ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΑΠΟ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ

Transcript

1 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΑΠΟ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ

2 Τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παραγωγή τόσο πρωτεϊνικών, όσο και μη πρωτεϊνικών ετερόλογων προϊόντων ΙΙροϊόντα (έτος πρώτης έγκρισης) Ορμόνες και πεπτιδικοί παράγοντες Ανθρώπινη ινσουλίνη (1982) Παράγοντας VIII-C (1992) Ανθρώπινη αυξητική ορμόνη (1985) Ερυθροποιητίνη (1989) Ιντερφερόνη-αλφα 2a (1986) Ιντερφερόνη -άλφα 2b Ιντερφερόνη-βήτα (1993) Ιντερφερόνη-γάμα (1990) Ιντερλευκίνη-2 (1992) Ένζυμα Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου Προυροκινάση/Ουροκινάση DN-άση (1994) Εμβόλια Ηπατίτιδας Β (1986) Έρπη Μονοκλωνικά αντισώματα Τελική χρήση Διαβήτης Αιμοφιλία Ατελής ανάπτυξη Αναιμία, χρόνια νεφρική ανεπάρκεια Λευχαιμικά τριχωτά κύτταρα, AIDSσχετιζόμενος καρκίνος Καρκίνος Καρκίνος, αφροδισιακά, μολυσματικές ασθενείς Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, Καρδιακή προσβολή Πνευμονική θεραπεία Εμβόλια Ηπατίτιδας Β Εμβόλιο ηπατίτιδας Β 'Ερπης Ευρεία κλίμακα διαφορετικών αντισωμάτων: διάγνωση, παρεμπόδιση πήξης αίματος, καρκίνο μαστού, καρκίνο του πνεύμονα.

3 Πωλήσεις βιοφαρμακευτικών προϊόντων το 2015 (εκτίμηση). ΠΡΟΪΟΝ ΕΝΔΕΙΞΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΠΩΛΗΣΕΙΣ (εκ US$) Aranesp & Epogen, Aναιμία ΑΜGEN >5000 (Ερυθροποιητίνη) Neulasta & Neupogen, Aναιμία ΑΜGEN >4000 (Ερυθροποιητίνη) Procrit/Eprix (Ερυθροποιητίνη) Aναιμία Johnson & Johnson >6000 Avonex (Iντερφερόνη-β) Σκλήρυνση κατά πλάκας Βiogen >2000 Rituxan Herceptin (Μονοκλωνικά αντισώματα) Humulin Humalog (Ινσουλίνη) Λέμφωμα Genentech >1000 Καρκίνος του στήθους Διαβήτης Lilly >2000

4 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ Καθαρό περιβάλλον BIOKATAΛΥΣΗ ΒΙΟΜΕΤΑΡΟΠΕΣ ΖΥΜΩΣΗ

5 Προκαρυωτικά είδη Μπορούν να καλλιεργηθούν Δεν μπορούν να καλλιεργηθούν Αναλογία προκαρυωτικών οργανισμών που μπορούν να καλλιεργηθούν Μεταφορά γονιδίων σε άλλους μικροοργανισμούς που μπορούν να καλλιεργηθούν Κλωνοποίηση γονιδίων

6 Κλωνοποίηση είναι η διαδικασία δημιουργίας ενός ή περισσοτέρων ακριβών αντιγράφων από ένα πρότυπο Με τη μοριακή κλωνοποίηση επιδιώκεται η αντιγραφή μορίων ή γονιδίων με σκοπό την ευχερέστερη μελέτη τους ή εκμετάλλευσή τους.

7 Κλωνοποίηση DNA Η μεταφορά γονιδίων προϋποθέτει: 1) τη διαθεσιμότητα κατάλληλων φορέων κλωνοποίησης (όχημα κλωνοποίησης- cloning vectors) για τη μεταφορά Ως όχηµα κλωνοποίησης θεωρητικά, µπορεί να χρησιµοποιηθεί κάθε µόριο DNA που έχει την ικανότητα να πολλαπλασιάζεται εξωχρωµοσωµικά στα κύτταρα που εισάγεται (δεν είναι αναγκαία η ενσωµάτωσή του στο γενετικό υλικό του κυττάρου). Το όχηµα διατηρεί την ικανότητα αυτή και µετά την ένωση του µε το τµήµα του ξένου DNA (insert).

8 2) Κύτταρα ξενιστές (host) ικανά να δεχθούν και να εκφράσουν το ξένο γονίδιο Η αξιοποίηση των χαρακτηριστικών του φορέα κλωνοποίησης προϋποθέτει την εισαγωγή του (επιµόλυνση) στο ξενιστή µε το κατάλληλο γενετικό υπόβαθρο. Οι ξενιστές που χρησιµοποιούνται είναι αποκλειστικά εργαστηριακά στελέχη µικροοργανισµών που έχουν αποµονωθεί µετά από γενετική επιλογή.

9

10 1) Αποµόνωση του DNA από την πηγή που περιέχει την γενετική πληροφορία που αναζητούµε. Πέψη DNA (με ενδονουκλεάσες περιορισμού) 2. Ένθεση του DNA στον φορέα κλωνοποίησης Αυτό επιτυγχάνεται με τη δράση της λιγάσης 3. Eισαγωγή του φορέα ανασυνδυασμένου DNA σε πληθυσμό ξενιστές (π.χ E.coli) με επιμόλυνση/μετασχηματισμό. 4. Ελεγχος µε µαζικό τρόπο (screening) των κλώνων, για να εντοπίσουµε την αλληλουχία που μας ενδιαφέρει

11 Κλωνοποίηση του DNA Με τη βοήθεια περιοριστικών ενδονουκλεασών όπως την EcoRI το γονιδίωμα ενός οργανισμού μπορεί να κοπεί σε χιλιάδες κομμάτια.

12 Χαρακτηριστικά παραδείγματα περιοριστικών ενζύμων διαφορετικής εξειδίκευσης Ενζυμα Οργανισμός Αλληλουχία πέψης παναγνώρισης

13 Επιλογή του DNA που θα κλωνοποιηθεί Α) Κλωνοποίηση τυφλής στόχευσης Β) Κλωνοποίηση c DNA (συμπληρωματικό DNA) Γ) Γονιδιακή σύνθεση

14 Κλωνοποίηση τυφλής στόχευσης Π.χ Δημιουργία γενωμικής βιβλιοθήκης 1) Πέψη χρωμοσωμικού DNA 2) Ενσωμάτωση κλασμάτων σε φορείς κλωνοποίησης (π.χ. πλασμίδια) σε συνθήκες τέτοιες ώστε: 1 κλάσμα σε 1 πλασμίδιο Η συλλογή αυτή βακτηρίων ονομάζεται βιβλιοθήκη γονιδίων (Gene Library) καθόσον περιέχουν όλη τη γενετική πληροφορία μέσα στην κυτταρική αυτή σειρά.

15 Μειονέκτημα της τυφλής στόχευσης Μόνο ορισμένα τμήματα του γενωμικού DNA περιέχουν γονίδια oπότε οι πιο πολλοί γενωμικοί κλώνοι θα περιέχουν τμήματα DNA που δεν εκφράζονται.

16 Στο DNA των ευκαρυωτικών κυττάρων υπάρχουν ανενεργές περιοχές (introns), οι οποίες δεν κωδικοποιούν τη σύνθεση πρωτεϊνών. Επειδή τα βακτήρια δεν έχουν τον κυτταρικό εξοπλισμό για να αποκόπτουν ιντρόνια και να επιτελέσουν τη διαδικασία του ματίσματος, τα ευκαρυωτικά γονίδια δεν μπορούν να τοποθετηθούν κατευθείαν στα βακτήρια για την παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης

17 Εναλλακτική μέθοδος: Η κλωνοποίηση να ξεκινά με επιλογή μόνο εκείνων των τμημάτων DNA που μεταγράφονται σε RNA (δηλαδή αντιστοιχούν σε γονίδια) Κλωνοποίηση συμπληρωματικού (complementary) c DNA Πηγή µας είναι ο ιστός ή τα κύτταρα στα οποία βεβαιωµένα εκφράζεται το γονίδιο που αναζητούµε (δεν µπορεί να είναι κάθε ιστός ή κυτταρικός τύπος) Μια cdna βιβλιοθήκη περιέχει αντίγραφα των mrna όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε κάποια κύτταρα

18 Το cdna δηµιουργείται µε καλούπι το mrna του κυττάρου µε την χρήση του ενζύµου της ανάστροφης µεταγραφάσης. Στο πρώτο στάδιο συντίθεται από mrna η συµπληρωµατική µονόκλωνη DNA αλυσίδα και µε καλούπι αυτή συνθέτουµε την συµπληρωµατική της για να δηµιουργήσουµε το δίκλωνο cdna το οποίο θα εισαχθεί στον φορέα κλωνοποίησης.

19

20 Κλωνοποίηση c DNA Κλωνοποίηση μόνο των τμημάτων DNA που μεταγράφονται σε RNA 1. Απομόνωση mrna Χρωματογραφία συγγένειας Στήλη με ολιγο-δεοξυθυμιδυλικό oligo dt Ολικό RNA Συγκράτηση του mrna (μόνο αυτό έχει πολυαδενυλικής ουρά στο 3 -στα περισσότερα ευκαρυωτικά) mrna

21

22 Σύνθεση προϊνσουλίνης σε βακτήρια Πηγή mrna είναι ο ιστός ή τα κύτταρα στα οποία βεβαιωµένα εκφράζεται το γονίδιο που αναζητούµε (δεν µπορεί να είναι κάθε ιστός ή κυτταρικός τύπος) Αντίστροφη μεταγραφάση Σύνδεση στο πλασμίδιο Γονίδιο προϊνσουλίνης Προϊνσουλίνη Πάγκρεας mrna ινσουλίνης θηλαστικών cdna της προϊνσουλίνης Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Μετασχηματισμένο βακτήριο

23 3) Κλωνοποίηση με γονιδιακή σύνθεση Προϋποθέτει γνώση της αλληλουχίας αμινοξέων Αποφεύγεται το πρόβλημα των ιντρονίων Ιn vitro χημική σύνθεση γονιδίου ξεκινώντας από δεοξυριβονουκλεοτίδια Ένα τεχνητό γονίδιο μπορεί να κωδικεύει ακριβώς την ίδια πρωτεΐνη, όπως το φυσικό. Η χημική σύνθεση μας επιτρέπει επίσης να παράγουμε ειδικά τροποποιημένες φυσικές πρωτεΐνες ή ενδεχομένως εξολοκλήρου σχεδιασμένες πρωτεΐνες. Σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων Σύνδεση Εισαγωγή στο φορέα έκφρασης Πρωτεΐνη έως 500 αμινοξέα

24 Τι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φορέας κλωνοποίησης; Ποια χαρακτηριστικά θα πρέπει να έχει; Με ποια κριτήρια γίνεται η επιλογή;

25 Φορείς κλωνοποίησης (vectors)- ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ- ΒΑΚΤΗΡΙΟΦΑΓΟΙ λ & Μ 13 ΙΙΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ (SV 40 ) ΚΟΣΜΙΔΙΑ ΤΕΧΝΗΤΑ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ Ή ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΑ

26 Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης.

27 ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ Ένας φορέας κλωνοποίησης φέρει αλληλουχίες έναρξης του διπλασιασµού (αφετηρία αντιγραφής origin -ori) του DNA και αλληλουχίες για την εισαγωγή του ξένου DNA οι οποίες αναγνωρίζονται από περιοριστικά ένζυµα. Οι φορείς κλωνοποίησης περιέχουν ένα τουλάχιστον γονίδιο που προσδίδει κάποιο επιλεκτικό πλεονέκτηµα στα κύτταρα που αναπτύσσονται (κύτταρα του ξενιστή). Συνήθως, προσφέρουν στον ξενιστή, αντοχή στην παρουσία ενός αντιβιοτικού στο καλλιεργητικό µέσο.

28 Σημαντικά πλεονεκτήματα προσφέρουν οι φορείς κλωνοποίησης που μπορούν να επιβιώσουν σε περισσότερους από έναν τύπο κυττάρων ξενιστών. Π.χ πλασμίδια τα οποία μπορούν να πολλαπλασιαστούν στα κύτταρα δύο διαφορετικών ξενιστών καθώς διαθέτουν δύο αφετηρίες αντιγραφής (ori) μια για κάθε ξενιστή π.χ E coli & Bacillus subtilis

29 Δείκτες επιλογής. Συνήθως δείκτες επιλογής είναι: Γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (πχ αμπικιλλίνη-apr ή amp, τετρακυκλίνη-tcr ή tet, χλωραμφενικόλη-cmr, καναμυκίνη-knr) Ανθεκτικότητα σε τετρακυκλίνη Ανθεκτικότητα σε αμπικιλίνη Αρχή της αντιγραφής pbr322 περιέχει γονίδια ανθεκτικότητας σε αμπικιλίνη και τετρακυκλίνη

30 Το γονίδιο lac Z που παράγει β-γαλακτοζιδάση α & Ω τμήματα του ενζύμου Ενεργό ένζυμο Η επιλογή αποικιών που περιέχουν πλασμίδια με ξένο DNA βασίζεται στο γεγονός ότι παραμένουν άχρωμες

31 Το πλασμίδιο puc18/19 έχει δύο δείκτες επιλογής: α. ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη και β. ένα γονίδιο lacz που παράγει την β-γαλακτοσιδάση. Υπάρχουν πλασμίδια που περιέχουν ένα πολυσυνδέτης (polylinker), δηλαδή μία DNA περιοχή που περιλαμβάνει θέσεις αναγνώρισης για περισσότερα από ένα ένζυμα περιορισμού. Ο πολυσυνδέτης βρίσκεται μέσα στο γονίδιο lacz

32 Επιπλέον χαρακτηριστικά. Το μοριακό βάρος του πλασμιδίου πρέπει να είναι μικρό, γιατί η αποδοτικότητα μετασχηματισμού και ο αριθμός αντιγράφων μειώνεται όσο μεγαλώνει το μοριακό βάρος του πλασμιδίου. Τα πλασµίδια εισέρχονται στο κύτταρο µέσω των πόρων της µεµβράνης και αυτό δηµιουργεί περιορισµούς. Όσον αυξάνει το ολικό µέγεθος µειώνεται η ικανότητά του να εισέλθει στο κύτταρο

33 Ο αριθμός των αντιγράφων του πλασμιδίου σε ένα βακτηριακό κύτταρο ελέγχεται γενετικώς από το ίδιο το πλασμίδιο.. πλασμίδιο αριθμός αντιγράφων puc pbluescript pgem ptz >1000 pbr pacyc psc ~5

34 Η εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια επιτυγχάνεται με δύο μεθόδους 1) Μετασχηματισμός: Ο μετασχηματισμός χρησιμοποιείται για την εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων, τόσο σε προκαρυωτικούς, όσο και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Σήμερα έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι για όλα σχεδόν τα βακτήρια, οι οποίες στηρίζονται στην επίδραση του κυτταρικού περιβλήματος από χημικές ουσίες, όπως ιόντα Ca 2+ και Mg 2+ πολυαιθυλενική γλυκόλη, αφαίρεση του κυτταρικού τοιχώματος).

35 H εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια επιτυγχάνεται μέσω της επώασης με θειϊκο ασβέστιο σε πάγο. Μετά από από σύντομο θερμικό σοκ τα κύτταρα μπορούν αν δεχτούν τα πλασμίδια

36 2) Hλεκτροδιάτρηση (electroporation) Tα κύτταρα μεταφέρονται σε διάλυμα που περιέχει DNA και δέχονται ένα ηλεκτρικό παλμό, ο οποίος προκαλεί το παροδικό άνοιγμα οπών στην εξωτερική μεμβράνη (ή στο κυτταρικό τοίχωμα αν πρόκειται για βακτήρια). Το DNA εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα (και στον πυρήνα στα ευκαρυωτικά κύτταρα)

37 Τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται για μεταφορά μορίων έως kb ενώ για τη μεταφορά μεγαλυτέρων μορίων DNA χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης DNA φάγων ή κοσμίδια.

38 Φάγοι Αποτελεσματικά συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού Το γονίδιο στόχος ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του φάγου και μεταφέρεται μέσα στο κύτταρο μετά τη μόλυνση με το φάγο Αναπτύσσονται μόνο μέσα στα κύτταρα και γι αυτό εισάγουν το γονιδίωμά τους στα κύτταρα για να πολλαπλασιαστούν

39 Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενοι βακτηριοφάγοι φορείς είναι ο λ (δίκλωνο DNA) και ο Μ13 (μονόκλωνο DNA). Και οι δυο πολλαπλασιάζουν το DNA τους σε ψηλά επίπεδα κατά τη μόλυνση του ξενιστή (βακτηρίου) και παράγουν ιοειδή, τα οποία ελευθερώνονται στο θρεπτικό μέσο. Η παρουσία τους είναι από μόνη της εμφανής και έτσι δεν χρειάζονται γενετικοί δείκτες, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των πλασμιδίων.

40 Το γονιδίωµα του λ φάγου είναι ένα δίκλωνο ευθύγραµµο µόριο DNA, µεγέθους περίπου 48 kb. Στα δύο άκρά του το DNA του φάγου φέρει µονόκλωνα, συµπληρωµατικά µεταξύ τους, τµήµατα DNA µήκους 12 νουκλεοτιδίων (cos sites). Ο φάγος προσκολλάται στην µεµβράνη του E.coli στους υποδοχείς που χρησιµοποιεί το βακτήριο για την ενδοκυτταρική µεταφορά της µαλτόζης µέσα στο κύτταρο. Η έκφραση των υποδοχέων επάγεται από την µαλτόζη και καταστέλλεται από την γλυκόζη.

41 Ένας πλήρως αναπτυγμένος λ-φάγος αποτελείται από την κεφαλή, που περιέχει συσκευασμένο το γραμμικό δίκλωνο μόριο DNA, την ουρά, μέσω της οποίας διοχετεύεται το DNA της κεφαλής στο βακτήριο ξενιστή. Ο λ έχει γονιδίωμα περίπου 48 kb, 20 kb από τις οποίες είναι περιττό για την αύξησή του σε E. coli και μπορούν να αντικατασταθεί με ξένο DNA. Ικανότητα να δέχεται σχετικά μεγάλα ενθέματα. Το γονίδιωμα του Μ13 είναι μονόκλωνο DNA και έτσι παράγει και το ένθεμα σε μονόκλωνη μορφή.

42 Κατασκευή μεταλλαγμένων λ φάγων σχεδιασμένων για κλωνοποίηση 20 kb Απομάκρυνση ενός τμήματος με δράση νουκλεασών περιορισμού Ετερόλογο γονίδιο Ανασυνδυασμός με ξένο DNA <75% δεν μπορεί να πακεταριστεί σε λ σωματίδιο Ιn vitro πακετάρισμα στον φάγο Μολυσματικό λ ιοσωμάτιο που φέρει το ξένo DNA

43 Αµέσως µετά την είσοδο του DNA του φάγου στο κύτταρο του ξενιστή, τα cos άκρα ενώνονται από την DNA λιγάση του κυττάρου και το κυκλικό µόριο που σχηµατίζεται, χρησιµοποιείται ως µήτρα για την µεταγραφή των γονιδίων στα πρώτα στάδια της µόλυνσης

44 Δύο διαφορετικές πορείες πολλαπλασιασμού σε ένα βακτήριο ξενιστή: α. η λυτική πορεία, όπου το DNA του ιού και οι πρωτεΐνες εκφράζονται γρήγορα, συσκευάζονται σε σωμάτια και καταστρέφουν το βακτήριο με ταυτόχρονη απελευθέρωση 100 έως 1000 περίπου ιοσωματίων (virions), β. η λυσιγονική πορεία, όπου το DNA του ιού ενσωματώνεται στο βακτηριακό γονιδίωμα και πολλαπλασιάζεται μαζί του παραμένοντας ανενεργό, μέχρις ότου αλλαγές στο περιβάλλον το ενεργοποιήσουν και ακολουθήσει τη λυτική πορεία

45 λ φάγος Ιικοί φορείς κλωνοποίησης ΛΥΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ιοσωμάτια Είσοδος λ DNA Eνεργοποίηση απελευθέρωση 100 έως 1000 περίπου ιοσωματίων ΛΥΣΙΓΟΝΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ενσωμάτωση του λ DNA στο γονιδίωμα του βακτηρίου Πολλοί ιοί είναι λυτικοί γι αυτό και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς για τη μόνιμη εισαγωγή και σταθερή έκφραση ενός γονιδίου σε κύτταρα

46 Κοσμίδια Eίναι φορείς-υβρίδια μεταξύ λ φάγου και πλασμιδίου, οι οποίοι μεταφέρουν μεγάλα κομμάτια DNA (μέχρι και 45 kb). Το DNA τους μπορεί να αντιγράφεται όπως ένα πλασμίδιο και να πακετάρεται όπως συμβαίνει σε ένα φάγο. Το γεγονός ότι τα κοσμίδια έχουν τη δυνατότητα ενσωμάτωσης μεγάλων μορίων DNA, αποτελεί και το κυριότερο πλεονέκτημα

47 Tα κοσμίδια, προϊόντα της γενετικής µηχανικής, είναι µικρά κυκλικά µόρια DNA τα οποία στην απλούστερη µορφή τους φέρουν ένα πλασµιδιακό ori (αφετηρία αντιγραφής) που επιτρέπει τον διπλασιασµό τους µέσα στον ξενιστή, ένα γονίδιο επιλογής σε αντιβιοτικό, µια τουλάχιστον αλληλουχία αναγνώρισης από περιοριστική ενδονουκλεάση και το cos άκρα του λ φάγου

48 Τα τµήµατα DNA µεταξύ kb αποµονώνονται και ενώνονται µε τα ευθύγραµµα µόρια κοσμιδίου. Το ένθεμα που περικλείεται από τα δύο ευθύγραµµα τμήματα κοσμιδίου το καθένα από τα οποία περιέχει ένα cos άκρο, σε συνθήκες in vitro «πακεταρίσµατος» εισέρχεται στην κεφαλή του φάγου. Μετά την επιµόλυνση, το ευθύγραµµο µόριο γίνεται κυκλικό ενδοκυτταρικά, όπως συµβαίνει και µε τον φάγο και επειδή περιέχει ένα πλήρες σετ των αλληλουχιών του κoσμιδίου µπορεί να αναπτυχθεί στον ξενιστή ως πλασµίδιο Αναπτύσσεται ως πλασμίδιο

49 Τα τεχνητά χρωματοσώματα ζύμης είναι φορείς που αποτελούνται από τα δομικά μέρη των χρωματοσωμάτων ζύμης και έχουν την δυνατότητα να δέχονται μεγάλα κομμάτια DNA (400kb). Τεχνητά χρωματοσώματα βακτηρίων Τα τεχνητά χρωματοσώματα βακτηρίων (BACs) είναι φορείς που αποτελούνται από δομικά μέρη βακτηριακών χρωματοσωμάτων.

50 1) Αποµόνωση του DNA από την πηγή που περιέχει την γενετική πληροφορία που αναζητούµε. Πέψη DNA (με ενδονουκλεάσες περιορισμού) 2. Ένθεση του DNA στον φορέα κλωνοποίησης Αυτό επιτυγχάνεται με τη δράση της λιγάσης 3. Eισαγωγή του φορέα ανασυνδυασμένου DNA σε πληθυσμό ξενιστές (π.χ E.coli) με επιμόλυνση/μετασχηματισμό. 4. Ελεγχος µε µαζικό τρόπο (screening) των κλώνων, για να εντοπίσουµε την αλληλουχία που μας ενδιαφέρει

51 ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΚΛΩΝΩΝ Γενετικές μέθοδοι (Οι περισσότεροι φορείς περιέχουν επιλεγμένους δείκτες, όπως ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ή τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για αυξητικούς παράγοντες και έχουν απομακρυνθεί με μετάλλαξη από τα κύτταρα-ξενιστές. Στην τελευταία περίπτωση, η ανάπτυξη είναι δυνατή μόνο παρουσία του πλασμιδίου) In situ υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων Επιλογή με βάση το προϊόν έκφρασης του γονιδίου

52 In situ υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων Σάρωση μιας βιβλιοθήκης για τον εντοπισμό του επιθυμητού κλώνου με ραδιενεργά σημασμένο με 32 P νουκλεϊκό οξύ ως ιχνηθέτη ΙΧΝΗΘΕΤΗΣ μονόκλωνο DNA (σημασμένο) συμπληρωματικής αλληλουχίας με το το DNA (ή RNA) που θα προσδιοριστεί Μήκος από 15 έως χιλιάδες νουκλεοτίδια Σύνθεση: συνήθως χημικά Σήμανση: με 32 P ή με χημική ομάδα

53 In situ υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων

54

55 Επιλογή με βάση την παραγόμενη πρωτεΐνη Προϋπόθεση η έκφραση του γονιδίου Ανάπτυξη κυττάρων Λύση κυττάρων και απελευθέρωση πρωτεϊνών Μεταφορά των πρωτεϊνών σε προσροφητικό υλικό Εκθεση στον πρωτεϊνικό ιχνηθέτη Πρωτεϊνικός Ιχνηθέτης ραδιενεργό αντίσωμα ή άλλο πρόσδεμα (ligand) για την ανίχνευση πρωτεΐνης που έχει παραχθεί από συγκεκριμένο κλώνο

56 Σάρωση μιας βιβλιοθήκης για τον εντοπισμό του επιθυμητού κλώνου με τη χρήση σημασμένου αντισώματος.

57

58 Μια άλλη προσέγγιση στην εξερεύνηση μιας βιβλιοθήκης γονιδίων είναι η χρήση των τεχνολογιών έκθεσης μέσω φάγων και μέσω βακτηρίων. Ένας βακτηριοφάγος ή ένα βακτήριο μπορεί να εκθέσει στην επιφάνειά του πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια που προέρχονται από τη βιβλιοθήκη. Κάθε κύτταρο μπορεί να εκθέσει στην καλύτερη περίπτωση μερικά μόνο από αυτά τα γονιδιακά προϊόντα. Η επιλογή γίνεται με βάση την εξειδικευμένη σύνδεση της συνδεδεμένης στη μεμβράνη πρωτεΐνης που εκφράζεται σε εξειδικευμένο πρόσδεμα

59 Η κλωνοποίηση ενός γονιδίου δεν πιστοποιεί την έκφρασή του ούτε η έκφραση ενός γονιδίου σε έναν άλλο οργανισμό πέραν αυτού που το εκφράζει φυσιολογικά πιστοποιεί ότι η πρωτεΐνη που θα προκύψει θα είναι και λειτουργική. Αποτελεσματική κλωνοποίηση ενός γονιδίου αποτελεσματική έκφραση ικανοποιητική ποσότητα και ποιότητα του παραγόμενου πρωτεϊνικού προϊόντος.

60 Έκφραση και μεγιστοποίηση της έκφρασης Η έκφραση ξένου DNA σε κύτταρο ξενιστή εξαρτάται από το γονίδιο και από το είδος του κυττάρου ξενιστή Στάδια στην έκφραση των γονιδίων: Μεταγραφή του DNA σε mrna Mάτισμα -απομάκρυνση ιντρονίων & συρραφή (μόνο σε ευκαρυωτικά) Μετάφραση mrna σε πρωτεΐνη Mετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις

61 ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Η περιοχή του υποκινητή (promoter- σύνδεση της RNA πολυμεράσης) αποτελεί μία σημαντική αλληλουχία DNA για τον έλεγχο της έκφρασης του γονιδίου που κλωνοποιείται. H παραγωγή μίας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης μπορεί να φθάσει σε επίπεδα έως το 50% του συνόλου των πρωτεϊνών που εκφράζει ο μικροοργανισμός ανάλογα με τον υποκινητή που επιλέγεται

62 Οι φυσικοί υποκινητές των κλωνοποιημένων γονιδίων μπορεί να λειτουργούν από πολύ αποτελεσματικά έως καθόλου. Τα cdna ή τα τεχνητά συντεθειμένα DNA δεν διαθέτουν υποκινητές εισαγωγή του γονιδίου στο φορέα έκφρασης κοντά στη περιοχή ενός υποκινητή

63 Υποκινητές οι οποίοι ενεργοποιούνται από ακριβές και τοξικές χημικές ουσίες δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μεγάλη κλίμακα οπότε για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται υποκινητές οι οποίοι ενεργοποιούνται π.χ αυξάνοντας τη θερμοκρασία του μέσου επώασης. Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Άλλοι υποκινητές ενεργοποιούνται σε χαμηλή πίεση οξυγόνου ή με φθηνούς και εύκολα διαθέσιμους υδατάνθρακες.

64 Οι αλληλουχίες τερματισμού της μεταγραφής είναι ένα άλλο στοιχείο που πρέπει να ελεγχθεί. Στην αντίθετη περίπτωση μπορεί να μειωθεί σημαντικά η παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης αφού καταναλώνεται από τον φορέα έκφρασης μεγάλο ποσό ενέργειας άσκοπα για την παραγωγή μη λειτουργικών mrna μορίων.

65 Μετάφραση Για την έναρξη της μετάφρασης είναι απαραίτητη η περιοχή σύνδεσης του mrna με το ριβόσωμα (RBS: ribosome binding site) περίπου 5 bp πριν από το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης. Η RBS δομή τείνει να είναι διαφορετική από βακτήριο σε βακτήριο

66 Χρησιμοποίηση φορέα κλωνοποίησης στον οποίο το γονίδιο μπορεί να εισαχθεί μετά από ένα υποκινητή και μια περιοχή σύνδεσης (RBS) με το ριβόσωμα

67 Πολλά αμινοξέα κωδικοποιούνται από περισσότερα του ενός κωδικονίου (συνώνυμα κωδικόνια) Τα περισσότερα βακτήρια δείχνουν προτίμηση σε συγκεκριμένα συνώνυμα κωδικόνια (τα κωδικόνια δεν χρησιμοποιούνται με την ίδια συχνότητα στους διάφορους οργανισμούς) Codons Ala [A] 2 Arg [R] 3 Asn [N] 1 Asp [D] 1 Cys [C] 1 Gln [Q] 1 Glu [E] 1 Gly [G] 2 His [H] 1 Ile [I] 1 Leu [L] 3 Lys [K] 1 Met [M] 1 Phe [F] 1 Pro [P] 2 Ser [S] 3 Thr [T] 2 Trp [W] 1 Tyr [Y] 1 Val [V] 2 Stop 1 Codons 32

68 H παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών που αποτελούνται από περισσότερες υπομονάδες μπορει να γίνει μέσω: Α) Δύο ξεχωριστών φορέων όπου ο καθένας φέρει το γονίδιο της κάθε υπομονάδας Β) Ενός κοινού φορέα ο οποίος μεταφέρει σε χωριστές θέσεις τα γονίδια των υπομονάδων όπου ο έλεγχος γίνεται από ξεχωριστούς υποκινητές (ένας για κάθε γονίδιο) Γ) Ενός κοινού φορέα ο οποίος μεταφέρει ένα τεχνητό οπερόνιο στο οποίο τα γονίδια των υπομονάδων εκφράζονται χρησιμοποιώντας τον ίδιο υποκινητή

69 Σύνθεση υπομονάδων πρωτεΐνης με τη χρήση κοινού φορέα ο οποίος μεταφέρει σε χωριστές θέσεις τα γονίδια των υπομονάδων όπου ο έλεγχος γίνεται από ξεχωριστούς υποκινητές.

70 Η κλωνοποίηση ενός γονιδίου δεν πιστοποιεί την έκφρασή του ούτε η έκφραση ενός γονιδίου σε έναν άλλο οργανισμό πιστοποιεί ότι η πρωτεΐνη που θα προκύψει θα είναι και λειτουργική. Αποτελεσματική κλωνοποίηση ενός γονιδίου αποτελεσματική έκφραση ικανοποιητική ποσότητα και ποιότητα του παραγόμενου πρωτεϊνικού προϊόντος.

71 Έκφραση και μεγιστοποίηση της έκφρασης Η έκφραση ξένου DNA σε κύτταρο ξενιστή εξαρτάται από το γονίδιο και από το είδος του κυττάρου ξενιστή Στάδια στην έκφραση των γονιδίων: Μεταγραφή του DNA σε mrna Mάτισμα -απομάκρυνση ιντρονίων & συρραφή (μόνο σε ευκαρυωτικά) Μετάφραση mrna σε πρωτεΐνη Mετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις

72 Κρίσιμος παράγοντας οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις; Λειτουργικότητα Έκκριση

73 Mετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Ιδιότητες/λειτουργικότητα των πρωτεϊνών Ορθή αναδίπλωση Έκκριση πρωτεΐνης από το κύτταρο Προσθήκη χημικών ομάδων Εξειδικευμένη απομάκρυνση πεπτιδικών αλυσίδων

74 Η επιλογή του συστήματος ξενιστή-φορέα Υπάρχει ανάγκη ή όχι για μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στο μόριο της πρωτεΐνης-προϊόν; Όχι Ναι Βακτήρια Ζωικά /φυτικά κύτταρα Απλές τροποποιήσεις Ζύμη ή μύκητες

75 Συστήματα μετασχηματισμού και κλωνοποίησης Βακτήρια Ε. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Sreptomyces Zυμομύκητες S. cerevisiae και S. pombe Mύκητες Aspergillus, Neurospora, Fusarium κ.ά. Ζωικά κύτταρα Φυτικά κύτταρα Έντομα Διαγονιδιακά ζώα Ξενιστές

76 Aνεπιθύμητη πρωτεόλυση κύτταρο / έκκριση του προϊόντος έξω από το Πρωτεΐνη σύντηξης (fusion proteins) µία φυσική πρωτεΐνη του κυττάρου-ξενιστή (που μπορεί να εκκριθεί) συντήκεται µε την αλληλουχία της πρωτεΐνης-στόχου Η διαδικασία επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης π.χ πλασμιδιακού φορέα στον οποίο το γονίδιο στόχος συντήκεται με το γονίδιο της πρωτεΐνης που μπορεί να εκκριθεί.

77 Eίναι δυνατή η κατασκευή πρωτεϊνών σύντηξης που θα διευκολύνουν τη διαδικασία ανάκτησης παρέχοντας µια «ουρά» (π.χ αποτελούμενη από 6 κατάλοιπα ιστιδίνης) που προσκολλάται εύκολα σε κάποιο ειδικό χρωµατογραφικό µέσο

78 Απομόνωση ετερόλογων πρωτεϊνών Χρωματογραφία συγγένειας

79 ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗ Η ΣΩΣΤΗ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ Η ορθή αναδίπλωση των πρωτεϊνών υποβοηθιέται με τη συμμετοχή µιας σηµαντικής κατηγορία πρωτεϊνών (chaperones) που βοηθούν στο κατάλληλο δίπλωµα των πεπτιδίων Οι πρωτεΐνες που δεν αναδιπλώνονται σωστά συσσωµατώνονται και δηµιουργούν αδιάλυτα συσσωματώματα (έγκλειστα). Πρωτεΐνες chaperones

80 Η πρωτεΐνη στο έγκλειστο βρίσκεται σε λανθασμένη αναδίπλωση και έτσι δεν αναπτύσσει καμία βιολογική δραστηριότητα. Αν τα έγκλειστα αυτά ανακτηθούν από την καλλιέργεια, τότε μπορούν να επαναδιαλυτοποιηθούν και η δραστικότητα (και η αξία) της πρωτεΐνης να αποκατασταθεί.

81 ΕΓΚΛΕΙΣΤΟ Διαλυτοποίηση σε διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης αποδιατακτικού παράγοντα (6-8 Μ ουρίας ή 5-6 M υδροχλωρικής γουανιδίνης). Σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών ( + μίγμα ανηγμένο και οξειδωμένο γλουταθείο (GSH/GSSC)) Η χρήση προσθέτων (όπως η αργινίνη) βελτιώνουν την απόδοση της αναδίπλωσης της πρωτεΐνης

82 Έκκριση των πρωτεϊνών Για την έκκριση των πρωτεϊνών απαραίτητη είναι η παρουσία µιας σηµατοδοτικής αλληλουχία 20 έως 25 επιπλέον αµινοξέων στο αμινοτελικό άκρο, η οποία περιλαμβάνει ένα πυρήνα από υδρόφοβα αμινοξέα που περιβάλλονται από υδρόφιλα αμινοξέα. Αυτή η αλληλουχία αφαιρείται κατά τη διάρκεια της έκκρισης διαμέσου της μεμβράνης.

83 Για πρωτεΐνες που θα μεταφερθούν έξω από το κύτταρο αλληλουχία σήματος (20-25 αμινοξέα) Τμήμα αμινοξέων που υδρολύεται Εξωκυττάριος χώρος πρωτεΐνη Κυτταρικό τοίχωμα/μεμβράνη Στα κατά Gram-θετικά βακτήρια (που δεν διαθέτουν εξωτερική μεμβράνη) αλλά και σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς η αλληλουχία σήματος κατευθύνει τις πρωτεΐνες που εκκρίνονται να περνούν εύκολα το κυτταρικό τοίχωµα και φθάνουν στον εξωκυτταρικό χώρο.

84 E. coli πρωτεΐνη X Εξωκυττάριος χώρος Πρωτεόλυση από πρωτεάσες Μεμβράνη Στα κατά Gram-αρνητικά βακτήρια (E. coli) η έκκριση δεν είναι αποτελεσματική λόγω ανεπιθύμητης πρωτεόλυσης

85 Άλλες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών, στα ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα, περιλαµβάνουν τον σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών, την προσθήκη σακχάρων μέσω αντιδράσεων γλυκοζυλίωσης, λιπιδίων και ακέτυλο ομάδων μέσω ακετυλιώσεων, φωσφορικών ομάδων μέσω αντιδράσεων φωσφορυλίωσης

86 Η επιλογή του συστήματος ξενιστή-φορέα Υπάρχει ανάγκη ή όχι για μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στο μόριο της πρωτεΐνης-προϊόν; Όχι Ναι Βακτήρια Ζωικά /φυτικά κύτταρα Απλές τροποποιήσεις Ζύμη ή μύκητες

87 Συστήματα μετασχηματισμού και κλωνοποίησης Βακτήρια Ε. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Sreptomyces Zυμομύκητες S. cerevisiae και S. pombe Mύκητες Aspergillus, Neurospora, Fusarium κ.ά. Ζωικά κύτταρα Φυτικά κύτταρα Έντομα Διαγονιδιακά ζώα Ξενιστές

88

89 Βακτήρια ως ξενιστές Ε. coli ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: γνώση της φυσιολογίας και της γενετικής του, υψηλοί ρυθμοί ανάπτυξης, δυνατότητα ανάπτυξης του σε υψηλές κυτταρικές συγκεντρώσεις, ανάπτυξη σε απλά και φθηνά θρεπτικά υλικά. ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: δεν εκκρίνει τις πρωτεΐνες πιθανή παθογονική δράση, όχι μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις Συχνά η πρωτεΐνη-στόχος σχηματίζει ένα έγκλειστο στο οποίο μπορεί όμως να συμπεριλαμβάνονται και άλλα κυτταρικά υλικά

90 Ε. coli δεν είναι η κατάλληλη επιλογή για βιομηχανική χρήση Gram (-) περιέχει τοξικούς λιποσακχαρίτες στην επιφάνειά του Οι πρωτεΐνες του είναι εσωκυτταρικά προϊόντα Για πρωτεΐνες που θα μεταφερθούν έξω από το κύτταρο αλληλουχία σήματος (15-30 αμινοξέα) Τμήμα αμινοξέων που υδρολύεται μεμβράνη πρωτεΐνη X Εξωκυττάριος χώρος E. coli

91 Στα Gram (+) (Bacillus) βακτήρια και στα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι εφικτή η έξοδος της πρωτεΐνης στο μέσο ανάπτυξης Το (+) κατά Gram βακτήριο, Bacillus subtilis είναι η καλύτερα μελετημένη βακτηριακή εναλλακτική λύση σε σχέση με το Ε. coli. ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: αποτελεσματικό σύστημα για την έκκριση των πρωτεϊνών ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: παράγει μεγάλη ποσότητα και μια ποικιλία πρωτεασών οι οποίες μπορούν να πολύ γρήγορα αποικοδομήσουν το προϊόν

92 Κατώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα ως ξενιστές Η ζύμη Saccharomyces cerevisiae τρόφιμα/βιομηχανικές ζυμώσεις (generally recognized as safe, GRAS) καταλληλότητα της ζύμης για την παραγωγή πρωτεϊνών σχετικών με τρόφιμα. Πλεονέκτημα ως ξενιστή: η ικανότητά της να γλυκοζυλιώνει τις πρωτεΐνες και να τις εκκρίνει Μειονέκτημα: Δυσκολία επίτευξης υψηλών επιπέδων πρωτεϊνικής έκφρασης- υπεργλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών, μη ικανοποιητική έκκριση. Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Yarrowia lipolytica.

93 Οι ζύμες από Pichia pastoris και Hansenula polymorpha, μπορούν να αναπτυχθούν σε μεθανόλη ως ενεργειακή πηγή άνθρακα. Πλεονεκτήματα: Υψηλές πυκνότητες κυττάρων (π.χ. έως 100 g/) Υψηλά επίπεδα έκφρασης ορισμένων πρωτεϊνών- καλύτερη αναδίπλωση και έκκριση απ' ό,τι στο Ε. coli. Οι ζύμες αυτές κάνουν απλές γλυκοζυλιώσεις πρωτεϊνών ενώ οι υπεργλυκοζυλιώσεις είναι λιγότερο πιθανές από ότι με τη S. cerevisiae. Μειονεκτήματα: Υψηλός ρυθμός μεταβολισμού δημιουργεί υψηλά επίπεδα μεταβολικής θερμότητας που πρέπει να απομακρύνεται, καθώς και υψηλές απαιτήσεις σε οξυγόνο.

94 Mύκητες π.χ.(aspergillus και Penicillium) Η έκφραση ετερόλογων πρωτεϊνών είναι πολύ μικρή σε σχέση με αυτή των ομόλογών τους πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό η ετερόλογη πρωτεΐνη κλωνοποιείται μαζί με μια υψηλά εκφραζόμενη ομόλογη πρωτεΐνη Περιορισμοί: η σωστή στερεοχημική διαμόρφωση της ετερόλογης πρωτεΐνης, η μετα-μεταφραστική τροποποίησή της, η ενδοκυττάρια μεταφορά και έκκρισή της.

95 Ανάγκη για πολύπλοκες γλυκοζυλιώσεις και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (Ν- και Ο-γλυκοσυλίωση, σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών για τη σωστή αναδίπλωση) όλα τα συστήματα των κατώτερων ευκαρυωτών δεν είναι κατάλληλα Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται καλλιέργειες ζωικών κυττάρων.

96 Ζωικά κύτταρα ως ξενιστές Διάφορες κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί ως ξενιστές για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών. Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενες είναι οι σειρές κυττάρων CHO (κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ).

97 Μειονέκτημα α) το υψηλό κόστος της διεργασίας β) τα ζωικά κύτταρα διαιρούνται μερικές μόνο φορές (θνησιγενείς κυτταρικές σειρές). γ) οι φορείς κλωνοποίησης είναι συνήθως ιοί ανώτερων θηλαστικών γεγονός που εγείρει επιφυλάξεις για τη χρησιμοποίησή τους καθώς θα μπορούσαν να είναι παθογόνοι για τον άνθρωπο

98 δ) Xαμηλή παραγωγικότητα - Οι περισσότεροι από αυτούς τους φορείς δεν μπορούν να δώσουν υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης-στόχου Υψηλότερα επίπεδα έκφρασης (π.χ. >100 mg/l της εκκρινόμενης, ενεργής πρωτεΐνης) μπορεί να ληφθούν μέσω της ενίσχυσης του αριθμού αντιγράφων των γονιδίων

99 Παρ όλο το υψηλό κόστος, τη χαμηλή παραγωγικότητα, τη μη σταθερότητα έκφρασης, το μεγάλο χρόνο που απαιτείται για την παραγωγή, πλήθος σημαντικών θεραπευτικών πρωτεϊνών παράγονται σε αυτού του είδους τα κύτταρα λόγω της υψηλής ποιότητάς τους. Φαρμακευτικές πρωτεΐνες Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου Ερυθροποιητίνη Παράγοντες VII, VIII, IX, X Ιντερλευκίνη-2 Λειτουργία Παράγοντας που αποτρέπει την πήξη του αίματος Αντιαναιμικός παράγοντας Aιμοφιλία Αντικαρκινική δράση, θεραπεία για HIV Μονοκλωνικά αντισώματα Ιντερφερόνη α, β και γ Θεραπευτικά και διαγνωστικά μέσα Αντικαρκινικά και αντιικά μέσα

100 Κύτταρα εντόμων Για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών (ανοσοσφαιρινών, ιικών αντιγόνων, και μεταγραφικών παραγόντων) σε εργαστηριακή ή σχετικά μικρή (<100 l) κλίμακα χρησιμοποιείται το σύστημα κύτταρο εντόμουβακιλοϊού. Οι ανασυνδυασμένοι βακιλοϊοί χρησιμοποιούνται ευρέως ως φορείς κλωνοποίησης σε κύτταρα εντόμων. Τα κύτταρα των εντόμων διαθέτουν πολλές ομοιότητες ως προς τις μετα-μεταφραστικές τροποποίησης με τα ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα, αν και η δυνατότητα γλυκοσυλίωσης που διαθέτουν είναι περιορισμένη

101 Το σύστημα έντομο-βακιλοϊού, χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα έκφρασης ενώ θεωρείται σημαντικά πιο ασφαλές σύστημα σε σχέση με τα συστήματα θηλαστικών-ρετροϊών. Αν και υπάρχουν όλοι οι απαραίτητοι μηχανισμοί μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, κάποιες από τις πρωτεΐνες που παράγονται από το σύστημα κύτταρο εντόμου-βακιλοϊού, δεν σχηματίζονται πανομοιότυπα με τις φυσικές πρωτεΐνες.

102 Dictyostelium discoideum Μονοκύτταρος οργανισμός εναλλακτικό ευκαρυωτικό σύστημα Πλεονέκτημα: διαθέτει την ικανότητα μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων (φωσφορυλίωσης, ακετυλίωσης, γλυκοσυλίωσης) ανάλογων αυτών που παρατηρούνται στους ανώτερους εξελικτικά ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εκφράζονται από εξωχρωμοσωμικά πλασμίδια (είναι από τους λίγους ευκαρυωτικούς οργανισμούς που έχει κυκλικό πυρηνικό πλασμίδιο υπόκεινται εύκολα σε χειρισμούς γενετικής τροποποίησης και επιπλέον απομονώνονται πολύ εύκολα) Αυτός ο οργανισμός είναι ιδανικός για την έκφραση σύνθετων γλυκοπρωτεϊνών. Όμως ο μικρός ρυθμός αναπαραγωγής του σε σχέση με τα βακτήρια καθιστά τη χρήση του μη χρηστική σε βιομηχανική κλίμακα.

103 Πρωτόζωα του γένους τρυπανόσωμα Αποτελούν νέα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Πολλές κυτταρικές λειτουργίες όπως η γλυκοσυλίωση μοιάζουν με αυτές των ανώτερων εξελικτικά ευκαρυωτικών οργανισμών. Διαθέτουν υψηλό ρυθμό διπλασιασμού οπότε και μπορούν να αναπαραχθούν ταχύτατα σε σχετικά φθηνό θρεπτικό μέσο. Τα πρωτόζωα δεν είναι παθογόνα για τον άνθρωπο και έτσι έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για την έκφραση πολύ σημαντικών πρωτεϊνών όπως της ερυθροποιητίνης, της ιντερφερόνης-γ, και της ιντερλευκίνης 2.

104 Περιορισμοί στην παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων από γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς Γενετική αστάθεια: Τα κύτταρα που περιέχουν πλασμίδια και παράγουν ετερόλογη πρωτεΐνη αναπτύσσονται πολύ πιο αργά σε σχέση με τα κύτταρα που δεν περιέχουν πλασμίδια. Τα κύτταρα που περιέχουν πλασµίδια που παράγουν πρωτεϊνη καταναλώνουν ενέργεια όχι για την ανάπτυξή τους µε αποτέλεσµα να αναπτύσσονται πολύ πιο αργά

105 Δομική αστάθεια πλασμιδίων Ορισμένα κύτταρα τροποποιούν τα πλασμίδια ώστε να μειωθούν οι επιβλαβείς επιδράσεις τους στο κύτταρο (δομική αστάθεια). Τα κύτταρα που περιέχουν τα τροποποιημένα πλασμίδια μπορούν να αυξηθούν με διαφορετικό ρυθμό από τα κύτταρα που έχουν τα αρχικά πλασμίδια.

106 Ένας άλλος περιοριστικός παράγοντας σχετίζεται με το γεγονός ότι στα κύτταρα-ξενιστές είναι δυνατόν να εμφανιστούν μεταλλάξεις που τα καθιστούν ακατάλληλα ως συστήματα παραγωγής ενός συγκεκριμένου προϊόντος. Οι μεταλλάξεις αυτές αλλάζουν συχνά τη ρύθμιση του κυττάρου και οδηγούν σε μειωμένη σύνθεση της πρωτεΐνης-στόχου

107 Aπώλεια διαχωρισμού εμφανίζεται όταν ένα κύτταρο διαιρείται έτσι ώστε ένα από τα θυγατρικά κύτταρα να μην εμπεριέχει κανένα πλασμίδιο. Η αστάθεια διαχωρισµού προκύπτει όταν ένα διαιρούµενο κύτταρο προσφέρει όλα του τα πλασµίδια στον ένα απόγονο και κανένα στον άλλο 1 στο (σε ένα βιοαντιδραστήρα ο αριθμός είναι μεγάλος) Η απώλεια διαχωρισμού των πλασμιδίων επηρεάζεται από πολλούς περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως το Ο 2, η θερμοκρασία, το θρεπτικό υλικό ανάπτυξης.

108 Η υπερ-έκφραση των ξένων γονιδίων στο γενετικά τροποποιημένο κύτταρο μπορεί να πραγματοποιηθεί με ενσωμάτωση πολλαπλών αντιγράφων του γονιδίου που κωδικοποιεί τη βιοσύνθεση του προϊόντος.

109 Στη βιοτεχνολογία η αξία ενός μικροβιακού στελέχους μετράται με την ικανότητα υπερ-παραγωγής του επιθυμητού μεταβολικού προϊόντος. Πολλά γενετικά τροποποιημένα στελέχη που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία έχουν χάσει τους γενετικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν την εξοικονόμηση ενέργειας στο κύτταρο. Αυτοί οι μικροοργανισμοί δε μπορούν να επιβιώσουν στο φυσικό περιβάλλον μπορούν όμως να αναπτύσσονται ταχύτατα στο βέλτιστο περιβάλλον που εξασφαλίζει ο βιοαντιδραστήρας.

110 Τεχνικές μεταφοράς γονιδίων σε κύτταρα 1. Μετασχηματισμός: πολλά βακτηριακά κύτταρα μπορούν να μετασχηματιστούν αρκεί να εκτεθούν σε γυμνά μόρια DNA (κατεργασία των κυττάρων με CaCl 2 & θερμικό σοκ στους 42 ο C για 45 s) 2. Hλεκτροδιάτρηση: τα κύτταρα μεταφέρονται σε διάλυμα που περιέχει DNA και δέχονται ένα ηλεκτρικό παλμό, ο οποίος προκαλεί το παροδικό άνοιγμα οπών στην εξωτερική μεμβράνη (ή στο κυτταρικό τοίχωμα αν πρόκειται για βακτήρια). Το DNA εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα (και στον πυρήνα στα ευκαρυωτικά κύτταρα)

111 Χημικά επαγόμενος μετασχηματισμός: To DNA προσλαμβάνεται άμεσα από κύτταρα παρουσία πολυαιθυλικής γλυκόλης (PEG) παρουσία ασβεστίου και υψηλού ph προωθούν τη μεταφορά DNA από το διάλυμα στο εσωτερικό των κυττάρων, προκαλώντας παροδικά ανοίγματα στις κυτταρικές μεμβράνες.

112 Μεταφορά γονιδίων με ηλεκτροδιάτρηση. Αποτελεσματικό μέσο εισαγωγής DNA και στα ζωικά κύτταρα H ηλεκτροδιάτρηση, περιλαμβάνει συνοπτικά μια σύντομη ηλεκτρική αποφόρτιση υψηλής τάσης που κάνει τα κύτταρα διαπερατά στο DΝΑ Ένα μικρό μέρος του DNA ενσωματώνεται στο γονιδίωμα

113 Γενετική Μηχανική των Ανώτερων Οργανισμών Η εισαγωγή των νέων γονιδίων σε φυτικά και ζωικά κύτταρα επιτυγχάνεται κυρίως με δύο τρόπους: α) Με άμεση μεταφορά γονιδίων απευθείας μεταφορά DNA στον πυρήνα β) Με έμμεση μεταφορά γονιδίων μέσω ενός βιολογικού φορέα

114 Άμεση μεταφορά DNA σε φυτικά κύτταρα με βομβαρδισμό μικροσφαιριδίων. Μέθοδος βομβαρδισμού με μικροβλήματα (microprojectiles): «γονιδιακό πιστόλι» Το DNA προσκολλάται στην επιφάνεια μικροσφαιριδίων από βολφράμιο ή χρυσό διαμέτρου 1μm τα οποία βάλλονται με μεγάλη ταχύτητα σε ανέπαφα κύτταρα Χρησιμοποιείται και σε ζωικά κύτταρα

115 Mικροέγχυση: Το DNA ενίεται κατευθείαν στον πυρήνα των κυττάρων μέσω λεπτών γυάλινων βελονών- Το άκρο της γυάλινης μικροπιπέτας έχει μικρή διάμετρο, που επιτρέπει τη διείσδυσή της στο κυτταρόπλασμα χωρίς να καταστρέφει το κύτταρο. Η επιτυχία της μικροέγχυσης εξαρτάται από τον εντοπισμό και προσανατολισμό του πυρήνα, ώστε το ξένο DNA να εγχύεται απευθείας στον πυρήνα, καθώς και από τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

116 Μεταφορά γονιδίων με μικροένεση Ειδικό μικροσκόπιο (αντίθεση μέσω διαφορικής παρεμβολής) Συσκευή συγκράτησης γονιμοποιημένου ωαρίου Προπυρήνας από το σπερματοζωάριο Μικροσύριγγα με το προς εισαγωγή γονίδιο Κυτταρόπλασμα που έχει μετακινηθεί λόγω φυγοκέντρησης

117 Θα σχηματίσουν τον πυρήνα του πρώτου κυττάρου του εμβρύου 2pL Κατασκευή διαγονιδιακών ποντικών με μικροένεση.

118 Εισαγωγή DNA με λιποσώματα

119 Η έμμεση μεταφορά γονιδίων

120 Για τα περισσότερα ζωικά κύτταρα, ο γενετικός χειρισμός μπορεί να επιτευχθεί υλικού. με την χρήση ιικών φορέων γενετικού Εισαγωγή ετερόλογου γονιδίου Επιμόλυνση και μεταφορά του γονιδίου στα κύτταρα-στόχος Ο ιός φέρει το ετερόλογο γονίδιο

121 Εισαγωγή γονιδίων σε φυτά με τη χρήση του πλασμιδίου Ti από το Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens βακτήριο που μολύνει τα φυτικά κύτταρα προκαλώντας τη δημιουργία φυτικών όγκων (κορονωτοί κάλοι) Ο όγκος επάγεται από το πλασμίδιο Τi το οποίο ενσωματώνει μέρος του DNA του (Τ-DNA) στο χρωμόσωμα του φυτικού ξενιστή Τi-κυκλικό δίκλωνο μόριο (200kb)

122 Οι φυτικοί ιοί μεταφοράς γονιδίων στα φυτά. Οι ιοί αυτοί εμφανίζουν μικρό γονιδίωμα, εύκολη μόλυνση του φυτού, επέκταση της μόλυνση σε όλο το φυτό. Τα εξωγενή γονίδια εισάγονται στο DNA του ιού και μεταφέρονται στα φυτικά κύτταρα όπου και εκφράζονται

123 Ανεξάρτητα από την τεχνική που χρησιμοποιείται, η μοίρα του μεταφερθέντος DNA ξενιστή δεν μπορεί πάντοτε να προβλεφθεί καθώς μπορεί να υποστεί διάσπαση από νουκλεάσες, ενώ στα ζωικά ή φυτικά κύτταρα δεν φτάνει πάντοτε στον πυρήνα ή δεν ενσωματώνεται με τον ορθό τρόπο. Για το λόγο αυτό απαραίτητη είναι η εφαρμογή μεθόδων επιλογής

124 ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Τα φυτικά κύτταρα χρησιμοποιούνται για την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών π.χ φαρμακευτικές ενώσεις, χρωστικές, ευώδεις ουσίες στα τρόφιμα, αγρο-χημικά (μικροβιοκτόνα και ζιζανιοκτόνα) κ.ά. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες που παράγονται από τα φυτά μπορεί να ανήκουν στις εξής κατηγορίες: αλκαλοειδή, τερπενοειδή, στεροειδή, ανθοκυανίνες, ανθρακινόνες, πολυφαινόλες κ.α.

125 Ιστοκαλλιέργεια είναι η τεχνική ανάπτυξης φυτικών κυττάρων, ιστών, οργάνων, λειτουργικών φυτών, σπόρων ή άλλων φυτικών μερών, που ονομάζονται έκφυτα, σε ελεγχόμενο περιβάλλον κάτω από ασηπτικές συνθήκες

126 Η καλλιέργεια κυττάρων και ιστών βασίζεται στην ολοδυναμικότητα των κυττάρων. Ολοδυναμικότητα (totipotency): Η ικανότητα που έχουν σχεδόν τα περισσότερα ζωντανά φυτικά κύτταρα, διαφοροποιημένα ή όχι να αναγεννούν ένα φυτό, όταν απομονώνονται και καλλιεργούνται σε ένα κατάλληλο μέσο. Κάθε φυτικό κύτταρο είναι δυνητικά «ολοδυναμικό»

127 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα φυτικά κύτταρα μπορεί να είναι πολύ μεγάλα με διάμετρο μm. Αργή ανάπτυξη t d h. Η πηγή άνθρακα/ενέργειας είναι συνήθως η σακχαρόζη ή η γλυκόζη. Aνάπτυξη σε χημικά καθορισμένο μέσο (σακχαρόζη, ανόργανα θρεπτικά υλικά, βιταμίνες και «ορμόνες» (ή ρυθμιστές ανάπτυξης).

128 Δυο κυρίως φυτορυθμιστικές ουσίες (ορμόνες) επηρεάζουν την διαφοροποίηση: Αυξίνες: Προάγουν την ανάπτυξη των ριζών Κιτοκινίνες: Προάγουν την ανάπτυξη του βλαστού Η έκθεση στο φως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη ρύθμιση της έκφρασης συγκεκριμένων μεταβολικών μονοπατιών.

129

130 Για την παραγωγή προϊόντων από φυτικά κύτταρα η καθιερωμένη διεργασία βασίζεται είτε στη χρησιμοποίηση των κάλλων (callus) (αδιαφοροποίητη μάζα) είτε στις καλλιέργειες εναιωρήματος (suspension cultures) Ένας κάλλος μπορεί να σχηματιστεί από οποιοδήποτε τμήμα του φυτού που περιέχει διαιρούμενα κύτταρα.

131 Το φυτικό υλικό που προέρχεται από εκτομή τοποθετείται σε στερεοποιημένο μέσο που περιέχει θρεπτικά συστατικά και ορμόνες. Οι συνήθεις συνθήκες επώασης είναι 27 C σε pη 5.5.

132 H παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω καλλιεργειών κυττάρων σε βιοαντιδραστήρες αντί της παραλαβής από φυτικά τμήματα, προσφέρει διάφορα πλεονεκτήματα όπως: -ανεξαρτησία από κλιματολογικούς παράγοντες -δυνατότητα ρύθμισης της διαδικασίας -καλλιέργεια υπό ελεγχόμενες και βελτιστοποιημένες συνθήκες

133 Διαφορές μεταξύ των καλλιεργειών φυτικών και μικροβιακών κυττάρων Διαφορές Επιπτώσεις στο σχεδιασμό των βιοαντιδραστήρων Μικρότερος ρυθμός αναπνοής Απαιτείται χαμηλότερος ρυθμός μεταφοράς Ο 2 Μεγαλύτερη ευαισθησία στις διατμητικές τάσεις Τα φυτικά κύτταρα συχνά μεγαλώνουν ως συσσωματώματα ή συμπαγής μάζα Ο βαθμός της συσσωμάτωσης μπορεί να επιδρά στο δευτερογενή μεταβολισμό Πτητικές ουσίες (π.χ CO 2 ) μπορεί να είναι σημαντικές στον κυτταρικό μεταβολισμό Χειρισμός υπό συνθήκες χαμηλής διάτμησης Περιορισμοί στη μεταφορά μάζας που εμποδίζουν τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών στα κύτταρα Μπορεί να υφίσταται ένα άριστο μέγεθος συσσωματωμάτων για την παραγωγή του προϊόντος Μπορεί να απαιτείται παροχή/ψεκασμός μείγματος αερίων

134 Εισαγωγή γονιδίων σε φυτά με τη χρήση του πλασμιδίου Ti από το Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens βακτήριο που μολύνει τα φυτικά κύτταρα προκαλώντας τη δημιουργία φυτικών όγκων (κορονωτοί κάλοι) Ο όγκος επάγεται από το πλασμίδιο Τi το οποίο ενσωματώνει μέρος του DNA του (Τ-DNA) στο χρωμόσωμα του φυτικού ξενιστή Τi-κυκλικό δίκλωνο μόριο (200kb)

135

136

137 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΖΩΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα ζωικά κύτταρα είναι κατάλληλα για παραγωγή πρωτεϊνών που απαιτούν εκτενή και ακριβή μετα-μεταφραστική επεξεργασία, οργανωμένων ιστών (τεχνητό δέρμα), ορισμένων εμβολίων και ιών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φυτοφάρμακα. Φαρμακευτικές πρωτεΐνες Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου Ερυθροποιητίνη Παράγοντες VII, VIII, IX, X Ιντερλευκίνη-2 Λειτουργία Παράγοντας που αποτρέπει την πήξη του αίματος Αντιαναιμικός παράγοντας Aιμοφιλία Αντικαρκινική δράση, θεραπεία για HIV Μονοκλωνικά αντισώματα Ιντερφερόνη α, β και γ Θεραπευτικά και διαγνωστικά μέσα Αντικαρκινικά και αντιικά μέσα

138 Ανοσοβιολογικοί Ρυθμιστές Η ιντερφερόνη (αντικαρκινική γλυκοπρωτεΐνη που εκκρίνεται από ζωικά κύτταρα κατά τη διάρκεια έκθεσης σε καρκινογόνους παράγοντες) αποτελεί ένα παράδειγμα ενός ανοσορυθμιστή που παράγεται από κύτταρα θηλαστικών Οι λεμφοκίνες (ορμονικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τις ανοσοαπαντήσεις), οι ιντερλευκίνες (αντικαρκινικοί παράγοντες), Ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου (ένωση που αποτρέπει την πήξη του αίματος).

139 Tα ζωικά κύτταρα είναι πιο σύνθετα και πιο εύθραυστα από τα κύτταρα βακτηρίων, μυκήτων και ζυμών. Δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμα αλλά περιβάλλονται από μια λεπτή και εύθραυστη κυτταρική μεμβράνη που αποτελείται από λίπη, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Τα ζωικά κύτταρα ποικίλουν τόσο ως προς το μέγεθος (από 10 έως 30 μm) όσο και ως προς τη μορφή (σφαιρικά ή ελλειψοειδή κύτταρα)..

140 Αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια των ζωικών κυττάρων ανάπτυξη σε θετικά φορτισμένες επιφάνειες, Πολλά κύτταρα διαθέτουν συγκεκριμένους υποδοχείς στην επιφάνειά τους γεγονός που επιτρέπει την προσκόλληση σε προσδέματα /επιφάνειες - - -

141 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΖΩΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ANAΠΤΥΞΗΣ περιέχει γλυκόζη, γλουταμίνη, αμινοξέα, ορό (υγρό χωρίς κύτταρα που ανακτάται από το αίμα αλόγου (ΗS), μόσχου (CS) ή εμβρύου βοοειδών (FBS)) μεταλλικά άλατα και Ανάπτυξη θρεπτικών υλικών χωρίς ορό [π.χ. τροποποιημένα υλικά Eagle's (MEM), F12 (Ham s), CMRl 1066]

142

143 Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια ζωικών κυττάρων διαφέρουν σημαντικά από εκείνες που χρησιμοποιούνται στα βακτήρια, τις ζύμες και τους μύκητες.

144 Αρχική (πρωτογενής) καλλιέργεια Ιστοί που αφαιρούνται υπό στείρες συνθήκες από συγκεκριμένα όργανα ζώων, τεμαχίζονται σε μικρά τεμάχια (~2 mm 3 ), μεταφέρονται σε θρεπτικό υλικό αύξησης που περιέχει ορό και μικρά ποσά αντιβιοτικών σε μικρές Τ-φιάλες στους 37 o C.. Η κυτταρική σειρά που λαμβάνεται από την πρωτογενή καλλιέργεια είναι γνωστή ως δευτερογενής καλλιέργεια

145 Ανάπτυξη στους 37 ο C pη = 7.3. Χρόνος διπλασιασμού h. Οι κινητικές αύξησης των κυττάρων των θηλαστικών είναι παρόμοιες με τη μικροβιακή αύξηση.

146 Για τα περισσότερα ζωικά κύτταρα, ο γενετικός χειρισμός μπορεί να επιτευχθεί υλικού. με την χρήση ιικών φορέων γενετικού Εισαγωγή ετερόλογου γονιδίου Επιμόλυνση και μεταφορά του γονιδίου στα κύτταρα-στόχος Ο ιός φέρει το ετερόλογο γονίδιο

147 Οι περισσότερες από τις διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές θηλαστικών είναι θνητές. Αυτές οι κυτταρικές σειρές υπόκεινται στη διαδικασία της γήρανσης. Τα κύτταρα που μπορούν να πολλαπλασιαστούν για αόριστο χρόνο καλούνται συνεχείς, μη θνητές ή μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές. Τα καρκινικά κύτταρα είναι φυσικώς μη θνητά. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές σειρές μετασχηματίζονται, αν και δεν είναι σαφές εάν όλες οι μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές είναι καρκινικές.

148 Λόγω της σύνδεσης του καρκίνου με το μετασχηματισμό κυττάρων, έχουν εκφραστεί ορισμένες επιφυλάξεις προκειμένου να λάβουν έγκριση προϊόντα που έγιναν από μετασχηματισμένα κύτταρα. Τα τελευταία χρόνια έχουν εγκριθεί διεργασίες που χρησιμοποιούν μη θνητά κύτταρα για την παραγωγή θεραπευτικών προϊόντων.

149 Καλλιέργεια υβριδωμάτων. Τα κύτταρα υβριδωμάτων λαμβάνονται από τη σύντηξη λεμφοκυττάρων (κανονικά κύτταρα αίματος που παράγουν αντισώματα) με κύτταρα μυελωμάτων (καρκινικά). Τα υβριδώματα γίνονται μη θνητά, μπορούν να αναπαραχθούν για απεριόριστο χρόνο και παράγουν αντισώματα. Χρησιμοποιώντας κύτταρα υβριδωμάτων μπορούν να παραχθούν μονοκλωνικά αντισώματα (προερχόμενα από ένα τύπο κυττάρου) για συγκεκριμένα αντιγόνα.

150 Λεμφοκύτταρα που παράγουν αντισώματα για το αντιγόνο Σύντηξη κυττάρων παρουσία PEG Κύτταρα μυελώματος ποντικού Ευπαθή σε ΗΑΤ Λείπει η τρανσφεράση της P-ριβοζυλο-υποξανθίνης και κατά συνέπεια δεν επιζούν σε μέσο HAT ΗΑΤ Υποξανθίνη Αμινοπτερίνη Θυμιδίνη Μόνο υβριδωματικά κύτταρα επιβιώνουν

151

152 EΦΑΡΜΟΓΕΣ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Μεγάλη εξειδίκευση Εύκολη παραγωγή 1. ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 2. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 3. ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΕΙΣ 4. ΘΕΡΑΠΕΙΑ 5. ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ 6. ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ

153 ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Χρήση καρκινικών κυττάρων (περιέχουν μοναδικά αντισώματα στην επιφάνειά τους) ως ανοσογόνα Παράγονται αντισώματα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου Σε αυτά συνδέονται τοξίνες ή ραδιοϊσότοπα Σύνδεση με καρκινικά κύτταρα και καταστροφή τους με τη δράση των τοξινών Εκπέμπεται ακτινοβολία που καταστρέφει μόνο καρκινικά κύτταρα που έχουν συνδέσει το αντίσωμα Εφαρμογή στη διαγνωστική απεικόνιση

154 Καταλυτικά αντισώματα Παραγωγή αντισωμάτων έναντι μορίων (απτενίων) ανάλογα της μεταβατικής κατάστασης των ενζυμικών υποστρωμάτων O Εστέρας R CH 2 C O R' + H 2 O O - O - Τετραεδρική μεταβατική κατάσταση R CH 2 C O R' OH R CH 2 P O R' O Φωσφονικό ανάλογο O ΑΠΤΕΝΙΟ Προϊόντα R CH C 2 OH + R' OH

155 Σύζευξη με πρωτεΐνη φορέα Φωσφονικό ανάλογο Αντίσωμα με καταλυτικές ιδιότητες Δομή ανάλογη της μεταβατικής κατάστασης

156 Στάδια παραγωγής καταλυτικών αντισωμάτων Επιλογή της αντίδρασης Σχεδιασμός και σύνθεση αναλόγου της μεταβατικής κατάστασης Σύζευξη σε πρωτεΐνη-φορέα (απτένιο) Ανάλυση δομής Επανασχεδιασμός (αν είναι αναγκαίο) Τεχνολογία υβριδώματος για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Καταλυτικά αντισώματα Διαλογή για αντισώματα με καταλυτική δράση Μοκοκλωνικά αντισώματα

157 Τι είναι γονιδιακή θεραπεία; Η αντιμετώπιση ενός σφάλματος του μεταβολισμού που οφείλεται σε αδυναμία του γενετικού υλικού, με εισαγωγή κατάλληλου γονιδίου Ο στόχος της γονιδιακής θεραπείας είναι ο κατάλληλος γονιδιακός χειρισμός για τη σύνθεση φυσιολογικών γονιδιακών προϊόντων ή την απενεργοποίηση γονιδίων που παράγουν ανεπιθύμητα ποσά προϊόντων

158 Το θεραπευτικό φυσιολογικό γονίδιο εισάγεται μέσω φορέων απευθείας στα κύτταρα του ιστού-στόχου του αρρώστου. In vivo In vivo Ενδοσωματική γονιδιακή θεραπεία

159 Eξωσωματική γονιδιακή θεραπεία Εx vivo Λαμβάνονται αυτόλογα κύτταρα από τον ασθενή τα οποία αναπτύσσονται στο εργαστήριο. Τα κύτταρα στη συνέχει εκτίθενται σε ιό που έχει το προς μεταφορά γονίδιο Εx vivo Τα τροποποιημένα κύτταρα διοχετευονται πίσω στον ασθενή

160 Μεταφορά γονιδίων με ιούς Φυσικός ιός Εισαγωγή τροποποιημένων (θεραπευτικών) γονιδίων Απομάκρυνση γονιδίων απαραιτήτων για τη μεταγραφή Επιμόλυνση μεταφορά «θεραπευτικού γονιδίου» κύτταρα- στόχος και του στα Ο ιός φέρει πλέον το «θεραπευτικό» γονίδιο

161 Στο πλαίσιο της γονιδιακής θεραπείας η χρήση ρετροϊών και αδενοϊών αποτελεί την πιο διαδεδομένη μέθοδο μεταφοράς γονιδίων

162 Σήμερα δοκιμάζονται πάνω από 300 πρωτόκολλα γονιδιακής θεραπείας που αφορούν ποικίλες ασθένειες, όπως λ.χ. αιμοφιλία, AIDS, κυστική ίνωση, διάφορους καρκίνους Πάρκινσον, Αλτσχάιμερ, Χορεία του Χάντινγκτον, και πολλές άλλες διαταραχές, όπως η οικογενής υπερχοληστεριναιμία κ.ά.

163 Ashanti de Silva 13 ετών. Η πρώτη ασθενής που έλαβε γονιδιακή θεραπεία (διαταραχή του ανοσοποιητικού συστήματος)

164 Φορείς που χρησιμοποιούνται στη γονιδιακή θεραπεία Φορείς που χρησιμοποιούνται στη γονιδιακή θεραπεία

165 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ 1. Αποτελεσμταικότητα φορέων μεταφοράς του φυσιολογικού γονιδίου. 2. Μη σταθερή και συνεχής έκφραση του μεταφυτευμένου γονιδίου 3. Ανεξέλεγκτη εμφύτευσή του στο χρωμόσωμα 4. Ανεπιθύμητες ανοσολογικές αντιδράσεις 5. Προβλήματα από τη χρήση ιών (τοξικότητα, ανοσολογική δράση, φλεγμονή) 6. Δυσκολίες εντοπισμού και επιλογής του κατάλληλου τύπου των υπό θεραπεία κυττάρων 7. Μικρός αριθμός τροποποιημένων γονιδίων που μπορούν να μεταφερθούν 8. Υψηλό κόστος

166

167 Προϋποθέσεις επιτυχίας Εισαγωγή του DNA χωρίς διαταραχή άλλων ζωτικών γονιδίων Ρυθμιζόμενη έκφραση του εισαγόμενου γονιδίου Μεταφορά DNA στα κατάλληλα κύτταρα με αποτελεσματικό τρόπο και χαμηλό κόστος

168 Πέραν της γονιδιακής θεραπείας έχουν αναπτυχθεί και άλλες μορφές θεραπευτικών παραμέτρων των νουκλεϊκών οξέων, όπως λ.χ. σχεδιασμένα ολιγονουκλεοτίδια και RNA ένζυμα που επιδιορθώνουν γονιδιακές μεταλλάξεις in vivo.