ΠΑΣΧΑΛΙΑ Χ. ΜΠΑΛΚΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΣΧΑΛΙΑ Χ. ΜΠΑΛΚΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ ΙΚΥ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΕ ΣΤΗΛΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΤΥΠΩΝ ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ, ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΚΑΙ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΣΧΑΛΙΑ Χ. ΜΠΑΛΚΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ ΙΚΥ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΕ ΣΤΗΛΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΤΥΠΩΝ ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ, ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΚΑΙ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσικής Χημείας, του Τομέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με υποτροφία του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ) Ημερομηνία προφορικής εξέτασης : 17 Μαρτίου 2009 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Παναγιώτης Νικήτας Επιβλέπων Καθηγητής Αναπλ. Καθηγήτρια Αδριανή Παππά Λουίζη (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Επικ. Καθηγητής Σωτήρης Σωτηρόπουλος (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής Αναστάσιος Βουλγαρόπουλος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Καθηγητής Γεώργιος Κοκκινίδης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγητής Ιωάννης Παπαδογιάννης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Επικ. Καθηγητής Γεώργιος Θεοδωρίδης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης)

3 Η επταμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της Διδακτορικής Διατριβής της Μπαλκατζοπούλου Πασχαλίας, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την Τρίτη 17 Μαρτίου 2009, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής με τίτλο : «Μέθοδοι βαθμωτής έκλουσης σε στήλες υγρής χρωματογραφίας διαφόρων τύπων για το διαχωρισμό παραγώγων αμινοξέων με ηλεκτροχημική, φθορισμομετρική και φασματοφωτομετρική ανίχνευση». Η επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της Επιστήμης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Καθηγητής Παναγιώτης Νικήτας Επιβλέπων Καθηγητής Αναπλ. Καθηγήτρια Αδριανή Παππά Λουίζη (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Επικ. Καθηγητής Σωτήρης Σωτηρόπουλος (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής Αναστάσιος Βουλγαρόπουλος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγητής Γεώργιος Κοκκινίδης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγητής Ιωάννης Παπαδογιάννης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Επικ. Καθηγητής Γεώργιος Θεοδωρίδης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης)

4 @ Πασχαλία Χ. Α.Π.Θ «Μέθοδοι βαθμωτής έκλουσης σε στήλες υγρής χρωματογραφίας διαφόρων τύπων για το διαχωρισμό παραγώγων αμινοξέων με ηλεκτροχημική, φθορισμομετρική και φασματοφωτομετρική ανίχνευση» ISBN «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Ν.5343/1932, άρθρο 202, παρ.2)

5 Στους γονείς μου

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 7 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11 Ι.1. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) 13 I.1.1. ΣΤΗΛΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ 16 Ι.1.2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ 24 Ηλεκτροχημικός ανιχνευτής 26 Υλικό του ηλεκτροδίου εργασίας 29 Περιορισμοί της κινητής φάσης 31 Ι.1.3. ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗ ΒΑΘΜΩΤΗ ΕΚΛΟΥΣΗ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΩΝ 33 Ι.2. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ HPLC 37 Ι.2.1. ΑΜΙΝΟΞΕΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΚΑΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕ ΟΡΑ 48 Διαδικασία παραγωγοποίησης των αμινοξέων με ΟΡΑ (ορθοφθαλαλδεϋδη) 51 Παρασκευή αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 51 Παρασκευή των παραγώγων των αμινοξέων 51 Ι.3. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 52 ΙΙ. ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ 57 ΙΙ.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 57 ΙΙ.2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 58 - Ανίχνευση των παραγώγων των αμινοξέων 59 - Χρωματογραφικό σύστημα 59 1

7 ΙΙ.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 60 ΙΙ.3.1. ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ ΣΕ ΤΙΜΗ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ 2, Ηλεκτροχημική μελέτη του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης 66 - Ηλεκτροχημική μελέτη ελεύθερων αμινοξέων 68 ΙΙ.3.2. ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ ΣΕ ΤΙΜΗ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ 5 74 ΙΙ.4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 80 ΙΙ.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 81 ΙΙΙ. ΒΑΘΜΩΤΗ ΕΚΛΟΥΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ph, ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ ΚΑΙ ΤΑΧΥΤΗΤΕΣ ΡΟΗΣ ΣΕ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ ΣΤΗΛΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 83 III.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 83 ΙΙΙ.2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 86 - Πειραματικός υπολογισμός του νεκρού χρόνου t o 88 - Πειραματικός υπολογισμός του χρόνου t D (dwell time) 88 III.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 90 ΙΙΙ.3.1. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph ΚΑΙ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΣΤΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ ΥΠΟ ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ 90 ΙΙΙ.3.2. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΙΜΗ ph ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ 2,5 ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΤΗΣ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΙ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ 97 ΙΙΙ.3.3. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΙΜΗ ph ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ 5 ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 109 2

8 ΙΙΙ.3.4. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΙΜΗ ph ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ 7 ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 116 ΙΙΙ.4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 121 ΙΙΙ.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 123 IV.A. ΒΑΘΜΩΤΗ ΕΚΛΟΥΣΗ ΜΕ ΒΗΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΣΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ ΣΕ ΣΤΗΛΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 125 IV.A.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 125 IV.A.2. ΘΕΩΡΙΑ 128 IV.A.2.1. ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΞΙΣΩΣΕΙΣ 128 IV.A.2.2. ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΛΟΥΣΗ ΤΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Έκλουση κατά τη διάρκεια του πρώτου βήματος Έκλουση κατά τη διάρκεια ενός ενδιάμεσου p βήματος Έκλουση κατά τη διάρκεια του τελευταίου βήματος q 134 ΙV.A.2.3. ΟΡΙΑΚΕΣ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ Σταθερό F και μεταβλητό φ Σταθερό φ και μεταβλητό F 135 IV.A.3. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΘΕΩΡΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΗ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ 136 IV.A.3.1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Διαδικασία παραγωγοποίησης των αμινοξέων με ΟΡΑ (ορθοφθαλαλδεϋδη) Ανίχνευση των παραγώγων των αμινοξέων Πειραματικός υπολογισμός του νεκρού χρόνου t o Πειραματικός υπολογισμός του χρόνου t D (dwell time) Χρωματογραφικό σύστημα και συνθήκες έκλουσης 137 3

9 - Βαθμωτή έκλουση με βηματική μεταβολή του ACN στην κινητή φάση και ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής Βαθμωτή έκλουση με βηματική μεταβολή της MeOH στην κινητή φάση και ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής 143 IV.A.3.2. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ 144 IV.A.3.3. ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΤΩΝ ΧΡΟΝΩΝ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΒΗΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΗ ΜΕ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ 148 IV.A.4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Βαθμωτή μεταβολή του ACN στην κινητή φάση με ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής Βαθμωτή μεταβολή της MeOH στην κινητή φάση με ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής 160 IV.A.5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 167 IV.A.6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 168 IV.B. ΒΑΘΜΩΤΗ ΕΚΛΟΥΣΗ ΜΕ ΓΡΑΜΜΙΚΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΣΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ ΣΕ ΣΤΗΛΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 171 IV.B.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 171 IV.B.2. ΘΕΩΡΙΑ 172 IV.B.2.1. ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΞΙΣΩΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗ ΤΗΣ ΟΥΣΙΑΣ 172 IV.B.2.2. ΘΕΜΕΛΙΩΔΗΣ ΕΞΙΣΩΣΗ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ 175 IV.B.2.3. ΜΙΑ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΤΙΚΗ 177 IV.B.3. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΘΕΩΡΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΗ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ 178 IV.B.3.1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 178 4

10 IV.B.3.2. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ 180 ΙV.B.3.3. ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΤΩΝ ΧΡΟΝΩΝ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΓΡΑΜΜΙΚΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΣΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ 180 IV.B.4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Γραμμική μεταβολή της συγκέντρωσης του ACN στην κινητή φάση και ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής Γραμμική μεταβολή της συγκέντρωσης της MeOH στην κινητή φάση και ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής 188 IV.B.4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 194 IV.B.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 195 V. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ ΣΕ ΜΟΝΟΛΙΘΙΚΗ ΣΤΗΛΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΣΤΗΝ ΚΙΝΗΤΗ ΦΑΣΗ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ 197 V.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 197 V.2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 198 V.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 199 V.4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 207 V.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 208 VI. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ, ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ (ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ) 5

11 ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΟΡΑ ΣΕ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ ΣΤΗΛΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ 209 VI.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 209 VI.2. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 211 VI.3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ 215 VI.4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 221 VI.5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 230 VI.6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 232 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 234 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΣΥΝΕΔΡΙΑ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ ΑΠΟ ΤΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 235 6

12 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκε η θεωρία διαφόρων μεθόδων βαθμωτής έκλουσης στην υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης και εφαρμόστηκε η θεωρία αυτή στο διαχωρισμό ενός μίγματος 18 παραγώγων αμινοξέων με ο-φθαλαλδεϋδη (ΟΡΑ). Η επιλογή των αμινοξέων για την εφαρμογή των διαφόρων μεθόδων βαθμωτής έκλουσης που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή έγινε γιατί η ανάλυση των αμινοξέων έχει μεγάλο βιολογικό ενδιαφέρον και οποιαδήποτε τεχνική μπορεί να συνεισφέρει στη βελτίωση του διαχωρισμού και της ανίχνευσής τους είναι πάντοτε ευπρόσδεκτη από την επιστημονική κοινότητα. Επιπλέον η ο-φθαλαλδεϋδη είναι το πλέον διαδεδομένο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης που χρησιμοποιείται για την ανάλυση των αμινοξέων με HPLC, δεδομένου ότι η ανάλυση των αμινοξέων χωρίς παραγωγοποίηση είναι ιδιαίτερα προβληματική τόσο στην ανίχνευση όσο και στο διαχωρισμό τους. Αντίθετα τα παράγωγα των αμινοξέων με ΟΡΑ απορροφούν στο UV, φθορίζουν και είναι ηλεκτροχημικά ενεργά λόγω του S-υποκατεστημένου ισοϊνδολικού δακτυλίου που περιέχουν. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν και οι τρεις αυτοί τρόποι ανίχνευσης λόγω της δυνατότητας χρήσης πολλών ανιχνευτών σε σειρά που μας δίνει το λογισμικό καταγραφής δεδομένων HPLC που αναπτύχθηκε στο Εργαστήριο Φυσικοχημείας. Πριν προχωρήσουμε, όμως, στη βελτιστοποίηση του διαχωρισμού των παραγώγων των αμινοξέων με ΟΡΑ με διάφορες μεθόδους βαθμωτής έκλουσης έγινε μια διεξοδική μελέτη της ηλεκτροχημικής συμπεριφοράς τους (κεφάλαιο ΙΙ του διδακτορικού), καθώς και μια μελέτη του ρόλου του ph της κινητής φάσης, της ποσότητας του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, της ταχύτητας ροής, καθώς και της θερμοκρασίας της στήλης τόσο στο χρωματογραφικό διαχωρισμό όσο και στη φθορισμομετρικήηλεκτροχημική ανίχνευση των παραγώγων των αμινοξέων με ΟΡΑ που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή (κεφάλαιο ΙΙΙ). Στη συνέχεια βελτιστοποιήσαμε το διαχωρισμό των παραγώγων των αμινοξέων αυτών σε τρεις διαφορετικές τιμές ph (2,5, 5 και 7). Η βελτιστοποίηση έγινε με τη βαθμιαία μεταβολή της ποσότητας του οργανικού διαλύτη (ακετονιτριλίου) 7

13 σε κάθε κινητή φάση διαφορετικού ph. Η εύρεση του βέλτιστου προφίλ της μεταβολής της ποσότητας του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση προσδιορίστηκε με τη βοήθεια αλγόριθμου βελτιστοποίησης που είχε ήδη αναπτυχθεί στο Εργαστήριο της Φυσικοχημείας και ο οποίος στηρίζεται σε χρωματογραφικά δεδομένα τεσσάρων απλών γραμμικών βαθμωτών εκλούσεων σε κάθε τιμή ph κινητής φάσης (κεφάλαιο ΙΙΙ). Στη συνέχεια, στα πλαίσια της διδακτορικής αυτής διατριβής αναπτύχθηκε για πρώτη φορά η θεωρία μιας βαθμωτής έκλουσης διπλού τύπου που περιλαμβάνει ταυτόχρονη μεταβολή τόσο στη συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση όσο και στην ταχύτητα ροής (κεφάλαια IV.A και IV.B). Η μέχρι σήμερα έλλειψη στη διεθνή βιβλιογραφία μιας θεωρίας για την ακριβή πρόβλεψη του χρόνου συγκράτησης κάτω από συνθήκες μιας τέτοιας διπλής βαθμωτής έκλουσης σχετίζεται κυρίως με τις διαφορετικές ιδιότητες που παρουσιάζουν οι δύο αυτοί τρόποι βαθμωτής έκλουσης. Δηλαδή, μία συγκεκριμένη μεταβολή στη συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη που σχηματίζεται στο μίκτη του χρωματογραφικού συστήματος συναντά την αναλυόμενη ουσία μέσα στη στήλη μετά από μερικά λεπτά, ενώ οποιαδήποτε αλλαγή στην ταχύτητα ροής της στήλης επηρεάζει την αναλυόμενη ουσία σχεδόν ακαριαία. Επιπρόσθετα, αλλαγές στην ταχύτητα ροής προκαλούν παραμόρφωση του προφίλ της μεταβολής της συγκέντρωσης του οργανικού διαλύτη που σχηματίζεται στο μίκτη όταν αυτό το προφίλ φτάνει στην αρχή της χρωματογραφικής στήλης διότι τα διάφορα τμήματα αυτού του προφίλ κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες. Παρά τη δυσκολία αυτή επιτύχαμε στο κεφάλαιο IV.A να συνδυάσουμε την ταυτόχρονη μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης και της ταχύτητας ροής σε μία απλή έκφραση στην περίπτωση που έχουμε βηματική μεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή με ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής. Στο κεφάλαιο IV.B επεκτείναμε τη διαδικασία αυτή σε βαθμωτές εκλούσεις διπλού τύπου για κάθε τύπο μεταβολής της συγκέντρωσης του οργανικού διαλύτη με ταυτόχρονη μεταβολή της ταχύτητας ροής. Το μαθηματικό μοντέλο που προέκυψε για την περιγραφή της ταυτόχρονης μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης και της 8

14 ταχύτητας ροής με το χρόνο εφαρμόστηκε με επιτυχία στο διαχωρισμό των 18 παραγώγων των αμινοξέων που χρησιμοποιούνται στη διατριβή αυτή (κεφάλαια IV.A και IV.B). Η πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης για το πειραματικό μας σύστημα με εκλουστικά συστήματα τροποποιημένα με ακετονιτρίλιο ή μεθανόλη κάτω από συνθήκες διπλού τύπου βαθμωτής έκλουσης ήταν πάρα πολύ ικανοποιητική και συνεπώς ο παραπάνω συνδυασμός των δύο τύπων βαθμωτής έκλουσης μπορεί να συμβάλλει τα μέγιστα στη βελτιστοποίηση των διαχωρισμών με HPLC. Στη συνέχεια το μαθηματικό μοντέλο που αναπτύξαμε για την περιγραφή της συγκράτησης των χρωματογραφούμενων ουσιών κάτω από συνθήκες ταυτόχρονης μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης και της ταχύτητας ροής το εφαρμόσαμε στο διαχωρισμό των παραγώγων των αμινοξέων σε μονολιθική στήλη (κεφάλαιο V). Τα αποτελέσματα αυτής της εφαρμογής έδειξαν ότι η θεωρία που αναπτύχθηκε μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία και σε μεγάλες ταχύτητες ροής που απαιτούνται για τον καλό διαχωρισμό με μονολιθικές στήλες και δεν περιορίζεται η εφαρμογή της σε μικρές ταχύτητες ροής που επιβάλλουν οι συμβατικές στήλες χρωματογραφίας. Τέλος χρησιμοποιήθηκε και η θερμοκρασία της στήλης ως ένας επιπλέον παράγοντας βελτιστοποίησης του χρωματογραφικού διαχωρισμού των παραγώγων των αμινοξέων με ΟΡΑ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κατάλληλη χρωματογραφική στήλη σταθερή μέχρι τη θερμοκρασία των 90 ο C και η χρωματογραφική συμπεριφορά των ουσιών περιγράφηκε από μία εξίσωση που δίνει την εξάρτηση της συγκράτησης μιας ουσίας ταυτόχρονα από τη θερμοκρασία και από την ποσότητα του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση (κεφάλαιο VI). Η μελέτη αυτή επέτρεψε την εύρεση της βέλτιστης θερμοκρασίας διαχωρισμού, καθώς και της βέλτιστης ταυτόχρονης μεταβολής του οργανικού διαλύτη και της ταχύτητας ροής που οδηγεί στον καλύτερο διαχωρισμό των υπό μελέτη ουσιών. Οι αλγόριθμοι της διδακτορικής αυτής διατριβής μπορούν να αποτελέσουν ένα μέρος ενός σύνθετου πακέτου προγραμμάτων 9

15 βελτιστοποίησης διαχωρισμών με HPLC που θα δίνει τη δυνατότητα στους επιστήμονες που μέχρι σήμερα εύρισκαν τις βέλτιστες συνθήκες διαχωρισμού ενός δείγματος εμπειρικά, να τις προβλέψουν θεωρητικά και να τις εφαρμόσουν στη συνέχεια με επιτυχία στην πράξη ιδιαίτερα όταν πρόκειται για δύσκολους διαχωρισμούς. Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής έγινε στο Εργαστήριο Φυσικής Χημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Α.Π.Θ. υπό την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Π. Νικήτα, τον οποίο θερμά ευχαριστώ και από τη θέση αυτή τόσο για την ουσιαστική συνεισφορά του στο θεωρητικό μέρος της διατριβής και στην ανάπτυξη των αλγορίθμων που χρησιμοποιήθηκαν όσο και για την συμπαράστασή του. Ιδιαίτερα θέλω να τονίσω την καθοριστική συμβολή της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Α. Παππά-Λουίζη τόσο στην υπόδειξη του θέματος όσο και στην επιστημονική καθοδήγηση και τη στήριξή της καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής, από το σχεδιασμό και την εκτέλεση των πειραμάτων μέχρι τη μαθηματική επεξεργασία των πειραματικών αποτελεσμάτων και τη συγγραφή της παρούσας διατριβής καθώς και μιας σειράς εργασιών κι ανακοινώσεων σε συνέδρια που προέκυψαν από τη διατριβή αυτή. Για τους λόγους αυτούς την ευχαριστώ βαθύτατα. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τον Επικ. Καθηγητή κ. Σ. Σωτηρόπουλο, μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, για όλες τις γνώσεις και τη βοήθεια που μου προσέφερε στα θέματα Ηλεκτροχημείας της παρούσας διατριβής. Τους Καθηγητές κ. Α. Βουλγαρόπουλο, κ. Γ. Κοκκινίδη και κ. Ι. Παπαδογιάννη, καθώς και τον Επικ. Καθ. κ. Γ. Θεοδωρίδη ευχαριστώ θερμά για τις καθοριστικές υποδείξεις τους που συντέλεσαν στη διαμόρφωση της τελικής μορφής της Διατριβής. Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ), το οποίο χρηματοδότησε την παρούσα 10

16 διδακτορική διατριβή στα πλαίσια μίας υποτροφίας που μου δόθηκε μετά από ειδικούς γραπτούς διαγωνισμούς. Πασχαλία Χ. Μπαλκατζοπούλου Θεσσαλονίκη

17

18 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι.1. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) Τα τελευταία χρόνια οι ανάγκες της κοινωνίας σε νευραλγικούς τομείς της ζωής του ανθρώπου, όπως στην υγεία, στη διατροφή, στο περιβάλλον, στη βιομηχανία κ.α. απαιτούσαν την ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων, στα οποία ένας σημαντικός αριθμός συστατικών έπρεπε να προσδιοριστεί σε πάρα πολύ χαμηλή συγκέντρωση. Επίσης το κόστος των αναλύσεων θα έπρεπε να διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα και τα αποτελέσματα να είναι αξιόπιστα και άμεσα διαθέσιμα. Έτσι, οι συνεχώς αυξανόμενες ανάγκες της εποχής για αναλύσεις υψηλών προδιαγραφών σε συνδυασμό με τη ραγδαία ανάπτυξη της Τεχνολογίας οδήγησαν στην κατασκευή αυτοματοποιημένων οργάνων υψηλής τεχνολογικής στάθμης, τα οποία από μόνα τους ή σε συνδυασμό με άλλα όργανα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη χημική ανάλυση. Από τη στιγμή που άρχισαν να κατασκευάζονται όργανα ακριβείας, άρχισε να αναπτύσσεται η ενόργανη χημική ανάλυση. Η ενόργανη χημική ανάλυση περιλαμβάνει μεθόδους που στηρίζονται στις φυσικοχημικές ιδιότητες των αναλυόμενων ουσιών. Μία σημαντική κατηγορία ενόργανων μεθόδων ανάλυσης είναι οι διαχωριστικές τεχνικές. Από τις διαχωριστικές τεχνικές εξέχουσα θέση με πάρα πολλές εφαρμογές κατέχει η χρωματογραφία. Η χρωματογραφία ταξινομείται αρχικά σε : Υγρή Χρωματογραφία (Liquid Chromatography, LC) Αέρια Χρωματογραφία (Gas Chromatography, GC) Υπερκρίσιμη Ρευστή χρωματογραφία (Supercritical Fluid Chromatography, SFC) Αν και η χρωματογραφία είναι γνωστή από το 1903, όταν ο Tswett διαχώρισε καροτίνη και χλωροφύλλη χρησιμοποιώντας ανθρακικό ασβέστιο ως στατική φάση, η υγρή χρωματογραφία αναπτύχθηκε πολύ αργότερα. Μία από τις πιο δημοφιλείς αυτοματοποιημένες χρωματογραφικές τεχνικές, με μεγάλο αριθμό εφαρμογών τα τελευταία χρόνια είναι η υγρή 13

19 χρωματογραφία υψηλής απόδοσης HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Η HPLC χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό πολλών χημικών ενώσεων, όπως αμινοξέων, αλκαλοειδών, αντιβιοτικών, αφλατοξινών, βαρβιτουρικών, υδατανθράκων, κατεχολαμινών, βιταμινών, πρωτεϊνών, ενζύμων, στεροειδών φαρμάκων κ.α [1]. Ο διαχωρισμός των ουσιών με την υγρή χρωματογραφία στηρίζεται στη διαφορετική αλληλεπίδραση των ουσιών σε δύο μη αναμειγνυόμενες φάσεις, μια στατική και μια κινητή. Ανάλογα, λοιπόν, με το μηχανισμό διαχωρισμού [2], η υγρή χρωματογραφία ταξινομείται ως εξής : 1) Χρωματογραφία Προσρόφησης (Adsorption Chromatography) 2) Χρωματογραφία Κατανομής (Partition Chromatography), η οποία διακρίνεται σε : i) Χρωματογραφία Κανονικής φάσης (Normal-Phase Chromatography) ii) Χρωματογραφία Αντίστροφης Φάσης (Reversed-Phase Chromatography) 3) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής (Ion-Exchange Chromatography) 4) Χρωματογραφία Συγγένειας (Affinity Chromatography) 5) Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (Size-Exclusion Chromatography) Μια τυπική διάταξη HPLC [2] περιλαμβάνει : α) Φιάλες κινητής φάσης β) Αντλία υψηλής πίεσης γ) Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος δ) Χρωματογραφική στήλη ε) Σύστημα ανίχνευσης στ) Σύστημα συλλογής και καταγραφής των αποτελεσμάτων Το σχήμα Ι.1 [2] απεικονίζει διαγραμματικά τα κυριότερα μέρη μιας διάταξης HPLC. Τα πιο σύγχρονα όργανα είναι δυνατό να περιέχουν αντλία βαθμωτής έκλουσης, αισθητήρα ρύθμισης της ροής της κινητής φάσης και μια μονάδα επεξεργασίας των δεδομένων. 14

20 Διαλύτες έκλουσης Αντλία Αισθητήρας ρύθμισης ροής Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος Στήλη Aντλία βαθμωτής έκλουσης Καταγραφέας Ανιχνευτής Μονάδα επεξεργασίας δεδομένων Σχήμα Ι.1. Διαγραμματική απεικόνιση μιας τυπικής διάταξης HPLC. Με τις διακεκομμένες γραμμές (- - -) απεικονίζονται εξαρτήματα που είναι προαιρετικά σε μια τέτοια διάταξη. Το δείγμα εισάγεται κάθε φορά από τη βαλβίδα εισαγωγής δείγματος. Στις φιάλες αποθήκευσης βρίσκονται οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται κάθε φορά για την έκλουση των προσδιοριζόμενων ουσιών, δηλαδή αποτελούν την κινητή φάση. Η κινητή φάση προωθείται με τη βοήθεια μιας αντλίας υψηλής πίεσης στη χρωματογραφική στήλη, όπου λαμβάνει χώρα ο διαχωρισμός των ουσιών. Οι ουσίες μετά την έκλουσή τους από τη στήλη της υγρής χρωματογραφίας οδηγούνται σε ένα σύστημα ανίχνευσης. Το σήμα που δίνουν στον ανιχνευτή οι προσδιοριζόμενες ουσίες καταγράφεται από ένα σύστημα συλλογής και καταγραφής αποτελεσμάτων και λαμβάνεται τελικά το χρωματογράφημα. Από τα εξαρτήματα των διατάξεων της HPLC που προαναφέρθηκαν, σημαντικότατο ρόλο παίζουν στην ποιότητα ενός διαχωρισμού ουσιών η χρωματογραφική στήλη και το σύστημα ανίχνευσης που θα χρησιμοποιηθεί. Η στήλη και ο ανιχνευτής ποικίλλουν ανάλογα με τις ουσίες που πρόκειται να διαχωριστούν, επηρεάζοντας καθοριστικά το τελικό αποτέλεσμα της ανάλυσης. Ένας άλλος παράγοντας που παίζει σημαντικό ρόλο στην ποιότητα του διαχωρισμού των ουσιών ενός 15

21 δείγματος είναι το εάν κατά την ανάπτυξη ενός χρωματογραφήματος εφαρμόζονται ή όχι συνθήκες βαθμωτής έκλουσης. Άλλωστε, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή έχει ως θέμα την ανάπτυξη διάφορων μεθόδων βαθμωτής έκλουσης, με τις οποίες είναι δυνατό να βελτιωθεί και να βελτιστοποιηθεί ο διαχωρισμός ουσιών με τη μέθοδο της HPLC. Για το λόγο αυτό θεωρήθηκε σκόπιμο να αναφερθούν πιο εκτενώς κάποια επιπλέον στοιχεία για τις χρωματογραφικές στήλες, τα συστήματα ανίχνευσης, καθώς και για τα είδη της βαθμωτής έκλουσης στην HPLC. Ι.1.1. ΣΤΗΛΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Η αναλυτική στήλη είναι η καρδιά ενός χρωματογραφικού συστήματος. Πρέπει να είναι υψηλής πιστότητας, ώστε να δίνει ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Η χρωματογραφική στήλη αποτελείται από τον εξωτερικό κύλινδρο και το υλικό πλήρωσης. Ο εξωτερικός κύλινδρος μπορεί να είναι κατασκευασμένος από μέταλλο, ανοξείδωτο ατσάλι, γυαλί ή πολυμερές [3]. Το υλικό πλήρωσης (ή στατική φάση) βρίσκεται στο εσωτερικό του κυλίνδρου και επιλέγεται ανάλογα με τις ενώσεις που θα διαχωριστούν. Οι στήλες της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) χωρίζονται ως προς : i) το υπόστρωμά τους ii) iii) τη διάμετρό τους το μηχανισμό διαχωρισμού τους Ως προς το υπόστρωμα Ο πρώτος μεγάλος διαχωρισμός των στηλών της υγρής χρωματογραφίας γίνεται με βάση το υπόστρωμά τους και διακρίνονται σε : συμβατικές και μονολιθικές στήλες. 16

22 Εδώ και παρά πολλά χρόνια οι διαχωρισμοί ουσιών με τη μέθοδο της HPLC γίνονταν σχεδόν αποκλειστικά με σωματιδιακά υλικά πλήρωσης (μορφής σφαιρικού ή ακανόνιστου σχήματος). Τα τελευταία χρόνια, όμως, άρχισαν να χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο οι μονολιθικές στήλες. Οι μονόλιθοι είναι ένας νέος τύπος στατικής φάσης και πλεονεκτούν έναντι των συμβατικών στηλών λόγω των ιδιοτήτων τους. Η μονολιθική στατική φάση παρουσιάζει μια συνεχή πορώδη δομή, η οποία συνήθως παρασκευάζεται με in situ πολυμερισμό ή με σταθεροποίηση μέσα στο σωλήνα της στήλης [2]. Κύριο χαρακτηριστικό των στηλών αυτών λόγω του μεγάλου πορώδους που παρουσιάζουν είναι ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν μεγάλες ταχύτητες ροής της κινητής φάσης σε σχέση με τις συμβατικές στήλες, χωρίς να αναπτύσσονται υψηλές πιέσεις, μειώνοντας έτσι σημαντικά το χρόνο της ανάλυσης [4], όμως συχνά μειονεκτούν στη διαχωριστική ικανότητα. Το σχήμα Ι.2 δείχνει εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης ηλεκτρονίων (SEM) του υλικού πλήρωσης μιας συμβατικής (α) και μιας μονολιθικής στήλης (β) [5,6]. α) β) Σχήμα Ι.2. Εικόνες SEM του υλικού πλήρωσης: α) μιας συμβατικής και μιας μονολιθικής στήλης. Τα περισσότερο ευρέως χρησιμοποιούμενα υλικά πλήρωσης των συμβατικών στηλών της HPLC [2] είναι : 1) Ανόργανα οξείδια και ιδιαίτερα το διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) 2) Οργανικά πολυμερή 3) Γραφιτικός άνθρακας 4) Ορυκτά φωσφορικού ασβεστίου 17

23 5) Διάφοροι πολυσακχαρίτες Η πορώδης πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου (silica gel) αποτελεί το σημαντικότερο υλικό που χρησιμοποιείται ως στατική φάση στη χρωματογραφία στερεού-υγρού. Τα περισσότερα υλικά πλήρωσης έχουν ως βάση την πηκτή διοξειδίου του πυριτίου (silica gel) γιατί έχει χαμηλό κόστος, δεν καταστρέφεται εύκολα και μπορούν εύκολα να παρασκευαστούν σωματίδια της πηκτής αυτής σε μια ευρεία περιοχή μεγεθών και διαμέτρων πόρων κατάλληλα για χρωματογραφία. Η επιφάνειά του αποτελείται από σιλανολικές (-SiOH) και σιλαξονικές (-Si-O- Si-) ομάδες. Μερικές σιλανολικές ομάδες είναι ελεύθερες, ενώ άλλες είναι ενωμένες ανά δύο με δεσμούς υδρογόνου [2,3]. (Σχήμα Ι.3). Σχήμα Ι.3. Δομή της πηκτής διοξειδίου του πυριτίου (silica gel). 18

24 Το υλικό αυτό αποτελεί επίσης το υπόστρωμα πάνω στο οποίο αντιδρούν χημικά διάφορες ομάδες, δίνοντας έτσι μια ξεχωριστή θέση στη σύγχρονη τεχνολογία παρασκευής στηλών [7-19]. Στον πίνακα Ι.1 [2] αναγράφονται οι κυριότερες ομάδες που αντιδρούν χημικά με την πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου. Πίνακας Ι.1. Ομάδες που μπορούν να αντιδράσουν με την πηκτή διοξειδίου του πυριτίου προς σχηματισμό μιας χημικά δεσμευμένης φάσης. Alkyl - CH 3 - C 4 H 9 - C 8 H 17 - C 18 H 37 - C 30 H 61 Fluoroalkyl - (CH 2 ) 2 (CF 2 ) 5 CF 3 - (CH 2 ) 2 C(CF 3 ) 2 C 3 F 7 Phenyl - C 6 H 5 - C 6 F 5 Cyano Amido Amide Carbamate Sulfonic acid Carboxylic acid Dimethylamine Quaternary amine - (CH 2 ) 3 CN - (CH 2 ) 3 NH 2 - (CH 2 ) 3 NHCOC 13 H 27 - (CH 2 ) 3 OCONHC 8 H 17 - (CH 2 ) 3 SO 3 H - (CH 2 ) 3 C 6 H 4 SO 3 H - C 6 H 4 SO 3 H - (CH 2 ) 3 OCH 2 COOH - (CH 2 ) 3 COOH - (CH 2 ) 3 C 6 H 4 CH 2 COOH - (CH 2 ) 3 N(CH 3 ) 2 - (CH 2 ) 3 N + (CH 3 ) 3 19

25 Η χημική δέσμευση των ομάδων αυτών μπορεί να γίνει με διάφορες αντιδράσεις. Η κυριότερη από αυτές είναι η αντίδραση μεταξύ των επιφανειακών σιλανολών με οργανοπυριτικές ενώσεις [7, 10, 13, 17, 20-28]. Η αντίδραση αυτή γίνεται σε δύο στάδια και στο σχήμα Ι.4 [2] που ακολουθεί δίνεται ένα παράδειγμα μιας τέτοιας αντίδρασης, στην οποία φαίνεται η πορεία της. Σχήμα Ι.4. Πορεία αντίδρασης μεταξύ της πηκτής διοξειδίου του πυριτίου και μιας οργανοπυριτικής ένωσης για το σχηματισμό μιας χημικά δεσμευμένης φάσης. Στο πρώτο στάδιο η πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου αντιδρά με τριαιθοξυ υδρίδιο του πυριτίου και σχηματίζει ένα ενδιάμεσο προϊόν, το οποίο στη συνέχεια αντιδρά με ένα αλκένιο (με το διπλό δεσμό σε ακραίο άνθρακα) σχηματίζοντας έναν ανθρακοπυριτικό δεσμό (C-Si) [2]. Γενικά, όμως, εκτός από τα πλεονεκτήματα [2] που έχει το υλικό αυτό όταν χρησιμοποιείται ως στατική φάση στη χρωματογραφία, παρουσιάζει και τα εξής μειονεκτήματα : (1) έχει μεγάλη διαλυτότητα σε αλκαλικά διαλύματα (ph > 8) 20

26 (2) οι δεσμευμένες σιλοξανικές φάσεις δεν είναι σταθερές σε όξινα διαλύματα (ph < 2) (3) οι στατικές φάσεις της πηκτής διοξειδίου του πυριτίου, καθώς και οι δεσμευμένες φάσεις αυτής, παρουσιάζουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις με βασικές ενώσεις έχοντας ως αποτέλεσμα την παραμόρφωση του σχήματος των κορυφών που καταγράφονται. Για να ξεπεραστούν τα παραπάνω προβλήματα χρησιμοποιούνται και άλλα υλικά ως στατική φάση στην υγρή χρωματογραφία. Τέτοια υλικά είναι κάποια ανόργανα οξείδια, όπως αυτά του αργιλίου, του ζιρκονίου και του τιτανίου, τα οποία έχουν μεγάλη μηχανική αντοχή και είναι πιο σταθερά στην υδρόλυση από την πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου. Όπως ήδη έχει αναφερθεί, εκτός από τις συμβατικές στήλες τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και οι μονολιθικές στήλες. Τα μονολιθικά υλικά παρασκευάζονται είτε από οργανικά πολυμερή, όπως πολυστυρένια είτε από ανόργανα πολυμερή, όπως η πηκτή διοξειδίου του πυριτίου. Τα τελευταία χρόνια οι μονολιθικές στήλες βρίσκουν εφαρμογή σε ολοένα και περισσότερα πεδία. Οι μονολιθικές στήλες είναι πλέον οι πιο κατάλληλες για το διαχωρισμό μεγαλομορίων, όπως πρωτεϊνών [29], πεπτιδίων [30], ολιγο- και πολύ-νουκλεοτιδίων [31] κ.α. Ακόμη βρίσκουν εφαρμογή στο διαχωρισμό ναρκωτικών ουσιών και μεταβολιτών τους, σε ουσίες περιβαλλοντικού ενδιαφέροντος, πρόσθετων τροφίμων, καθώς και σε αναλύσεις βιοαναλυτικών διαχωρισμών [32, 33]. Οι μονολιθικές στήλες είναι συμβατές, εκτός από την HPLC, με την αέρια χρωματογραφία και την τριχοειδή ηλεκτροχρωματογραφία και βρίσκουν εφαρμογές και με αυτές τις τεχνικές. Ως προς τη διάμετρο Οι στήλες της υγρής χρωματογραφίας μπορούν να χωριστούν και ως προς τη διάμετρό τους. Έτσι διακρίνονται σε στήλες μεγάλης διαμέτρου για χρήση σε βιομηχανική κλίμακα, σε μικροδιαμετρικές (μικροστήλες), σε 21

27 νανοδιαμετρικές, σε τριχοειδείς και στήλες τόσο μικρής διαμέτρου, όσο το μέγεθος ενός chip [4]. Μια τυπική αναλυτική στήλη έχει μήκος 250 mm, εσωτερική διάμετρο (I.D.) 4,6 mm και είναι πακτωμένη με σφαιρικά σωματίδια διαμέτρου 3,5 μm [6]. Ως προς το μηχανισμό διαχωρισμού Οι στήλες της υγρής χρωματογραφίας διακρίνονται και ως προς το μηχανισμό διαχωρισμού με τον οποίο λειτουργούν σε διάφορες κατηγορίες που αναφέρονται προηγούμενα και δίνουν και το όνομά τους στις διάφορες μεθόδους της υγρής χρωματογραφίας. Γενικά, η χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RPLC) είναι η πιο διαδεδομένη από τις μεθόδους της υγρής χρωματογραφίας λόγω της ευρείας περιοχής εφαρμογών που έχει, καθώς και της απλότητας λειτουργίας της [34-36]. Το πιο χαρακτηριστικό γνώρισμα των στηλών της αντίστροφης φάσης είναι η μεγαλύτερη πολικότητα της κινητής φάσης σε σχέση με τη στατική, η οποία θεωρητικά θα πρέπει να συμπεριφέρεται σαν μια ιδανική μη πολική στατική φάση [2,4]. Ως κινητές φάσεις σ αυτόν τον τύπο διαχωρισμού χρησιμοποιούνται συνήθως μίγματα οργανικών διαλυτών με νερό, καθώς επίσης και μίγματα οργανικών διαλυτών με ρυθμιστικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph. Η RPLC είναι η πλέον κατάλληλη για το διαχωρισμό πολικών ή μη πολικών μορίων. Επίσης με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατός ο ταυτόχρονος διαχωρισμός ουδέτερων και ιονικών ενώσεων [2]. Η δυνατότητα πολλών αλλαγών στην κινητή φάση και η γρήγορη αποκατάσταση της ισορροπίας στατικής και κινητής φάσης διευκολύνει την ανάπτυξη και εφαρμογή μεθόδων βαθμωτής έκλουσης [2]. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα των στηλών αυτών είναι ότι μπορούν χρησιμοποιηθούν κάτω από διάφορες συνθήκες [2], οπότε προκύπτουν οι παρακάτω τεχνικές χρωματογραφίας : i) Χρωματογραφία Ζεύγους Ιόντων (Ion Pair Chromatography, IPC). Η τεχνική αυτή της χρωματογραφίας χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό ιοντικών ενώσεων, καθώς και 22

28 για το διαχωρισμό μιγμάτων ιοντικών και ουδέτερων ενώσεων [37-40]. Η τεχνική αυτή απαιτεί την παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος, καθώς και ενός ιοντικού συστατικού (ion-pair reagent), στην κινητή φάση. ii) Χρωματογραφία Συμπίεσης Ιόντων (Ion Suppression Chromatography, ISC). Με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός ασθενών οξέων και βάσεων [41-43], καθώς και μίγματα αυτών με ουδέτερες ενώσεις. Ανάλογα με τις τιμές των σταθερών pk a και pk b των οξέων και των βάσεων επιλέγεται και η τιμή του ph της κινητής φάσης. Μάλιστα, η τιμή του ph της κινητής φάσης είναι ένας παράγοντας ο οποίος επιλέγεται για τη βελτιστοποίηση του διαχωρισμού. iii) Χρωματογραφία Μικκυλίων (Micellar Liquid Chromatography, MLC). Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί μια υδατο-οργανική κινητή φάση που περιέχει μια τασενεργή ουσία [44-46]. Η προσθήκη του τασενεργού συστατικού στην κινητή φάση τροποποιεί τη σταθερά κατανομής των ουσιών μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης και έτσι επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός. iv) Χρωματογραφία Υδρόφοβης Αλληλεπίδρασης (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC). Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί μία ασθενώς υδρόφοβη στατική φάση και εφαρμόζεται βαθμωτή έκλουση ενός υδατικού ρυθμιστικού διαλύματος της κινητής φάσης, με συνεχώς ελαττούμενη ιονική ισχύ για το διαχωρισμό πρωτεϊνών [47-54]. v) Χρωματογραφία Συμπλοκοποίησης Μετάλλου (Metal Complexation Chromatography). Με την τεχνική αυτή μπορούν να διαχωριστούν μεταλλικά ιόντα αφού πρώτα μετατραπούν σε ουδέτερα σύμπλοκα με τη βοήθεια κατάλληλων υποκαταστατών (ligand) που προστίθενται στην κινητή φάση [2]. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα χρησιμοποιηθούν στήλες αντίστροφης φάσης τόσο συμβατικές όσο και μονολιθικές. 23

29 Ι.1.2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Ένα από τα βασικά συστατικά του εξοπλισμού μιας διάταξης υγρής χρωματογραφίας είναι ο ανιχνευτής. Ένας ανιχνευτής HPLC, ανεξάρτητα από την αρχή στην οποία βασίζεται η λειτουργία του, πρέπει να πληρεί ορισμένες προϋποθέσεις [3] : Χαμηλό επίπεδο θορύβου. Υψηλή ευαισθησία και μεγάλο εύρος γραμμικής περιοχής. Μικρός χρόνος απόκρισης. Μικρός νεκρός όγκος (να μη συνεισφέρει στη διεύρυνση των κορυφών). Ανεξαρτησία στις μεταβολές της θερμοκρασίας και της ροής. Σταθερότητα σε μεταβολές της σύστασης της κινητής φάσης. Αξιοπιστία και ευκολία στη χρήση. Δυνατότητα ανίχνευσης διαφορετικών ενώσεων και παροχή στοιχείων για την ταυτοποίησή τους. Μη καταστροφή του αναλυόμενου δείγματος. Ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται συχνά στην HPLC είναι οι παρακάτω: i) Ανιχνευτής ορατού υπεριώδους (UV-Vis). Ο ανιχνευτής UV [2] είναι ο πλέον χρησιμοποιούμενος στην υγρή χρωματογραφία. Λόγω του γεγονότος ότι οι περισσότερες οργανικές ενώσεις απορροφούν σε ορισμένο βαθμό στην περιοχή UV του φάσματος, δικαιολογημένα ο ανιχνευτής αυτός είναι ο πλέον χρησιμοποιούμενος. Αυτοί μετρούν την απορρόφηση της ακτινοβολίας μιας χημικής ένωσης σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Σύμφωνα με το νόμο Lambert Beer η απορρόφηση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ένωσης στην κυψελίδα συνεχούς ροής. Η απόκριση του ανιχνευτή, εξαρτάται από το πόσο ισχυρά απορροφά το δείγμα σε συγκεκριμένο μήκος κύματος, καθώς και πόσο απορροφά η κινητή φάση που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό. Οι οργανικές ενώσεις απορροφούν ισχυρά στην περιοχή των μηκών κύματος nm. Στην περιοχή αυτή, όμως, οι περισσότεροι διαλύτες έχουν ισχυρές ταινίες απορρόφησης, κάνοντας έτσι 24

30 δύσκολη την ανίχνευση σ αυτή την περιοχή. Στην πράξη συνήθως χρησιμοποιούνται μεγαλύτερα μήκη κύματος, ελαττώνοντας έτσι την ευαισθησία. Τα όρια ανίχνευσης είναι στην περιοχή 0,1-10 ng. ii) Ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων (photodiode array detection). Ο ανιχνευτής αυτός συλλέγει τα δεδομένα της απορρόφησης της αναλυόμενης ένωσης σε όλο το φάσμα του ορατού ή του υπεριώδους. Η ουσιαστική διαφορά του με τον κλασσικό ανιχνευτή UV-Vis είναι η παρουσία του ολογραφικού φράγματος στη θέση του μονοχρωμάτορα. Το δείγμα δέχεται ακτινοβολία ολόκληρου του φάσματος και η ακτινοβολία που βγαίνει από την κυψελίδα, αφού αναλυθεί στο ολογραφικό φράγμα, προσπίπτει σε παράταξη φωτοδιόδων, η οποία περιλαμβάνει από ή και παραπάνω φωτοευαίσθητα στοιχεία. Κάθε δίοδος δέχεται την ακτινοβολία ενός και μόνο nm και το σήμα αφού ενισχυθεί μετατρέπεται σε ψηφιακό και αποθηκεύεται στον υπολογιστή [3]. iii) Φθορισμομετρικός ανιχνευτής. Ο φθορισμομετρικός ανιχνευτής χρησιμοποιείται για ενώσεις που φθορίζουν και δίνει σήμα ανάλογο προς τη συγκέντρωση του συστατικού που φθορίζει. Ο φθορισμομετρικός ανιχνευτής είναι αδιαμφισβήτητα πιο ευαίσθητος από τον ανιχνευτή UV αλλά έχει μια περιορισμένη περιοχή εφαρμογών. Μόνο ένα μικρό μέρος των οργανικών ενώσεων που απορροφούν το φως είναι και φθορίζοντες ταυτόχρονα, ενώ ένα ακόμη μικρότερο μέρος αυτών είναι ισχυρά φθορίζοντες. Ο φθορισμομετρικός ανιχνευτής δεν είναι μόνο πολύ ευαίσθητος αλλά και πολύ εκλεκτικός. Αυτό συμβαίνει γιατί χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά μήκη κύματος, διέγερσης και εκπομπής. Τα όρια ανίχνευσης μπορούν να αγγίξουν την περιοχή των 1-10 pg [2]. iv) Ηλεκτροχημικός ανιχνευτής. Εδώ και χρόνια έχει επικρατήσει για τον αμπερομετρικό ανιχνευτή ο όρος ηλεκτροχημικός ανιχνευτής, ο οποίος στηρίζεται στη μέτρηση του ηλεκτρικού ρεύματος που παράγεται κατά την οξείδωση ή αναγωγή του συστατικού στην επιφάνεια ηλεκτροδίων μιας κυψέλης συνεχούς 25

31 ροής. Κατά την οξείδωση γίνεται μεταφορά ηλεκτρονίων από το συστατικό στο ηλεκτρόδιο, ενώ κατά την αναγωγή συμβαίνει το αντίστροφο [2]. v) Αγωγιμομετρικός ανιχνευτής. Στον αγωγιμομετρικό ανιχνευτή εφαρμόζεται εναλλασσόμενη διαφορά δυναμικού ανάμεσα στα δύο ηλεκτρόδια της κυψέλης συνεχούς ροής. Εδώ μετριέται η ειδική αγωγιμότητα του ιόντος, η οποία είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση [2]. vi) Φασματογράφος μάζας. Τα συστατικά που μας ενδιαφέρει να προσδιοριστούν καθώς εκλούονται από τη στήλη της υγρής χρωματογραφίας εισάγονται με τη μορφή διαλύματος στο φασματογράφο μάζας, όπου εξατμίζονται, ιονίζονται και στη συνέχεια λαμβάνονται τα φάσματα μάζας για την αποτίμηση των αποτελεσμάτων [1]. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν τρεις ανιχνευτές : ο ηλεκτροχημικός, ο φθορισμομετρικός και ο UV ανιχνευτής ή και συνδυασμός αυτών χάρη σε κατάλληλο λογισμικό που αναπτύξαμε και επιτρέπει τη συλλογή και καταγραφή δεδομένων από πολλούς ανιχνευτές που είναι συνδεδεμένοι σε σειρά. Ο ανιχνευτής UV και ο φθορισμομετρικός ανιχνευτής είναι απλοί στη χρήση και τα βασικά χαρακτηριστικά αυτών αναφέρθηκαν παραπάνω. Ο ηλεκτροχημικός ανιχνευτής, όμως, έχει περισσότερους περιορισμούς στη χρήση και απαιτεί γνώσεις Ηλεκτροχημείας για μια καλύτερη απόδοση. Για το λόγο αυτό κρίθηκε σκόπιμο να αναπτυχθεί περισσότερο ο τρόπος λειτουργίας του. Ηλεκτροχημικός ανιχνευτής Η έννοια της ηλεκτροχημικής ανίχνευσης σε κάποιο υγρό που ρέει περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα τεχνικών που παρέχονται από τη μοντέρνα ηλεκτροχημεία. Όμως μέχρι σήμερα στην πράξη πιο σπουδαίες είναι οι αμπερομετρικές και κουλομετρικές μετρήσεις, γι αυτό ο όρος 26

32 ηλεκτροχημική ανίχνευση θεωρείται συχνά ταυτόσημος με τις μεθόδους αυτές [55]. Η υγρή χρωματογραφία με ηλεκτροχημική ανίχνευση (LC-EC, liquid chromatography with electrochemical detection) χρησιμοποιείται σήμερα πάρα πολύ για τον προσδιορισμό πολύ μικρών ποσοτήτων ουσιών που οξειδώνονται ή ανάγονται εύκολα. Για έναν αριθμό ουσιών που οξειδώνονται έχουν επιτευχθεί όρια ανίχνευσης της τάξης του 1 pmol. Όμως το πρακτικό όριο ανίχνευσης για ουσίες που ανάγονται εύκολα είναι 10 φορές μεγαλύτερο λόγω των προβλημάτων που δημιουργεί το οξυγόνο το διαλυμένο μέσα στο υγρό που αναλύεται, αλλά και λόγω της σταθερότητας του ηλεκτροδίου. Γενικά θα μπορούσαμε να πούμε ότι η απόδοση του ηλεκτροχημικού ανιχνευτή ποικίλλει και εξαρτάται τόσο από την ουσία που αναλύεται όσο κι από τις χρωματογραφικές συνθήκες. Αφ ότου οι ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές άρχισαν να διατίθενται στο εμπόριο γύρω στα 1974, η LC-EC άρχισε να εξελίσσεται ραγδαία και σήμερα αποτελεί μια από τις πιο σημαντικές τεχνικές στον προσδιορισμό ιχνοποσοτήτων ηλεκτροενεργών ουσιών μεγάλου βιολογικού ενδιαφέροντος σε πολύπλοκα δείγματα. Η υγρή χρωματογραφία και η υδροδυναμική ηλεκτροχημεία είναι δυο αρκετά συμβατές τεχνολογίες που σε συνδυασμό στην LC-EC δίνουν πολλά πλεονεκτήματα στην ιχνοανάλυση πολλών ουσιών. Τα κύρια πλεονεκτήματα της LC-EC είναι : α) Εκλεκτικότητα της ανίχνευσης που μπορεί να ποικίλλει με αλλαγή των ηλεκτροχημικών συνθηκών. Αποτέλεσμα της εκλεκτικότητας της ηλεκτροχημικής ανίχνευσης είναι συχνά η απλούστευση της επεξεργασίας του δείγματος που αναλύεται, δεδομένου ότι η παρουσία προσμίξεων στο δείγμα μπορεί να επηρεάζει την επιθυμητή ανίχνευση. β) Μεγάλη ευαισθησία (χαμηλά όρια ανίχνευσης) σε συνδυασμό με καλή ακρίβεια ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις της ουσίας που αναλύεται. γ) Χαμηλό κόστος σε σχέση με τις φασματοσκοπικές μεθόδους ανίχνευσης που πολλές φορές χρησιμοποιούνται στην HPLC. Ας σημειωθεί επιπλέον ότι οι κλασσικές 27

33 φασματοσκοπικές τεχνικές ανίχνευσης δεν παρουσιάζουν ούτε την εκλεκτικότητα ούτε την ευαισθησία της ηλεκτροχημικής ανίχνευσης. Στο σχήμα I.5 φαίνεται σχηματικά η ηλεκτροχημική ανίχνευση μιας ηλεκτροενεργής ουσίας που καθώς περνά από την ηλεκτροχημική κυψέλη οξειδώνεται πάνω στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου εργασίας στο οποίο εφαρμόζεται σταθερό δυναμικό. Προφανώς η LC-EC προσφέρεται κυρίως για την ανίχνευση ουσιών που παρουσιάζουν ηλεκτροδιακές αντιδράσεις πολύ γρήγορες, οπότε τα ηλεκτροχημικά ρεύματα (σήματα) που παίρνονται ακόμα και σε χαμηλά δυναμικά του ηλεκτροδίου εργασίας είναι μεγάλα, ενώ το βασικό ρεύμα και ο θόρυβος είναι χαμηλός στα χαμηλά αυτά δυναμικά, όπου ακόμη πολύ λίγες ουσίες παρεμποδίζουν ηλεκτροχημικά. Σχήμα Ι.5. Οξείδωση ηλεκτροενεργής ουσίας πάνω στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου εργασίας. Όμως όπως κάθε τεχνική έτσι και η HPLC με ηλεκτροχημική ανίχνευση έχει και τα μειονεκτήματά της. Το πιο σοβαρό, που παρουσιάζεται σε όλες τις μεθόδους που βασίζονται σε ηλεκτροδιακές δράσεις, οφείλεται στο γεγονός ότι ο ηλεκτροχημικός ανιχνευτής (δηλαδή το ηλεκτρόδιο 28

34 εργασίας) βρίσκεται σε συνεχή επαφή με το διάλυμα που αναλύεται. Συνεπώς, οι ετερογενείς αντιδράσεις μεταφοράς φορτίου των ουσιών που αναλύονται επηρεάζονται ισχυρά από φαινόμενα της διπλοστιβάδας, που προκαλούνται από την προσρόφηση των ουσιών πάνω στο ηλεκτρόδιο, από αλλαγές στο μέγεθος και στην κατανομή της ηλεκτροδιακής επιφανειακής ενέργειας, από αλλαγές στις καταλυτικές επιδράσεις των ενεργών θέσεων στην ηλεκτροδιακή επιφάνεια κ.α. Συνεπώς δεν μπορούν να υπάρχουν γενικές οδηγίες για τη διατήρηση της ηλεκτροδιακής επιφάνειας σε μια σταθερή ενεργό κατάσταση ή για την επανεργοποίηση της παθητικοποιημένης ηλεκτροδιακής επιφάνειας. Δηλαδή, οι ευνοϊκές συνθήκες για κάθε ηλεκτροχημική μέτρηση πρέπει να βρίσκονται ειδικά για κάθε ιδιαίτερη περίπτωση και αυτό απαιτεί μια βασική γνώση της ηλεκτροχημείας και κάποια εμπειρία. Από την άποψη αυτή η ηλεκτροχημική ανίχνευση μειονεκτεί σε σχέση με τις κλασσικές φασματοσκοπικές μεθόδους ανίχνευσης, όπου κανείς μπορεί να παίρνει μετρήσεις με επιτυχία ακόμη και αν αγνοεί το μηχανισμό στον οποίο υπόκειται η μέτρηση. Ένα άλλο μειονέκτημα της LC-EC είναι η εξάρτηση του ηλεκτροχημικού σήματος από την ταχύτητα ροής του εκλουστικού ή της κινητής φάσης, γεγονός που κάνει την ηλεκτροχημική ανίχνευση ευαίσθητη στις διακυμάνσεις του ρυθμού άντλησης. Ακόμη η επιλογή της σύστασης της κινητής φάσης είναι κατά κάποιο τρόπο περιορισμένη, δεδομένου ότι η ηλεκτροχημική ανίχνευση σαν ηλεκτροχημική μέτρηση απαιτεί ηλεκτρικά αγώγιμη κινητή φάση. Το ηλεκτροχημικό σήμα επίσης εξαρτάται από τη σύσταση του υγρού που ρέει, γι αυτό και η χρήση της βαθμωτής έκλουσης είναι πιο δύσκολη από ότι με μερικές άλλες τεχνικές ανίχνευσης, αν και όχι αδύνατη. Τέλος το ηλεκτροχημικό σήμα εξαρτάται από τη θερμοκρασία αλλά όχι τόσο καθοριστικά ώστε να είναι απαραίτητος ο έλεγχος της θερμοκρασίας σε συνηθισμένες αναλύσεις. Υλικό του ηλεκτροδίου εργασίας Η επιλογή του ηλεκτροδιακού υλικού στην LC-EC είναι πολύ πιο σημαντική απ ότι σε άλλες ηλεκτροαναλυτικές μετρήσεις, κι αυτό γιατί στην ηλεκτροχημική ανίχνευση της HPLC απαιτείται ηλεκτροδιακό υλικό 29

35 μηχανικής αντοχής και σταθερότητας μεγάλης διάρκειας, εις τρόπον ώστε να εξασφαλίζεται καλή επαναληψιμότητα των μετρήσεων. Το πιο ουσιαστικό όμως χαρακτηριστικό που πρέπει να παρουσιάζει ένα ηλεκτρόδιο για υδροδυναμική αμπερομετρία είναι ένας ευνοϊκός λόγος σήματος προς θόρυβο. Έτσι για παράδειγμα, το γεγονός ότι ένα ηλεκτρόδιο δίνει ένα χαμηλότερο βασικό ρεύμα από ένα άλλο σε δεδομένο δυναμικό δεν είναι από μόνο του ενδεικτικό ενός καλύτερου ηλεκτροδίου, γιατί εάν η ταχύτητα μεταφοράς ηλεκτρονίων στην ουσία που αναλύεται είναι επίσης χαμηλή στο ηλεκτρόδιο αυτό, τότε θα μπορούσε κι ο λόγος σήματος προς θόρυβο να μην είναι καθόλου ευνοϊκός για τη δεδομένη ηλεκτροχημική μέτρηση. Παρακάτω αναφέρονται οι πιο ενδιαφέρουσες ιδιότητες των συνηθισμένων ηλεκτροδιακών υλικών με βάση τη σχετική βιβλιογραφία που υπάρχει. Το ηλεκτροδιακό υλικό που χρησιμοποιείται πιο συχνά σε εμπορικά συστήματα αμπερομετρικής ανίχνευσης είναι ο υαλώδης άνθρακας, γιατί αυτός είναι ανθεκτικός σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών που συχνά χρησιμοποιούνται στις κινητές φάσεις, όπως το ακετονιτρίλιο, η ακετόνη κ.α. Η απόδοση όμως του υαλώδη άνθρακα, καθώς και του πυρολυτικού γραφίτη και των ευγενών μετάλλων (χρυσού, λευκόχρυσου), που επίσης χρησιμοποιούνται συχνά σε αμπερομετρικούς ανιχνευτές, εξαρτάται πολύ από τη λείανση της ηλεκτροδιακής επιφάνειας. Καλά γυαλισμένα ηλεκτρόδια λευκοχρύσου και υαλώδη άνθρακα δίνουν επαναλήψιμα σήματα σε μια μεγάλη χρονική διάρκεια χρήσης (συχνά πολλούς μήνες, απουσία όμως τασενεργών ουσιών στην κινητή φάση). Επίσης μετά την μηχανική λείανση στην οποία συχνά υποβάλλονται για την αναγέννησή τους, ουσιαστικά παίρνονται οι ίδιες απόλυτες τιμές ρεύματος. Ο θόρυβος που δίνουν τα ηλεκτρόδια λευκοχρύσου είναι κανονικός κι αυξάνει ομοιόμορφα με την αύξηση της ευαισθησίας της μέτρησης, ενώ ο θόρυβος που παρουσιάζει ο υαλώδης άνθρακας είναι αρχικά χαμηλός και ξαφνικά αυξάνει όταν μετριούνται ρεύματα κάτω από 10-7 Α. Τέλος ο υαλώδης άνθρακας έχει ένα ευνοϊκό βασικό ρεύμα σε αρνητικά δυναμικά κι έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε δύσκολες ηλεκτροδιακές δράσεις, όμως είναι ευαίσθητος στο πέρασμα μεγάλων ρευμάτων και στο χρόνο ζωής, 30

36 γεγονότα που οδηγούν στην ανακρυστάλλωση του υαλώδη άνθρακα σε γραφίτη και σε σοβαρή μείωση της απόδοσής του. Περιορισμοί της κινητής φάσης Όλοι οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην HPLC βάζουν περιορισμούς στη σύσταση της κινητής φάσης που πρέπει να χρησιμοποιείται. Ιδιαίτερα όμως στην ηλεκτροχημική ανίχνευση πρέπει κανείς να μην ξεχνά ότι η ανίχνευση στηρίζεται σε μια ηλεκτροδιακή (επιφανειακή) αντίδραση που εξαρτάται πολύ τόσο από τις φυσικές όσο και τις χημικές ιδιότητες του μέσου. Για τη βελτιστοποίηση ενός LC-EC προσδιορισμού θα πρέπει τόσο η χρωματογραφική στήλη όσο και ο ανιχνευτής να αντιμετωπίζονται μαζί. Γενικά, μη πολικοί οργανικοί διαλύτες δεν είναι συμβατοί με ηλεκτροχημικό ανιχνευτή, γιατί δε μπορούν να εξασφαλίσουν την απαραίτητη αγωγιμότητα για μια ηλεκτροδιακή δράση. Συνεπώς, κλασσικοί διαχωρισμοί με κανονική φάση σε στήλες silica ή alumina δεν μπορούν να συνδυάζονται με ηλεκτροχημική ανίχνευση. Σήμερα η πλειονότητα των LC διαχωρισμών γίνονται με αντίστροφη φάση. Στους διαχωρισμούς αυτούς οι κινητές φάσεις είναι γενικά ρυθμιστικά διαλύματα με ή χωρίς οργανικούς τροποποιητές (π.χ. μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, τετραϋδροφουράνιο κ.α.). Η συγκράτηση των ουσιών που διαχωρίζονται μεταβάλλεται ρυθμίζοντας τη συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, το ph ή την ιονική ισχύ, ή ακόμα προσθέτοντας αντιδραστήρια που σχηματίζουν ζεύγη ιόντων με τις ουσίες που αναλύονται. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί κι ο έλεγχος της θερμοκρασίας να είναι χρήσιμος σε κάποιο διαχωρισμό. Κινητές φάσεις αυτού του τύπου είναι ιδανικές για ηλεκτροχημική ανίχνευση, που απαιτεί μια χρωματογραφική κινητή φάση αφ ενός χημικά και ηλεκτροχημικά αδρανή στην περιοχή δυναμικού που θα χρησιμοποιηθεί και αφ ετέρου ηλεκτρικά αγώγιμη. Τα ρυθμιστικά διαλύματα της κινητής φάσης θα πρέπει να έχουν μικρή ιονική ισχύ (0,01-0,1 Μ) ώστε να υπάρχει μεν η κατάλληλη αγωγιμότητα, 31

37 αλλά να ελαχιστοποιείται ταυτόχρονα η συνεισφορά στο βασικό ρεύμα των προσμίξεων που πιθανά υπάρχουν στα αντιδραστήρια του ρυθμιστικού. Ιδιαίτερα όταν εφαρμόζονται τεχνικές αναγωγικής ηλεκτροχημικής ανίχνευσης, ίχνη μεταλλικών ιόντων, που μπορούν να αναχθούν ηλεκτροχημικά και δεν μπορούν να περιοριστούν ολοκληρωτικά κατά τη διαδικασία παρασκευής των αντιδραστηρίων του ρυθμιστικού, μπορούν να δημιουργήσουν μεγάλο πρόβλημα στη σταθερότητα της βασικής γραμμής. Όταν απαιτούνται πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης σε τέτοιες αναλύσεις θα πρέπει αφ ενός να χρησιμοποιούνται πολύ καθαροί διαλύτες και αντιδραστήρια και αφ ετέρου η κινητή φάση να ηλεκτρολύεται πριν από την άντλησή της στη χρωματογραφική στήλη. Ένα ακόμη μεγαλύτερο πρόβλημα στους αναγωγικούς προσδιορισμούς με LC-EC είναι η απομάκρυνση του διαλυμένου οξυγόνου τόσο από την κινητή φάση όσο κι από το δείγμα που αναλύεται. Εάν δεν αφαιρεθεί το οξυγόνο και δεν εμποδιστεί να επιστρέψει στο σύστημα μετά την απαέρωση, θα παραχθούν ακόμη και σε πολύ χαμηλά δυναμικά πολύ μεγάλα βασικά ρεύματα από την αναγωγή του οξυγόνου με αποτέλεσμα να περιοριστεί πολύ η χρησιμότητα της αναγωγικής ανίχνευσης. Βέβαια, η σοβαρότητα του παραπάνω προβλήματος εξαρτάται κι από το ηλεκτροδιακό υλικό που χρησιμοποιείται. 32

38 Ι.1.3. ΙΣΟΚΡΑΤΙΚΗ ΒΑΘΜΩΤΗ ΕΚΛΟΥΣΗ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΩΝ Η έκλουση των ουσιών στην υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) μπορεί να γίνει είτε ισοκρατικά είτε βαθμωτά. Στον απλό τύπο ισοκρατικής έκλουσης, οι χρωματογραφικές συνθήκες παραμένουν σταθερές, δηλαδή η σύσταση της κινητής φάσης, η ταχύτητα ροής και η θερμοκρασία της στήλης. Πολλά πολύπλοκα δείγματα περιέχουν συστατικά που διαφέρουν πολύ στη συγκράτηση, δηλαδή άλλα συγκρατούνται ασθενώς και άλλα ισχυρά. Αν οι ισοκρατικές συνθήκες επιλεγούν με τέτοιο τρόπο ώστε τα συστατικά του δείγματος που συγκρατούνται ισχυρά να εκλούονται σε έναν ικανοποιητικό και σχετικά μικρό χρόνο, τότε τα συστατικά που συγκρατούνται ασθενώς στη στατική φάση θα εκλουστούν πολύ νωρίς και είναι πολύ πιθανόν κάποια από αυτά να εκλουστούν στο νεκρό χρόνο της στήλης. Από την άλλη, αν οι ισοκρατικές συνθήκες επιλεγούν με τέτοιο τρόπο ώστε τα συστατικά του δείγματος που συγκρατούνται ασθενώς να διαχωρίζονται ικανοποιητικά, τότε τα συστατικά που συγκρατούνται ισχυρά εκλούονται σε μεγάλο χρόνο, οι κορυφές τους είναι ευρείες και η ολοκλήρωση των κορυφών για την ποσοτική τους αποτίμηση γίνεται πολύ δύσκολη ή ακόμη και αδύνατη. Έτσι όταν απαιτείται ο διαχωρισμός των συστατικών ενός πολύπλοκου δείγματος, ο απλός τύπος ισοκρατικής έκλουσης δεν οδηγεί σε επιτυχή διαχωρισμό των συστατικών του. Για την αποφυγή όλων αυτών των προβλημάτων χρησιμοποιείται πολύ συχνά η βαθμωτή έκλουση. Η βαθμωτή έκλουση μπορεί να γίνει : Με μεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού διαλύτη της κινητής φάσης και γενικότερα με μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης. Με μεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης. Με μεταβολή της θερμοκρασίας της στήλης διαχωρισμού. Το πιο συνηθισμένο είδος βαθμωτής έκλουσης είναι η μεταβολή της συγκέντρωσης του οργανικού διαλύτη της κινητής φάσης. Σε αυτό το είδος βαθμωτής έκλουσης αρχικά χρησιμοποιείται μια κινητή φάση με μικρό ποσοστό οργανικού διαλύτη, έτσι ώστε να επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισμός των ασθενώς συγκρατούμενων ενώσεων. Στη συνέχεια η 33