ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΕΥΟ ΩΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΥΕΛΟΥ ΑΤΟΜΩΝ ΜΕ β-μεσογειακη ΑΝΑΙΜΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ -ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙ ΙΚΟΤΗΤΕΣ» ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΝΙΚΟΛΑΟΣ Κ. ΖΟΥΜΠΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΕΥΟ ΩΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΥΕΛΟΥ ΑΤΟΜΩΝ ΜΕ β-μεσογειακη ΑΝΑΙΜΙΑ ΣΑΛΣΑ Μ. ΜΠΑΣΑΜ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ

2 ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΚΑΙ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Νικόλαος Ζούµπος Παναγιώτα Ματσουκά Σταµάτης Αλαχιώτης Χαράλαµπος Γώγος Σταµάτης Λιόσης Μαρίνα Καρακάντζα Αθανασία Μουζάκη Επιβλέπων καθηγητής Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω όσους µε βοήθησαν κατά την εκπόνηση και τη συγγραφή αυτής της διδακτορικής διατριβής. Τον καθηγητή µου κύριο Νικόλαο Ζούµπο, στον οποίο εκφράζω την ευγνωµοσύνη µου για την αµέριστη υποστήριξη και την επιστηµονική καθοδήγηση που µου προσέφερε σ όλη τη διάρκεια αυτής της διατριβής. Την κυρία Παναγιώτα Ματσουκά για τις καίριες επιστηµονικές υποδείξεις της και για τη συµµετοχή της στην τριµελή συµβουλευτική επιτροπή. Τον κύριο Σταµάτη Αλαχιώτη, καθηγητή µου στην επιστήµη της βιολογίας για τη συµπαράσταση και κατανόηση που επέδειξε για σειρά ετών καθώς και για τη συµµετοχή του στην τριµελή συµβουλευτική επιτροπή. Την ιατρική οµάδα του αιµατολογικού τµήµατος και ειδικά τους γιατρούς κ. Αλέκα Κουράκλη και τον κ. Αργύρη Συµεωνίδη για τη συµπαράσταση και καθοδήγησή τους στα πρώτα µου ερευνητικά βήµατα καθώς και για τις πολύτιµες συµβουλές τους. Τους κ. Χαράλαµπο Γώγο και Σταµάτη Λιόση για τη συµµετοχή τους στην επταµελή εξεταστική επιτροπή. Τις κ. Μαρίνα Καρακάντζα και Αθανασία Μουζάκη για τις επιστηµονικές συµβουλές και τη συµµετοχή τους στην επταµελή εξεταστική επιτροπή. 3

4 Στην οικογένειά µου και ιδιαίτερα στη σύζυγό µου Στην αγαπηµένη µου πατρίδα Στην Ελλάδα µας 4

5 Περιεχόµενα Πρόλογος Αφιέρωση Σελίδα Γενικό µέρος 1 Εισαγωγή Μεταλλάξεις που προκαλούν τη β-θαλασσαιµία Τύποι β-θαλασσαιµιών Παθοφυσιολογία της β-θαλασσαιµίας Κλινική αντιµετώπιση της οµόζυγης β-θαλασσαιµίας και επιπτώσεις Το ανοσοποιητικό σύστηµα Κυτταροκίνες και ανοσοαπόκριση Ανοσολογική κατάσταση της β-θαλασσαιµίας Οι κυτταροκίνες Κυτταροκίνες και φυσική ανοσία Ιντερφερόνες (IFNs) Παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α) Ιντερλευκίνη-1 ( IL-1) Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Κυτταροκίνες και αιµοποίηση Κυτταροκίνες που επηρεάζουν την αιµοποίηση στη β-θαλασσαιµία Ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) Stem cell factor (SCF) Ιντερλευκίνη-3 (IL-3) Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) Macrophage stimulating factor (M-CSF) Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Απόπτωση και β-θαλασσαιµία Κυτταροκίνες και απόπτωση 47 Ειδικό µέρος Σκοπός 50 5 Μέθοδοι ιαχωρισµός Μονοπύρηνων Κυττάρων Αίµατος Υγρή λεµφοκυτταρική καλλιέργεια περιορισµένης διάρκειας, 52 5

6 3 ηµερών και 7 ηµερών. 5-3 Μέτρηση των κυτταροκινών µε τη µέθοδο ELISA Ηµίρρευστη καλλιέργεια µεθυλοκυτταρίνης σύντοµης διάρκειας (STC) Μελέτη παραγωγής κυτταροκινών από µονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίµατος Αποτελέσµατα Συσχέτιση µη επαγόµενης παραγωγής κυτταροκινών µε τον αριθµό των 70 µεταγγίσεων 6-3 Σύγκριση µη επαγόµενης παραγωγής κυτταροκινών σε άτοµα µε β- θαλασσαιµία, µε τα επίπεδα φερριτίνης. 6-4 Σύγκριση µη επαγόµενης παραγωγής κυτταροκινών σε άτοµα µε β- θαλασσαιµία, θετικά και αρνητικά για την ηπατίτιδα C. 6-5 Σύγκριση µη επαγόµενης παραγωγής κυτταροκινών σε άτοµα µε β- θαλασσαιµία µε ή χωρίς αγωγή µε IFN-a. 6-6 Σύγκριση µη επαγόµενης παραγωγής κυτταροκινών σε άτοµα µε β- θαλασσαιµία µε ύπαρξη ή µη σπληνεκτοµής. 6-7 Αποτελέσµατα επαγόµενης παραγωγής κυτταροκινών από µονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίµατος. 6-8 Μελέτη παραγωγής αιµοποιητικών αποικιών από µονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίµατος ατόµων µε β-θαλασσαιµία Αποτέλεσµα παραγωγής αιµοποιητικών αποικιών. 95 Συζήτηση 96 ηµοσίευση 105 Περίληψη 109 Βιογραφικό σηµείωµα 111 Βιβλιογραφία 114 6

7 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7

8 Εισαγωγή Ο Thomas Cooley και Pearl Lee το 1925 περιέγραψαν τη β-θαλασσαιµία βάσει της κλινικής εικόνας που παρουσίαζαν παιδιά που έπασχαν από βαριά αναιµία, σπληνοµεγαλία (Εικόνα 1) και χαρακτηριστικές σκελετικές αλλοιώσεις (Cooley TB et al 1925). Η βαριά αυτή αναιµία έγινε γνωστή ως αναιµία του Cooley και συµπίπτει απόλυτα µε την κλινική εικόνα της οµόζυγης β-θαλασσαιµίας. Επειδή τα πρώτα περιστατικά βρέθηκαν στην περιοχή της µεσογείου επικράτησε το όνοµα θαλασσαιµία από την ελληνική λέξη θάλασσα. Αργότερα διαπιστώθηκε η ευρεία κατανοµή της β- θαλασσαιµίας (Εικόνα 2) στη λεκάνη της Μεσογείου, στη Μέση Ανατολή, στην Ινδία, στη νοτιοανατολική Ασία και στη νότια Κίνα (Weatherall DJ et al 1996). Στις επόµενες δεκαετίες εντατικοποιήθηκε η έρευνα όσον αναφορά στη δοµή και λειτουργία της αιµοσφαιρίνης, καθώς και στη δοµή και οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών του ανθρώπου, η οποία βοήθησε στην κατανόηση των αιµοσφαιρινοπαθειών και των θαλασσαιµικών συνδρόµων. ιακόσιες περίπου µεταλλάξεις έχουν αναφερθεί οι οποίες επηρεάζουν το γονίδιο της β-σφαιρίνης. Η β-θαλασσαιµία είναι κληρονοµική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από ελλειµµατική (β + ) ή και µηδενική (β 0 ) παραγωγή αλυσίδων σφαιρίνης-β (Weatherall DJ et al 1994). Το αποτέλεσµα αυτής της διαταραχής είναι η ανισόρροπη σύνθεση σφαιρινών και η καταστροφή των ερυθροκυττάρων στο µυελό πριν βγουν στην κυκλοφορία. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα την µη αποδοτική ερυθροποίηση (Pootrakul P. et al 2000) και την εκδήλωση της αναιµίας. Πρόσφατες εργασίες έδειξαν ότι η µη αποδοτική ερυθροποίηση που παρουσιάζεται στη β- θαλασσαιµία είναι αποτέλεσµα αυξηµένου ρυθµού απόπτωσης λόγω ανεπαρκούς 8

9 σύνθεσης σφαιρινών στα ερυθροποιητικά κύτταρα του µυελού των οστών (Yuan J et al 1993, Pootrakul P et al 2000 ). Η κλινική αντιµετώπιση έχει στόχο την βελτίωση της ποιότητας και την παράταση της ζωής των ασθενών µε β-θαλασσαιµία. Οι µεταγγίσεις, η αποσιδήρωση και η σπληνεκτοµή αποτελούν τους τρεις βασικούς άξονες της κλινικής αντιµετώπισης. Οι πολλαπλές µεταγγίσεις όµως έχουν σαν αποτέλεσµα τη µετάδοση ασθενειών (Gascon et al 1984) και τη συσσώρευση σιδήρου, παράγοντες που ασκούν αρνητικές επιδράσεις στη λειτουργική ακεραιότητα του ανοσοποιητικού συστήµατος (G. Pardalos 1987). Η χρήση χηλικών φαρµάκων όπως η Desferroxamine (DFO) στοχεύει στην ελάττωση των επικίνδυνων επιπλοκών που παρατηρούνται στα όργανα λόγω υπερφόρτωσης σιδήρου. Η σπληνεκτοµή µειώνει την άµυνα του οργανισµού (Germenis et al 1988). Υπάρχουν πολλές αναφορές που περιγράφουν ποιοτικές και αριθµητικές διαταραχές των κυττάρων που συµβάλλουν στην ανοσοαπόκριση, όπως την ανεπαρκή λειτουργία των πολυµορφοπύρηνων ουδετερόφιλων και µονοκυττάρων (Zoumbos N et al 1985, Ballart IJ et al 1986), την ελάττωση των CD4 + κυττάρων και την αύξηση των CD8 + κυττάρων, τη µειωµένη ανταπόκριση στα µιτογόνα και τη µειωµένη δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων (Arne N, Goicoa 1986). Αυτά και πιθανώς άλλες άγνωστες διαταραχές µπορεί να εξηγούν την τάση για σοβαρές και µη συνηθισµένες λοιµώξεις. Η σοβαρότητα των λοιµώξεων στους θαλασσαιµικούς ασθενείς εκδηλώνεται µε επιδείνωση του βαθµού της αναιµίας και µε αυξηµένη πιθανότητα σήψης. Οι επιπλοκές από τις λοιµώξεις αποτελούν τη δεύτερη αιτία θανάτου και την κύρια αιτία νοσηρότητας σε ασθενείς µε β-θαλασσαιµία. Οι κυτταροκίνες είναι αγγελιοφόρα µόρια του ανοσοποιητικού συστήµατος, ασκούν επίδραση στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος και ρυθµίζουν την 9

10 ανοσοαπόκριση. Οι ανοσολογικές διαταραχές σε άτοµα µε β-θαλασσαιµία έχουν ως επακόλουθο την απορρύθµιση παραγωγής ορισµένων κυτταροκινών. Είναι γνωστό ότι η παραγωγή κυτταροκινών όπως IL-1, TNF-α και IFN-γ από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος, παίζει σηµαντικό ρόλο στη γενίκευση των κύριων εκδηλώσεων οξείων λοιµώξεων, όπως την εµφάνιση πυρετού και την επιδείνωση της αναιµίας. Οι κυτταροκίνες είναι οµάδες ρυθµιστικών πρωτεϊνών που εκκρίνονται από διάφορα κύτταρα, ασκούν επίδραση στα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα και προκαλούν την ενεργοποίηση, την κυτταρική αύξηση και την κυτταρική διαφοροποίηση. Η επίδραση οµάδων κυτταροκινών στη διαδικασία της αιµοποίησης είναι είτε ευοδωτική είτε κατασταλτική (Ogawa 1993, Scwarzmeier JD. 1996). Άτοµα µε β- θαλασσαιµία χαρακτηρίζονται από αιµοποιητικές διαταραχές, µη αποδοτική ερυθροποίηση και εµφάνιση αναιµίας. Η αναιµία µε τη σειρά της προκαλεί την επέκταση της ερυθροποίησης λόγω της ιστικής υποξίας, που επάγει την αύξηση της παραγωγής ερυθροποιητίνης. Υπάρχουν µελέτες που αναφέρονται στην επίδραση ορισµένων κυτταροκινών, όπως της ερυθροποιητίνης, στην αιµοποίηση ατόµων µε β- µεσογειακή αναιµία, δεν έχει γίνει όµως µέχρι σήµερα µια ολοκληρωµένη µελέτη όσον αφορά στην επίδραση των ευοδωτικών και κατασταλτικών κυτταροκινών στη διαδικασία της αιµοποίησης ατόµων µε β-µεσογειακή αναιµία καθώς και στην παραγωγή τους κατά τη διάρκεια ζωής των ατόµων αυτών, αντικείµενο µε το οποίο ασχολείται η παρούσα εργασία. 10

11 Εικόνα 1: Άτοµα µε β-θαλασσαιµία που παρουσιάζουν σπληνοµεγαλία και σκελετικές αλλοιώσεις. Εικόνα 2: Γεωγραφική κατανοµή της β-θαλασσαιµίας 11

12 1-1 Μεταλλάξεις που προκαλούν τη β-θαλασσαιµία ιακόσιες περίπου µεταλλάξεις έχουν περιγραφεί στους θαλασσαιµικούς ασθενείς (Weatherall, DJ., and Clegg, J. B.1981). Οι µεταλλάξεις έχουν ταξινοµηθεί µε βάση τα στάδια παραγωγής των αλυσίδων β-σφαιρίνης, δηλαδή από την µεταγραφή έως την παραγωγή αλυσίδων β-σφαιρίνης (Σχήµα 1-1). A) Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την µεταγραφή του γονιδίου της σφαιρίνης-β: Οι µεταλλάξεις αυτές χαρτογραφήθηκαν στην περιοχή ελέγχου του γονιδίου της σφαιρίνης β, στην περιοχή του υποκινητή και στην περιοχή 5 UTR µε τη χρήση ενζύµων περιορισµού. Είκοσι έξι σηµειακές µεταλλάξεις έχουν αναφερθεί, οι οποίες προκαλούν τρεις τύπους µειωµένης παραγωγής αλυσίδων β-σφαιρίνης και συµβολίζονται ως εξής: β +, β ++ και ο σιωπηλός-β ++. Για παράδειγµα η µετάλλαξη στη θέση -30(Τ Α) δίνει τύπο β + στην περιοχή της Μεσογείου (Fei YJ et al 1988). Η µετάλλαξη στη θέση - 86(C Α) δίνει τύπο β ++ στους Ιταλούς (Rosatelli MC et al 1992). Η µετάλλαξη στη θέση 5 UTR την CAP+10(-T) δίνει τύπο σιωπηλό-β ++ στους Έλληνες (Athanassiadou A. et al 1994). Ελλείµµατα στο γονίδιο της β-σφαιρίνης έχουν αναφερθεί στο 3 περιοχής µήκους 619bp και είναι συχνή στον Ινδικό και Πακιστανικό πληθυσµό (Thein SL et al 1984). Η παρεµβολή αλληλουχιών είναι σπάνιο φαινόµενο και έχει αναφερθεί παρεµβολή περιοχής µήκους 6-7 kb DNA στην παρεµβαλλόµενη περιοχή IVSII (Divoky V. et al 1996). Β) Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την επεξεργασία του mrna σφαιρίνης-β: Η διαδικασία αποµάκρυνσης (splicing) των παρεµβαλόµενων περιοχών IVSΙ και IVSΙΙ διαταράσσεται από σηµειακές µεταλλάξεις στα σηµεία ένωσης του εξονίου µε το ιντρόνιο, µε αποτέλεσµα να δηµιουργηθούν νέες θέσεις splicing. Έχουν αναφερθεί 23 µεταλλάξεις, οι οποίες έχουν σαν αποτέλεσµα τη µηδενική παραγωγή αλυσίδων 12

13 β-σφαιρίνης που συµβολίζεται µε τον τύπο β 0. Για παράδειγµα η µετάλλαξη IVSI -1 (G Α) δίνει τύπο β 0 στην περιοχή της Μεσογείου (Orkin SH et al 1982). Η µετάλλαξη αυτή συναντάται σε συχνότητα 16% στον ελληνικό πληθυσµό (Kollia P et al 1988). Η µετάλλαξη IVSII -1 (G Α) δίνει τύπο β 0 στην περιοχή της µεσογείου και η µετάλλαξη IVSI -3 del 17bp δίνει τύπο β 0 στoυς Κουβεϊτιανούς (Kazazian et al 1988). Ένδεκα µεταλλάξεις στις περιοχές IVSI και IVSIΙ (consensus splice site) δίνουν τύπους β +, β ++ και το σιωπηλό-β ++, όπως οι µεταλλάξεις IVSI -5 (G Τ) στην περιοχή της Μεσογείου που δίνουν τύπο β + (Atweh GF et al 1987), η µετάλλαξη IVSII -5 (G C) στoυς Κινέζους που δίνει τύπο β + ( Jiang NH et al 1993) και η µετάλλαξη IVSII -844 (C G) στoυς Ιταλούς που δίνει τύπο σιωπηλό-β ++ (Murru S et al 1991). Έξι κρυφές θέσεις splice έχουν περιγραφεί στα ιντρόνια, όπως η µετάλλαξη IVSI -110 (G Α) που δίνει τύπο β + στην περιοχή της Μεσογείου (Spritz RA et al 1981) και η µετάλλαξη IVSI -116 (Τ G) που δίνει τύπο β 0 στην περιοχή της µεσογείου. Πέντε κρυφές θέσεις splice έχουν περιγραφεί στα εξόνια, όπως η µετάλλαξη CD27 (GCC TCC) (Ala Ser),Hb Knossos που δίνει τύπο β + στην περιοχή της Μεσογείου (Arous N et al 1982) και τέλος µεταλλάξεις στο 3 UTR που δίνουν τύπους β +, β ++. Γ) Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την µετάφραση του mrna σφαιρίνης-β: Συνολικά ογδόντα έξι µεταλλάξεις έχουν αναφερθεί που επηρεάζουν την µετάφραση του mrna της σφαιρίνης β και όλες δίνουν τύπο β 0. Eπτά από αυτές αφορούν στο κωδικόνιο έναρξης (Ιnitiation codon), όπως για παράδειγµα η µετάλλαξη ATG GTG δίνει τύπο β 0 στoς Ιάπονες (Ohba Y et al 1997). εκαπέντε µεταλλάξεις που οδηγούν σε κωδικόνια χωρίς νόηµα όπως η µετάλλαξη CD15 TGG TAG, δίνουν τύπο β 0 στoς Ιάπωνες (Ohba Y et al 1997) και τέλος εξήντα τέσσερις µεταλλάξεις που αφορούν στην αλλαγή αναγνωστικού πλαισίου (frameshift) όπως η µετάλλαξη CD1 G, δίνουν τύπο β 0 στην περιοχή της Μεσογείου (Rosatelli MC et al 1992). 13

14 Μεταγραφή Ελλείµµατα Υποκινητής 5 5 UTR Μεταλλάξεις του του γονιδίου της της β-σφαιρίνης Ωρίµανση Σηµεία συνένωσης Πρόσθεση poly A Επανασύνδεση Ιντρόνια Εξόνια Μετάφραση Κωδικόνιο έναρξης Κωδικόνιο χωρίς νόηµα Αλλαγή πλαισίου ανάγνωσης Σηµειακές µεταλλάξεις β + + β Σιωπηλός-β Μεταλλάξεις σε σε θέση Splicing, IVS I I - - IVS IVS II II β Μεταλλάξεις β + +,, β++, Σιωπηλός β Μεταλλάξεις β Κωδικόνιο έναρξης Κωδικόνιο χωρίς νόηµα Αλλαγή πλαισίου ανάγνωσης Σχήµα 1-1 : Οι µεταλλάξεις του γονιδίου της β-σφαιρίνης κατά τη µεταγραφή, ωρίµανση και µετάφραση του γονιδίου. 14

15 ) Μεταλλάξεις που εντοπίζονται σε άλλα χρωµοσώµατα: Έχουν βρεθεί γενετικοί τόποι στο χρωµόσωµα Χ που επηρεάζουν την έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων. Ένας τέτοιος γενετικός τόπος για παράδειγµα, βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος Χ και αφορά τον ειδικό παράγοντα GATA-1 για την έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων (Zon LI et al 1990). Ένας δεύτερος γενετικός τόπος που βρίσκεται επίσης στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος Χ ελέγχει την παραγωγή F- κυττάρων σε φυσιολογικά και σε δρεπανοκυτταρικά άτοµα (Dover GJ et al 1992). Ε) Ελλείψεις που προκαλούν β-θαλασσαιµία: Ελλείψεις σε γονίδια που ανήκουν στο σύµπλεγµα των γονιδίων της σφαιρίνης β επηρεάζουν την έκφραση και των άλλων γονιδίων του συµπλέγµατος αυτού. Πολλές από αυτές τις ελλείψεις περιλαµβάνουν τα γονίδια της σφαιρίνης δ και της σφαιρίνης β, δηµιουργώντας τις δβ θαλασσαιµίες και σε αρκετές περιπτώσεις την εµφάνιση του συνδρόµου της HPFH κληρονοµικής παραµονής της HbF ( Kazazian et al 1990). 15

16 1-2 Τύποι β-θαλασσαιµιών Σιωπηλή β-θαλασσαιµία : Η σιωπηλή β-θαλασσαιµία χαρακτηρίζεται από φυσιολογικούς αιµατολογικούς δείκτες µε ελάχιστα µειωµένους τους δείκτες ΜCH, MCV και ελάχιστα αυξηµένη παραγωγής ΗbA2. Επίσης ανιχνεύεται µικρή ανισόρροπη σύνθεση των αλυσίδων α/β σφαιρίνης και δεν παρουσιάζονται µορφολογικές αλλοιώσεις στα ερυθρά αιµοσφαίρια. Ήπια β-θαλασσαιµία : Ασθενείς µε ήπια β-θαλασσαιµία είναι συνήθως ετεροζυγώτες για το γονίδιο της β-σφαιρίνης. Άτοµα µε ήπια β-θαλασσαιµία παρουσιάζουν αυξηµένα επίπεδα HbA 2 (α 2 δ 2 ) περίπου 3,5-5.5%, καθώς επίσης και αυξηµένα επίπεδα HbF στην παρουσία του ελλείµµατος δβ στους ετεροζυγώτες. Έχουν ελαφρώς χαµηλότερο λόγο β/α σύνθεσης σφαιρίνης και παρουσιάζουν φυσιολογικά επίπεδα σιδήρου, ελαφρό ίκτερο και µικρή σπληνική διόγκωση. Ενδιάµεση β-θαλασσαιµία : Μια ποικιλία φαινoτύπων προκαλεί την ενδιάµεση β- θαλασσαιµία, η οποία παρουσιάζεται σε οµοζυγωτία της δβ-θαλασσαιµίας, στους διπλούς ετεροζυγώτες µε β +, β 0, δβ-θαλασσαιµία, Ηb Lepore και στην περίπτωση συνύπαρξης οµοζυγωτίας β + θαλασσαιµία µε α-θαλασσαιµία. Οι ασθενείς µε ενδιάµεση β-θαλασσαιµία πάσχουν από µέτριο βαθµό αναιµίας, παρουσιάζουν επίπεδα αιµοσφαιρίνης 9-10g/dl που συνοδεύεται από σπληνοµεγαλία, σπάνια µεταγγίζονται και πάσχουν από υπερφόρτωση σιδήρου λόγω αυξηµένης απορρόφησης σιδήρου. εν εµφανίζουν σηµαντικές σκελετικές ανωµαλίες και σηµαντικές ενδοκρινικές διαταραχές. Οι επιπλοκές που συναντώνται στα άτοµα µε ενδιάµεση β-θαλασσαιµία είναι η έλλειψη φυλλικού οξέος, η αιµοσιδήρωση, οι λοιµώξεις από στρεπτόκοκκο και σταφυλόκοκκο, η µυελική απλασία και η εξωµυελική ερυθροποίηση. Βαριά β-θαλασσαιµία : H βαριά β-θαλασσαιµία παρουσιάζεται κυρίως σε άτοµα µε οµοζυγωτία (β + / β +, β 0 / β 0 ) ή σε διπλή ετεροζυγωτία (β + / β 0 ). Σοβαρότερες 16

17 Τύποι β-θαλασσαιµίας και κλινικές εκδηλώσεις Γενότυπος ιάγνωση Κλινικές εκδηλώσεις β / β β + / β β 0 /β (δβ) 0 /β (δβ) 0 Lepore /β (δβ) 0 /(δβ) 0 β 0 /(δβ) 0 β + /(δβ) 0 β + /(δβ) 0 Lepore (δβ) 0 /(δβ) 0 Lepore β + /β + µε α-thal β + /β + β 0 /β 0 β + /β 0 (δβ) 0 Lepore /(δβ) 0 Lepore Φυσιολογικός Ήπια β-θαλασσαιµία Ενδιάµεση β-θαλασσαιµία Οµόζυγη β-θαλασσαιµία Καµιά Χωρίς σηµαντικές κλινικές εκδηλώσεις -Ήπια αναιµία. -Ποικιλία διόγκωσης του σπλήνα. -Αναποτελεσµατική απορρόφηση σιδήρου και υπερφόρτωση σιδήρου. -Οι ασθενείς σπάνια µεταγγίζονται. -Βαριά αναιµία. -Επέκταση του µυελού. -Αναποτελεσµατική απορρόφηση σιδήρου και υπερφόρτωση σιδήρου. -Έκπτωση της καρδιακής λειτουργίας. - ιόγκωση ήπατος και σπλήνας. -Σκελετικές παραµορφώσεις. -Επιβράδυνση της ανάπτυξης. Πίνακας 1-1: Τύποι β-θαλασσαιµιών, διάγνωση και κλινικές εκδηλώσεις. 17

18 επιπτώσεις βαρύνουν τους οµοζυγώτες β 0 /β 0, των οποίων που η αιµοσφαιρίνη αποτελείται από 95% ΗbF µε µικρή ποσότητα ΗbΑ. Σύνθετοι ετεροζυγώτες β + / β 0 και οµοζυγώτες β + / β + παράγουν µικρές ποσότητες αλυσίδων β-σφαιρίνης και εποµένως µικρές ποσότητες ΗbA. Οι ασθενείς µε βαρεία β-θαλασσαιµία πάσχουν από βαρεία αναιµία, υποβάλλονται σε συχνές µεταγγίσεις και εµφανίζουν υπερφόρτωση σιδήρου λόγω αυξηµένης απορρόφησης σιδήρου από το έντερο. Η µειωµένη σύνθεση αλυσίδων β-σφαιρίνης έχει σαν αποτέλεσµα την έντονη υποχρωµία ή το χαµηλό MCH και τη µικροκυττάρωση MCV. Άτοµα µε βαρεία β-θαλασσαιµία παρουσιάζουν συχνές λοιµώξεις, καθυστέρηση της σωµατικής ανάπτυξης, προοδευτική διόγκωση του σπλήνα, ηπατοµεγαλία, και ενδοκρινολογικές διαταραχές. Οι επιπλοκές που παρουσιάζονται είναι οι υποτροπιάζουσες λοιµώξεις από πνευµονιόκοκκο, στρεπτόκοκκο και σταφυλόκοκκο. Παρουσιάζουν ποικίλες ανοσολογικές διαταραχές σε επίπεδο χυµικής και κυτταρικής ανοσίας (Πίνακας 1-2). 1-3 Παθοφυσιολογία της β-θαλασσαιµίας Η κύρια αιτία της διαταραχής είναι η µειωµένη ή και µηδενική παραγωγή αλυσίδων β-σφαιρίνης. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα την ανισόρροπη σύνθεση σφαιρίνης και την περίσσεια α-αλυσίδων (Wickramasinghe SN et al 1976). Το αποτέλεσµα είναι η µείωση παραγωγής ΗbA (α 2 β 2 ). Η παραµονή της σύνθεσης ΗbF (α 2 γ 2 ) µετά την γέννηση δεν είναι αρκετή για να αναπληρώσει την ανεπάρκεια της ΗbA. Η σύνθεση της αιµοσφαιρίνης γίνεται κατά κύριο λόγο στο µυελό των οστών από τα πρόδροµα ερυθροποιητικά κύτταρα. Οι αλυσίδες α που δεν δεσµεύονται καθιζάνουν στα πρόδροµα ερυθροποιητικά κύτταρα του µυελού των οστών και στα προγονικά κύτταρα που κυκλοφορούν στην περιφέρεια, γεγονός που έχει σαν αποτέλεσµα το σχηµατισµό 18

19 του αιµοχρώµατος. Οι αλυσίδες α που καθιζάνουν στα ερυθροκύτταρα εκτίθενται στη δράση πρωτεολυτικών ενζύµων, οξειδώνoνται και µετατρέπονται σε µεθαιµοσφαιρίνη και καθιζάνουν σαν αιµόχρωµα (Yuan J et al 1997). Αυτό οδηγεί σε αναποτελεσµατική ωρίµανση των πρόδροµων ερυθροποιητικών κυττάρων, µε επακόλουθο τον εγκλωβισµό των προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων στη φάση G1 και την επιτάχυνση της απόπτωσης στους ερυθροβλάστες (Orvieto R. et al 1992). Αποτέλεσµα όλων αυτών των παραγόντων είναι η µη-αποδοτική ερυθροποίηση και η εµφάνιση της αναιµίας (Σχήµα 1-2). Η αναιµία προκαλεί την επιτάχυνση της ερυθροποίησης από 10 έως 30 φορές στο µυελό των οστών ατόµων µε β-θαλασσαιµία, µε επακόλουθο την επέκτασή του. Η επέκταση προκαλεί σκελετικές παραµορφώσεις (Borgna-Pignatti C. et al 1992), διαταραχές του µεταβολισµού και επιβράδυνση της ανάπτυξης. Η διόγκωση του σπλήνα είναι αποτέλεσµα της εξωµυελικής ερυθροποίησης και παγίδευσης των παραµορφωµένων ερυθρών σε αυτόν. Η µη-αποδοτική ερυθροποίηση προκαλεί την αναιµία, µε αποτέλεσµα τη µειωµένη οξείδωση των ιστών, που έχει ως επακόλουθο την αύξηση της παραγωγής της ερυθροιητίνης. Η ερυθροποιητίνη µε τη σειρά της επάγει την περαιτέρω επέκταση της ερυθροποίησης στο µυελό των οστών. Η επέκταση της ερυθροποίησης αυξάνει την απορρόφηση σιδήρου στα έντερα, µε αποτέλεσµα να αυξάνεται η συγκέντρωσή του στα αποθηκευτικά όργανα, µε σοβαρές παθολογικές επιπτώσεις κυρίως στο ήπαρ, στην καρδιά και στους ενδοκρενείς αδένες. 19

20 γ Aλυσίδες α Περίσσεια α β α2γ2 Επιλεκτική επιβίωση πρόδροµα ΗbF Αιµόλυση Παραµόρφωση ερυθρών Καταστροφή των πρόδροµων ερυθρών Αυξηµένη HbF στα ερυθρά ιόγκωση σπλήνα Μη αποδοτική ερυθροποίηση Υψηλή συγγένεια ερυθρών Αναιµία Μείωση αποδέσµευσης Ο2 Ερυθροποιητίνη Υποξία ιστών Μεταγγίσεις Επέκταση µυελού Αύξηση απορρόφησης Fe Υπερφόρτωση σιδήρου - Σκελετικές παραµορφώσεις - Οστεοπόρωση - Ενδοκρινική ανεπάρκεια - Καρδιακή ανεπάρκεια - Ηπατική ανεπάρκεια Σχήµα 1-2 : Παράσταση της παθοφυσιολογίας των β-θαλασσαιµιών. 20

21 1-4 Κλινική αντιµετώπιση της οµόζυγης β-θαλασσαιµίας και επιπτώσεις Η σύγχρονη θεραπευτική αντιµετώπιση των β-θαλασσαιµιών έχει αυξήσει σηµαντικά το χρόνο επιβίωσης των ασθενών έως και την πέµπτη δεκαετία της ζωής. Οι τρεις βασικοί άξονες της θεραπευτικής αντιµετώπισης περιλαµβάνουν: µεταγγίσεις, αποσιδήρωση, σπληνεκτοµή. Επίσης η µεταµόσχευση µυελού την τελευταία δεκαετία αυξάνει τα ποσοστά επιτυχίας. Σε πειραµατικό στάδιο βρίσκονται θεραπείες όπως η συνδυασµένη χρήση φαρµάκων αποσιδήρωσης, η υδροξυουρία, φάρµακα που επάγουν την αύξηση σύνθεσης HbF και η συνδιασµένη θεραπεία ηπατίτιδας C µε PEG- ιντερφερόνη. Σε πειραµατικό στάδιο επίσης βρίσκεται η γονιδιακή θεραπεία. Οι µεταγγίσεις: έχουν στόχο την διόρθωση της αναιµίας και την επαναφορά των επιπέδων αιµοσφαιρίνης σε επίπεδα ικανά για την οξυγόνωση των ιστών, τη µείωση της επέκτασης της ερυθροποίησης και τη µείωση της απορρόφησης του σιδήρου στο έντερο (Gascon et al 1984). Μερικές από τις αρνητικές επιπτώσεις των µεταγγίσεων είναι η αύξηση του σιδήρου του σώµατος κατά 2-3γρ/έτος, η µετάδοση λοιµωδών ασθενειών από µολυσµένο αίµα δοτών µε ηπατίτιδα C, B και HIV καθώς και η πιθανή αλλοευαισθητοποίηση των ερυθρών στα αντιγόνα των οµάδων αίµατος. Η αποσιδήρωση: Η χρήση χηλικών φαρµάκων όπως το Desferroxamine στοχεύει στον περιορισµό των επιπλοκών της αιµοσιδήρωσης στην καρδιά, το ήπαρ και τους ενδοκρινείς αδένες. εν έχουν αναφερθεί σηµαντικές επιπτώσεις από τη θεραπεία µε Desferroxamine. Η σπληνεκτοµή: ο σπλήνας είναι ένα µέρος του δικτυοενδοθηλιακού συστήµατος (RES). Η σταδιακή διόγκωσή του οφείλεται κυρίως στην εξωµυελική ερυθροποίηση και στην καταστροφή των ερυθρών σ αυτόν. Στους θαλασσαιµικούς ασθενείς 21

22 παρατηρήθηκε ότι έχει µεγαλύτερη φαγοκυτταρική δραστηριότητα σε σχέση µε τους φυσιολογικούς. Η αφαίρεση του σπλήνα µειώνει σηµαντικά την δικτυοενδοθηλιακή δραστικότητα στους θαλασσαιµικούς ασθενείς και παρατηρείται η εµφάνιση των λοιµώξεων που υποδηλώνουν την µειωµένη άµυνα του οργανισµού (Geremis A ). Η µεταµόσχευση: πολλές µεταµοσχεύσεις έχουν γίνει από HLA-συµβατούς δότες σε θαλασσαιµικούς ασθενείς µε επιτυχία. Οι µεταµοσχεύσεις που πραγµατοποιούνται λόγω ηπατικής ανεπάρκειας και αναποτελεσµατικής αποσιδήρωσης είχαν ποσοστό επιτυχίας 90% σε µεταµοσχευµένους ασθενείς µικρής ηλικίας, οι οποίοι θεραπεύονται πλήρως τρία χρόνια µετά την επέµβαση, ενώ οι µεταµοσχεύσεις που πραγµατοποιούνται σε ασθενείς µεγάλης ηλικίας το ανάλογο ποσοστό ήταν 60%. Στις περιπτώσεις καρδιακής δυσλειτουργίας λόγω υπερφόρτωσης σιδήρου, παραµονής ηπατικής υπερφόρτωσης σιδήρου και παρουσίας ηπατίτιδας C, οι µεταµοσχεύσεις καθίστανται αναποτελεσµατικές (Olivieri N. 2004). 22

23 2-1 Tο Ανοσοποιητικό σύστηµα. Το ανοσοποιητικό σύστηµα είναι η εξελικτική απάντηση για την άµυνα του οργανισµού απέναντι στα βλαβερά ερεθίσµατα του περιβάλλοντος. Αποτελείται από διάφορα όργανα και ιστούς όπως ο θύµος αδένας, ο σπλήνας, ο µυελός των οστών, οι πλάκες του Peyer στα έντερα, οι αµυγδαλές, τα λεµφαγγεία και τα λεµφογάγγλια. Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος περιλαµβάνουν πολλούς κυτταρικούς τύπους όπως τα Τ και Β λεµφοκύτταρα, τα ΝΚ κύτταρα, τα δεντριτικά κύτταρα, τα µονοκύτταρα/µακροφάγα, τα πολυµορφοπύρηνα και τα αιµοπετάλια. Τα κύτταρα αυτά είναι διασκορπισµένα σε όλο το σώµα. Η ανοσοαπόκριση διεξάγεται µε τη συµµετοχή διαφόρων κυττάρων και των διαφόρων µορίων που αυτά εκκρίνουν όπως τα αντισώµατα και οι κυτταροκίνες. Σηµαντικό ρόλο επίσης σε όλες τις ανοσοποιητικές αποκρίσεις παίζουν τα µονοκύτταρα/µακροφάγα και τα δεντριτικά κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα παρουσιάζουν το αντιγόνο (ΑPC, antigen presenting cells) στα Τ-κύτταρα, τα φυσικοκτόνα κύτταρα (NK, natural killer cells), τα πολυµορφοπύρηνα που συµβάλλουν στην φαγοκυττάρωση, τα αιµοπετάλια τα οποία συµµετέχουν στη φλεγµονώδη αντίδραση, τα σιτευτικά κύτταρα που έχουν δοµικές και λειτουργικές οµοιότητες µε τα βασεόφιλα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα που ελέγχουν τη διακίνηση και κατανοµή των λεµφοκυττάρων. Τα T-λευκοκύτταρα που περιλαµβάνουν τα Τ-κυτταροτοξικά, αυτά δεσµεύονται στα ξένα κύτταρα και τα καταστρέφουν. Τα Τ-βοηθητικά, αυτά δεσµεύουν τα αντιγόνα και τα παρουσιάζουν στα Τ-κυτταροτοξικά. Επίσης χρησιµοποιούνται για την παρουσίαση του αντιγόνου και στα Β-λεµφοκύτταρα. Τα Τ-κατασταλτικά τερµατίζουν την ανοσολογική απόκριση εµποδίζοντας τη δράση των Β- και των Τ- λεµφοκυττάρων και τα Τ-µνηµονικά είναι υπεύθυνα για τη δευτερογενή ανοσολογική απόκριση. Στην ανοσοαπόκριση συµβάλλουν πρωτεϊνικά µόρια που καλούνται διαλυτοί 23

24 µεσολαβητές της ανοσίας. Αυτά περιλαµβάνουν το συµπλήρωµα, τα αντισώµατα, τις κυτταροκίνες και διάφορες πρωτεΐνες που υπάρχουν φυσιολογικά στον ορό. Κατά τη διάρκεια της φλεγµονής, η συγκέντρωση πολλών από αυτές τις πρωτεΐνες στον ορό αυξάνεται ταχύτατα, γι αυτό καλούνται πρωτεΐνες της οξείας φάσης. Το ανοσοποιητικό σύστηµα ενεργοποιείται από ιδιαίτερα ερεθίσµατα, που έχουν ένα κοινό χαρακτηριστικό, δηλαδή το να αναγνωρίζονται από τον οργανισµό σαν ξένα αντιγόνα. Τα ερεθίσµατα αυτά µπορεί να είναι εξωγενή όπως παθογόνοι ιοί, µικροοργανισµοί και παράσιτα, ή ενδογενή όπως για παράδειγµα νεοπλασµατικά κύτταρα. Μετά την ενεργοποίηση αρχίζει µια σειρά αυξητικών κυτταρικών φαινοµένων που αποτελούν την φυσική και την ειδική ανοσοαπόκριση. Η φυσική ανοσοαπόκριση, γνωστή σαν φλεγµονώδης απάντηση, εκδηλώνεται µε την φαγοκυττάρωση και την φλεγµονώδη αντίδραση. Η ειδική ανοσοαπόκριση διακρίνεται σε χυµική και κυτταρική ανοσοαπόκριση. Η χυµική ανοσοαπόκριση προκαλείται µετά την παρουσίαση του αντιγόνου από τα Τ-βοηθητικά κύτταρα αυτό έχει σαν αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των Β-κυττάρων και τη διαφοροποίησή τους σε πλασµατοκύτταρα καθώς και την παραγωγή των αντισωµάτων και δίνει το έναυσµα για την παραγωγή των Β- µνηµονικών κυττάρων. Η κυτταρική ανοσοαπόκριση προκαλείται µετά την παρουσίαση του αντιγόνου από τα Τ-βοηθητικά κύτταρα και από τα µολυσµένα κύτταρα µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των ΝΚ-κυττάρων και δίνει το έναυσµα για την παραγωγή των Β-µνηµονικών κυττάρων (Σχήµα 2-1 ). Μετά την πρώτη επαφή µε ένα ειδικό αντιγόνο η επόµενη επαφή οδηγεί σε ενισχυµένη ή τροποποιηµένη ανοσοαπόκριση ως προς το συγκεκριµένο αντιγόνο. Τα Β-κύτταρα είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των αντισωµάτων και αναγνωρίζονται από την παρουσία 24

25 ανοσοσφαιρινών στην επιφάνειά τους, οι οποίες δρουν ως υποδοχείς ειδικών αντιγόνων. Αντιπροσωπεύουν το 5-15% των κυκλοφορούντων λεµφικών κυττάρων. Τα περισσότερα Β-κύτταρα εκφράζουν δύο ισότυπους ανοσοσφαιρινών στην επιφανειά τους τις ανοσοσφαιρίνες IgM και IgD, ενώ λίγα στην κυκλοφορία εκφράζουν τις ανοσοσφαιρίνες IgG, IgA ή IgE. 25

26 Φυσική ανοσοαπόκρηση και µετάβαση στην ειδική ανοσοαπόκτηση Ειδική ανοσοαπόκριση, χυµική και κυτταρική Σχήµα 2-1: Φυσική ανοσοαπόκριση και µετάβαση στην ειδική ανοσοαπόκρηση, χυµική και κυτταρική. 26

27 2-2 Κυτταροκίνες και ανοσοαπόκριση Τα µακροφάγα και τα δεντριτικά κύτταρα µετά από την εκθεσή τους στα αντιγόνα ενεργοποιούνται και εκκρίνουν τις κυτταροκίνες IL-1, IL-6, TNF-α και IL-12, αυτές µε τη σειρά τους ενεργοποιούν την κυτταροτοξική δράση των ΝΚ-κυττάρων κατά την φυσική ανοσοαπόκριση. Τα µακροφάγα κατά την ειδική ανοσοαπόκριση εκκρίνουν IL- 12 και IL-18, οι οποίες δρουν στα ΝΚ κύτταρα µε αποτέλεσµα τα κύτταρα αυτά να εκκρίνουν IFN-γ. Η IFN-γ προκαλεί µε τη σειρά της τη διαφοροποίηση των Τ- βοηθητικών κυττάρων σε Τh1 κύτταρα. Τα Τh1 κύτταρα εκκρίνουν τις κυτταροκίνες IFN-γ, TNF-β και την IL-2 µε αποτέλεσµα να ενεργοποιούν τη χηµική ανοσοαπόκριση. Η κυτταρική ανοσοαπόκριση προκαλείται µε την έκκριση IL-4 από τα NK και τα Τ- βοηθητικά κύτταρα µε αποτέλεσµα να διαφοροποιηθούν τα Τ-βοηθητικά σε Τh2 κύτταρα. Αυτά εκκρίνουν τις κυτταροκίνες IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και την IL-13 οι οποίες επάγουν µε τη σειρά τους την χυµική ανοσοαπόκριση. Η έκκριση TGF-β1 από τα µακροφάγα και τα Τ-βοηθητικά κύτταρα ενεργοποιεί την παραγωγή IgA από τα B- λεµφοκύτταρα (William E. Et al 1994). (Σχήµα 2-2 ) 27

28 Σχήµα 2-2 : Κυτταροκίνες που µεσολαβούν στην ειδική ανοσοαπόκριση. 28

29 2-3 Ανοσολογική κατάσταση της β-θαλασσαιµίας Οι επιπλοκές από τις λοιµώξεις αποτελούν την δεύτερη αίτια θανάτου και την κύρια αιτία νοσηρότητας σε ασθενείς µε β-θαλασσαιµία. Επίσης παράγοντες που προκαλούν τις ανοσολογικές ανωµαλίες είναι οι µεταγγίσεις, η υπερφόρτωση σιδήρου, η σπληνεκτοµή (Kapadia A et al 1980), η επανειληµµένη έκθεση στα αλλοαντιγόνα του αίµατος (Gascon P. et al 1984), η αποσιδήρωση (Wonke B. et al 2001) και η έκθεση σε ανοσοκατασταλτικούς ιούς. Ένα µεγάλο φάσµα των ανωµαλιών σχετίζεται µε τις ποσοτικές και λειτουργικές ανωµαλίες των κυττάρων που συµβάλλουν στην ανοσοαπόκριση όπως των Τ και Β λεµφοκυττάρων, των ουδετερόφιλων και µακροφάγων, την παραγωγή ανοσοσφαιρινών, τη φαγοκυττάρωση και το συµπλήρωµα (Farmakis D et al 2003). Ανοσολογικές διαταραχές που έχουν αναφερθεί σε ασθενείς µε β-θαλασσαιµία είναι η αύξηση των Τ8 κατασταλτικών κυττάρων και µικρή µείωση των Τ4 βοηθητικών κυττάρων η οποία αποδίδεται στη σπληνεκτοµή και την υπερφόρτωση σιδήρου (Gascon P. et al 1984), αυξηµένος αριθµός των λεµφοκυττάρων µε παράλληλη µείωση του λόγου Τ4/Τ8 ύστερα από σπληνεκτοµή (Grady RW. et al 1985), η δυσλειτουργία των µονοκυττάρων λόγω αυξηµένων επιπέδων σιδήρου (Isidro et al 1986), η µειωµένη δραστικότητα των ΝΚ-κυττάρων που σχετίζεται µε τις πολλαπλές µεταγγίσεις (Gascon P. et al 1984), τα αυξηµένα επίπεδα παραγωγής ανοσοσφαιρινών (Dweyer J. et al 1987), η ελαττωµατική φαγοκυτταρική δραστηριότητα των πολυµορφοπυρήνων κυττάρων (Skoutelis AT. et al 1984), η καταστολή της λειτουργίας του συµπληρώµατος µε χαµηλά επίπεδα C3 και C4, καθώς επίσης αύξηση της παραγωγής ανοσοσφαιρινών IgG, IgM και IgA (Quintiliani L. et al 1983). 29

30 3-1 Οι κυτταροκίνες Οι κυτταροκίνες είναι µια µεγάλη οµάδα ρυθµιστικών πρωτεϊνών ή γλυκοπρωτεϊνών µικρού µοριακού βάρους. Ο γενικός όρος «κυτταροκίνες» περιλαµβάνει τις ιντερλευκίνες (interleukins,ils), τις ιντερφερόνες (interferones, IFNs), τους παράγοντες νέκρωσης των όγκων (tumor necrosis factors, TNFs) τους παράγοντες διέγερσης των αποικιών (colony stimulating factors, CSFs) και τις χηµειοκίνες (chemokines). Οι κυτταροκίνες παράγονται από µια ποικιλία εξειδικευµένων κυττάρων ως απάντηση σε διάφορα ερεθίσµατα. Είναι δραστικές σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις, η δράση τους είναι πλειοτροπική, δρουν σε ποικίλες οµάδες κυττάρων και έχουν πολλαπλές διαφορετικές επιδράσεις στο ίδιο κύτταρο-στόχο. Μία συγκεκριµένη κυτταροκίνη µπορεί να παράγεται από διάφορα είδη κυττάρων όπως για παράδειγµα µονοκύτταρα/µακροφάγα, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και µαστοκύτταρα. Οι κυτταροκίνες επίσης επηρεάζουν τη σύνθεση καθώς και τη δράση άλλων κυτταροκινών και ρυθµίζουν πολλές βιολογικές διεργασίες. Στη διαδικασία της αιµοποίησης δρουν στα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα, δρουν συνεργατικά και προκαλούν την κυτταρική ενεργοποίηση, την κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση. Οι κυτταροκίνες επίσης δρουν ανταγωνιστικά µε αποτέλεσµα να καταστέλει η µια τη δράση της άλλης. Οι κυτταροκίνες είναι αγγελιοφόρα µόρια του ανοσοποιητικού συστήµατος και ο ρόλος τους είναι ο συντονισµός της λειτουργίας διαφορετικών κυττάρων που συµµετέχουν στη φυσική και στην ειδική ανοσολογική απάντηση. Οι κυτταροκίνες προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς που βρίσκονται στη µεµβράνη κυττάρων στόχων και η σύνδεσή τους µε την κυτταρική επιφάνεια προκαλούν αλλαγές στο κυτταρικό RNA και στην πρωτεϊνική σύνθεση που έχει σαν αποτέλεσµα την αλλοίωση της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων στόχων.( Ivan Roitt et al Immunology 1995) 30

31 3-2 Κυτταροκίνες και φυσική ανοσία Οι κυτταροκίνες που µεσολαβούν στην φυσική ανοσία περιλαµβάνουν α) αυτές που προστατεύουν έναντι των µολυσµατικών ιών όπως οι Ιντερφερόνες και β) αυτές που ξεκινούν τη φλεγµονώδη αντίδραση, η οποία προστατεύει τον οργανισµό έναντι των παθογόνων βακτηρίων και περιλαµβάνουν τις ιντερφερόνες, ιντερλευκίνες και τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων Ιντερφερόνες (ΙFNs) Μοριακή κατασκευή: ΙFN-α, IFN-β και IFN-γ. Η IFN-α είναι µη γλυκοζυλιοµένη πρωτεΐνη µε µ.β. 20 kd, ενώ η IFN-β και IFN-γ είναι γλυκοζυλιοµένες πρωτεΐνες. Τα γονίδια της INF-α και IFN-β βρίσκονται στο χρωµόσωµα 9, ενώ της IFN-γ στο χρωµόσωµα 12. Σχεδόν κάθε κύτταρο µπορεί να παράγει INF-α και IFN-β µετά από διέγερση. Η κύρια πηγή της IFN-α είναι τα λευκά αιµοσφαίρια, κυρίως από τα µονοκύτταρα/µακροφάγα. ενώ η κύρια πηγή της IFN-β είναι οι ινοβλάστες µετά από διέγερση από ιούς, βακτηριακές ενδοτοξίνες και από άλλες κυτταροκίνες. Η παραγωγή της IFN-γ γίνεται από τα Τ κύτταρα µετά διέγερση από αντιγόνα ή µιτογόνα. Οι υποδοχείς των IFNs είναι τύπου Ι IFN-αR για την IFN-α και IFN-β, και τύπου ΙΙ για την IFN-γ. Έχουν περιγραφεί διαλυτές µορφές και των δύο τύπων. Η IFN-α έχει δράση κατά των ιών και κυτταροτοξική δράση κατά διαφόρων όγκων (Shannaran Α. Et al 2001). Η IFN-γ διεγείρει την λειτουργία των µονοκυττάρων/µακροφάγων και αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων (Mantovani A. et al 1994). 31

32 Ιντερφερόνη και β-θαλασσαιµία Η ιντερφερόνη-γ in vitro ασκεί κατασταλτική δράση στη διαδικασία της αιµοποίησης, Ζoumbos N. et al Οι Wanachiwanawin et al 1999 αναφέρουν αυξηµένα επίπεδα IFN-γ, ΤΝF-a και IL-1β στον ορό ασθενών µε β-θαλασσαιµία. Επίσης παρατήρησαν αυξηµένη προσκόλληση ανοσοσφαιρίνη IgG στα ερυθρά ασθενών µε αυξηµένα επίπεδα IFN-γ, ενώ µειωµένη προσκόληση ήταν σε ασθενείς µε φυσιολογικά επίπεδα IFN-γ και καταλήγουν στο συµπέρασµα ότι η IFN-γ επιδεινώνει την αναιµία µε τη δραστηριοποίηση των µονοκυττάρων/µακροφάγων έναντι τα ερυθρά αιµοσφαίρια Παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α) Ο TNF-α που ονοµάζεται επίσης Cachectin, είναι ένα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 157 αµινοξέα, έχει µοριακό βάρος 17 kd και είναι προϊόν γονιδίου το οποίο εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 6 στην περιοχή του µείζονος συµπλέγµατος ιστοσυµβατότητας MHC. Ο υποδοχέας TNFR-I, TNFR-IΙ υπάρχει σε διαλυτή και µεµβρανική µορφή. Ο TNF πρωτοαναγνωρίστηκε σαν παράγοντας που προκαλεί αιµορραγική νέκρωση των όγκων. Στη συνέχεια η πρωτεΐνη αυτή ενοχοποιήθηκε ως υπεύθυνος παράγοντας που προκαλεί καχεξία και shock. Το TNF-α εµφανίζει µεγάλες οµοιότητες στη δοµή του µορίου και στις βιολογικές ιδιότητες µε µια λεµφοκίνη που παράγεται από τα διεργεµένα Τ-λεµφοκύτταρα, τη λεµφοτοξίνη (LT) ή TNF-β. Είναι γλυκοπρωτεΐνη µε µοριακό βάρος 25kD. Το γονίδιο που παράγει την LT βρίσκεται επίσης στο χρωµόσωµα 6 και σε πολύ µικρή απόσταση από το γονίδιο του TNF-α. Τα δύο µόρια έχουν οµολογία 35%, συνδέονται µε τον ίδιο υποδοχέα στη µεµβράνη των κυττάρων στόχων και εµφανίζουν σε µεγάλο βαθµό τις ίδιες βιολογικές ιδιότητες. Η κύρια πηγή του TNF-α είναι τα διεγερµένα µακροφάγα κύτταρα ενώ ο TNF-β προέρχεται από τα διεγερµένα λεµφοκύτταρα. Η ενδοτοξίνη που είναι 32

33 λιποπολυσακχαρίτης (LPS), αποτελεί µέρος του κυτταρικού τοιχώµατος των gram αρνητικών βακτηριδίων και αποτελεί ισχυρό διεγέρτη για την παραγωγή TNF-α από τα µακροφάγα. Οι κύριες βιολογικές δράσεις του TNF είναι: προκαλεί πυρετό µε απευθείας δράση στον υποθάλαµο ή εµµέσως µε τη διέγερση της παραγωγής IL-1, δρα στους οστεοκλάστες µε αποτέλεσµα την οστική απορρόφηση, προκαλεί διάσπαση της πρωτεογλυκάνης του χόνδρου και διεγείρει την παραγωγή προσταγλαδίνης και κολλαγενάσης από τα κύτταρα του αρθρικού υµένα και τους ινοβλάστες. Στα λιποκύτταρα καταστέλλει τη σύνθεση της λιπάσης της λιποπρωτεϊνης (LPL) ενώ στα ουδετερόφιλα διεγείρει την παραγωγή H2O2 και την αποκοκκίωση των λιποσωµάτων, αυξάνει την φαγοκυτταρική τους ικανότητα προς ορισµένους µικροοργανισµούς και προκαλεί την προσκόλλησή τους στα κύτταρα του ενδοθηλίου. Η χρόνια έκθεση στο TNF µπορεί να προκαλέσει λεµφοπενία και ανοσοκαταστολή. Η έκθεση του οργανισµού σε µεγάλες συγκεντρώσεις TNF προκαλεί µειωµένη συσταλτικότητα του µυοκαρδίου, προκαλεί θροµβώσεις στο ενδοθήλιο των αγγείων και προκαλεί διαταραχές στο µεταβολισµό της γλυκόζης. Αυξάνει την έκφραση των αντιγόνων HLA τάξης Ι και ΙΙ µε διευκόλυνση έτσι της παρουσίασης του αντιγόνου και προάγει έµµεσα την έκφραση γονιδίων άλλων κυτταροκινών. Προκαλεί επίσης διέγερση των κυττάρων που εµπλέκονται στην φλεγµονώδη απάντηση (λεµφοκύτταρα, µονοκύτταρα και πολυµορφοπύρηνα), ενώ αυξάνει την κυτταροτοξικότητα των Τ και ΝΚ κυττάρων, (Arai K. et al 1992). Ο ΤΝF δραστηριοποιεί τα µονοπύρηνα φαγοκύτταρα και άλλα κύτταρα προς παραγωγή κυτταροκινών όπως η IL-1 και IL-6 και καταστέλλει τη διαίρεση των προγόνων κυττάρων του µυελού των οστών. Ο TNF-α έχει ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη αιµοποιητικών αποικιών, όµως σε πρόσφατες µελέτες φαίνεται ότι συνεργάζεται µε την IL-3 ή τον GM-CSF προάγοντας τον πολλαπλασιασµό των πρώιµων CD34 προγονικών 33

34 κυττάρων. Σε πιο ώριµα στάδια της αιµοποίησης ο TNF αναστέλλει το σχηµατισµό αποικιών της κοκκιώδους και ερυθράς σειράς, ενώ προάγει το σχηµατισµό αποικιών µακροφάγων ( Hu X. Et al 1999). ΤΝF-α και β-θαλασσαιµία Αυξηµένα επίπεδα TNF-a, scd8 και scd23 στον ορό ασθενών µε β-θαλασσαιµία και µη ανιχνεύσιµα επίπεδα IL-2, IL-6 αναφέρουν οι Lombardi et al 1994, πιθανόν λόγω της αλλοαντιγονικής επίδρασης των µεταγγίσεων στους θαλασσαιµικούς ασθενείς Ιντερλευκίνη 1 Υπάρχουν δύο τύποι ιντερλευκίνης 1, η α και η β. Η IL-1α αποτελείται από 154 αµινοξέα και η IL-1β από 153 αµινοξέα και το µοριακό βάρος της IL-1 είναι kd. Τα δύο µόρια εµφανίζουν οµολογία 27%. Είναι προϊόντα δύο διαφορετικών γονιδίων, τα οποία εντοπίζονται στο χρωµόσωµα 2. Η IL-1 παράγεται κυρίως από τα διεγερµένα µακροφάγα. Άλλα κύτταρα που παράγουν την IL-1 είναι τα Τ και τα Β λεµφοκύτταρα, τα ΝΚ κύτταρα, τα κύτταρα της κεράτινης στιβάδας του δέρµατος, τα ενδοθηλιακά και τα επιθηλιακά κύτταρα, τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα, τα µεγάλα κοκκιώδη λεµφοκύτταρα, οι ινοβλάστες και οι λείες µυϊκές ίνες. Η παραγωγή της IL-1 επάγεται δια µέσου αντιγόνων, τοξινών και φλεγµονωδών νόσων. Η συστηµατική δράση της IL-1 εκδηλώνεται κατά την οξεία φάσης της αιτίας που την επάγει. Ετσι, µετά από λοίµωξη η IL-1 ανιχνεύεται µέσα σε λίγες ώρες. Παρουσιάζει πολλές βιολογικές δράσεις: δρα στο ΚΝΣ και προκαλεί πυρετό, υπνηλία, ανορεξία και έκκριση ACTH κορτιζόλης και ινσουλίνης. Στο ήπαρ διεγείρει τη σύνθεση των πρωτεϊνών της οξείας φάσεως. Η δράση της IL-1 στο ενδοθήλιο εκδηλώνεται µε την έκκριση προσταγλαδινών και µε υπόταση. Προκαλεί την απελευθέρωση κολλαγενάσης 34

35 από τους οστεοκλάστες και τα χονδροκύτταρα. Επίσης προκαλεί πρωτεόλυση των µυών, πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων, των κυττάρων του αρθρικού υµένα των ινοβλαστών. Η IL-1 συµβάλλει στη διέγερση και τον πολλαπλασιασµό των Τ-λεµφοκυττάρων και επαυξάνει τη διέγερση των Β- λεµφοκυττάρων (Carter et al 1990) Ιντερλευκίνη 6 Η IL-6 είναι µονοµερής πρωτεΐνη, έχει µοριακό βάρος 26 kd και είναι προϊόν γονιδίου που εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 7. Η IL-6 παράγεται από τα µακροκύτταρα/µακροφάγα, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, ηπατοκύτταρα και από τα διεγερµένα Τ-λεµφοκύτταρα. Η IL-6 που παράγεται από τα Τ- λεφοκύτταρα δρα συνεργικά µε την IL-1 και ο ΤΝF για την διαφοροποίηση των Τ κυττάρων. ρα επίσης µαζί µε άλλες κυτταροκίνες στη διαφοροποίηση των διεγερµένων Β-λεµφοκυττάρων προς πλασµατοκύτταρα. Επίσης, η IL-6 εµφανίζει µικρή αντιική δράση, ιδιότητα για την οποία της έχει δοθεί και η ονοµασία IFN-β2. ραστηριοποιεί την παραγωγή των πρωτεϊνών της οξείας φάσεως από τα ηπατοκύτταρα. Στη διαδικασία της αιµοποίησης η IL-6 δραστηριοποιεί τα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα βραχύνοντας το G0 στάδιο και προκαλεί την ωρίµανση των µεγακαρυοκυττάρων και την αύξηση του αριθµού των αιµοπεταλίων (Akira S. Et al 1990). IL-6 και β-θαλασσαιµία Αυξηµένα επίπεδα IL-6 στον ορό ασθενών µε β-θαλασσαιµία διαπιστώνουν οι Οzturk et al Σχετίζουν την αύξηση παραγωγής IL-6 από τα µακροφάγα λόγω υπερφόρτωσης σιδήρου. 35

36 4-1 Κυτταροκίνες και αιµοποίηση Οι αιµοποιητικές κυτταροκίνες παράγονται από αρκετά διαφορετικά κύτταρα που είναι κοινά σε όλα τα όργανα και ιδιαίτερα στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος, τα µονοκύτταρα/µακροφάγα, τα Β και Τ λεµφοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες. Επιπλέον οι κυτταροκίνες µπορεί να παραχθούν και από τα επιθηλιακά κύτταρα, µεσοθηλιακά κύτταρα, κερατινοκύτταρα, µαστοκύτταρα και τους οστεοβλάστες. Τα διάφορα κύτταρα δεν παράγουν αυτόµατα κυτταροκίνες αλλά απαιτείται η διέγερσή τους µε κατάλληλα ερεθίσµατα όπως αντιγόνα, φυτοαιµοσυγκολλητίνη, λιποπολυσακχαρίτη και από άλλες κυτταροκίνες. Μετά τη διέγερσή τους, η απελευθέρωση των κυτταροκινών γίνεται πολύ γρήγορα και µπορεί να εµφανιστεί πολύ µεγάλη αύξηση. Αυτό έχει σηµαντική σηµασία σε καταστάσεις λοιµώξεων, µαζική απώλεια αίµατος, αναιµία, µυελοκατασταλτική θεραπεία και άλλες καταστάσεις που ελαττώνουν την αιµοποίηση. Οι κυτταροκίνες οµαδοποιήθηκαν σε οικογένειες και περιλαµβάνουν τις Ιντερφερόνες (Interferons,IFNs), τις Ιντερλευκίνες (Interleukins ILs), τους παράγοντες νέκρωσης των όγκων (Tumor necrosis factors TNFs) και τους αυξητικούς παράγοντες (Growth factors, GFs)(Metcalf D,1966). Η δράση τους στη διαδικασία της αιµοποίησης είναι ευοδωτική ή κατασταλτική. Οι κυτταροκίνες που συµβάλλουν στην αυξητική διαδικασία της αιµοποίησης καλούνται αιµοποιητικοί αυξητικοί παράγοντες (Growth factors, GFs). Σε αυτή τη διαδικασία οι κυτταροκίνες α) δρουν ως τροφικοί παράγοντες για τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα και η παρουσία τους είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων αυτών, β) ενεργοποιούν τα εν ηρεµία (G0) προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα προς τη διαδικασία του πολλαπλασιασµού και διαφοροποίησης, γ) επιδρούν στα πολυδύναµα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα και ρυθµίζουν την παραγωγή όλων των κυτταρικών σειρών και 36

37 την επέκτασή τους και δ) επιδρούν στα δεσµευµένα µονοδύναµα αιµοποιητικά κύτταρα και επάγουν τον πολλαπλασιασµό και την ωρίµανσή τους. Οι κυτταροκίνες που ενεργοποιούν τον πολλαπλασιασµό των εν ηρεµία G0 αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων είναι οι SCF, η IL-6, G-CSF, IL-11, IL-12 και LIF (Ogawa M,1993). Ως τροφικοί παράγοντες για την επιβίωση των G0 αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων φαίνεται να είναι η ΙL-3 και το GM-CSF ( Leary AG et al 1992). Παράγοντες που δρουν στα πολυδύναµα αιµοποιητικά κύτταρα φαίνεται να είναι οι SCF, IL-3, GΜ-CSF και IL-4. Αυτοί οι παράγοντες επάγουν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των πολυδύναµων προγονικών κυττάρων µετά την έξοδό τους από τη φάση G0. Οι κυτταροκίνες που ενεργοποιούν τη διαφοροποίηση και ωρίµανση των µονοδύναµων δεσµευµένων προγονικών κυττάρων προς µια κυτταρική σειρά θεωρούνται οι G-CSF, Μ-CSF, ΙL-5 και η ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ). Η ΕΡΟ είναι φυσιολογικός ρυθµιστής της ερυθροποιητικής σειράς, το Μ-CSF των µονοκυττάρων/µακροφάγων και η ΙL-5 της σειράς των εωζινόφιλων ενώ το G-CSF ρυθµίζει τον πολλαπλασιασµό και την ωρίµανση των προγονικών ουδετερόφιλων κυττάρων. Επίσης δρα συνεργατικά µε τους παράγοντες που ενεργοποιούν τα εν ηρεµία προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα. Μελέτες των Dick JE. Keller G. 1985, µε την εισαγωγή σηµασµένου ρετροϊού στα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα έδειξαν την κοινή προέλευση των µυελικών και λεµφικών σειρών. Οι κυτταροκίνες που προκαλούν τον πολλαπλασιασµό και διαφοροποίηση των λεµφικών σειρών είναι το SCF σε συνεργασία µε IL-6, IL-11 και το G-CSF ή µε τη συνεργασία του SCF µε την IL-12, ενώ η IL-3 δεν είχε επίδραση ή συνεργασία µε το SCF για την ανάπτυξή τους (Hirayama F, 1992,1993). 37

38 Οι κυτταροκίνες σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις ασκούν µεγάλη επίδραση στη ρύθµιση της αιµοποποίησης. Εκτός από τις ευοδωτικές υπάρχουν και οι κατασταλτικές κυτταροκίνες. Οι κατασταλτικές κυτταροκίνες περιλαµβάνουν τις ιντερφερόνες (Raefsky EL. 1985), το TNF-α (Roodman GD 1987), το TGF-β (Kishi K et al 1989) και το MIP-1 α (Broxmeyer HE et al 1992). Οι ιντερφερόνες και το TNF-α φαίνεται να ασκούν κατασταλτική δράση σε όλο το φάσµα της διαφοροποίησης, ενώ το TGF-β και ο MIP-1α δρουν κατασταλτικά στα πρώτα στάδια της αιµοποίησης στα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα. Η έρευνα έδειξε ότι το TGF-β δρα ανταγωνιστικά µε τις κυτταροκίνες που δρουν στα αρχικά στάδια της αιµοποίησης. Έτσι οι κατασταλτικές κυτταροκίνες συµβάλουν στην αρνητική ρύθµιση της αιµοποίησης. Οι Chen et al 1992 σε ηµήρευστη καλλιέργεια µεθυλοκυτταρίνης (STC) καλλιέργησαν µονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίµατος από ασθενείς µε β-θαλασσαιµία, παρατήρησαν αυξηµένο αριθµό κυκλοφορούντων προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων κατά 3-5 φορές, που υποδηλώνει την αυξηµένη αιµοποίηση, επίσης παρατήρησαν παράλληλη αύξηση παραγωγής όλων των αιµοποιητικών αποικιών ΒFU-E, CFU-GM, CFU-mix. 38

39 Αρχέγονο αιµοποιητικό κύτταρο CSF,IL-3 GM-CSF ΜΥΕΛΙΚΗ ΣΕΙΡΑ CFU-GEMM CSF,IL-3 GM-CSF TPO,IL-6 IL-3 GM-CSF SCF + G-CSF IL-6 IL-11 IL-12 LIF + GM-CSF IL-3, IL-4 SCF + IL-12 + IL-6 IL-11 G-CSF ΛΕΜΦΙΚΗ ΣΕΙΡΑ BFU-E CFU- MK CFU-GM ΝΚ-ΚΥΤΤΑΡΑ CSF,IL-3 GM-CSF EPO CSF,IL-3 GM-CSF TPO,IL-6 GM-CSF G-CSF B-STEM IL-7 T-STEM IL-7, IL-4 CFU-G CFU-M CFU-Eo CFU-Bas CFU-Mast GM-CSF G-CSF GM-CSF M-CSF IL-5 GM-CSF M-CSF IL-5, IL3 IL3 IL3, SCF PRE B-CELL IL-7 ΠΡΟΘΥΜΟΚΥΤΤΑΡΟ IL-15 CFU-E CFU-MK ΜΥΕΛΟΒΛΑΣΤΗ ΜΟΝΟΒΛΑΣΤΗ TPO EPO GM-CSF, IL-3, TPO GM-CSF IL-11, IL-6 GM-CSF G-CSF B-ΛΕΜΦΟΒΛΑΣΤΗ T-ΛΕΜΦΟΒΛΑΣΤΗ ΒΑΣΕΟΦΙΛΑ B-KYTTAΡO ΠΡΟΕΡΥΘΡΟ- ΒΛΑΣΤΗ EPO MΕΓΑΚΑΡΥΟ- KYTTAΡΟ TPO, IL-1 IL-6 ΟΥ ΕΤΕΡΟΦΙΛΟ ΜΥΕΛΟΚΥΤΤΑΡΟ GM-CSF G-CSF ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΟ ΕΟΖΙΝΟΦΙΛΑ ΜΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΚΥΤΤΑΡΟ Τ-KYTTAΡO ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ ΕΡΥΘΡΟ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ ΟΥ ΕΤΕΡΟΦΙΛΟ Σχήµα 4-1 : Κυτταροκίνες και αιµοποίηση. 39

40 4-2 Κυτταροκίνες που επηρεάζουν την αιµοποίηση στη β-θαλασσαιµία Η αιµοποίηση σε άτοµα µε β-θαλασσαιµία επηρεάζεται αφενός από παράγοντες που σχετίζονται µε την ίδια την ασθένεια όπως η αναποτελεσµατική ερυθροποίηση εξαιτίας της καταστροφής των προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων και οι επιπτώσεις των λοιµώξεων σ αυτούς τους ασθενείς και αφετέρου από παράγοντες που σχετίζονται µε την κλινική αντιµετώπιση των ασθενών όπως οι µεταγγίσεις, η αποσιδήρωση και η σπληνεκτοµή, οι οποίες ασκούν αρνητική επίδραση στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Η αιµοποίηση και η ανοσοαπόκριση ρυθµίζονται από τις κυτταροκίνες, η διαταραγµένη παραγωγή των οποίων επηρεάζει αρνητικά την αιµοποίηση σε άτοµα µε β-θαλασσαιµία. Η αυξηµένη παραγωγή ερυθροποιητίνης επάγει την επέκταση της ερυθροποίησης, και η υπερπαραγωγή κυτταροκινών όπως TNF-α και IFN-γ ασκούν αρνητική επίδραση στην αιµοποίηση ατόµων µε β- θαλασσαιµία Ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) Η ερυθροποιητίνη είναι γλυκοπρωτεΐνη 34-39kD. Η ανασυνδυασµένη µορφή της αποτελείται από 166 αµινοξέα και έχει µ.β kd. Κωδικοποιείται από γονίδιο που εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 7. Παράγεται κυρίως από τα περισωληναριακά κύτταρα του νεφρού. Συµπληρωµατικές πηγές ερυθροποιητίνης είναι το ήπαρ και από τα µονοκύτταρα/µακροφάγα. Η ερυθροποιητίνη αποτελεί τον κύριο ρυθµιστή της ερυθροποίησης, συνδέεται µε έναν υποδοχέα της µεµβράνης των δεσµευµένων προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων, προάγει την διαφοροποίηση των CFU-Ε και προκαλεί τον πολλαπλασιασµό των BFU-E (Eridani et al 1998). 40

41 Ερυθροποιητίνη και β-θαλασσαιµία Ο ειδικός ρόλος της ερυθροποιητίνης στη διαδικασία της ερυθροποίησης έχει επισηµανθεί από διάφορους ερευνητές. Για τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των δεσµευµένων προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων και την παραγωγή των B- FUE in vitro απαραίτητη είναι η παρουσία των κυτταροκινών EPO, GM-CSF και IL-3. Ο Μ. Valtieri et al 1989 ύστερα από ηµίρευστη καλλιέργεια µονοπήρινων κυττάρων περιφερικού αίµατος βρήκαν ότι µόνο η EPO έχει την ικανότητα in vitro παραγωγής B-FUE απουσία FCS -. Αυξηµένα επίπεδα ερυθροποιητίνης έχουν αναφερθεί στον ορό ατόµων µε β-θαλασσαιµία σε σχέση µε φυσιολογικά άτοµα. Οι Chaisiripoomkere et al 1999 προσδιόρισαν την συγκέντρωση της EPO στον ορό φυσιολογικών ατόµων, ατόµων µε ενδιάµεση β-θαλασσαιµία και ατόµων µε οµόζυγη β-θαλασσαιµία και η συγκέντρωση της EPO ήταν 8U/ml, 126U/ml, 165U/ml αντίστοιχα. Επίσης διαπίστωσαν αντίστροφη συσχέτιση µεταξύ επιπέδων EPO και του Hct των ασθενών. Ανάλογα αποτελέσµατα αναφέρθηκαν από τους Paritpokee et al 2002, οι οποίοι αναφέρουν 18 φορές αύξηση παραγωγής ΕΡΟ σε άτοµα µε οµόζυγη β-θαλασσαιµία σε σχέση µε τα φυσιολογικά άτοµα. Οι Manor et al 1986 αναφέρουν µειωµένη ανταπόκριση στην ΕΡΟ στους µεγάλους σε ηλικία θαλασσαιµικούς ασθενείς σε σχέση µε τους ανήλικους ασθενείς. Οι Rachmilewitz et al 1995 αναφέρουν αυξηµένη παραγωγή αιµοσφαιρίνης F στη θαλασσαιµία µε τη µακροχρόνια χορήγηση ΕΡΟ σε πειραµατόζωα. Οι Sukpanichant et al 1997 αναφέρουν υψηλότερα επίπεδα ερυθροποιητίνης σε άτοµα µε β-θαλασσαιµία µεγάλης ηλικίας σε σχέση µε ασθενείς µικρής ηλικίας. 41

42 4-2-2 Stem cell factor (SCF) Το SCF είναι γνωστό επίσης µε το όνοµα c-kit ligand, mast cell growth factor MGF και steel factor SF. Υπάρχει σε δύο µορφές: Η πρώτη είναι οµοδιµερής πρωτεΐνη 24kD, η οποία αποτελείται από 164 ή 165 αµινοξέα και είναι η διαλυτή µορφή SCF. Η δεύτερη µορφή είναι η διαµεµβρανική, έχει µοριακό βάρος 27kD και αποτελείται από 220 ή 248 αµινοξέα. Και οι δύο µορφές παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ωρίµανση των διαφορετικών αιµοποιητικών σειρών. Το SCF παράγεται από τα στρωµατικά κύτταρα του µυελού των οστών, από τους ινοβλάστες, από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και από τα ηπατοκύτταρα. Το SCF δρα συνεργατικά µε άλλους αναπτυξιακούς παράγοντες, όπως GM-CSF,G-CSF, IL-3 και την EPO για την επαγωγή σχηµατισµού αποικιών της κοκκιώδους, µεγακαρυοκυτταρικής και ερυθροποιητικής σειράς. Επάγει επίσης τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των λεµφοκυτταρικών σειρών και των ιστιοκυττάρων (Μetcalf D. 1991) Ιντερλευκίνη-3 (IL-3) Η ανθρώπινη IL-3 είναι γλυκοπρωτεΐνη µε µ.β. 25 kd, ενώ η ανασυνδυασµένη αποτελείται από 152 αµινοξέα και έχει µ.β kd. Το γονίδιό της είναι µέρος της οµάδας των γονιδίων διαφόρων κυτταροκινών (IL-4, IL-5, GM-CSF) και βρίσκεται στο χρωµόσωµα 5. Παράγεται κυρίως από διεγερµένα Τ κύτταρα, NK κύτταρα και από τα µαστοκύτταρα Οι υποδοχείς της IL-3 ανήκουν στην υπεροικογένεια αιµοποιητικών υποδοχέων και αποτελούνται από δύο τουλάχιστον διαφορετικές υποοµάδες που είναι ο IL-3Rα και ο IL-3Rβ. Κύριες δράσεις της IL-3 είναι η διέγερση και διαφοροποίηση των πρώιµων αιµοποιητικών προγονικών κυττάρων και των δεσµευµένων κυττάρων για τις διάφορες σειρές. Έχει συνεργεία µε άλλες κυτταροκίνες όπως οι GM-CSF, G- CSF, EPO, IL-11 και IL-6 για την αντίστοιχη αύξηση των αποικιών 42