«Η συμβολή της βιοπληροφορικής στη μελέτη της ποικιλότητας των πληθυσμών της πεταλούδας Carassius gibelio»

Transcript

1 «Η συμβολή της βιοπληροφορικής στη μελέτη της ποικιλότητας των πληθυσμών της πεταλούδας Carassius gibelio» Γεώργιος Τσιπάς 1, Μαρία Τάτση 2 1 Καθηγητής Βιολόγος Ph.D., Γυμνάσιο Καινουργίου Αιτωλοακαρνανίας Διδάσκων 407 Πανεπιστημιακής Σχολής Αγρινίου- Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων gtsipas@cc.uoi.gr 2 Καθηγήτρια Πληροφορικής, Γυμνάσιο Καινουργίου Αιτωλοακαρνανίας mtatsi@sch.gr ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην εργασία αυτή γίνεται αναφορά στις εφαρμογές της πληροφορικής που αξιοποιούν, επεξεργάζονται και αναλύουν μοριακά γενετικά δεδομένα των πληθυσμών για την εξαγωγή συμπερασμάτων για τη βιοποικιλότητα, αναγνώριση, ταυτοποίηση και αποκάλυψη των φυλογενετικών τους σχέσεων. Με βάση τα αποτελέσματα στους φυσικούς πληθυσμούς της πεταλούδας Carassius gibelio των λιμνών της Αιτωλοακαρνανίας η βιοπληροφοριακή ανάλυση στηριζόμενη στη μελέτη του γονιδίου β-κυτόχρωμα (cyt b) του μιτοχονδριακού DNA (mtdna) συνέβαλε στην εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων για τη βιοποικιλότητα του είδους. Η ανάλυση στην αλληλουχία των 1140 ζευγών βάσεων του γονιδίου αποκάλυψε 2 διαφορετικούς απλότυπους για το σύνολο των μελετούμενων ιχθυοπληθυσμών. Ο ένας αφορούσε το πληθυσμό της Αμβρακίας και ο δεύτερος τους πληθυσμούς της Τριχωνίδας και του Οζερού. Αντίθετα, στη λίμνη Λυσιμαχία ανιχνεύτηκαν και οι 2 απλότυποι, ενώ ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα 1.27% παρατηρήθηκε μόνο στο πληθυσμό της Λυσιμαχίας. Με τη χρήση των λογισμικών πακέτων MEGA 3.1 και PAUP υπολογίστηκαν οι τιμές των νουκλεοτιδικών αποκλίσεων οι οποίες κυμάνθηκαν από 0.0% %, ενώ η Νeighbor-joining (ΝJ ) και Μaximum-parsimony (MP) ανάλυση ανέδειξε φυλογενετικά δένδρα που ήταν ταυτόσημα με δύο κύριους κλάδους. Στον ένα κλάδο ομαδοποιούνταν ο πληθυσμός της Αμβρακίας και ο ένας απλότυπος του πληθυσμού της Λυσιμαχίας και στον άλλο κλάδο ο δεύτερος απλότυπος της Λυσιμαχίας μαζί με τους πληθυσμούς της Τριχωνίδας και του Οζερού. Η παρουσία του ίδιου ακριβώς απλότυπου ταυτόχρονα στους πληθυσμούς της Αμβρακίας και Λυσιμαχίας, σε συνδυασμό με την απροσδόκητα υψηλή τιμή νουκλεοτιδικής απόκλισης πιθανό-τατα να είναι αποτέλεσμα ανθρωπογενών δραστηριοτήτων και επεμβάσεων που έλαβαν χώρα κατά το παρελθόν και σχετίζονται με την εισαγωγή και τη μείξη των [355]

2 «Ψηφιακές και Διαδικτυακές εφαρμογές στην Εκπαίδευση» ιχθυοπληθυσμών. Παρόλα αυτά η ψηφιακή ανάλυση των δεδομένων μας ανέδειξε την ύπαρξη μοναδικών γενετικών αποθεμάτων (genetic tag) για τους πληθυσμούς της Αμβρακίας, Τριχωνίδας και Οζερού οι οποίοι απαιτούν ειδική διαχείριση για τη διατήρηση της βιοποικιλότητας του είδους. ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Βιοπληροφορική, λογισμικά πακέτα MEGA, PAUP, NJ, MP, Πεταλούδα, mtdna ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ψηφιακή επεξεργασία και ανάλυση μοριακών γενετικών δεδομένων αποτελεί σήμερα ένα σημαντικό επιστημονικό εργαλείο στη μελέτη των φυσικών πληθυσμών. Η αναγνώριση, ο καθορισμός της γενετικής δομής, η χαρτογράφηση του γονιδιώματος, η εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας, ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων, η εξακρίβωση της φυλογεωγραφικής ιστορίας των οργανισμών, η αξιολόγηση ανθρωπογενών δραστηριοτήτων και επεμβάσεων στο φυσικό περιβάλλον και γενικά η διαχείριση, διατήρηση, προστασία του εθνικού γενετικού πλούτου αποτελούν εφαρμογές ειδικών πληροφοριακών λογισμικών συστημάτων, πακέτων και προγραμμάτων. Η οικογένεια Cyprinidae χαρακτηρίζεται από μεγάλο αριθμό γενών, ειδών, πληθυσμών, τα άτομα της οποίας παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλότητα στη μορφολογική-μεριστική και ανατομική τους μορφή (Kirpichnikov 1981), με αποτέλεσμα πολλές φορές να δυσχεραίνεται η ταξινόμηση, η ανάδειξη μοναδικών φυσικών ιχθυοαποθεμάτων και ο προσδιορισμός των φυλογενετικών τους σχέσεων. Γι αυτό το λόγο αρχικά οι βιοχημικές (Ferguson 1980) και πρόσφατα οι μοριακές γενετικές μέθοδοι, όπως η ανάλυση του μιτοχονδριακού DNA (mtdna) ή / και του πυρηνικού DNA σε συνδυασμό με την εφαρμογή της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) και η ανάλυση της αλληλουχίας βάσεων (direct sequence analysis) (Cronin et al.1993, Tautz 1993, Zhou et al. 2003), χρησιμοποιούνται σήμερα κατά περίπτωση με τη βοήθεια και τη συνδρομή ειδικών λογισμικών πακέτων βιοπληροφορικής, ανάλογα με την αποτελεσματικότητά τους στη μελέτη των (taxa) πληθυσμών, υβριδίων, ειδών, γενών και στην εκτίμηση της βιοποικιλότητας. Αρκετές μελέτες έχουν δημοσιευθεί, oι οποίες στηρίζονται στην ανάλυση επιλεγμένων γονιδιακών τόπων για διάφορα είδη, όπως Silurus sp. (Triantaphyllidis et al. 1999), Onchorynchus sp. (Cronin et al. 1993), Cyprinus carpio (Zhou et al. 2003, Tsipas et al. 2009). Η πεταλούδα (Carassius gibelio) ως θερμόφιλο παμφάγο ψάρι και η μεγάλη προσαρμοστική δυνατότητα του, είχε ως συνέπεια τη θεαματική του εξάπλωση. Αν και θεωρείται ενδημικό είδος για την Ελλάδα, εντούτοις υπάρχουν ενδείξεις ότι μπορεί να έχει εισαχθεί στα εσωτε-ρικά νερά της Κεντρικής και Νοτιο-Δυτικής Ελλάδας (Economidis et al. 2000). Ως αλίευμα είναι άφθονο αλλά θεωρείται κατώτερης ποιότητας με χαμηλή εμπορική αξία. [356]

3 Στη παρούσα μελέτη, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ψηφιακής επεξεργασίας μοριακών γενετικών δεδομένων των πληθυσμών της πεταλούδας Carassius gibelio, με σκοπό τη διερεύνηση της πληθυσμιακής ποικιλότητας και την εκτίμηση των φυλογενετικών τους σχέσεων. Ως μέθοδος επιλέχθηκε η τεχνική της ανάλυσης της αλληλουχίας των βάσεων του γονιδίου β- κυτόχρωμα (cyt b) του mtdna δεδομένου ότι αυτή αποτελεί σημαντικό μοριακό βιοπληροφοριακό δείκτη, έναντι άλλων (Birky 1983). ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η συλλογή 9 ατόμων από καθένα πληθυσμό πραγματοποιήθηκε από διαφορετικές τοποθεσίες στις περιοχές μελέτης των ιχθυοπληθυσμών, στις λίμνες Αμβρακία, (ΑMV1), Οζερός (ΟΖΕ1), Λυσιμαχία (LYS1) και Τριχωνίδας (TRI1) της Αιτωλοακαρνανίας. Αμέσως αφαιρέθηκαν από τα νωπά ζωντανά δείγματα λέπια, τα οποία διατηρήθηκαν σε διάλυμα 100% αιθανόλης μέχρι την ανάλυσή τους. Η απομόνωση DNA από τον ιστό των λεπιών έγινε μετά από κατάλληλη επεξεργασία τους σύμφωνα με τη μέθοδο του Taggart (et al. 1992). Κατόπιν, με την εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), έγινε ενίσχυση του γονιδίου β-κυτόχρωμα (cyt b) του mtdna (Cronin et al.1993) με τη χρήση ενός ζεύγους ειδικών εκκινητών (spesific primers) που ήταν αντίστοιχα : cyt b Forward : 5 ATT AGT ACA TAT ATG TAT TAT CAC C 3 cyt b Reverse : 5 CGGGGT TTG ACA AGG ATA ACA G 3 Τα προιόντα της PCR εμπλουτίσθηκαν και προετοιμάστηκαν κατάλληλα για να ακολουθήσει ο προσδιο- ρισμός της αλληλουχίας των βάσεων ολόκληρου του γονιδίου. Οι αλληλουχίες των βάσεων αναλύθηκαν περαιτέρω και με τη βοήθεια των λογισμικών πακέτων MEGA3.1 computer package (Kumar et al. 2004) and PAUP (version 4b10) (Swofford 1998), υπολογίσθηκαν οι τιμές της γενετικής ποικιλότητας και οι νουκλεοτιδικές - φυλογενετικές αποκλίσεις. Οι παράμετροι αυτοί χρησιμοποιήθηκαν για τη κατασκευή δενδρογράμμων με τη χρήση των προγραμμάτων Νeighbor-joining (ΝJ) and Μaximum-parsimony (MP) τα οποία βασίζονται στην ανάλυση bootstrap analysis 1000 δένδρων (Saitou and Nei 1987). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η ανάλυση των αλληλουχιών βάσεων αποκάλυψε 42 αλλαγές υποκαταστάσεις βάσεων για το 1140 ζευγών βάσεων του γονιδίου β- κυτοχρώματος και ανέδειξε 2 απλότυπους / γενότυπους. Ο πρώτος απλότυπος αντιστοιχεί στους (AMV1 και LYS1a) και ο δεύτερος στους (OZE1, TRI1 και LYS1b) πληθυσμούς. [357]

4 «Ψηφιακές και Διαδικτυακές εφαρμογές στην Εκπαίδευση» Απλότυπος α/α C.a.l. AMV1 LYS1a LYS1b OZE1 TRI1 Σύνολο Θέσεις αλλαγών βάσεων στο γονίδιο β-κυτόχρωμα t t c t t t t a g t c c a g g a t a a g t t c a a g g c g t t c a a c t c t g t c a. c t.... t. c t..... c.. a c. t g.. a t a.. t.. t c a.. c. g. c t.... t. c t..... c.. a c. t g.. a t a.. t.. t c a.. c. g c.. c c c c. a.. t c a a g. g g.. c.. g a... c c. g g... c a. t. c.. c c c c. a.. t c a a g. g g.. c.. g a... c c. g g... c a. t. c.. c c c c. a.. t c a a g. g g.. c.. g a... c c. g g... c a. t. Πίνακας 1 : Απλότυποι και αλλαγές στην αλληλουχία των 1140 ζευγών βάσεων του β- κυτοχρώματος των πληθυσμών της πεταλούδας. Oι τελείες δείχνουν ακριβώς ίδιες αλληλουχίες στη θέση με εκείνη του απλότυπου Carassius auratus langsdorfi (C.a.l) (Genbank : AB006953) με τον οποίο έγινε η σύγκριση. Οι παρατηρούμενες νουκλεοτιδικές νουκλεοτιδικές αλλαγές συνέβησαν 38 στη τρίτη και 4 στη πρώτη θέση των κωδικονίων και απαιτήθηκαν 3 αντικαταστάσεις αμινοξέων στο κωδικοποιούμενο πρωτεινικό προιόν. Μάλιστα οι αντικαταστάσεις των βάσεων μεταξύ πουρινών (a g) ή μεταξύ πυριμιδινών (t c) ήταν 40 και μεταξύ πουρινών - πυριμιδινών (a, g t, c) ήταν μόνον δύο (Πίνακας 1). Ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα παρατηρήθηκε μόνον στο πληθυσμό της λίμνης Λυσιμαχία και ήταν 1.27%, ενώ οι τιμές των νουκλεοτιδικών αποκλίσεων μεταξύ των πληθυσμών της πεταλούδας κυμάνθηκαν από 0.00% έως 3.76% ( Πίνακας 2). Carassius gibelio AMV1 LYS1a LYS1b OZE1 TRI1 AMV1 - LYS1a LYS1b OZE TRI Πίνακας 2: Νουκλεοτιδική απόκλιση (%) των πληθυσμών της πεταλούδας Carassius gibelio (AMV1, LYS1a, LYS1b, OZE1, TRI1), με βάση τις αλληλουχίες του μιτοχονδριακού γονιδίου β- κυτόχρωμα. Η τοπολογία των γενεαλογικών δένδρων ήταν σχεδόν ταυτόσημη με πολύ υψηλά ποσοστά αποδοχής. Σύμφωνα με τη τοπολογία των φυλογενετικών δένδρων μόνον ο πληθυσμός της λίμνης Λυσιμασία [358]

5 κατανέμεται πολυφυλετικά σχηματίζοντας κλάδους μαζί με τους άλλους τρεις πληθυσμούς (Σχήμα 1). Η γενετική ανάλυση των δεδομένων με τη βοήθεια των λογισμικών πακέτων ανέδειξε την ύπαρξη 2 διαφορετικών πληθυσμών, ένα για τη λίμνη Αμβρακία και έναν για τις λίμνες Τριχωνίδα και Οζερού οι οποίοι αντιπροσωπεύονται από τον απλότυπο AMV1 ο πληθυσμός της Αμβρακίας και από τους απλότυπους OZE1 και TRI1 (που είναι γενετικά πανομοιότυποι) οι πληθυσμοί της Τριχωνίδας και Οζερού. Ο πληθυσμός της λίμνης Λυσιμαχία χαρακτηρίζεται από τη παρουσία 2 διαφορετικών απλότυπων LYS1a και LYS1b οι οποίοι είναι ταυτόσημοι γενετικά με εκείνους που ανιχνεύτηκαν στη λίμνη Αμβρακία και στις λίμνες Τριχωνίδα και Οζερό, αντίστοιχα. Το γεγονός ότι οι απλότυποι LYS1b, TRI1 OZE1, TRI1 είναι ακριβώς οι ίδιοι αυτό μπορεί να εξηγηθεί λόγω της ροής των γονιδίων μεταξύ των αντίστοιχων πληθυσμών επειδή οι λίμνες Λυσιμαχία, Τριχωνίδα και Οζερός ανήκουν στο ευρύτερο οικοσύστημα του Αχελώου ποταμού και υπό ειδικές και ελεγχόμενες συνθήκες είναι δυνατή η επικοινωνία μεταξύ τους, άρα και η ροή-ανταλλαγή γονιδίων μεταξύ αυτών των πληθυσμών (Ferguson et al. 1995). Aντίθετα η παρουσία των ίδιων απλότυπων (AMV1και LYS1a) σε Αμβρακία - Λυσιμαχία καταδεικνύει μια πιθανή εισαγωγή ή ανάμειξη των ιχθυοπληθυσμών κατά το παρελθόν (Economidis et al. 2000). Σχήμα 1: Neighbor-joining δενδρόγραμμα που αποκαλύπτει τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών της πεταλoύδας Carassius gibelio. Οι αριθμοί δείχνουν το βαθμό αξιοπιστίας του δένδρου με βάση τη Νeighbor-joining (επάνω) και Μaximum-pasrimony (κάτω) ανάλυση. Η αλληλουχία του β-κυτόχρωμα του Cyprinus carpio (GenBank: X61010) χρησιμοποιήθηκε σαν outgroup. H σχετικά υψηλή και απροσδόκητη νουκλεοτιδική απόκλιση (3.76%) μεταξύ των πληθυσμών της πεταλούδας όπως παρουσιάζεται στο (Πίνακα 2), απαιτεί μια πιο σύνθετη εξήγηση. Αν δεχθούμε ακόμη και πιο γρήγορη εξέλιξη του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (η εξέλιξη του μιτοχονδριακού γονιδιώματος είναι πράγματι ταχύτερη του πυρηνικού) δεν δικαιολογείται η υψηλή τιμή διότι αντίθετα παρατηρήθηκαν μείωση στις τιμές αυτές σε διάφορα είδη ιχθύων κατά τη παγετώδη περίοδο. Αντίθετα, υψηλότερα [359]

6 «Ψηφιακές και Διαδικτυακές εφαρμογές στην Εκπαίδευση» επίπεδα μεγέθους πληθυσμών παρουσιάζουν μεγαλύτερη γενετική ποικιλότητα, έναντι εκείνων με ιστορικά χαμηλά ή ασταθή μεγέθη (Avise 1994). Χωρίς να αγνοήσουμε την έντονη προσαρμοστικότητα και εξάπλωση της πεταλούδας στα λιμναία οικοσυστήματα, το γεγονός ότι ο ίδιος ακριβώς απλότυπος (LYS1a και AMV1) που ανιχνεύτηκε στα οικοσυστήματα της Αμβρακίας και Λυσιμαχίας μάλλον, πρέπει να είναι αποτέλεσμα εισαγωγής ή τυχαίας μείξης των πληθυσμών και αποτελεί το πιθανότερο σενάριο για τη παρατηρούμενη υψηλή γενετική διαφοροποίηση αν και το είδος της πεταλούδας θεωρείται ενδημικό για την Ελλάδα. H NJ and MP ανάλυση ανέδειξε ένα δενδρόγραμμα (Σχήμα 1) το οποίο έρχεται σε αντίθεση με τη ταξινόμηση η οποία βασίζεται σε μορφο-μεριστικά χαρακτηριστικά (Βιδάλης κα. 2003). Αυτό το εύρημα φανερώνει ότι η παρατηρούμενη ποικιλότητα είναι πράγματι περισσότερο γενετική παρά φαινοτυπική και συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες για διάφορα είδη (Petterson et al. 1993). Συμπερασματικά, η ψηφιακή ανάλυση των δεδομένων μας ανέδειξε την ύπαρξη-αναγνώριση δύο διαφορετικών μοναδικών πληθυσμών-οικότυπων, της Αμβρακίας και εκείνο της Τριχωνίδας - Οζερού οι οποίοι αποτελούν δύο διαφορετικά γενετικά αποθέματα (genetic tag) και απαιτούν ειδική διαχείριση για τη διατήρηση της βιοποικιλότητας. Αντίθετα, ο πληθυσμός της Λυσιμαχίας που συνιστά ένα μείγμα των δύο οικότυπων αντανακλά ανθρωπογενείς δραστηριότητες και επεμβάσεις που έλαβαν χώρα κατά το παρελθόν. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Eυχαριστούμε το Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων και το ΤΕΙ Μεσολογγίου για την υλικοτεχνική υποδομή που μας διέθεσαν για την ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Avise J.C. (1994), Molecular Markers, Natural History and Evolution, Chapman and Hall, New York. 2. Βιδάλης Κ., Τσιπάς Γ., Χωρέμη Κ., Μπούρτζης Κ. (2003), Ομοιογένεια των πληθυσμών του ψαριού Carassius auratus gibelio (πεταλούδα ή χρυσόψαρο) στις λίμνες της Αιτωλοακαρνανίας (Δ. Ελλάδα), Πρακτικά 11 ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Ιχθυολόγων, σελ , Πρέβεζα. 3. Birky J., Maruyama Τ. & Fuerst P. (1983), An approach to population and evolutionary genetic theory for genes in mitochondria and chloroplasts and some results, Genetics, 103, Cronin M., Spearman W., Wilmot R., Patton J. & Bickham J. (1993), Mitochondrial DNA variation in chinook (Oncorhynchus tshawytscha) and chum (O. Keta) detected by restriction enzyme analysis of polymerase chaιn reaction (PCR) products, Canadian J. of Fisheries and Aquatic Sciences, 50, [360]

7 5. Economidis P.S., Dimitriou E., Pagoni R., Michaloudi E., Natsis L. (2000), Introduced and trans-located fish species in the inlandwaters of Greece, Fish Management Ecology, 7, Ferguson A., (1980), Biochemical systematics and evolution, Blackie 194 pp, Glasgow. 7. Ferguson A., Taggart J.B., Prodohl P.A., McMeel O., Thompson C., Stone C., McGinnity P., Hynes R.A. (1995), The application of molecular markers to the study and conservation of fish population, with special reference to Salmo, J. Fish Biology, 47(suppl A), Kirpichnikov V.S. (1981), Genetic bases of fish selection (Translated by G.G. Gause), pp, Springer, Berlin. 9. Kumar S., Tamur K., Nei M. (2004), MEGA 3.1: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment briefings, Bioinformatics 5, Patterson C., Williams D.M., Humphries C.J. (1993), Congruence between molecular and morpho- logical phylogenies. Annuals Review Ecology Systematics, 24, Saitou N., Nei M. (1987), The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees, Molecular Biology Evolution, 4, Swofford D.L. (1998,) PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods) Version 4.0. Sinauer, Sunderland. 13. Taggart J.B, Hynes R.A., Prodohl P.A, Ferguson A. (1992), A simplified protocol for routine total DNA isolation from salmonid fishes, J. Fish Biology, 40, Tautz T., (1993), Notes on the definition and nomenclature of randomly repetive DNA sequences. In : Pena S., R. Chakraborty, J.T. Epplen & A.J. freys, editors DNA Fingerprinting: State of the Science, pp, Berlin - Birkhauser. 15. Triantaphyllidis A., Abatsopoulos T.J. & Economidis P.S. (1999), Genetic differentiation and phylogenetic relationships among Greek Silurus gl. and Silurus ar. (Pisces Siluridae) populations, assessed by RFLP analysis of mitochondrial DNA segments, Heredity, 82, Tsipas G., Tsiamis G., Vidalis K., Bourtzis K. (2009), Genetic differentiation among Greek lake populations of Carassius gibelio and Cyprinus carpio carpio, Genetica, 136, Zhou J.F., Wu Q.J., Ye Y.Z., Tong J.G. (2003), Genetic divergence between Cyprinus carpio carpio and Cyprinus carpio haematopterus as assessed by mitochondrial DNA analysis with emphasis on origin of European domestic carp, Genetica, 119, [361]