Ο ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου στην κυτταρική επιβίωση και απόπτωση

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης στη Μοριακή Φαρμακολογία - Κλινική Φαρμακευτική Διπλωματική εργασία με τίτλο: Ο ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου στην κυτταρική επιβίωση και απόπτωση Αριάδνη Παπαδοπούλου, Φαρμακοποιός Επιβλέπουσα: κ. Ευαγγελία Παπαδημητρίου Επ.Καθηγήτρια Τμ.Φαρμακευτικής Απρίλιος 2007

2 Περιεχόμενα Σελ. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Γενικά 1 Παραγωγή και δράση των ROS στα κύτταρα 1 Ρύθμιση της παραγωγής των ROS 4 Προστασία των κυττάρων από τις ROS 6 ROS και ΜΑΡ κινάσες 8 ROS και AP-1 10 NO και Οξειδωτικό στρες 12 ROS, ΝΟ και cgmp 15 HARP Γενικά 17 Πρωτεϊνική δομή της HARP 17 Δομή του γονιδίου της HARP 20 Έκφραση και ρύθμιση του γονιδίου της HARP 22 Υποδοχείς της HARP και μεταγωγή σήματος 24 Βιολογικές δράσεις της HARP Ανάπτυξη και κυτταρικός πολλαπλασιασμός 28 Αγγειογένεση 31 HARP και καρκίνος 33 Η HARP ως διαγνωστικός δείκτης 36 ΣΚΟΠΟΣ 38 ΜΕΘΟΔΟΙ Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC 41 Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer 43 Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου 44 ανθρώπου Ανακαλλιέργεια κυττάρων LNCaP 46 Απομόνωση της HARP από το θρεπτικό μέσο των κυττάρων 46 Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, σε 48 αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western 50 Αποδέσμευση αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) 54 Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυμα (Μέθοδος 55 Bradford) Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της 55 λουσιφεράσης Απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος από κύτταρα HUVEC 58 Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός των υπομονάδων του μεταγραφικού 60 παράγοντα ΑΡ-1 με τη μέθοδο ELISA Έλεγχος της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης JNK σε κύτταρα HUVEC με τη 64 μέθοδο ELISA Ανακαλλιέργεια κυττάρων CVEC 68 Ψύξη κυττάρων 69 1

3 Απόψυξη κυττάρων 70 Έλεγχος της επίδρασης των υπό μελέτη ουσιών στην επιβίωση και τον 71 πολλαπλασιασμό των κυττάρων CVEC Προσδιορισμός του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης κυττάρων 73 CVEC Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων πρωτεϊνών με σύστημα ανάλυσης 76 εικόνας Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 77 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΡΟΣ Α Οι αναστολείς της enos, L-NAME και L-NIO, αναστέλλουν την επαγόμενη 78 από το ΗΡ έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC και LNCaP Ο L-NAME αναστέλλει την επαγόμενη από το ΗΡ μεταγραφική ενεργοποίηση 79 του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC και LNCaP Ο L-NAME αναστέλλει την επαγόμενη από το HP ενεργοποίηση 81 συγκεκριμένων υπομονάδων του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στα κύτταρα HUVEC Το HP δεν επηρεάζει την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης JNK στα κύτταρα 82 HUVEC Ο L-NAME αναστέλλει την επαγόμενη από το HP ενεργοποίηση των 83 πρωτεϊνών ERK1/2 στα κύτταρα HUVEC Ο αναστολέας της sgc, ODQ, αναστέλλει την επαγόμενη από HP 84 ενεργοποίηση των πρωτεϊνών ERK1/2 στα κύτταρα HUVEC Οι L-NAME και ODQ δεν επηρεάζουν την επαγόμενη από το HP 85 ενεργοποίηση της p38 στα κύτταρα HUVEC Ο αναστολέας της p38, SB202190, αναστέλλει την επαγόμενη από το HP 86 ενεργοποίηση των πρωτεϊνών ERK1/2 στα κύτταρα HUVEC ΜΕΡΟΣ Β Το ΗΡ προκαλεί την απόπτωση των κυττάρων CVEC 87 Το ΗΡ αναστέλλει την επαγωγική δράση των αυξητικών παραγόντων VEGF 88 και FGF-2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CVEC Ο Z-VAD δεν επηρεάζει την επαγόμενη από την DMNQ αναστολή του 91 πολλαπλασιασμού των κυττάρων CVEC ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΡΟΣ Α 94 ΜΕΡΟΣ Β 100 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 102 2

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3

5 ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Γενικά Στα κύτταρα των αερόβιων οργανισμών περισσότερο από το 95% του οξυγόνου που καταναλώνεται ανάγεται από τη μιτοχονδριακή οξειδάση των κυτοχρωμάτων, ενώ το υπόλοιπο μέρος ανάγεται από τις διάφορες άλλες οξειδάσες και τις αεροβικές αφυδρογονάσες. Για την πλήρη αναγωγή ενός μορίου οξυγόνου, απαιτείται η ταυτόχρονη μεταφορά τεσσάρων ηλεκτρονίων που οδηγεί στην παραγωγή δύο μορίων νερού ή άλλων ισοδύναμων ενώσεων. Η αναγωγή του οξυγόνου από λιγότερα από τέσσερα ηλεκτρόνια, οδηγεί στην παραγωγή ασταθών μεταβολιτών που ονομάζονται δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS). Η κυτταρική παραγωγή ROS μπορεί να αυξηθεί από τη δράση ορμονών, κυτταροκινών και άλλων φυσιολογικών ερεθισμάτων, αλλά και από εξωτερικούς παράγοντες, όπως κατά τον ξενοβιοτικό μεταβολισμό ή με την επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας. Σε υψηλές συγκεντρώσεις οι ROS είναι τοξικές για τα κύτταρα, προκαλώντας βλάβες στην κυτταρική μεμβράνη και μη αναστρέψιμες τροποποιήσεις στο DNA. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, οι ROS δρουν ως ειδικά σηματοδοτικά μόρια που συμμετέχουν στον έλεγχο των ανοσολογικών διαδικασιών, της κυκλοφορίας του αίματος και της ρύθμισης του ενδοκρινικού και άλλων συστημάτων (Turpaev, 2002; Paravicini and Touyz, 2006). Παραγωγή και δράση των ROS στα κύτταρα Η αναγωγή ενός ηλεκτρονίου του οξυγόνου, παράγει το ανιόν του υπεροξειδίου (O 2 ). Η μη-ενζυματική οξείδωση της ημι-ανηγμένης ουβικινόνης (UQ 10 ) είναι μια από τις κύριες πηγές της μιτοχονδριακής σύνθεσης του ανιόντος αυτού (Raha and Robinson, 2000): UQ 10 + O 2 O 2 + UQ 10 4

6 Το O 2 παράγεται επίσης ως αναπόφευκτο παραπροϊόν της αντίδρασης υδροξυλίωσης που καταλύεται από το κυτόχρωμα Ρ-450 και μέσω μερικών άλλων οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Πιο συγκεκριμένα, το O 2 είναι ένα από τα κύρια προϊόντα των αντιδράσεων που καταλύονται από την οξειδάση NAD(P)H, την οξειδάση της ξανθίνης και τη διοξυγενάση της ινδολαμίνης (Morel and Barouki, 1999) (εικόνα Ε.1). Το O 2 επίσης παράγεται και σε μερικές μη-ενζυματικές αντιδράσεις (όπως κατά τη διάρκεια της οξείδωσης των κατεχολαμινών παρουσία ιόντων σιδήρου, κατά τη διάρκεια της οξείδωσης των ημι-ανηγμένων φλαβινών, των ημικινονών και της αίμης του σιδήρου από το μοριακό οξυγόνο). Στην αντίδραση της δισμουτάσης με το νερό, το υπεροξείδιο παράγει μάλλον ταχέως (t 1/2 =10-6 s, 37 C) ΗΡ (hydrogen peroxide, ΗΡ ή H 2 O 2 ) και O 2 (Reiter, 1995). Εικόνα Ε.1: Σχηματική απεικόνιση των κύριων μονοπατιών παραγωγής και αμοιβαίων μετασχηματισμών ROS. Το οξυγόνο (Ο 2 ) ανάγεται σε ανιόν υπεροξειδίου (O 2 ) από τα μιτοχόνδρια στην αντίδραση με την ημι-ανηγμένη ουβικινόνη (UQ 10 ), καθώς και από τις αντιδράσεις που καταλύονται από την οξειδάση της ξανθίνης και τις ειδικές NAD(P)H οξειδάσες. Το ΗΡ παράγεται από το O 2 μέσω της αντίδρασης της δισμουτάσης ή κατά την αφαίρεση δύο ηλεκτρονίων του οξυγόνου από τις υδροξυλάσες. Το O 2 οξειδώνει τα ενεργά κέντρα των πρωτεϊνών που περιέχουν σίδηρο, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση ιόντων σιδήρου και την παραγωγή ριζών υδροξυλίου (ΗO ) στην αντίδραση με το ΗΡ. 5

7 Το ΗΡ παράγεται με αναγωγή δύο ηλεκτρονίων του μοριακού οξυγόνου σε αντιδράσεις που καταλύονται από οξειδάσες των L-αμινοξέων, από την αλδεϋδική αφυδρογονάση, τη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου, τη μονοαμινοξειδάση, την 5-λιποξυγενάση, τη δισμουτάση του υπεροξειδίου και μερικά άλλα ένζυμα (Thannickal and Fanburg, 2000; Reiter, 1995). Σε αντίθεση με το O 2, το ΗΡ λόγω έλλειψης φορτίου μπορεί να διαπεράσει τις κυτταρικές μεμβράνες και να αλληλεπιδράσει ακόμα και με κυτταρικά συστατικά που βρίσκονται μακρυά από τη θέση σύνθεσής του. Το ΗΡ είναι μια μάλλον σταθερή ένωση σε σχέση με το O 2, και η ενεργότητά του δεν είναι πολύ υψηλή. Εντούτοις, η συσσώρευση ΗΡ είναι πολύ επικίνδυνη για τα κύτταρα, επειδή η αναγωγή ενός μόνο ηλεκτρονίου του παρουσία ελεύθερων ιόντων Fe 2+ ή Cu + (αντίδραση Fenton), οδηγεί στην παραγωγή της πολύ ενεργής υδροξυλικής ρίζας (OH ): ΗΡ + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ Αυτή η ελεύθερη ρίζα έχει μικρό χρόνο ημιζωής (t 1/2 =10-9 s, 37 C) αλλά μπορεί να οξειδώσει σχεδόν όλες τις οργανικές ενώσεις που βρίσκονται κοντά στη θέση παραγωγής της (Reiter, 1995). Οι τοξικές δράσεις της OH αποτελούν κυρίως συνέπειες των μη-αντιστρεπτών τροποποιήσεων στα νουκλεϊκά οξέα και τις πρωτεΐνες, καθώς και της έναρξης των αλυσιδωτών αντιδράσεων οξείδωσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων, με αποτέλεσμα την καταστροφή της ακεραιότητας των κυτταρικών μεμβρανών. Θεωρείται ότι τα κύτταρα των θηλαστικών μπορούν να πολλαπλασιάζονται σε περιβάλλον όπου η συγκέντρωση του ΗΡ είναι κάτω από 700 nμ, ενώ σε συγκεντρώσεις άνω του 1 μμ τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση (Boveris et al., 2002). Το ΗΡ, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, φαίνεται ότι όχι μόνο ενισχύει τη μεταγωγή σήματος μέσω συγκεκριμένων μεμβρανικών υποδοχέων, αλλά αποτελεί και απαραίτητη προϋπόθεση για τη σωστή λειτουργία διαφόρων μονοπατιών μεταγωγής σήματος (Stone and Collins, 2002). 6

8 Ρύθμιση της παραγωγής των ROS Ποικίλα ενζυμικά συστήματα που βρίσκονται σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων αυξάνουν τη σύνθεση των ROS ως ανταπόκριση σε εξωκυτταρικά σήματα (Thannickal and Fanburg, 2000). Η γονιδιακή έκφραση της διοξυγενάσης της ινδολαμίνης επάγεται από τις ιντερφερόνες και τις κυτταροκίνες (Hayaishi, 1996). Ενεργοποίηση των ασβεστιο-εξαρτώμενων πρωτεϊνασών οδηγεί στον πρωτεολυτικό μετασχηματισμό της αφυδρογονάσης της ξανθίνης σε οξειδάση της ξανθίνης και O 2 (Saksela, 1999). Η μιτοχονδριακή παραγωγή ROS αυξάνεται στα κύτταρα που επωάζονται με IL-1 ή TNF-α (Raha and Robinson, 2000) ή που βρίσκονται κάτω από συνθήκες υποξίας. Ο μηχανισμός σύνθεσης των ROS που επάγεται από τις κυτταροκίνες και λαμβάνει χώρα στα μιτοχόνδρια, δεν είναι πλήρως γνωστός. Έχει προταθεί ότι η σύνθεσή τους ίσως διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση της, παραγόμενης από το κεραμίδιο, σφιγγομυελινάσης και άλλων ενζύμων που σχετίζονται με τη μεμβράνη και εμπλέκονται στο μεταβολισμό των φωσφολιπιδίων (Fernandez-Checa, 1988). Εκτός από τα μιτοχόνδρια, σημαντικές πηγές που ρυθμίζουν τη σύνθεση των ROS αποτελούν η NAD(P)H οξειδάση και η 5-λιποξυγενάση που βρίσκονται στην πλασματική μεμβράνη. Η 5-λιποξυγενάση εκφράζεται φυσιολογικά στα λεμφοκύτταρα και τα αστροκύτταρα (Bonizzi et al., 2000). Η NAD(P)H οξειδάση εκφράζεται φυσιολογικά σε διάφορα κύτταρα, όπως στα φαγοκύτταρα του αίματος (ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και μακροφάγα), στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα χονδροκύτταρα και τα αστροκύτταρα, αλλά και στα περισσότερα όργανα, όπως στα νεφρά, στο ηπαρ, στους σκελετικούς μυς, στον προστάτη, στον πνεύμονα και στο μαστό (Ray and Shah, 2005). Η NAD(P)H οξειδάση καταλύει την αναγωγή ενός ηλεκτρονίου του οξυγόνου δεχόμενη το αναγωγικό ισοδύναμο από το NADH ή το NADPH. Η NAD(P)H οξειδάση ενεργοποιείται από κυτταροκίνες που προκαλούν φλεγμονή (IFN-γ, TNF-α, TGFβ, IL-1) και από ορισμένους αυξητικούς παράγοντες. Κάτω από αυτές τις συνθήκες, την αποκαλούμενη «οξειδωτική έκρηξη», το 90% του οξυγόνου που καταναλώνεται στα ουδετερόφιλα ανάγεται σε O 2 και έπειτα σε ΗΡ (De Keulenaer et al., 1998). Το σύμπλεγμα της NAD(P)H οξειδάσης περιλαμβάνει το 7

9 κυτταρόχρωμα b 558 που είναι μόνιμα συνδεδεμένο στην πλασματική μεμβράνη και αποτελείται από δύο πρωτεϊνικές υπομονάδες (p91 phox και p22 phox ). Η μετατόπιση των κυτταροπλασματικών τμημάτων της NAD(P)H οξειδάσης, αρχίζει από τη σύνδεση των κυτταροκινών με τους αντίστοιχους υποδοχείς και την επακόλουθη ενεργοποίηση μιας μεμβρανικής Ras G-πρωτεΐνης και της κυτταροπλασματικής p21 rac G-πρωτεΐνης. Η τελευταία, στην ενεργή μορφή της (συνδεδεμένη με GTP), μετατοπίζεται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη όντας σε σύμπλεγμα με τις πρωτΐνες p40 phox, p47 phox και p67 phox. Χάρις στη διαμεμβρανική θέση του κυτταροχρώματος b 558, η NAD(P)H οξειδάση εκκρίνει το O 2 στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων (Bonizzi et al., 2000; Babior, 1999). Εκτός από την ιστοειδική NAD(P)H οξειδάση που εκφράζεται κυρίως στα φαγοκύτταρα του αίματος, διάφορα άλλα ομόλογα ένζυμα έχουν περιγραφεί (Fukui et al., 1997). Τα ενεργά σύμπλοκα αυτών των οξειδασών περιλαμβάνουν την p22 phox υπομονάδα του κυτταροχρώματος b 558 ή άλλων κυτταροχρωμάτων της ομάδας b. Οι ROS παράγονται επίσης μέσω της οξείδωσης του αραχιδονικού οξέος, σε αντιδράσεις που καταλύονται από την κυκλοξυγενάση και τις λιποξυγενάσες. Ένα υπόστρωμα γι αυτά τα ένζυμα που συνδέονται με τη μεμβράνη, είναι το ελεύθερο αραχιδονικό οξύ, για την παραγωγή του οποίου απαιτείται ενεργοποίηση της φωσφολίπασης A 2 (PLA 2 ). Αυτή η διαδικασία βρίσκεται υπό τον έλεγχο ορισμένων πεπτιδικών ορμονών (αγγειοτενσίνη), κυτταροκινών (tumor necrosis factor-α, TNF-α) και αυξητικών παραγόντων (platelet-derived growth factor, PDGF) (Bonizzi et al., 2000; Cao et al., 2000). Η ενζυματική οξείδωση του αραχιδονικού οξέος συνοδεύεται από παραγωγή υπεροξειδίων, καθώς και εικοσανοειδών υπό μορφή ελευθέρων ριζών, τα οποία μπορούν να παράγουν ROS (Ivanov et al., 1999). 8

10 Προστασία των κυττάρων από τις ROS Η αντίδραση του O 2 με το νερό που οδηγεί στην παραγωγή ΗΡ συμβαίνει είτε αυθόρμητα (k = M -1 s -1 ) είτε διαμεσολαβούμενη από τις δισμουτάσες του υπεροξειδίου (superoxide dismutases, SODs). Τρία ισοένζυμα της δισμουτάσης είναι γνωστά και παρουσιάζουν υψηλή ενεργότητα: η κυτταροπλασματική (SOD1) και η εξωκυτταρική (SOD3), που περιέχουν Cu 2+ και Zn 2+ στις ομάδες της αίμης τους, και η μιτοχονδριακή (SOD2) που περιέχει Mn 2+ (Thannickal and Fanburg, 2000; Herdegen and Leah, 1998). Το μονοξείδιο του αζώτου (nitric oxide, NO) είναι ένα ανεξάρτητο κυτταρικό συστατικό που αντιδρά με το O 2 αποτελεσματικότερα απ ότι οι δισμουτάσες του υπεροξειδίου. Όταν η συγκέντρωση του ΝΟ στα κύτταρα είναι χαμηλή, το O 2 συνήθως υποβαθμίζεται ενεργειακά από τις δισμουτάσες πριν μπορέσει να συμμετάσχει σε άλλες χημικές αντιδράσεις (Raha and Robinson, 2000). Επομένως, η συσσώρευση του ΗΡ είναι η κύρια συνέπεια της σύνθεσης του O 2 στα κύτταρα. Το ΗΡ απομακρύνεται από διάφορα ένζυμα όπως καταλάσες, υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και υπεροξειδάση της θειοριδοξίνης. Ο αριθμός των οξειδωμένων θειο-ομάδων της γλουταθειόνης και της θειοριδοξίνης ελαττώνεται στις αντιδράσεις που καταλύονται από τις ειδικές NADPH-εξαρτώμενες αναγωγάσες. Εκτός από το ΗΡ, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης μπορεί επίσης να μειώσει τα επίπεδα των οργανικών υδροπεροξειδίων (ROOH) (Morel and Barouki, 1999; Reiter, 1995). Η προστασία των κυττάρων από την παραγωγή του OH απαιτεί την ακινητοποίηση των ιόντων σιδήρου και την απομάκρυνση των ευμετάβλητων ομάδων της αίμης. Αυτές οι διαδικασίες διαμεσολαβούνται από ενδοκυτταρικές χηλικές ενώσεις, όπως η φερρεδοξίνη, η μεταλλοθειονίνη και το πικολινικό οξύ (προϊόν διάσπασης της τρυπτοφάνης), καθώς και από την οξυγενάση της αίμης που διασπά το δακτύλιο της αίμης (Reiter, 1995; Platt and Nath, 1998). Ο σχηματισμός ελεύθερων ριζών κατά την οξείδωση των ημικινονών, αποτρέπεται από τις αναγωγάσες των κινονών. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων και άλλων κυτταρικών συστατικών που προκαλούν οι ελεύθερες ρίζες, προλαμβάνεται από το ασκορβικό 9

11 οξύ, το λιπόφιλο αντιοξειδωτικό α-τοκοφερόλη (βιταμίνη Ε), καθώς επίσης από τη μελατονίνη και τη βιλιρουβίνη (προϊόντα καταβολισμού της τρυπτοφάνης και της πρωτοπορφυρίνης αντίστοιχα). Τα μικρής μοριακής μάζας αντιοξειδωτικά, δρώντας ως δότες ηλεκτρονίων, εξουδετερώνουν τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια των ιδιαίτερα δραστικών θειολο-, αλκοξυ- και υπεροξυ-ριζών, μετατρέποντάς τις σε σχετικά σταθερότερες ελεύθερες ρίζες (Reiter, 1995). Κάτω από καθορισμένες συνθήκες, το ΝΟ μπορεί να δράσει ως αντιοξειδωτικό, δεδομένου ότι είναι διαλυτό στις λιπόφιλες κυτταρικές μεμβράνες και είναι σε θέση να επιβραδύνει τις αλυσιδωτές αντιδράσεις υπεροξείδωσης των λιπιδίων (Joshi et al., 1999). Το ΝΟ παράγει επίσης νιτροζυλο-σύμπλοκα με ιόντα σιδήρου που εμποδίζουν την παραγωγή ριζών υδροξυλίου (Stamler et al., 1992). Μια άλλη ομάδα αντιοξειδωτικών, η γλουταθειόνη και οι πρωτεϊνικοί παράγοντες θειοριδοξίνη και Ref-1 που περιέχουν στο μόριό τους ενεργές SH-ομάδες, επίσης εμπλέκονται στη μείωση των οξειδωμένων θειολομάδων (Morel and Barouki, 1999). Οι ROS ενεργοποιούν στα κύτταρα την έκφραση ειδικών γονιδίων, πολλά από τα οποία απαιτούνται για την άμυνα των κυττάρων απέναντι στην τοξική δράση του οξειδωτικού στρες. Αυτά τα γονίδια περιλαμβάνουν την ήδη αναφερθείσα υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, την αναγωγάση της κινόνης, την καταλάση, τη δισμουτάση του υπεροξειδίου, την οξυγενάση-1 της αίμης, τη φερριτίνη, την αναγωγάση της γλουταθειόνης, τη θειοριδοξίνη, την αναγωγάση της θειοριδοξίνης, τη μεταλλοθειονίνη, την κυκλοξυγενάση-2 και τη συνθάση της γ- γλουταμυλοκυστεΐνης. Η αντιοξειδωτική δράση της κυκλοξυγενάσης φαίνεται να είναι συνέπεια της μείωσης των επιπέδων του ελεύθερου αραχιδονικού οξέος που προκαλείται από τη δραστηριότητα του ενζύμου αυτού, ενώ η συνθάση της γλουταμυλοκυστεΐνης εμπλέκεται στη σύνθεση της γλουταθειόνης (Thannickal and Fanburg, 2000; Reiter, 1995). Επιπλέον, οι ROS ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων που δεν επηρεάζουν άμεσα την κυτταρική αντίσταση στο οξειδωτικό στρες, αλλά συμμετέχουν σε ενδοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Κατά συνέπεια, στα επιθηλιακά κύτταρα και στα φαγοκύτταρα του αίματος, οι ROS επάγουν ορισμένες ιντερλευκίνες και χημειοκίνες όπως η IL-8 και η MIP-1α (Remick and Villarete, 10

12 1996). Στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στους χονδρογενείς και συνδετικούς ιστούς, οι ROS ενεργοποιούν την έκφραση της στρομελυσίνης, της κολλαγενάσης 3 και άλλων μεταλλοπρωτεϊνασών (Wenk et al., 1999; Lo et al., 1998). Με όλες αυτές τις δράσεις, οι ROS επηρεάζουν την κατάσταση στο εσωτερικό του κυττάρου. Οι περιοχές των υποκινητών των γονιδίων που επάγονται από τις ROS περιλαμβάνουν αλληλουχίες δέσμευσης για τους μεταγραφικούς παράγοντες AP-1, ATF/CREB, Ets, C/EBP και NF-κΒ. Σε αντίθεση με τους προκαρυωτικούς μεταγραφικούς παράγοντες που περιέχουν Fe-S- ή θειολο-ευαίσθητες ομάδες υποδοχέων (Thannickal and Fanburg, 2000; Marshall et al., 2000), η ενεργοποιούμενη δράση των ROS στους μεταγραφικούς παράγοντες των ευκαρυωτικών κυττάρων διαμεσολαβείται από σύνθετα οξειδοαναγωγικά συστήματα. Αυτά τα συστήματα είναι ιεραρχικά οργανωμένα και αποτελούνται από ρυθμιστικές GTPάσες, φωσφολιπάσες και πρωτεϊνικές φωσφατάσες, καθώς και GMPεξαρτώμενες, φωσφολιπίδιο-εξαρτώμενες και πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (mitogen activated protein kinases, MAP κινάσες). ROS και ΜΑΡ κινάσες Οι ΜΑΡ κινάσες αποτελούν ένα κύριο ρυθμιστικό σύστημα που διαμεσολαβεί τον έλεγχο της έκφρασης των γονιδίων από τα διάφορα εξωκυτταρικά ερεθίσματα (Westermarck and Kahari, 1999; Kopnin, 2000). Η υπεροικογένεια των ΜΑΡ κινασών αποτελείται από τρεις κύριες υποομάδες, που περιλαμβάνουν τις ERK1/2, p38, και JNK (ή SAPK) πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης. Η δραστηριότητα αυτών των κινασών ελέγχεται από μια διακλαδισμένη αλυσίδα πρωτεϊνικών κινασών θρεονίνης-τυροσίνης, οι οποίες με τη σειρά τους είναι γνωστές ως κινάσες των ΜΑΡ κινασών (MAP/ERK kinase, MEK; MAPK kinase, MAPKK ή MKK). Το επίπεδο φωσφορυλίωσης και η δραστηριότητα των κινασών των ΜΑΡ κινασών, ρυθμίζεται από συγκεκριμένες πρωτεϊνικές φωσφατάσες (MAP kinase 11

13 phosphatases, MKP1; MKP2; κ.λπ.), ενώ η έκφραση των MKP1 και MKP2 ρυθμίζεται από την ενεργοποίηση των ΜΑΡ κινασών. Η ενεργότητα των πρωτεϊνικών κινασών των ΜΑΡ κινασών βρίσκεται υπό τον έλεγχο των ενζύμων του επόμενου ρυθμιστικού επιπέδου, των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης-θρεονίνης των κινασών των ΜΑΡ κινασών (ΜΕΚ kinase, MEKK; MAPK kinase kinase MAPKKK, κ.λπ.) (Westermarck and Kahari, 1999; Denhardt, 1996). Γενικά, οι ROS ενεργοποιούν τις ΜΑΡ κινάσες, όμως η ανταπόκριση των διαφορετικών μελών της οικογένειας των ΜΑΡ κινασών εξαρτάται τελικά από τον τύπο του κυττάρου (Abe et al., 2000). Η δραστηριότητα του καταρράκτη αντιδράσεων που περιλαμβάνει τις κινάσες ERK1/2 (extracellular signal regulating kinases) βρίσκεται υπό τον έλεγχο αυξητικών παραγόντων. Οι ERK1/2 φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τους μεταγραφικούς παράγοντες Elk-1 και c-ets, οι οποίοι στη συνέχεια επάγουν την κωδικοποίηση του γονιδίου για το μεταγραφικό παράγοντα c-fos (Cano and Mahadevan, 1995). Οι ERK1/2 ενεργοποιούνται από το ΗΡ σε διάφορους τύπους κυττάρων, όπως λεμφοκύτταρα, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά η ενεργοποίησή τους διαρκεί λιγότερο (περίπου λεπτά) απ ότι η ενεργοποίηση της JNK υπό τις ίδιες συνθήκες (Gomez del Arco et al., 1996). Η ενεργοποίηση των ERK1/2 από τις ROS διαμεσολαβείται από διάφορες πρωτεΐνες που συνδέονται με την κυτταρική μεμβράνη και που βρίσκονται λειτουργικά στο ανώτερο επίπεδο του καταρράκτη αντιδράσεων των ΜΑΡ κινασών. Τέτοιες πρωτεΐνες είναι οι p21 Ras και Rac1 G-πρωτεΐνες, η Fyn (μέλος της Src οικογένειας κινασών τυροσίνης), ο παράγοντας p66 Shc και η Raf κινάση σερίνης-σερίνης (Abe et al., 2000). Οι ΜΑΡ κινάσες και ειδικά οι ERK1/2, κατέχουν ένα ρόλο-κλειδί στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και των κυτταρικών ανταποκρίσεων που προκαλούν οι αυξητικοί παράγοντες (Westermarck and Kahari, 1999). Μέσω της ρύθμισης της ενεργότητας των ΜΑΡ κινασών, οι ROS επηρεάζουν τα συστήματα ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, εμπλέκονται στο μετασχηματισμό των κυττάρων που διεγείρεται από τους φορβολικούς εστέρες (Hsu et al., 2000). 12

14 Ο σχετικά καλά διευκρινισμένος μηχανισμός ενεργοποίησης των ΜΑΡ κινασών διαμεσολαβείται από την πρωτεϊνική κινάση ASK1 (apoptosis signal regulating kinase-1), μέλος της υπεροικογένειας των MAP3 κινασών, οι οποίες με τη σειρά τους ρυθμίζουν τις αντιδράσεις που σχετίζονται με τις κινάσες p38 και JNK. Τα κύρια υποστρώματα της JNK είναι οι μεταγραφικοί παράγοντες c-jun και ATF-2 (ή CREB-2 και CREBP-1 αντίστοιχα) (Cano and Mahadevan, 1995). Ένα άλλο μονοπάτι ενεργοποίησης της JNK από τις ROS βασίζεται στην αντιστρεπτή απενεργοποίησή της λόγω σχηματισμού διμερούς συμπλόκου της, παρουσία της π- ισομορφής της S-τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (Adler et al., 1999). Μεταξύ όλων των μελών της οικογένειας των ΜΑΡ κινασών, η JNK είναι η πιο ευαίσθητη στις ROS, οι οποίες προκαλούν μια μεγάλης διάρκειας ενεργοποίησή της. Εκτός από τη συμμετοχή της στη ρύθμιση των μεταγραφικών παραγόντων και της γονιδιακής έκφρασης, η JNK επηρεάζει τα ρυθμιστικά συστήματα του κυττάρου που ελέγχουν την απόπτωση. Συγκεκριμένα, η JNK σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με την πρωτεΐνη p53, το οποίο τροποποιεί τη σταθερότητα της τελευταίας (Buschmann et al., 2000), ενώ επιπλέον φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την κασπάση-3, μια πρωτεϊνάση που διαδραματίζει βασικό ρόλο στην απόπτωση (Chan et al., 2000). ROS και AP-1 Ο μεταγραφικός παράγοντας AP-1 (activator protein-1) δεσμεύεται σε συγκεκριμένες παλίνδρομες αλληλουχίες με παρόμοια δομή, τις TGACTCA και TGACGTCA, που αποτελούν τα στοιχεία απόκρισης TRE (tetradecanoyl phorbolacetate response element) και CRE (camp response element). Ο AP-1 αποτελείται από δύο υπομονάδες, μία τουλάχιστον από τις οποίες είναι μέλος των Jun (c-jun, JunB, JunD) ή Fos (c-fos, FosB, Fra1, Fra2) πρωτεϊνών, οι οποίες δεσμεύονται στο DNA (Herdegen and Leah, 1998). Η δεύτερη υπομονάδα του AP-1 μπορεί να είναι μέλος της οικογένειας των ATF (activating transcription factor) πρωτεϊνών (De 13

15 Cesare and Sassone-Corsi, 2000). Η σύνθεση των υπομονάδων καθορίζει τη συγγένεια του AP-1 με την αλληλουχία του DNA και την αλληλεπίδρασή του με τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες για το σχηματισμό ενός συμπλέγματος στον υποκινητή του γονιδίου. Έτσι, το ομοδιμερές c-jun c-jun παρουσιάζει υψηλότερη συγγένεια για την αλληλουχία TRE, ενώ το ετεροδιμερές c-jun ATF-2 για την αλληλουχία CRE. Τα διμερή JunB c-fos και c-jun c-fos δεσμεύονται και στις δύο ακολουθίες των στοιχείων απόκρισης με παρόμοια συγγένεια. Η δέσμευση των c-jun και ATF-2 με τις υπομονάδες Fra1, Fra2 και ATF-3 καταστέλλει τη λειτουργική δραστηριότητα αυτών των παραγόντων (Herdegen and Leah, 1998). Ο AP-1 μπορεί να ενεργοποιηθεί από αυξητικούς παράγοντες, κυτταροκίνες, ορμόνες, βαρέα μέταλλα, ξενοβιοτικούς οργανισμούς, υπεριώδη ακτινοβολία, μηχανική και ωσμωτική πίεση, αποπόλωση μεμβρανών, οξειδωτικό στρες και υποξία. Οι αποκρίσεις των συγκεκριμένων AP-1 εξαρτώμενων γονιδίων σε κάθε ένα από αυτά τα ερεθίσματα δεν είναι οι ίδιες, αλλά καθορίζονται εν μέρει από τη διαφορετική κάθε φορά σύνθεση των υπομονάδων του AP-1 (Karin et al., 1997). Επειδή ορισμένες περιοχές πρόσδεσης του AP-1 βρίσκονται στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου c-jun, η φωσφορυλίωση και η ακόλουθη ενεργοποίηση της πρωτεΐνης c-jun οδηγεί στην επαγωγή του ίδιου της του γονιδίου (Herdegen and Leah, 1998). Τέτοια ρύθμιση της ενεργότητας της c-jun οδηγεί σε μακράς διάρκειας ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 (Von Knethen et al., 1999). Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνικών κινασών ERK1/2 που εξαρτάται από τις ROS, οδηγεί στη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων c- Ets και Elk-1 (Cano and Mahadevan, 1995). Αυτοί οι δύο ομόλογοι παράγοντες, αναγνωρίζουν την ακολουθία CCGGAAG του DNA και εν συνεχεία ενεργοποιούν την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις υπομονάδες του ΑΡ-1, JunB και c-fos (Wasylyk et al.,1998). Ο παράγοντας JunB,αντίθετα από τον c-jun, μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των AP-1 εξαρτώμενων γονιδίων με την προϋπόθεση ότι οι περιοχές του υποκινητή του περιέχουν αρκετά αντίγραφα της ακολουθίας του στοιχείου απόκρισης CRE (Chiu et al., 1989). 14

16 Οι παράγοντες c-jun και c-fos περιέχουν στις περιοχές δέσμευσης του DNA τους κατάλοιπα κυστεΐνης (Cys252 και Cys154 αντίστοιχα), ιδιαίτερα ευαίσθητα στις ROS. Οξείδωση αυτών των SH-ομάδων, αδρανοποιεί αντιστρεπτά τον AP-1 (Morel and Barouki, 1999). Η αντίστροφη αναγωγή αυτών των ομάδων διαμεσολαβείται από τον πρωτεϊνικό παράγοντα Ref-1 (redox factor-1) που περιέχει ενεργές θειολομάδες και ο οποίος ανάγεται στη συνέχεια, απουσία ενζύμου, σε μια αντίδραση ανταλλαγής θειοδισουλφιδίου με τη θειοριδοξίνη (Arner and Holmgren, 2000). Επιπλέον, ο Ref-1 ενεργοποιεί τον παράγοντα p53 που ελέγχει τις διαδικασίες της απόπτωσης (Gaiddon et al., 1999). Η οξειδωτική αδρανοποίηση του AP-1 λαμβάνει χώρα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ROS σε σχέση με αυτές που απαιτούνται για την ενεργοποίηση των ΜΑΡ κινασών. Το έντονο οξειδωτικό στρες συνοδεύεται από μείωση της ενεργότητας του AP-1 και ελάττωση της μεταγραφής των σχετικών γονιδίων. Τα προϊόντα πολλών από αυτά τα γονίδια περιλαμβάνονται στο κυτταρικό σύστημα προστασίας έναντι του οξειδωτικού στρες. Κατά συνέπεια, η κινητικότητα των προστατευτικών κυτταρικών συστημάτων θα εξασθενίσει μετά από ένα συγκεκριμένο όριο αύξησης των ROS, ενώ θα αυξηθούν τα αποπτωτικά ερεθίσματα. NO και Οξειδωτικό στρες Υπάρχει μια ομοιότητα ανάμεσα στην ευαισθησία των κυττάρων και τη μεταγραφική τους ανταπόκριση όσον αφορά στη δράση του NO και των ROS. Τα σηματοδοτικά αυτά μόρια δρούν μέσω κοινών ενδοκυτταρικών στόχων, όπως οι πρωτεΐνες που περιέχουν ενεργές ομάδες αίμης, καθώς και θειολ- και Fe-S ομάδες (Marshall et al., 2000; Bogdan, 2001; Turpaev, 1998; Nedospasov, 1998; Men shchikova et al., 2000). Ένα παράδειγμα των παράλληλων δράσεων του ΝΟ και των ROS είναι η επαγωγή των γονιδίων της οξυγενάσης-1 της αίμης και της 2- κυκλοξυγενάσης, υπό την επίδραση οξειδωτικού στρες ή ΝΟ. Η μεταγραφική 15

17 ενεργοποίηση και των δύο αυτών γονιδίων διαμεσολαβείται από τις MAP κινάσες (Chen and Maines, 2000; Von Knethen and Brune, 2000). Παρόλα αυτά, οι μεταγραφικές ανταποκρίσεις μερικών άλλων γονιδίων έναντι του ΝΟ και των ROS είναι διαφορετικές. Έτσι, η δισμουτάση-2 του υπεροξειδίου (SOD2) επάγεται από τις ROS και όχι από το ΝΟ, ενώ το NO ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor, VEGF), του οποίου η μεταγραφή καταστέλλεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες (Kimura et al., 2000; Marquis and Demple, 1998). Η οξείδωση του ΝΟ με το μοριακό οξυγόνο οδηγεί στην παραγωγή ενεργών παραγώγων αζώτου με μικρή διάρκεια ζωής, όπως το ιόν NO +, ο νιτρικός ανυδρίτης και η ρίζα NO 2 (εικόνα Ε.2). Εικόνα Ε.2: Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων του ΝΟ με το οξυγόνο, το ιόν του υπεροξειδίου και τη γλουταθειόνη (GSH). Για τη νιτροζυλίωση της GSH απαιτείται η προηγούμενη παραγωγή της γλουταθειονυλικής ρίζας (GS ) ή των ενεργών παραγώγων του ΝΟ από την αντίδραση των ROS με το μοριακό οξυγόνο. Το NO σχηματίζει επίσης Fe-νιτροζυλο σύμπλοκα με ενώσεις που περιέχουν Fe(II). (Turpaev, 2002) Αντίθετα από το μάλλον χημικά σταθερό ΝΟ, αυτές οι ενώσεις μπορούν να νιτροζυλιώσουν τα κατάλοιπα κυστεΐνης και να νιτρώσουν τα κατάλοιπα τυροσίνης των πρωτεϊνών (Stamler et al., 1992). Η αντίδραση του ΝΟ με το οξυγόνο είναι κατά 300 φορές περίπου συχνότερη στα λιπόφιλα τμήματα της μεμβράνης απ ότι στα υδρόφιλα. Έτσι, μπορεί να υποτεθεί ότι οι πρωτεΐνες των 16

18 μεμβρανών είναι πιο ευαίσθητες στις τροποποιήσεις που εξαρτώνται από το ΝΟ απ ότι οι πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος (Liu et al., 1998). Το NO φαίνεται επίσης να ρυθμίζει την ενεργότητα της p21 Ras G-πρωτεΐνης, της κυκλοξυγενάσης-2 και των λιποξυγενασών (Teng et al., 1999; Brune et al., 1999; Holzhutter et al., 1997). Σε συνθήκες έντονης σύνθεσης ΝΟ και παρουσία ROS, η γλουταθειόνη, η πιο αντιπροσωπευτική θειολο-ένωση στο κύτταρο, νιτροζυλιώνεται με επακόλουθη συσσώρευση νιτροζυλο-γλουταθειόνης (GSNO). Η GSNO συντίθεται στα κύτταρα μέσω ενδιάμεσης παραγωγής της γλουταθειονυλικής ρίζας (GS ) και άλλων ελευθέρων ριζών, ενώ συμμετέχει και στην αντίδραση μεταφοράς της νιτροζυλομάδας σε προσβάσιμες SH-ομάδες των πρωτεϊνών (Singh et al., 1996): R-SH + GSNO R-SNO + GSH Η αντίδραση αυτή καταλύεται από την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης αλλά μπορεί να συμβεί και απουσία ενζύμου (Freedman et al., 1995). Η νιτροζυλίωση της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης στην αντίδραση με την GSNO σχετίζεται με την παρεμπόδιση της δράσης του ενζύμου (Nikitovic and Holmgren, 1996). Η επίδραση του ΝΟ στα κύτταρα εξαρτάται από την αναλογία των ενδοκυτταρικών συγκεντρώσεων του ΝΟ και των ROS. Ένα παράδειγμα αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο τύπων ενώσεων είναι η αντίδραση ανάμεσα στο ΝΟ, το οξυγόνο και το ιόν του υπεροξειδίου, με αποτέλεσμα την παραγωγή του υπεροξυνιτρώδους (ONOO ) και άλλων ενδιάμεσων ενώσεων με μικρή διάρκεια ζωής (εικόνα 2) (Singh et al., 1996; Chiueh and Rauhala, 1999; Hogg et al., 1996). Επιπλέον, η αναλογία των ενδοκυτταρικών συγκεντρώσεων του ΝΟ και των ROS καθορίζει την επίδραση αυτών των ενώσεων στις διαδικασίες ρύθμισης της απόπτωσης. Κάτω από ευνοϊκές συνθήκες για τη συσσώρευση του ONOO, το NO επάγει την απόπτωση που σχετιζεται κατ αρχήν με την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης JNK και των παραγόντων p53 και Bax, καθώς και με την απελευθέρωση του κυτταροχρώματος-c από τα μιτοχόνδρια και την επακόλουθη 17

19 ενεργοποίηση των κασπασών. Αντίθετα, σε χαμηλές συγκεντρώσεις O 2, το νιτρικό οξύ προκαλεί GMP-εξαρτώμενη επαγωγή ορισμένων καταστολέων της απόπτωσης, όπως είναι οι πρωτεΐνες HSP32, HSP70 και Bcl-2. Τέλος, υπό συνθήκες που προωθούν τη νιτροζυλίωση των πρωτεϊνών, το NO αδρανοποιεί την κασπάση-3, βασικό στοιχείο του μονοπατιού που οδηγεί στην απόπτωση (Chung et al., 2001). ROS, ΝΟ και cgmp Ενώ οι MAP κινάσες επάγονται από τα προϊόντα οξείδωσης του NO, η διαλυτή γουανυλική κυκλάση (soluble guanylate cyclase, sgc) ενεργοποιείται άμεσα από το ίδιο το NO (Severina, 1998; Denninger, and Marletta, 1999). Η sgc περιέχει μια προσθετική ομάδα αίμης με υψηλή συγγένεια για το ΝΟ (Κ s 250 nm) (Stone and Marletta, 1996). Η πρόσδεση του NO οδηγεί στην ενεργοποίηση του ενζύμου και στη σύνθεση της κυκλικής GMP (cgmp). Μία cgmp-εξαρτώμενη κινάση σερίνης-θρεονίνης (protein kinase G, PKG) φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί πολλούς ενδοκυτταρικούς στόχους, όπως ιοντικά κανάλια, μεταγραφικούς παράγοντες και συστατικά των συστημάτων των MAP κινασών. Η ενεργοποίηση της PKG από ανάλογα της cgmp που διεισδύουν στη μεμβράνη, επάγει την έντονη ενεργοποίηση της JNK και την ακόλουθη επαγωγή των μεταγραφικών παραγόντων AP-1 και ATF-2 σε νευροενδοκρινικά κύτταρα (Ho et al., 1999). Επιπλέον, η ενεργοποίηση της sgc από ανάλογα του ΝΟ και της cgmp, οδηγεί στην ενεργοποίηση των ERK1/2 και των μεταγραφικών παραγόντων c-fos και JunB σε λεία μυϊκά κύτταρα και σε εμβρυικούς ινοβλάστες (Komalavilas et al., 1999; Pilz et al., 1995). Το NO μπορεί επίσης να διεγείρει την cgmp-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της κινάσης p38, που είναι χαρακτηριστική στα κύτταρα HeLa (Chen and Maines, 2000). Η μεταγραφική ενεργοποίηση των cgmp-εξαρτώμενων γονιδίων δεν διαμεσολαβείται μόνο από τις MAP κινάσες αλλά και από μερικά άλλα σηματοδοτικά συστήματα. Έτσι, παρόμοια με την camp-εξαρτώμενη κινάση 18

20 (PKA), η PKG είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα CREB (Lu et al., 1999; Gudi et al., 2000). Εκτός από το ΝΟ, η ενεργότητα της sgc εξαρτάται και από την οξειδοαναγωγική κατάσταση των κυττάρων. Η sgc περιέχει ενεργές SH-ομάδες, που όταν τροποποιηθούν οξειδωτικά, αναστέλλεται η δράση του ενζύμου. Επίσης, η sgc λειτουργεί ως ΝΟ-εξαρτώμενος αισθητήρας Ο 2, αφού το μοριακό οξυγόνο είναι σε θέση να οξειδώσει τα νιτροζυλο-σύμπλοκα Fe(II)-NO της αίμης σε NO 2 και Fe(ΙΙΙ), τα οποία αδρανοποιούν αντιστρεπτά το ένζυμο (Dierks and Burstyn, 1998). Ο αντίστροφος μετασχηματισμός του σιδήρου της αίμης της sgc στην αρχική μορφή Fe(II), καταλύεται από μία NADPH-εξαρτώμενη οξειδοαναγωγάση, ανάλογη με τη μεθαιμοσφαιρινική αναγωγάση των ερυθροκυττάρων (Gupte et al., 1999). Οι διάφορες ROS επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη δραστηριότητα της sgc: ενώ το ανιόν του υπεροξειδίου είναι ένας ισχυρός αναστολέας της, το ΗΡ αυξάνει την ΝΟ-εξαρτώμενη ενεργοποίησή της (Friebe et al., 1998; Kim et al., 1998). 19

21 HEPARIN AFFIN REGULATORY PEPTIDE (HARP) Γενικά Η HARP είναι ένας αυξητικός παράγοντας με μοριακή μάζα 18 kda που, όπως αναφέρει και το όνομά του, παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Ανήκει στην ίδια οικογένεια αυξητικών παραγόντων με την πρωτεΐνη Midkine (MK) (Kadomatsu et al., 1988), με την οποία παρουσιάζει 55% ομολογία αμινοξικής αλληλουχίας, και την ομόλογη αυτής στα πτηνά (Raulais et al., 1991). Εκτός της αμινοξικής ομολογίας, η HARP και η Midkine έχουν τους ίδιους υποδοχείς και κοινές βιολογικές δράσεις, οι περισσότερο χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή των νευριτών και η ανάπτυξη των όγκων (Papadimitriou et al., 2004). Στη βιβλιογραφία η HARP απαντάται και με άλλες ονομασίες, όπως πλειοτροπίνη (pleiotropin, PTN) (Li et al., 1992), που είναι και η συνηθέστερη, ή heparinbinding growth associated molecule (HB-GAM) (Rauvala, 1989), γεγονός που οφείλεται στην ταυτόχρονη απομόνωση του μορίου από πολλά εργαστήρια και από διαφορετικά είδη ιστών. Η έκφραση της HARP λαμβάνει χώρα κατά την πρώιμη ανάπτυξη και λιγότερο κατά την ενήλικη ζωή. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί σε πολλά συστήματα και όργανα, όπως στο νευρικό, για το οποίο έχουν γίνει οι πρώτες και περισσότερες μελέτες, στα οστά, στο ενδοθήλιο, στην καρδιά και στους χόνδρους. Τέλος, υψηλά επίπεδα του γονιδίου της HARP εκφράζονται σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, όπως στο νευροβλάστωμα, στο γλοιοβλάστωμα και στον καρκίνο του προστάτη. Πρωτεϊνική δομή της HARP Η πρωτοταγής δομή της HARP, όπως προκύπτει από μελέτη του cdna της, αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα σε διαφορετικά είδη, όπως στον άνθρωπο, στον αρουραίο, στο βόδι και στην όρνιθα (Li et al., 20

22 1990). Η φαινομενική μοριακή μάζα της HARP, όπως υπολογίστηκε από SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση, είναι 18 kda. Το νούμερο αυτό δεν αντιστοιχεί στην αμινοξική αλληλουχία του ώριμου πολυπεπτιδίου, αφού φασματοφωτομετρικές μελέτες απέδωσαν στη HARP μοριακή μάζα 15,291 kda (Hampton et al., 1992). Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι κατά την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση αυξάνεται το φαινομενικό μοριακό βάρος του μορίου λόγω μικρότερης κινητικότητας (Raulais et al., 1991; Wellstein et al., 1992). Η HARP περιέχει μια υδρόφοβη αμινοτελική αλληλουχία 32 αμινοξέων, η οποία ονομάζεται σηματοδοτικό πεπτίδιο (signal peptide), καθώς και ένα υδρόφιλο καρβοξυτελικό άκρο (Merenmies and Rauvala, 1990). Η αποκοπή του σηματοδοτικού πεπτιδίου φαίνεται να εξαρτάται από το είδος του κυττάρου και οδηγεί στην παραγωγή δύο διαφορετικών μοριακών τύπων, οι οποίοι διαφέρουν στο αμινοτελικό άκρο του μορίου κατά τρία αμινοξέα, με αποτέλεσμα να προκύπτουν πρωτεΐνες 136 και 139 αμινοξέων (Bernard-Pierrot et al., 2001). Η αμινοτελική αλληλουχία της ανθρώπινης ανασυνδυασμένης HARP με μιτογόνο δράση, η οποία απομονώνεται από έκφραση του γονιδίου σε σύστημα ευκαρυωτικών κυττάρων, περιέχει τρία επιπλέον αμινοξέα στο καρβοξυτελικό της άκρο (Laaroubi et al., 1994). Αξιοσημείωτο είναι ότι ανάλογη μορφή του μορίου μπορεί να εμφανισθεί και στο άλλο μέλος της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων στην οποία ανήκει η HARP, τη Midkine. Η ώριμη πρωτεΐνη HARP αποτελείται κατά 24% από βασικά αμινοξέα. Οι 28 λυσίνες που περιέχονται στο μόριο οργανώνονται σε δυο αλληλουχίες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο, τα οποία φαίνεται να παρουσιάζουν τυχαία διαμόρφωση. Το μόριο περιμβάνει ακόμα 10 κυστεΐνες που σχηματίζουν 5 δισουλφιδικούς δεσμούς ανάμεσα στις αλυσίδες, οι οποίοι και καθορίζουν την τριτοταγή δομή του μορίου (εικόνα Ε.3). Η τριτοταγής δομή της HARP οργανώνεται σε δυο περιοχές, κάθε μια από τις οποίες περιλαμβάνει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές στο κεντρικό της τμήμα. Οι κεντρικές περιοχές αποτελούν τα σημεία πρόσδεσης του μορίου με την ηπαρίνη και θεωρούνται ότι 21

23 παρουσιάζουν ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι (thrombospondin type I repeat, TSR), που εντοπίζεται στο εξωκυττάριο υλικό και σε πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας (Kilpelainen et al., 2000). Ωστόσο, πιο πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι αυτές οι περιοχές της HARP παρουσιάζουν πολύ μικρή αμινοξική ομολογία με το μοτίβο της TSR δομής (Roszmusz et al., 2002). Εικόνα Ε.3: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης της HARP. Οι β-πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης και οι πέντε δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης (Papadimitriou et al., 2004). Η πρωτοταγής δομή της HARP περιλαμβάνει επίσης τρεις περιοχές που φέρουν το μοτίβο K-R/K-X-R/K, οι οποίες περιέχουν θετικά φορτισμένα αμινοξέα, εντοπίζονται κυρίως σε εσωτερικές θέσεις της πεπτιδικής αλυσίδας και θεωρούνται υπεύθυνες για τη είσοδο πρωτεϊνών στον πυρήνα (Chelsky et al., 1989). Παρά την ύπαρξη των παραπάνω αλληλουχιών, μέχρι στιγμής δεν έχει ανιχνευθεί η HARP στον πυρήνα των κυττάρων, αλλά έχει προταθεί ότι ενδεχομένως να δεσμεύεται στη νουκλεολίνη (Take et al., 1994). Επίσης, δεν περιέχει αμινοτελικά 22

24 συνδεδεμένες θέσεις γλυκοζυλίωσης (Merenmies et al., 1990), ενώ υπάρχει μια αλληλουχία στο καρβοξυτελικό άκρο που είναι ομόλογη με ενεργές θέσεις αναστολέων πρωτεασών τύπου Kazal, αν και η HARP δεν παρουσιάζει ενεργότητα έναντι στην τρυψίνη (Kuo et al., 1990). Δομή του γονιδίου της HARP Το γονίδιο της HARP στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος (Li et al., 1992), καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al., 1992; Kretshmer et al., 1993). Το ανθρώπινο m-rna της HARP οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια (Kretshmer et al., 1993). Το σηματοδοτικό πεπτίδιο, καθώς και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretshmer et al., 1993). Η 5 μη μεταφρασμένη περιοχή (5 -UTR) καλύπτει ολόκληρο το εξόνιο 1 (U1), ενώ στο ανθρώπινο γονίδιο και στο γονίδιο του ποντικού έχει αναφερθεί μια επιπρόσθετη 5 -UTR περιοχή (U2) (Lai et al., 1995; Sato et al., 1997). Όσο για τα γονίδια της HARP στα τρωκτικά, αυτά παρουσιάζουν παρόμοια οργάνωση και έχουν βρεθεί στο χρωμόσωμα 4 στο ποντίκι και στο χρωμόσωμα 6 στον αρουραίο (Hornum et al., 1996). Το γονίδιο της HARP στο ποντίκι περιορίζεται σε πέντε εξόνια και τέσσερα ιντρόνια και δεν καταλαμβάνει περισσότερα από 32 kb (Katoh et al., 1992). Επίσης, στην 5 περιοχή του εντοπίζονται δυο επαγωγείς (Ι και ΙΙ), οι οποίοι περιέχουν τις περιοχές CCAAT και TATA, καθώς και αλληλουχίες ρυθμιστικών στοιχείων. Στον επαγωγέα Ι βρίσκεται το στοιχείο απόκρισης στην cαmp (camp-response element), η περιοχή δέσμευσης του SP-1 και το στοιχείο απόκρισης στη θυρεοειδική ορμόνη, ενώ στον επαγωγέα ΙΙ απαντάται το στοιχείο απόκρισης στα γλυκοκορτικοειδή (Sato et al., 1997). 23

25 Οι 3 - και 5 - μη μεταφρασμένες περιοχές του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο παρουσιάζουν υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της HSP70 (heat shock protein) και της L17 πρωτεΐνης του ριβοσώματος (Lai et al., 1992). Ανάλυση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο αποκάλυψε την απουσία της TATA περιοχής και την παρουσία της CCAAT περιοχής, η οποία εντοπίστηκε 91 νουκλεοτίδια ανοδικά (upstream) από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (εικόνα Ε.4). Εικόνα Ε.4: Οργάνωση του ανθρώπινου γονιδίου της HARP. Η εικόνα δείχνει τις δύο 5 μη-μεταφρασμένες περιοχές U1 και U2, την πιθανή αλληλουχία πρόσδεσης για το μεταγραφικό παράγοντα ΑΡ-1, τους GT1 και MyoD, καθώς και μία CCAAT περιοχή. Τα νουκλεοτίδια είναι αριθμημένα σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής, το οποίο επισημαίνεται με τον αριθμό +1 (Papadimitriou et al., 2004). Αρχικά, από την ανάλυση του γονιδίου της HARP δεν προέκυψαν θέσεις δέσμευσης γενικών μεταγραφικών παραγόντων. Παρόλα αυτά, στην 5 -περιοχή αναγνωρίστηκαν δύο πιθανές αλληλουχίες δέσμευσης για το μεταγραφικό παράγοντα ΑΡ-1, τέσσερεις για το MyoD και μία αλληλουχία SRE (serum response element) (Li et al., 1992). Από την άλλη, στην 3 - μη μεταφρασμένη περιοχή εντοπίστηκαν 3 επαναλήψεις του μοτίβου ΑΤΤΤΑ. Η αλληλουχία αυτή, η οποία εμπλέκεται στη σταθερότητα του mrna, εντοπίζεται στην 3 -περιοχή αρκετών ογκογονιδίων (Lai et al., 1992). Επιπλέον, στο γονίδιο της HARP στον άνθρωπο έχει ανιχνευθεί και ένα ενδογενές στοιχείο με δομή ρετροϊού (HERV- E.HARP), το οποίο δημιουργεί έναν φυλογενετικά καινούργιο επαγωγέα που οδηγεί στην έκφραση λειτουργικών μεταγράφων HERV-HARP σε κακοήθεις τροφοβλάστες (π.χ. στο χοριοκαρκίνωμα) (Schulte et al., 1996). 24

26 Έκφραση και ρύθμιση του γονιδίου της HARP Η HARP απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1989 από εγκέφαλο αρουραίου (Rauvala et al., 1989) και μήτρα βοός (Milner et al., 1989). Η έκφραση του γονιδίου υπάγεται σε χρονικούς περιορισμούς και λαμβάνει χώρα κατά το τέλος της εμβρυογένεσης, μέχρι και την πρώιμη μετεμβρυϊκή περίοδο (Rauvala et al., 1989; 1994; Li et al., 1990). Η παρουσία του mrna της HARP σε αρκετούς ενήλικους ιστούς δείχνει ότι η HARP συμμετέχει και σε φυσιολογικές διαδικασίες της ενήλικης ζωής (Vanderwinden et al., 1992). Στο νευρικό σύστημα, όπου έχουν γίνει και οι περισσότερες μελέτες, η HARP εκφράζεται κυρίως στον πρώιμο μετεμβρυϊκό εγκέφαλο αρουραίων και βοών και ανιχνεύεται στα κοκκία πρώιμων νευρώνων (Rauvala, 1989; Kuo et al., 1990). Εντοπίζεται σε νευροεξωδερμικές και μεσεγχυματικές κυτταρικές σειρές αρουραίου (Vanderwinden et al., 1992), όπως και σε νευράξονες και στις περισσότερες περιοχές στον αναπτυσσόμενο πρόσθιο εγκέφαλο εμβρύου αρουραίου (Kinnunen et al., 1999). Η HARP ανιχνεύεται σε λίγους νευρώνες στον ιππόκαμπο και στις επιφανειακές στοιβάδες του φλοιού ενήλικων τρωκτικών (Mentlein and Held-Feindt, 2002), καθώς και σε νωτιαίους κινητικούς νευρώνες νεογέννητων ποντικών (Mi et al., 2007). Στα ποντίκια, η έκφραση της HARP περιορίζεται στα ραχιαία τμήματα της σπονδυλικής στήλης (Fan et al., 2000). Σε κυτταρικό επίπεδο, η έκφραση του γονιδίου της HARP επάγεται στα μακροφάγα, στα αστροκύτταρα και στα επιθηλιακά κύτταρα, ρυθμίζοντας έτσι τη διαδικασία παλινόρθησης του εγκεφάλου που ακολουθεί οξύ ισχαιμικό επεισόδιο στους αρουραίους (Yeh et al., 1998). Η έκφραση της HARP έχει ακόμα αναφερθεί σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος του Parkinson (Marchionini et al., 2007), η νόσος Alzheimer και το σύνδρομο Down, ενώ η παρουσία της HARP σε αμυλοϊδικές β-περιοχές μπορεί να αποτελεί δείκτη νευρωνικού τραυματισμού (Wisniewski et al., 1996). Εκτός του νευρικού, η HARP εκφράζεται και στο μυικό σύστημα. Συγκεκριμένα, εντοπίζεται στην επιφάνεια μυϊκών κυττάρων, καθώς και σε μονοπάτια νευριτών 25

27 που αναπτύσσονται σε μεσεγχυματικό ιστό στα άκρα, κάτι που σχετίζεται με μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίηση του μυϊκού ιστού (Szabat and Rauvala, 1996). Η πρωτεΐνη ανευρίσκεται επίσης σε καλλιέργειες μυϊκών κυττάρων και είναι σημαντική για το σχηματισμό συμπλόκων του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στον αναπτυσσόμενο μυ στο Xenopus (Peng et al., 1995). Η HARP εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στα κυτταρικά στρώματα που δρουν ως υπόστρωμα για το σχηματισμό οστών. Συγκεκριμένα, το mrna και η πρωτεΐνη της HARP εκφράζονται έντονα στο αναπτυσσόμενο οστό στον αρουραίο και ειδικά στις ανατομικές περιοχές που επιστρατεύονται οι πρόδρομοι των οστεοβλαστών κατά τη διαδικασία της επιδιόρθωσης του οστού (Imai et al., 1998). Επιπλέον, το mrna και η πρωτεΐνη της HARP εκφράζονται έντονα στο χόνδρο και στα χονδροκύτταρα εμβρύου και νεογνού βοός, ενώ η έκφρασή τους περιορίζεται στα ενήλικα άτομα (Azizan et al., 2000). Η πρωτεΐνη της HARP συσχετίζεται και με άλλα συστήματα και όργανα, όπως το πεπτικό και το αναπνευστικό, τα αισθητήρια, οι τρίχες του σώματος, οι διεργασίες του προσώπου και οι καταβολές των άκρων (Mitsiadis et al., 1995). Εκφράζεται επίσης στο καρδιαγγειακό και στο σκελετικό σύστημα, στην επίφυση των βοειδών και στο ρινικό χόνδρο των νεογέννητων μοσχαριών (Neame et al., 1993). Η έκφρασή της μπορεί να ρυθμιστεί από ένα ψυχοενεργό συστατικό της κάνναβης (Mailleux et al., 1992) και από τη βιταμίνη D3 σε κύτταρα οστεοβλαστών (Tamura and Noda, 1994). Τέλος, η HARP φαίνεται να συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις στρώματος επιθηλίου (Vanderwinden et al., 1992). Η έκφραση του mrna και της πρωτεΐνης είναι ορμονοεξαρτώμενα στη μήτρα αρουραίου, με τη μεγαλύτερη έκφραση του mrna να ανιχνεύεται κατά την έναρξη του κύκλου και το δίοιστρο, ενώ επάγεται από την προγεστερόνη, η οποία είναι η πιο σημαντική στεροειδής ορμόνη κατά την εγκυμοσύνη. Το mrna και η πρωτεΐνη της HARP έχουν εντοπιστεί στο ενδομητριακό ενδοθήλιο, στο αδενικό επιθήλιο (Milhiet et al., 1998) και στον ιστό 26

28 του πλακούντα που περιβάλλει τα μητρικά αγγεία κατά την ανάπτυξη στα ποντίκια (Fan et al., 2000). Μετά την ενηλικίωση, το mrna της HARP εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα του προστάτη και του μαστού (Milhiet et al., 1998) και σε πολύ υψηλά επίπεδα στους όρχεις (Zhang et al., 1999). Το mrna της HARP εκφράζεται σε μεσεγχυματικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης του ήπατος και παρουσιάζεται αισθητά αυξημένο σε ηπατικά κύτταρα και σε τραυματισμένο ήπαρ ενήλικου αρουραίου (Asahina et al., 2002). Αξιοσημείωτο είναι επίσης το γεγονός ότι έχουν χαρακτηριστεί δύο μέλη της οικογένειας των HARP/Midkine στη δροσόφιλα (Drosophila melanogaster), τα οποία κωδικοποιούν ορισμένες εκκρινόμενες πρωτεΐνες (Englund et al., 2006). Λίγα δεδομένα υπάρχουν για τον τρόπο που ρυθμίζεται η έκφραση του γονιδίου της HARP. H camp (Mourlevat et al., 2005), ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (platelet derived growth factor, PDGF) και η υποξία (Antoine et al., 2005) φαίνεται να επάγουν την αύξηση των επιπέδων της HARP. Επιπλέον, ο μεταγραφικός παράγοντας HOXA5 πιθανόν διεγείρει άμεσα τη μεταγραφή του γονιδίου της (Chen et al., 2005). Περισσότερο, έχει μελετηθεί ο αυξητικός παράγοντας των ινωβλαστών (fibroblast growth factor, FGF) (Hatziapostolou et al., 2006) και το ΗΡ (hydrogen peroxide, HP) (Polytarchou et al., 2005), που επάγουν τη μεταγραφή της HARP μέσω επαγωγής του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1, ο οποίος με τη σειρά του προσδένεται στις δύο αλληλουχίες δέσμευσης στον υποκινητή του γονιδίου της HARP. Υποδοχείς της HARP και μεταγωγή σήματος Η HARP απομονώθηκε για πρώτη φορά ως μια πρωτεΐνη που επάγει την προέκταση των νευριτών στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο και από τότε έχει αποδειχθεί και καθιερωθεί η συγγένειά της με την ηπαρίνη (Courty et al., 1991; 27

29 Hampton et al., 1992; Kilpelainen et al., 2000). Αυτή η ιδιότητα της HARP χρησιμοποιείται εκτεταμένα στις διαδικασίες απομόνωσης (Papadimitriou et al., 2000; 2001; Polykratis et al., 2004) και ποσοτικοποίησης του μορίου στο θρεπτικό μέσο κυτταροκαλλιεργειών ή σε βιολογικά υγρά (Soulie et al., 2002; Bernard- Pierrot et al., 2004), χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας. Με παρόμοιες τεχνικές προέκυψε ότι η HARP αλληλεπιδρά με την ηπαρίνη μέσω μιας περιοχής δέκα μονοσακχαριτών που βρίσκεται στο μόριο της τελευταίας (Kinnunen et al., 1996). Από την άλλη, οι περιοχές της HARP που απαιτούνται για την πρόσδεση στην ηπαρίνη ή στις άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι υπό μελέτη. Αρχικά αναφέρθηκε ότι οι ομάδες των βασικών αμινοξέων που εντοπίζονται στα δυο άκρα του μορίου αποτελούν τις θέσεις στις οποίες δεσμεύεται η ηπαρίνη (Kuo et al., 1990). Ωστόσο, αργότερα προέκυψε η άποψη ότι η πρόσδεση με την ηπαρίνη θα μπορούσε να συμβεί μέσω των δύο κεντρικών περιοχών του μορίου (Hampton et al., 1992). Μελέτες με φασματοσκοπία NMR που ακολούθησαν, έδειξαν ότι η HARP αλληλεπιδρώντας με την ηπαρίνη υφίσταται αλλαγές στη διαμόρφωσή της, και ότι οι β-πτυχές, όπως και οι 5 δισουλφιδικοί δεσμοί παίζουν βασικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία (Kilpelainen et al., 2000). Η HARP μπορεί να δεσμεύεται ισχυρά και με αλυσίδες θειικής ηπαράνης διαφόρων πρωτεογλυκανών (heparan sulfate proteoglycans, HSPGs), και γι αυτό μπορεί να εντοπισθεί στην εξωκυττάρια ύλη και στην επιφάνεια διαφορετικών τύπων κυττάρων (Vacherot et al., 1999; Papadimitriou et al., 2001). Σε μικρότερο βαθμό παρουσιάζει συγγένεια και με άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες, όπως η θειική δερματάνη (dermatan sulfate, DS) και η θειική χονδροϊτίνη Α (chondroitin sulfate A, CS-A), αλλά όχι η θειική χονδροϊτίνη C (chondroitin sulfate C, CS-C) ή η θειική κερατάνη (keratan sulfate, KS) (Vacherot et al., 1999). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες επάγουν το διμερισμό της HARP και ενισχύουν τη μιτογόνο δράση της (Bernard-Pierrot et al., 1999). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το ότι ανάλογες συγκεντρώσεις γλυκοζαμινογλυκανών έχουν ανασταλτική δράση στην επαγόμενη από τη HARP προέκταση των νευριτών και μετανάστευση των νευρώνων (Kinnunen et al., 1996; 1999; Maeda et al., 1998). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν 28

30 ότι η μιτογόνος δράση και η προέκταση των νευριτών που επάγονται από τη HARP θα μπορούσαν να συμβούν μέσα από διαφορετικούς μηχανισμούς και ότι ο διμερισμός θα ήταν πιο σημαντικός για τη μιτογόνο δράση παρά για τη δράση της προέκτασης των νευριτών. Τέλος, οι γλυκοζαμινογλυκάνες προστατεύουν μερικά τη HARP από αποικοδόμηση από την πλασμίνη (Polykratis et al., 2004), αλλά όχι από την τρυψίνη ή τη χυμοτρυψίνη (Delbe et al., 1995), γεγονός που δείχνει ότι αυτά τα μόρια μπορεί να είναι υπεύθυνα για τη μορφή με την οποία η HARP τελικά παρουσιάζεται σε πιο εξειδικευμένους υποδοχείς. Επιπλέον, η HARP αλληλεπιδρά και με δύο άλλες πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης της κυτταρικής επιφάνειας, τις συνδεκάνες 1 και 3 (syndecan-1, syndcan-3). Η συνδεκάνη-3 ή N-συνδεκάνη (εικόνα Ε.5) έχει μοριακή μάζα περίπου 200 kda και εμπλέκεται στην επαγωγή των νευριτών από τη HARP, όπως αποδείχθηκε με τη χρήση αντισωμάτων για την N-συνδεκάνη (Raulo et al., 1994) ή με την επώαση των νευρώνων με ηπαριτινάση (Rauvala et al., 1994). Με τη χρήση κυττάρων του νευροβλαστώματος N18, τα οποία υπερέκφραζαν το cdna συνδεκάνης αρουραίου, αποδείχθηκε ότι ο μετασχηματισμός των κυττάρων για την Ν-συνδεκάνη επάγει την εξαρτώμενη από τη HARP επαγωγή των νευριτών και ότι η μετασχηματισμένη Ν-συνδεκάνη κατανέμεται στους κώνους ανάπτυξης και στα φιλοπόδια των νευριτών (Kinnunen et al., 1998). Η HARP δεσμεύεται επίσης στην πρωτεογλυκάνη 6Β4, ή αλλιώς φωσφακάνη (phosphacan), η οποία αντιπροσωπεύει την κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης στον εγκέφαλο και αποτελεί μια εξωκυτταρικά τροποποιημένη μορφή του διαμεμβρανικού υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor-like protein tyrosine phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) (Maeda et al., 1996). Ανάλυση κατά Scatchard του συμπλόκου 6Β4-HARP αποκάλυψε δυο περιοχές δέσμευσης, η μια χαμηλής και η άλλη υψηλής συγγένειας. Η ηπαρίνη αναστέλλει δραστικά τη δέσμευση της HARP στην 6Β4. Η θειική ηπαράνη και η θειική χονδροϊτίνη-c την αναστέλλουν πιο ήπια, ενώ η θειική χονδροϊτίνη-α και η θειική κερατάνη δεν έχουν δράση. Όταν το θρεπτικό μέσο των κυτταροκαλλιεργειών επωάσθηκε με 29