική και ολοκληρωμένη αντιμετώπιση των έχθρων των καλλιεργειών 12 Α.4. Εντομοπαθογόνοι μύκητες Μόλυνση Βιολογικός κύκλος Κονίδια - Προσκόλληση Βλάστηση - Διείσδυση Αναγνώριση Ξενιστή Πορεία της μόλυνσης Μύκητες που ανήκουν στο γένος Beauveria Μύκητες που ανήκουν στο γένος Metarhizium Μύκητες που ανήκουν στο γένος Isaria Εμπορικά μικροβιακά σκευάσματα με βάση μύκητες 22 Α.5. Συνδυασμός των εντομοπαθογόνων μυκήτων με άλλους μικροοργανισμούς 23 Α.6. Ενδόφυτα Εντομοπαθογόνοι μύκητες ως ενδόφυτα Διαχωρισμός των ενδοφυτών με βάση τη μετάδοση τους Clavicipitaceous ενδοφύτα Nonclavicipitaceous ενδόφυτα 28 Α.7. Επίδραση των ενδοφυτικών μυκήτων στην φυσιολογία των φυτών ξενιστών 31 Α.8. Επίδραση των μη ενδοφυτικών μυκήτων στην φωτοσύνθεση των φυτών ξενιστών 32 Α.9. Σκοπός της Εργασίας 36 Β. Υλικά και Μέθοδοι B.1. Οργανισμοί 1.1. Έντομα Εντομοπαθογόνοι μικροοργανισμοί Φυτικό υλικό 39 B.2. Εκτροφή του εντόμου Sesamia nonagrioides 2.1. Υπόστρωμα ωοτοκίας και κλωβοί ακμαίων του εντόμου Υπόστρωμα εκτροφής του εντόμου Συνθήκες διατήρησης των νυμφών του εντόμου 41 B.3. Παρασκευή Εναιωρημάτων 3.1. Εντομοπαθογονών Μυκήτων Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 42

5 Περιεχόμενα B.4. Εργαστηριακά πειράματα 4.1. Μελέτη της επίδρασης των εντομοπαθογόνων μυκήτων στην επιβίωση των προνυμφών του S. nonagrioides in vitro 4.1.Α. Προσδιορισμός της ευαισθησίας προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides στα στελέχη των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea Β. Προσδιορισμός της ευαισθησίας των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides στα στελέχη των εντομοπαθογόνων μυκήτων σε εύρος πυκνοτήτων Μελέτη της επίδραση της συνδιαστικής εφαρμογής του εμπορικού σκευάσματος Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki και των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana 46 και M. robertsii επί προνυμφών του εντόμου 4.2.Β. Μελέτη της αύξησης των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana και M. robertsii επί θρεπτικού υποστρώματος παρουσία του εντομοπαθογόνου βακτηρίου 48 Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki in vitro 4.3. Μελέτη της επίδρασης των στελεχών των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea στην πρόσληψη τροφής, στην κατανάλωση τροφής και 49 στην ανάπτυξη των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides B.5. Πειράματα πεδίου Επίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων in planta τόσο στις προνύμφες του εντόμου όσο και στα φυτά γλυκού σόργου σε συνθήκες πεδίου Φωτοσυνθετική δραστηριότητα Ταχύτητα αφομοίωσης CΟ 2 (Αναλυτής αερίων τύπου Li-6400 (Li-cor, Lincoln, Ne, USA) Ταχύτητα ροής ηλεκτρονίων (mini PAM) Μέθοδος φθορισμού της χλωροφύλλης Κινητικές επαγωγής του φθορισμού της χλωροφύλλης (OJIP transients) (Handy PEA) Σχετικό υδατικό περιεχόμενο (RWC) Μέτρηση χλωροφύλλης Μορφολογικοί και αναπτυξιακοί δείκτες Ύψος και Αριθμός Φύλλων Βιομάζα 65 B.6. Μέθοδοι εντοπισμού των εντομοπαθογόνων μυκήτων 6.1. Ανίχνευση των εντομοπαθογόνων μυκήτων στους ιστούς του γλυκού σόργου σε υπόστρωμα SDA Εξαγωγή ολικού γονιδιώματος των φυτών του γλυκού σόργου Εξαγωγή ολικού γονιδιώματος των εντομοπαθογόνων μυκήτων Πολλαπλασιασμός των γονιδίων στόχων μέσω της PCR Η αντίδραση της PCR 68 Γ. Αποτελέσματα Πειράματα in vitro Γ.1. Μελέτη της επίδρασης των εντομοπαθογόνων μυκήτων στην επιβίωση των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides in vitro Γ.1.Α Προσδιορισμός της ευαισθησίας προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides στα στελέχη των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea Γ.1.Β. Προσδιορισμός ευαισθησίας προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides στα στελέχη των εντομοπαθογόνων μυκήτων των B. bassiana ΙΓΕ3, M. robertsii Elateridae και I. fumosorosea Άγιος Στέφανος σε εύρος συγκεντρώσεων Γ.2. Μελέτη της επίδραση της συνδιαστικής εφαρμογής του εμπορικού σκευάσματος Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki και των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana και M. robertsii επί προνυμφών του εντόμου

6 Περιεχόμενα Γ.3. Μελέτη της επίδρασης των στελεχών των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M.robertsii και I. fumosorosea στην πρόσληψη τροφής, στην κατανάλωση τροφής και στην ανάπτυξη των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides Γ.3.Α. Μέσο νωπό βάρος των προνυμφών του εντόμου 86 Γ.3.Β. Σχετική ταχύτητα κατανάλωσης (RCR), τα αποχωρήματα και καταναλωθείσα τροφή των προνυμφών 88 Γ.3.Γ. Σχετική ταχύτητα αύξησης (RGR) των προνυμφών 89 Γ.3.Δ. Δείκτης πεπτικότητας (AD) των προνυμφών 91 Γ.3.Ε. Μετατροπή της προσληφθείσας τροφής (ECI) των προνυμφών 91 Γ.3.Ζ. Μετατροπή της αφομοιωμένης τροφής (ECD) των προνυμφών 92 Πειράματα Πεδίου Γ.4. Μελέτη της επίδραση της in planta ανάπτυξης των εντομοπαθογόνων μυκήτων τόσο στις προνύμφες του εντόμου όσο και στα φυτά γλυκού σόργου σε συνθήκες πεδίου Γ.4.Α. Πείραμα σε φυσικό έδαφος. 94 Γ.4.Β. Πείραμα σε γλάστρες 98 Γ.4.Γ. Πολλαπλασιασμός των γονιδίων στόχων μέσω της PCR Μέθοδοι εντοπισμού των εντομοπαθογόνων μυκήτων Απομόνωση εντομοπαθογόνου μύκητα από βλαστούς και φύλλα γλυκού σόργου σε υπόστρωμα SDA 107 Γ.4.Δ. Μελέτη της επίδρασης της in planta ανάπτυξης των εντομοπαθογόνων μυκήτων στην φωτοσυνθετική δραστηριότητας του γλυκού σόργου πριν και μετά την προσβολή 108 από την προνύμφη του εντόμου. 1. Ταχύτητα ροής ηλεκτρονίων (ETR) Μελέτη της ταχείας φάσης επαγωγής του φθορισμού της χλωροφύλλης (OJIPtransients) Σχετική περιεκτικότητα σε νερό (RWC) Συγκέντρωση χλωροφύλλης 116 Δ. Συζήτηση Δ.1. Μελέτη της επίδρασης των εντομοπαθογόνων μυκήτων στην επιβίωση των 117 προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides in vitro Δ.2. Μελέτη της επίδραση της συνδιαστικής εφαρμογής του εμπορικού σκευάσματος Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki και των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana 119 και M. robertsii επί προνυμφών του εντόμου Δ.3. Μελέτη της επίδρασης των στελεχών των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea στην πρόσληψη τροφής, στην κατανάλωση τροφής και 123 στην ανάπτυξη των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides Δ.4. Μελέτη της επίδρασης των εντομοπαθογόνων μυκήτων στην ανάπτυξη του 126 εντόμου in planta και σε συνθήκες πεδίου Δ.5. Η ενδοφυτική συμπεριφορά των τριών ειδών μυκήτων έναντι του γλυκού σόργου 128 και σε συνθήκες πεδίου Συμπεράσματα 132 E. Βιβλιογραφία 134

7 Πρόλογος Πρόλογος Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστήμιου Πατρών. Με την ολοκλήρωση της νιώθω την ανάγκη αλλά και την υποχρέωση να ευχαριστήσω τους ανθρώπους με τους οποίους συνεργάστηκα και συνυπήρξα τα τελευταία 4 και μισό χρόνια. Αρχικά θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες προς τον Αν. Καθηγητή του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Κωνσταντίνο Αγγελόπουλο, τόσο για την πολύτιμη βοήθεια του όσο και για την συνεχή υποστήριξη που μου προσέφερε καθ όλη την διάρκεια εκπόνησης της διατριβής μου. Ιδιαίτερα, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου και τις ευχαριστίες μου προς στο επιβλέποντα Καθηγητή της διδακτορικής μου διατριβής μετά την συνταξιοδότηση του κ. Κωνσταντίνου Αγγελόπουλου, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Γεώργιο Γραμματικόπουλο, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, του οποίου η αρωγή σε κρίσιμες στιγμές καθώς και οι πολύτιμες συμβουλές του, οι ατελείωτες και ενδιαφέρουσες συζητήσεις που κάναμε και η ψυχολογική του στήριξη λειτούργησαν καταλυτικά και συνέβαλαν ουσιαστικά στην περάτωση αυτής της διδακτορικής διατριβής. Να ευχαριστήσω επίσης και την υπόλοιπη τριμελή επιτροπή τον κ. Γεώργιο Παπαδούλη Καθηγητή του τμήματος Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών και τον κ. Παναγιώτη Μυλωνά Ερευνητή Β του Εργαστηρίου Βιολογικής Αντιμετώπισης του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου, για τις ιδιαιτέρα εποικοδομητικές και άκρως ουσιαστικές υποδείξεις τους, που συνέβαλαν στην βελτίωση της διατριβής, αλλά και όλα τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, που είχαν την καλοσύνη να με τιμήσουν με την παρουσία τους και να συμβάλουν με τις συμβουλές τους στην τελική μορφή της. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Δημητρή Κοντοδήμα Ερευνητή B του Εργαστήριο Γεωργικής Εντομολογίας του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου που τα τελευταία 8 χρόνια με ακολουθεί στις επιστημονικές μου αναζητήσεις σαν φίλος και σαν δάσκαλος και που χωρίς την βοήθεια και την καθοδήγηση του δεν θα πραγματοποιούνταν αυτή η διδακτορική διατριβή. i

8 Πρόλογος Επιπροσθέτως, θέλω να ευχαριστήσω θερμά το επιστημονικό προσωπικό του Εργαστηρίου της Φυσιολογίας Φυτών, τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Μανέτα, την Επ. Καθηγήτρια κ. Γεωργία Πετροπούλου, τους φίλους και συνοδοιπόρους μου στο εργαστήριο, την Υπ. Διδάκτορα κ. Αλεξάνδρα Κυζερίδου και τον μεταπτυχιακό φοιτητή κ. Χρήστο Χονδρογιάννη και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια κ. Έλενα Κούτρα για τις υπεροχές στιγμές που περάσαμε. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Κωνσταντίνο Πουλά για τις συμβουλές του στο μοριακό κομμάτι της διατριβής και τις μεταπτυχιακές φοιτήτριες κ. Ειρήνη Σταματάκη και κ. Μαρίνα Μπαρτσακούλια για τις πολύτιμη βοήθεια τους. Να ευχαριστήσω επιπλέον τον κ. Θανάση και την κ. Μαρία Αβραμοπούλου για τις συμβουλές τους, την ενθάρρυνση που μου παρείχαν και τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις τους αναφορικά με λογική ροή και βέλτιστη δομή της διατριβής. Τους γονείς μου, Δημήτριο και Σοφία Μαντζούκα και την γιαγιά μου Αικατερίνη Σκανδάλου, οι οποίοι με στήριξαν όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος την αγαπημένη μου σύντροφο και συνοδοιπόρο στην ζωή, την Θεανώ που τα τελευταία χρόνια της στέρησα παρά πολλά. Ίσως το ευχαριστώ να είναι λίγο μπροστά στη στήριξη και αγάπη που μου παρείχε στις εύκολες και στις δύσκολες στιγμές αυτού του ταξιδιού κρατώντας μου πάντα το χέρι. Σπυρίδων Δ. Μαντζούκας Πάτρα 2013 ii

9 Περίληψη Περίληψη Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) και Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae), που απομονώθηκαν από ελληνικά εδάφη, επί του κυριότερου και πιο επιβλαβούς εχθρού της καλλιέργειας του γλυκού σόργου, του λεπιδόπτερου Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). Μελετήθηκε στο εργαστήριο η επίδραση έξι στελεχών των παραπάνω μυκήτων στην επιβίωση των προνυμφών του εντόμου. Τα στελέχη των μυκήτων προκάλεσαν υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες του εντόμου, που κυμάνθηκε σε ποσοστά από 78%-98%. Αποτελεσματικότερα στελέχη ήταν τα B. bassiana (ΙΓΕ3), M. robertsii (Elateridae) και I. fumosorosea (Άγιος Στέφανος). Αυτές οι τρείς απομονώσεις επιλέχθηκαν προκειμένου να εξεταστεί η επίδραση της πυκνότητας των κονιδιακών εναιωρημάτων στη θνησιμότητα των προνυμφών. Καταγράφηκαν ποσοστά θνησιμότητας 7%-93% σε σχέση με την πυκνότητα των κονιδιακών εναιωρημάτων επί των προνυμφών. Διαπιστώθηκε ότι η ικανότητα που παρουσιάζουν οι εντομοπαθογόνοι μύκητες στον έλεγχο της επιβίωσης προνυμφών του εντόμου ήταν ανάλογη της χρησιμοποιημένης πυκνότητας των κονιδιακών εναιωρημάτων. Επίσης, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana (ΙΓΕ3) και M. robertsii (Elateridae) με εμπορικό σκεύασμα Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki όσον αφορά τη θανάτωση προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides. Η θνησιμότητα των προνυμφών καταγράφηκε καθημερινά για δεκαέξι ημέρες και κυμάνθηκε από % για τον M robertsii μαζί με το B thuringiensis subsp. kurstaki και % για τον B. bassiana μαζί με το βάκιλο. Επίσης, η συνδυασμένη δράση των μικροοργανισμών υπολογίστηκε για την όγδοη, δέκατη τρίτη και τη δέκατη έκτη μέρα και βρέθηκε προσθετική στους περισσότερους συνδιασμούς για την δέκατη τρίτη και δέκατη έκτη μέρα ενώ την όγδοη μέρα η συνδυαστική δράση των παθογόνων βρέθηκε αρνητική στους περισσότερους συνδιασμούς και χαρακτηρίζεται ως ανταγωνιστική. Η ανάπτυξη των εντομοπαθογόνων μυκήτων όταν καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα που περιείχε υδατικό διάλυμα B. thuringiensis subsp. kurstaki, δεν επηρεάστηκε από την iii

10 Περίληψη παρουσία του βακτηρίου. Ο συνδυασμός του B. thuringiensis subsp. kurstaki με τους εντομοπαθογόνους μύκητες που εξετάσαμε είχε ως αποτέλεσμα να αυξηθεί η θνησιμότητα των προνυμφών του S. nonagrioides. Τα στελέχη ΙΓΕ3, Elateridae και Άγιος Στέφανος των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea αντίστοιχα, δοκιμάστηκαν επί των προνυμφών του S. nonagrioides σε τρεις κονιδιακές συγκεντρώσεις και μελετήθηκε η επίδρασή τους στην πρόσληψη τροφής, στην κατανάλωση τροφής και στην ανάπτυξη των προνυμφών. Παρατηρήθηκε μείωση της πρόσληψης τροφής από προνύμφες 3 ης προνυμφικής ηλικίας σε ποσοστά 41-81%, μείωση του βάρους τους κατά 29-45% και μείωση των απορριμάτων κατά 46-81%. Παρατηρήθηκε επίσης ελάττωση της σχετικής ταχύτητας ανάπτυξης των προνυμφών κατά 31-72% και της σχετικής ταχύτητας κατανάλωσης τροφής κατά 12-35%. Τέλος, ο δείκτης πεπτικότητας, ο δείκτης μετατροπής της προσληφθείσας τροφής και ο δείκτης μετατροπής της αφομοιωμένης τροφής ήταν υψηλότεροι σε σχέση με τους αντίστοιχους του μάρτυρα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ενδεχομένως ότι η μόλυνση από τους εντομοπαθογόνους μύκητες προκαλεί επιδείνωση σε ορισμένες τροφικές διεργασίες της προνύμφης που θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην υπονόμευσή της από ασιτία. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα στο πεδίο προκείμενου να μελετηθεί η επίδραση της ενδοφυτικής παρουσίας των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea στις προνύμφες του εντόμου S. nonagrioides in planta. Kαι οι τρείς μύκητες έδρασαν αποτρεπτικά απέναντι στην προσπάθεια των προνυμφών να εισέλθουν στο στέλεχος του φυτού. Οι προνύμφες της 4 ης προνυμφικής ηλικίας που πέτυχαν να εγκατασταθούν στο στέλεχος των φυτών δημιούργησαν στοές μικρότερου μήκους παρουσία των μυκήτων, και η θνησιμότητά τους ήταν μεγαλύτερη, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα των in vitro πειραμάτων. Ως προς τις επιπτώσεις της παρουσίας των ενδοφύτων στο φυτό ξενιστή, η επίδραση της παρουσίας των μυκήτων στην ανάπτυξη, την τελική βιομάζα και την κατανομή της βιομάζας σε υπέργειους ή υπόγειους ιστούς των φυτών καταγράφηκε ως ουδέτερη. Η συγκέντρωση της χλωροφύλλης και η περιεκτικότητα σε νερό δεν παρουσίασαν μεταβολές που μπορούν να αποδοθούν στην παρουσία των ενδοφύτων. Ωστόσο, ορισμένες παράμετροι της φωτοσυνθετικής διαδικασίας (καθαρή φωτοσύνθεση, ταχύτητα ροής ηλεκτρονίων, η πιθανότητα μετατροπής της iv

11 Περίληψη συλληφθείσας ενέργειας σε ροή ηλεκτρονίων, η πιθανότητα μεταφοράς ηλεκτρονίων από τους ενδιάμεσους φορείς μέχρι την αναγωγή των τελικών υποδοχέων στο PSI και ο δείκτης ζωτικότητας της φωτοσυνθετικής συσκευής PI total ) επηρεάστηκαν αρνητικά μετά την προσβολή των στελεχών του σόργου από τις προνύμφες του εντόμου. Η ενδοφυτική παρουσία των μυκήτων B. bassiana και M. robertsii απέτρεψε τις παραπάνω αρνητικές επιδράσεις. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προσφέρουν ισχυρές ενδείξεις για επιτυχή χρησιμοποίηση ορισμένων στελεχών των εντομοπαθογόνων μυκήτων στον έλεγχο των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides τόσο στο εργαστήριο όσο και στο πεδίο. Επίσης, θα ήταν ενδιαφέρουσα η περαιτέρω μελέτη της χρήσης αυτών των εντομοπαθογόνων μυκήτων κάτω από συνθήκες μειωμένης διαθεσιμότητας νερού. v

12 Abstract Abstract The aim of this study was to investigate the effect of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae), isolated from Greek soils against the main and most damaging pest of sweet sorghum, Mediterranean corn borer Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). Laboratory studies were performed to determine the effect of six strains of the above fungi on survival of larvae of S. nonagrioides. All strains of fungi causing high mortality among larvae, killed 78-98% of exposed larvae. The most effective were B. bassiana (IGE3), M. robertsii (Elateridae) and I. fumosorosea (Agios Stefanos). These three isolates were selected to examine the effect several conidial suspensions on the mortality of larvae. Recorded mortality was from 7% - 93% depending on the density of conidial suspensions used on larvae. From the above results was found that the capability provided by the entomopathogenic fungi to control the insect was according by the density of the conidial suspensions. Also, the interactions between commercial B. thuringiensis subsp. kurstaki and two entomopathogenic fungi were examined on larvae of S. nonagrioides in 8, 13 and 16 days post-treatment intervals. An overall positive interaction between the pathogens was observed and larval mortality at 16 days was % exposed to M. robertsii combined with B. thuringiensis subsp. kurstaki, whereas B. bassiana combined with B. thuringiensis subsp. kurstaki killed % of exposed larvae. After 8 days, in 6 of the combinations, we found an additive relationship between the pathogens, whereas, a negative interaction was observed in 10 of them. In contrast, after 13 days, we observed a positive interaction in two combinations which could be considered as synergistic, additive in ten combinations and negative in only four combinations. Finally, after 16 days, in eleven combinations we found an additive interaction, whereas negative interaction was recorded in five of them. We conclude that application of combined pathogens may be more effective for S. nonagrioides control. vi

13 Abstract The strains IGE3, Elateridae and Agios Stefanos of B. bassiana, M. robertsii and I. fumosorosea respectively, were tested for their effectiveness on larval food intake, food consumption and larvae growth at three conidial concentrations. We observed a decrease in food intake by the larvae ranged between 41 and 81%, reduced larvae weight from 29 to 45% and reduced production of wastes from 46 to 81%. We also recorded significant differences in the relative growth rate of larvae, the relative consumption rate of larvae, the index digestibility, the conversion ratio of ingested food and the conversion ratio of assimilated food between infected and control individuals. Therefore, it is possible that infection of larvae by the fungi has an adverse effect on physiological and metabolic processes which results in larva starvation. Subsequently, we performed experiments in the field, in order to investigate the plant endophyte association behavior using B. bassiana, M. robertsii and I. fumosorosea, as well as the impact of these associations on larva activity when in planta and under environmental conditions. All three fungal species significantly prevented larvae from entering into plants stalk. Statistically significant differences were also observed in the length of tunnels created by larvae in the stem of the plant and in their mortality for individuals infected by the entomopathogenic fungi. These results confirm our findings of the in vitro experiments. Regarding the effect of endophytes on the host plant, a neutral impact was recorded for the development, final biomass and distribution of biomass to the aboveground and underground plant tissues. Temporary changes of chlorophyll concentration and leaf water content stability throughout the experimental period should not be attributed to the presence of endophytes. However, some aspects of the photosynthetic process (net photosynthesis, electron transport rate, as well as parameters of the photosynthetic machinery relative to electron flow round the two photosystems) negatively affected after infection of plants by the larvae. The presence of B. bassiana and M. robertsii ameliorated these adverse effects. The results of this study are strongly indicative of successful usage of certain fungi strains for biological control of S. nonagrioides larvae both in laboratory conditions and in the field. vii

14 Εισαγωγή Α. Εισαγωγή Α.1. Γλυκό Σόργο (Sorghum bicolor) 1.1. Γενικά Οι ενεργειακές καλλιέργειες αφορούν καλλιεργούμενα ή αυτοφυή είδη, τα οποία παράγουν ως κύριο προϊόν βιομάζα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διάφορους ενεργειακούς σκοπούς (Monti και Venturi 2003). Το γλυκό σόργο [Sorghum bicolor (L.) Moench], διαθέτει υψηλή φωτοσυνθετική ικανότητα ως C4 φυτό, υψηλές αποδόσεις σε βιομάζα, υψηλό ποσοστό ζυμώσιμων σακχάρων και χαμηλές απαιτήσεις σε νερό και θρεπτικά συστατικά (Ryan et al. 2001). Επιπλέον, προσαρμόζεται εύκολα σε διάφορες κατηγορίες εδαφών, σε ποικίλες κλιματικές συνθήκες και έχει προταθεί ως ένα υποψήφιο είδος για συστηματική παραγωγή βιοαιθανόλης από τα υπολείμματα εκχύλισης των σακχάρων του (Reddy et al. 2003, Gosse 1996). Η Ε.Ε. έχει χρηματοδοτήσει τα τελευταία χρόνια αρκετές ερευνητικές μελέτες με στόχο τη χρησιμοποίησή του ως μία εναλλακτική και οικονομικά βιώσιμη λύση παραγωγής ενέργειας (Καβαδάκης κ.α. 2000). Η παραγωγή γλυκού σόργου στην Ελλάδα έχει αποκτήσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον την τελευταία δεκαετία και έχουν εξεταστεί αρκετές ποικιλίες (Keller, Wray, Mn1500, κ.ά.) (Alexopoulou et al. 2000, Νικολάου κ.α. 2000). Οι αποδόσεις τους ποικίλουν, ανάλογα με την περιοχή, τις κλιματικές συνθήκες, τη γονιμότητα του εδάφους και τις καλλιεργητικές τεχνικές, που εφαρμόζονται (Alexopoulou et al. 2000) Βοτανική ταξινόμηση και προέλευση Το όνομα γλυκό ή σακχαρούχο σόργο (Sweet Sorghum) χρησιμοποιείται για το χαρακτηρισμό των γλυκών και χυμωδών ποικιλιών σόργου, που ανήκουν στο είδος Sorghum bicolor (L.) Moench, της οικογένειας των Αγρωστωδών (Poaceae). Κατά τον De Wet (1970) το γένος περιλαμβάνει τρία διαφορετικά είδη: S. bicolor, S. halepencse και S. propinquum (Καραμάνος 1999). Το σόργο είναι ετήσιο φυτό με C4 φωτοσυνθετικό μεταβολισμό, η δε καταγωγή του εντοπίζεται στην Αφρική. Καλλιέργεια του σόργου αναφέρεται επίσης και στην Ινδία, την Ασσυρία, ενώ η καλλιέργεια έφτασε στην Κίνα το 13ο αιώνα και πολύ αργότερα στις Η.Π.Α. στις αρχές 17ου αιώνα (Undersander et al. 1992). Από τότε, το σόργο έχει εξαπλωθεί σε πολλές τροπικές, υποτροπικές και θερμές εύκρατες περιοχές του κόσμου. Το γλυκό σόργο όμως πέραν της διατροφικής του αξίας, θεωρείται η πιο υποσχόμενη «νέα ύλη» 1

15 Εισαγωγή για την ενέργεια και τη βιομηχανία (Billa et al. 1997). Όλες οι καλλιεργούμενες ποικιλίες σόργου ανήκουν στο υπο-είδος Sorghum bicolor subsp. bicolor και μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τη χρήση τους σε τέσσερις μεγάλες ομάδες (Dahlberg 1995, Νικολάου κ.ά. 2000): 1. Το σποροπαραγωγικό ή καρποδοτικό σόργο (Grain Sorghum), το οποίο καλλιεργείται για παραγωγή σπόρου, και είναι ένα εντατικά καλλιεργούμενο είδος σε πολλές χώρες της Αφρικής, ορισμένες περιοχές της Ινδίας και στις Η.Π.Α. 2. Το σόργο σάρωθροποιΐας (Broomcorn), το οποίο χρησιμοποιείται για την κατασκευή σκούπας από τις μακριές διακλαδώσεις της ταξιανθίας του. Το ινώδες σόργο (Fibre Sorghum) είναι υβρίδιο μεταξύ του σποροπαραγωγικού και του σόργου σαρωθροποιΐας, με υψηλό ποσοστό κυτταρίνης και χαμηλή περιεκτικότητα σε διαλυτά σάκχαρα (Gosse 1996). 3. Το σόργο του Σουδάν (Sudangrass), το οποίο καλλιεργείται για ζωοτροφή. Έχει πλούσια φυτική μάζα, ταχεία ανάπτυξη και ευχέρεια στην αναβλάστηση μετά την κοπή. Το γλυκό σόργο του Σουδάν (Sweet Sudangrass) που προέρχεται από τη διασταύρωση του σόργου του Σουδάν με το σακχαρούχο σόργο έχει γλυκύτερα και παχύτερα στελέχη. 4. Το γλυκό ή σακχαρούχο σόργο (Sweet Sorghum), το οποίο καλλιεργείται για τα γλυκά στελέχη του, κυρίως για την παραγωγή αιθανόλης, αλλά και για ζωοτροφή. Ποικιλίες με χοντρά και ψηλά στελέχη με υψηλή περιεκτικότητα σε σάκχαρα στο στέλεχος (κυρίως σακχαρόζη), τα οποία είναι εύκολα ζυμώσιμα Κυριότεροι εχθροί της καλλιέργειας του Γλυκού Σόργου στην Ελλάδα Στην Ελλάδα, η καλλιέργεια του γλυκού σόργου σχετίζεται με την παραγωγή αιθανόλης από την βιομάζα του και βρίσκεται ακόμη σε πειραματικό επίπεδο. Εντούτοις, κατά την καλλιέργεια του γλυκού σόργου εντοπίστηκαν προβλήματα προσβολών που επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την απόδοση και την ποιότητά του. Οι σημαντικότερες ζημίες στην καλλιέργεια του γλυκού σόργου οφείλονται σε προσβολές από έντομα της οικογένειας Noctuidae (Dimas et al. 2007). 2

16 Εισαγωγή Α.2. Το έντομο Sesamia nonagrioides 2.1. Βιολογία του εντόμου Το S. nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae) είναι ένα πολυφάγο και πολυκυκλικό είδος που προκαλεί σοβαρές ζημίες κυρίως σε είδη της οικογένειας Poaceae, όπως το καλαμπόκι (Zea mays), το ρύζι (Oryza sativa), το σόργο (Sorghum bicolor), τη βρώμη (Avena sativa), το κεχρί (Panicum sp.), το σακχαροκάλαμο (Saccarum officinalis) και λιγότερο συχνά στο σπαράγγι (Asparagus officinalis), το βαμβάκι (Gossypium sp.) και σε άλλα είδη της οικογένειας Solanaceae (Stavrakis 1967, Ζαρταλούδης κ.α. 1997, Ntanos και Koutroubas 2000, Dimas et al. 2007, Ανδρεάδης κ.α. 2007). Έχει επίσης αναφερθεί ότι προσβάλλει τη μπανάνα (Musa sp.) (Uygun και Kayapinar 1993), το πεπόνι και το φοίνικα (Eizaguirre και Fantinou 2012) και το καλλωπιστικό φυτό Strelizia reginae (Allsopp και Sallam 2001) και διάφορα είδη αναρριχητικών φυτών (Tams και Bowden 1953) Η διάρκεια ζωής των ενηλίκων είναι μερικές ημέρες (5 12) και εξαρτάται από μια σειρά βιολογικών και οικολογικών παραγόντων (Lopez et al. 2003). Η διάρκεια ζωής των θηλυκών ενηλίκων είναι 12 ημέρες στους 20 ο C και 6 ημέρες στους 30 ο C ενώ των αρσενικών ενηλίκων 9 ημέρες στους 20 ο C και 30 ο C (Θανόπουλος και Τσιτσιπής 1986). Η έξοδος των ενηλίκων, η πτήση, η σύζευξη και η αναπαραγωγή τους, πραγματοποιούνται τη νύχτα. Τα ενήλικα που εμφανίζονται την άνοιξη, έχουν χαμηλότερο ποσοστό σύζευξης (41%) από ότι τα ενήλικα που εμφανίζονται το καλοκαίρι (63%) ή το φθινόπωρο (49%) (Fantinou et al. 2008). Το μεγαλύτερο μέγεθος του πληθυσμού παρατηρείται στα μέσα Σεπτεμβρίου (Τσιτσιπής κ.α. 1987). Η ωοτοκία αρχίζει μια ημέρα μετά τη σύζευξη. Το θηλυκό γεννά τα αυγά του κατά ωομάζες, σε παράλληλες γραμμές στην εσωτερική επιφάνεια του κολεού των φύλλων του φυτού ξενιστή (De Santis et al. 2007). Ωοτοκεί αυγά ανά ημέρα: το 45% του συνόλου την πρώτη νύχτα, 25% την δεύτερη και στην συνέχεια το ποσοστό μειώνεται (Αλεξανδρή 1986). Η περίοδος ωοτοκίας διαρκεί περίπου μέρες (Al Salti και Galighet 1986). Ο Hilal (1978) αναφέρει μέσο αριθμό αυγών ανά θηλυκό ενήλικο 440, ο Tsitsipis (1990) περισσότερα από 100 αυγά ανά θηλυκό ενήλικο ενώ η Αλεξανδρή (1986) 709 ανά θηλυκό ενήλικο. Η εκκόλαψη των αυγών πραγματοποιείται σε 7-15 ημέρες στους 20 ο C και σε 3-10 ημέρες στους 30 ο C (Θανόπουλος και Τσιτσιπής 1986). Οι προνύμφες τις πρώτης γενεάς μετακινούνται και προσβάλλουν το στέλεχος σε άλλα μεσογονάτια και αρχίζουν να ορύσσουν στοά στο στέλεχος 48 ώρες μετά την 3

17 Εισαγωγή εκκόλαψή τους. Οι προνύμφες της επόμενης γενεάς ή γενεών εντοπίζονται όχι μόνο στο στέλεχος φυτών ξενιστών όπως το καλαμπόκι και το σόργο αλλά και στους σπάδικες του καλαμποκιού (Θανόπουλος και Τσιτσιπής 1986). Η προνύμφη νυμφώνεται στο εσωτερικό του στελέχους του φυτού. Πριν την νύμφωση, η προνύμφη κατασκευάζει μια διευρυμένη στοά, η οποία εξωτερικά καταλήγει σε μια οπή εξόδου για το νεαρό ενήλικο άτομο, που καλύπτεται από φυτικούς ιστούς του στελέχους ή του κολεού των φύλλων (Μπαμπίλης 1992). Το ενήλικο εξέρχεται από τη στοά σπάζοντας τους φυτικούς ιστούς, οι οποίοι καλύπτουν το άνοιγμα της εξόδου. Το S. nonagrioides διαχειμάζει ως αναπτυγμένη προνύμφη σε κατάσταση διάπαυσης στα υπολείμματα της καλλιέργειας (στέλεχος, σπάδικες και ριζικό σύστημα κοντά στην επιφάνεια του εδάφους), καθώς επίσης και σε αυτοφυή φυτά της οικογένειας Poaceae (Anglade και Vible 1999, Allsopp και Sallam 2001). Στην χώρα μας το έντομο εισέρχεται σε διάπαυση από τα μέσα Σεπτεμβρίου (Fantinou et al. 1998b). Η περάτωση της διάπαυσης λαμβάνει χώρα νωρίς τον χειμώνα. Στη συνέχεια ακολουθεί μια μεταδιαπαυτική περίοδος, όπου το έντομο διατηρείται σε κατάσταση αδράνειας, τόσο για την αποφυγή των χαμηλών θερμοκρασιών μέχρι το πέρας του χειμώνα όσο και για την επίτευξη συγχρονισμού μεταξύ της εξόδου των ενηλίκων και της εμφάνισης των ξενιστών τους (Gillyboeuf et al. 1994). Έτσι, η νύμφωση αρχίζει περί τα μέσα Μαρτίου και τα πρώτα ενήλικα εμφανίζονται στις αρχές Απριλίου (Fantinou et al. 1998b). Ο πληθυσμός του εντόμου την εποχή αυτή βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα, ωστόσο αυξάνεται προοδευτικά. Ο αριθμός των γενεών που αναπτύσσονται ετησίως εξαρτάται κατά κύριο λόγο από το μικροκλίμα της περιοχής (θερμοκρασία και υγρασία). Στην Ελλάδα, στις νοτιότερες περιοχές, η πτήση των ενηλίκων αρχίζει στα μέσα Μαρτίου και διαρκεί ως τις αρχές Νοεμβρίου, συμπληρώνοντας τέσσερις γενεές (Fantinou et al. 2008, Eizaguirre και Fantinou 2012). Στις βορειότερες περιοχές της χώρας, τα ενήλικα της πρώτης γενεάς εμφανίζονται στα τέλη Απριλίου και αφού συμπληρωθούν τρεις και μερικές φορές τέσσερις γενεές, η πτήση τους ολοκληρώνεται στις αρχές Οκτωβρίου (Τσιτσιπής κ.α. 1987) Μορφολογία του εντόμου Το τέλειο έντομο S. nonagrioides έχει σώμα βραχύ (15mm) και χρωματισμό καστανόχρυσο. Ο θώρακας είναι χνουδωτός με κύριο χρωματισμό καστανό ανοιχτό ή ισαβέλιο, με διάφορες κηλίδες και σχήματα που ποικίλουν σε ένταση και έκταση 4

18 Εισαγωγή (Σταμόπουλος 1999). Στο θηλυκό ο θώρακας είναι ιδιαίτερα χνουδωτός σε σχέση με το αρσενικό. Σε ορισμένες περιπτώσεις το στοιχείο αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη διάκριση των δύο φύλων. Τα θηλυκά άτομα είναι κατά κανόνα μεγαλύτερα από τα αρσενικά. Το άνοιγμα των πτερύγων είναι mm στα αρσενικά και mm στα θηλυκά. Οι πρόσθιες πτέρυγες έχουν χρώμα ανοιχτό καστανό, κατά μήκος δε και στο μέσον αυτών υπάρχει μία γραμμή με σκούρα καστανή απόχρωση ενώ φέρουν ακαθόριστα στίγματα στην επιφάνεια τους (Σταμόπουλος 1999). Στην εξωτερική πλευρά ξεχωρίζουν πέντε μαύρα στίγματα, σε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους. Οι οπίσθιες πτέρυγες έχουν χρώμα λευκό, αργυρόχροο (Εικ. 1). Οι κεραίες των αρσενικών είναι αμφικτενοειδείς σε όλο τους το μήκος, διακριτικό γνώρισμα του S. nonagrioides σε σχέση με το S. cretica, ενώ των θηλυκών, νηματοειδείς. Η μορφή των κεραιών αποτελεί το κύριο χαρακτηριστικό για την διάκριση των δύο φύλων. Εικόνα 1. Ενήλικο άτομο του εντόμου S. nonagrioides Τα αυγά είναι σφαιρικά, με διάμετρο 1mm περίπου, πεπλατυσμένα στους πόλους και με ραβδώσεις κατά μήκος. Το χρώμα είναι ανοιχτό κίτρινο, εν συνεχεία ροδόχροο και τέλος σκούρο καστανό. Η επώαση των αυγών διαρκεί 6.5 μέρες, στους 25 ο C (Hilal 1978) (Εικ. 2). 5

19 Εισαγωγή Εικόνα 2. Ομάδα αυγών του S. nonagrioides Το χρώμα της προνύμφης κυμαίνεται από λευκό λευκορόδινο αλλά και λευκοκίτρινο, φαιό ή ρόδινο, ανάλογα με το φυτό ξενιστή. Η κεφαλική κάψα και η προθωρακική πλάκα έχουν λαμπερό σκούρο καστανό χρώμα. Το μήκος φθάνει τα mm και στον κορμό της διακρίνονται δυο σειρές μαύρων αναπνευστικών στιγμάτων, μια σε κάθε πλευρά. Η νύμφη περιβάλλεται από μετάξινα νήματα. Έχει μήκος περίπου 20mm και σχήμα ημικυλινδρικό, χρωματισμό ανοιχτό καστανό τις πρώτες 2 3 ημέρες και στη συνέχεια αποκτά σκούρο καστανό χρώμα μέχρι την έξοδο του ενήλικου (Hilal 1978). Επίσης φέρει δυο κοιλιακά και δυο νωτιαία άγκιστρα στην επιφάνεια της κοιλίας της. Η νύμφη από την οποία θα προκύψει το θηλυκό άτομο είναι συνήθως μεγαλύτερη σε μέγεθος από εκείνη που θα προκύψει το αρσενικό άτομο. Η στάση που παίρνει η νύμφη συνήθως είναι κεκαμμένη (Καγκελάρης 2003) Ταξινομική θέση του εντόμου Το είδος S. nonagrioides περιέγραψε για πρώτη φόρα ο Lefebvre το 1827, δίδοντας του το όνομα Cossus nonagrioides. Το 1852, ο Guenne κατατάσσει το έντομο στο γένος Sesamia. Το 1934, οι Rocci και Turati αναφερόμενοι στο είδος αυτό το κατατάσσουν στο Sesamia vuteria Stoll, δίδοντας σε παρένθεση ως συνώνυμο το nonagrioides, συνωνυμία την οποία διευκρινίζει αργότερα ο Μπατζάκης (1970). Για 6

20 Εισαγωγή το είδος αυτό υπήρχε σύγχυση, όσον αφορά την ταυτότητά του, λόγω των διαφόρων συνωνύμων, μερικά από τα οποία αφορούν άλλα είδη του γένους Sesamia. Μετά από συνεχείς αλλαγές το έντομο τοποθετήθηκε εκ νέου στο γένος Sesamia από τους Tam και Bowden (1953). Στην Ελλάδα, η πρώτη αναφορά του εντόμου γίνεται από τον Καλογερέα, το 1930 σε κατάλογο εντόμων, τα οποία συνέλεξε κατά το διάστημα στη Λάρισα. Οι Rocci και Turati (1934) αναφέρουν την ύπαρξη του είδους και στην Ελλάδα, χωρίς ωστόσο να καταγράφουν συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές που απαντά. Το 1939, ο Ισαακίδης σε κατάλογο βλαβερών εντόμων αναφέρει την ύπαρξη άλλου είδους του ιδίου γένους και συγκεκριμένα του S. cretica στις περιοχές Άρτας, Κωπαΐδας και Μεσολογγίου. Αναφορά του S. cretica, γίνεται επίσης από τον Πελεκάση το 1962, σε κατάλογο των σημαντικότερων επιβλαβών εντόμων της περιόδου , χωρίς να αναφέρεται η ύπαρξη του S. nonagrioides. Ο κυριότερος εχθρός του αραβοσίτου είναι το είδος S. nonagrioides στην Ελλάδα ωστόσο καταγράφεται και η ύπαρξη του S. cretica (Stavrakis 1967). Η Αλεξανδρή (1986), αναφέρει ότι κανένα άτομο της S. cretica δεν βρέθηκε στις περιοχές Αλεξανδρούπολης, Λάρισας, Λαμίας Κωπαΐδας, Αιτωλοακαρνανίας, Ηλείας και Ιστιαίας κατά το Τα τελευταία χρόνια στην Ελλάδα δεν έχει αναφερθεί το είδος S. cretica. Όλες οι ερευνητικές εργασίες αναφέρονται στο S. nonagrioides. Το έντομο εντοπίζεται στις περιοχές της Πελοποννήσου, της Αττικής, της Βοιωτίας, της Λάρισας, της Μακεδονίας, της Θράκης και η ταξινομική κατάταξη είναι: ΚΛΑΣΗ: ΤΑΞΗ: ΥΠΟΤΑΞΗ: ΔΙΑΙΡΕΣΗ: ΥΠΟΔΙΑΙΡΕΣΗ: ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: ΓΕΝΟΣ ΕΙΔΟΣ Insecta Lepidoptera Heteroneura Ditrysia Heterocera Noctuoidea Noctuidae Amphipyrinae Sesamia nonagrioides (Lefebvre) 7

21 Εισαγωγή 2.4. Η Γεωγραφική εξάπλωση του εντόμου Το S. nonagrioides εντοπίζεται στις περισσότερες Μεσογειακές χώρες (Lobos 1981). Εκτείνεται βόρεια μέχρι πλάτους 45 ο, ενώ νότια έχει αναφερθεί και σε περιοχές της Β. Αφρικής: Μαρόκο, Αλγερία, Σενεγάλη, Σουδάν καθώς και στην Ουγκάντα, στην Μαδέρα, στις Αζόρες και στους Καναρίους νήσους (Tams και Bowden 1953). Στο Μαρόκο, όπως αναφέρει ο Hilal (1978) το έντομο συμπληρώνει 4 γενεές το χρόνο σε διαφορετικούς ξενιστές της οικογένειας Poaceae. Οι προσβολές από το S. nonagrioides στο σακχαροκάλαμο έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένη περιεκτικότητα σε σακχαρόζη (σουκρόζη) και αυξημένη σε δεξτράνη (γλυκόζη) στο χυμό του (Hilal 1985). Ωστόσο, το σακχαροκάλαμο δεν φαίνεται να είναι ο καταλληλότερος ξενιστής γι αυτό το είδος στο Μαρόκο. Οι προνύμφες που τρέφονται στις ταξιανθίες ή στα στελέχη του καλαμποκιού έχουν υψηλότερη ταχύτητα ανάπτυξης και αύξησης του βάρους, καθώς και τη χαμηλότερη προνυμφική θνησιμότητα. Αντίθετα οι προνύμφες που τρέφονται στο σιτάρι και στο σακχαροκάλαμο, παρουσιάζουν χαμηλή ταχύτητα ανάπτυξης και υψηλή θνησιμότητα (10-25%), πράγμα που μπορεί να εξηγεί τη συγκριτικά χαμηλότερη πυκνότητα προνυμφών που παρατηρείται στην καλλιέργεια του σακχαροκάλαμου (1 προνύμφη/φυτό) ενώ στο καλαμπόκι παρατηρούνται σχεδόν 10 προνύμφες/φυτό (Hilal 1985) Στην Ισπανία, ο χρόνος εμφάνισης του εντόμου προσδιορίζεται από τα μέσα Μαΐου έως τον Σεπτέμβριο, εμφανίζοντας δυο γενεές, με τη πτήση των ακμαίων της πρώτης γενιάς να λαμβάνει χώρα το Μάιο και της δεύτερης τον Ιούλιο Αύγουστο (Delgado de Torres 1930, Moreno 1972, Allsop και Sallam 2001). Στη βορειοδυτική Ισπανία, το λεπιδόπτερο S. nonagrioides προσβάλλει το καλαμπόκι παράλληλα με το λεπιδόπτερο Ostrinia nubilalis. Οι προνύμφες της πρώτης γενιάς και των δύο ειδών, σπάνια προσβάλλουν το καλαμπόκι και φαίνεται να εκμεταλλεύονται εναλλακτικούς ξενιστές. Αργότερα το φθινόπωρο, τα περισσότερα φυτά καλαμποκιού προσβάλλονται από το S. nonagrioides και σε μικρότερο βαθμό από το O. nubilalis. Οι προνύμφες και των δύο ειδών διαχειμάζουν στα φυτά καλαμποκιού που εγκαταλείπονται συνήθως, στους αγρούς μετά τη συγκομιδή. Δεδομένου ότι οι χειμώνες είναι ηπιότεροι στην βορειοδυτική Ισπανία, οι περισσότερες προνύμφες είναι δυνατό να επιβιώσουν μέχρι την επόμενη άνοιξη (Cordero et al. 1998). Στην Γαλλία καταγράφεται εμφάνιση δυο γενεών το χρόνο για το έντομο S. nonagrioides στο καλαμπόκι και η περίοδος εμφάνισης δραστήριων σταδίων του 8

22 Εισαγωγή εντόμου ικανών να προκαλέσουν ζημιά είναι από το Μάη μέχρι τον Ιούλη και από τον Αύγουστο μέχρι τον Οκτώβρη. (Nepveu 1953, Αnglade 1972, Naino et al. 1996, Frerot et al. 1997). Στην Σικελία, παρατηρείται εμφάνιση των πρώτων τέλειων εντόμων κατά το τέλος Μαρτίου, οι τελευταίες δε ωοτοκίες λαμβάνουν χώρα τον Οκτώβριο έως τον Δεκέμβριο (Nicifora 1966). Ανάλογες παρατηρήσεις έγιναν στην Μεσσήνα (Marianni 1934), στην Σαρδηνία (Prota 1965), στο Ισραήλ (Rinvay 1963), στην Τουρκία (Sertkaya et al. 2005), στο Ιράν (Baniabbassi 1981), στην Πορτογαλία, στην πρώην Γιουγκοσλαβία, Ισραήλ ( Kravchenko και Muller 2008), Κύπρο (Krambias et al. 1973) και τέλος στην Ιταλία. Τέλος, στη Νότια Ανατολία (Τουρκία), σχεδόν το 59% φυτειών μπανανιάς βρέθηκαν με μεγάλα ποσοστά προσβολών κατά τη διάρκεια των αρχών της δεκαετίας του 90. Ο πληθυσμός του εντόμου έφθασε στη μεγαλύτερη πυκνότητα μέχρι το Σεπτέμβριο Νοέμβριο και η ζημιά που προκάλεσαν οι προνύμφες ήταν μεγαλύτερη στα νεαρά φυτά. Η πυκνότητα του πληθυσμού και η προσβολή από το S. nonagrioides στις φυτείες μπανανιάς σχετιζόταν άμεσα με την παρουσία φυτών αραβοσίτου που είναι και ο κύριος ξενιστής του S. nonagrioides (Uygun και Kayapinar 1993) Ζημία Η ζημία που προκαλεί το έντομο S. nonagrioides, ιδιαίτερα στις όψιμες (επίσπορες) καλλιέργειες καλαμποκιού είναι πολύ σοβαρή και μπορεί να φτάσει το 50% της παραγωγής (Τσιτσιπής κ.α 1991). Οι προνύμφες της πρώτης γενεάς προσβάλουν τα νεαρά φυτά στην βάση του ακραίου φύλλου, οπότε παρατηρείται μάρανσή του, ενώ επηρεάζεται και η κορυφή του φυτού, με άμεση συνέπεια την ανάπτυξη πλευρικών στελεχών σε καλαμπόκι και σόργο με αποτέλεσμα την καθυστέρηση στην ανάπτυξη του φυτού. Οι προνύμφες των επόμενων γενεών προσβάλουν ανεπτυγμένα φυτά προκαλώντας αυλακώσεις στο στέλεχος, ενώ παράλληλα τρέφονται από την ράχη του σπάδικα, τα άνθη και τους σπόρους, με αποτέλεσμα τη μείωση της ποσότητας, του βάρους και της ποιότητας του παραγόμενου σπόρου (Τσιτσιπής κ.α 1991). Εκτός από την άμεση ζημία που προκαλεί η προνύμφη του εντόμου παρατηρούνται και έμμεσες ζημίες όπως εύκολη θραύση των στελεχών από τον άνεμο και προσβολή σε συνθήκες υψηλής υγρασίας, των προσβεβλημένων μερών του φυτού 9

23 Εισαγωγή από τον μύκητα Fusarium moniliforme (Sobek και Munkvold, 1999) Αντιμετώπιση του Εντόμου Τα μέτρα που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση του εντόμου μπορούν να ταξινομηθούν σε: καλλιεργητικά, βιολογικά, χημικά και χρήση γενετικά τροποποιημένων ποικιλιών. Οι ζημιές από την πρώτη γενεά, κυρίως στο καλαμπόκι, δεν φαίνεται να αποτελούν σοβαρό πρόβλημα για την ελληνική γεωργία διότι οι πληθυσμοί του εντόμου είναι πολύ χαμηλοί στις αρχές της άνοιξης (Fantinou και Kagkou 2000, Allsopp και Sallam 2001). Σημαντικό ρόλο για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του εντόμου S. nonagrioides παίζει η επιλογή των ποικιλιών του καλαμποκιού και του σόργου που θα επιλεχθούν (Σταμόπουλος 1999). Η καλλιέργεια ποικιλιών που εμφανίζουν αφενός καλή προσαρμογή στις εκάστοτε εδαφοκλιματικές συνθήκες και αφετέρου ανθεκτικότητα έναντι του συγκεκριμένου εντόμου, θεωρείται ότι θα συμβάλλει στον περιορισμό των υψηλών πληθυσμών του εντόμου. Επιπλέον, η εφαρμογή καταλλήλων καλλιεργητικών μέτρων, όπως η πρώιμη σπορά προκειμένου τα φυτά να έχουν αναπτυχθεί αρκετά την περίοδο που το έντομο αρχίζει να δραστηριοποιείται, αλλά και η καταστροφή των υπολειμμάτων της καλλιέργειας αμέσως μετά την συγκομιδή, μπορούν να οδηγήσουν σε αποτελεσματική αντιμετώπιση του S.nonagrioides (Τσιτσιπής κ.α. 1991). Για τη βιολογική αντιμετώπιση του εντόμου S. nonagrioides, συστήνεται η χρήση μικροβιακών σκευασμάτων του B. thuringiensis subsp kurstaki (ΥΠΑΑΤ 2013). Στην Ελλάδα, τα ωά του S. nonagrioides έχει βρεθεί να παρασιτούνται από το ωοπαράσιτο Platylenomus busseola, το οποίο προσβάλλει έως και το 90% των ωών του εντόμου και από το ωοπαράσιτο Telenomus busseolae (Alexandri και Tsitsipis 1990, Fantinou et al. 1998a, Καγκελάρης 2003, De santis et al. 2008). Παρασιτοειδή που προσβάλουν τις προνύμφες του εντόμου είναι το Lydella thompsoni, το Habrobracon hebetor και τέλος το Campoplex sp. (Eizaguirre 1989, Alexandri και Tsitsipis 1990). Σε άλλες χώρες της μεσογείου έχουν αναφερθεί ως παρασιτοειδή του εντόμου το Trichogramma evascens που παρασιτεί τα ωά, το Cotesia ruficrus που παρασιτεί την προνύμφη και τα Ichneumon sarcitorius, Pimpla spuria και Barichneumon sp. που παρασιτούν την νύμφη του εντόμου. (Colazza et al. 1997, Sertkaya και Kornosor 1999, Sertkaya και Kornosor 2003). 10

24 Εισαγωγή Επίσης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν βιοτεχνολογικές μέθοδοι που εκμεταλλεύονται ορισμένα βιολογικά χαρακτηριστικά και ιδιαιτέρως στοιχεία συμπεριφοράς του εντόμου. Η προσέλκυση και μαζική παγίδευση του εντόμου με την χρήση φερομονικών παγίδων (Μπαμπίλης 1992) ή φωτoπαγίδων (φθορισμού) (Τσιτσιπής κ.α. 1991) μπορεί να δώσει ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στον έλεγχο του πληθυσμού του εντόμου. Η παρεμπόδιση της σύζευξης των ενηλίκων ατόμων επιτυγχάνεται είτε με την χρήση εξατμιστήρων φερομόνης είτε με την χρήση ψεκάσιμου μίγματος φερομόνης που οδηγεί σε δραστική μείωση του πληθυσμού (Μπαμπίλης 1992, Albajes et al. 2002). Εκτός των προαναφερόμενων μεθόδων, έχουν δημιουργηθεί και χρησιμοποιούνται στις Η.Π.Α και σε άλλες χώρες γενετικά τροποποιημένες ποικιλίες καλαμποκιού με τοξίνες του εντομοπαθογόνου βακτηρίου B. thuringiensis subsp. kurstaki εναντίον προνυμφών των λεπιδόπτερων εντόμων (Fitt 2008, Lawo et al. 2008). Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά επηρεάζουν μόνο το έντομο στόχο και με την χρήση τους μειώνεται η χρήση εντομοκτόνων (Letourneau et al. 2003). Η χημική καταπολέμηση επιβάλλεται να εφαρμόζεται μόνο όταν και όπου κρίνεται πραγματικά αναγκαία κι εφόσον δεν υπάρχει εναλλακτικός τρόπος αντιμετώπισης (Θανόπουλος και Τσιτσιπής 1989). Στην περίπτωση του εντόμου S. nonagrioides, η έγκαιρη εφαρμογή εντομοκτόνων είναι ιδιαίτερα σημαντική αφού αν εφαρμοστεί κατά τη διάρκεια της πρώτης προνυμφικής ηλικίας δηλαδή πριν το έντομο προλάβει να εισέλθει στο εσωτερικού του στελέχους του φυτού ή στο στάδιο του ωού, οδηγεί σε δραστική μείωση των πληθυσμών και σε μείωση του αριθμού των επαναληπτικών εφαρμογών στις επόμενες γενεές (Τσιτσιπής κ.α. 1991). Τα επιτρεπόμενα χημικά σκευάσματα στη Ελλάδα ανήκουν στην ομάδα των οργανοφωσφορικών (Phosmet), οξαδιαζινών (Indoxacarb) και των πυρεθροειδών (Deltamethrin) (ΥΠΑΑΤ 2013). Η χρήση των παραπάνω βιολογικών και χημικών μεθόδων αντιμετώπισης δεν είναι αποτελεσματική κατά τις φάσεις που το έντομο δραστηριοποιείται και τρέφεται στο εσωτερικό του στελέχους του φυτού. Επομένως, υπάρχει ανάγκη να δοκιμαστούν και να αξιολογηθούν παθογόνοι παράγοντες που θα πρέπει να είναι αποτελεσματικοί έναντι του εντόμου όταν αυτό δραστηριοποιείται στο εσωτερικό του φυτού και ουδέτεροι για το φυτό ξενιστή. 11

25 Εισαγωγή Α.3. Η βιολογική και ολοκληρωμένη αντιμετώπιση των εχθρών των καλλιεργειών Η ολοκληρωμένη αντιμετώπιση των εχθρών των καλλιεργειών (Integrated Pest Management IPM), σύμφωνα με τον Huffaker (1971), είναι ένα σύστημα αντιμετώπισης εχθρών, στα πλαίσια συγκεκριμένων περιβαλλοντολογικών συνθηκών και της δυναμικής πληθυσμών του εχθρού που περιλαμβάνει όλες τις μεθόδους και τεχνικές κατά τον πλέον εναρμονισμένο τρόπο και επιτυγχάνει τη διατήρηση του πληθυσμού του εχθρού κάτω από επίπεδο που δύναται να προξενήσει οικονομική ζημία στην καλλιέργεια. Είναι δηλαδή, μια οικολογικά βασισμένη στρατηγική αντιμετώπισης εχθρών των καλλιεργειών που στηρίζεται κυρίως σε φυσικούς παράγοντες θνησιμότητας (φυσικοί εχθροί) και αναζητεί τακτικές οι οποίες δεν διαταράσσουν ή διαταράσσουν όσο γίνεται λιγότερο το περιβάλλον. Ως βιολογική καταπολέμηση αναφέρεται η αντιμετώπιση των εχθρών (εντόμων, μικροοργανισμών, νηματωδών και ζιζάνιων), των καλλιεργούμενων φυτών με τη βοήθεια άλλων οργανισμών. Σύμφωνα με τους Van Driesche και Bellows (1996), ως βιολογική αντιμετώπιση εντόμων ορίζεται η δράση των φυσικών εχθρών των επιβλαβών εντόμων. Στις κατηγορίες των φυσικών εχθρών εντάσσονται τα ωφέλιμα αρθρόποδα και ακάρεα (παρασιτοειδή, αρπακτικά), οι εντομοπαθογόνοι νηματώδεις και οι παθογόνοι μικροοργανισμοί (μύκητες, βακτήρια ιοί). Οι κατηγορίες των φυσικών εχθρών διαφέρουν σημαντικά στη βιολογία και συμπεριφορά τους και ως εκ τούτου στην ικανότητα να ελέγξουν τον πληθυσμό των εχθρών σε κάθε περιβάλλον. Για τη σωστή άλλα και έγκαιρη χρήση των φυσικών εχθρών χρειάζεται καλή γνώση του βιολογικού κύκλου τόσο των εχθρών (βιολογία, διαχείμαση κ.α.) όσο και των φυσικών τους εχθρών. Έτσι μπορεί να καταρτιστεί ένα ολοκληρωμένο πρόγραμμα αντιμετώπισης των εχθρών (Pickett και Bugg 1998). Η παθογένεια, η οποία προκαλείται από τους μικροοργανισμούς δεν είναι ίδια σε όλα τα έντομα και διαφέρει ακόμα και σε κάθε στάδιο του εντόμου. Συνήθως είναι μεγαλύτερη στα νεαρά στάδια του εντόμου, ιδιαίτερα στο στάδιο της προνύμφης. Το σημείο εισόδου ή ανάπτυξης ενός παθογόνου διαφέρει, ανάλογα με το έντομο και το εκάστοτε παθογόνο. Συνήθως η είσοδος των παθογόνων γίνεται από την στοματική οδό, ενώ οι μύκητες έχουν τη δυνατότητα να εισβάλλουν στον ξενιστή τους και από τον εξωσκελετό (cuticula) του εντόμου (Jackson et al. 2000). 12

26 Εισαγωγή Α.4. Εντομοπαθογόνοι μύκητες Περισσότερα από 750 είδη παθογόνων μυκήτων από 85 γένη έχουν απομονωθεί από έντομα, αλλά μέχρι σήμερα ένας μικρός αριθμός τους έχει αξιοποιηθεί ως εντομοκτόνα (McCoy et al. 1998). Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες κατατάσσονται ταξινομικά στο υποφύλο των Ασκομυκήτων και συγκεκριμένα στην τάξη των Hypocreales, με πιο σημαντικά γένη αυτά των Beauveria, Metarhizium και Isaria. Από τα διάφορα είδη εντόμων, τα πιο ευπαθή σε μυκητολογικές μολύνσεις, είναι τα Λεπιδόπτερα (προνύμφες), από τα Ημίπτερα οι αφίδες και είδη που ανήκουν στις Οικογένειες Cicadidae και Coccidae, από τα Υμενόπτερα τα Vespoidea, από τα Κολεόπτερα είδη της οικογένειας Scarabaeidae και από τα Δίπτερα είδη του γένους Hylemyia και τα κουνούπια (Warui και Kuria 1983, St Leger et al. 1992, Pingel και Lewis 1996, Vandenberg et al. 1998, Tefera και Pringle 2003, 2004, Ownley 2004, Posada et al. 2007, Tefera και Vidal 2009, Aboot et al. 2010, Gurulingappa et al. 2011) Μόλυνση Βιολογικός κύκλος Η μόλυνση ενός εντόμου από εντομοπαθογόνο μύκητα είναι αποτέλεσμα της επαφής των σπορίων του μύκητα με την επιδερμίδα του εντόμου. Η διαδικασία με την οποία οι εντομοπαθογόνοι μύκητες εισέρχονται στο έντομο είναι μια αλληλουχία γεγονότων και επηρεάζεται από εσωτερικούς και εξωτερικούς παράγοντες, οι οποίοι τελικά καθορίζουν εάν το παθογόνο θα διαρρήξει την επιδερμίδα του ξενιστή ή όχι. Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες έχουν βιολογικό κύκλο που συγχρονίζεται με αυτόν του ξενιστή αλλά και με τις περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν (Shahid et al. 2012). Η μόλυνση μπορεί να ανασταλεί λόγω της χαμηλής σχετικής υγρασίας, της αδυναμίας χρήσης διαθεσίμων θρεπτικών παραγόντων στην επιδερμίδα του εντόμου και της απουσίας παραγόντων απαραίτητων για την αναγνώριση του ξενιστή (Sierotzki et al. 2000, Pell et al. 2001, Shaw et al. 2002). Επίσης, συνοδεύεται και από αλλαγές στη συμπεριφορά του εντόμου κυρίως όσον αφορά τη μετακίνηση, τη διατροφή και την ωοτοκία. Η μείωση της διατροφής του εντόμου είναι μια από τις πρώτες έκδηλες αλλαγές. Ακολουθούν η νωθρότητα και η εμφάνιση διαταραχών κατά την ωοτοκία. Μετά το πέρας 3 έως 7 ημερών επέρχεται ο θάνατος του ξενιστή από ασιτία (Hajek 1989, Hussain et al. 2009, Shahid et al ). 13

27 Εισαγωγή Ο κύκλος ανάπτυξης των εντομοπαθογόνων μυκήτων in vivo περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα: α) προσκόλληση του κονιδίου στην επιδερμίδα του ξενιστή, β) σχηματισμός βλαστικού σωλήνα, γ) διάτρηση της επιδερμίδας, δ) παραγωγή ενζύμων προς διευκόλυνση της διαδικασίας εισβολής, ε) βλαστική ανάπτυξη στο εσωτερικό του εντόμου, στ) χρήση των θρεπτικών και εγκατάσταση, η) παραγωγή τοξινών και μολυσματικών παραγόντων για την καταστολή της άμυνας του ξενιστή και θ) παραγωγή εξωτερικών κονιδιοφόρων μετά το θάνατο του εντόμου (Hajek et al. 2007, Xiong et al. 2012) Το τελικό αποτέλεσμα της μόλυνσης εξαρτάται από την γενετική ικανότητα του μύκητα να μολύνει, από την ικανότητα του εντόμου να αμύνεται και από ένα μεγάλο αριθμό βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων και αλληλεπιδράσεων (Shahid et al. 2012) Κονίδια - Προσκόλληση Βλάστηση - Διείσδυση Συγκρινόμενοι με άλλους μικροοργανισμούς οι εντομοπαθογόνοι μύκητες είναι μοναδικοί στην πρόκληση ασθενειών σε έντομα στόχους, επειδή οι περισσότεροι εισέρχονται από τη δερμίδα και όχι μέσω του πεπτικού σωλήνα (Hajek et al. 2007). Η μόλυνση ενός εντόμου από εντομοπαθογόνο μύκητα αρχίζει με την προσκόλληση των αναπαραγωγικών του δομών στη δερμίδα (Boucias et al. 1988). Η δερμίδα του εντόμου είναι ο πρώτος ιστός του εντόμου που έρχεται σε επαφή είτε με τα βιολογικά είτε με τα χημικά εντομοκτόνα. Σχηματίζεται από αρκετές στοιβάδες οι οποίες χωρίζονται από έξω προς τα μέσα σε εφυμενίδα, εξωδερμίδα, ενδοδερμίδα και υποδερμίδα (Xiong et al. 2012) Η δερμίδα είναι λεπτή (0.1 3 μm) και σύνθετη δομή συντιθέμενη από πρωτεΐνες, χιτίνη και λιπαρά οξέα, πολύστοιβη και η κάθε στοιβάδα έχει διαφορετική χημική σύσταση και ιδιότητες (Hackman 1974, Juarez και Calderon 2006, Pedrini et al. 2006).. Η εξωτερική στοιβάδα αποτελείται από λιπίδια, αμινοξέα και γλυκοσαμίνες, είναι υδατοαποθωτική και ανθεκτική στην ενζυμική αποικοδόμηση, αποτελώντας το κυριότερο εμπόδιο για την είσοδο των αποικοδομητικών ενζύμων του μύκητα στη δερμίδα (Woods και Grula 1984). Η δημιουργία βλαστικού σωλήνα που σχηματίζει το κονίδιο του μύκητα φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην εδραίωση του παθογόνου στο έντομο (Lu et al. 2008). Διασυνδέσεις δημιουργούνται μεταξύ της εξωτερικής στοιβάδας της δερμίδας του ξενιστή και του κυτταρικού τοιχώματος ή και του εξωκυτταρικού πλέγματος του μύκητα. Συνακόλουθα, ο 14