ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠPOΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠPOΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ Μεθοδολογίες μοριακής απεικόνισης με επισημασμένα νανοσωματίδια για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους ΕΙΡΗΝΗ ΤΣΙΑΠΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Πάτρα, 2013

2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠPOΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ Μεθοδολογίες μοριακής απεικόνισης με επισημασμένα νανοσωματίδια για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους ΕΙΡΗΝΗ ΤΣΙΑΠΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. Πάτρα, 2013

4

5 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Γεώργιος Καγκάδης, Επίκουρος Καθηγητής Επιβλέπων Καθηγητής Γεώργιος Λούντος, Επίκουρος Καθηγητής Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Γεώργιος Νικηφορίδης, Καθηγητής Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Γεώργιος Καγκάδης, Επίκουρος Καθηγητής Επιβλέπων Καθηγητής Γεώργιος Νικηφορίδης, Καθηγητής Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Γεώργιος Λούντος, Επίκουρος Καθηγητής Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Δημήτριος Σιαμπλής, Καθηγητής Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Παύλος Βασιλάκος, Καθηγητής Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Δημήτριος Καρναμπατίδης, Αναπλ.Καθηγητής Αλεξάνδρα Βαρβαρήγου, Ερευνήτρια Α Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής

6

7 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF MEDICINE DEPARTMENT OF PHYSICS INTERDEPARTMENTAL PROGRAM OF POSTGRADUATE STUDIES IN MEDICAL PHYSICS Molecular imaging methodologies with radiolabeled nanoparticles for the quantitative evaluation of angiogenesis spatial distribution in malignant tumors IRENE TSIAPA DOCTORATE THESIS Patras, 2013

8

9 Στην οικογένειά μου

10

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη υπό την επίβλεψη του επίκουρου καθηγητή κ. Γ. Καγκάδη, σε συνεργασία του Εργαστηρίου της Ιατρικής Φυσικής του Πανεπιστημίου Πάτρας, με το Εργαστήριο Ραδιοφαρμακολογικών Μελετών του Ινστιτούτου Πυρηνικών & Ραδιολογικών Επιστημών & Τεχνολογίας, Ενέργειας & Ασφάλειας (Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α.) του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» και το τμήμα Μηχανικών Βιοϊατρικής Τεχνολογίας του Τ.Ε.Ι. Αθηνών. Ευχαριστώ θερμά τον επίκουρο καθηγητή κ. Γ. Καγκάδη καθώς και τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον επίκουρο καθηγητή κ. Γ. Λούντο και τον καθηγητή κ. Γ. Νικηφορίδη, για την ανάθεση του θέματος, την καθοδήγησή τους και τις επιστημονικές υποδείξεις κατά την διάρκεια της παρούσας εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την Δρ. Α. Βαρβαρήγου ερευνήτρια Α του ΙΠΡΕΤΕΑ για την φιλοξενία που μου πρόσφερε στο εργαστήριο Ραδιοφαρμακολογικών Μελετών, για την συνεχή υποστήριξη και καθοδήγησή της για την ολοκλήρωση της εργασίας αυτής, αλλά κυρίως για την για την αμέριστη εμπιστοσύνη που μου έδειξε από την πρώτη στιγμή. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να εκφράσω στη Δρ. Π. Μπουζιώτη, ερευνήτρια Β του ΙΠΡΕΤΕΑ, για τη φιλοξενία μου στο εργαστήριο Ελέγχου Ποιότητας Ραδιοφαρμάκων και την πολύτιμη βοήθειά της και την συμβολή της προκειμένου να ολοκληρωθεί η παρούσα εργασία. Ευχαριστώ τον Δρ. Γ. Κόρδα ερευνητή Α του Ινστιτούτου Επιστήμης Υλικών στο Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» και ιδιαιτέρως την Δρ. Ε. Ευθυμιάδου για την συμβολή της στην σύνθεση και τον χαρακτηρισμό των νανοσωματιδίων, την Δρ. Μ. Παραβατού, για τη φιλοξενία της στο Εργαστήριο Ραδιοβιολογικών μελετών του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», όπου πραγματοποιήθηκε το σύνολο των in vitro πειραμάτων στις κυτταροκαλλιέργειες, καθώς και τον Δρ. Λ. Λεοντιάδη υπεύθυνο του Εργαστηρίου Διοξινών του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» για την λήψη των φασμάτων μάζας. Ευχαριστώ τους Δρες: Ε. Φραγκογεώργη, Δ. Ψημάδα, Θ. Τσοτάκο, Χ. Λιόλιο, τον κ. Σ. Ξανθόπουλο, την κ. Β. Λιάκου και τον κ. Λ. Παλαμάρη για την πολύτιμη βοήθειά τους σε όλη τη διάρκεια της διατριβής καθώς και το προσωπικό του ΙΠΡΕΤΕΑ και ιδιαιτέρως τους Δρες: Ε. Λιβανίου, Χ. Ζήκο, Ι. Πιρμεττή, Μ. Παπαδόπουλο, Χ. Τσουκαλά και Χ. Τριάντη, για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις τους. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου και τους φίλους μου για την αγάπη, την ψυχολογική 1

12 συμπαράσταση και την υπομονή τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης και συγγραφής αυτής της Διατριβής. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας παρήχθησαν οι παρακάτω δημοσιεύσεις σε Διεθνή επιστημονικά περιοδικά καθώς και ανακοινώσεις σε επιστημονικά συνέδρια: Δημοσιεύσεις: Tsiapa I., Loudos G., Varvarigou A., Fragogeorgi E., Psimadas D., Tsotakos T., Xanthopoulos S., Mihailidis D., Bouziotis P., Nikiforidis G.C., Kagadis G.C., «Biological evaluation of an ornithine-modified 99m Tc-labeled RGD peptide as an angiogenesis imaging agent» Nuclear Μedicine and Βiology 40, , Tsiapa I., Efthimiadou K.E., Fragogeorgi E., Loudos G., Varvarigou A., Bouziotis P., Kordas G.C., Mihailidis D., Nikiforidis G.C., Xanthopoulos S., Psimadas D., Paravatou-Petsotas M., Palamaris L., Kagadis G.C. «99m Tc-Labeled aminosilane-coated iron oxide nanoparticles for molecular imaging of tumor angiogenesis and challenges for in vivo hyperthermia» Medical Physics, submitted Sept Tsiapa I., Psimadas D., Fragogeorgi E., Loudos G., Kagadis G.C., Varvarigou A. «Nanoparticles and Nuclear Medicine: A Look in Cancer and Ischemia» Current Medicinal Chemistry, submitted June Tsiapa I., et al. «Molecular imaging methodologies with radiolabeled nanoparticles for the quantitative evaluation of angiogenesis spatial distribution in malignant tumors», (in preparation). Συνέδρια: Tsiapa I., Loudos G., Varvarigou A., Xanthopoulos S., Bouziotis P., Mihailidis D., Nikiforidis G.C., Kagadis G.C. «Evaluation of a new radiopeptide RGD analog GGC-(Orn)x-cRGDfK, suitable for Specific Targeting of Tumor Angiogenesis by RGD-Conjugated Magnetic Nanoparticles, for Combined Cancer Imaging and Therapy» European Symposium on Radiopharmacy and Radiopharmaceuticals ESRR, Γαλλία Απριλίου Tsiapa I., Xanthopoulos S., Bouziotis P., Mihailidis D., Nikiforidis G.C., Varvarigou A., Loudos G., Kagadis G.C. «Evaluation of a new radiopeptide RGD analog GGC-(Orn) 3 -crgdfk, suitable for Specific Targeting of Tumor Angiogenesis by RGD-Conjugated Magnetic Nanoparticles, for Combined Cancer Imaging and Therapy» PET/MR and SPECT/MR: New Paradigms for Combined Modalities in Molecular Imaging Conference, Ιταλία Μαΐου Tsiapa I., Loudos G., Varvarigou A., Fragogeorgi E., Efthimiadou K.E., Palamaris L., Xanthopoulos S., Mihailidis D., Bouziotis P., Nikiforidis G.C., Kagadis G.C. «99m Tc-Labeled Iron Oxide Nanoparticles as a dual modality imaging agents and challenges for in vivo hyperthermia» 2 nd International Conference on Bio-Medical Instrumentation and related Engineering and Physical Sciences BIOMEP, Αθήνα Ιουνίου Tsiapa I., Loudos G., Varvarigou A., Bouziotis P., Xanthopoulos S., Fragogeorgi E., Paravatou- Petsotas M., Efthimiadou K.E., Kordas G.C., Mihailidis D., Nikiforidis G.C., Kagadis G.C. «99m Tc- Labeled aminosilane-coated iron oxide nanoparticles as dual modality imaging agents of tumor angiogenesis and in vivo hyperthermia evaluation» COST TD1004 Action Theranostics Imaging and Therapy: An Action to Develop Novel Nanosized Systems for Imaging-Guided Drug Delivery, Αθήνα 1-3 Σεπτεμβρίου

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 7 SUMMARY 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μοριακή απεικόνιση Τεχνικές Μοριακής Απεικόνισης Πυρηνική Ιατρική Ραδιοϊσότοπα στην Πυρηνική Ιατρική «Διαγνωστικά» ραδιοϊσότοπα «Θεραπευτικά» ραδιοϊσότοπα Σπινθηρογραφική μελέτη με SPECT Ανίχνευση φωτονίων με γ-camera Σύστημα microspect Απεικόνιση μικρών ζώων m Tc και ιατρική διάγνωση Εφαρμογή του 99m Tc στην Ιατρική Παραγωγή του 99m Tc Γεννήτρια 99 Mo/ 99m Tc Αξιολόγηση της απόδοσης επισήμανσης με Χρωματογραφικές Τεχνικές Ιντεγκρίνες και αγγειογένεση στον καρκίνο Αγγειογένεση Aγγειογένεση και καρκίνος Ιντεγκρίνες α ν β 3 και το φαινόμενο της αγγειογένεσης στον καρκίνο Ο ρόλος των ιντεγκρινών στην ανάπτυξη των καρκινικών όγκων Μοριακή απεικόνιση της ιντεγκρίνης α ν β 3 με χρήση πεπτιδίων Χαρακτηριστικά των RGD πεπτιδίων Ραδιοεπισημασμένα RGD πεπτίδια ως παράγοντες απεικόνισης της αγγειογένεσης Μοριακή απεικόνιση με χρήση μαγνητικών νανοσωματιδίων Γενικά χαρακτηριστικά μαγνητικών βιοϋλικών In vivo χαρακτηριστικά νανοσωματιδίων Σιδηρομαγνητικά νανοσωματίδια Στοχευμένα νανοσωματίδια στην μοριακή απεικόνιση Ραδιοεπισημασμένα νανοσωματίδια συζευγμένα με RGD ως παράγοντες απεικόνισης της 45 αγγειογένεσης 7. Βασικές αρχές της υπερθερμίας Ο ρόλος της υπερθερμίας στη θεραπεία του καρκίνου Μαγνητική υπερθερμία με την χρήση μαγνητικών νανοσωματιδίων 47 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός της Εργασίας 53 3

14 9. Αναλυτικά όργανα και πρώτες ύλες Χαρακτηρισμός του RGD πεπτιδικού παραγώγου Χαρακτηρισμός της καθαρότητας του πεπτιδικού παραγώγου με υγρή χρωματογραφία 56 υψηλής απόδοσης (HPLC) Χαρακτηρισμός του πεπτιδικού παραγώγου με φασματομετρία μάζας (ESI-ΜS) Σχηματισμός και χαρακτηρισμός του πεπτιδικού συμπλόκου με 185/187 Re Σχηματισμός και χαρακτηρισμός του πεπτιδικού παραγώγου με 99m Tc Επισήμανση του πεπτιδικού παραγώγου με 99m Tc Ραδιοχημικός έλεγχος του ραδιοεπισημασμένου πεπτιδικού παραγώγου με RP-HPLC Προσδιορισμός της λιποφιλικότητας του ραδιοπεπτιδικού συμπλόκου Μελέτη της σταθερότητας του πεπτιδικού συμπλόκου 99m Tc-RGD Μελέτη της σταθερότητας σε συνάρτηση με το χρόνο Μελέτη της σταθερότητας παρουσία περίσσειας κυστεΐνης Μελέτη της σταθερότητας σε πλάσμα αίματος (plasma stability) Ανάλυση μεταβολιτών (metabolic study) Σύνθεση και χαρακτηρισμός των σιδηρομαγνητικών νανοσωματιδίων Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων Επικάλυψη νανοσωματιδίων Fe 3 Ο 4 με αμινοσιλάνιο Σύζευξη νανοσωματιδίων με το RGD πεπτιδικό παράγωγο Φυσικοχημικός Χαρακτηρισμός Σχηματισμός και χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων με 99m Tc Επισήμανση των νανοσωματιδίων με 99m Tc Ραδιοχημικός έλεγχος των νανοσωματιδίων Μελέτη της σταθερότητας των επισημασμένων νανοσωματιδίων Μελέτη της σταθερότητας σε συνάρτηση με το χρόνο Μελέτη της σταθερότητας παρουσία περίσσειας ιστιδίνης και DTPA Μελέτη της σταθερότητας σε ορό αίματος (serum stability) 16. Κυτταρικές καλλιέργειες Απόψυξη κυτταρικής σειράς Ανακαλλιέργεια-Αναπαραγωγή κυττάρων Ψύξη κυτταρικής σειράς Βιολογική αξιολόγηση των συμπλόκων του 99m Tc Πειραματικά Πρότυπα (Experimental animals) Εμφύτευση καρκινικών κυττάρων σε άθυμους μύες και ανάπτυξη καρκινικών όγκων Αναισθητοποίηση και σπινθηρογραφική απεικόνιση του πειραματόζωου Μελέτες βιοκατανομής σε πειραματικά πρότυπα Μελέτη της χωρο-χρονικής κατανομής της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους Διερεύνηση χρήσης υπερθερμίας για την καταπολέμηση των καρκινικών κυττάρων Μελέτη της θερμικής απόκρισης των σιδηρομαγνητικών νανοσωματιδίων 69 4

15 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηρισμός του RGD πεπτιδικού παραγώγου Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Αποτελέσματα ανάλυσης του πεπτιδικού παραγώγου με RP-HPLC Χαρακτηρισμός του πεπτιδίου με φασματομετρία μάζας (ESI-ΜS) Σχηματισμός και χαρακτηρισμός του πεπτιδικού συμπλόκου με 185/187 Re Χαρακτηρισμός του πεπτιδικού συμπλόκου 185/187 Re-RGD με φασματομετρία μάζας 75 (ESI-MS) 21. Επισήμανση του RGD πεπτιδικού παραγώγου με 99m Tc Προσδιορισμός της λιποφιλικότητας του πεπτιδίου 99m Tc-RGD Μελέτη της σταθερότητας του πεπτιδίου 99m Tc-RGD Μελέτη της σταθερότητας σε συνάρτηση με το χρόνο Μελέτη της σταθερότητας παρουσία περίσσειας κυστεΐνης (cystein challenge) Μελέτη της σταθερότητας σε πλάσμα αίματος (plasma stability) Ανάλυση μεταβολιτών (metabolic study) Χαρακτηρισμός των σιδηρομαγνητικών νανοσωματιδίων Χαρακτηρισμός μαγνητικών νανοσωματιδίων Fe 3 Ο Χαρακτηρισμός μαγνητικών νανοσωματιδίων με επικάλυψη αμινοσιλάνιο Χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων έπειτα από την σύζευξη με το RGD πεπτιδικό 86 παράγωγο 24. Επισήμανση των νανοσωματιδίων με 99m Tc Επισήμανση νανοσωματιδίων 99m Tc-NPs και 99m Tc-NPs-RGD Μελέτη της σταθερότητας των ραδιοεπισημασμένων νανοσωματιδίων Μελέτη της σταθερότητας σε συνάρτηση με το χρόνο Μελέτη σταθερότητας των επισημασμένων νανοσωματιδίων Σπινθηρογραφικές μελέτες σε μύες τύπου Swiss (Swiss mice) με τα ραδιοεπισημασμένα 93 παράγωγα Σπινθηρογραφική απεικόνιση φυσιολογικών πειραματόζωων με το πεπτίδιο 99m Tc-RGD Σπινθηρογραφική απεικόνιση φυσιολογικών πειραματόζωων με νανοσωματίδια 99m Tc- 95 NPs Σπινθηρογραφική απεικόνιση φυσιολογικών πειραματόζωων με νανοσωματίδια 99m Tc- 98 NPs-RGD 27. Μελέτες βιοκατανομής των επισημασμένων παραγώγων σε μύες τύπου Swiss (Swiss mice) Μελέτες βιοκατανομής του πεπτιδίου 99m Tc-RGD σε φυσιολογικά πειραματόζωα Συγκριτικές μελέτες βιοκατανομής των νανοσωματιδίων 99m Tc-NPs και 99m Tc-NPs-RGD σε 103 φυσιολογικά πειραματόζωα 28. Σπινθηρογραφικές μελέτες παθολογικών πρότυπων καρκίνου με τα ραδιοεπισημασμένα παράγωγα Σπινθηρογραφική απεικόνιση παθολογικών πρότυπων καρκίνου με το πεπτίδιο 99m Tc- RGD Σπινθηρογραφική απεικόνιση παθολογικών πρότυπων καρκίνου με νανοσωματίδια 99m Tc -NPs

16 29. Μελέτες βιοκατανομής των επισημασμένων παραγώγων σε παθολογικά πρότυπα 111 καρκίνου Μελέτες βιοκατανομής του πεπτιδίου 99m Tc-RGD σε παθολογικά πρότυπα καρκίνου Μελέτες βιοκατανομής των νανοσωματιδίων 99m Tc-NPs σε παθολογικά πρότυπα 114 καρκίνου 30. Αξιολόγηση της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους Αξιολόγηση της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης με το πεπτίδιο 99m Tc-RGD Σπινθηρογραφική απεικόνιση της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης σε 119 παθολογικά πρότυπα καρκίνου με το πεπτίδιο 99m Tc-RGD Αξιολόγηση της αγγειογένεσης στον όγκο με χορήγηση νανοσωματιδίων 99m Tc-NPs-RGD Αξιολόγηση της υπερθερμίας για την καταπολέμηση των καρκινικών κυττάρων In vitro μελέτη υπερθερμίας με νανοσωματίδια NPs In vivo μελέτη υπερθερμίας με νανοσωματίδια NPs Ex vivo μελέτη υπερθερμίας με νανοσωματίδια NPs 128 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 132 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 140 6

17 Μεθοδολογίες μοριακής απεικόνισης με επισημασμένα νανοσωματίδια για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους Ειρήνη Τσιάπα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη της απεικόνισης και ποσοτικοποίησής της με χρήση τεχνικών μοριακής απεικόνισης. Ένα νέο κυκλικό πεπτιδικό παράγωγο RGDfK (Arg-Gly-Asp-D-Phe Lys), το crgdfk-orn 3 -CGG, αξιολογήθηκε ως νέο μοριακό μέσο στόχευσης του καρκίνου μέσω της ειδικής στόχευσης των υποδοχέων ιντεγκρίνης α ν β 3 που υπερεκφράζονται κατά την αγγειογένεση. Το νέο πεπτιδικό παράγωγο φέρει τον περιφερειακό υποκαταστάτη CGG (Cys-Gly-Gly), κατάλληλο για την επισήμανση με σύμπλοκα του πεντασθενούς 99m Tc(V) καθώς και για την σύζευξη με νανοσωματίδια. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκαν σιδηρομαγνητικά νανοσωματίδια (10±2 nm) συζευγμένα με το νέο παράγωγο RGD, κατάλληλα τόσο για SPECT/MRI απεικόνιση όσο και για υπερθερμία. Ειδικότερα, αξιολογήθηκαν ως νέα μοριακά μέσα απεικόνισης: 99m Τc-RGD (crgdfk-orn 3 -CGG), 99m Τc-NPs και 99m Τc-NPs-RGD, αναφορικά με τα ραδιοχημικά, ραδιοβιολιγικά και in vivo απεικονιστικά χαρακτηριστικά τους. Τα επισημασμένα παράγωγα λήφθηκαν σε υψηλές αποδόσεις και παρουσίασαν ικανοποιητική σταθερότητα in vitro: α) με την πάροδο του χρόνου, β) σε παρουσία περίσσειας ανταγωνιστών για το 99m Tc, γ) σε παρουσία ανθρωπίνου πλάσματος ή ορού. Η μελέτη της in vivo συμπεριφοράς, αλλά και η βιοκατανομή των νέων παραγώγων πραγματοποιήθηκε σε φυσιολογικούς μύες και σε παθολογικά πρότυπα καρκίνου τύπου γλοιοβλαστώματος U87MG. Η αξιολόγηση της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης κατέδειξε μέγιστη στόχευση στις ιντεγκρίνες α ν β 3 σε ποσοστό 11,60±3,05 % ID/g για το παράγωγο 99m Tc-RGD και 9,01±0,19 ID/g για τα στοχευμένα νανοσωματίδια 99m Tc-NPs-RGD. Το 99m Tc-RGD σχεδιάστηκε κατάλληλα ώστε να αποβάλλεται από τον οργανισμό μέσω του ουροποιητικού συστήματος, με την προσθήκη του υδρόφιλου μορίου ορνιθίνης (Orn 3 ) στη δομή του. Ενώ, τα 99m Tc-NPs αποβάλλονται κυρίως μέσω του ηπατοχολικού συστήματος, τα στοχευμένα 99m Tc-NPs-RGD παρουσιάζουν χαμηλότερη πρόσληψη στο ήπαρ και υψηλότερη πρόσληψη στους νεφρούς, η οποία μπορεί να αποδοθεί στην πρόσδεση του RGD παραγώγου στην επιφάνεια των NPs. Ικανοποιητικές απεικονίσεις των όγκων ελήφθησαν και με τα επισημασμένα παράγωγα 99m Tc-RGD και 99m Τc-NPs. Τέλος, η in vivo αξιολόγηση της θερμικής απόκρισης των NPs 7

18 ανέδειξε ικανοποιητικά αποτελέσματα, με αντικαρκινική δράση σε πειραματόζωο που φέρει U87MG όγκο. Τα παραπάνω αρχικά αποτελέσματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα στοχευμένα νανοσωματίδια είναι πολλά υποσχόμενα στο πεδίο της μοριακής απεικόνισης για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χωροχρονικής κατανομής της αγγειογένεσης με στόχο τη διάγνωση αλλά και τη θεραπευτική προσέγγιση. 8

19 Molecular imaging methodologies with radiolabeled nanoparticles for the quantitative evaluation of angiogenesis spatial distribution in malignant tumors Irene Tsiapa ABSTRACT The aim of the present project is the in vivo evaluation of quantitative monitoring of angiogenesis making use of the molecular imaging methodology. A new cyclic RGDfK (Arg- Gly-Asp-D-Phe Lys) derivative, namely the crgdfk-orn 3 -CGG, was evaluated as eventually promising in early tumor detection through specifically targeting integrin α ν β 3 receptors, overexpressed in angiogenesis. This new peptide, availing the 99m Tc-chelating moiety CGG (Cys-Gly-Gly), is appropriately designed for 99m Tc-labeling, as well as consequent conjugation onto nanoparticles. Specifically, RGD-conjugated iron oxide nanoparticles (10±2 nm) have been developed appropriately for SPECT/MRI imaging and hyperthermia treatment. Particularly, they were evaluated as tumor imaging agents: 99m Τc-RGD (crgdfk-orn 3 -CGG), 99m Τc-NPs and 99m Τc-NPs-RGD. The new derivatives were examined with regard to their radiochemical, radiobiological and imaging characteristics. It has been demonstrated that they were obtained in high radiochemical yield and presented high in vitro stability being examined: a) at different time-points, b) in the presence of an excess of antagonist moites for 99m Tc, c) in human plasma or serum. The in vivo study and the biodistribution evaluation of radiolabeled products were assessed in normal mice and in pathological models (scid mice) bearing experimental U87MG glioblastoma tumors. Τhe quantitative evaluation of angiogenesis spatial distribution confirmed high specific binding of the 99m Tc-RGD peptides to α ν β 3 integrins, with significantly high tumor uptake 11.60±3.06 % ID/g, while targeting with 99m Tc-NPs-RGD demonstrates high tumor uptake 9.01±0.19 ID/g. The 99m Tc-RGD was appropriately designed to have urine excretion due to the ornithine (Orn 3 ) linker, while the 99m Tc-NPs exhibits hepatobiliary excretion, compared to 99m Tc-NPs-RGD, which exhibit lower values of liver uptake with a significantly higher kidney uptake, which can be attributed to the attachment of the RGD derivative on the surface of NPs. Satisfactory tumor images were obtained with the radiolabeled derivatives 99m Tc-RGD and 99m Τc-NPs. Finally, the in vivo heating efficiency experiment showed that hyperthermia induction with the aid of iron oxide NPs was feasible, resulting to anti-tumor effect in a U87MG tumor-bearing mouse. The above preliminary results indicate that targeted iron oxide NPs are promising 9

20 candidates for the quantitative monitoring of angiogenesis for molecular imaging and potential cancer therapy. 10

21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

22 1. Μοριακή απεικόνιση Η μοριακή απεικόνιση (molecular imaging) έχει ευρέως οριστεί ως ο in vivo χαρακτηρισμός και η ποσοτικοποίηση των βιολογικών διεργασιών σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο [1]. Ανιχνεύει μοριακές ανωμαλίες που αποτελούν αιτία για την εκδήλωση μιας ασθένειας, σε αντιδιαστολή με την «κλασική» διαγνωστική απεικόνιση που αναδεικνύει το αποτέλεσμα αυτών των μοριακών αλλαγών. Η Μοριακή Απεικόνιση έχει ως στόχο την in vivo μη επεμβατική παρακολούθηση βιολογικών διαδικασιών και βασίζεται στην απεικόνιση βιοσημαντών που διαφοροποιούν μια παθολογική από την αντίστοιχη φυσιολογική κατάσταση. Κάνει χρήση ειδικών μοριακών ανιχνευτών και αναδεικνύει τους υπευθύνους για τη νόσο μοριακούς μηχανισμούς. Η διαδικασία περιλαμβάνει την σήμανση ενώσεων με ιχνηθέτες, όπως τα μόρια φλουοροσκεΐνης, ραδιενεργά άτομα ή παραμαγνητικά ιόντα και την εισαγωγή τους στον ζωντανό, υπό εξέταση οργανισμό. Οι ενώσεις αυτές αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες (συνήθως κυτταρικούς υποδοχείς ή ένζυμα) ή γονίδια, οι οποίες αποτελούν τους «μοριακούς στόχους» που εμπλέκονται στις υπο μελέτη βιολογικές πορείες/ βιοχημικά μονοπάτια Τεχνικές Μοριακής Απεικόνισης Η Μοριακή Απεικόνιση, με την εξαιρετική ευαισθησία των μεθόδων της, αποτελεί μια πρώτης τάξης μεθοδολογία για την απεικόνιση της κυτταρικής βιοχημείας in vivo. Συγκεκριμένα, στη διαγνωστική απεικόνιση του καρκίνου, οι παράγοντες που σχετίζονται με την αντίθεση της εικόνας (contrast) διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην ενίσχυση αυτής της αντίθεσης εικόνας μεταξύ των φυσιολογικών ιστών και των όγκων. Μερικές από τις υπάρχουσες τεχνολογίες για την απεικόνιση του καρκίνου περιλαμβάνουν τις μη επεμβατικές τεχνικές απεικόνισης, όπως την Υπολογιστική Τομογραφία (Computed Tomography, CT), την Μαγνητική Τομογραφία (Magnetic Resonance Imaging, MRΙ), την Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίων (Positron Emission Tomography, PET), την Υπολογιστική Τομογραφία Μονοφωτονικής Εκπομπής (Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT), το Υπερηχογράφημα (Ultrasound, US), και την οπτική απεικόνιση για μικροσκοπική ανίχνευση των όγκων. Καθεμία από τις τεχνικές μοριακής απεικόνισης χαρακτηρίζεται από τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά της. Οι ραδιοϊσοτοπικές τεχνικές (SPECT/Planar imaging, PET) οι οποίες υπερτερούν σε ευαισθησία και υστερούν σε διακριτική ικανότητα 12

23 σε σχέση με το MRI και το CT, δίνουν τη δυνατότητα ανίχνευσης πολύ μικρών συγκεντρώσεων επισημασμένων ενώσεων. Η διαπίστωση κυτταρικών ή/και μοριακών διαταραχών σε πρώιμο στάδιο με τις τεχνικές της μοριακής απεικόνισης δίνει τη δυνατότητα έγκαιρης και αποτελεσματικής θεραπευτικής παρέμβασης και επιτρέπει την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπευτικής αγωγής. Οι ραδιοϊσοτοπικές τεχνικές αποτελούν τις μεθόδους επιλογής για την απεικόνιση των εν λόγω μοριακών στόχων Πυρηνική Ιατρική Η πυρηνική ιατρική είναι ο κλάδος της ιατρικής που ασχολείται με τη διάγνωση και τη θεραπεία ασθενειών, με χρήση ραδιενεργών ισοτόπων (ραδιονουκλιδίων), τα οποία διασπώνται με την πάροδο του χρόνου, με εκπομπή ακτινοβολίας. Αναλυτικότερα, η ραδιενεργός διάσπαση είναι η διαδικασία κατά την οποία ένας ασταθής πυρήνας χάνει ενέργεια εκπέμποντας σωματίδια ή/και Ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Το αποτέλεσμα είναι ότι ο αρχικός (μητρικός) πυρήνας, πίπτει σε διαφορετικό (θυγατρικό) πυρήνα. Τα ραδιοφάρμακα (radiopharmaceuticals ή radioactive drugs) αποτελούν ανόργανες ή οργανικές ενώσεις ραδιονουκλιδίων (ιχνηθετών), με κατάλληλες φυσικοχημικές και βιολογικές ιδιότητες ώστε να μπορούν να χορηγηθούν στον άνθρωπο με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα στο πλαίσιο διάγνωσης ή θεραπείας στην πυρηνική ιατρική. Τα ραδιοφάρμακα χρησιμοποιούνται κυρίως στη διάγνωση διαφόρων ασθενειών και σε μικρότερο ποσοστό ως μέσα θεραπείας. Οι ραδιοφαρμακευτικές ενώσεις χορηγούμενες στον οργανισμό παρουσιάζουν εκλεκτική εντόπιση σε ένα όργανο ή ιστό του σώματος [2]. Η εκλεκτική αυτή εντόπιση οφείλεται στη συμμετοχή του ραδιοφαρμάκου σε ορισμένους βιολογικούς μηχανισμούς και είναι αποτέλεσμα τις περισσότερες φορές κατάλληλου σχεδιασμού της χημικής δομής του μορίου. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ραδιοφαρμάκων, όπως το μέγεθος του μορίου, το φορτίο, η λιποφιλικότητα, κ.λ.π. είναι καθοριστικές για την εκλεκτική πρόσληψη και καθήλωση των ραδιοφαρμάκων στο όργανοστόχο [3,4]. Η κατάλληλη φαρμακοτεχνική μορφή (π.χ. η διαμόρφωση του ραδιονουκλιδίου σε κολλοειδή ή συσσωματώματα με τη βοήθεια εκδόχων) μπορεί επίσης να κατευθύνει ένα ραδιοφάρμακο στο όργανο-στόχο. Έτσι ανάλογα με τις φυσικοχημικές ή βιολογικές ιδιότητες του ραδιοφαρμάκου, αυτό καθηλώνεται για μικρό ή μεγάλο χρονικό διάστημα, 13

24 στα διάφορα όργανα ή ιστούς μεταφέροντας δόση ακτινοβολίας στο όργανο-στόχο. Η ακτινοβολία αυτή ανάλογα με το είδος της, δρα είτε θεραπευτικά, είτε ανιχνεύεται εξωτερικά με κατάλληλη ανιχνευτική διάταξη και χρησιμεύει για τη μελέτη της μορφολογίας, της λειτουργικότητας του οργάνου, ή τον εντοπισμό κάποιας βλάβης Ραδιοϊσότοπα στην Πυρηνική Ιατρική «Διαγνωστικά» ραδιοϊσότοπα Στη διαγνωστική πυρηνική ιατρική τα ραδιοφάρμακα χορηγούνται ενδοφλέβια ή από το στόμα, και απεικονίζουν τις παθολογικές εστίες, εκπέμποντας σήμα ραδιενέργειας που ανιχνεύεται από ειδικές εξωτερικές απεικονιστικές διατάξεις [4]. Μετά την χορήγηση του ραδιοφαρμάκου στον ασθενή, η μελέτη του ρυθμού και του τρόπου εντόπισης ή και απομάκρυνσής του από το όργανο/στόχο ή τον ιστό παρέχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την φυσιολογία/λειτουργικότητα του υπό μελέτη οργάνου. Τα ραδιοφάρμακα φέρουν στο μόριό τους ραδιονουκλίδιο που εκπέμπει ακτινοβολία γ, β - ή β +, όπως 99m Tc, 201 Tl, 131 I, 18 F κλπ. Κατάλληλα για εφαρμογή στον τομέα της διάγνωσης (SPECT/PET απεικόνιση) είναι τα ραδιοϊσότοπα που εκπέμπουν ακτινοβολία γ, χωρίς να συνοδεύονται από α ή β σωματιδιακή εκπομπή, με σχετικά μικρό χρόνο ημιζωής και αποδιέγερση σε ένα σταθερό θυγατρικό νουκλίδιο. Στον Πίνακα αναφέρονται τα πιο συνήθη ραδιοϊσότοπα που βρίσκουν εφαρμογή στην διαγνωστική πυρηνική ιατρική και τα πυρηνικά χαρακτηριστικά τους. Πίνακας : Ραδιοϊσότοπα με εφαρμογή στη ραδιοσπινθηρογράφηση. Ραδιοϊσότοπο Χρόνος Ημιζωής (t 1/2 ) Εκπεμπόμενη Ακτινοβολία (MeV) 131 I 123 I 111 In 67 Ga 99m Tc 64 Cu 201 Tl 18 F 8,04 d 13,27 h 2,8 d 3,26 d 6,03 h 12,7 h 3,04 d 110 min γ (0,364), β - (0,6) γ (0,159) γ (0,245, 0,171) γ (0,093, 0,185, 0,3) γ (0,141) γ (1,346), β - (0,578), β + (0,653) EC (ακτίνες-χ: 0,069-0,083, 0,135, 0,167) β+ (0,664), EC(0,511) EC: electron capture (σύλληψη ηλεκτρονίου) 14

25 Όπως καταγράφεται στον πίνακα, σε αυτά συμπεριλαμβάνονται το ιώδιο-131 ( 131 I), το ιώδιο-123 ( 123 I), το ίνδιο-111 ( 111 In) και το τεχνήτιο-99m ( 99m Tc). Αν και το 131 I έχει χρησιμοποιηθεί στη ραδιοσπινθηρογράφηση, το υψηλό ενεργειακό του επίπεδο (364 ΚeV) οδηγεί σε μη ικανοποιητική ποιότητα απεικόνισης και σε υψηλές δόσεις ακτινοβολίας. Αντίθετα, το ενδιάμεσο ενεργειακό επίπεδο του 123 I (159 kev) έχει σαν αποτέλεσμα απεικόνιση μεγάλης ευκρίνειας και με χαμηλότερες δόσεις ακτινοβολίας [5]. Το πιο χαρακτηριστικό ραδιοϊσότοπο της τεχνικής PET είναι το 18 F (t 1/2 = min). Το ραδιοφάρμακο [ 18 F]FDG (FluoroDeoxyGlucose), αποδείχτηκε σημαντικό στη διάγνωση, καθώς συνεισφέρει σημαντικά στην κατανόηση των αντιδράσεων του εγκεφάλου σε βιοχημικό επίπεδο. Άλλα ραδιοϊσότοπα αυτής της κατηγορίας είναι τα: 11 C ( t 1/2 = 20.3 min), 13 N (t 1/2 = 9.9 min), 18 O (t 1/2 = 123 sec). Σήμερα ραδιοϊσότοπο επιλογής είναι το 99m Tc, το οποίο βρίσκει μεγάλη εφαρμογή στην πυρηνική ιατρική [6]. Τέλος, το 111 In αποτελεί ένα επίσης κατάλληλο ραδιοϊσότοπο καθώς εκπέμπει ακτίνες γ, εντός του ενεργειακού εύρους των ανιχνευτών που συνήθως χρησιμοποιούνται «Θεραπευτικά» ραδιοϊσότοπα Στη θεραπεία με ραδιοϊσότοπα, είτε αυτή γίνεται με πεπτίδια είτε μέσω άλλων επισημασμένων παραγόντων (μονοκλωνικά αντισώματα, σύμπλοκα μετάλλων κ.ά.), στόχο αποτελεί το καλύτερο δυνατό θεραπευτικό αποτέλεσμα, δηλαδή η συρρίκνωση ή η καταστροφή του όγκου με τη μικρότερη δυνατή επιβάρυνση των γύρω ιστών από την ακτινοβολία. Αυτό μπορεί να εκτιμηθεί βάσει της θεραπευτικής αναλογίας. Ο όρος «θεραπευτική αναλογία» αναφέρεται στην κατανομή (ποσοστό) του ραδιοεπισημασμένου παράγοντα μεταξύ του ιστού όπου υπάρχει η οργανική βλάβη, ο οποίος καλείται ιστόςστόχος (target tissue, T) και των γειτονικών φυσιολογικών ιστών (normal tissues ή nontarget tissues, NT). Είναι ευνόητο ότι κατά τη θεραπεία αποσκοπούμε στη μέγιστη δυνατή θεραπευτική αναλογία (Τ/ΝΤ). Τα ραδιοϊσότοπα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία (Πίνακας ) διασπώνται σύμφωνα με έναν από τους ακόλουθους τρόπους: i) με εκπομπή σωματιδίων β, ii) με εκπομπή σωματιδίων α, iii) με σύλληψη ηλεκτρονίου και εκπομπή ηλεκτρονίων Auger ή εσωτερικής μετατροπής. Κάθε τύπος σωματιδίων που εκπέμπεται έχει διαφορετική εμβέλεια στους ιστούς και διαφορετικά επίπεδα γραμμικής ενέργειας μεταφοράς (LET: 15

26 Linear Energy Transfer). Τα σωματίδια α έχουν υψηλή LET και καταστρέφουν τα κύτταρα. Καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται όταν τα σωματίδια αυτά εντοπίζονται στον πυρήνα του κυττάρου. Την ίδια επίδραση έχουν και τα ηλεκτρόνια Auger και εσωτερικής μετατροπής. Τα σωματίδια β έχουν μεγαλύτερη εμβέλεια από τα παραπάνω σωματίδια, αλλά χαμηλότερη LET και για το λόγο αυτό οι προϋποθέσεις εφαρμογής τους είναι λιγότερο απαγορευτικές από εκείνες των υπόλοιπων σωματιδίων. Πολλές από τις παραπάνω διασπάσεις μπορεί να συνοδεύονται από ταυτόχρονη εκπομπή ακτινοβολίας γ, κάτι που επιτρέπει τη μελέτη της in vivo κατανομής του ραδιοσκευάσματος, αλλά παράλληλα αυξάνει τη ραδιενεργό δόση που κατανέμεται σε ολόκληρο τον οργανισμό, προκαλώντας άσκοπη ακτινοβόληση των φυσιολογικών ιστών [7-8]. Όσον αφορά το χρόνο ημιζωής του ραδιοϊσοτόπου, αυτός θα πρέπει να ανταποκρίνεται στην in vivo φαρμακοκινητική του ραδιοεπισημασμένου φορέα [7-9]. Πίνακας : Ραδιοϊσότοπα με εφαρμογή στη θεραπεία. Ραδιοϊσότοπο Χρόνος Ημιζωής (t 1/2 ) Τρόπος Διάσπασης 32 P 14.3 d β Re 0.71 d β - & γ 153 Sm 1.95 d β - & γ 177 Lu 6.7 d β - & γ 125 I 60.1 d EC 90 Υ 2.7 d β - EC: electron capture (σύλληψη ηλεκτρονίου) 2. Σπινθηρογραφική μελέτη με SPECT 2.1. Ανίχνευση φωτονίων με γ-camera Η SPECT είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος απεικόνισης της Πυρηνικής Ιατρικής. Περισσότερα από 50 SPECT ραδιοφάρμακα είναι σήμερα γνωστά με χρόνους ημιζωής από 6 ώρες έως 8 ημέρες και ενέργεια φωτονίων που κυμαίνεται από 70 έως 606 kev. Εξέχουσα θέση ανάμεσα σε όλα τα ραδιονουκλίδια που χρησιμοποιούνται κατέχει το 99m Tc λόγω των εξαιρετικών φυσικών ιδιοτήτων που το χαρακτηρίζουν (Πίνακας 2.1.1). Πάνω από 85% των εξετάσεων που γίνονται σήμερα στην πυρηνική ιατρική χρησιμοποιούν ραδιοφάρμακα με 16

27 βάση το 99m Tc [10]. Το SPECT μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μελέτες χορήγησης πολλαπλών ραδιοϊχνηθετών στον ίδιο ασθενή μιας και το σύστημα ανίχνευσης που χρησιμοποιείται μπορεί να διαχωρίσει τις ενέργειες διαφορετικών ραδιονουκλιδίων [11]. Πίνακας 2.1.1: Τα σημαντικότερα ραδιονουκλίδια με εφαρμογή στην τεχνική SΡΕCΤ. Ραδιονουκλίδιο t1/2(h) Τρόπος διάσπασης (%) Ενέργεια διάσπασης (kev) Τρόπος παραγωγής 99m Tc 6,02 γ, ΙΤ 140 Γεννήτρια 99 Mo/ 99m Tc 111 In 67,2 Auger e -, EC 172, 247 Κυκλοτρόνιο 67 Ga 78,1 γ, EC 93, 185, 300 Κυκλοτρόνιο 123 I 13 γ, EC 159 Κυκλοτρόνιο 131 I 192,5 γ, ΙΤ 364, 606 Αντιδραστήρας 201 Tl 73 γ, EC 135, 167 Κυκλοτρόνιο Δεν συμπεριλαμβάνεται η εκπομπή ακτίνων-χ που συνοδεύει την EC διάσπαση. IT (Internal Transmission): Εσωτερική μετάπτωση, β - : σωματιδιακή ακτινοβολία Σύστημα microspect Στο SPECT γίνεται χορήγηση ραδιοφαρμάκου στον ασθενή, το οποίο συγκεντρώνεται επιλεκτικά στους προς εξέταση ιστούς. Τα ραδιονουκλίδια που χρησιμοποιούνται εκπέμπουν ακτίνες γάμμα χαμηλών σχετικά ενεργειών. Τοποθετώντας ένα κατευθυντήρα μεταξύ ανιχνευτή και δείγματος, μόνο τα φωτόνια που ταξιδεύουν σε κατεύθυνση παράλληλη προς τις οπές του κατευθυντήρα μπορούν και τον διαπερνούν και φτάνουν σε μία σειρά από φωτοευαίσθητους κρυστάλλους. Οι κρύσταλλοι με τη σειρά τους ενεργοποιούν φωτοπολλαπλασιαστές και μπορεί να εντοπιστεί το σημείο από όπου προήλθαν οι ακτίνες γάμμα. Αν ο ανιχνευτής περιστρέφεται γύρω από το αντικείμενο, τότε έχουμε ένα σύστημα τομοσπινθηρογραφίας SPECT και λαμβάνουμε τομογραφικές εικόνες. Το υπό εξέταση όργανο διαχωρίζεται με τη βοήθεια υπολογιστή σε ξεχωριστές, επίπεδες επιφάνειες (τομές-slices) και ανιχνεύονται τα φωτόνια τα προερχόμενα από κάθε μία επιφάνεια χωριστά. Κάθε ανιχνευτής, συνδεόμενος με κατευθυντήρα παράλληλων οπών, δίνει δισδιάστατες προβολές, οι οποίες συνδυαζόμενες κατάλληλα σε υπολογιστή, επιτρέπουν την κατασκευή εγκάρσιας εικόνας, που αναπαριστά την κατανομή του ραδιοφαρμάκου στο υπό μελέτη όργανο και επιτρέπει την αξιολόγηση της μορφολογίας και της λειτουργικότητάς του [1, 4-6]. Με τη μέθοδο αυτή οι πληροφορίες που λαμβάνονται 17

28 μπορεί να είναι σε τρεις διαστάσεις, αν και κατά κανόνα λαμβάνεται σειρά εικόνων δύο διαστάσεων του οργάνου. Είναι επίσης δυνατός ο ακριβής προσδιορισμός της θέσης και της έκτασης της βλάβης του οργάνου και παρέχεται η δυνατότητα προσδιορισμού της ποσοστιαίας πρόσληψης του ραδιοσκευάσματος σε μια οποιαδήποτε περιοχή του. [9]. Οι βασικοί περιορισμοί της πυρηνικής ιατρικής είναι, ο υψηλός θόρυβος (background) και η σχετικά περιορισμένη διακριτική ικανότητα και ευαισθησία των κλινικών συστημάτων. Επιπλέον, το μεγάλο μέγεθος των συμβατικών συστημάτων, τα οποία προορίζονται για ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών, δεν ευνοεί τη λεπτομερή απεικόνιση οργάνων μικρών διαστάσεων. Για το λόγο αυτό, έχουν αναπτυχθεί εξειδικευμένα συστήματα απεικόνισης, τα οποία βασίζονται τόσο σε τροποποιήσεις της υπάρχουσας τεχνολογίας, όσο και σε καινοτόμες μεθόδους και υποκαθιστούν τα συμβατικά συστήματα της επίπεδης και της τομογραφικής γ-κάμερα τύπου SPECT [12]. Ένα τυπικό σύστημα γ-κάμερα αποτελείται από: (1) Κατευθυντήρα. Ο κατευθυντήρας επιτρέπει την είσοδο και καταγραφή των φωτονίων εκείνων που κινούνται σε κατεύθυνση παράλληλη προς τις οπές του, οι οποίες βρίσκονται σε διάταξη πλέγματος και έχουν συνήθως εξαγωνικό σχήμα. Το υλικό κατασκευής του είναι συνήθως το βολφράμιο, το οποίο απορροφά τα φωτόνια που δεν κινούνται παράλληλα με τις οπές του. Ο κατευθυντήρας είναι υψηλής διακριτικής ικανότητας με οπές διαμέτρου συνήθως 0,5-1 mm (για απεικόνιση μικρών ζώων). (2) Κρύσταλλο, ο οποίος είναι διακριτοποιημένος σε μικρές κυψελίδες διαστάσεων 1x1 mm 2 έως 3x3 mm 2, ανάλογα με τις εφαρμογές του κάθε συστήματος. Το πλεονέκτημα των διακριτοποιημένων κρυστάλλων είναι ότι ο σπινθηρισμός που δημιουργείται στον κρύσταλλο, δεν διαχέεται σ αυτόν, με αποτέλεσμα να παράγεται εστιασμένο φως. (3) Χωρικά ευαίσθητος φωτοπολλαπλασιαστής (position sensitive photomultiplier tube PSPMT) τετραγωνικής διατομής. Όταν το οπτικό φως προσπίπτει στη φωτοκάθοδο του PSPMT πολλαπλασιάζεται σε ένα σύστημα δυνόδων (οι νέοι PSPMT έχουν δυνόδους μεταλλικών καναλιών). Τελικά στην άνοδο φτάνει ένα ηλεκτρονιακό νέφος από όπου λαμβάνεται ένας αριθμός σημάτων. Τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα των συστημάτων που βασίζονται σε PSPMT είναι: α) η άριστη χωρική διακριτική ικανότητα, που φτάνει στο 1 mm, β) το μικρό τους μέγεθος και γ) το σχετικά χαμηλό τους κόστος. 18

29 (4) Ηλεκτρονικές μονάδες ή κάρτες. Με τις κάρτες αυτές τα σήματα ενισχύονται, ψηφιοποιούνται και μεταφέρονται σε υπολογιστή όπου μετά από διάφορα στάδια επεξεργασίας έχουμε τελικά απεικόνιση. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιείται το πρότυπο σύστημα microspect, εγκατεστημένο στο Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α. του Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «Δημόκριτος» [12]. Στην Εικόνα βλέπουμε τη μονάδα του πρότυπου συστήματος microspect με γ-κάμερα μικρού πεδίου (5x10 cm), "Mouse Sized camera", η οποία σχεδιάστηκε και συναρμολογήθηκε στο ΕΜΠ και στo ΤΕΙ Αθήνας. Το πεδίο της έχει κατάλληλες διαστάσεις ώστε να είναι δυνατή η ολόσωμη απεικόνιση ενός ποντικιού και η πραγματοποίηση δυναμικών μελετών κατανομής σε κάτοψη. Με τη βοήθεια του παραπάνω σπινθηρογραφικού συστήματος λήφθηκαν εικόνες (με ρυθμό 1 εικόνα/2 min) της μεταβολής της συγκέντρωσης στις περιοχές ενδιαφέροντος, όπως στον όγκο και σε ολόκληρο το σώμα του ζώου. Η πειραματική γ-κάμερα αποτελείται από: (1) 2 χωρικά ευαίσθητους PSPMT Hamamatsu H8500 τετράγωνου πεδίου (52 mm x 52 mm) και πάχους 34 mm. (2) διακριτοποιημένο κρύσταλλο NaI (Bicron-St. Gobain). Κάθε κυψελίδα του κρυστάλλου έχει διαστάσεις 1 mm x 1 mm x 5 mm. Οι εξωτερικές έχουν πλάτος 2 mm για σταθερότητα. (3) Κατευθυντήρα μολύβδου παράλληλων εξαγωνικών οπών. (4) Παράθυρο εισόδου από γραφίτη πάχους 0.5 mm. (5) Περίβλημα από βολφράμιο πάχους 8 mm. Η ανάγνωση σημάτων πραγματοποιείται με χρήση 2 καρτών PCI6110 ADCs 4 καναλιών (National Instruments). Η ενεργειακή διακριτική ικανότητα είναι ~15% και η ευαισθησία έχει βρεθεί γύρω στα 5000 κρούσεις/min/mci/cm 2. H καταλληλότερη υψηλή τάση (HV) για τη λειτουργία του συστήματος βρέθηκε ότι για το 99m Tc είναι τα 795 V. Η τάση αυτή επιλέχθηκε, έτσι ώστε να είναι αρκετά χαμηλή για την αποφυγή του θορύβου από τη λειτουργία και αρκετά υψηλή, ώστε να επιτυγχάνεται καλός λόγος σήματος προς θόρυβο (Signal to Noise Ratio SNR). 19

30 Εικόνα 2.2.1: Σύστημα microspect Απεικόνιση μικρών ζώων Για την απεικόνιση μικρών ζώων χρησιμοποιείται γ-camera με χρήση παράλληλου κατευθυντήρα ή κατευθυντήρα οπής (pinhole collimator). Το πρότυπο σύστημα τομογραφικής απεικόνισης παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, τα οποία συνοψίζονται στη μικρή απόσταση μεταξύ της απεικονιστικής διάταξης και του πειραματόζωου, στην υψηλή διακριτική ικανότητα, την υψηλή ευαισθησία, το μικρό βάρος και τη δυνατότητα μεταφοράς του όλου απεικονιστικού συστήματος. Η τυπική τοποθέτηση ενός πειραματόζωου στην πειραματική διάταξη παρουσιάζεται στην Εικόνα Το πειραματόζωο αμέσως μετά την χορήγηση του προς μελέτη ραδιοσκευάσματος και τη νάρκωσή του, τοποθετείται με προσοχή στο κέντρο του πεδίου της γ-camera. Ακολούθως συλλέγονται συνεχώς δεδομένα και λαμβάνονται διαδοχικές εικόνες ανά 2 min (ή περισσότερο), έτσι ώστε να απεικονιστεί η χωρική κατανομή του ραδιοεπισημασμένου μορίου μέσα στον οργανισμό σε διαδοχικές χρονικές στιγμές και με ικανοποιητική στατιστική. 20

31 Εικόνα 2.3.1: Τυπική τοποθέτηση του πειραματόζωου (μυός) στην πειραματική γ-camera που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη m Tc και ιατρική διάγνωση 3.1 Εφαρμογή του 99m Tc στην Ιατρική Το 99m Tc θεωρείται το πιο κατάλληλο ραδιονουκλίδιο για απεικόνιση στην Πυρηνική Ιατρική. Tα πλεονεκτήματα του 99m Tc σε σύγκριση με άλλα ραδιονουκλίδια, είναι ο μικρός χρόνος υποδιπλασιασμού, η εκπομπή γ ακτινοβολίας ενέργειας 140 ΚeV (που θεωρείται κατάλληλη για εξωτερικές μετρήσεις) και η απουσία ακτινοβολίας σωματιδιακής φύσης. Ο χρόνος ημιζωής του 99m Tc (t 1/2 =6,03 h) θεωρείται κατάλληλος για την παρασκευή βραχύβιων ραδιοφαρμάκων ενώ παράλληλα, και σε συνδυασμό με την έλλειψη ακτινοβολίας β -, επιτρέπει την χορήγηση σημαντικής ποσότητας του ραδιοϊσοτόπου στον ασθενή χωρίς ιδιαίτερη δοσιμετρική επιβάρυνσή του. Στα πλεονεκτήματα αυτά προστίθεται και το μικρό κόστος παρασκευής του 99m Tc, καθώς και η εύκολη διαθεσιμότητα για καθημερινή χρήση σε μονάδες Πυρηνικής Ιατρικής. Οι φυσικές ιδιότητες του 99m Tc, επιτρέπουν τη λήψη σπινθηρογραφικών εικόνων καλής ποιότητας με ταυτόχρονα περιορισμένη ακτινοβόληση του ασθενούς. Επίσης η ανάπτυξη ραδιοσκευασμάτων του 99m Tc για την απεικόνιση όγκων ανοίγει τον δρόμο για την ανάπτυξη θεραπευτικών ραδιοφαρμάκων του 186 Re και 188 Re, λόγω των κοινών χημικών ιδιοτήτων που παρουσιάζουν αυτά τα στοιχεία. 21

32 3.2. Παραγωγή του 99m Tc Γεννήτρια 99 Mo/ 99m Tc Για την διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε το 99m Tc το οποίο προέρχεται από διάσπαση του μολυβδαινίου 99 Μο. Ένα τμήμα των πυρήνων του 99 Μο μετατρέπεται άμεσα σε 99 Tc. Στο 86% όμως των πυρήνων παράγει ένα μεταβολικά σταθερό ενδιάμεσο προϊόν, το 99m Tc. Αυτό σημαίνει πως οι πυρήνες μολυβδαινίου, αφού αποδώσουν ένα ηλεκτρόνιο, παραμένουν για ένα συγκεκριμένο διάστημα σε κατάσταση διέγερσης. Με την εκπομπή γ ακτινοβολίας οι πυρήνες του 99m Tc, με χρόνο υποδιπλασιασμού 6 ώρες, μεταπίπτουν σε 99 Tc. Το 99 Tc έχει χρόνο υποδιπλασιασμού αρκετά χρόνια και με τη σειρά του μεταπίπτει στο σταθερό 99 Ru. Το 99 Tc λόγω του μεγάλου χρόνου υποδιπλασιασμού του, μπορεί να θεωρηθεί για τον ασθενή ως σταθερό, σχετικά με τη δόση ακτινοβολίας. Το 99m Tc παράγεται σε γεννήτρια του ραδιονουκλιδίου. Στη γεννήτρια υπάρχει 99 Μο προσροφημένο σε οξείδιο του αλουμινίου σε χρωματογραφική στήλη. Το 99m Tc που παράγεται κατά τη ραδιενεργό μετατροπή υπάρχει στη γεννήτρια υπό τη μορφή μη συνδεδεμένων υπερτεχνητικών ιόντων (Pertechnetate, TcO - 4 ). Για την παραγωγή του ραδιονουκλιδίου 99m Tc στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν γεννήτριες με χρόνο ισχύος περίπου 20 ημέρες μετά από την πρώτη έκλουση. Οι εκλούσεις της γεννήτριας λαμβάνουν χώρα περίπου κάθε 24 h. Η διεξαγωγή των πειραμάτων επισήμανσης με χρήση 99m Τc πραγματοποιήθηκαν στο Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α. του Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «Δημόκριτος». Το 99m Τc λαμβάνεται σε αποστειρωμένη μορφή από γεννήτριες 99 Μο- 99m Τc (Εικόνα 3.2.1). Η γεννήτρια είναι κλειστού τύπου και περιέχει χρωματογραφική στήλη μικρών διαστάσεων, με προσροφητικό υλικό Al 2 O 3. Το 99 Μο βρίσκεται κατάλληλα προσροφημένο στον ιοντοανταλλάκτη υπό τη μορφή διαλύματος μολυβδαινικών ανιόντων. Το 99 Μο κατά τη διάσπασή του παράγει 99m Τc, το οποίο διαχωρίζεται από το 99 Μο με έκλουση της στήλης με στείρο διάλυμα φυσιολογικού ορού (0.9% NaCl). Για τον σκοπό αυτό, φιαλίδιο πενικιλίνης που περιέχει το διάλυμα του ορού φέρεται στο ένα από τα δύο άκρα της γεννήτριας και καρφώνεται σε δύο βελόνες που υπάρχουν εκεί. Στο άλλο άκρο, όπου υπάρχει μία βελόνα, τοποθετείται δεύτερο φιαλίδιο, το οποίο είναι σφραγισμένο υπό κενό (φιαλίδιο εκλούσεως). Η μία από τις δύο βελόνες, οι οποίες βρίσκονται στο πρώτο φιαλίδιο, οδηγεί τον ορό στη χρωματογραφική στήλη, ενώ η άλλη διοχετεύει σε αυτό αέρα, ο οποίος περνά από βακτηριοστατικό φίλτρο, με σκοπό την εξισορρόπηση της ατμοσφαιρικής πίεσης μέσα στο φιαλίδιο. Κατά την έκλουση το 99m Τc παραλαμβάνεται 22

33 εκλεκτικά στο φιαλίδιο έκλουσης με τη μορφή διαλύματος Na 99m TcO 4. Μετά την έκλουση προσδιορίζεται η συνολική ενεργότητα του εκλούσματος σε μετρητή ακτινοβολίας τύπου φρέατος. Εικόνα 3.2.1: Σχηματική παράσταση γεννήτριας 99 Μο- 99m Τc Αξιολόγηση της απόδοσης επισήμανσης με Χρωματογραφικές Τεχνικές Οι χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης, εφαρμοζόμενες επί πολλά χρόνια, είναι ευρέως διαδεδομένες και καθολικά αναγνωρισμένες. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ή πίεσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) αποτελεί την εξέλιξη της χρωματογραφίας στήλης, η οποία εκτός από το διαχωρισμό των συστατικών, παρέχει ταυτόχρονα ποσοτικά στοιχεία της σύστασης του υπό εξέταση δείγματος, δηλαδή αποτελεί αναλυτική μέθοδο που προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των άλλων χρωματογραφικών τεχνικών. Η μεγάλη ποικιλία των υλικών πλήρωσης των στηλών (στερεά φάση), καθώς και ο μεγάλος αριθμός των πιθανών συστημάτων έκλουσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στις χρωματογραφικές μεθόδους ανάλυσης δίνει την δυνατότητα στην τεχνική αυτή να χρησιμοποιηθεί τόσο στην ποσοτική όσο και στην ποιοτική ανάλυση μορίων και βιομορίων. Τα πλεονεκτήματα αυτά σε συνδυασμό με το γεγονός, ότι αφ ενός δεν απαιτείται μετατροπή του προς ανάλυση δείγματος σε παράγωγα, αφ ετέρου ότι δεν 23

34 καταστρέφεται το δείγμα, έχει καταστήσει την HPLC μια από τις βασικότερες μεθόδους ανάλυσης [13]. Οι κύριες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τον ραδιοχημικό έλεγχο επισημασμένων προϊόντων είναι η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) και η HPLC. - Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC): Στο διάλυμα στο οποίο βρίσκεται το ραδιοεπισημασμένο προϊόν συνήθως υπάρχει και μια ποικιλία παραπροϊόντων π.χ. 99m TcO 4, 99m Tc-κολλοειδή, διάφορα οξείδια του 99m Tc, κ.α. Με τη βοήθεια της TLC επιτυγχάνεται συνήθως ο διαχωρισμός των προϊόντων αυτών απλά και γρήγορα. Η κινητή φάση της χρωματογραφίας αποτελείται από έναν οργανικό διαλύτη (π.χ. ακετόνη, αιθανόλη, μεθυλοαιθυλοκετόνη, ισοπροπυλική αλκοόλη) και κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα. Κατά την χρωματογραφική ανάλυση, τα κολλοειδή του 99m Tc συνήθως παραμένουν στο σημείο εναπόθεσης του διαλύτη, τα ιόντα 99m TcO 4 πηγαίνουν στο μέτωπο του διαλύτη, ενώ το επισημασμένο βιομόριο μετακινείται στο μέσο του χρωματογραφικού χαρτιού. Πρέπει να τονιστεί ότι η TLC παρέχει πληροφορίες μόνο για την απόδοση της επισήμανσης αναφορικά προς όλες τις μορφές του 99m Tc ενώ δεν είναι κατάλληλη για τον προσδιορισμό της ραδιοχημικής καθαρότητας του επισημασμένου προϊόντος και την ανίχνευση και το διαχωρισμό ισομερών μορφών. - Αναλυτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC): Τα τελευταία χρόνια η HPLC έχει γίνει τεχνική ρουτίνας όσον αφορά στο ραδιοχημικό έλεγχο ραδιοεπισημασμένων προϊόντων. Οι διαλύτες ανάπτυξης που χρησιμοποιούνται στην ράδιο-hplc ποικίλουν: ακετονιτρίλιο, μεθανόλη, αιθανόλη, τριφθωροξικό οξύ, κ.α.. Ένα σύστημα HPLC περιλαμβάνει εξαρτήματα ή πλήρεις χρωματογραφικές μονάδες. Συνήθως αποτελείται από: 1. τις στήλες και τα εξαρτήματά τους (προσαρμογείς, φίλτρα, περιβλήματα, συσκευές ελέγχου) 2. τα συστήματα παροχής της κινητής φάσης ή τις αντλίες 3. τις δεξαμενές κινητής φάσης 4. τα συστήματα εισαγωγής δείγματος ή εγχυτήρες (που χρησιμοποιούνται για να εφαρμόσουν τα δείγματα υπό πίεση στη στήλη) 24

35 5. τους ανιχνευτές (για να μετρήσουν την παρουσία διαλυτών ουσιών) 6. το καταγραφικό σύστημα ή/και σύστημα υπολογιστή Ο ανιχνευτής αποτελεί ένα σημαντικό στοιχείο του συστήματος HPLC, γιατί κάνει ορατό το διαχωρισμό που γίνεται στη στήλη. Εάν ένας ανιχνευτής, ο οποίος αποκρίνεται στη συγκέντρωση των διαλυμένων ουσιών, τοποθετηθεί αμέσως μετά τη στατική φάση και στην έξοδο της στήλης προκειμένου να ανιχνευθούν οι ενώσεις όπως εξάγονται από τη στήλη, το σήμα του θα καταγραφεί ως συνάρτηση του χρόνου και θα λαμβάνεται σειρά κορυφών, όπως απεικονίζεται στην Εικόνα Η κορυφή (peak) που παρατηρείται καταγράφεται όταν μια ένωση εξέρχεται από τη στήλη. Ο χρόνος διατήρησης της κορυφής χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει την ένωση. Το ύψος κορυφής (peak height) (ή περιοχή) (peak area) είναι ανάλογο προς τη συγκέντρωση της ένωσης στο δείγμα. Το διάγραμμα αυτό ονομάζεται χρωματογράφημα (chromatogram) και είναι χρήσιμο τόσο για ποιοτική όσο και για ποσοτική ανάλυση. Οι θέσεις των κορυφών ως προς τον άξονα του χρόνου εξυπηρετούν την ταυτοποίηση των συστατικών του δείγματος και το εμβαδόν κάθε κορυφής αποτελεί ποσοτικό μέτρο κάθε συστατικού. Το εύρος ζώνης (bandwidth) και το ύψος των κορυφών μπορούν συνήθως να ρυθμιστούν καθώς επίσης και οι παράμετροι ανίχνευσης και ευαισθησίας. Εικόνα 3.3.1: Χρωματογράφημα αναλυτικής υγρής χρωματογραφίας (HPLC). Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιείται η αναλυτική στήλη αντιστρόφου φάσεως υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (reverse phase HPLC, RP-HPLC) και έχει σύστημα έκλουσης βαθμιαίας μεταβαλλόμενης σύστασης (gradient). Η ανίχνευση γίνεται με ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας συνδεόμενο με ανιχνευτή ραδιενέργειας για τον προσδιορισμό των επισημασμένων προϊόντων. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι η ικανότητά της να προσδιορίζει τη ραδιοχημική καθαρότητα του επισημασμένου προϊόντος και να διαχωρίζει όλες τις μορφές του 99m Tc που 25

36 περιλαμβάνονται στο διάλυμα επισήμανσης, καθώς και διαφορετικές ισομερείς μορφές π.χ. επιμερή και διαστερεοϊσομερή. Παρά τα προαναφερθέντα πλεονεκτήματα, η HPLC έχει και αυτή περιορισμούς, όπως για παράδειγμα το γεγονός ότι δεν μπορεί να ανιχνεύσει τα ραδιοεπισημασμένα κολλοειδή. Γι αυτό απαιτείται η εφαρμογή της σε συνδυασμό με την TLC για την εξαγωγή ολοκληρωμένων συμπερασμάτων. 4. Ιντεγκρίνες και αγγειογένεση στον καρκίνο 4.1. Αγγειογένεση Η αγγειογένεση, δηλαδή η δημιουργία αιμοφόρων αγγείων από ήδη υπάρχοντα, είναι απαραίτητη για την δημιουργία ενός κλειστού κυκλοφορικού συστήματος στο σώμα των οργανισμών για την παροχή οξυγόνου και εξασφάλιση της θρέψης στους ιστούς [14, 15]. Εμφανίζεται από πολύ νωρίς κατά τη διαδικασία ανάπτυξης του οργανισμού και διατηρείται σε κάποιες περιπτώσεις και κατά την ενήλικη ζωή [16]. Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης η αγγειογένεση διακρίνεται σε δύο φάσεις. Στην πρώτη φάση που ονομάζεται πρώιμη εμβρυϊκή αγγειογένεση (vasculogenesis), σχηματίζονται αγγεία που προέρχονται από in situ διαφοροποίηση των τοπικών πρόδρομων πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων, αρχικά σε αγγειοβλάστες και στη συνέχεια σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Η δεύτερη φάση γνωστή ως δευτερογενής αγγειογένεση (angiogenesis) περιλαμβάνει την ολοκλήρωση της δημιουργίας των πρωτογενών αγγείων και την παραγωγή νέων ενδοθηλιακών κυττάρων τα οποία μπορούν να αναπτύσσονται και να διακλαδίζονται σχηματίζοντας νέα αγγεία. [16, 17] Κατά την ενήλικη ζωή, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων παραμένει πολύ χαμηλός, σε σύγκριση με αυτόν πολλών άλλων ειδών κυττάρων του ανθρώπινου οργανισμού. Εξαίρεση αποτελούν κάποιες φυσιολογικές διαδικασίες όπως η επιδιόρθωση των ιστών σε περιπτώσεις φλεγμονής ή στην επούλωση τραυμάτων. Επιπλέον στο γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα παρατηρείται αύξηση της αγγειογένεσης κατά την ωρίμανση του ωχρού σωματίου, στο ενδομήτριο κατά την παραγωγική φάση του κύκλου και στον πλακούντα κατά την εγκυμοσύνη. Τέλος, αυξημένη αγγειογένεση υπάρχει σε κάποιες παθολογικές διαδικασίες όπως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα, στη διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, στην ψωρίαση καθώς και στην ανάπτυξη νεοπλασμάτων [18]. 26

37 4.2. Aγγειογένεση και καρκίνος Ο Ιπποκράτης έδωσε στην πάθηση του καρκίνου το όνομά της και ήταν ο πρώτος που την ανακάλυψε. Παρομοίασε τον όγκο που προκαλεί ο καρκίνος με την εικόνα του κάβουρα (καρκίνου). Πολύ αργότερα, ο Valsalva, το 1704 υποστήριξε ότι αρχικά ο καρκίνος ήταν ένα τοπικό φαινόμενο που μπορούσε να αφαιρεθεί χειρουργικά ενώ σε πιο προχωρημένο στάδιο ο καρκίνος μπορούσε μέσω των λεμφαγγείων να μεταφερθεί αλλού στο σώμα. Η παρατήρηση ότι γύρω από καρκινικούς όγκους συμβαίνει αγγειογένεση έγινε πριν από σχεδόν 100 χρόνια [19-21]. Συγκεκριμένα, η υπόθεση ότι οι όγκοι παράγουν μια διαχεόμενη αγγειογενετική ουσία τέθηκε το 1968 [22, 23]. Το 1971, ο Folkman διατύπωσε την άποψη ότι η ανάπτυξη όγκων και η μετάστασή τους, εξαρτάται από την αγγειογένεση, συνεπώς η παρεμπόδιση της αγγειογένεσης θα μπορούσε να αποτελέσει μια στρατηγική για την καταστολή την ανάπτυξης των καρκινικών όγκων [24]. Αυτή η προοπτική έδωσε το έναυσμα για εντατική έρευνα προς αναζήτηση αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων. Το 1976, o Gullino έδειξε ότι τα κύτταρα σε προκαρκινικό ιστό αποκτούν ικανότητα επαγωγής της αγγειογένεσης καθώς μεταπίπτουν σε καρκινικά [25]. Την αγγειογένεση συγκροτούν ένα πλήθος σημαντικές και πολύπλοκες ακολουθίες γεγονότων. Ως γνωστόν σχεδόν όλα τα κύτταρα των θηλαστικών απαιτούν Ο 2 και θρεπτικά συστατικά για την επιβίωσή τους, και γι αυτό βρίσκονται σε απόσταση 0,1 με 0,2 mm από αιμοφόρα αγγεία που είναι και το όριο διάχυσης για το Ο 2. [26]. Ένας όγκος δεν μπορεί να μεγαλώσει πάνω από ~1 mm 3 χωρίς την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων στην περιοχή για την παροχή αίματος, εξαιτίας της ιδιαίτερα αυξημένης ανάγκης του για Ο 2 αλλά και του υψηλού ποσοστού απόπτωσης που παρατηρείται σε αυτόν. Έτσι λοιπόν, για την αποφυγή μετατροπής του όγκου στο σύνολό του σε υποξικό ιστό, παρατηρείται μετανάστευση των αγγείων προς τον όγκο και του όγκου προς τα αγγεία [27-29]. Στην Εικόνα φαίνεται η ανάπτυξη των νέων αιμοφόρων αγγείων γύρω από έναν αναπτυσσόμενο όγκο. 27