5 VÝBER ANALYTICKEJ METÓDY

Transcript

1 5 Výber analytickej metódy 39 5 VÝBER ANALYTICKEJ METÓDY Základným prvkom každého laboratórneho vyšetrenia je analytický postup. Výsledkom analytického postupu aplikujúceho určitú analytickú metódu je vo väčšine prípadov kvantitatívny údaj vyjadrujúci napr. koncentráciu niektorej zložky v danom type biologickej vzorky. Výsledok laboratórneho vyšetrenia má lekárovi pomôcť potvrdiť alebo vylúčiť určitú diagnózu, spresniť diagnózu, posúdiť priebeh ochorenia, určiť zodpovedajúcu terapiu a sledovať jej účinok. Z uvedeného vyplýva, že v laboratórnej medicíne má význam používať len také analytické postupy/metódy, ktoré umožnia posúdiť zdravotný stav jedinca. Výber vhodnej analytickej metódy je zložitý a zdĺhavý proces. V priebehu tohto procesu je potrebné zohľadniť vlastnosti metódy z klinického hľadiska (aká je požadovaná kvalita výsledkov z lekárskeho hľadiska), analytické vlastnosti metódy (vlastné charakteristiky analytickej metódy) a tiež ekologické, toxikologické a ekonomické požiadavky. Situáciu značne komplikuje skutočnosť, že analytické vlastnosti metódy sa nikdy nedajú úplne oddeliť od klinických požiadaviek/vlastností, pretože analytické vlastnosti metódy sú do určitej miery podmienené/určené správaním sa sledovaných zložiek v živom organizme. 5.1 Vlastnosti metódy z klinického hľadiska Interpretácia výsledkov laboratórnych vyšetrení je založená na porovnaní určitého výsledku analýzy (hodnoty) s tzv. referenčnými hodnotami. Referenčné hodnoty boli stanovené pre všetky bežné klinicky významné analyty a zvyčajne predstavujú určitú normu (hranice) pre zdravých jedincov. Niekedy sa označujú aj ako normálne alebo fyziologické hodnoty. Referenčné rozmedzie sú také hodnoty laboratórneho testu, medzi ktorými leží väčšina hodnôt získaných meraním referenčnej populácie. Väčšina hodnôt zvyčajne predstavuje 95 % zo všetkých výsledkov. Referenčná populácia je súbor jedincov spĺňajúcich určité predpoklady. Najčastejšie je to súbor jedincov, ktorí sú hodnotení ako zdraví. Pretože pojem zdravie je relatívny, referenčná skupina sa vytvára tak, že sa vylúčia tí, ktorí nie sú za zdravých pre daný prípad považovaní, vylúčia sa evidentne chorí užívajúci lieky a ľudia s rizikovými faktormi. Obvykle sa u referenčnej populácie požaduje aj splnenie ďalších podmienok, ako je odber krvi nalačno a po telesnom pokoji. Niekedy sa zohľadnením ďalších faktorov vytvoria podskupiny podľa veku, pohlavia a ďalších kritérií. Podľa odporúčania IFCC má referenčnú populáciu tvoriť minimálne 120 jedincov. Pretože obvykle nie je možné vyšetriť celú referenčnú populáciu, náhodným výberom sa získa výberová referenčná skupina. Pre túto skupinu sa namerajú výberové referenčné hodnoty a výsledky sa štatisticky spracujú. Vylúčia sa odľahlé výsledky, určí sa výberové referenčné rozloženie a určia sa výberové referenčné medze. Referenčné medze definujú referenčný interval. Ak je výberová referenčná skupina dostatočne veľká a ak bol správne vykonaný

2 5 Výber analytickej metódy 40 náhodný výber, zodpovedá odhad referenčnej medze u výberovej skupiny skutočným referenčným medziam u celej referenčnej populácie. Vzťahy medzi vyššie uvedenými pojmami a postup pri výpočte referenčného intervalu znázorňuje obr Vlastný výpočet je založený na výpočte aritmetického priemeru x, smerodajnej odchýlky s a výpočte odhadov referenčných medzí podľa: x ± k s, kde k je koeficient, ktorý závisí od zvolenej pravdepodobnosti (pre 95 % pravdepodobnosť je k = 1,96; hodnota 1,96 sa spravidla zaokrúhľuje na 2 a nazýva sa koeficient prekryvu pre 95 % pravdepodobnosť). Referenčný interval je v tomto prípade ( x ± 2 s). Niektoré príklady referenčných intervalov sú uvedené v tab referenčná populácia náhodný výber výberová referenčná skupina meranie, stanovenie výberové referenčné hodnoty štatistika rozloženie referenčných hodnôt výpočet referenčné medze referenčný interval f(x) -2s -1s x +1s +2s x 1, 96s x + 1, 96s x ± 1, 96s Obr. 5-1 Schéma postupu pri určovaní referenčného intervalu Pri klinickej interpretácii laboratórneho výsledku sa obvykle porovnáva výsledok laboratórneho vyšetrenia s referenčnými medzami: ak výsledok leží vo vnútri referenčných medzí, výsledok je normálny (fyziologický), ak je mimo, či už zvýšený, alebo znížený, je patologický. Diagnostický význam môže nadobúdať aj poloha výsledku vo vnútri referenčného rozmedzia (bližšie k dolnej medzi, bližšie k hornej medzi, leží uprostred). Prakticky všetky faktory opísané v kapitole o predanalytickom ovplyvňovaní výsledkov ovplyvňujú aj referenčné hodnoty, a teda menia aj referenčné medze. Aj keď sa pri meraní referenčných výsledkov u referenčnej populácie tieto faktory vylúčia, u vzoriek pacientov sa môžu prejaviť. V referenčných medziach sa nachádza len 95 % všetkých výsledkov referenčnej populácie najčastejšie zdravých ľudí. Prakticky to ale znamená, že pre 5 % zdravých jedincov sa získa výsledok, ktorý sa nachádza mierne mimo referenčných medzí. Takéto vychýlenie je prejavom individuality niektorých jedincov, nie prítomnosti choroby. Preto výsledok, ktorý mierne presahuje referenčné medze, môže indikovať ochorenie, ale v podstate môže ísť aj o zdravého jedinca, ktorý patrí medzi uvedených 5 %.

3 5 Výber analytickej metódy 41 Referenčné hodnoty sa niekedy líšia podľa druhu použitej metódy. Pri stanovení aktivity enzýmov sú rôzne podľa použitého substrátu, pri stanovení Na a K podľa toho, či sa použije plameňová fotometria alebo potenciometrické stanovenie a pod. Tabuľka 5-1 Referenčné intervaly niektorých analytov u dospelých jedincov Analyt Referenčný interval Jednotka Albumín g/l Bilirubín do 20 μmol/l Celkové bielkoviny g/l Glukóza 3,33-5,83 mmol/l Cholesterol 3,87-5,20 mmol/l Močovina Muži: 2,5-8,3 Ženy: 2,0-6,9 mmol/l Kreatinín μmol/l Kyselina močová Muži: Ženy: μmol/l ALP Muži: 1-8 Ženy: 0,7-2,3 μkat/l ALT Muži: 0,15-0,78 Ženy: 0,15-0,85 μkat/l AST 0,29-0,78 μkat/l Fibrinogén 2-4 g/l Tým, že v klinickej chémii existujú referenčné hodnoty (referenčné intervaly) analytov, je už od začiatku definovaná požiadavka na minimálny rozsah kalibračnej funkcie analytickej metódy. Rozsah kalibračnej funkcie by mal príslušný referenčný interval na obidve strany značne presahovať. Napr. referenčný interval glukózy je 3-6 mmol/l, ale koncentrácia glukózy v klinických vzorkách sa bežne pohybuje v intervale až 2-20 mmol/l. Kalibračná funkcia má mať rozsah minimálne 2-20 mmol/l. Iným príkladom, ako analytické a klinické vlastnosti úzko súvisia, je požiadavka na ďalšiu charakteristiku analytickej metódy zhodnosť (tiež precíznosť). Zhodnosť je zhoda medzi nezávislými výsledkami meraní. Priamym ukazovateľom rozptýlenia (variability, nezhodnosti ) výsledkov je smerodajná odchýlka s (rozptyl s 2 ). Môže sa vyjadriť aj ako relatívna smerodajná odchýlka RSD (%) (podľa ISO sa označuje ako variačný koeficient CV (%). Každý analyt, v závislosti od jeho vlastností, množstva, stability, matrice a metódy stanovenia, možno stanoviť len s určitou zhodnosťou. Zhodnosť analytickej metódy použitej v klinickej analýze by mala byť v súlade s následnou klinickou interpretáciou laboratórneho výsledku. Na stanovenie analytov s relatívne najužšími referenčnými intervalmi je potrebné použiť také analytické metódy, ktorých zhodnosť je vynikajúca. Celková prípustná chyba (total allowable error, TE) vyjadrená ako CV, by nemala prekročiť štvrtinu referenčného intervalu. Výsledok laboratórneho vyšetrenia, aj keď sa uvedie ako jedno číslo, v skutočnosti vždy reprezentuje interval čísel s určitým rozptylom. Tento rozptyl sa skladá z dvoch hlavných zložiek.

4 5 Výber analytickej metódy 42 Prvá zložka je rozptyl vlastného analytického postupu (suma rozptylov v predanalytickej aj analytickej fáze). Druhá zložka, ktorá je často omnoho významnejšia, predstavuje biologický rozptyl (intraindividuálny a inter-individuálny biologický rozptyl). Intra-individuálny biologický rozptyl (variabilita) charakterizuje individuálne kolísanie hodnôt určitého parametra okolo hodnoty typickej pre daného jedinca. Tento typ variability sa zohľadňuje pri monitorovaní individuálneho pacienta. V prípade, že sa sleduje väčšia populácia, zohľadňuje sa aj inter-individuálny rozptyl (variabilita). Biologická variabilita sa vyjadruje (podobne ako nezhodnosť) relatívnou smerodajnou odchýlkou, v anglickej literatúre sa používa predovšetkým označenie CV (%), CV I pre intraindividuálnu variabilitu a CV G pre inter-individuálnu variabilitu. Celkovú variabilitu CVT potom možno vyjadriť ako: CV T 2 = CV A 2 + CV I 2 alebo CV T 2 = CV A 2 + CV I 2 + CV G 2. V uvedených vzťahoch CV A predstavuje variabilitu analytickej metódy. Je zrejmé, že pre stanovenie biologickej variability je nutné zvoliť také postupy a metódy, ktoré majú variabilitu CV A menšiu ako biologická variabilita Výber metódy založený na biologickej variabilite Tento spôsob výberu analytickej metódy je v súčasnosti považovaný za najprimeranejší ako klinickým, tak aj analytickým požiadavkám. Princípom je zistenie takých podmienok, kedy bude možné s požadovanou pravdepodobnosťou vydeliť klinicky významný signál z hladiny biologického a analytického šumu. Intra- a inter-individuálna variabilita analytov je takmer konštantná (aj v starobe), čo umožňuje geografický a časový prenos informácií, alebo vypočítať príspevok variability analytického postupu k celkovej variabilite, ak celkovú variabilitu zistime z experimentov a biologickú variabilitu z literatúry. Na obr. 5-2 je znázornený tento príspevok analytickej variability CV A k celkovej variabilite pre rôzne pomery CV A a CV I. Z obr. 5-2 je zrejmé, že s rastúcou hodnotou variability analytickej metódy CV A, narastá % príspevok CV A k celkovej variabilite, tento nárast ale nie je lineárny. Cotlove ako prvý navrhol požiadavku, že analytická variabilita by mala byť menšia ako ½ intraindividuálnej biologickej variability, teda že CV A 0,5 CV I. Harris štatistickým spracovaním dát ukázal, že ak CV A 0,5 CV I, potom nárast správnej variability (biologickej variability) v dôsledku pridanej analytickej variability bol asi 12 %. Fraser rozšíril túto koncepciu a omnoho podrobnejšou numerickou analýzou ukázal, že ak CV A 0,75 CV I, potom nárast variability bol asi 25 %. Pre CV A 0,5 CV I je nárast 12 % a pre CV A 0,25 CV I je nárast iba 3 % (obr. 5-2).

5 5 Výber analytickej metódy % % nárast CV % 0,75 minimum 3 % 10 0,5 vhodné 0,25 optimum 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 CV A /CV I Obr. 5-2 Príspevok analytickej variability CV A k celkovej variabilite CV T 2 = CV A 2 + CV I 2 pre rôzne pomery CV A a CV I Charakteristiky klinicky ideálnej analytickej metódy: analytická variabilita CV A má byť CV A 0,5 CV I (alebo dokonca až CV A 0,25 CV I ), vychýlenie B v % (bias, systematická chyba merania) má byť B 0,25 (CV 2 I + CV 2 G ) 1/2 celková chyba TE (total error) v % má byť TE k 0,5 CV I + 0,25 (CV 2 I + CV 2 G ) 1/2, kde k = 1,65 pre 95 % pravdepodobnosť. V tab. 5-2 sú uvedené hodnoty biologickej variability CV I a CV G spolu s požadovanými hodnotami CV A, B a TE pre rôzne analyty. Pri monitorovaní stavu pacienta (sledovanie pacienta v čase) sa kladie najväčší dôraz na minimálny rozptyl výsledkov merania v čase; systematická zložka chyby merania je menej významná (za predpokladu, že sa v priebehu sledovania systematická zložka nemení). Naopak, stanovenie pre diagnostické účely vyžaduje čo najnižšiu systematickú chybu a toleruje trochu väčší rozptyl meraní (vyššiu náhodnú chybu). V prípade, ak v praxi nie je možné dosiahnuť požadovanú kvalitu analytických meraní (súčasný vývojový stupeň techniky to jednoducho neumožňuje), pracuje sa s dohodnutými odchýlkami od cieľovej hodnoty analytu (target value, TV).

6 5 Výber analytickej metódy 44 Cieľová hodnota je buď priemerná hodnota všetkých výsledkov súboru po vylúčení odľahlých výsledkov, alebo je to priemer stanovený definičnou alebo referenčnou metódou. Ak definičná alebo referenčná metóda nie je k dispozícii, môže sa použiť porovnávacia metóda. Dohodnuté odchýlky od cieľovej hodnoty sú napr. ± % pre enzýmy, ± 10 % pre bielkoviny, cholesterol, glukózu a ± 5 % pre chloridy. Analytická metóda by mala vychádzať z princípu funkcie daného analytu v živom organizme. Táto požiadavka je významná predovšetkým pri metódach na stanovenie enzýmov, pretože analytickými metódami stanovujeme funkciu enzýmov katalytickú aktivitu. Tabuľka 5-2 Intra-individuálna (CV I ), inter-individuálna (CV G ) biologická variabilita, analytická variabilita (CV A ), vychýlenie (B) a celková chyba (TE) niektorých analytov v sére Analyt Biologická variabilita Požadované charakteristiky CV I (%) CV G (%) CV A (%) B (%) TE (%) Metóda albumín 3,1 4,2 1,6 (2) 1,3 (2) 3,9 (6) BCG, BCP celkové bielkoviny 2,7 4,0 1,4 (2) 1,2 (2) 3,4 (6) Biuret ALP 6,4 24,8 3,2 (5) 6,4 (10) 11,7 (18) IFCC ALT 24,3 41,6 12,2 (6) 12,0 (6) 32,1 (6) IFCC AST 11,9 17,9 6,0 (6) 5,4 (5) 15,2 (15) IFCC α-amyláza 9,5 29,8 4,8 (5) 7,8 (8) 15,7 (16) IFCC LD 8,6 14,7 4,3 (7) 4,3 (7) 11,4 (17) IFCC bilirubín celkový 25,6 30, (13) 10,0 (10) 31,1 (31) Jendrassik-Gróf chloridy 1,2 1,5 0,6 (2) 0,5 (2) 1,5 (5) Potenciometria cholesterol 6,0 14,9 3,0 (3) 4,0 (4) 9,0 (10) CHO-PAP CK 22,8 40,0 11,4 (6) 11,5 (6) 30,3 (15) IFCC kreatinín 4,3 12,9 2,2 (4) 3,4 (6) 6,9 (10) Jaffé kyselina močová 8,6 17,2 4,3 (4) 4,8 (5) 11,9 (12) Urikáza-PAP glukóza 5,7 6,9 2,9 (5) 2,2 (4) 6,9 (10) GOD-PAP horčík 3,6 6,4 1,8 (3) 1,8 (3) 4,8 (7) Enzýmová UV draslík 4,8 5,6 2,4 (4) 1,8 (3) 5,8 (9) FAES vápnik 1,9 2,8 1,0 (2) 0,8 (2) 2,4 (5) FAAS, FAES sodík 0,7 1,0 0,4 (1) 0,3 (2) 0,9 (4) FAES update 2004; návrh analytických kritérií v SR je uvedený na Celková variabilita CV T sa znižuje s rastúcim počtom meraní; všeobecný vzorec pre jej výpočet je: CV T = (CV A 2 /n 1 + CV I 2 /n 2 ) 1/2, kde n 1 je počet opakovaných meraní tej istej vzorky a n 2 je počet vzoriek odobratých od jedného človeka.

7 5 Výber analytickej metódy 45 Z porovnania výsledkov vypočítaných v nasledujúcom príklade vyplýva, že variabilita sa významnejšie znižuje vtedy, ak sa od jedinca odoberie viac vzoriek a každá sa analyzuje jeden raz. Súvisí to so skutočnosťou, že v uvedenom príklade je biologická variabilita vyššia ako variabilita analytická. Z údajov uvedených v tab. 5-2 vyplýva, že ide o všeobecný jav. Príklad: Intra-individuálna biologická variabilita CV I cholesterolu je 6 %. Vypočítajte 95 % interval spoľahlivosti stanovenia cholesterolu koncentrácie 5 mmol/l a % nárast celkovej variability (ako CV) v dôsledku variability analytickej metódy pre nasledujúce hodnoty CV A 0,6; 1; 2; 3; 4; 5 a 6. Pre pravdepodobnosť 95 % je štatistický koeficient k = 1,96. Riešenie: Výpočet pre CV A = 0,6 95 % celková variabilita CV T = ± 1,96 (CV 2 A + CV 2 I ) 1/2 = ± 1,96 (0, ) 1/2 = ± 11,82 % 95 % interval spoľahlivosti = (5 ± 5 11,82/100) = (5 ± 0,59) mmol/l. 95 % variabilita vyplývajúca z intra-individuálnej biologickej variability ± 1,96 (CV 2 I ) 1/2 = ± 1,96 (6 2 ) 1/2 = 11,76 %. % nárast CV v dôsledku existencie CV A = (11,82-11,76) 100/11,76 = 0,34 %. (Celková variabilita CV v metrologickej terminológii ide o rozšírenú relatívnu neistotu). Výpočet pre CV A = 1 95 % celková variabilita CV T = ± 1,96 (CV 2 A + CV 2 I ) 1/ 2 = ± 1,96 ( ) 1/2 = ± 11,92 % 95 % interval spoľahlivosti = (5 ± 5 11,92/100) = (5 ± 0,60) mmol/l. % nárast CV v dôsledku existencie CV A = (11,92-11,76) 100/11,76 = 1,36 %. Všetky vypočítané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke: CV A CV I 95 % CV T 95 % interval (%) (%) (%) (mmol/l) CV A /CV I % nárast CV 0,6 6 11,82 5±0,59 0, ,92 5±0,60 0, ,40 5±0,62 0,33 5, ,15 5±0,66 0,50 11, ,13 5±0,71 0,67 20, ,31 5±0,76 0,83 30, ,63 5±0,83 1,00 41,4 Grafickým vyjadrením % nárastu CV pre rôzne hodnoty CV A /CV I je krivka uvedená na obr. 5-2.

8 5 Výber analytickej metódy 46 Príklad: Vypočítajte, aký vplyv má vzrastajúci počet opakovaných meraní z jednej vzorky n 1 alebo jednorazová analýza viacerých vzoriek odobratých od jedného človeka n 2 na celkovú variabilitu, ak variabilita analytickej metódy CV A je 3 % a biologická variabilita CV I je 6 %. Riešenie: Výpočet vplyvu n 1 : 95 % celková variabilita CV T = ± 1,96 (CV A 2 /n 1 + CV I 2 ) 1/2 nech n 1 = 2 95 % celková variabilita CV T = ± 1,96 (3 2 / ) 1/2 = 12,46 % 95 % interval spoľahlivosti = (5 ± 5 12,46/100) = (5 ± 0,62) mmol/l. Vypočítané výsledky pre ďalšie hodnoty n 1 : n 1 95 % CV T (%) 95 % interval spoľahlivosti (mmo/l) 1 13,15 5±0, ,46 5±0, ,24 5±0, ,12 5±0,60 Výpočet vplyvu n 2 : 95% celková variabilita CV T = ± 1,96 (CV A 2 + CV I 2 /n 2 ) 1/2 nech n 2 = 2 95% celková variabilita CV T = ± 1,96 ( /2) 1/2 = 10,18 % 95 % interval spoľahlivosti = (5 ± 5 10,18/100) = (5 ± 0,51) mmol/l. Vypočítané výsledky pre ďalšie hodnoty n 2 : n 2 95 % CV T (%) 95 % interval spoľahlivosti (mmo/l) 1 13,15 5±0, ,18 5±0,51 3 8,98 5±0,45 4 8,31 5±0, Výber metódy podľa jej klinickej úspešnosti Pri chorobných stavoch dochádza k zmene koncentrácie niektorých zložiek alebo zmene iných parametrov v organizme; tieto zmeny možno sledovať rôznymi metódami. Ako už bolo uvedené v úvode časti 5.1, u niektorých jedincov nastane takáto zmena aj vtedy, ak nie sú chorí. Na diagnostické účely je preto vhodné použiť len niektoré parametre a na ich určenie len niektoré metódy. Vybrať vhodný parameter alebo metódu umožňuje vyhodnotenie úspešnosti laboratórnej metódy (zistenie, do akej miery možno výsledky metódy použiť na spoľahlivú diagnostickú výpoveď).

9 5 Výber analytickej metódy 47 V laboratóriách sa v podstate používajú dva typy metód/testov. Prvý typ sú metódy/testy, ktoré poskytujú binárne výsledky v tvare áno/nie, pozitívny/negatívny. Druhý typ metód poskytuje kvantitatívne údaje v číselnej forme. Postup hodnotenia diagnostickej úspešnosti týchto dvoch typov metód je podobný. Testy s binárnymi výsledkami Vyšetrované osoby môžu patriť do jednej z dvoch skupín: k chorým alebo zdravým. Rozdelenie do týchto dvoch skupín sa dosiahne nezávislou metódou, ktorá je založená na inom princípe ako preverovaný test. Preverovaný test má za úlohu tieto populácie od seba odlíšiť. Pre daný test sa najskôr určí alebo odhadne kritická hodnota hranica rozhodovania (diskriminačná medza, decision level, operating point, cut-of-point), podľa ktorej sa vykoná zatriedenie jedincov do príslušnej skupiny zdraví/chorí. Hranica rozhodovania je výsledkom skúšky, ktorá odlíši (diskriminuje) prítomnosť a neprítomnosť špecifickej choroby. Hranica rozhodovania sa určí: o ako dolná alebo horná hranica referenčného intervalu. Napr. horná hranica referenčného intervalu pre izoenzým CK-MB je 5 μg/l, u jedincov s koncentráciou CK-MB nad 5 μg/l sa predpokladá prítomnosť akútneho koronárneho syndrómu. Pre takto zvolenú hranicu rozhodovania pre CK-MB sa potom jedinci s negatívnym výsledkom testu (< 5 μg/l) zaradia do skupiny zdraví a jedinci s pozitívnym výsledkom (> 5 μg/l) sa zaradia do skupiny chorí. Postup testu musí byť zvolený tak, aby pre koncentrácie < 5 μg/l poskytoval negatívny výsledok a pre koncentrácie > 5 μg/l pozitívny výsledok, o ako dohodnutá hodnota, stanovená a uverejnená panelom expertov formou medzinárodného odporúčania. Napr. podľa expertov WHO je koncentrácia glukózy v plazme nad hodnotu 7 mmol/l dôvodom diagnostikovať diabetes, o postupom ROC analýzy. V ideálnom prípade poskytuje preverovaný test pozitívny výsledok u všetkých chorých a negatívny výsledok u všetkých zdravých. Prevažná väčšina testov však poskytuje pozitívny výsledok aj u malej časti zdravých a negatívny výsledok u malej časti chorých jedincov. Ak sa porovná zatriedenie osôb získané preverovaným testom so správnym zatriedením (získaným nezávislou metódou), nastane jedna zo štyroch možností a to, že preverovaný test poskytol: o pozitívny výsledok u chorého (správne pozitívny výsledok, sp, true positive), o negatívny výsledok u chorého (falošne negatívny výsledok, fn, false negative), o negatívny výsledok u zdravého (správne negatívny výsledok, sn, true negative), o pozitívny výsledok u zdravého (falošne pozitívny výsledok, fp, false positive). Z tohto hľadiska sa skupina vyšetrovaných osôb rozdelí do štyroch podskupín. Zistí sa počet osôb v jednotlivých podskupinách a výsledky sa zoradia do kontingenčnej tabuľky (tab. 5-3).

10 5 Výber analytickej metódy 48 Z takto usporiadaných výsledkov možno vypočítať charakteristiky preverovaného testu a na základe týchto charakteristík posúdiť úspešnosť (diagnostický význam) preverovaného testu. Tabuľka 5-3 Kontingenčná tabuľka Správne Výsledok preverovaného testu zatriedenie pozitívny negatívny Suma Chorí správne pozitívny sp, počet Nsp falošne negatívny fn, počet Nfn počet chorých Nsp + Nfn Zdraví falošne pozitívny fp, počet Nfp správne negatívny sn, počet Nsn počet zdravých Nfp + Nsn Suma počet pozitívnych Nsp + Nfp počet negatívnych Nfn + Nsn počet všetkých vyšetrených Nsp + Nfn + Nfp + Nsn Charakteristiky testov Citlivosť, senzitivita (sensitivity), sens udáva s akou pravdepodobnosťou sa u chorého získa správne pozitívny výsledok testu. Je to podiel počtu chorých s pozitívnym testom a celkového počtu testovaných chorých. Charakterizuje úspešnosť testu pri odhaľovaní choroby. Diagnosticky najvýznamnejšie testy majú najvyššiu citlivosť. sens = Nsp / (Nsp + Nfn). Necitlivosť, nesenzitivita, nesens udáva s akou pravdepodobnosťou sa u chorého získa falošne negatívny výsledok testu. Nesens = (1 - sens) = Nfn / (Nsp + Nfn). Špecifickosť (specificity), spec udáva s akou pravdepodobnosťou sa u zdravého získa správne negatívny výsledok. Je to podiel počtu zdravých osôb s negatívnym testom a celkového počtu testovaných zdravých jedincov. Charakterizuje úspešnosť testu pri vylučovaní prítomnosti choroby. Diagnosticky najvýznamnejšie testy majú najvyššiu špecifickosť. spec = Nsn / (Nfp + Nsn). Nešpecifickosť, nespec udáva s akou pravdepodobnosťou sa u zdravého získa falošne pozitívny výsledok. nespec = (1 - spec) = Nfp / (Nfp + Nsn). Pre posúdenie/hodnotenie úspešnosti preverovaného testu nie je ani tak zaujímavá pravdepodobnosť pozitívneho (negatívneho) výsledku u chorého (zdravého), ale aká je pravdepodobnosť, že vyšetrovaný jedinec je skutočne chorý (zdravý), ak je výsledok testu pozitívny (negatívny). Tieto pravdepodobnosti opisujú ďalšie charakteristiky preverovaného testu. Prediktívna hodnota pozitívneho výsledku, pozitívna prediktívna hodnota (positive predictive value), predpos udáva pravdepodobnosť, že daný jedinec bude diagnostikovaný ako chorý, ak

11 5 Výber analytickej metódy 49 je výsledok testu pozitívny. Charakterizuje úspešnosť testu pri vyhľadávaní chorých medzi všetkými jedincami s pozitívnym výsledkom testu. predpos = Nsp / (Nsp + Nfp). Prediktívna hodnota negatívneho výsledku, negatívna prediktívna hodnota (negative predictive value), predneg udáva pravdepodobnosť, že daný jedinec bude diagnostikovaný ako zdravý, ak je výsledok testu negatívny. Ukazuje úspešnosť testu pri vyhľadávaní zdravých medzi všetkými jedincami s negatívnym výsledkom testu. predneg = Nsn / (Nsn + Nfn). Diagnostická citlivosť charakterizuje výsledky testu v skupine chorých a diagnostická špecifickosť charakterizuje výsledky testu v skupine zdravých jedincov. Ak sa tieto charakteristiky určia spracovaním údajov získaných z veľkého súboru jedincov, sú pre daný test konštantné (v prípade, že sa nezmení test ani kritériá hodnotenia výsledkov). Citlivosť a špecifickosť laboratórneho testu sa nemení, ak sa zmení počet vyšetrovaných osôb a nezávisí ani od pravdepodobnosti výskytu danej choroby v sledovanej populácii (prevalencia). Prevalencia, prev je pravdepodobnosť výskytu ochorenia v definovanej populácii v určitom časovom okamihu. Prev = Nchorých / Nvšetkých vyšetrovných = (Nsp + Nfn) / (Nsp + Nfn + Nsn + Nfp). Pozitívna prediktívna hodnota a negatívna prediktívna hodnota od počtu vyšetrovaných osôb nezávisí, ale silne závisí od prevalencie ochorenia v populácii. Ak je prevalencia ochorenia malá, čo je v bežnej populácii najčastejšia situácia, negatívna prediktívna hodnota testu je vysoká. V tomto prípade negatívny výsledok testu prakticky vylučuje chorobu. S rastúcou prevalenciou ochorenia v populácii stúpa pozitívna a menej výrazne klesá negatívna prediktívna hodnota testu. Z toho vyplýva, že čím vyššia je prevalencia, tým bezpečnejšia je diagnostika. Hodnota prevalencie je známa pred použitím laboratórneho testu a charakterizuje predtestovú pravdepodobnoť výskytu choroby. Medzi prevalenciou, hodnotami Nsp, Nfp, Nsn a Nfn platia tieto vzťahy (Bayesov teorém): Nsp = prev sens Nfp = (1 - prev) (1 - spec) Nsn = (1 - prev) spec Nfn = prev (1 - sens). Ak je známa citlivosť a špecifickosť testu a prevalencia ochorenia, možno z vyššie uvedených vzťahov vypočítať Nsp, Nfp, Nsn a Nfn a podľa definičných vzťahov potom vypočítať pozitívnu a negatívnu prediktívnu hodnotu testu. Účinnosť, výdatnosť (efficiency) je pomer počtu všetkých správnych výsledkov k ich celkovému počtu. Závisí od citlivosti, špecifickosti aj prevalencie. účinnosť, výdatnosť = (Nsp + Nsn) / (Nsp + Nsn + Nfp + Nfn).

12 5 Výber analytickej metódy 50 Príklad: Úspešnosť nového laboratórneho testu sa overuje na skupine 200 jedincov. Nezávislou metódou sa zistilo, že v tejto skupine je 100 chorých a 100 zdravých jedincov. Prevalencia daného ochorenia je teda prev = 100/200 = 0,5. Pri testovaní novým laboratórnym testom sa získali údaje uvedené v nasledujúcej kontingenčnej tabuľke. Vypočítajte charakteristiky testu. Správne Výsledok preverovaného testu zatriedenie pozitívny negatívny Suma Chorí 92 sp 8 fn 100 Zdraví 4 fp 96 sn 100 Suma Riešenie: sens = 92/100 = 0,92 (test zaradí 92 % chorých správne) nesens = 1-0,92 = 0,08 spec = 96/100 = 0,96 (test zaradí 96 % zdravých správne) nespec = 1-0,96 = 0,04 predpos = 92/96 = 0,96 (96 % z tých, čo majú pozitívny test, je naozaj chorých) predneg = 96/104 = 0,92 (92 % z tých, čo majú negatívny test, je naozaj zdravých) účinnosť = ( )/200 = 0,94 (test zaradí 94 % vyšetrovaných správne). Tento test sa ďalej použil na testovanie skupiny 400 jedincov. Prevalencia ochorenia zostala rovnaká (prev = 0,5). Z toho vyplýva, že v testovanej skupine je 200 chorých a 200 zdravých jedincov. Keďže sa používa ten istý test, citlivosť a špecifickosť sa nezmení. Vypočítajte charakteristiky testu predpos, predneg a účinnosť. Nsp = sens 200 = 0, = 184 Nsn = spec 200 = 0, = 192 Nfp = (1 - spec) 200 = (1-0,96) 200 = 8 Nfn = (1 - sens) 200 = (1-0,92) 200 = 16 Na výpočet možno použiť aj Bayesovu teorému: Nsp = prev sens = 0,5 0,92 = 0,46 tzn. Nsp je 46 % zo všetkých, Nsp = 0, = 184 Nfp = (1 - prev) (1 - spec) = (1-0,5) (1-0,96) = 0,02 tzn. Nfp je 2 % zo všetkých, Nfp = 8 Nsn = (1 - prev) spec = (1-0,5) 0,96 = 0,48 tzn. Nsn = 192 Nfn = prev (1 - sens) = 0,5 (1-0,92) = 0,04 tzn. Nfn = 16 Kontingenčná tabuľka má tvar: Správne Výsledok preverovaného testu zatriedenie pozitívny negatívny Suma Chorí 184 sp 16 fn 200 Zdraví 8 fp 192 sn 200 Suma predpos = 184/( ) = 0,96 predneg = 192/( ) = 0,92 účinnosť = ( )/400 = 0,94. Je zrejmé, že ak sa prevalencia ochorenia nezmení, nezmenia sa ani uvažované charakteristiky testu. Ten istý test (sens = 0,92 a spec = 0,96) sa použil pri testovaní osôb pri rôznej prevalencii ochorenia. Vypočítajte, aká bude predpos a predneg tohto testu, ak prevalencia bude: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6 a 0,8.

13 5 Výber analytickej metódy 51 Ak je prev = 0,1, potom: Nsp = prev sens = 0,1 0,92 = 0,092 Nfp = (1 - prev) (1 - spec) = (1-0,1) (1-0,96) = 0,036 Nsn = (1 - prev) spec = (1-0,1) 0,96 = 0,864 Nfn = prev (1 - sens) = 0,1 (1-0,92) = 0,008 predpos = Nsp/(Nsp + Nfp) = 0,092/(0, ,036) = 0,72 predneg = Nsn/(Nsn + Nfn) = 0,864/(0, ,008) = 0,99 Všetky výsledky sú zoradené v tabuľke: prev predpos predneg účinnosť 0,1 0,72 0,99 0,96 0,2 0,86 0,98 0,95 0,3 0,91 0,97 0,95 0,4 0,94 0,95 0,94 0,5 0,96 0,92 0,94 0,6 0,97 0,89 0,94 0,8 0,99 0,75 0,93 Z výsledkov je zrejmé, že s rastúcou prevalenciou ochorenia v populácii stúpa pozitívna prediktívna hodnota testu. Posudzovanie spojitých údajov Väčšina analytických metód poskytuje kvantitatívny údaj v číselnej forme ležiaci na spojitej stupnici (napr. koncentrácia analytu v krvnom sére). V ideálnom prípade je možné na základe stanovenia koncentrácie oddeliť populáciu zdravých a chorých. Ak sa zvolí hranica rozhodovania podľa obr. 5-3, potom citlivosť a špecifickosť metódy je 1 (všetci zdraví aj chorí sú zaradení správne). S takouto metódou sa v praxi stretávame len výnimočne. f(x) Zdraví Chorí * parameter Obr. 5-3 Ideálna laboratórna metóda s citlivosť aj špecifickosť sú rovné 1 Šípka * označuje hranicu rozhodovania, f(x) je hustota pravdepodobnosti, ktorú možno pre dostatočne veľké súbory aproximovať relatívnou početnosťou, parameter testu môže byť napr. koncentrácia Pri väčšine metód sa výsledky populácie zdravých a chorých jedincov do určitej miery prekrývajú (obr. 5-4). Citlivosť a špecifickosť testu závisí od určenia takej hodnoty testu (koncentrácie), od ktorej sa bude výsledok testu považovať za pozitívny, teda od určenia hranice rozhodovania. V prípade a) je hranica rozhodovania zvolená tak, aby citlivosť bola 1 (všetci chorí sa zaradia správne), ale do skupiny chorých bude zaradený aj určitý počet zdravých jedincov (falošne pozitívne výsledky), špecifickosť testu je malá.

14 5 Výber analytickej metódy 52 V prípade b) sa správne zaradili všetci zdraví (špecifickosť je 1), ale veľký počet chorých má falošne negatívne výsledky, metóda je nedostatočne citlivá. Prípad c) je určitý kompromis, kedy má metóda rovnakú citlivosť aj špecifickosť a približne rovnaký počet falošne pozitívnych aj falošne negatívnych výsledkov. Prípad d) je metóda, kde sa výsledky testu u zdravých aj chorých natoľko prekrývajú, že nie je možné zvoliť žiadnu vyhovujúcu hranicu rozhodovania. Nedostatočná citlivosť a špecifickosť vylučuje využitie uvedenej metódy pre daný diagnostický účel. f(x) Zdraví f(x) Zdraví d c Chorí a b parameter parameter Obr. 5-4 Zmena citlivosti a špecifickosti metódy posúvaním hranice rozhodovania Hranica rozhodovania (označená šípkou): a - metóda má vysokú citlivosť, b - metóda má vysokú špecifickosť, c - kompromis medzi citlivosťou a špecifickosťou, d - nevhodná metóda Oblasť medzi šípkami a a b (obr. 5-4) sa nazýva oblasť hraničných hodnôt. Ak bude výsledok stanovenia práve v tejto oblasti, vnáša do rozhodovania veľkú neistotu. Z obrázkov vidno, že posúvaním hranice rozhodovania medzi referenčnými a patologickými hodnotami v oblasti hraničných koncentrácií možno meniť citlivosť a súčasne aj špecifickosť testu. Tieto dve charakteristiky sú však spojené. Ak sa citlivosť určitého testu zvyšuje posúvaním hranice doľava, znižuje sa zároveň jeho špecifickosť a naopak. Zvýšenie oboch charakteristík možno dosiahnuť len zámenou samotného testu za test s vyššou informačnou váhou. Hodnoty hranice rozhodovania sa môžu líšiť podľa účelu, pre ktorý sa test vykonáva. Ak má metóda slúžiť na screeningové účely, zvolí sa hranica rozhodovania tak, aby metóda mala citlivosť rovnú 1, test musí odhaliť všetkých chorých, metóda nesmie poskytnúť žiadny falošne negatívny výsledok (na obr. 5-4 je to hranica a). Naproti tomu sa toleruje trochu nižšia špecifickosť (do skupiny chorých sú zaradení aj niektorí zdraví jedinci s falošne pozitívnymi výsledkami). Jedinci s falošne pozitívnymi výsledkami sa vylúčia použitím špecifického testu (na obr. 5-4 je to hranica b) v druhom kole vyšetrení. Príklad postupného použitia testov je na obr Vzťah medzi diagnostickou citlivosťou, nešpecifickosťou (1-spec) a sériou hodnôt hraníc rozhodovania vyjadruje tzv. ROC krivka (receiver characteristic operating curve) opisujúca operačnú charakteristiku testu. Pre názornosť je v nasledujúcom príklade uvedený celý postup testu a konštrukcie ROC krivky. Podobne ako pri testoch s binárnym výsledkom, aj v prípade posudzovania spojitých údajov sa vyšetruje dostatočne veľká populácia osôb, ktoré môžu patriť do jednej z dvoch skupín: k chorým alebo zdravým. Rozdelenie do týchto dvoch skupín sa dosiahne nezávislou metódou, ktorá je založená na inom princípe ako preverovaná metóda. Preverovaná metóda má za úlohu tieto populácie od seba odlíšiť.

15 5 Výber analytickej metódy osôb Screeningová metóda Vysoká citlivosť Pozitívny výsledok 50 osôb sp+fp Negatívny výsledok 950 osôb, sn 0 osôb, fn Špecifická metóda Vysoká špecifickosť Pozitívny výsledok 5 osôb, sp chorí Negatívny výsledok 45 osôb fp 995 osôb, sn+fp zdraví Obr. 5-5 Použitie screeningovej a špecifickej laboratórnej metódy sn - správne negatívny, sp - správne pozitívny, fp - falošne pozitívny, fn falošne negatívny Pre všetky vyšetrované osoby sa preverovanou metódou stanoví napr. koncentrácia takého analytu v sére, o ktorom sa predpokladá, že súvisí s diagnostikovaným ochorením. Výsledkom stanovení je súbor číselných údajov - určitý koncentračný interval (v príklade je to 0-10 μg/l). Celý súbor stanovených koncentrácií sa potom rozdelí do n-menších koncentračných intervalov, n-tried (napr. 10), a zistí sa (porovnaním so správnym zatriedením získaným nezávislou metódou) počet zdravých a chorých jedincov poskytujúcich výsledky v jednotlivých triedach. Potom sa rozdelí celý súbor koncentrácií na dve časti, pričom hranica rozhodovania sa postupne kladie na hranicu tried. Vhodnou voľbou hranice rozhodovania v oblasti nižších tried (nižších koncentrácií) možno vytvoriť skupinu zloženú zo zdravých jedincov. Pre túto skupinu sa stanovili koncentrácie nižšie ako zvolená hranica rozhodovania. V riešenom príklade takáto situácia nastane, ak sa hranica rozhodovania zvolí napr. medzi 3. a 4. triedou. Naopak, vhodnou voľbou medze v oblasti vyšších tried, možno vytvoriť skupinu zloženú len z chorých (zvolí sa hranica medzi 7. a 8. triedou). Optimálna situácia by nastala, ak by tieto dve medze boli totožné (takáto situácia sa predpokladá v prípade binárnych dát). V bežných situáciách sú medze rozhodovania rozdielne. Pri hodnotení testov s binárnymi dátami sa najskôr zvolila hranica rozhodovania a podľa nej sa vykonalo zatriedenie jedincov do príslušnej skupiny zdraví alebo chorí. Toto zatriedenie sa porovnalo so správnym zatriedením, zostavila sa kontingenčná tabuľka a vypočítali sa charakteristiky testu. Aj na posúdenie spojitých dát možno použiť prístup, ktorý sa použil pri hodnotení binárnych dát. Ak sa rozdelí celý súbor koncentrácií na dve časti, pričom hranica rozhodovania sa postupne kladie na hranicu tried, postupne vznikne n-1 kontingenčných tabuliek, z ktorých je možné vypočítať citlivosť, špecifickosť a ďalšie charakteristiky.

16 5 Výber analytickej metódy 54 Príklad: Úspešnosť nového laboratórneho testu sa preverovala na skupine 1000 jedincov. Nezávislou metódou sa zistilo, že v tejto skupine je 200 chorých a 800 zdravých jedincov. Preverovaný test poskytol hodnoty koncentrácie analytu v rozsahu 0-10 μg/l. Počet chorých a zdravých jedincov poskytujúci výsledky v jednotlivých triedach sa zistil porovnaním so správnym zatriedením získaným nezávislou metódou. Výsledky sú uvedené v tabuľke: Správne c (μg/l) zatried. trieda Chorí Zdraví Riešenie: Zvolí sa hranica rozhodovania medzi 3. a 4. triedou, tzn. jedinci, pre ktorých sa stanovila hodnota c 3 μg/l sa zaradia do skupiny zdravých (negatívny výsledok testu) a jedinci s hodnotami c > 3 μg/l do skupiny chorých (pozitívny výsledok testu). Zostrojí sa kontingenčná tabuľka pre hranicu rozhodovania 3 μg/l: Správne Výsledok preverovaného testu zatriedenie pozitívny negatívny Suma Chorí 200 sp 0 fn 200 Zdraví = 570 fp = 230 sn 800 Suma sens = 200/200 = 1 sp ec = 230/800 = 0,29 predpos = 200/770 = 0,26 predneg = 230/230 = 1 účinnosť = ( )/1000 = 0,43 Zvolí sa hranica rozhodovania medzi 4. a 5. triedou, tzn. jedinci, pre ktorých sa stanovila hodnota c 4 μg/l sa zaradia do skupiny zdravých (negatívny výsledok testu) a jedinci s hodnotou c > 4 μg/l do skupiny chorých (pozitívny výsledok testu). Zostrojí sa kontingenčná tabuľka pre hranicu rozhodovania 4 μg/l: Správne Výsledok preverovaného testu zatriedenie pozitívny negatívny Suma Chorí 190 sp 10 fn 200 Zdraví = 220 fp = 580 sn 800 Suma sens = 190/200 = 0,95 sp ec = 580/800 = 0,72 predpos = 190/410 = 0,46 predneg = 580/590 = 0,98 účinnosť = ( ) /1000 = 0,77 Tento postup sa zopakuje pre ďalšie hranice ro zhodovania, čím sa získajú výsledky uvedené v nasledujúcej tabuľke:

17 5 Výber analytickej metódy 55 Hranica rozhodovania c (μg/l) sens spec 1-spec predpos predneg účinnosť 3 1 0,29 0,71 0,26 1 0,43 4 0,95 0,72 0,28 0,46 0,98 0,77 5 0,77 0,92 0,08 0,72 0,94 0,89 6 0,45 0,97 0,03 0,82 0,88 0,87 7 0,22 1,00 0,00 1,00 0,84 0,84 Potom sa zostrojí ROC krivka tak, že na os x sa vynesú hodnot y nespec = (1-spec) a na os y hodnoty sens (obr. 5-6). Každému bodu krivky zodpovedá jedna hodnota hranice rozhodovania (jedna koncentrácia). Diagonálna línia spájajúca body (0,0) a (1,1) na obr. 5-6 predstavuje prípad laboratórnej metódy s nulovou prediktívnou hodnotou, keďže pravdepodobnosť úspešného a neúspešného zatriedenia je zhodne 0,5. Vzdialenosť ROC krivky od diagonálnej línie je mierou úspešnosti laboratórnej metódy; čím strmšie prebieha krivka v počiatočnej oblasti, tým lepšia je diskriminácia medzi chorými a zdravými (zmena od hodnoty 0,5 do 1). 1,0 0,8 0,6 sens 0,4 0,2 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1-spec Obr. 5-6 Krivka operačnej charakteristiky testu (ROC krivka) ROC analýza umožňuje zvoliť hranicu rozhodovania tak, aby sa v súlade s cieľmi diagnostického procesu dosiahla: o maximálna citlivosť testu (zachytiť všetkých chorých v uvedenom príklade je to hranica rozhodovania 3 μg/l), o maximálna špecifickosť skúšky (vylúčiť všetkých zdravých v uvedenom príklade je to koncentrácia 7 μg/l), o optimálna kombinácia detekcie ochorenia a vylúčenie choroby. Z krivky sa môže určiť, kde sú minimalizované chyby počet falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov. Je to v bode, kde má smernica operačnej charakteristiky hodnotu rovnú pomeru počet zdravých/počet chorých (v príklade je to 800/200 = 4, zodpovedajúci uhol je arctg 4 = 76 o ).

18 5 Výber analytickej metódy 56 ROC analýza umožňuje tiež: o posúdiť diagnostickú úspešnosť metódy, o porovnať niekoľko laboratórnych metód a vybrať z nich najlepšiu. Pri porovnávaní viacerých metód bude najlepšia taká metóda, ktorá uzatvára najväčšiu plochu medzi operačnou charakteristikou a priamkou spájajúcou body (0,0) a (1,1). 5.2 Charakteristiky analytickej metódy Hlavnou úlohou použitia analytických metód v laboratóriu je produkovanie analytických výsledkov, ktoré sú porovnateľné s výsledkami získanými v iných laboratóriách a inými metódami. To možno dosiahnuť, ak použité analytické metódy majú zodpovedajúce metrologické charakteristiky, ako sú: zhodnosť, presnosť, správnosť, selektivita/špecifickosť, kalibrácia a nadväznosť, linearita, citlivosť, koncentračný rozsah, medza detekcie a medza stanovenia, výťažnosť, vplyv matrice a neistoty výsledkov analýz. Tieto charakteristiky sa zisťujú v procese validácie metód pri ich vývoji alebo zavádzaní do laboratórií. V regulovaných oblastiach ako je zdravotníctvo, farmácia a potravinárstvo sa uprednostňujú normované metódy, ktoré sa považujú za validované, hoci pri ich zavádzaní do laboratória je žiaduca aspoň ich čiastočná validácia. Okrem uvedených charakteristík sú prirodzene významné aj také vlastnosti analytickej metódy, ako použiteľnosť metódy, informačná obsahovosť a informačný výkon metódy, náročnosť úpravy vzorky, obsluhy a údržby prístrojov a zariadení, doba trvania a výsledná cena analýzy. Presnosť (accuracy) je tesnosť zhody medzi výsledkom merania (x) a prijatou referenčnou hodnotou (X, μ). Súvisí so systematickou a náhodnou chybou merania. Zhodnosť (precision) je tesnosť zhody medzi nezávislými výsledkami meraní získanými pri vopred špecifikovaných podmienkach. Zhodnosť závisí len od rozdelenia náhodných chýb, nemá vzťah ku skutočnej hodnote. Miera zhodnosti sa počíta ako smerodajná odchýlka výsledkov. Smerodajná odchýlka s je náhodná veličina, nemožno ju považovať za všeobecne platnú charakteristiku danej analytickej metódy, platí len pre definované podmienky (pracovný postup bez najmenších odchýlok, daný materiál a koncentračný rozsah), musí byť určená z dlhodobého merania dostatočne veľkého počtu vzoriek toho istého materiálu, použitie všetkých parametrických štatistických testov (vylučovanie odľahlých výsledkov, F-test, t-test) vyžaduje znalosť s, ak nezávisí od obsahu (množstva, koncentrácie, x), udáva sa v takých jednotkách ako samotný výsledok, ak závisí od obsahu, udáva sa relatívna hodnota s r v % alebo ako zlomok. Výpočet s pre n meraní jednej vzorky: s = 1 n n i= 1 ( μ ) x i 2

19 5 Výber analytickej metódy 57 Skutočnú hodnotu μ obvykle nepoznáme; najlepším odhadom hodnoty μ je aritmetický prieme r x. Spôsob výpočtu odhadu s závisí od počtu meraní a počtu vzoriek: Výpočet pre n meraní jednej vzorky n>15-20 n 1 2 s = ( x i x) n 1 i= 1 n je 2-10 Dean Dixon s R = k n R rozpätie R = x max -x min m 20 n 2-10 m 20 Výpočet pre n paralelných meraní m vzoriek s m n 1 s = ( x m( n 1) j = 1 i= 1 R = k n R ji priemerné rozpätie x ) R j 2 m j= = 1 m R j Postup výpočtu priemerného rozpätia pre n meraní m vzoriek: vzorka j meranie i x j,max - x j,min = R j 1 x 1,1 x 1,2... x 1,n x 1,max - x 1,min = R 1 2 x 2,1 x 2,2... x 2,n x 2,max x 2,min = R m x m,1 x m,2... x m,n x m,max - x m,min = R m R m j= = 1 m R j Relatívna smerodajná odchýlka s r, s r,r (variačný koeficient, CV) Na stanovenie analytov s relatívne najužšími referen čnými intervalmi je potrebné použiť také analytické metódy, ktorých zhodnosť je vynikajúca. Tonks empiricky dospel k záveru, že celková prípustná chyba (total allowable error, TE) vyjadrená ako CV, by nemala prekročiť štvrtinu referenčného intervalu. s s r = = CV x s r, R = sr x Správnosť (trueness) je tesnosť zhody medzi priemernou hodnotou získanou z veľkého radu výsledkov meraní pri vopred špecifikovaných podmienkach a prijatou referenčnou hodnotou. Súvisí len so systematickou chybou merania. Prijatá referenčná hodnota je konvenčne pravá referenčná hodnota, ktorou môže byť: o teoretická hodnota, o konsenzuálna alebo certifikovaná hodnota založená na experimentálnych prácach národných alebo medzinárodných organizácií, o očakávaná hodnota meranej veličiny, tzn. stredná hodnota špecifikovaného základného súboru meraní. Vychýl enie, systematická chyba (bias, B) je rozdiel medzi priemernou hodnotou výsledkov meraní a prijatou referenčnou hodnotou. B = x μ. Opakovateľnosť (repeatability) je zhodnosť v podmienkach opakovateľnosti.

20 5 Výber analytickej metódy 58 Podmienky opakovateľnosti sú podmienky, pri ktorých sa nezávislé výsledky meraní získajú tou istou metódou s identickými vzorkami, v tom istom laboratóriu, tým istým operátorom pri použití toho istého vybavenia počas krátkeho časového rozpätia. Reprodukovateľnosť (reproducibility) je zhodnosť v podmienkach reprodukovateľnosti. Podmienky reprodukovateľnosti sú podmienky, pri ktorých sa výsledky meraní získajú rovnakou metódou s identickými vzorkami, v rôznych laboratóriách, rôznymi operátormi používajúcimi rôzne zariadenia. Neistota merania (uncertainty of measurement) je parameter, ktorý súvisí s výsledkom merania. Charakterizuje rozptyl hodnôt, ktoré možno dôvodne priradiť meranej veličine. Parametrom môže byť smerodajná odchýlka, prípadne je násobok, alebo šírka intervalu spoľahlivosti. Neistota merania pozostáva z mnohých zložiek. Niektoré z nich možno odvodiť zo štatistického rozdelenia výsledkov opakovaných meraní a vyjadriť smerodajnou odchýlkou (neistota typu A). Ostatné zložky, ktoré sa tiež charakterizujú smerodajnou odchýlkou, sa získajú z predpokladaných rozdelení pravdepodobnosti na základe skúseností (neistota typu B). Na rozdiel od chyby sa neistota nemôže použiť na korekciu výsledku. Chyba (error) je definovaná ako rozdiel medzi individuálnym výsledkom a skutočnou hodnotou. Je to jednoduchá hodnota, ktorá sa môže použiť na korekciu výsledku. Chyba sa skladá z dvoch zložiek: náhodnej a systematickej. Kalibrácia (calibration) je súbor činností, ktorými sa za špecifikovaných podmienok stanoví vzťah medzi hodnotami veličín, ktoré sú indikované prístrojom alebo meracím systémom a zodpovedajúcimi známymi hodnotami meranej veličiny, ktoré sa realizujú etalónmi (štandardmi). Výsledkom kalibrácie je kalibračná funkcia opisujúca meraný signál y ako funkciu známych hodnôt meranej veličiny y = f(c). Kalibrácia alebo použitie metrologického etalónu (štandardu) spája laboratórium s národným (medzinárodným) referenčným meracím systémom. Toto spojenie sa nazýva nadväznosť. Nadväznosť (traceability) je vlastnosť výsledku merania alebo hodnoty štandardu, pomocou ktorej sa tieto môžu vztiahnuť na vhodný etalón (štandard, v klinickej chémii obvykle medzinárodný štandard) neprerušovaným reťazcom porovnávaní s určenými neistotami. Analytická citlivosť (analytical sensitivity) je podiel zmeny meraného analytického signálu a zodpovedajúcej zmeny koncentrácie alebo množstva analytu. Matematicky je vyjadrená ako prvá derivácia kalibračnej funkcie y = f(c) podľa c a pre lineárnu závislosť je to smernica kalibračnej priamky. Medza detekcie (limit of detection) je najnižšia koncentrácia analytu, pri ktorej je analytický signál štatisticky významne odlišný od šumu. Medza stanovenia (limit of determination) je najnižšia koncentrácia analytu, pre ktorú je relatívna smerodajná odchýlka predikcie z kalibračného modelu dostatočne malá (obvykle 10 %). Linearita (linearity) je schopnosť metódy poskytovať analytický signál, ktorý je lineárnou funkciou množstva/koncentrácie analytu.

21 5 Výber analytickej metódy 59 Lineárny rozsah (linear range) je rozsah koncentrácií, v ktorom je analytický signál lineárnou funkciou množstva/koncentrácie analytu. Výťažnosť (recovery) udáva pomer množstva (koncentrácie) analytu získaného danou analytickou metódou k prijatej referenčnej hodnote: o na určenie výťažnosti zvoliť minimálne 3 koncentračné hladiny pokrývajúce na 50 až 200 % očakávané koncentrácie vo vzorkách, o výťažnosť má byť % pre všetky koncentračné hladiny, o počet paralelných stanovení na určenie relatívnej smerodajnej odchýlky má byť minimálne 7 a S R musí byť 3 % pre všetky koncentračné hladiny. Analytická selektivita (analytical selectivity) je schopnosť metódy presne a správne určiť analyt aj v prítomnosti interferujúcich látok (matrice). Analytická špecifickosť (analytical specificity) je schopnosť meracieho postupu stanovovať len tú meranú veličinu, ktorá má byť stanovená. Robustnosť metódy (ruggedness, robustness) je schopnosť metódy poskytovať prijateľné výsledky meraní aj v prípade malých odchýlok v meracom postupe alebo zložení vzorky. Kontrolné otázky Vysvetlite prečo boli zavedené referenčné hodnoty a ako sa zisťujú. Vysvetlite čo je biologická variabilita populácie a ako sa vyjadruje. Uveďte aké sú požiadavky na zhodnosť analytickej metódy vzhľadom na biologickú variabilitu. Napíšte čo je hranica rozhodovania a ako sa určí. Definujte citlivosť a špecifickosť testu. Definujte prediktívne hodnoty testu. Opíšte ako sa určí/odhadne hranica rozhodovania pre screeningovú metódu. Napíšte čo vyjadruje ROC krivka. Uveďte ako možno využiť ROC analýzu.