Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης Φυτών

Transcript

1 ΑΝΩΤΑΤΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΚΡΗΤΗΣ ΣΧΟΛΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΟΙΚΟΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΜΟΡΦΙΑΣ ΣΕ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗ ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΑΓΓΟΥΡΙΑΣ (CUCUMIS SATIVUS var. KNOSSOS) ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ RAPDs ΣΠΟΥΔΑΣΤΗΣ: ΜΗΝΑΣ ΙΑΚΩΒΙΔΗΣ ΕΙΣΗΓΗΤΗΣ: Δρ. ΦΑΝΟΥΡΑΚΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΤΡΑΝΤΑΣ ΜΑΝΟΣ Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης Φυτών Ηράκλειο 2006

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Cucumis sativus Ιστορική Αναδρομή Σημερινή κατάσταση χρήσεις Ταξινόμηση και Φυσιολογία του φυτού Ανθοφορία άνθιση Ποικιλία Κνωσσός Γονιδίωμα του αγγουριού Πλεονεκτήματα του Cucumis sativus σε γενετικές μελέτες Η πικρότητα στο αγγούρι Ασθένειες Εχθροί Μοριακοί Δείκτες Γενικά Χαρακτηριστικά μοριακών δεικτών RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της τεχνικής RAPDs 23 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 24 Εισαγωγή - Σκοπός της παρούσας εργασίας 25 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προβλάστηση Σπόρων Φύτευση των Σπόρων Μεταφύτευση των Νεαρών Φυταρίων στο Θερμοκήπιο Φροντίδα Φυτών στο Θερμοκήπιο Τεχνητές Επικονιάσεις Συγκομιδή Καρπών και Εξαγωγή Σπόρων Απομόνωση DNA από Φύλλα Αγγουριάς Ποσοτικός Προσδιορισμός του DNA Ενίσχυση RAPD μετά την PCR Αντιδράσεις PCR Ηλεκτροφόρηση Αγαρόζης Βαθμονόμηση Μοριακών Δεικτών 37 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μορφολογικά χαρακτηριστικά της ποικιλίας Κνωσός Μορφολογία Καρπού Πικρότητα Τύπος άνθισης Ανθεκτικότητα στο ωίδιο Ποσοτικός Προσδιορισμός των DNAs Ανάλυση RAPDs 43 2

3 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ 53 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 57 3

4 Πρόλογος Με την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά, κατ αρχήν τον εισηγητή μου Δρ. Νικόλαο Φανουράκη για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με το παρόν θέμα, για τις πολύτιμες γνώσεις, καθώς και την ανεκτίμητη βοήθεια του τόσο στο πειραματικό, όσο και στο θεωρητικό μέρος, τον κο Μάνο Τραντά για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε, που χωρίς αυτή η παρούσα εργασία θα ήταν πιο δύσκολη, τον κο Πάνο Σαρρή και την κα Μαρία Φανουράκη για την τεχνογνωσία που μου προσέφεραν στο πειραματικό μέρος. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω τους σπουδαστές Κορνιωτάκη Γιάννη για την συνεργασία που είχαμε, Αθανασία Γάκη και Κατερίνα Μπατάκη, τους φίλους μου Μαριάνθη Παγουλάτου, Τζόκα Ιωάννη, Μαρίνα Γιαννοπούλου και Νικόλαο Αθανασάκη για την ηθική συμπαράσταση που μου προσέφεραν άμεσα και έμμεσα. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου την καθηγήτρια μου Δρ. Ταμπακάκη Αναστασία, χωρίς τη συμβολή της οποίας δεν θα ασχολιόμουν με το συγκεκριμένο αντικείμενο που τόσο πολύ επιθυμούσα. Με εκτίμηση, Ιακωβίδης Μηνάς 4

5 Περίληψη Σε πολλές περιοχές στην Ελλάδα,περισσότερο τα προηγούμενα χρόνια, αγρότες καλλιεργούσαν παραδοσιακές ποικιλίες, μερικά από τα χαρακτηριστικά των οποίων αποτελούν χρήσιμα εργαλεία για τους γενετιστές και βελτιωτές σήμερα, προκειμένου να ενσωματώσουν επιθυμητά χαρακτηριστικά σε φυτά με ευρεία κατανάλωση. Ένα από τα φυτά αυτά είναι και το αγγούρι, που παρουσιάζει σαφή πλεονεκτήματα έναντι άλλων φυτών όσον αφορά την καλλιέργειά του αλλά και τη χρησιμότητα που αυτό επιδεικνύει σε γενετικές μελέτες Αντικείμενο της παρούσας εργασίας ήταν η ανίχνευση γενετικής ποικιλομορφίας μεταξύ των φυτών της παραδοσιακής ποικιλίας Κνωσός με τη χρήση μοριακών δεικτών RAPDs και καταγραφή ποιοτικών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών, με σκοπό την εκτίμηση της γενετικής καθαρότητας της ποικιλίας και αν αυτή αντικατοπτρίζεται στο φαινότυπο. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε DNA από 30 τυχαία επιλεγμένα φυτά για τη μοριακή ανίχνευση με RAPDs, χρησιμοποιώντας 20 δεκαμερή ολιγονουκλεοτίδια με τυχαία σειρά νουκλεοτιδίων. Κάθε τμήμα DNA που ανιχνεύθηκε αποτελεί δείκτη RAPD και όλα τα φυτά ελέγχθηκαν για την παρουσία ή απουσία δεικτών. Η μορφολογική περιγραφή του κάθε φυτού ξεχωριστά περιελάβανε τα εξής χαρακτηριστικά: Τύπος άνθους, ανθεκτικότητα στο ωίδιο, πικρότητα, χρώμα άωρου και ώριμου καρπού, στιλπνότητα επιδερμίδας καρπού, ραβδώσεις καρπού, μέγεθος, χρώμα και αριθμό τριχιδίων καρπού. Το αποτέλεσμα της μοριακής ανάλυσης με RAPDs έδειξε ότι δεν παρατηρήθηκε απόκλιση από την απόλυτη ομοιομορφία στους δείκτες που ανιχνεύθηκαν, μερικοί από τους οποίους είναι ειδικοί για την συγκεκριμένη ποικιλία και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό της από άλλες παραδοσιακές ποικιλίες με ίδια ή παρόμοια φαινοτυπική έκφραση. Η περιγραφή των φυτών της ποικιλίας έδειξε την ύπαρξη υψηλού βαθμού φαινοτυπικής ομοιομορφίας μεταξύ τους, γεγονός που συνηγορεί και με τα αποτελέσματα της μοριακής ανάλυσης με RAPDs και αποδεικνύει τον υψηλό βαθμό της γενετικής καθαρότητας τους. 5

6 Abstract In a lot of regions in Greece, certainly the previous years, farmers cultivated traditional varieties (landraces), especially those characteristics that constitute usefully tools for the geneticists today, in order to incorporate desirable characteristics in plants with wide consumption. One of these plants is the cucumber, which presents explicit advantages than other plants, in regard to its culture and the usefulness that this demonstrates in genetic studies. The object of the present work was the detection of genetic diversity among the plants of the landrace Knosos with the use of the RAPD molecular markers and the registration of qualitative phenotypical characteristics, aiming at the estimate of the genetic cleanliness of the variety and if this is reflected in the phenotype. For this aim, it was used DNA from 30 randomly selectively plants for the molecular detection with RAPDs, using mer oligonucleotides with randomly sequence of noucleotides. Each DNA segment that was detected, constitutes an RAPD marker and all the plants were checked for the presence or absence of markers. The morphological description of each plant separately was included the following characteristics: Sex expression, powdery mildew resistance, bitterness, immature fruit color, mature fruit color, spine size, spine frequency, spine color, warted fruit and fruit skin gloss. The result of the RAPD molecular analysis showed that it was not observed any divergence from absolute uniformity in the markers that were detected, certain of which are experts for this concrete landrace and they could be used for its determination from other landraces with same or similar phenotypical expression. The description of the plants of this variety indicated high degree phenotypical uniformity existence among them, make that speaks with the results of the RAPD molecular analysis and proves their high degree genetic cleanliness. 6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

8 Εισαγωγικά Σε διάφορα είδη φυτών, κυρίως της οικογένειας Cucurbitaceae, έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες τεχνικές, για την καταγραφή γενετικών δεικτών, πρωτεϊνικής αφενός φύσεως όπως τα ισοένζυμα (isozymes) και αφετέρου νουκλεϊνικής φύσεως όπως τα RFLPs, τα RAPDs, τα AFLPs κ.α.. Τελικός σκοπός σε κάθε περίπτωση είναι είτε η ανίχνευση γενετικής ποικιλομορφίας έτσι ώστε να είναι δυνατή η συσχέτιση των δεικτών με γνωρίσματα που παρουσιάζουν ενδιαφέρον είτε η διάκριση και ταυτοποίηση εμπορικών ποικιλιών και υβριδίων (Fanourakis and Simon, 1987) είτε η χαρτογράφηση του γονιδιώματος (Meglic και Staub, 1993, Kner και Staub 1992). 1.1 Cucumis sativus Ιστορική Αναδρομή Η αγγουριά θεωρείται ιθαγενές φυτό των Ινδιών. Η απόδειξη του παραπάνω είναι μάλλον δύσκολη διότι δεν βρέθηκε ποτέ στην άγρια μορφή της. Επιπροσθέτως, μεγάλη ποικιλομορφία παρατηρήθηκε όσον αφορά τα χαρακτηριστικά βλάστησης, το μέγεθος και το σχήμα του καρπού, το χρώμα του, καθώς και ανθεκτικότητα σε διάφορες ασθένειες, γεγονός που συνηγορεί στο να θεωρηθεί η συγκεκριμένη περιοχή της νοτιοδυτικής Ασίας κέντρο καταγωγής του. Πέραν τούτου έχει βρεθεί αυτοφυές στις παρυφές των Ιμαλάϊων μικρό και πικρό αγγούρι που φέρει αραιά και σκληρά αγκάθια, το Cucumis sativus var. hardwickii, στενός συγγενής και πολύ πιθανόν ο πρόγονος της καλλιεργούμενης αγγουριάς. Πιστεύεται ότι το αγγούρι καλλιεργείτο στις Ινδίες από το π.χ. (Lopez-Sese and Staub, 2003). Είναι ένα από τα κυριότερα φυτά που αναφέρονται στη Βίβλο και στο ξεκίνημα της χριστιανικής εποχής καλλιεργούταν στη νότιο Αφρική, στην Ιταλία, στην Ελλάδα, στην ινδική χερσόνησο και σε άλλες χώρες. Ο αυτοκράτορας Τιβέριος ανέπτυξε καταναγκαστικές μεθόδους για να εξασφαλίσει σταθερό ανεφοδιασμό των αγορών με αγγούρια. Η καλλιέργεια αγγουριών πρωτοεισήχθηκε στην Ευρώπη και ειδικότερα στην Αγγλία, στης αρχές του 1300 αλλά καλλιεργήθηκε συστηματικά 250 8

9 χρόνια αργότερα. Ο Κολόμβος μετέφερε σπόρους αγγουριού στην Αϊτή το 1539 όπου και άρχισε να καλλιεργείται από τις αυτόχθονες φυλές στη Φλόριντα, στη Βιρτζίνια το 1584 και στη Μασαχουσέτη το 1629 (Peirce, 2004). Με βάση τα παραπάνω, η αγγουριά είναι ένα από τα πιο παλιά καλλιεργούμενα είδη. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι καλλιεργείται σχεδόν από τότε που άρχισαν να καλλιεργούνται και τα δημητριακά. Τμήματα του φυτού έχουν βρεθεί σε αρχαίους αιγυπτιακούς τάφους, ενώ στην Ελλάδα αναφέρεται σε πολλά αρχαία γραπτά. Ο Θεόφραστος, με το όνομα «Σικύς ή Σικύος», αναφέρεται σε τουλάχιστον 3 ποικιλίες Σημερινή κατάσταση χρήσεις Σήμερα, φρέσκα αγγούρια είναι διαθέσιμα όλες τις εποχές του χρόνου. Πολλές περιοχές στην Κίνα, την Φλόριντα, το Τέξας και την Καλιφόρνια είναι οι πιο σημαντικές παραγωγικές περιοχές, ιδιαίτερα για τη χειμερινή και ανοιξιάτικη αγορά. Οι διάφορες ποικιλίες αγγουριού είναι παρόμοιες στην αύξηση και την ανάπτυξη και συνεισφέρουν σημαντικά ποσά βιταμινών και ανόργανων αλάτων (Πίν. 1). To περιεχόμενο σε βιταμίνη Α, που είναι χαμηλό σε σύγκριση με άλλα λαχανικά, είναι μηδενικό εάν ο πράσινος φλοιός αφαιρεθεί. Το περιεχόμενο σε βιταμίνη C είναι συγκρατημένα χαμηλότερο, σε σύγκριση με άλλα λαχανικά που καταναλώνονται ωμά. Πίνακας 1. Περιεκτικότητα διαφόρων συστατικών των κυριοτέρων λαχανικών * της οικογένειας Cucurbitaceae. Βιταμίνες (mg) Μεταλλικά στοιχεία (mg) Υδρογο Ενέργειτεϊνερά A C T a N b R c Ca P Fe Na K Πρω- Λιπα- Νερό ν- Φυτό (%) Άνθρακ (cal) (g) (g) ες(g) Αγγούρι ,9 0,1 3, ,03 0,04 0, , Πε ,7 0,1 7, ,04 0,03 0, , πόνι Καρπούζι ,5 0,2 6, ,03 0,03 0, , Πηγή: National Food Review (USDA) * τα δεδομένα έχουν εκφραστεί ανά 100 g δείγματος. a b θειαμίνη ριβοφλαβίνη c νιασίνη (Peirce, 2004). 9

10 Στην Ελλάδα καλλιεργούνται πολλά υβρίδια. Ακόμα και οι Ρωσοπόντιοι που έφτασαν στην χώρα μας έφεραν σπόρο από τη Ρωσία για να καλλιεργήσουν εδώ τη μικρόκαρπη ρωσική αγγουριά, η οποία χρησιμοποιείται για τουρσί. Εκτός από τη χρήση του στη διατροφή (ωμό ως ορεκτικό, σε σαλάτες, ή τουρσί σε ξύδι ή άλμη κ.τ.λ.), χρησιμοποιείται σήμερα και από τις βιομηχανίες καλλυντικών για την παραγωγή σκευασμάτων περιποίησης προσώπου. Η φαρμακευτική αξία του αγγουριού έγκειται στο γεγονός ότι εμπεριέχει ουσίες, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν συστατικά επιθεμάτων προσώπου, είναι διουρητικό ενώ ο χυμός του έχει βρεθεί ότι ωφελεί το δέρμα και τους πάσχοντες από δερματικά Ταξινόμηση και Φυσιολογία του φυτού. Το αγγούρι (Cucumis sativus L.) ανήκει στην οικογένεια Cucurbitaceae (κολοκυνθοειδή), που περιλαμβάνει περίπου 118 γένη και 825 είδη που απαντώνται πρώτιστα στις τροπικές και υποτροπικές περιοχές του κόσμου. Το φυτό είναι ετήσιο, ποώδες με βλαστούς μακριούς (3-4 m), γωνιώδεις και τριχωτούς που διακλαδίζονται και έρπουν ή αναρριχώνται στερεωμένοι με τους έλικες που αναπτύσσονται (Εικ.1). Οι πλευρικοί έλικες αναπτύσσονται στη μασχάλη του κάθε φύλλου, και αρχίζουν να αναπτύσσονται μετά από την έκπτυση δύο ή τριών Εικόνα 1. Μορφολογία φυτού αγγουριάς. πραγματικών φύλλων. Η διακλάδωση του φυτού αρχίζει επίσης εκείνη τη στιγμή (Dean et al., 2005). Φέρει φύλλα εναλλασσόμενα, πλατιά με 3-5 γωνιώδεις λοβούς ή απλώς πενταγωνικά, μακρόμισχα και με επιφάνεια επίσης τριχωτή (Εικ.2). Ο καρπός είναι ράγα κυλινδρική, λιγότερο ή περισσότερο επιμήκης με επιφάνεια λεία ή με μικρά εξογκώματα και χρώματος πράσινου ή κιτρινοπράσινου ανάλογα με την ποικιλία Εικόνα 2. Μορφολογία φύλλου (Εικ.3). Έχει σάρκα λευκή ή λευκοπράσινη που αγγουριάς. 10

11 αποτελείται περίπου από 95% νερό, 3% υδατάνθρακες, 0,15% πρωτεΐνες και 0,1% λιπαρές ουσίες. Το ριζικό σύστημα του αγγουριού είναι χαρακτηρισμένο σαν βαθύ (βαθύρριζο), με πολλές πλάγιες τροφοδοτικές ρίζες να απλώνονται πλευρικά. Όσο τα φυτά ωριμάζουν, οι πλευρικές ρίζες αυξάνονται προς τα κάτω και η συνολική επέκταση της ρίζας μπορεί να είναι μέχρι 2,1m. (Peirce 2004, Staub et al., 1996). Εικόνα 3. Μορφολογία καρπού αγγουριάς Ανθοφορία άνθιση Πριν περιγραφεί η ανάπτυξη των ανθέων στο αγγούρι, είναι σημαντικό να κατανοήσει κανείς τη σειρά των αναπαραγωγικών τύπων που εμφανίζεται συνήθως σε αυτά τα είδη φυτών. Στα άγρια είδη συναντώνται όλοι οι τύποι των ανθέων. Η πιο κοινή είναι η μόνοικος άνθιση, κατά την οποία αρσενικά και θηλυκά άνθη βρίσκονται στο ίδιο φυτό, αλλά χωριστά. Επίσης, πολλές ποικιλίες με υπεροφόρα άνθιση έχουν αναπτυχθεί. Ομόζυγα γυνόοικα φυτά παράγουν συνήθως μόνο θηλυκά άνθη, ενώ αρσενικά άνθη (Εικ.5) μπορούν συχνά να βρεθούν κάτω από ειδικές περιβαλλοντικές συνθήκες, που να ευνοούν την αρσενική έκφραση ανθέων. Μια σειρά άλλων τύπων φύλου στο αγγούρι είναι ο Εικόνα 5. Μορφολογία αρσενικού άνθους ερμαφρόδιτος τύπος φύλου (τέλεια άνθη), ο ανδρόοικος αγγουριάς. τύπος (αρσενικά άνθη μόνο), ο ανδρομόνοικος τύπος (αρσενικά και τέλεια άνθη), ο γυνεομόνοικος (τέλεια και θηλυκά άνθη) και τέλος ο τριμόνοικος τύπος (φυτό που έχει αρσενικά, θηλυκά και τέλεια άνθη μαζί), αλλά αυτοί οι τύποι των φύλων συναντώνται σε φυτικά είδη που δεν έχουν γίνει αποδεκτά για παραγωγή αγγουριών. (Nitsch et al., 1952). Τα άνθη διαμορφώνονται νωρίς στο στάδιο του σπορόφυτου και μπορούν να βρεθούν στους χαμηλούς κύριους κόμβους μίσχων. Η ρύθμιση της σεξουαλικής ανάπτυξης ελέγχεται γενετικά, περιβαλλοντικά και ορμονικά και έχει μελετηθεί εντατικά τα τελευταία 40 έτη. Ο τύπος των φύλων των ανθέων στο 11

12 αγγούρι παρουσιάζει ευδιάκριτο ενδογενετικό σχέδιο (Knerr και Staub, 1992). Οι γόνοι που καθορίζουν το φύλλο στο αγγούρι είναι: α) Ο γόνος M / m που ελέγχει αν το άνθος θα εξελιχθεί σε μονόκλινο ή δίκλινο, όπως επίσης και την ανθική καταβολή (mm=μονόκλινα ερμαφρόδιτα άνθη, Mm,MM=δίκλινα αρσενικά ή θηλυκά ή και τα δυο μαζί και όχι ερμαφρόδιτα) και β) ο γόνος F / f που ελέγχει την καταβολή θηλυκών ανθέων (επιτυγχάνει την επίτευξη της τρίτης φάσης ανθίσματος του φυτού) και είναι μερικώς επικρατής (F), αλλά επηρεάζεται έντονα από τις συνθήκες περιβάλλοντος. Μόλις οι πλευρικοί βλαστοί αναπτυχθούν, οι συστάδες των ανθέων εμφανίζονται στις μασχάλες των φύλλων. Γενικά, ανοίγουν τις πρωινές ώρες για να παραμείνουν ανοικτά μια, σπανιότερα δυο ημέρες, ή και περισσότερες, εφόσον δεν γονιμοποιηθούν. Στα μόνοικα φυτά, η πρώτη συστάδα αποτελείται σχεδόν πάντα από αρσενικά άνθη (λίγα και συνήθως όχι αναπτυγμένα), για φωτοπεριόδους μεγαλύτερες των 14 h. Στους επόμενους κόμβους συναντώνται είτε αρσενικά (συνήθως περισσότερα), είτε θηλυκά (ένα ή δυο και σπανιότερα τρία άνθη ανά κόμβο). Κατά κανόνα στα μόνοικα φυτά υπάρχει μια τάση για αρσενικότητα στον κεντρικό βλαστό σε σχέση με τους πλάγιους βλαστούς, περισσότερα θηλυκά άνθη εμφανίζονται προς την περιφέρεια του φυτού, ενώ αύξηση θηλυκών ανθέων παρατηρείται όσο αυξάνεται και η ηλικία του φυτού, γεγονός που συμβαίνει σε όλες τις ποικιλίες. Γενικά στα μόνοικα φυτά, το κεντρικό στέλεχος εμφανίζει τρεις φάσεις τύπου άνθους: α) Η φάση της βάσης (μόνο αρσενικά άνθη στη βάση του φυτού, β) η μικτή φάση (αρχίζει από τον κόμβο με το πρώτο θηλυκό άνθος και κόμβοι με αρσενικά άνθη παρεμβάλλονται ανάμεσα σε κόμβους με θηλυκά άνθη) και γ) η φάση των θηλυκών ανθέων (μόνο θηλυκά άνθη στις μασχάλες των φύλλων). Θεωρείται ότι η αλλαγή περιβαλλοντικών παραγόντων επηρεάζει το μήκος κάθε φάσης ανθίσματος, αλλά όχι τη σηματοδότηση για την έναρξη της κάθε φάσης. Αν και στα άγρια είδη απαντώνται όλοι σχεδόν οι τύποι ανθέων, οι περισσότερες ποικιλίες που αναπτύχθηκαν από τα μέσα της δεκαετίας του '60 και μετά, ήταν υπεροφόρες, παράγοντας ένα ή περισσότερα θηλυκά μόνο άνθη σε κάθε κόμβο. Οι καλλιεργούμενες στο θερμοκήπιο ποικιλίες και υβρίδια φέρουν συνήθως θηλυκά μόνο άνθη. Αυτό δεν επηρεάζει το σχηματισμό των καρπών αφού αυτοί αναπτύσσονται παρθενοκαρπικά. Συνήθως, κάθε καρπός αγγουριού που σχηματίζεται μετά από κάθε γονιμοποίηση δίνει σπόρους, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον 12

13 πολλαπλασιασμό του φυτού στις επόμενες γενιές. Αρσενικά άνθη εμφανίζονται στα γυνόοικα φυτά μόνο εάν αυτά καταπονηθούν ή εάν εφαρμοσθεί γιββερελίνη. Αντίθετα, θηλυκά άνθη (Εικ. 4) εμφανίζονται με την εφαρμογή ethephon, ή γενικά ουσιών που απελευθερώνουν αιθυλένιο. Και τα δύο, (γιββερελίνη και ethephon) Εικόνα 4. Μορφολογία θηλυκού άνθους μεταβάλλουν τα ενδογενή επίπεδα αυξίνης των αγγουριάς. φυτών. Υψηλά επίπεδα αυξίνης είναι συνδεδεμένα με θηλυκότητα και χαμηλά επίπεδα με αρσενικότητα. Η εφαρμογή γιββερελίνης αυξάνει την αρσενικότητα, μειώνοντας τα επίπεδα αυξίνης. Το ethephon αυξάνει τα επίπεδα αυξίνης και την εμφάνιση των θηλυκών άνθεων (Lopez-Sese and Staub, 2003). Μια άλλη κατηγορία ουσιών που επηρεάζει το φύλλο στο αγγούρι είναι τα άλατα αργύρου (νιτρικός άργυρος (AgNO 3 ), θειοθειϊκός άργυρος [Ag(S 2 O 3 ) 2 ]). Πολλά πειράματα έχουν δείξει ότι τα παραπάνω άλατα συντελούν ώστε να παράγονται αρσενικά άνθη, τεχνική που εφαρμόζεται μέχρι και τις μέρες μας (Φανουράκης, 2005) Ποικιλία Κνωσσός Από αρχαιοτάτων χρόνων (Μινωική εποχή) οι Κρητικοί χρησιμοποιούσαν το αγγούρι στη διατροφή τους. Η ποικιλία Κνωσός έχει ως πρόγονο κάποιο πληθυσμό αγγουριάς που καλλιεργείτο πριν από πολλά χρόνια στην ευρύτερη περιοχή του νομού Ηρακλείου για οικιακή χρήση και μόνο (παραδοσιακή ποικιλία). Το μεγάλο της όμως μειονέκτημα ήταν η πικρότητα που εμφάνιζε στη γεύση Γονιδίωμα του αγγουριού Το αγγούρι (Cucumis sativus L., 2n = 2x = 14), έχει το μικρότερο αριθμό χρωμοσωμάτων στο γένος Cucumis. Το μέγεθος του γονιδιώματος του (Πίνακας 2) (376 Mb) είναι σχετικά μικρό (430 Mb στο ρύζι, 953 Mb στην ντομάτα και 2504 Mb 13

14 στον αραβόσιτο), αλλά μεγαλύτερο από το Arabidopsis (145 Mb) (Bennett and Smith, 1976). Μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί πολλές μοριακές και κυτταρολογικές μελέτες για το αγγούρι (Chen et al., 2005, Koo et al., 2005). Εντούτοις, εξ αιτίας του μικρού μεγέθους και της μορφολογικής ομοιότητας των χρωμοσωμάτων στο αγγούρι, αυτά έχουν χαρακτηριστεί μόλις πρόσφατα (Εικόνα 5). Πίνακας 2. Μέτρηση του μεγέθους χρωμοσωμάτων (μm) και των ετεροχρωματινών (%) των χρωμοσωμάτων του αγγουριού στο στάδιο της μιτωτικής μετάφασης. Αριθμός χρωμοσώματος Μέγεθος χρωμοσώματος(μm) Ετεροχρωματίνες (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.76 Εικόνα 5. Καρυότυπος αγγουριού στη μιτωτική μετάφαση a,b και στη μειωτική παχυταινία c. Τα βελάκια προσδιορίζουν το κεντρομερίδιο (από Koo et al., 2005). 14

15 1.1.7 Πλεονεκτήματα του Cucumis sativus σε γενετικές μελέτες Τα πλεονεκτήματα του αγγουριού που το καθιστούν χρήσιμο εργαλείο σε γενετικές μελέτες σύμφωνα με τους Thomas και Staub (1999) είναι τα ακόλουθα: 1. Μικρός κύκλος ζωής, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται περισσότερες από μία γενιές το χρόνο. 2. Χαμηλό κόστος και εύκολη καλλιέργεια χωρίς προβλήματα καταπόνησης. 3. Τα άνθη των φυτών αγγουριού ενός σταδίου ανάπτυξης μπορούν να διασταυρωθούν με φυτά που βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο ωριμότητας. 4. Εύκολη επικονίαση. 5. Μικρός αριθμός χρωμοσωμάτων που διευκολύνει τις γενετικές μελέτες. 6. Μεγάλος αριθμός σπόρων και καρπών. 7. Εύκολη αναπαραγωγή είτε με γονιμοποίηση είτε παρθενοκαρπικά Η πικρότητα στο αγγούρι Στο αγγούρι υπάρχει μια κατηγορία γονιδίων, η οποία είναι υπεύθυνη για την παραγωγή μιας ουσίας, της κουκουρμπιτασίνης (cucurbitacin) (τερπενοειδής ένωση), που προκαλεί την πικρότητα στον καρπό, στα φύλλα και στους έλικες του φυτού. Αξίζει να σημειωθεί ότι εξαιτίας μιας μετάλλαξης στο γονίδιο αυτό, οι γενετιστές είχαν τη δυνατότητα να δημιουργήσουν ποικιλίες και υβρίδια με καρπούς χωρίς πικρή γεύση, πράγμα σημαντικό από καταναλωτικής απόψεως. Εντούτοις αξίζει αναφοράς το γεγονός ότι εξαιτίας της παρουσίας της κουκουρμπιτασίνης, τα φυτά καθίστανται ανθεκτικά σε μερικά έντομα, ενώ άλλα έντομα προτιμούν την παρουσία κουκουρμπιτασίνης. Αυτή η συσσώρευση τερπενοειδών ενώσεων που προκαλεί την πικρότητα στο αγγούρι μπορεί να ελεγχθεί γενετικά, παρόλο που το υπερβολικό εδαφικό άζωτο την αυξάνει (Knerr and Staub, 1992). 15

16 1.1.9 Ασθένειες Εχθροί Οι ασθένειες και οι εχθροί που συνήθως προσβάλλουν το αγγούρι αναφέρονται παρακάτω. Οι ασθένειες είναι οι εξής: Περονόσπορος (Pseudoperonospora cubensis) Ανθράκωση (Colletotrichum lagenarium) Κλαδοσπορίωση (Cladosporium cucumerinum) Βοτρύτης (Botritis sp.) Σκληρωτινίαση (Sclerotinia sclerotiorum) Ωίδιο (Erysiphe cichoracearum) Φουζαρίωση (Fusarium sp.) Τήξη φυταρίων (Pythium sp.) Βακτηρίωση (Phytomonas lachrimans) Στο αγγούρι μεταδίδονται και διάφορες ιώσεις, κυρίως με τις αφίδες. Συμπτώματα ιώσεων είναι ο μωσαϊκός χρωματισμός των φύλλων, ο νανισμός και η ακαρπία των φυτών. Άλλα συνήθη παράσιτα, έντομα που προκαλούν πολλές φορές ζημιές στις καλλιέργειες του αγγουριού είναι τα παρακάτω: Αφίδες (Aphis sp.) Αλευρώδης (Trialeurodes vaporariorum) Υλέμυα (Hylemyia antiqua) Έντομα εδάφους (Glyllotalpa vulgaris, Agrotis sp.) Τετράνυχος (Tetranychus urticae) Νηματώδεις (Heterodera sp.) 1.2 Μοριακοί Δείκτες Γενικά Στις διάφορες ποικιλίες φυτών μπορεί κανείς να διακρίνει διαφορές μεταξύ άλλων και σε μορφολογικά χαρακτηριστικά, η εκδήλωση των οποίων δεν επηρεάζεται 16

17 από το περιβάλλον (ποιοτικά χαρακτηριστικά). Η μελέτη των χαρακτηριστικών αυτών γίνεται με μοριακή ανάλυση του γονιδιώματος (DNA) των φυτών που εμφανίζουν τα χαρακτηριστικά αυτά. Το βιοτεχνολογικό εργαλείο που συνδέεται με την ανάλυση του DNA καλείται μοριακή ανάλυση δεικτών. Μια από τις εφαρμογές της ανάλυσης του DNA είναι η διάκριση διαφορών μεταξύ συγγενικών φυτών. Οι μοριακοί δείκτες είναι τμήματα DNA χωρίς άμεση επίδραση στο φαινότυπο, που παρουσιάζουν διαφορές μεταξύ των προς μελέτη ατόμων, η ανάδειξη των οποίων χρησιμοποιείται για την μελέτη της κληρονομικότητας χαρακτηριστικών και της ποικιλομορφίας μεταξύ των ατόμων πληθυσμών (Fanourakis et al., 2004). Επιπρόσθετα, δεν επηρεάζονται από το περιβάλλον αλλά ούτε από το αναπτυξιακό στάδιο που βρίσκονται τα άτομα που μελετώνται. Θεωρητικά, για τη μελέτη της κληρονομικότητας, του πολυμορφισμού μεταξύ των ατόμων και την κατασκευή γενετικών χαρτών ενός πληθυσμού μπορούν να χρησιμοποιηθούν μοριακοί δείκτες νουκλεϊνικής φύσεως που να καλύπτουν ολόκληρο το γονιδίωμα σε προβλεπόμενες ή μη γενετικές αποστάσεις (Χατζόπουλος, 2002). Πρόσφατα, οι μοριακοί δείκτες έχουν επιτρέψει στους γενετιστές και τους βελτιωτές να επινοήσουν στρατηγικές για την ταχύτερη χαρτογράφηση των γονιδιωμάτων των φυτών (Staub et al., 1996, Stam et. al., 1993). Εντούτοις, η χρησιμότητα των χαρτών για τη βελτίωση φυτών όπως της οικογένειας Cucurbitaceae, περιορίζεται από την έλλειψη στενών συνδέσμων με σημαντικά οικονομικά γνωρίσματα. Στο εμπορικό αγγούρι (Cucumis sativus L. var. sativus) η χρήση των μοριακών δεικτών έχει επιτρέψει την καλύτερη κατανόηση του γονιδιώματος του (Kennard et al., 1994, Fanourakis and Simon, 1987) Οι πρώτοι μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) (Botstein et al., 1980), οι οποίοι αποτέλεσαν την απαρχή για την μετέπειτα εξέλιξη της μοριακής βελτίωσης φυτών. Μετά την εισαγωγή της PCR σαν πολύτιμο εργαλείο στην έρευνα, χρησιμοποιήθηκε στην ανάπτυξη μεθόδων μοριακής βελτίωσης όπως τα RAPDs (Randomly Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990). Τη δεκαετία του 1990 αναπτύχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν οι δεύτερης γενιάς μοριακοί δείκτες, που συμπεριλαμβάνουν τους SSRs (Simple Sequence Repeats) (Hearne et al., 1992), AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) (Vos et al., 1995) και μία ποικιλία τροποποιημένων τύπων 17

18 τους. Στα τέλη της δεκαετίας του 1990 αναπτύχθηκαν και η τρίτης γενιάς μοριακοί δείκτες IFLPs (Intron Fragment Length Polymorphisms) και οι SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) (Landegren et al., 1988). Τις δύο τελευταίες δεκαετίες μία πολύ μεγάλη γκάμα μοριακών δεικτών έχει γίνει διαθέσιμη (Πίν. 3). Πίνακας 3. Μοριακοί δείκτες από Pushpendra et al. (2002). AFLP Amplified fragment length polymorphism AMP-PCR Anchored microsatellite primed PCR AP-PCR Arbirarily primed PCR ASA Allele-specific amplification ASSR Anchored simple sequence repeat CAPS Cleaved amplified polymorphic sequence DAF DNA amplification fingerprint DALP Direct amplification of length polymorphism DAMD-PCR Direct amplification of microsatellite DNA by PCR DFLP DNA fragment length polymorphism dramp Digested RAMP IFLP Intron fragment length polymorphism IM-PCR Inter-microsatellite PCR IRAP Inter-retrotransposon amplified polymorphism ISA Inter-SSR amplification ISSR Inter-simple sequence repeats MAAP Multiple arbitrary amplicon profiling MP-PCR Microsatellite-primed PCR OLA Oligonucleotide ligation assay RAHM Randomly amplified hybridizing microsatellites RAMPO RAMP RAMS RAPD RBIP REMAP RFLP SAMPL SCAR SNP SPAR S-SAP SSCP SSLP SSR STAR STMS STR STS VNTR Randomly amplified microsatellite polymorphisms Randomly amplified microsatellite polymorphism Randomly amplified microsatellites Random amplified polymorphic DNA Retrotransposon-based insertion polymorphism Retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism Restriction fragment length polymorphism Selective amplification of microsatellite polymorphic loci Sequence characterised amplified regions Single nucleotide polymorphism Single primer amplification reactions Sequence-specific amplification polymorphism Single strand conformation polymorphism Simple sequence length polymorphism Simple sequence repeat Sequence tagged amplified region Sequence-tagged microsatellite site Short tandem repeat Sequence-tagged-site Variable number of tandem repeats 18

19 1.2.2 Χαρακτηριστικά μοριακών δεικτών Η φύση των μοριακών δεικτών εξαρτάται άμεσα από τη μεθοδολογία που χρησιμοποιείται για την αξιοποίησή τους σε προγράμματα ταυτοποίησης και πιστοποίησης γενετικού υλικού. Οι μοριακοί δείκτες πρέπει να συγκεντρώνουν τα περισσότερα από τα παρακάτω γνωρίσματα (Hu et al., 1995, Χατζόπουλος, 2001), ώστε να παρουσιάζουν τη μέγιστη χρησιμότητα: Παρουσία πολυμορφισμού ή ύπαρξη πολλών αλληλόμορφων για κάθε γενετικό τόπο. Απλή κληρονομικότητα (Μεντελιανή). Να μπορούν να διακρίνουν την ομόζυγη από την ετερόζυγη κατάσταση. Υψηλός συντελεστής κληρονομικότητας. Διασπορά και στην ιδανική περίπτωση ισοκατανομή σε ολόκληρο το γονιδίωμα. Η μεθοδολογία να μην κοστίζει πολύ, να μην έχει αρνητικές συνέπειες στο φυτό, να είναι εύκολη, να εφαρμόζεται κατά τα νεαρά στάδια της ανάπτυξης των φυτών και συγκεκριμένα όταν τα φυτά έχουν αναπτυχθεί τόσο ώστε να μπορεί να απομονωθεί ικανοποιητική ποσότητα DNA RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) Είναι μια τεχνική που στηρίζεται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) για την ανίχνευση γενετικής ποικιλομορφίας και όχι στη χρήση ραδιοσημασμένων ανιχνευτών, όπως γίνεται στη χρήση των δεικτών RFLPs. Η PCR είναι μια νέα τεχνική που επιτυγχάνει τον εκλεκτικό πολλαπλασιασμό σε εκατομμύρια αντίγραφα αλληλουχιών DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA. Η μέθοδος χρησιμοποιεί το ένζυμο DNA-πολυμεράση (polymerase) και ειδικούς εκκινητές (primers), οι οποίοι κατασκευάζονται με βάση την αλληλουχία των άκρων του επιθυμητού τμήματος DNA. Η DNA-πολυμεράση αντιγράφει μονόκλωνες αλληλουχίες DNA όταν στο 3 άκρο τους υπάρχει μια μικρή δίκλωνη περιοχή. Οι δίκλωνες αυτές περιοχές μπορούν να δημιουργηθούν με τη χρήση εκκινητών που είναι 19

20 Εικόνα 6. Τα βήματα της τεχνικής PCR. μικρά συνθετικά τμήματα μονόκλωνου DNA μεγέθους νουκλεοτιδίων και έχουν αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο της αλυσίδας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε. Για τον πολλαπλασιασμό μιας δίκλωνης περιοχής DNA απαιτούνται δυο εκκινητές, ένας για το 3 άκρο της κάθε αλυσίδας. Η διαδικασία PCR γίνεται σε επαναλαμβανόμενους κύκλους, όπου ο κάθε κύκλος περιλαμβάνει: α) Την αποδιάταξη των δυο κλώνων του DNA με θέρμανση στους C, β) τη σύνδεση (υβριδισμός) των εκκινητών στις συμπληρωματικές περιοχές των δύο αλυσίδων, η οποία επιτυγχάνεται με μείωση της θερμοκρασίας στους 35 έως 55 C και γ) τη σύνθεση των συμπληρωματικών αλυσίδων με τη δράση της ειδικής θερμοάντοχης DNA-πολυμεράσης στους 72 C (Εικ. 6). Το τελικό αποτελέσμα της PCR θα είναι στο τέλος των 20 κύκλων να έχουν δημιουργηθεί 2 20 ενισχυμένα τμήματα για κάθε αρχικό μόριο DNA που χρησιμοποιείται σαν υπόστρωμα (Λουλακάκης, 2002). Σύμφωνα με την τεχνική των RAPDs, ενισχύονται τμήματα DNA κάνοντας χρήση εκκινητών με τυχαία ακολουθία νουκλεοτιδίων (Williams et al., 1990; Welsh and McClelland, 1990). Κάθε προϊόν ενίσχυσης προκύπτει από τον υβριδισμό των τυχαίων αυτών εκκινητών με τις συμπληρωματικές περιοχές του υπό εξέταση DNA. 20

21 Ένα δίκλωνο μόριο DNA για να σχηματιστεί είναι απαραίτητη η ύπαρξη 2 εκκινητών, ένας για το 3 άκρο της κάθε αλυσίδας (Williams et al., 1990) (Εικ. 7). Οι ζώνες πολυμορφισμού θα μπορούσαν να προκληθούν από τις διαφορές στις ακολουθίες της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας στα μέρη της υβριδοποίησης (όπως οι μεταλλαγές σημείου), ή από τις τοπικές διαμορφώσεις της χρωμοσωμικής αλυσίδας μέσα στην ενισχυμένη ακολουθία (π.χ. ελλείψεις, μετατοπίσεις, αναστροφές) (Welsh and McClelland, 1990). Εικόνα 7. Η βασική αρχή της τεχνικής RAPDs. Οι εκκινητές αυτοί που χρησιμοποιούνται στην τεχνική RAPDs δεν είναι γνωστοί ή συγκεκριμένοι αλλά η επιλογή τους γίνεται τυχαία. Το παραπάνω εξασφαλίζει την επιλογή τυχαίων αλληλουχιών στο γονιδιωματικό μόριο DNA, οπότε κάθε εκκινητής να μπορεί να υβριδοποιήσει μια, πολλές ή ακόμα και σε καμία θέση του γονιδιωματικού DNA. Το αποτέλεσμα είναι ότι πολλαπλασιάζονται ανισομεγέθη τμήματα για το DNA κάθε ατόμου, τα οποία όμως είναι συγκεκριμένα για το κάθε DNA, επομένως και για το κάθε άτομο. Διαφορετικά φυτά δίδουν με αυτή τη μέθοδο τμήματα DNA που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος, τον αριθμό, ή και τα δυο (Φανουράκης, 2002). Η παρατήρηση και ταυτοποίηση των προϊόντων της PCR γίνεται εύκολα με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οποιοδήποτε τμήμα του DNA μπορεί να αναγνωριστεί μέσω αυτής της τεχνικής και χρησιμοποιείται ευρύτατα για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση τόσο του DNA όσο και του RNA. Ένα πήκτωμα αγαρόζης είναι ένα 21

22 πολύπλοκο δίκτυο πολυμερών σακχάρων, του οποίου το μέγεθος των πόρων εξαρτάται από τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος και τη συγκέντρωση (%) της αγαρόζης. Οι πόροι αυτοί παίζουν καταλυτικό ρόλο στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA ανάλογα με το μέγεθος των μορίων αυτών. Κατά την ηλεκτροφορητική κινητικότητα, τα μόρια του DNA εμφανίζουν μια πλαστική συμπεριφορά όπου αυτή μεταβαίνει από την κατάσταση της πλήρους αναδίπλωσης σε κατάσταση μιας πυκνής σφαίρας. Σε μια συγκεκριμένη συγκέντρωση αγαρόζης που έχει διαλυθεί σε ένα συγκεκριμένο ρυθμιστικό διάλυμα, ένα εύρος μεγεθών μορίων DNA μπορεί να διαχωριστεί ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Η κινητικότητα των μορίων του DNA είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογάριθμου του μεγέθους ή του μοριακού βάρους. Τα διακριτά τμήματα των νουκλεϊκών μπορούν να εντοπιστούν εύκολα, με υπεριώδη ακτινοβολία, σαν ζώνες που βάφονται με Βρωμιούχο Αιθίδιο (EtBr) (Χατζόπουλος, 2001). Τα ενισχυμένα τμήματα του DNA (ή τα αντιγραφόμενα τμήματα) δημιουργούνται μόνο στις περιοχές του γονιδιώματος που υβριδίζει ο εκκινητής με κατάλληλο προσανατολισμό σε μια απόσταση 200 έως βάσεων περίπου. Ένας εκκινητής έχει μια καθορισμένη αλληλουχία, αλλά η αλληλουχία αυτή είναι τυχαία. Έτσι, υπάρχει δυνητικά ένας απεριόριστος αριθμός εκκινητών RAPDs με συγκεκριμένες αλληλουχίες (Deragon and Landry, 1992). Ο εκκινητής μπορεί να υβριδίσει σε εκατοντάδες θέσεις μέσα στο γονιδίωμα, όμως μόνο εκείνοι που υβριδίζουν σε δυο θέσεις στις αντίθετες αλυσίδες του DNA μέσα σε 200 έως βάσεις έχουν σαν αποτέλεσμα την παραγωγή και εμφάνιση ζωνών μετά από την PCR. Ο κύκλος υβριδισμού, αποδιάταξης και πολυμερισμού επαναλαμβάνεται με αποτέλεσμα τη λογαριθμική αύξηση της συγκέντρωσης του μέρους αυτού του γονιδιώματος. Η χρήση της μεθόδου RAPDs μεταξύ διαφορετικών φυτών μπορεί να συμβάλλει στην αποκάλυψη δεικτών (μορίων DNA) που καταδεικνύουν ότι τα φυτά αυτά διαφέρουν. Η χρησιμότητα των δεικτών αυτών (Ghany and Zaki, 2003) έγκειται στα εξής: Αξιολόγηση της γενετικής παραλλακτικότητας μεταξύ πληθυσμών αλλά και ειδών (π.χ. μαζική ανάλυση διαχωρισμού). 22

23 Για να μελετηθούν οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ ειδών και υποειδών (π.χ. family genome mapping). Για να κατασκευαστούν και να μελετηθούν οι γενετικοί χάρτες συνδέσμων, η επικόλληση γονιδίων και ο προσδιορισμός των ποικιλιών Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της τεχνικής RAPDs Σύμφωνα με τους Benter et al. (1995), η τεχνική RAPDs παρουσιάζει μια πλειάδα πλεονεκτημάτων αλλά και μειονεκτημάτων, τα οποία παρουσιάζονται παρακάτω. Πλεονεκτήματα της τεχνολογίας RAPD Περισσότερος πολυμορφισμός σε σχέση με τα RFLPs. Απλή και γρήγορη μέθοδος. Δεν χρησιμοποιούνται ραδιοϊσότοπα. Λόγω της χρήσης τυχαίων εκκινητών, εξασφαλίζεται η αντικειμενικότητα των αποτελεσμάτων. Διαφοροποιείται στην ενίσχυση τμημάτων DNA έπειτα από μεταλλαγές. Η μέθοδος εφαρμόζεται και σε δείγματα χαμηλής καθαρότητας DNA. Μεγάλος αριθμός ζωνών παράγεται ανά εκκινητή. Οι εκκινητές μπορούν να συντεθούν εύκολα. Μειονεκτήματα της χρησιμοποίησης της τεχνολογίας RAPD Η ανίχνευση του πολυμορφισμού είναι ακόμα περιορισμένη (παρόμοια με RFLPs). Η δυνατότητα επανάληψης των αποτελεσμάτων είναι ανακόλουθη. Το gel αγαρόζης μπορεί να δημιουργήσει φτωχά πρότυπα ανάλυσης, λόγω της περιορισμένης ικανότητας της αγαρόζης να διαχωρίζει διαφορετικού μεγέθους τμήματα DNA και κατά συνέπεια της εμφάνισης λιγότερων ζωνών. Ανιχνεύει μόνο τους κυρίαρχους δείκτες. 23

24 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 24

25 Εισαγωγή - Σκοπός της παρούσας εργασίας Σε πολλές περιοχές στην Ελλάδα, οι αγρότες στις τοπικές κοινωνίες καλλιεργούσαν διάφορες ποικιλίες φυτών με συγκεκριμένα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (παραδοσιακές ποικιλίες), ειδικά προσαρμοσμένα στις τοπικές συνθήκες περιβάλλοντος που συχνά ήταν ακραίες (ξηρασία, κρύο, ανθεκτικότητα σε τοικές ασθένειες κ.τ.λ.). Όλες σχεδόν οι σύγχρονες ποικιλίες που σήμερα καλλιεργούνται έχουν χαρακτηριστικά προερχόμενα από παραδοσιακές ποικιλίες. Ήδη πριν από αρκετά χρόνια, γινόταν μελέτη των φυτών αυτών με βάση τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά, η επιλογή των οποίων δεν ήταν πάντοτε εύκολη υπόθεση. Υπάρχουν χαρακτηριστικά, για παράδειγμα, που δεν εκφράζονται άμεσα στο φαινότυπο, ή εκφράζονται καθυστερημένα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του φυτού, ή ακόμα που για να εκδηλωθούν χρειάζεται εφαρμογή ειδικών συνθηκών (π.χ. ανθεκτικότητα σε διάφορες ασθένειες). Παλαιότερα, για τη μελέτη της ποικιλομορφίας μεταξύ των φυτών μιας ποικιλίας, γινόταν μονάχα καταγραφή των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών και η επιλογή των φυτών αυτών γινόταν με βάση τα παραπάνω χαρακτηριστικά. Μετά όμως την εισαγωγή της βιοτεχνολογίας στη Γενετική Βελτίωση, οι μελετητές είχαν πλέον στα χέρια τους ένα πολύτιμο και συνάμα σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη των φυτών αυτών ως προς την παραλλακτικότητα τους. Όπως είναι γνωστό, γονίδια που εκφράζονται φαινοτυπικά δεν καταγράφονται σε όλο το γονιδίωμα, δηλαδή μόνο ένα μικρό ποσοστό του γονιδιώματος (5-10%) εκφράζεται στο φαινότυπο. Είναι λοιπόν σωστότερη και πιο αξιόπιστη μέθοδος η μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας ενός πληθυσμού. Το βιοτεχνολογικό εργαλείο που δίνει στο βελτιωτή τη δυνατότητα αυτή λέγεται μοριακή ανάλυση δεικτών (RFLPs, RAPDs, κ.α.), δηλαδή τμημάτων DNA που μπορούν να καλύψουν ολόκληρο το γονιδίωμα και όχι μόνο το μεταφραζόμενο κομμάτι τους. Πολλοί γενετιστές, με βάση την παραπάνω μεθοδολογία, έχουν προσπαθήσει να μελετήσουν ποικιλίες διαφόρων ειδών, όπως ο Fanourakis et al. (2004) που μελέτησε τη γενετική σχέση διαφόρων ποικιλιών στο αγγούρι, οι Simon και Kapteyn (2002) που μελέτησαν τη γενετική ποικιλομορφία της Echinacea sp., ο Fanourakis et al. (2003) που μελέτησε τη γενετική ποικιλομορφία σε παραδοσιακές ποικιλίες πεπονιού κ.α.. 25

26 Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανίχνευση γενετικής ποικιλομορφίας μεταξύ των φυτών της παραδοσιακής ποικιλίας αγγουριάς Κνωσός και η συσχέτιση των μοριακών δεδομένων με τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τα οποία καταγράφηκαν κατά την καλλιέργεια της συγκεκριμένης ποικιλίας, που δεν έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα γενετικά αρκετά και δεν είναι δυνατή η εκτίμηση της υπάρχουσας γενετικής παραλλακτικότητας. 26

27 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 27

28 2.1 Προβλάστηση Σπόρων Οι σπόροι των αγγουριών που επιλέχθηκαν, δόθηκαν από το εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης φυτών του ΤΕΙ Κρήτης, ανήκαν στην ποικιλία Κνωσός και ήταν ενός έτους. Για την προβλάστησή τους, εισήχθησαν περίπου 70 σπόροι σε τριβλία Petri, στα οποία είχε τοποθετηθεί διηθητικό χαρτί, βρεγμένο με νερό. Στη συνέχεια, τα τριβλία αυτά τοποθετήθηκαν σε θάλαμο επώασης σπόρων για περίπου 24 h. Ο χρόνος αυτός θεωρήθηκε αρκετός για την προβλάστησή τους, αφού μετά το πέρας των 24 h, σχεδόν όλοι οι σπόροι είχαν αναπτύξει μικρό ριζίδιο, τόσο όσο έπρεπε για τη σωστή μεταφύτευση τους σε δίσκους φύτευσης πολλαπλών θέσεων. 2.2 Φύτευση των Σπόρων Οι βλαστημένοι σπόροι φυτεύτηκαν σε δίσκους φύτευσης πολλαπλών θέσεων. Σε κάθε θέση που περιείχε τύρφη τοποθετήθηκε ένας σπόρος σε βάθος 5 cm περίπου, ώστε να εξελιχθεί ομαλά η συνέχεια της ανάπτυξης τους. Οι σπόροι ποτίζονταν με νερό βρύσης μια φορά την ημέρα και όπου χρειαζόταν γινόταν και δεύτερη επέμβαση με νερό, ενώ έγινε και μια φορά υδρολίπανση χρησιμοποιώντας λίπασμα NUTRILIF 1% w.v. για την καλύτερη ανάπτυξη των φυταρίων. Μόλις τα φυτάρια απέκτησαν ύψος περίπου cm, και είχε εκπτυχθεί το τρίτο πραγματικό φύλλο, μεταφυτεύθηκαν στο θερμοκήπιο. 2.3 Μεταφύτευση των Νεαρών Φυταρίων στο Θερμοκήπιο Η μεταφύτευση των φυταρίων έγινε με τη μπάλα χώματος, ώστε να μην τραυματιστούν οι ρίζες. Τα νεαρά φυτά φυτεύθηκαν σε διπλή σειρά στο γυάλινο θερμοκήπιο του εργαστηρίου Γενετικής και Βελτίωσης φυτών στο αγρόκτημα του ΤΕΙ Κρήτης, σε απόσταση 25 cm επί της γραμμής και 50 cm μεταξύ των γραμμών. 28

29 2.4 Φροντίδα Φυτών στο Θερμοκήπιο Τα φυτά στην αρχή και μέχρι το ύψος των 50 cm ποτίζονταν καθημερινά, ενώ στη συνέχεια ποτίζονταν κάθε δύο μέρες, από μια φορά την ημέρα. Λίπανση γινόταν μια φορά κάθε βδομάδα με λίπασμα 5% w.v Οι πλάγιοι βλαστοί αφαιρούνταν από τα φυτά μέχρι το ύψος των 50 cm, όχι όμως πάνω από αυτό, διότι ήταν επιθυμητή η μεγάλη φυλλική επιφάνεια λόγω της διεξαγωγής τεχνητών επικονιάσεων για την εξαγωγή σπόρου. 2.5 Τεχνητές Επικονιάσεις Οι τεχνητές επικονιάσεις άρχισαν όταν είχαν αναπτυχθεί αρσενικά και θηλυκά άνθη πάνω στο ίδιο το φυτό. Για την αποφυγή τυχαίων επικονιάσεων (λόγω ανέμου ή εντόμων) το θερμοκήπιο είχε κλειστεί ερμητικά με σίτες ώστε να μην εισέρχονται έντομα και η πόρτα του θερμοκηπίου έκλεινε κάθε φορά που γινόταν κάποια επέμβαση στα φυτά μέσα στο θερμοκήπιο. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για να γίνουν οι επικονιάσεις ήταν η εξής: Από το αρσενικό άνθος (Εικ. 8), το οποίο κοβόταν μαζί με το μίσχο του, αφαιρούνταν τα πέταλα μαζί με ένα μικρό μέρος από τα σέπαλα που είναι ενωμένα ώστε να αποκαλυφθούν οι στήμονες με τη γύρη. Εικόνα 8. Θηλυκό και αρσενικό άνθος του φυτού Cucumis sativus. Φροντίδα λαμβανόταν ώστε η γύρη να διατηρούσε όσο το δυνατόν περισσότερο την κολλώδη ιδιότητά της και γι αυτό το λόγο οι τεχνητές επικονιάσεις γίνονταν την 29

30 πιο κατάλληλη στιγμή της ημέρας (συνήθως πρωινές ώρες). Στη συνέχεια, το αρσενικό άνθος τοποθετούνταν με τέτοιο τρόπο πάνω στο θηλυκό (Εικ. 8) ώστε η γύρη του αρσενικού άνθους να εφάπτεται με το στίγμα που βρίσκεται πάνω στο στύλο του θηλυκού άνθους όσο το δυνατόν περισσότερο. Με τον παραπάνω τρόπο εξασφαλιζόταν η προσκόλληση μεγαλύτερης ποσότητας γύρης πάνω στο στίγμα και κατά συνέπεια μεγαλύτερη πιθανότητα επιτυχίας της επικονίασης. Στη συνέχεια το θηλυκό άνθος κλείνονταν με έλασμα με τέτοιο τρόπο, ώστε το αρσενικό άνθος να μείνει μέσα στο θηλυκό. Με τον τρόπο αυτό αυξανόταν η πιθανότητα επιτυχίας και παράλληλα μειωνόταν η πιθανότητα τυχαίας επικονίασης (Εικ. 9). Εικόνα 9. Η διαδικασία της τεχνητής επικονίασης στο αγγούρι. 30

31 Στη συνέχεια έγινε τοποθέτηση καρτέλας στο μίσχο του άνθους που ανέφερε τα στοιχεία της επικονίασης, όπως τα στοιχεία των γονέων και την ημερομηνία της τεχνητής επικονίασης. Οι τεχνητές επικονιάσεις συνεχίστηκαν για χρονικό διάστημα περίπου ημερών και μέχρι την περάτωση 3-4 επικονιάσεων τουλάχιστον σε κάθε φυτό. Ο μικρός σχετικά αριθμός των επικονιάσεων οφειλόταν, αφενός στο μεγάλο βάρος των καρπών που θα μπορούσαν να τραυματίσουν το φυτό και αφετέρου στο μεγάλο αριθμό σπόρων που περιέχει ο κάθε καρπός. Μετά το πέρας του παραπάνω χρονικού διαστήματος, σταμάτησαν οι επικονιάσεις μέχρι να γίνει η συγκομιδή των καρπών και η εξαγωγή των σπόρων από κάθε φυτό που έγινε αυτογονιμοποίηση. 2.6 Συγκομιδή Καρπών και Εξαγωγή Σπόρων Η συγκομιδή των καρπών που προήλθαν από τα άνθη στα οποία είχε γίνει τεχνητή επικονίαση γινόταν μετά από ημέρες από την έναρξη της διαδικασίας της κάθε αυτογονιμοποίησης. Οι καρποί που συγκομίστηκαν ήταν 3-4 από κάθε φυτό. Ο καρπός στο στάδιο της συγκομιδής ήταν διογκωμένος, με χρώμα κίτρινο. Η εξαγωγή των σπόρων έγινε με νερό βρύσης ακολουθώντας την παρακάτω διαδικασία: Έγινε συγκέντρωση των καρπών του κάθε φυτού ξεχωριστά, οι καρποί κόβονταν στη μέση και σε τρεχούμενο νερό αφαιρούνταν οι σπόροι από το εσωτερικό των καρπών, οι οποίοι κατέληγαν σε ένα οικιακό στραγγιστήρι, ώστε ν αποφευχθεί η έκπλυσή τους και η απώλεια τους στην αποχέτευση. Οι σπόροι που είχαν συγκεντρωθεί στο στραγγιστήρι, πλένονταν καλά με νερό ώστε να αποβληθούν στην αποχέτευση κελύφη αγονιμοποίητων σπόρων και ακαθαρσιών από τον καρπό που είχαν συσσωρευθεί στο σκεύος στράγγισης κατά τη διαδικασία εξαγωγής τους. Μετά το τέλος της παραπάνω διαδικασίας οι σπόροι από κάθε φυτό τοποθετούνταν σε ένα πλαστικό δοχείο διάτρητο στη βάση του για τη διευκόλυνση της περαιτέρω στράγγισης του νερού που υπήρχε στο δοχείο. Κάθε δοχείο περιείχε τους σπόρους του κάθε φυτού ξεχωριστά που είχε αυτογονιμοποιηθεί. Τα δοχεία αυτά αφήνονταν για μια μέρα περίπου σε κανονικές συνθήκες περιβάλλοντος για να αποβληθεί όσο πιο πολύ νερό ήταν δυνατόν και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ειδικό 31

32 ξηραντήρα για περίπου 24 h στους 37 C. Το χρονικό αυτό διάστημα ήταν αρκετό για να στεγνώσουν πλήρως οι σπόροι από το νερό. Στη συνέχεια οι σπόροι από το κάθε δοχείο που αντιπροσώπευαν το κάθε φυτό, τοποθετούνταν σε ειδικά χάρτινα σακουλάκια, πάνω στα οποία εγγραφόταν ο χρόνος εξαγωγής των σπόρων και ο αριθμός του φυτού που είχε αυτογονιμοποιηθεί και απ το οποίο είχαν παρθεί οι σπόροι, καθώς επίσης και η ποικιλία του φυτού, που στην προκειμένη περίπτωση ήταν η Κνωσός. Τα σακουλάκια αυτά φυλάσσονταν στη συνέχεια στον ειδικό ψυκτικό χώρο του εργαστηρίου Γενετικής και Βελτίωσης φυτών του ΤΕΙ Κρήτης σε θερμοκρασία 5 C και σχετικής υγρασίας 25% περίπου για περαιτέρω χρήση και μελέτη. 2.7 Απομόνωση DNA από Φύλλα Αγγουριάς Για την απομόνωση του DNA χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος με CTAB (Hulbert and Bennetzen, 1991) με κάποιες τροποποιήσεις. Το DNA απομονώθηκε από νεαρά φύλλα. Κάθε φύλλο, αφού πλύθηκε καλά με 10% διάλυμα με κοινό σαπούνι και προσεκτικά ώστε να μην καταστραφούν οι ιστοί του, τεμαχίστηκε σε πολύ μικρά κομμάτια. Η πλύση με σαπούνι κρίθηκε απαραίτητη για την αποφυγή μόλυνσης του φυτικού DNA με DNA από μύκητες και βακτήρια. Σε δοχείο τύπου eppendorf τοποθετήθηκαν mg τεμαχισμένων φύλλων, προστέθηκαν μl προθερμασμένου στους 60 C διαλύματος 2x CTAB [CTAB 2%, Tris (0,1 M ph 8,0), EDTA (0,02 M ph 8,0), NaCl 1,4 M] και ακολούθησε ομογενοποίηση με πλαστικό κονιορτοποιητή. Προστέθηκε ίσου όγκου προθερμασμένο στους 60 C διαλύματος CTAB και έγινε ήπια ανάδευση και επιπλέον ομογενοποίηση όπου χρειαζόταν. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 60 C για min. Κάθε 5 min γινόταν ήπια ανάδευση. Προστέθηκε χλωροφόρμιο ίσου όγκου με το περιεχόμενο διάλυμα CTAB και έγινε καλή αλλά ήπια ανάδευση. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 min στις rpm σε επιτραπέζια φυγόκεντρο, σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο διάλυμα μεταφέρθηκε σε νέα δοχεία τύπου eppendorf. Όπου χρειαζόταν, ανάλογα με την καθαρότητα, επαναλαμβανόταν τα τελευταία δυο βήματα. Η κατακρήμνιση των νουκλεϊκών οξέων έγινε με προσθήκη 1/10 του όγκου οξικού νατρίου 3 M, ph 5,2 και ίσου όγκου ισοπροπανόλης. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 32

33 20 min στις rpm στους 4 C. Το ίζημα ξεπλύθηκε με 1 ml 70% αιθυλική αλκοόλη, ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min και στη συνέχεια στέγνωσε στους 60 C για 10 min. Στη συνέχεια η πελέτα επαναδιαλύθηκε σε 50 μl απεσταγμένου και αποστειρωμένου νερού. Μετά την επαναδιάλυση προστέθηκε 1μL RNAse (10 mg/ml) και έγινε επώαση για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου. Το DNA που απομονώθηκε διατηρήθηκε στους -20 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί και η ποσότητά του ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση σε 0,8% w.v πηκτώμα αγαρόζης (Sigma A-9311) με EtBr (0,5μg/mL) σε 0,5x TBE (0,54% w.v Tris, 0,275% w.v. Boric Acid, 0,01 M EDTA). 2.8 Ποσοτικός Προσδιορισμός του DNA Η ποσότητα DNA που περιέχεται στο υδατικό διάλυμα, υπολογίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης του στα 260 nm. Όπως είναι γνωστό, τα νουκλεϊκά οξέα έχουν το μέγιστο της απορρόφησης τους στην περιοχή αυτή της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). Με βάση το γεγονός ότι 1 μονάδα απορρόφησης στα 260 nm (1 OD 260 ) αντιστοιχεί σε 50 μg/ml δίκλωνου DNA βρέθηκε η συγκέντρωση των δειγμάτων που απομονώθηκαν, λαμβάνοντας 1 μl από το απομονωμένο DNA και προσθέτοντας 999 μl ddh 2 O και μετρώντας την απορρόφηση του υδατικού αυτού διαλύματος σε φωτόμετρο στα 260 nm. 2.9 Ενίσχυση RAPD μετά την PCR Για την ανίχνευση ποικιλομορφίας στην παραδοσιακή ποικιλία αγγουριού Κνωσσός χρησιμοποιήθηκαν 20 διαφορετικά ολιγονουκλεοτίδια (Williams et al. 1990), η αλληλουχία των οποίων παρουσιάζεται στον Πίνακα 4. 33

34 Πίνακας 4. Αλληλουχία των τυχαίων εκκινητών OPA (Operon Technologies) που χρησιμοποιήθηκαν για την τυχαία πολυμορφική ανάλυση του DNA του Cucumis sativus var. Knosos. ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ DNA 5 3 OPA01 CAGGCCCTTC OPA02 TGCCGAGCTG OPA03 AGTCAGCCAC OPA04 AATCGGGCTG OPA05 AGGGGTCTTG OPA06 GGTCCCTGAC OPA07 GAAACGGGTG OPA08 GTGACGTAGG OPA09 GGGTAACGCC OPA10 GTGATCGCAG OPA11 CAATCGCCGT OPA12 TCGGCGATAG OPA13 CAGCACCCAC OPA14 TCTGTGCTGG OPA15 TTCCGAACCC OPA16 AGCCAGCGAA OPA17 GACCGCTTGT OPA18 AGGTGACCGT OPA19 CAAACGTCGG OPA20 GTTGCGATCC 2.10 Αντιδράσεις PCR Για τις αντιδράσεις PCR χρησιμοποιήθηκαν σωληνάκια τύπου eppendorf όγκου 200 μl. Όλες οι αντιδράσεις έγιναν σε τελικό όγκο 25 μl χρησιμοποιώντας τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια (OPA) ανά αντίδραση (Πίνακας 5). Οι κωδικοί αριθμοί των φυτών που χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία για την ανάλυση με RAPDs, δίδονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 5. Παρουσίαση των τετράδων ολιγονουκλεοτιδίων (OPA) που χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις PCR. Τετράδες ολιγονουκλεοτιδίων Σειρά ολιγονουκλεοτιδίων (OPA) ΣΕΙΡΑ_1 1,2,3,4 ΣΕΙΡΑ_2 5,6,7,8 ΣΕΙΡΑ_3 9,10,11,12 ΣΕΙΡΑ_4 13,14,15,16 ΣΕΙΡΑ_5 17,18,19,20 34

35 Πίνακας 6. Οι κωδικοί αριθμοί των φυτών αγγουριάς που χρησιμοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις PCR και την RAPD ανάλυση. ΦΥΤΑ ΚΩΔΙΚΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ Κάθε αντίδραση PCR περιείχε ng DNA, 1x ρυθμιστικό διάλυμα PCR, 15 mm MgCl 2, 200 μm dntps, 0,6 ng/μl κάθε OPA, 1x Q-διάλυμα (ρυθμιστικό), 1 unit πολυμεράση. Τα ένζυμα και τα αντιδραστήρια ήταν της Qiagen. Οι παραπάνω αντιδράσεις έγιναν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler Gradient και το πρόγραμμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το εξής: 3 min στους 94 C (για να γίνει η αποδιάταξη του DNA) και ακολούθησαν 45 κύκλοι που ο καθένας αποτελείτο από 30 sec στους 94 C, 30 sec στους 36 C (για να γίνει η υβριδοποίηση των εκκινητών με το αντίστοιχο συμπληρωματικό τμήμα του γονιδιωματικού DNA), 1 min στους 72 C (για να γίνει η σύνθεση με τα αντίστοιχα συμπληρωματικά τμήματα 35

36 του γονιδιωματικού DNA του αγγουριού με τη βοήθεια της θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης) και με το πέρας των 45 κύκλων ακολούθησαν 3 min στους 72 C Ηλεκτροφόρηση Αγαρόζης Η ανάλυση των προϊόντων της απομόνωσης DNA έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (Sigma A-9311) 0,8% w.v με προσθήκη EtBr (0,5 μg/ml), ενώ των προϊόντων της PCR έγινε σε πήκτωμα αγαρόζης 1,2% w.v.. Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε συνεχή ηλεκτρική τάση 5 volt/cm, ενώ το διάλυμα ηλεκτροφόρησης ήταν TBE 0,5x (0,54% w.v Tris, 0,275% w.v. Boric Acid, 0,01 M EDTA). Για τον προσδιορισμό των προϊόντων της PCR, χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας γνωστών μοριακών μεγεθών, DNA από το φάγο λ που είχε κοπεί με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRΙ και HindΙΙΙ. Τα μεγέθη του μάρτυρα λecorι καθώς και του μάρτυρα λecorι/hindιιι φαίνονται στον Πίνακα 7 και στην Εικόνα 10. Πίνακας 7. Τα μεγέθη των μαρτύρων που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα. Μεγέθη μάρτυρα λecorι (bp) Μεγέθη μάρτυρα λecorι/hindιιι (bp)

37 bp bp Εικόνα 10. Τα μεγέθη των μαρτύρων λecorι και λecorι/hindιιι 2.12 Βαθμονόμηση Μοριακών Δεικτών Τα αποτελέσματα που μας έδωσαν οι αντιδράσεις PCR (ζώνες) είναι οι δείκτες RAPDs της ποικιλίας Κνωσός, το μέγεθος των οποίων προσδιορίστηκε με τη βοήθεια του μάρτυρα λecorι/hindιιι. Κάθε ζώνη DNA στο πήκτωμα αποτελεί και ένα δείκτη RAPD, ενώ και τα 30 φυτά ελέγχθηκαν για την παρουσία ή την απουσία δεικτών που έδινε η κάθε τετράδα ολιγονουκλεοτιδίων. Όλα αυτά τα αποτελέσματα μπήκαν σε ένα συγκεντρωτικό πίνακα, τα οποία συγκρίθηκαν με τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της ποικιλίας που καταγράφηκαν καθ όλη τη διάρκεια του παραπάνω πειράματος. Η παρουσία κάθε δείκτη συμβολιζόταν με 1, ενώ η απουσία συμβολιζόταν με 0. Τα φαινοτυπικά αυτά χαρακτηριστικά της ποικιλίας Κνωσός είναι άμεσα συνδεδεμένα με την ύπαρξη ή μη ποικιλομορφίας στην ποικιλία, ο έλεγχος και η ταυτοποίηση της οποίας γίνεται με τους δείκτες RAPDs. 37