Δρ. Νικόλας Φωκιαλάκης. Επίκουρος Καθηγητής. Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων

Transcript

1 ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΙΙ Δρ. Νικόλας Φωκιαλάκης Επίκουρος Καθηγητής Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων

2 Βασικές αρχές στην φυτοχημική ανάλυση Θεωρητικό υπόβαθρου των τεχνικών Μέθοδοι και τεχνικές που εφαρμόζονται σε ερευνητικό επίπεδο Βασικές μέθοδοι που εφαρμόζονται στην βιομηχανία Ανάπτυξη μεθοδολογίας Αποτίμηση βιολογικής δράσης Διεπιστημονικές εφαρμογές (βιοκατευθυνόμενη απομόνωση, μεταβολομική, κλπ) ΣΚΟΠΟΣ

3 1. Μέθοδοι εμπλουτισμού εκχυλισμάτων, κλασμάτωσης, και απομόνωσης φυσικών προϊόντων 2. Μέθοδοι ταυτοποίησης φυσικών προϊόντων 3. Αξιολόγηση της βιολογικής δράσης ΔΟΜΗ

4 Μέθοδοι εμπλουτισμού εκχυλισμάτων, κλασμάτωσης και απομόνωσης φυσικών προϊόντων

5 Εμπλουτισμός φυτικών εκχυλισμάτων Πού στοχεύει? Στην αύξηση της περιεκτικότητας ενός εκχυλίσματος σε κάποιο επιθυμητό προϊόν Γιατί? Συνήθως τα επιθυμητά συστατικά συναντώνται σε πολύ μικρό ποσοστό στα φυτικά εκχυλίσματα

6 Εκχυλίσεις Στερεό / υγρό Υγρό / υγρό

7 Εκχύλιση υγρό / υγρό Επιλογή διαλύτη Να μην αντιδρά με την ουσία Να ανακτάται εύκολα Η αμοιβαία διαλυτότητα των διαλυτών να είναι αμελητέα Να μην σχηματίζουν γαλάκτωμα Να μην είναι τοξικός Να είναι καλή η διαλυτότητα της ουσίας στο εκχυλιστικό μέσο.

8

9 Solvent Miscibility Table In this table, comparesion of commenly used solvents are given. Immiscible (that means that in some proportions two phases will be produced) Miscible

10 Snyder's solvent classification scheme for normal phase chromatography proton acceptors (x e ) and proton donors (x d ), and their dipole interactions (x n )]. Individual solvent strengths (s i )

11

12

13

14

15 Εκχυλιστήρες βιομηχανικής κλίμακας

16 Συντελεστής κατανομής ΚD ΚD= a1/a2 a1= ενεργότητα της ουσίας α στην φάση 1 a2= ενεργότητα της ουσίας α στην φάση 2 Για δεδομένο σύστημα διαλυτών εξαρτάται μόνο από την θερμοκρασία. Ισχύει μόνο όταν η ουσία βρίσκεται στις δύο φάσεις με την ίδια ακριβώς μορφή

17 Λόγος Κατανομής D D= C2/C1 C1 = Η ολική συγκέντρωση της ουσίας Α στην φάση 1 C2 = Η ολική συγκέντρωση της ουσίας Α στην φάση 2

18 Πολλαπλές εκχυλίσεις Wn = ( V1 / DV2+V1) n Wo Wn = η πόσότητα της ουσίας Α που παραμένει στην στιβάδα 1 μετά από n εκχυλήσεις. V1= διαλύτης 1 V2= διαλύτης 2 (όπου V2=V1) D = λόγος κατανομής Wο = η ποσότητα της ουσίας Α που υπάρχει αρχικά στην στιβάδα 1

19 Countercurrent Extraction Θεωρία Η εκχύλιση κατ' αντιρροή (countercurrent extraction) αποτελεί μέθοδο πολλαπλών εκχυλίσεων υγρού-υγρού, με την οποία πετυχαίνεται ο διαχωρισμός ουσιών που διαφέρουν ως προς το λόγο κατανομής στο διφασικό σύστημα. Η εκχύλιση κατ' αντιρροή μπορεί να πραγματοποιηθεί εύκολα με μια έξυπνη κατασκευή, γνωστή ως συσκευή Craig. Η συσκευή Craig αποτελείται από μια σειρά υάλινων σωλήνων συνδεμένων μεταξύ τους έτσι, ώστε να είναι δυνατή η μεταφορά της επάνω φάσης (ειδικώς ελαφρότερη φάση) από το ένα σωλήνα στον επόμενο. 'Ολες οι εκχυλίσεις και μεταφορές γίνονται συγχρόνως σε όλους τους σωλήνες, οι οποίοι εκτελούν είδος περιστροφικών κινήσεων συνήθως με ηλεκτρομηχανικά μέσα.

20 F. Craig Apparatus and Craig Countercurrent distribution Η κάτω φάση με τον (ειδικώς) βαρύτερο διαλύτη (π.χ. νερό, με μπλε χρώμα στην εικόνα), αποτελεί τη "στατική φάση", ενώ η επάνω φάση με τον (ειδικώς) ελαφρότερο διαλύτη (π.χ. εξάνιο, με κόκκινο χρώμα στην εικόνα) αποτελεί την "κινητή φάση". Προφανώς οι ουσίες με τους μεγαλύτερους λόγους κατανομής (δηλ. με μεγαλύτερη "προτίμηση" για τον ελαφρότερο διαλύτη) κινούνται ταχύτερα από τον ένα σωλήνα στο άλλο, σε σχέση με τις ουσίες με μικρότερους λόγους κατανομής. Lyman C. Craig, Ph.D. Albert Lasker Award

21 Extraction 1 Transfer 1a Transfer 1b Extraction 2 Transfer 2 Extraction 3

22 ΤΕΧΝΙΚΕΣ Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC) High-Performance Countercurrent Chromatography (HPCCC) High-Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) Centrifugal Partition Chromatography (CPC)

23 Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC) Η Droplet CCC είναι η πιο παλιά μέθοδος της CCC. Χρησιμοποιεί μόνο βαρύτητα για να κινηθεί η κινητή φάση μέσω της στατικής φάσης. Κατά την εφαρμογή της κατιούσας DCCC, σταγόνες από την κινητή φάση και το δείγμα, περνούν μέσα από τη στήλη με την στατική φάση, χρησιμοποιώντας μόνο τη βαρύτητα.

24 High-Performance Countercurrent Chromatography (HPCCC)

25 Στην HPCCC ο εξοπλισμός απαιτεί μια στήλη που αποτελείται από ένα σωλήνα τυλιγμένο γύρω από ένα πηνίο. Το πηνίο περιστρέφεται γύρω από ένα διπλό άξονα ο οποίος προκαλεί πεδίο μεταβλητής βαρύτητας που δρα σε κάθε στήλη κατά τη διάρκεια της περιστροφής. Αυτή η κίνηση κάνει τη στήλη να ξεκινήσει το διαχωρισμό ανά περιστροφή και έτσι τα συστατικά του μείγματος αρχίζουν να διαχωρίζονται. Ο διαχωρισμός με HPCCC έχει υψηλή ποιότητα και γίνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα.

26 High-Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) Η HSCCC αποτελείται από μια ελικοειδή σπείρα αδρανών σωληνώσεων που περιστρέφονται γύρω από τον άξονά τους. Τα περισσότερα όργανα HSCCC περιέχουν πολλά πηνία διαχωρισμού που μπορούν να συνδεθούν είτε σε σειρά είτε παράλληλα.

27 Centrifugal Partition Chromatography (CPC) Η CPC αποτελείται από ένα μοναδικό στροφείο το οποίο περιστρέφεται γύρω από τον άξονά του. Η CPC κάνει λιγότερο θόρυβο και δονείται λιγότερο. Ακόμα προσφέρει μεγαλύτερο φάσμα περιστροφής σε σχέση με την HSCCC. Άρα επιτρέπει καλύτερη καθίζηση κυρίως στα διφασικά συστήματα.

28 Ο στροφέας του CPC αποτελείται από επαλληλία δίσκων, στους οποίους είναι χαραγμένες μικρές κυψελίδες όπου γίνεται ο χρωματογραφικός διαχωρισμός. Ο στροφέας γεμίζει με την στατική φάση η οποία μένει μέσα, ενώ η κινητή φάση μεταφέρεται μόνο από το στροφέα. Λειτουργεί και σε ανιούσα και κατιούσα φάση, ενώ δεν χρησιμοποιεί βαρύτητα αλλά τη δύναμη του στροφέα.

29 CPC MECANISM Inlet Interdiscs gaskets F centrifuge F c Outlet Upper phase Lower phase F c Descending Mode F c Ascending Mode

30 Eκχύλιση κατ' αντιρροή- Hight speed Countercurrentb Chromatography (HSCC)

31 Eκχύλιση κατ' αντιρροή- Hight speed Countercurrentb Chromatography (HSCC) 100% παραλαβή του δείγματος σύντομη δεν αποικοδομούνται οι μεταβολίτες χαμηλό κόστος μικρή / κατανάλωση διαλυτών εκλεκτική δυνατότητα για πιλοτική κλίμακα

32 Μικρότερες θεωρητικές πλάκες από τις άλλες υγρές χρωματογραφίες (HPLC) άρα μικρότερη αποτελεσματικότητα της στήλης κατά το διαχωρισμό μειγμάτων ουσιών με παραπλήσιους χρόνους συγκρατήσεως. ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ

33 ΜΕΘΟΔΟΙ Normal mode Reverse mode Dual mode Gradient mode ph Zone Refining

34 Normal mode Η στατική φάση είναι πιο πολική από την κινητή φάση. Επομένως, τα πιο πολικά συστατικά συγκρατούνται ισχυρότερα από τη στατική φάση και εκλούονται αργότερα από τα λιγότερο πολικά.

35 Ένα παράδειγμα χρήσης της χρωματογραφίας κανονικής φάσης είναι η απομόνωση, ο διαχωρισμός και ο καθαρισμός υδατοδιαλυτών συστατικών Η στατική φάση που χρησιμοποιείται είναι υδατική, ενώ η κινητή φάση είναι οργανική.

36 Reverse mode Η στατική φάση είναι λιγότερο πολική από την κινητή. Επομένως, τα πιο πολικά συστατικά εκλούονται νωρίτερα από τα λιγότερο πολικά καθώς συγκρατούνται ασθενέστερα από τη στατική φάση.

37 Dual mode Η κινητή φάση και η κατεύθυνση της ροής αλλάζουν διεύθυνση σε κάποια φάση του διαχωρισμού, έτσι ώστε οι ενώσεις που έχουν ισχυρή συγγένεια με τη στατική φάση να μπορούν να εκλουσθούν γρήγορα. Αυτή η μέθοδος εξασφαλίζει την έκλουση όλου του ενέσιμου δείγματος, τον καλύτερο διαχωρισμό των συστατικών, καθώς και την αποφυγή εξαιρετικά υψηλών χρόνων κατακράτησης των αναλυτών.

38 Gradient mode Η κινητή φάση έχει συστηματικά αυξανόμενη ή μειούμενη πολικότητα, ώστε να καλύψει μεγαλύτερο εύρος πολικοτήτων απ ότι ένα σύστημα ενός μόνο διαλύτη.

39 ph Zone Refining Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί βασική οργανική φάση και όξινη υδατική φάση (ή αντίστροφα) για το διαχωρισμό. Οι αναλυτές, αφού διαλυθούν στη στατική φάση σε μία ιονική μορφή, διαβιβάζονται στην κινητή φάση σύμφωνα με τις τιμές pka και τη διαλυτότητά τους. Σημαντικά πλεονεκτήματα είναι η μεγάλη ικανότητα φόρτωσης και η υψηλή διαχωριστική ικανότητα.

40

41 Διήθηση Τεχνική διαχωρισμού στερεού-υγρού: Κατακράτηση στερεών σωματιδίων από το φίλτρο Ελεύθερη δίοδος υγρού (διήθημα) Αποτέλεσμα: το διήθημα γίνεται καθαρότερο από το αρχικό αιώρημα Προϋποθέσεις: Φίλτρο κατάλληλου πορώδους Διαφορά πίεσης στις δυο πλευρές του φίλτρου

42

43 Μέθοδοι Διήθησης

44 Microfiltration Microfiltration is a filtration process which removes contaminants from a fluid (liquid & gas) by passage through a microporous membrane. A typical microfiltration membrane pore size range is 0.1 to 10 micrometeres (µm). Microfiltration is not fundamentally different from reverse osmolisis, ultrafiltration or nano filtration, except in terms of the size of the molecules it retains.

45 Cross-flow filtration μέθοδος διήθησης σε σωλήνες που στα τοιχώματα τους φέρουν φίλτρα (μεμβράνες) το προς διήθηση διάλυμα ρέει εφαπτομενικά προς το φίλτρο (διαφορά με κλασσική διήθηση όπου το διάλυμα ρέει μέσα στο φίλτρο) εφαρμογή πίεσης στο ένα άκρο του σωλήνα διαλύματος προς μια μόνο κατεύθυνση εξαναγκάζει κίνηση το διήθημα μπορεί να συγκεντρώνεται και να επανατροφοδοτείται στο σωλήνα αύξηση αποτελεσματικότητας

46

47 Cross-flow filtration Πλεονεκτήματα: το ίζημα που κατακρατείται από το φίλτρο ξεπλένεται από τη συνεχή ροή του διαλύματος συνεχής διήθηση (εύκολη αυτοματοποίηση της τεχνικής) υψηλότερα ποσοστά ανάκτησης του επιθυμητού συστατικού στο διήθημα οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται ως φίλτρα εύκολα ξεπλένονται και επαναχρησιμοποιούνται οικονομικά συμφέρουσα διαδικασία φιλική προς το περιβάλλον κλειστό σύστημα ελαχιστοποίηση του κινδύνου επιμόλυνσης εύκολη η εφαρμογή της σε βιομηχανική κλίμακα

48 Συσκευή cross-flow filtration βιομηχανικής κλίμακας Κεραμικές μεμβράνες στο εσωτερικό της συσκευής

49 Citrus limonum, Rutaceae (λεμόνι) Χρήση: στην νέα αγορά οικολογικών προϊόντων ως: - υποκατάστατο του κιτρικού οξέος σαν παράγοντα οξίνισης σε κονσέρβες φρούτων (έτσι δεν έχουμε απώλεια αρωματικής ποιότητας) - συντηρητικό τροφίμων - βελτιωτικό γεύσης

50 Έρευνα: Αναζήτηση κατάλληλου παράγοντα οξίνισης για αντικατάσταση κιτρικού οξέος Εναλλακτικές λύσεις για την παραγωγή χυμού λεμονιού Απαραίτητη η απομάκρυνση των τερπενικών υδρογονανθράκων που ευθύνονται για την υποβάθμιση του αρώματος στα τρόφιμα κατά τη συντήρησή τους με χυμό λεμονιού

51 Πειραματική διαδικασία 1. Συνεχής φυγοκέντρηση: - για απομάκρυνση σταθερών αδιάλυτων σωματιδίων από εναιώρημα - σε παραγωγή ινών από φλούδα εσπεριδοειδών 2. Xρήση μεμβρανών τριών μεγεθών πόρων για απομάκρυνση τερπενικών υδρογονανθράκων (π.χ. λιμονένιο) Da -0,45 μ χρήση διηθήματος ως μέσο οξίνισης σε τρόφιμα -0,20 μ χρήση διηθήματος για προσθήκη αρώματος λεμονιού 3. Έκπλυση μεμβρανών: - με καθαρό νερό (θ=25 C) - με NAOH (θ= 50 C) - με καθαρό νερό (θ=25 C) 4. Ποσοτική ανάλυση με GC-MS

52 Ανακρυστάλωση

53 Καθίζηση

54 Ανακρυστάλωση Μέθοδος Α

55 Ανακρυστάλωση Μέθοδος Β

56 Ανακρυστάλωση Μέθοδος Γ

57

58

59 Ηλεκτροφόρηση

60 Ηλεκτροφόρηση Διαχωρισμός Πρωτεϊνών

61 Ηλεκτροφόρηση

62

63

64 Εκχυλίσεις στερεάς φάσης (solid phase extraction) Κανονικής Φάσης Αντίστροφης φάσης Ιοντοανταλλαγής Διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης 1.Εξισορρόπηση 2.Πρόσδεση 3.Έκπλυση 4. Εκλεκτική έκλουση

65 ADSORPTION RESINS Polymeric adsorbents are highly porous structures, mainly of styrenic or acrylic type, whose internal surfaces can adsorb mainly by π-π interactions and then desorb a wide variety of different chemical substances depending on the solvent with which they are used.

66 ADSORPTION RESINS Adsorbtion Absorbtion Αναγεννήσημες Στάδια 1. Εξισορρόπηση 2. Πρόσδεση 3. Έκπλυση 4. Εκλεκτική έκλουση

67 Columns filled with adsorption resin Pilot scale (100 lt resin) Laboratory scale (100 ml resin)