ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ

Transcript

1

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Αλίκη Καλλίνικου - Μανιάτη Επιβλέπουσα Kαθηγήτρια. 2. Αθανασία Μουζάκη Επίκουρη Kαθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 3. Αθανάσιος Παπαβασιλείου Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Αλίκη Καλλίνικου - Μανιάτη Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 2. Αθανασία Μουζάκη Επίκουρη Kαθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 3. Αθανάσιος Παπαβασιλείου Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 4. Στέφανος Μανταγός Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 5. Αναστασία Βαρβαρήγου Αναπληρώτρια Kαθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 6. Φωτεινή Παληογιάννη Επίκουρη Kαθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών. 7. Μαρίνα Καρακάντζα Λέκτορας Τμήματος Ιατρικής, Παν/μίου Πατρών.

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στην Εργαστηριακή Αιματολογία- Αιμοδοσία της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Ολοκληρώνοντας την εργασία αυτή αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω όλους όσους συνέβαλλαν στην πραγματοποίησή της. Την καθηγήτρια Αιματολογίας και διευθύντρια του εργαστηρίου Αιματολογίας- Αιμοδοσίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών κ. Αλίκη Καλλινίκου-Μανιάτη, που με την καθοδήγησή της και τις πολύτιμες συμβουλές της με βοήθησε στην αξιολόγηση αποτελεσμάτων, τη συγγραφή εργασιών καθώς και της διατριβής μου. Την επίκουρη καθηγήτρια Αθανασία Μουζάκη που μου δίδαξε τον τρόπο της ερευνητικής προσέγγισης και με την εποικοδομητική συνεργασία τον κριτικό διάλογο και τη σωστή καθοδήγηση ήταν συνέχεια δίπλα μου σε κάθε δύσκολο βήμα. Τα υπόλοιπα μέλη της Επταμελούς Επιτροπής, τον καθηγητή Αθανάσιο Παπαβασιλείου, τον καθηγητή Στέφανο Μανταγό, την αναπληρώτρια καθηγήτρια Αναστασία Βαρβαρήγου, την επίκουρη καθηγήτρια Φωτεινή Παληογιάννη και τη λέκτορα Μαρίνα Καρακάντζα για τη συμβολή τους στην ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Τους γιατρούς της Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών Βασιλική Βλάχα και Ιωάννη Γιαννακόπουλο, καθώς και την παιδίατρο Ευαγγελία Φαρρή-Κωστοπούλου για τη βοήθεια που μου προσέφεραν στη συλλογή του υλικού αυτής της εργασίας. Όλα τα μέλη του εργαστηρίου Αιματολογίας-Αιμοδοσίας για το ενδιαφέρον τους και τη πολύπλευρη στήριξή τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τη Σωτηρία Θυμιανού, τον Ιορδάνη Ξαγοράρη και την Κοκώνα Χατζαντώνη για την πολύ καλή συνεργασία και το ζεστό και φιλικό κλίμα που με στήριξε σ αυτή την προσπάθεια. Τέλος, ευχαριστώ ολόψυχα την οικογένειά μου που στάθηκε στο πλευρό μου και μοιράστηκε μαζί μου όλες τις ευχάριστες και δυσάρεστες στιγμές. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον αδερφό μου Κωνσταντίνο Θεοδωρόπουλο για την πολύμηνη και επίμονη ενασχόλησή του με την ηλεκτρονική επεξεργασία του κειμένου και τις χρήσιμες συμβουλές του.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΟΑΠΟΚΡΙΣΗ Τ - ΚΥΤΤΑΡΑ Μηχανισμός ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων Η ενδοκυττάρια μεταβίβαση μηνύματος από τον TcR Η ενεργοποίηση της μεταγραφής Βοηθητικά Τ-κύτταρα Διαχωρισμός των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων σε υποπληθυσμούς ανάλογα με το εκκριτικό προφίλ κυτταροκινών ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΙΔΙΟΠΑΘΗΣ ΘΡΟΜΒΟΚΥΤΤΑΡΟΠΕΝΙΚΗ ΠΟΡΦΥΡΑ (ΙΘΠ) Παθοφυσιολογία Ο ρόλος των Β λεμφοκυττάρων στην ΙΘΠ Ο ρόλος των APCs στην ΙΘΠ Ο ρόλος των Τ κυττάρων στην ΙΘΠ Φαινοτυπικές ανωμαλίες Λειτουργικές ανωμαλίες O ρόλος των φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ) στην ΙΘΠ Διάγνωση Πρωταρχική αντιμετώπιση της νόσου Αντιμετώπιση της πρώτης υποτροπής Σπληνεκτομή

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 4.10 Χρόνια ανίατη ιδιοπαθή θρομβοκυτταροπενική πορφύρα ΕΝΔΟΦΛΕΒΙΑ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΗ (Intravenous immunoglobulin, IVIG) Μηχανισμοί δράσης της ΙVIG Δράση διαμέσου του Fc υποδοχέα Αντιφλεγμονώδη δράση Δράση στα Β κύτταρα και στα αντισώματα Δράση στα Τ κύτταρα ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΗ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΙVIG ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA Απομόνωση Ποσοτικός προσδιορισμός νουκλεϊκών οξέων Φωτομετρικός προσδιορισμός Προσδιορισμός με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης ΤΕΧΝΙΚΗ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ DNA ΜΕ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Σύνθεση cdna Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ DNA ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ BRADFORD

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 9. ΟΛΙΓΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΣΗΜΑΝΣΗ ΟΛΙΓΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΩΝ Σήμανση των ολιγονουκλεοτιδίων με προεξέχοντα 5 άκρα Σήμανση των ολιγονουκλεοτιδίων με τυφλά 5 άκρα ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΤΩΝ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΜΗ ΕΝΣΩΜΑΤΩΜΕΝΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΑΣΜΕΝΟΥΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΜΕΘΟΔΟΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗΣ (EMSA - ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY) TGF-β1 ELISA ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΙ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΙΘΠ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΩΝ Th1/Th2 ΤΥΠΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΤΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΙΘΠ Επαγωγή της Th1/Th2 γονιδιακής έκφρασης στους ασθενείς με ΙΘΠ ΠΟΣΟΣΤΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ Τh1/Τh2 ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ Τh1 κυτταροκίνες Τh2 κυτταροκίνες ΕΠΙΠΕΔΑ TGF-β1 ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΚΑΙ ΣΕ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ IVIG ΟΙ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑP-1, NFAT ΚΑΙ NF-κΒ ΣΤΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΙΘΠ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΟΑΠΟΚΡΙΣΗ Η κάθε είδους ειδική ανοσιακή απάντηση αρχίζει με την αναγνώριση του ξένου αντιγόνου, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων. Αποτέλεσμα της ενεργοποίησης αυτής είναι η κινητοποίηση μηχανισμών, οι οποίοι μεσολαβούν στην εκδήλωση της φυσιολογικής δράσης της ανοσιακής απάντησης, δηλαδή στην εξουδετέρωση του αντιγόνου. Αρχικά, τα ξένα αντιγόνα συνδέονται με ειδικούς υποδοχείς, που εκφράζονται στην επιφάνεια των Τ και Β λεμφοκυττάρων. Τα Τ κύτταρα ωριμάζουν στο θύμο και εκφράζουν αντιγονικούς υποδοχείς (συνήθως τους αβ Τ κυτταρικούς υποδοχείς) και συνυποδοχείς (CD4 ή CD8), οι οποίοι αναγνωρίζουν μικρές πεπτιδικές αλληλουχίες συνδεδεμένες με μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC). Τα Β κύτταρα ωριμάζουν στο μυελό των οστών και εκφράζουν στη μεμβράνη τους μόρια αντισωμάτων, ικανά να συνδέονται με ξένες πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες ή λιπίδια, που βρίσκονται σε διαλυτή μορφή. Τα ώριμα Τ και Β λεμφοκύτταρα εξέρχονται από τα γενεσιουργά λεμφοειδή όργανα (θύμος και μυελός των οστών) και κυκλοφορούν στους περιφερειακούς λεμφοειδείς ιστούς, στους οποίους μεταφέρονται και συγκεντρώνονται και τα αντιγόνα. Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (ΑPCs) δεσμεύουν τα πρωτεϊνικά αντιγόνα που εισέρχονται διαμέσου των επιθηλίων, τα φαγοκυτταρώνουν και με πρωτεόλυση τα διασπούν σε μικρότερα αντιγονικά πεπτίδια, τα οποία συνδέονται με ΜΗC μόρια. Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα, ΜΗC:πεπτίδιο, παρουσιάζονται στην επιφάνεια των APCs και αλληλεπιδρούν με Τ κυτταρικούς υποδοχείς (T cell receptors, TcR). Αυτές οι αλληλεπιδράσεις, μαζί με τις αλληλεπιδράσεις των συνδιεγερτών (π.χ. Β27/CD28) και με τη βοήθεια κυτταροκινών που εκκρίνονται από τα APCs οδηγούν τα Τ λεμφοκύτταρα σε ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση. Τα Β κύτταρα ενεργοποιούνται με τη βοήθεια των Τ λεμφοκυττάρων και διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα, τα οποία εκκρίνουν αντιγονοειδικά IgG αντισώματα. Τα CD4+ T βοηθητικά κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό των αντισωμάτων που θα παραχθούν έναντι κάποιου ξένου αντιγόνου και στον έλεγχο της ανοσοαπόκρισης. Έτσι, οποιοδήποτε ελάττωμα ή μη φυσιολογική διέγερση των αντιγονοειδικών Τ βοηθητικών κυττάρων μπορεί να επηρεάσει σημαντικά 5

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την έκβαση της ανοσοαπόκρισης. Κατά την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων ενεργοποιούνται διάφορα μεμβρανικά και κυτταροπλασματικά ένζυμα, τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες που επάγουν τη μεταγραφή διαφόρων γονιδίων. Προϊόντα τέτοιων γονιδίων είναι κυτταροκίνες, υποδοχείς των κυτταροκινών, ανοσοδραστικά μόρια, καθώς και διάφορες άλλες πρωτεΐνες που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο. Καθώς μειώνεται ο αριθμός των αντιγόνων εξασθενίζει και το ερέθισμα που απαιτείται για την επιβίωση των λεμφοκυττάρων και η ανοσοαπόκριση φθίνει. Τα περισσότερα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα πεθαίνουν με αποπτωτικό θάνατο και έτσι το ανοσοποιητικό σύστημα επιστρέφει στην αρχική κατάσταση ηρεμίας του και διατηρεί την ομοιόστασή του. 6

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2. Τ - ΚΥΤΤΑΡΑ 2.1 Μηχανισμός ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων Απουσία ειδικής ενεργοποίησης τα Τ κύτταρα βρίσκονται σε ηρεμία, δεν εκκρίνουν λεμφοκίνες και παραμένουν στη G 0 φάση του κυτταρικού κύκλου. Καθοριστικής σημασίας για τη διαδικασία μεταβίβασης των μηνυμάτων, που οδηγούν στη γονιδιακή μεταγραφή, είναι η κατάσταση φωσφορυλίωσης των τυροσινικών, θρεονινικών και σερινικών ριζών διαφόρων πρωτεϊνών και συγκεκριμένα η ισορροπία μεταξύ της προσθήκης φωσφορικών ομάδων, που καταλύεται από τις πρωτεϊνικές κινάσες και της απομάκρυνσης φωσφορικών ομάδων, που καταλύεται από τις φωσφατάσες (Chan et al., 1994 και Thomas, 1994). Στα αρχικά στάδια της μεταβίβασης του μηνύματος, οι πρωτεΐνες, που υφίστανται μεταβολές στην κατάσταση φωσφορυλίωσής τους, είναι ένζυμα συνδεδεμένα με την κυτταρική μεμβράνη. Ανάλογες μεταβολές που ακολουθούν την κατάσταση φωσφορυλίωσης των αντίστοιχων μεταγραφικών παραγόντων (trans-acting DNA-binding proteins, transcription factors), φαίνεται ότι ρυθμίζουν τη μεταγραφή των γονιδίων του Τ-κυττάρου Η ενδοκυττάρια μεταβίβαση μηνύματος από τον TcR Ο καταρράκτης των διεργασιών που ακολουθούν τη σύνδεση του υποδοχέα του Τ κυττάρου (TcR) με το σύμπλεγμα αντιγονικό πεπτίδιο-μηc μόριο περιλαμβάνει τέσσερα διακεκριμένα αλλά αλληλοδιαπλεκόμενα φαινόμενα: (α) την τυροσινική φωσφορυλίωση διαφόρων μεμβρανικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, (β) την υδρόλυση ενός ινοσιτολικού φωσφολιπιδίου της κυτταρικής μεμβράνης, (γ) την αύξηση της συγκέντρωσης του κυτταροπλασματικού ασβεστίου και (δ) την αύξηση της δραστικότητας της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC). Εντός του πρώτου λεπτού από τη σύνδεση του TcR με το σύμπλεγμα αντιγονικό πεπτίδιο-μηc μόριο παρατηρείται αύξηση της φωσφορυλίωσης των τυροσινικών ριζών διαφόρων μεμβρανικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, στις οποίες περιλαμβάνονται η ζ υπομονάδα του συμπλέγματος του ΤcR, η φωσφολιπάση-γ (PLC-γ), η κινάση της φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης-3 (PI-3 kinase), το CD5 και άλλες πρωτεΐνες, όπως οι vav, 7

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ cbl, SLP-76 και το σύμπλοκο των πρωτεϊνών grb-2/sos (Rudd et al., 1999). Οι φωσφορυλιώσεις αυτές καταλύονται από ένζυμα που φέρονται ως φωσφοτυροσινικές κινάσες (phosphotyrosine kinases, PTKs). H φωσφορυλίωση επιτυγχάνεται με τη σύνδεση των PTKs πάνω σε συγκεκριμένη αλληλουχία, που αποτελείται από 16 αμινοξέα και ονομάζεται ΙΤΑΜ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Διακρίνονται δύο οικογένειες ΡΤΚs: η Src-οικογένεια, στην οποία ανήκουν οι PTKs Lck και Fyn και η οικογένεια των ΖΑΡ-70 (ζ associated protein of 70 kd) και Syk PTKs. Η Lck εκφράζεται κατ εξοχήν στα Τ κύτταρα και εμφανίζεται σε σύνδεση με τα κυτταροπλασματικά άκρα των CD4 και CD8. Αντίθετα, η Fyn εκφράζεται σε πολλά αιμοποιητικά κύτταρα, δεν συνδέεται με τα CD4 και CD8 και φαίνεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μεταβίβαση του μηνύματος του TcR στα διπλά αρνητικά Τ κύτταρα της περιφέρειας. Η τυροσινική φωσφορυλίωση των ΙΤΑΜ έχει σαν άμεσο επακόλουθο τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της ΖΑΡ-70. Μετά απ αυτό, η ΖΑΡ-70, που εκφράζεται αποκλειστικά στα Τ και ΝΚ κύτταρα, εμφανίζεται στερεά συνδεδεμένη με το κυτταροπλασματικό άκρο της ζ αλυσίδας. Τέλος, η Syk εκφράζεται κατ εξοχήν στα Β-κύτταρα. Παρόλο που οι ΡΤΚs πιστεύεται συχνά ότι συμμετέχουν στη διακοπή της μεταβίβασης κάποιου μηνύματος με το να αποφωσφορυλιώνουν διάφορες πρωτεΐνες, παίζουν επίσης και σημαντικό ρόλο στην έναρξη της μεταβίβασης κάποιου μηνύματος. Οι κινάσες p59 fyn και p56 lck παραμένουν σε ανενεργή μορφή όταν είναι φωσφορυλιωμένη κάποια ρυθμιστική περιοχή τους. Η ενεργοποίηση αυτών των κινασών προϋποθέτει τη δράση του CD45, το οποίο τις αποφωσφορυλιώνει και έτσι μεταπίπτουν στην ενεργό μορφή τους. Το CD45, που εκφράζεται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα της αιμοποιητικής σειράς, καταλύει την απομάκρυνση φωσφορικών ομάδων από διάφορα βασικής πιθανώς σημασίας υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων των Lck και Fyn, η τυροσινική αποφωσφορυλίωση των οποίων έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ΡΤΚ-δραστηριότητάς τους. Στα Τ κύτταρα όπου απουσιάζει το CD45, παρατηρείται μειωμένη μεταβίβαση του μηνύματος από τον TcR, επειδή γεγονότα όπως η αύξηση της συγκέντρωσης του Ca 2+, η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C καθώς και η έκκριση κυτταροκινών δεν μπορούν να πραγματοποιηθούν (Weaver et al., και Koretzky et al., 1991). Σε διάφορες αυτοάνοσες ασθένειες έχουν περιγραφεί ανωμαλίες που αφορούν ειδικές πρωτεϊνικές φωσφατάσες, καθώς και πρωτεϊνικές κινάσες της τυροσίνης υπεύθυνες για τη μεταβίβαση του μηνύματος που ξεκινά από τον TcR (Μatsuzawa et al.,1992 και Shultz et al., και Tsui et al., και Kozlowski et al., και Rapoport et al., 1993 και Arpaia et al., και Elder et al., 1994 και Hibbs et al., 1995). Η PLC-γ συνδέεται με τις φωσφορυλιωμένες τυροσινικές ρίζες των κυτταροπλασματικών άκρων των πρωτεϊνών του συμπλέγματος του TcR και ενεργοποιείται. Η ενεργοποίηση της PLC-γ προκαλεί υδρόλυση των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης και παράγει 8

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πολυφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3) και διακυλ-γλυκερόλες (DAG). Η ΙΡ3 διεγείρει την απελευθέρωση ασβεστίου από τις ενδοκυττάριες μεμβρανικές αποθήκες με αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης του κυτταροπλασματικού ασβεστίου. Αποτέλεσμα της αύξησης του ενδοκυττάριου ασβεστίου αλλά και της DAG είναι η ενεργοποίηση της PKC. Από την άλλη πλευρά, η αυξημένη συγκέντρωση του ασβεστίου επάγει το σχηματισμό συμπλεγμάτων του ιόντος με μια ρυθμιστική πρωτεΐνη, την καλμοδουλίνη. Τα συμπλέγματα ασβεστίου-καλμοδουλίνης επάγουν την ενεργοποίηση διαφόρων ενζύμων, κυρίως φωσφατασών, όπως η καλσινευρίνη, τα οποία δρουν σε υποστρώματα διαφορετικά εκείνων της PKC (Timmerman et al., 1996 και Dolmetsch et al., 1997) (Εικόνα 1). Η καλσινευρίνη σαν μέσο μεταβίβασης του σήματος έχει δειχτεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή Th1 κυτταροκινών από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα (Gajewski et al.,1990). Εικόνα 1: Η πρώιμη φάση της μεταβίβασης του μηνύματος μετά από τη διέγερση του ΤcR. 9

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι ενεργοποιημένες PKC ενεργοποιούν στη συνέχεια μόρια όπως την p21 ras, την raf-1 κινάση και την πρωτεϊνική κινάση που ενεργοποιείται από μιτογόνο (mitogen activated protein kinase, ΜΑΡΚ). Αυτή η οδός μεταβίβασης του μηνύματος έχει βρεθεί ελαττωματική σε πειραματικά μοντέλα αυτοάνοσου διαβήτη τύπου Ι, με αποτέλεσμα να υπάρχει πρόβλημα στην ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και στην παραγωγή των Τh2 κυτταροκινών (Ζipris et al., 1991 και Rapoport et al., 1993). Ανωμαλίες σε μόρια που συμμετέχουν στη μεταβίβαση του σήματος διαμέσου του TcR υποδοχέα ίσως συνδέονται με αυτοάνοσα νοσήματα, γεγονός που δείχνει ότι κάθε αυτοάνοση ασθένεια ίσως να συνδέεται με διαφορετική ανωμαλία ή ανωμαλίες στη μεταβίβαση του μηνύματος Η ενεργοποίηση της μεταγραφής Μέσα σε λίγα λεπτά από τη στιγμή της σύνδεσης του TcR με το σύμπλεγμα αντιγόνο- MHC αρχίζει η μεταγραφή ενός πλήθους γονιδίων, τα προϊόντα των οποίων είναι απαραίτητα για την εξέλιξη της ενεργοποίησης του Τ κυττάρου. Πρόκειται για τα γονίδια των πρωτο-ογκογονιδίων/μεταγραφικών παραγόντων, των κυτταροκινών και των υποδοχέων των κυτταροκινών. Η περισσότερο μελετημένη από τις μεταγραφικές διαδικασίες είναι εκείνη του γονιδίου της IL-2. Η μεταγραφή του γονιδίου της IL-2, όπως και των άλλων κυτταροκινών, αρχίζει μια ώρα μετά τη σύνδεση του TcR με το σύμπλοκο αντιγόνο-mhc. Ο υποκινητής (promoter) του γονιδίου της IL-2 παριστά μια περιοχή περίπου 300 bp κατά το 5 -πέρας του γονιδίου, όπου υπάρχουν πολλαπλά τμήματα DNA, τα οποία είτε ανταποκρίνονται στα μηνύματα του TcR και των συνοδών μορίων, είτε και επιταχύνουν τη μεταγραφή. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της σύνδεσης αυτών των DNA-τμημάτων με μη ειδικούς για τα Τ-κύτταρα πυρηνικούς παράγοντες (nuclear factors, NFs), οι οποίοι είτε υπάρχουν ενεργοποιημένοι (π.χ. Oct1) είτε επάγονται από τη διέγερση των Τ-κυττάρων, όπως ο NF-kB και ο AP-1, που αποτελείται από τα προϊόντα των πρωτο-ογκογονιδίων fos και jun. Το φαινόμενο που συνδέει την πρώιμη φάση της μεταβίβασης του μηνύματος του διεγερμένου TcR, με τα φαινόμενα της μεταγραφής είναι η επαγωγή της σύνθεσης του fos και κατ επέκταση της παραγωγής AP-1, από την PKC. Ο NF-kB υπάρχει σε ενεργοποιημένη μορφή αλλά βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα συνδεδεμένος με τον αναστολέα IkB. Η φωσφορυλίωση του IkB από την PKC αποδεσμεύει τον NF-kB και επιτρέπει τη μετακίνησή του προς τον πυρήνα και τη σύνδεσή του με τον υποκινητή. Επιπλέον, ο υποκινητής του γονιδίου της ΙL-2 διαθέτει και δύο αλληλουχίες που συνδέονται με NFs, οι οποίοι εκφράζονται μόνο στα Τ-κύτταρα, μετά από τη διέγερση του 10

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ TcR. Αυτοί είναι οι NFAT (nuclear factor of activated T cells) και NFIL-2A. Ο NFAT, που είναι υπεύθυνος για τη μεταγραφή των γονιδίων και διάφορων άλλων κυτταροκινών, υπάρχει στο κυτταρόπλασμα πριν από τη διέγερση του TcR. Η αποφωσφορυλίωσή του από την καλσινευρίνη επιτρέπει την εισοδό του στον πυρήνα, όπου συνδέεται με την παραγόμενη AP-1 και σχηματίζει σύμπλεγμα που καθηλώνεται στον υποκινητή. Ο NFIL-2A συνίσταται από τον Oct1 και από μια επαγόμενη, ειδική για τα Τ-κύτταρα πρωτεΐνη, την OAP (Oct1 activating protein). Ο ακριβής μηχανισμός δράσης του δεν είναι γνωστός. Αν και η σύνδεση του NFAT με τον υποκινητή είναι απαραίτητη για την έναρξη της μεταγραφής, εντούτοις δεν είναι από μόνη της ικανή να οδηγήσει σε παραγωγή IL-2. Τα mrnas των κυτταροκινών είναι εξαιρετικά ασταθή, λόγω της ύπαρξης μιας μη μεταφραζόμενης 3 -αλληλουχίας, σκοπός της οποίας είναι η αποφυγή της μόνιμης παραγωγής τους και η ρύθμιση της δραστικότητάς τους. Έτσι, η επιτυχής μεταγραφή του γονιδίου της IL-2 προϋποθέτει, εκτός από τη δράση του NFAT, τη σταθεροποίηση του mrna, η οποία επάγεται από το μήνυμα που μεταβιβάζεται από το CD28 αμέσως μετά τη σύνδεσή του με το μόριο Β7. Η σύνδεση αυτή αυξάνει περίπου 3 φορές τη μεταγραφή του mrna της IL-2, ενώ η σταθεροποίηση του mrna αυξάνει τη σύνθεση της IL-2 κατά φορές. Τελικό αποτέλεσμα είναι η αύξηση της παραγωγής IL-2 κατά 100 φορές. Το CD28 είναι μια ομοδιμερής μικρομοριακή (44kD) γλυκοπρωτεϊνη που εκφράζεται στην επιφάνεια όλων σχεδόν των CD4+ Τ κυττάρων και στο 50% των CD8+ Τ κυττάρων. Παράλληλα με τη σύνδεση του συμπλέγματος αντιγονικό πεπτίδιο-mhc μόριο με τον TcR, το CD28 συνδέεται με τα μεμβρανικά μόρια Β7.1 και Β 7.2 των μακροφάγων, των δενδριτικών κυττάρων και των ενεργοποιημένων Β κυττάρων. Η σύνδεση αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη μεταβίβαση του δεύτερου μηνύματος, που είναι απαραίτητο για την εκδήλωση της ενεργοποίησης του Τ κυττάρου. Απουσία αυτού του μηνύματος (ενδεχομένως και άλλων, λιγότερο διευκρινισμένων), το διεγειρόμενο μόνο από τη σύνδεση του συμπλέγματος αντιγονικό πεπτίδιο-mhc μόριο με τον TcR, T-κύτταρο περιέρχεται σε κατάσταση, κατά την οποία είναι επί μακρόν βιώσιμο αλλά αδυνατεί να ανταποκρίνεται στο αντιγονικό ερέθισμα (ανεργία). 2.2 Βοηθητικά Τ-κύτταρα H ενεργοποίηση των βοηθητικών Τ κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μηνυμάτων μεσολαβητών που είναι απαραίτητα για την εκδήλωση των κυτταροεξαρτώμενων ανοσιακών αντιδράσεων, για τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων με συνέπεια την παραγωγή αντισωμάτων, και γενικότερα για τη ρύθμιση της λειτουργίας των Τ και Β κυττάρων, των μονοκυττάρων και μακροφάγων, καθώς και άλλων κυττάρων του ανοσιακού 11

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συστήματος. Η επίδραση των βοηθητικών Τ κυττάρων στη διαφοροποίηση των Β κυττάρων επιτυγχάνεται, επίσης, και με την άμεση επαφή των δύο κυτταρικών πληθυσμών, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την άμεση διέγερση των υποδοχέων των Β κυττάρων και την έκθεσή τους σε υψηλές συγκεντρώσεις κυτταροκινών που παράγονται από τα Τ κύτταρα. Ο αριθμός των κυτταροκινών που παράγονται από τα παρθένα Τ βοηθητικά κύτταρα είναι πολύ περιορισμένος. Πρακτικά, αμέσως μετά την πρώτη επαφή τους με το αντιγόνο, τα βοηθητικά Τ κύτταρα παράγουν αποκλειστικά σχεδόν IL-2. Όταν, όμως, τα παρθένα βοηθητικά Τ κύτταρα ενεργοποιηθούν, εξελίσσονται σε δραστικά Τ κύτταρα που παράγουν μεγάλη ποικιλία κυτταροκινών Διαχωρισμός των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων σε υποπληθυσμούς ανάλογα με το εκκριτικό προφίλ κυτταροκινών Τα περισσότερα από τα ώριμα δραστικά Τ κύτταρα διακρίνονται σε δύο υποπληθυσμούς, τα Τh1 και τα Τh2 κύτταρα, βάσει των κυτταροκινών που παράγουν. Η παραγωγή διαφορετικών κυτταροκινών επιτρέπει στους δύο αυτούς υποπληθυσμούς των βοηθητικών Τ κυττάρων να προάγουν διαφορετικά είδη ανοσιακών αντιδράσεων και να είναι περισσότερο αποτελεσματικά στην καταστροφή διαφορετικών παθογόνων μικροοργανισμών. Τα Τh1 κύτταρα παράγουν IL-2, IFN-γ, TNF-α και IL-12. Γενικά, αυτές οι κυτταροκίνες προάγουν τις λειτουργίες των μακροφάγων και των άλλων φαγοκυττάρων και, κατά συνέπεια, την ενδοκυττάρια καταστροφή των παθογόνων. Αντίθετα, τα Τh2 κύτταρα εκκρίνουν IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13. Αυτές οι κυτταροκίνες δρουν σαν χημειοτακτικοί παράγοντες των Β-κυττάρων, των ιστιοκυττάρων και των βασεόφιλων και προάγουν την ωρίμανση και τη διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων στα σημεία της ανοσιακής απάντησης. Κατ αυτόν τον τρόπο τα Τh2 κύτταρα είναι ιδιαίτερα δραστικά έναντι πολυκυτταρικών παρασίτων, τα οποία καταστρέφονται εξωκυτταρίως από τα ηωσινόφιλα αλλά είναι αρκετά μεγάλα, για να καταστραφούν από τα μακροφάγα (Romagnani et al., 1994). Τα Τh1 και Τh2 κύτταρα φαίνεται ότι προέρχονται από ένα κοινό πρόδρομο Τ κύτταρο, το Τh0 κύτταρο, που χαρακτηρίζεται από την ικανότητά του να εκκρίνει τις περισσότερες από τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν τα Th1 και Τh2 κύτταρα, και κυρίως IL-2 και IL-10 (Yssel et al., 1992). Η διαφοροποίηση του Τh0 κυττάρου προς τον ένα ή τον άλλο υποπληθυσμό εξαρτάται από τις κυτταροκίνες που υπάρχουν στο περιβάλλον. H IFN-γ παίζει ρόλο στην απόκτηση του Th1 φαινότυπου από τα Τ λεμφοκύτταρα, αν και μάλλον είναι σημαντικότερος ο ρόλος της στην αποτροπή διαφοροποίησης των 12

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τ λεμφοκυττάρων σε Τh2. Απ ευθείας διαφοροποίση σε Th1 προκαλεί η IL-12, ενώ η IL-4 οδηγεί στην παραγωγή Τh2 κυττάρων. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εκκρίνουν IL-12 που προάγει την τοπική παραγωγή Τh1 κυττάρων, τα οποία ακολούθως ενισχύουν τη δράση των μακροφάγων. Για την προέλευση της IL-4, κατά την αρχική φάση της ανοσιακής απάντησης ενοχοποιείται ένας μικρός υποπληθυσμός Τ κυττάρων. Κατά την εξέλιξη της ανοσιακής απάντησης, η διαφοροποίηση προς Τh2 κύτταρα είναι πιθανό ότι προάγεται από την IL-4 που παράγεται από τα ενεργοποιημένα ιστιοκύτταρα. Επιπλέον, οι κυτταροκίνες που παράγονται από καθέναν από τους υποπληθυσμούς των βοηθητικών Τ κυττάρων προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης του άλλου. Η παραγόμενη από τα Τh1 κύτταρα IFN-γ αναστέλλει την ανάπτυξη των Τh2 κυττάρων, ενώ η IL-4 που παράγεται από τα Τh2 κύτταρα αναστέλλει την ανάπτυξη των Τh1 κυττάρων (Εικόνα 2). Ως αποτέλεσμα όλων αυτών των θετικών και αρνητικών αλληλορυθμίσεων, κατά την εξέλιξη κάθε ανοσιακής απάντησης, επικρατεί ένας συγκεκριμένος υποπληθυσμός βοηθητικών Τ κυττάρων. Στον οργανισμό θεωρείται ότι οι φυσιολογικοί επαγωγείς του εκκριτικού προφίλ των Τ λεμφοκυττάρων είναι τα APCs και μεταξύ αυτών είναι καλά τεκμηριωμένος ο ρόλος των δενδριτικών κυττάρων. Θεωρείται ότι στα πλαίσια της παρουσίασης αντιγόνων από τα δενδριτικά κύτταρα, παράγονται κυτταροκίνες που προκαλούν τη διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων (Moser και Murphy, 2000). Επίσης έχει διαπιστωθεί ότι τα γδ+ Τ λεμφοκύτταρα παράγουν ταχύτερα κυτταροκίνες και ίσως αυτά να είναι η πηγή των κυτταροκινών που προκαλεί in vivo την πόλωση των αβ+ Τ λεμφοκυττάρων σε Τh1ή Th2 Εικόνα 2: Η παραγωγή κυτταροκινών από τα Th1 και Th2 - κύτταρα. (Οι συνεχόμενες γραμμές δηλώνουν επαγωγή και οι διακεκομμένες αναστολή). 13

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Ferrick et al., 1995). H απόκτηση του φαινότυπου έκκρισης κυτταροκινών δεν επάγεται υποχρεωτικά από κυτταροκίνες, αλλά υπάρχουν και άλλοι παράγοντες. Η διαφορετική συγκέντρωση αντιγόνου μπορεί να επηρεάσει το προφίλ των κυτταροκινών που εκκρίνονται, ενώ σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή φαίνεται ότι έχουν και μόρια συνδιεγέρτες (costimulatory molecules) που επάγουν δεύτερο σήμα για τη διέγερση των λεμφοκυττάρων (Sayegh et al., 1995). Το μήνυμα που μεταφέρεται προκειμένου να παραχθούν κυτταροκίνες τύπου Τh1 ή Th2 διαφέρει όπως έχει δειχτεί από διάφορους ερευνητές (Kawakami και Parker, 1992 και Li και Fox, 1993 και Katamura et al. και Tamura et al., 1995). Περισσότερο έχει μελετηθεί η οδός ενεργοποίησης για την παραγωγή IL-2 από τα Τh1 κύτταρα, όπου συμμετέχουν οι p59 fyn και ZAP-70 πρωτεϊνικές κινάσες της τυροσίνης, ενεργοποιείται η PLCγ, παράγεται πολυφωσφορική ινοσιτόλη, αυξάνεται η ενδοκυττάρια συγκέντρωση ασβεστίου και ενεργοποιείται η PKC. Τα διαμεμβρανικά μηνύματα που οδηγούν στην παραγωγή IL-4 από τα Th2 κύτταρα έχουν μελετηθεί λιγότερο, αλλά ωστόσο φαίνεται ότι χρησιμοποιείται διαφορετική οδός ενεργοποίησης απ αυτή που οδηγεί στην παραγωγή IL-2. Επιπλέον έχει δειχτεί ότι όταν υπάρχει πρόβλημα στην οδό PKC-p21 ras -MAPK μπορεί να επηρεάσει την παραγωγή της IL-4 που ελέγχεται από την ενεργοποίση του TcR υποδοχέα και όχι την παραγωγή IL-2 (Ζipris et al., 1991 και Rapoport et al., 1993). 14

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3. ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ H αυτοανοσία είναι μια σωματική αιτία νόσου των ανθρώπων και επηρεάζει το 2% περίπου του πληθυσμού των ανεπτυγμένων χωρών. Η επιδημιολογική παρατήρηση ότι όσο αυξάνεται το επίπεδο υγιεινής και μειώνεται η εμφάνιση λοιμωδών νοσημάτων σε ένα πληθυσμό (δηλαδή όσο μειώνεται το φυσικό αντιγονικό ρεπερτόριο) τόσο αυξάνεται η εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων, αποτελεί τη βάση μιας δημοφιλούς σημερινής θεωρίας ότι η έλλειψη του φυσιολογικού στόχου του ανοσοποιητικού συστήματος το εκτρέπει προς την αυτοανοσία. H ικανότητα των λεμφοκυττάρων να διακρίνουν, να αναγνωρίζουν και να απαντούν στα ξένα αντιγόνα και παράλληλα να μην αντιδρούν στο πλήθος των αντιγονικών ουσιών που απαντώνται στον ίδιο τον οργανισμό, αποτελεί μια από τις σημαντικότερες ιδιότητες του ανοσιακού συστήματος. Η κεντρική ανοχή είναι ένας μηχανισμός επιλογής των ανώριμων αυτο-αντιδρώντων λεμφοκυττάρων που απαλείφει κύτταρα που φέρουν υποδοχείς υψηλής συγγένειας για γενικευμένα αυτοαντιγόνα. Συχνά διατυπώνεται η υπόθεση ότι η αυτοανοσία προκύπτει από αποτυχία αυτής της διαδικασίας επιλογής. Υπάρχουν όμως λίγες μαρτυρίες που υποστηρίζουν την υπόθεση αυτή για όλες τις περιπτώσεις αυτοάνοσων νοσημάτων. Είναι πιθανό επίσης, ότι ακόμη κι αν αποτύχει η κεντρική ανοχή, περιφερικοί μηχανισμοί είναι διαθέσιμοι για τη διατήρηση μη απόκρισης σε πολλά αυτοαντιγόνα. Η ανοχή των ώριμων αντιγονο-ειδικών Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια διατηρείται μέσω λειτουργικής ανεργίας, απαλοιφής μέσω απόπτωσης και καταστολής των ρυθμιστικών κυττάρων. Η αυτοανοσία που προκύπτει από αποτυχία καθενός από τους μηχανισμούς της περιφερειακής Τ ανοχής, έχει δειχτεί σε πολλά πειραματικά μοντέλα και σε στελέχη ποντικών με γονιδιακές μεταλλάξεις που εμφανίζουν προδιάθεση για αυτοάνοσα νοσήματα (Sinha et al., 1990). Οι αυτοάνοσες παθήσεις χαρακτηρίζονται από ιστική βλάβη και λειτουργικές διαταραχές που προκαλούνται από τα αυτοδραστικά λεμφοκύτταρα και τα αντιγόνα. Μπορεί να οφείλονται σε πρωταρχικές ανωμαλίες των Β κυττάρων, των Τ κυττάρων ή και των δύο. Τα αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα μπορούν να προκαλέσουν ιστική βλάβη είτε άμεσα με κυτταροτοξικούς μηχανισμούς, οι οποίοι απαιτούν ειδική αλληλεπίδραση 15

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ με το κύτταρο στόχο μέσω αναγνώρισης του MHC-πεπτιδίου από τον TCR, είτε έμμεσα με έκκριση κυτταροκινών, με αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στον κυτταρικό θάνατο, με ενεργοποίηση της διαφοροποίησης των Β κυττάρων σε πλασματοκύτταρα που παράγουν αυτοαντισώματα, ή με απελευθέρωση αυτοαντιγόνων από τους κυτταρικούς στόχους. Ενώ οι αντιγονικοί στόχοι, οι μηχανισμοί της ιστικής βλάβης και η γενετική βάση στην αυτοανοσία είναι τώρα περισσότερο κατανοητά, τα αρχικά γεγονότα που οδηγούν στην απώλεια της ανοχής καθώς και οι παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για τη διάρκεια και για την υποτροπή αυτοάνοσων φαινομένων παραμένουν αδιευκρίνιστα. Οι δύο κύριες θεωρίες που επικρατούν σχετικά με την επαγωγή της ανοσιακής ανοχής είναι είτε μέσω κλωνικής απάλειψης των αυτο-αντιδρώντων Τ κυττάρων μέσα στο θύμο (Kappler et al., 1988), είτε μέσω αντιγονοειδικών ή μη μηχανισμών εκτός θύμου οι οποίοι καθιστούν τα Τ κύτταρα ανενεργά (Mueller et al., 1989). Έτσι, κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ζωής τα λειτουργικά ανώριμα λεμφοκύτταρα περνούν από ένα στάδιο διαφοροποίησης, κατά το οποίο έρχονται σε επαφή με τα αυτόλογα αντιγόνα και η επαφή αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την καταστροφή ή την αδρανοποίησή τους. Η απώλεια ανοσιακής ανοχής στα αυτό-αντιγόνα ίσως είναι το αποτέλεσμα ενός αριθμού μηχανισμών όπως π.χ. μη φυσιολογικοί αριθμοί αυτοαντιδρώντων Τ κυττάρων, έλλειψη ενεργών περιφερικών κατασταλτικών μηχανισμών εκτός θύμου όπως κατασταλτικά λεμφοκύτταρα και δίκτυα κυτταροκινών, γενετικοί παράγοντες ή περιβαλλοντική διέγερση, που μπορεί να μιμηθεί αυτό-αντιγόνα.(αντιγονικός μιμητισμός). 16

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4. ΙΔΙΟΠΑΘΗΣ ΘΡΟΜΒΟΚΥΤΤΑΡΟΠΕΝΙΚΗ ΠΟΡΦΥΡΑ (ΙΘΠ) Η IΘΠ είναι ένα επίκτητο αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από την παραγωγή αντισωμάτων (Abs) έναντι αντιγόνων της μεμβράνης των αιμοπεταλίων, γεγονός που οδηγεί στην αυξημένη καταστροφή των αιμοπεταλίων από τα μακροφάγα στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα. H συχνότητα με την οποία εμφανίζεται είναι 100 περιπτώσεις ανά άτομα το χρόνο, από τις οποίες οι μισές περίπου απαντώνται σε παιδιά (Lilleyman, 1994 και Frederiksen και Schmidt, 1999). Η ΙΘΠ διακρίνεται σε 2 τύπους: τη χρόνια ΙΘΠ, μια τυπική νόσο των ενηλίκων και την οξεία ΙΘΠ που εμφανίζεται σε παιδιά, συμβαίνει συνήθως μέσα σε κάποιες εβδομάδες μετά από κάποια ίωση και γενικά υποχωρεί το πολύ μετά από 6 εβδομάδες. Περίπου το 20% των παιδιών με οξεία ΙΘΠ αναπτύσσουν τη χρόνια μορφή της νόσου, που χαρακτηρίζεται από θρομβοκυτταροπενία (αριθμός αιμοπεταλίων< l -1 ) για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο των έξι μηνών. Η ΙΘΠ εμφανίζεται πιο συχνά στα παιδιά παρά στους ενήλικες και περίπου το 40% των ασθενών είναι ηλικίας κάτω των 10 ετών. Στα παιδιά και τα δύο φύλα προσβάλλονται εξίσου, ενώ στους ενήλικες υπερισχύουν οι γυναίκες με αναλογία 3:1 (George et al., 1994 και 1996). Παρόλο που και η οξεία και η χρόνια μορφή της νόσου είναι ανοσολογικής αιτιολογίας (Berchtold et al., 1989), φαίνεται ότι διαφορετικοί παθογενετικοί μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για κάθε μία από τις δύο μορφές. Διευκρίνιση τέτοιων διαφορών ίσως μας βοηθήσει να καταλάβουμε ποια απ τα παιδιά με οξεία ΙΘΠ είναι πιθανόν να αναπτύξουν τη χρόνια μορφή της. 4.1 Παθοφυσιολογία Η ΙΘΠ προκαλείται από αυτοαντισώματα, κάτι που αποδεικνύεται από το γεγονός ότι νεογνά που γεννήθηκαν από προσβεβλημένες μητέρες παρουσιάζουν παροδική θρομβοκυτταροπενία, καθώς και υγιή άτομα που υποβλήθηκαν σε μετάγγιση πλάσματος με κλάσματα πλούσια σε IgG από ασθενείς με ιδιοπαθή θρομβοκυτταροπενική πορφύρα. Τα αιμοπετάλια που είναι καλυμμένα με IgG αυτοαντισώματα αναγνωρίζονται από τα μακροφάγα διαμέσου του Fcγ υποδοχέα και καταστρέφονται κυρίως στο σπλήνα και στο ήπαρ. Στους περισσότερους ασθενείς παρατηρείται αύξηση της παραγωγής των αιμοπεταλίων προκειμένου να αντισταθμιστεί η καταστροφή τους. Σε άλλους, παρατηρείται 17

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μείωση της παραγωγής αιμοπεταλίων ως αποτέλεσμα της ενδομυελικής καταστροφής τους από τα μακροφάγα ή της αναστολής της μεγακαρυοποίησης (Gernsheimer et al., 1989). Τα επίπεδα της θρομβοποιητίνης δεν αυξάνονται, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία φυσιολογικού αριθμού μεγακαρυοκυττάρων (Emmons et al., 1996). Τα αντισώματα ασθενών με ιδιοπαθή θρομβοκυτταροπενική πορφύρα αναγνωρίζουν σύμπλοκα των γλυκοπρωτεϊνών ΙΙb/IIIa, Ib/IX, Ia/Iia, IV και V, καθώς και διάφορους άλλους υποδοχείς της μεμβράνης των αιμοπεταλίων (van Leeuwen et al., 1982 και Kunicki και Νewman, 1992) (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Παθογένεια της IΘΠ [N Engl J Med, 346(13):995] Tα φυσιολογικά αντισώματα έναντι των γλυκοπρωτεϊνών Iib/IIIa εμφανίζουν κλωνικό περιορισμό στη χρήση της ελαφριάς αλυσίδας (McMillan et al., 2001), αλλά και αντισώματα που προκύπτουν από βιβλιοθήκες φάγων εμφανίζουν υψηλή συντήρηση στη χρήση του γονιδίου V H. Προσδιορισμός της αλληλουχίας των περιοχών των αντιγόνων που συνδέονται μ αυτά τα αντισώματα έδειξε ότι προέρχονται από περιορισμένο αριθμό Β κυτταρικών κλώνων με αντιγονο-κατευθυνόμενη επιλογή συγγένειας και σωματικές 18

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεταλλάξεις (Fischer et al., 1999). Ενήλικες με ΙΘΠ συχνά εμφανίζουν αυξημένο αριθμό HLA-DR+ Τ κυττάρων, αυξημένο αριθμό των διαλυτών υποδοχέων της ιντερλευκίνης-2 και ένα προφίλ κυτταροκινών που δείχνει ενεργοποίηση των πρόδρομων Τ βοηθητικών κυττάρων και των τύπου Ι Τ βοηθητικών κυττάρων (Semple et al., 1996). Σ αυτούς τους ασθενείς, τα Τ κύτταρα διεγείρουν την παραγωγή αντισωμάτων μετά από έκθεση σε τμήματα της γλυκοπρωτεΐνης IIb/IIIa (Kuwana et al., 2001). Oι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της ιδιοπαθούς θρομβοκυτταροπενικής πορφύρας στοχεύουν σε διάφορα στάδια του κύκλου παραγωγής των αντισωμάτων ή της ευαισθητοποίησης, καταστροφής και παραγωγής των αιμοπεταλίων (Εικ. 4). Εικόνα 4: Μηχανισμοί δράσης της θεραπείας στην IΘΠ [N Engl J Med, 346(13):995] Πολλοί ιοί αλληλεπιδρούν με τα μεγακαρυοκύτταρα και καταστέλλουν την παραγωγή αιμοπεταλίων (Young και Mortimer, 1984 και Kaplan et al., 1992). H ανοσοαπόκριση που ακολουθεί ίσως οδηγεί στο σχηματισμό αιμοπεταλιακών αυτοαντισωμάτων με ποικίλους μηχανισμούς όπως απόκριση σε κατεστραμμένο κύτταρο ή ακάλυπτα κρυπτοαντιγόνα, πολυκλωνική ενεργοποίηση, μοριακή μίμηση και σχηματισμό αντιιδιοτυπικών 19

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντισωμάτων (Vaughan et al., 1995). Συχνά, προηγείται της οξείας ΙΘΠ κάποια βακτηριακή λοίμωξη και είναι πιθανό τοξίνες ή υπεραντιγόνα να οδηγούν στην επαγωγή της θρομβοκυτταροπενίας. Η πορφύρα που εμφανίζεται νωρίς κατά την διάρκεια της λοίμωξης ίσως να οφείλεται άμεσα στην καταστροφή των μεγακαρυοκυττάρων, ενώ η θρομβοκυτταροπενία που εμφανίζεται μετά την λοίμωξη ίσως επάγεται από ανοσολογικά σύμπλοκα ή αυτοαντιγόνα. Επίσης είναι πιθανή και η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών μηχανισμών, όπως έχει προταθεί και για τη θρομβοκυτταροπενία που οφείλεται στη μόλυνση με τον ιό ΗΙV (human immunode ciency virus) (Karpatkin et al., 1995 και Bettaieb et al., 1996). Στην οξεία ΙΘΠ της παιδικής ηλικίας, τα αιμοπετάλια παραμένουν ζωντανά για μικρό χρονικό διάστημα και ο αριθμός των μεγακαρυοκυττάρων, όπως προκύπτει από εξετάσεις μετά από διήθηση μυελού των οστών είτε παραμένει στα φυσιολογικά επίπεδα, είτε εμφανίζεται αυξημένος. Ο ρυθμός παραγωγής των αιμοπεταλίων είναι άγνωστος, και συχνά ποικίλλει, ανάλογα με την ανταπόκριση στη θεραπεία. 4.2 Ο ρόλος των Β λεμφοκυττάρων στην ΙΘΠ Ο μηχανισμός της ανοσολογικής αυτο-ανοχής στο επίπεδο των Β κυττάρων είναι ανάλογος εκείνου των Τ κυττάρων: κλωνική εξάλειψη των αυτοαντιδρώντων Β κυττάρων και/ή καταστολή των Β που δεν έχουν εξαλειφθεί. Η παραγωγή αυτοαντισωμάτων στις αυτοάνοσες ασθένειες, ίσως να οφείλεται σε ενδογενείς ανωμαλίες των Β λεμφοκυττάρων είτε/και σε ανωμαλίες μηχανισμών που άμεσα τα ελέγχουν, όπως αυξημένη ενεργότητα ή ενισχυμένη ευαισθησία σε εξωτερικά ερεθίσματα, αυξημένα αντιγονικά φορτία και/ή ενισχυμένη ανοσοδιέγερση διαμέσου των Τ κυττάρων. Τα Β κύτταρα υφίστανται αρνητική επιλογή κατά την οντογένεσή τους, αν και διαφεύγουν πολλά κυρίως χαμηλής συγγένειας αυτοδραστικά Β κύτταρα στην περιφέρεια, με συνέπεια η παραγωγή αυτοαντισωμάτων να είναι φυσιολογική και στα υγιή άτομα. Το πλήρες ώριμο εύρος ειδικοτήτων των IgM φυσικών αντισωμάτων διαμορφώνεται νωρίς στη ζωή και παραμένει σταθερό σε όλη τη διάρκεια της. Οι ειδικότητες των αυτοδραστικών ΙgG επιλέγονται με την αναγνώριση περιορισμένου αριθμού αυτοαντιγόνων και παραμένουν σταθερές σε όλη τη ζωή. Αντίθετα οι ειδικότητες των IgG έναντι των ξένων αντιγόνων ποικίλλουν πολύ από άτομο σε άτομο, αλλάζουν με την ηλικία και αντανακλούν το ιστορικό του κάθε ατόμου. Βασική λειτουργία των φυσικών αυτοαντισωμάτων φαίνεται ότι είναι η πρώτη γραμμή άμυνας σε λοιμογόνους παράγοντες πριν την εμφάνιση της αναμνηστικής ανοσολογικής απόκρισης. Συντελούν επίσης στην κάθαρση γηρασμένων κυττάρων και μεταβολικών αποβλήτων, καθώς και στην κάθαρση ανοσοσυμπλεγμάτων από την κυκλοφορία. Εμφανίζουν ακόμα αντιφλεγμονώδη δράση δεσμεύοντας ενεργοποιημένα κλάσματα του συμπληρώματος, καθώς και με την επαγωγή αντιφλεγμονωδών παραγόντων. Έχει προταθεί επίσης ρόλος τους στην ανοσοεπιτήρηση του καρκίνου και στην τροποποίηση της επε- 20

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ξεργασίας και της παρουσίασης αντιγόνων στα Τ κύτταρα. Άλλη σημαντική λειτουργία μπορεί να είναι η πρόληψη της αυτοανοσίας και η διατήρηση της ομοιόστασης του ανοσοποιητικού μέσω αντιιδιοτυπικών επιδράσεων και κάλυψης μικροβιακών αντιγόνων. Έχει προταθεί ότι τα παθογόνα αυτοαντισώματα στις αυτοάνοσες καταστάσεις μπορεί να προέρχονται μετά από πολυκλωνική ενεργοποίηση και αυξημένη παραγωγή φυσικών αυτοαντισωμάτων ή να είναι προϊόν σωματικών μεταλλάξεων που συμβαίνουν σε προγονικά φυσικά αυτοαντισώματα υπό την καθοδήγηση του αυτοαντιγόνου. Ίσως τα πρώιμα IgM αυτοαντισώματα να οφείλονται σε πολυκλωνική ενεργοποίηση και η επιλογή των μεταλλαγμένων αντισωμάτων από το αντιγόνο να γίνεται στην πορεία της νόσου. Τα φυσικά αυτοαντισώματα μπορεί να παράγονται από όλα τα Β κύτταρα που εξέρχονται από τον μυελό των οστών που ενεργοποιούνται είτε από ένα αυτοαντιγόνο είτε από αντιιδιοτυπικό αντίσωμα. Ανωμαλίες των Β λεμφοκυττάρων έχουν περιγραφεί σε πολλά αυτοάνοσα νοσήματα, συμπεριλαμβανομένης και της χρόνιας ΙΘΠ (Βurastero et al., 1988 και Shirai et al., 1992). Όταν CD19+ Β κύτταρα που απομονώθηκαν από ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ καλλιεργήθηκαν παρουσία υπερκείμενων από Τ βοηθητικά κύτταρα (Τh) των ασθενών διεγερμένα in vitro με αυτόλογα αιμοπετάλια παρουσίασαν αυξημένη παραγωγή IgM και IgG, αλλά όχι αυτοαντισωμάτων, ενώ παρήγαγαν αυτοαντισώματα όταν καλλιεργήθηκαν μαζί με αυτόλογα αυτοδραστικά Τh κύτταρα που είχαν προηγουμένως διεγερθεί με αιμοπετάλια. Επομένως, ενώ τα Β κύτταρα ασθενών με ΙΘΠ είναι υπερευαίσθητα στις κυτταροκίνες των Τ κυττάρων, για την παραγωγή αυτοαντισωμάτων απαιτείται άμεση επαφή Β και Τh κυττάρων. Σε ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ, έχει παρατηρηθεί σημαντική αύξηση των CD5 θετικών (CD5 + ) Β κυττάρων τόσο αυτών που βρίσκονται στο σπλήνα, όσο και αυτών της περιφερικής κυκλοφορίας, η οποία συσχετίστηκε με την ικανότητα των Β κυττάρων να παράγουν αντιαιμοπεταλιακά αντισώματα in vitro (Mizutani et al., 1991 και Semple και Freedman, 1991). Η αύξηση του ποσοστού των Β κυττάρων σε συνδυασμό με την αύξηση των ενεργοποιημένων (ΗLADR+) Τh κυττάρων μπορεί να σημαίνει ότι η αύξηση του Β κυτταρικού πληθυσμού προκαλείται από διαταραχές της λειτουργίας των Τ κυττάρων. Επίσης έχει δειχτεί ότι τα CD5 Β κύτταρα διαθέτουν κλώνους υπεύθυνους για την παραγωγή αυτοαντισωμάτων (Burastero et al., 1988 και Shirai et al., 1992). Ωστόσο, δεν είναι εξακριβωμένο αν μόνο τα CD5 + Β κύτταρα είναι υπεύθυνα για την παραγωγή αυτοαντισωμάτων και την ανάπτυξη αυτοανοσίας. Σε πολλές αυτοάνοσες καταστάσεις έχει παρατηρηθεί κλωνικότητα των αυτοαντισωμάτων που παράγονται. Η κλωνικότητα της Β κυτταρικής ανοσοαπόκρισης στην αυτοανοσία δείχνει το ότι διεγείρονται τα Β κύτταρα και ίσως αντανακλά τη φύση του αυτοαντιγόνου και/ή τη ρύθμιση διαμέσου των Τ κυττάρων. Σε ασθενείς με ΙΘΠ έχουν βρεθεί εκτεταμένοι κλώνοι Β κυττάρων που δεν περιορίζονται σε CD5 + Β κυτταρικούς υποπληθυσμούς μόνο (van der Harst et al., 1990). 21

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4.3 Ο ρόλος των APCs στην ΙΘΠ Τα ΑΡCs αποτελούν τα κύτταρα που είναι πρωταρχικά υπεύθυνα για τη φυσιολογική καταστροφή των αιμοπεταλίων στο σπλήνα. Επίσης πολύ σημαντικός φαίνεται ότι είναι ο ρόλος τους στην έναρξη της αυτοάνοσης διαδικασίας, όπου μπορεί να συμμετέχουν παρουσιάζοντας αυτοαντιγονικούς επιτόπους στα αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα. Λίγα είναι γνωστά όσο αφορά την ενδοκυτταρική αποδόμηση και την επεξεργασία των μεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών των αιμοπεταλίων. Πιθανόν, αυτές οι γλυκοπρωτεΐνες να μην αποδομούνται πλήρως στα λυσοσώματα αλλά να επανεκφράζονται στην επιφάνεια των APCs, προσδεμένες με MHC-ΙΙ μόρια. Επιπλέον κάτι που σχετίζεται με τα παραπάνω είναι το γεγονός ότι τα μακροφάγα μπορούν να επαχθούν και να εκφράσουν στην επιφάνειά τους MHC-ΙΙ μόρια από ένα πλήθος φλεγμονοδών παραγόντων (Trinchieri και Perussia, 1985). Διάφορες λειτουργίες των APCs μπορούν να επηρεαστούν από κυτταροκίνες όπως η IFN-γ, καθώς και από κάποιες φλεγμονώδεις αντιδράσεις (Elson et al., 1995). Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι τα μακροφάγα βρίσκονται in vivo σε κατάσταση ενεργοποίησης στους ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ. Οι Fc υποδοχείς των μονοκυττάρων έχουν βρεθεί αυξημένοι στην ΙΘΠ και στην αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία και έχει παρατηρηθεί αυξημένος σχηματισμός ροζετών μονοκυττάρων-αιμοπεταλίων στους ασθενείς με ανθεκτική ΙΘΠ (Semple 1998). Επίσης, στον ορρό ασθενών με χρόνια ΙΘΠ έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα Μ-CSF (Zeigler et al., 1993), μιας κυτταροκίνης που συμβάλλει στη διαφοροποίηση κυττάρων της μονοκυτταρικής σειράς, είναι πιθανός ενεργοποιητής των μακροφάγων και επάγει τη φαγοκυττάρωση αλλά και την παραγωγή ΙL-1β (Moore et al., 1980 και Das et al., 1981). Επιπλέον, σε ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ έχει βρεθεί αυξημένος αριθμός CD68+ μορίων. Η CD68 είναι μια λυσοσωματική γλυκοπρωτεΐνη που πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην ενδοκυττάρωση και στην ενδομεμβρανική κυκλοφορία και περιορίζεται στα μακροφάγα, όπου η έκφρασή της επάγεται από φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Σε συνδυασμό με την ενισχυμένη έκφραση του CD68 βρέθηκαν στους ασθενείς με ΙΘΠ και αυξημένα επίπεδα GM-CSF, γεγονός που οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ο GM-CSF εκκρίνεται από ενεργοποιημένα Th που διεγείρουν την φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα με αποτέλεσμα την αύξηση των CD68 μικρομορίων και την καταστροφή των αιμοπεταλίων (Nomura et al., 1995). Είναι πιθανό αυτά τα κύτταρα να παίζουν κάποιο ρόλο στα αρχικά γεγονότα της παθογένειας της IΘΠ, δίνοντας στα Τ κύτταρα τα κατάλληλα συνδιεγερτικά ερεθίσματα έτσι ώστε να ενεργοποιηθούν και στη συνέχεια να επάγουν την παραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β κύτταρα. 22

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4.4 Ο ρόλος των Τ κυττάρων στην ΙΘΠ Φαινοτυπικές ανωμαλίες Ανοσοφαινοτυπικές μελέτες των Τ κυτταρικών πληθυσμών σε ασθενείς με ΙΘΠ έχουν δώσει συχνά αντικρουόμενα αποτελέσματα. Κάποιοι ερευνητές έχουν αναφερθεί σε αυξημένους αριθμούς CD3 + HLA-DR + Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ, γεγονός που δείχνει ότι τα Τ κύτταρα ενεργοποιούνται μη φυσιολογικά in vivo (Mizutani et al., 1987 και Semple και Freedman, 1991 και Garcia-Suarez et al., 1993). Αντιθέτως, σε παιδιά με οξεία ΙΘΠ δεν έχουν βρεθεί αυξημένοι πληθυσμοί HLA-DR + T κυττάρων (Ware et al., 1993). Έχει δειχτεί ότι HLA-DR + T κύτταρα ενεργοποιούν in vitro άλλα εν ηρεμία Τ λεμφοκύτταρα και έτσι ίσως επηρεάζουν την αναγνώριση των αυτοαντιγόνων in vivo (Bouchonnet et al., 1994). Οι φαινοτυπικές διαφορές των HLA-DR + T κυττάρων στην οξεία και στη χρόνια ΙΘΠ ίσως σχετίζονται με διαφορετικούς παθογενετικούς μηχανισμούς που ευθύνονται για την έναρξη ή/και τη διαιώνιση των δύο τύπων της νόσου. Επιπλέον κατά τη μελέτη των Τ κυτταρικών υποπληθυσμών έχουν περιγραφεί ανωμαλίες που αφορούν τη μείωση του πληθυσμού των Τ βοηθητικών κυττάρων (CD4) με αποτέλεσμα να αντιστρέφεται η αναλογία CD4/CD8, όπως και την αύξηση του πληθυσμού των CD45RA και τη μείωση του πληθυσμού των CD45RO Τ λεμφοκυττάρων, κυρίως σε παιδιά με οξεία IΘΠ. Οι ανωμαλίες αυτές δείχνουν τη σχέση που υπάρχει ανάμεσα στη μόλυνση με τον ιό HIV και τη θρομβοκυτταροπενία, καθώς και με άλλα αυτοάνοσα φαινόμενα όπως ο συστημικός ερυθηματώδης λύκος (SLE), ο οποίος μπορεί πρωταρχικά να εμφανίζεται ως ΙΘΠ (Ware και Howard, 1993). Σε πολλά αυτοάνοσα νοσήματα, συμπεριλαμβανομένης και της ΙΘΠ έχει επίσης αναφερθεί και μη φυσιολογική έκφραση οικογενειών γονιδίων του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Μελετώντας την έκφραση του TCR σε Τ κύτταρα ασθενών με χρόνια ΙΘΠ (Ware και Howard, 1993) παρατηρήθηκε ότι 2 στους 14 ασθενείς είχαν στην κυκλοφορία αυξημένους αριθμούς V β 8 + Τ κυττάρων. Έτσι, στη συνέχεια βρήκαν ότι τα παιδιά με οξεία ΙΘΠ έχουν αυξημένους αριθμούς γδ Τ λεμφοκυττάρων (Ware et al., 1994), που αποτελούν το 1% με 15% των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος και πιστεύεται ότι παίζουν άμεσο ρόλο στην πρωταρχική ανοσοαπόκριση έναντι των μολυσματικών παραγόντων. Επίσης ενέχονται στην παθογένεια πολλών αυτοάνοσων νοσημάτων όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η πολυμυοσίτιδα και ο συστημικός ερυθηματώδης λύκος (Haas et al., 1993). Τα γδ κύτταρα ίσως συμμετέχουν στην καταστροφή των αιμοπεταλίων μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος με μηχανισμούς όπως η ενίσχυση της απόκρισης σε αυτοαντιγόνα ή με απευθείας κυτταρόλυση των αιμοπεταλίων. Επίσης έχει βρεθεί ότι τα γδ 23

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κύτταρα παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην ανοσοαπόκριση από τα πρωταρχικά CD4 + T κύτταρα και ίσως σχετίζονται με τους δύο τύπους της ασθένειας, την οξεία και τη χρόνια (Ferrick et al., 1995) Λειτουργικές ανωμαλίες Έχουν περιγραφεί διάφορες λειτουργικές ανωμαλίες στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΙΘΠ. Έχει δειχτεί ότι Τ κυτταρικοί πληθυσμοί από ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ μπορούν να διεγερθούν in vitro με αιμοπετάλια και προσκολλημένα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και στη συνέχεια να πολλαπλασιαστούν και να εκκρίνουν IL-2 (Semple και Freedman 1991). Επίσης, από περιφερικό αίμα παιδιών με οξεία αλλά κυρίως με χρόνια ΙΘΠ έχουν δημιουργηθεί Τ κυτταρικοί κλώνοι ειδικοί που μπορούν και δρουν κατά των αιμοπεταλίων, οι οποίοι όμως είναι ασταθείς και ζουν για σχετικά μικρό χρονικό διάστημα (Ware και Howard 1993). Αυτό οφείλεται στην κατασταλτική δράση που παρουσιάζουν in vitro τα εμπλουτισμένα αιμοπετάλια. Τα αιμοπετάλια παρόλο που είναι ΜΗC Ι θετικά (Santoso et al., 1993), κανονικά στερούνται αντιγόνων τύπου ΙΙ και in vitro δεν μπορούν να επάγουν την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Ένας τρόπος για να μετριαστεί αυτό το πρόβλημα είναι να χρησιμοποιηθούν in vitro γλυκοπρωτεΐνες που έχουν απομονωθεί από αιμοπετάλια σαν ερέθισμα για τη δημιουργία Τ κυτταρικών κλώνων. Προκαταρκτικά αποτελέσματα που προέκυψαν από την εισαγωγή καθαρών GPIIb-IIIa σε λυσοσώματα είναι ενθαρρυντικά (Semple και Freedman, 1995). Άλλες μελέτες σε ασθενείς με ΙΘΠ έχουν δείξει μειωμένη αυτόλογη μεικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση, η οποία θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει κάποιο ρυθμιστικό πληθυσμό Τ κυττάρων που προστατεύουν με ενεργητικό μηχανισμό από την αυτοανοσία αναγνωρίζοντας αυτοαντιγόνα (Zinberg et al., 1982 και Mizutani et al., 1987 και Furubayashi et al., 1992). Επίσης, Τ κύτταρα από ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ έχει παρατηρηθεί ότι παρουσιάζουν μειωμένη ικανότητα διέγερσης από ΡΗΑ, αλλά είναι φυσιολογικά όσο αφορά την ικανότητά τους να παράγουν ΙL-2 (Garcia-Suarez et al., 1993). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τη δουλειά άλλων ερευνητών που έχουν δείξει ότι μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από ασθενείς με οξεία ή χρόνια ΙΘΠ διεγείρονται φυσιολογικά από ΡΗΑ (Quagliata και Karpatkin, 1979 και Semple και Freedman, 1991 και Ware και Howard, 1994). Οι διαφορές, ωστόσο, ίσως να οφείλονται στα διαφορετικά πειραματικά συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν. Εν τούτοις είναι άξιο απορίας το γεγονός ότι τα Τ κύτταρα των ασθενών με ΙΘΠ ίσως είναι ελλατωματικά όσο αφορά τη διέγερσή τους με μιτογόνα, αλλά ωστόσο εκκρίνουν φυσιολογικά IL-2. Σχετική μ αυτές τις παρατηρήσεις είναι και η περίπτωση ενός ασθενούς με χρόνια ΙΘΠ του οποίου τα Τ κύτταρα παρουσίαζαν πρόβλημα στη μετάδοση του σήματος διαμέσου του CD28 μορίου (Perez-Blas et al., 1991). Το 24

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ CD28 εκφράζεται στα περισσότερα Τ κύτταρα και είναι μέλος της υπεργονιδιακής οικογένειας των ανοσοσφαιρινών. Το CD28 συνδέεται με το Β7 (CD80) μόριο που βρίσκεται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και είναι σημαντικός παράγοντας για την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανοσοαπόκρισης. Διαταραχές μορίων μεταγωγής σήματος θα μπορούσαν να στρεβλώσουν και την απόκριση των λεμφοκυττάρων προς Th1 ή Th2 προφίλ κυτταροκινών και να επηρεάσουν έτσι την πολικότητα της Τ κυτταρικής απόκρισης. Απ αυτά τα δεδομένα προκύπτει ότι ίσως τα Τ κύτταρα ασθενών με ΙΘΠ παρουσιάζουν πρόβλημα όσο αφορά την ενδοκυτταρική μεταβίβαση σήματος και ίσως αυτό σχετίζεται με την αυτοάνοση παθογένεια της νόσου. 4.5 O ρόλος των φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ) στην ΙΘΠ Τα φυσικά φονικά κύτταρα (natural killer cells, NK) είναι λεμφοκύτταρα που έχουν την ικανότητα να προκαλούν λύση σε κακοήθη, αλλά και σε μη κακοήθη κύτταρα. Πιστεύεται ότι είναι σημαντικά όχι μόνο στην ανοσοεπιτήρηση, αλλά επίσης και στη ρύθμιση της αιμοποίησης και την ωρίμανση των Β κυττάρων. Σε πολλές αυτοάνοσες παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης και της χρόνιας ΙΘΠ, έχει παρατηρηθεί μειωμένη ενεργότητα των ΝΚ παρόλο που ο αριθμός τους κυμαίνεται στα φυσιολογικά επίπεδα (Gastl et al., 1984 και Semple et al., 1991). Μολονότι, η σημασία της μειωμένης ενεργότητας των ΝΚ στην ΙΘΠ δεν είναι γνωστή, τα ΝΚ μπορούν να ρυθμίζουν την παραγωγή ανοσοσφαιρινών από τα Β κύτταρα και έτσι η ελαττωματική τους ενεργότητα ίσως επηρεάζει την παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Σε PBMC ασθενών με χρόνια ΙΘΠ έχει παρατηρηθεί σημαντική αύξηση των CD3 + CD56 + κυτταροτοξικών Τ κυττάρων καθώς και των CD3 - CD56 + φυσικών φονικών κυττάρων. Η αύξηση των ΝΚ ήταν ιδιαίτερα έντονη στους ασθενείς εκείνους που δεν ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία. Επίσης, ενδιαφέρουσα ήταν η παρατήρηση ότι οι αυξημένοι CD3 - CD56 + πληθυσμοί των ΝΚ παρουσίαζαν επίσης αυξημένη έκφραση μορίων HLA τύπου ΙΙ, δείχνοντας έτσι in vivo ενεργοποίηση (Garcia-Suarez et al., 1993). Έτσι, στους ασθενείς με χρόνια ΙΘΠ υπάρχουν ανωμαλίες των ΝΚ κυττάρων, αλλά η σημασία τους στην παθογένεια της νόσου δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί. 4.6 Διάγνωση Η διάγνωση της ιδιοπαθούς θρομβοκυτταροπενικής πορφύρας παραμένει διάγνωση εξ αποκλεισμού. Δευτερεύουσες μορφές της νόσου μπορούν να εμφανισθούν σε συνδυασμό με το συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο, ανοσοανεπάρκειες (IgΑ ανεπάρκεια και υπογαμασφαιριναιμία), λεμφοβλαστικές νόσους, καθώς και σε ασθενείς με HIV ή ηπατίτιδα C, όπως και μετά από θεραπεία με φάρμακα όπως η ηπαρίνη και η γουανιδίνη. Η επίκτητη αυτοάνοση ή αλλοάνοση θρομβοκυτταροπενία 25