Προσδιορισμός της κατάστασης του γονιδίου Ε2 του Human Papillomavirus (HPV) -16 σε κλινικά δείγματα

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Προσδιορισμός της κατάστασης του γονιδίου Ε2 του Human Papillomavirus (HPV) -16 σε κλινικά δείγματα ΓΚΟΡΤΣΙΛΑΣ ΠΑΣΧΑΛΗΣ Επιβλέπων: Αν. Καθηγητής Παναγιώτης Μαρκουλάτος Λάρισα 2008

2 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ & ΠΛΗΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Ειαικη Συλλογή «Γκρίζα Βιβλιογραφία» Αριθ. Εισ.: 6591/1 Ημερ. Εισ.: Δωρεά: Π.Θ. Ταξιθετικός Κωδικός: ΠΤ - ΒΒ 2008 ΓΚΟ

3 Στους γονείς μου, Ιωάννη και Αναστασία.

4 Στοιχεία Πτυχιακής Εργασίας Τριμελής Επιτροπή: Αν. καθηγητής Π. Μαρκουλάτος Καθηγητής Ζ. Μαμούρης Λέκτορας Δ. Μόσιαλος Ημερομηνία Κατάθεσης Πτυχιακής εργασίας: [3]

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το πειραματικό μέρος της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Μικροβιολογίας - Ιολογίας του Τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας κατά το χρονικό διάστημα Σεπτέμβριος Απρίλιος 2008 υπό την επίβλεψη του Αν. καθηγητή Παναγιώτη Μαρκουλάτου. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους καθηγητές μου κύριο Ζήση Μαμούρη και Δημήτριο Μόσιαλο που με ευχαρίστηση δέχτηκαν να συμμετάσχουν στη τριμελή επιτροπή για τη παρούσα μελέτη, αλλά και κυρίως γιατί, μαζί με όλους τους καθηγητές του τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας λειτούργησαν για μένα σαν υπόδειγμα πανεπιστημιακών δασκάλων με τις γνώσεις και το ήθος τους. Αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες μου και την βαθύτερη εκτίμησή μου στον καθηγητή μου κ. Παναγιώτη Μαρκουλάτο τόσο για την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου για την ανάθεση τις συγκεκριμένης πτυχιακής εργασίας όσο και για τις γνώσεις που μου παρείχε καθ όλη την διάρκεια των φοιτητικών μου σπουδών. Οι γνώσεις του και οι συμβουλές του πάνω στο αντικείμενο ήταν πάρα πολύ σημαντικές για μένα και θα με ακολουθούν συνέχεια στην περεταίρω σταδιοδρομία μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω μέσα από την ψυχή μου τους υποψήφιους διδάκτορες Κυριακοπούλου Ζαχαρούλα, Δεδεψίδη Ευάγγελο και Πλιάκα Βίκυ για την βοήθεια τους και τις πολύτιμες συμβουλές τους τόσο στον εργαστηριακό τομέα όσο και στο να μπορέσουν να ξεπεραστούν τα όποια εργαστηριακά προβλήματα που προέκυψαν. Το ιδιαίτερα φιλικό περιβάλλον που αναπτύχθηκε μεταξύ μας ήταν πάρα πολύ σημαντικό για να μπορέσω να ολοκληρώσω την παρούσα εργασία με ευχαρίστηση. Το ήθος και ο χαρακτήρας που ανέδειξαν μέσα στο εργαστήριο ήταν μεγάλο «σχολείο» για μένα. Τους εκτιμώ και τους σέβομαι βαθύτατα γι αυτό. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το συνάδελφο Μάριο Ευδόκιμου για τη συμπαράσταση και την ευχάριστη συνεργασία μέσα στο εργαστήριο. Ιδιαίτερα όμως θα ήθελα να ευχαριστήσω μέσα από την καρδιά μου τον φίλο και συνάδελφο Δημήτρη Τσακογιάννη με τον οποίο πραγματοποιήσαμε το μεγαλύτερο μέρος των πειραμάτων και χωρίς την βοήθειά ήταν πολύτιμη για τη πραγματοποίηση της παρούσας εργασίας, τόσο σε πρακτικό όσο και σε θεωρητικό επίπεδο. Τον εκτιμώ ιδιαίτερα τόσο για την αρμονική [4]

6 συνεργασία όσο και για την συμπαράσταση, υπομονή, επιμονή και εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω του γονείς μου, Ιωάννη και Αναστασία, για την συμπαράστασή τους καθώς και για τις θυσίες και τον αγώνα που έκαναν τόσα χρόνια προσφέροντάς μου όλα τα απαραίτητα αγαθά, υλικά και ψυχικά, για τη πραγματοποίηση των σπουδών μου. Η συγκεκριμένη εργασία είναι αφιερωμένη, εξολοκλήρου, σε αυτούς. [5]

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Βιολογία των Ανθρώπινων Papilloma ιών (HPV) Γενικά χαρακτηριστικά Ταξινόμηση των Papilloma ιών Δομή των Ανθρώπινων papilloma ιών (HPV) Δομή του καψιδίου Γενωμική οργάνωση Ο κύκλος ζωής των HPV Είσοδος του ιού στο κύτταρο Αντιγραφή του ιικού γενώματος Μεταγραφή του ιικού γενώματος Σύνθεση των ιικών σωματιδίων και απελευθέρωση του ιού Ιστολογικές αλλοιώσεις Εργαστηριακή διάγνωση Τεστ Παπανικολάου (test Pap) Hybrid Capture II test Μοριακές τεχνικές που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κλινικά Δείγματα Απομόνωση DNA-RNA Εκκινητικά μόρια PCR Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Ενίσχυση του γονιδίου της β-γλοβουλίνης Ενίσχυση του Ε2 γονιδίου Ενίσχυση των μεταγράφων των ιικών ογκογονιδίων - ΑΡΟΤ assay Αντίστροφη μεταγραφή (RT) PCR Nested PCR Εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων της PCR (Sequencing) Μελέτη των νουκλοεοτιδικών αλληλουχιών - Προγράμματα βιοπληροφορικής...54 [6]

8 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αποτελέσματα PCR PCR με τα εκκινητικά μόρια της β-γλοβουλίνης PCR με τα εκκινητικά μόρια της δημοσίευσης PCR με τα εκκινητικά μόρια που σχεδιάστηκαν στην παρούσα εργασία Αποτελέσματα από ανάλυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΟΓΡΑΦΙΑ...67 [7]

9 Περίληψη Οι ιοί των ανθρώπινων θηλωμάτων (human papillomaviruses) είναι μικροί ιοί χωρίς εξωτερικό περίβλημα. Το γονιδίωμά τους αποτελείται από ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA μήκους 8000 βάσεων περίπου. Έχουν περιγράφει πάνω από 100 διαφορετικοί γενότυποι HPV, οι οποίοι μολύνουν τους δερματικούς και βλεννογόνους επιθηλιακούς ιστούς του γεννητικού συστήματος και των άκρων. Μια ομάδα HPV αποτελούν την κύρια αιτία για το καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, μιας και στο 99% των όγκων έχει ανιχνευθεί το DNA αυτών. Οι τύποι του ιού οι οποίοι μολύνουν τα επιθηλιακά κύτταρα του γεννητικού συστήματος χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: υψηλού κινδύνου και χαμηλού κινδύνου. Οι τύποι υψηλού κινδύνου εμπλέκονται στην ανάπτυξη καρκίνου του γεννητικού συστήματος συμπεριλαμβανομένου και του τραχήλου της μήτρας, ενώ οι μολύνσεις από HPV χαμηλού κινδύνου προκαλούν μόνο καλοήθη γεννητικά θηλώματα. Οι κυριότεροι τύποι υψηλού κινδύνου είναι οι HPV-16, -18, -31, -33 και -45, ενώ οι κυριότεροι τύποι χαμηλού κινδύνου είναι οι HPV-6 και HPV-11. Οι HPV οι οποίοι προσβάλλουν το γεννητικό σύστημα είναι σεξουαλικώς μεταδιδόμενοι και πιστεύεται ότι περίπου τα 2/3 των ατόμων που έχουν σεξουαλική επαφή με ένα μολυσμένο άτομο μολύνονται και αυτά. Ωστόσο, η πλειοψηφία των μολύνσεων δεν παρουσιάζουν κλινικά συμπτώματα. Η μόλυνση από HPV υψηλού κινδύνου δεν περιορίζεται μόνο στο γεννητικό σύστημα, μιας και περίπου το 20% των καρκίνων του στοματοφάρυγγα περιέχουν DNA από αυτούς τους τύπους HPV. Βάση επιδημιολογικών μελετών οι πιο επικρατείς τύποι HPV που προκαλούν τραχηλικές αλλοιώσεις και κατ επέκταση καρκίνο είναι οι HPV-16 και HPV-18 σε ποσοστό 50% (Bosch FX. et al 1995) και 10-25% αντίστοιχα ακολουθώντας οι HPV-45 σε ποσοστό 8%, και ο HPV-31 σε ποσοστό 5%. Παρά το γεγονός ότι η εφαρμογή των προληπτικών κυτταρολογικών εξετάσεων (test pap) ελάττωσε την εμφάνιση της νόσου στις Δυτικές χώρες, τα ποσοστά παραμένουν αρκετά υψηλά. Η παρούσα εργασία ασχολείται με τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων τύπου 16 (HPV-16) και πιο συγκεκριμένα με την ανάλυση της κατάστασης του γονιδίου Ε2, με ειδικά ζεύγη εκκινητικών μορίων, σε κλινικά δείγματα τα οποία είναι μολυσμένα με HPV- 16. Πιο συγκεκριμένα, το γονιδίωμά του HPV-16 μπορεί να βρίσκεται σε δυο μορφές, είτε επισωμικό, είτε ενσωματωμένο στο γονιδίωμά του κυττάρου-ξενιστή. Η ενσωμάτωση αυτή γίνεται συνήθως στην περιοχή του Ε2 γονιδίου, με θραύση σε κάποιο σημείο του. [8]

10 Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την φυσιολογική παραγωγή ή όχι της πρωτεΐνης Ε2. Η Ε2 πρωτεΐνη παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταλλαγή των φυσιολογικών κερατινοκυττάρων σε καρκινικά, κυρίως ως ρυθμιστής της μεταγραφής των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7 των HPV υψηλού κινδύνου. Επίσης πραγματοποιήθηκε νουκλεοτιδική και φυλογενετική μελέτη για το συγκεκριμένο γονίδιο των κλινικών δειγμάτων. Η μελέτη της κατάστασης του Ε2 γονιδίου είναι πολύ σημαντική γιατί μπορεί να οδηγήσει στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης της Ε2 πρωτεΐνης και κυρίως πως εμπλέκεται στην μεταλλαγή των κυττάρων. [9]

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Η Βιολογία των Ανθρώπινων Papilloma ιών (HPV) Γενικά χαρακτηριστικά Οι Papilloma ιοί (από την λατινική λέξη papilla: θηλή ή φλύκταινα και την ελληνική κατάληξη oma: όγκος) συγκροτούν την μεγάλη οικογένεια των Papillomaviridae. Είναι δίκλωνοι κυκλικοί DNA ιοί μεγέθους 7900 bp χωρίς εξωτερικό περίβλημα. Προσβάλουν την βασική στοιβάδα του επιθηλίου και σχετίζονται με την ανάπτυξη ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων. Είναι υπεύθυνοι για την ανάπτυξη μιας σειράς βλαβών (εικόνα 1.1, πίνακας 1.1), οι οποίες εκτείνονται από τα κοινά θηλώματα μέχρι τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και τον καρκίνο του πέους (zur Hausen, 1996). Butchers' wart Εικόνα 1.1: Γενεαλογικό δέντρο των Papilloma ιών (PVs) στο οποίο φαίνονται και οι βλάβες που προκαλούν. Οι υψηλού κινδύνου (High risk) HPVs είναι κυρίως υπεύθυνοι για την πρόκληση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. [10]

12 Συμπτώματα Στέλεχος Θηλώματα του πέλματος (μυρμηγκιές) HPV-1,2, 4, 63 Επίπεδα Θηλώματα HPV-3,10, 27, 28, 38, 41, 49 Μωσαϊκά θηλώματα HPV-2,27, 57 Epidermodisplasia Verrucifornis HPV-2, 3,10,12,15,19, 36, 46, 47, 50 Επιδερμικές αλλοιώσεις (Μη θηλωματικές) HPV-37,38 Αναπνευστική παπιλσομάτωση HPV- 6,11 Καρκίνος των πνευμόνων HPV- 6,11,16,18 Κονδυλώματα στον λάρυγγα Καρκίνος στον λάρυγγα Κονδυλώματα στην κοιλότητα της γνάθου HPV-6,11,30 HPV-16,18 HPV-16,18 Στοματική επιθηλιακή υπερπλασία HPV-13, 32 Καρκίνος στο στόμα Στοματική λευκοπλακία Καρκίνος στον οισοφάγο HPV-16,18 HPV-16,18 HPV-16,18 Γιγάντια κονδυλώματα (Buschke-Lowensteii HPV-6,11 tumor) Κοινά θηλώματα HPV-1, 2, 4, 26, 27, 29, 41, 57, 65 Πίνακας 1.1: Διάφοροι τύποι HPV και τα συμπτώματα που προκαλούν. Ανακαλύφθηκαν πρώτη φορά στις αρχές του 20~ αιώνα, όταν αποδείχθηκε ότι τα δερματικά θηλώματα μπορούσαν να μεταδοθούν μεταξύ ατόμων με την βοήθεια ενός διηθητού παράγοντα. Το 1935 ο Francis Peyton Rous, ο οποίος μόλις είχε αποδείξει την πρόκληση σαρκώματος στα κοτόπουλα από ιό, συσχέτισε τους papilloma ιούς με τον καρκίνο του δέρματος. Παρατήρησε ότι μολυσμένα κουνέλια του γένους sylvilagus [11]

13 εμφάνιζαν θηλώματα, τα οποία μετά από σύντομο χρονικό διάστημα μετατρέπονταν σε κακοήθη όγκο. Αυτή ήταν η πρώτη απόδειξη που ενοχοποιούσε τους ιούς για την πρόκληση καρκίνου. Από τότε διάφοροι τύποι της ομάδας αυτής των ιών εντοπίστηκαν και συνδέθηκαν με την δημιουργία όγκων σε πολλά είδη μεταξύ των οποίων και ο άνθρωπος. Οι ιοί των θηλωμάτων έγιναν ευρέως γνωστοί στις αρχές της δεκαετίας του 80 καθώς ανακαλύφθηκε, ότι ορισμένα στελέχη του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV - Human Papillomaviruses) συσχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, μία από τις πλέον διαδεδομένες μορφές καρκίνου παγκοσμίως. Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας αποτελεί την δεύτερη πιο συχνή μορφή καρκίνου μεταξύ των γυναικών παγκοσμίως και τον πέμπτο mo θανατηφόρο καρκίνο στις γυναίκες (Parkin D. Μ. et al., 2000, Pisani Ρ. et al., 2002). Περίπου καινούργιες περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου αναφέρονται ετησίως, με κυριότερη ηλικία ανάπτυξης κακοήθειας τα 52 χρόνια (Boring C. C. et al., 1994, Pisani P. et al., 2002). Οι περισσότερες περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έχουν βρεθεί στις Ηνωμένες Πολιτείες και στην Δυτική Ευρώπη. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, ο αριθμός των περιπτώσεων αυτού του τύπου καρκίνου ελαττώθηκε πάνω από 80% τα τελευταία χρόνια λόγω της εφαρμογής του τέστ Παπανικολάου (Pap test) ως διαγνωστική μέθοδο (Singer A. et al., 1995). Παρόλα αυτά, ετησίως περίπου 10,000 γυναίκες διαγιγνώσκονται με καρκίνο του τραχήλου ενώ 5,000 από αυτές πεθαίνουν (Parkin D. Μ. et al., 2000). Περίπου το 99% των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας είναι θετικές σε HPV μόλυνση και βάση επιδημιολογικών μελετών οι πιο επικρατείς τύποι HPV που προκαλούν τραχηλικές αλλοιώσεις και κατ επέκταση καρκίνο είναι οι ιοί HPV-16 (με τον οποίο ασχολείται και η παρούσα μελέτη) και HPV-18 σε ποσοστό 50% (Bosch FX. et al., 1995) και 10-25% αντίστοιχα και ακολουθούν οι HPV-45 σε ποσοστό 8%, και ο HPV-31 σε ποσοστό 5% (εικόνα 1.2). 50% HPV 16 lahpv 18 ο HPV 45 HPV 31 I Other Εικόνα 1.2: Ποσοστά των τύπων HPV που ανευρίσκονται στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. [12]

14 Οι ιοί των ανθρώπινων θηλωμάτων μεταδίδονται μέσω δερματικής επαφής. Τα μολυσματικά ιικά σωματίδια μολύνουν τα κύτταρα της βασικής στοιβάδας της επιδερμίδας, τα οποία έχουν εκτεθεί στον ιό μέσω μικροτραυματισμών της επιθηλιακής στοιβάδας. Υπάρχουν τρεις τρόποι μετάδοσης του ιού: a) Η σεξουαλική επαφή. Οι HPV προσβάλουν με μεγαλύτερη συχνότητα γυναίκες που εναλλάσσουν πολλαπλούς συντρόφους. b) Μετάδοση από την μητέρα στο νεογέννητο. c) Χωρίς σεξουαλική επαφή ( επαφή με ουρογενετικά εκκρίματα). (Fraiser, 1994) Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί και έχουν πλήρως αλληλουχηθεί περισσότεροι από 100 διαφορετικοί τύποι HPV (Zur Flausen, 2000). Μια ομάδα 30 στελεχών HPV μεταδίδεται μέσω σεξουαλικής επαφής και προσβάλουν το ουρογεννητικό σύστημα (Gillison, 2001). Οι FIPV βάσει του τροπισμού τους μπορούν να διαχωριστούν σε δερματικούς και στους ιούς εκείνους που προσβάλλουν το επιθήλιο του βλεννογόνου. Οι τελευταίοι ανάλογα με την έκταση και την σοβαρότητα της βλάβης μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τρεις χαρακτηριστικές ομάδες (πίνακας 1.2). Στην ομάδα υψηλής επικινδυνότητας (High risk), τα μέλη της οποίας είναι συνδεδεμένα με την πρόκληση επεκτατικού καρκίνου συνήθως του ουρογενετικού συστήματος (εικόναΐ.3). Στην ομάδα ενδιάμεσης επικινδυνότητας (Middle risk), τα μέλη της οποίας μπορεί να ανευρίσκονται σε δυσπλασίες και στην ομάδα χαμηλής επικινδυνότητας (Low risk), τα μέλη της οποίας, εντοπίζονται σπανίως σε καρκίνο άλλα είναι στενά συνδεδεμένα με την πρόκληση θηλωμάτων (Munoz Ν. et al., 2003). [13]

15 Τράχηλος όπως φαίνεται στο μη τροσκ όποιο Τράχηλος Εικόνα 1.3: Καρκινική αλλοίωση του τραχήλου της μήτρας. Καρκινικός ιστός Κολπικό τοίχωμα Ομάδα επικινδυνότπτας Τύπος HPV Υψηλού κινδύνου (High risk) HPV-,16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,55,56,58,59,68,73,82,83 Ενδιάμεσου κινδύνου (middle risk) HPV-26,53,66 Χαμηλού κινδύνου (Low risk) HPV-6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81 Πίνακας 1.2. Αναφορά στις ομάδες επικινδυνότητας των αντίστοιχων HPV τύπων. Εκτός από τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας οι HPV επίσης σχετίζονται με την εμφάνιση καρκίνου του πέους, της μήτρας και του πρωκτού. Ακόμα έχει παρατηρηθεί ότι καρκίνος του λάρυγγα, του οισοφάγου και του πνεύμονα ιστολογικά μοιάζει με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας γεγονός που εμπλέκει τους papilloma ιούς στους προαναφερθέντες τύπους καρκίνου Ταξινόμηση των Papilloma ιών Οι ιοί των θηλωμάτων (papillomaviruses) αρχικά είχαν ταξινομηθεί μαζί με τους polyoma ιούς και τον ιό SV40 σε μια ενιαία μεγάλη οικογένεια, την οικογένεια των Papovaviridae. Η ταξινόμηση αυτή βασίστηκε σε ομοιότητες στην δομή των χωρίς [14]

16 περίβλημα καψιδίων των ιών αυτών καθώς και στο γεγονός ότι διαθέτουν παρόμοιο δίκλωνο κυκλικό μορίο DNA. Αργότερα, όμως, αναγνωρίστηκε ότι οι δυο αυτές ομάδες των ιών έχουν διαφορετικά μεγέθη γονιδιώματος, εντελώς διαφορετική γενωμική οργάνωση και καθόλου σημαντικές ομοιότητες στις νουκλεοτιδικές ή αμινοξικές αλληλουχίες τους. Τα ευρήματα αυτά οδήγησαν στο να ταξινομηθούν οι παραπάνω ιοί, από την Διεθνή Επιτροπή Ταξινόμησης των Ιών (ICTV), σε δυο διαφορετικές διακριτές οικογένειες. Την οικογένεια των Papillomaviridae, η οποία περιλαμβάνει όλους τους ιούς των θηλωμάτων (papillomaviruses) και την οικογένεια των Polyomaviridae που περιλαμβάνει τους polyomaviruses (de Villiers Ε.Μ et al., 2004, The Papillomaviruses, 2007). Or papilloma ιοί δεν κατηγοριοποιούνται σε ορότυπους. Η ταξινόμηση των ιικών τύπων γίνεται βάση της προέλευσης του στελέχους και του βαθμού συγγένειας των ιικών γενωμάτων (Shih-Yen Chan et al., 1995). Πιο συγκεκριμένα, οι papilloma ιοί ταξινομούνται βάση των διαφορών που υπάρχουν στο γονίδιο της καψιδιακής πρωτεΐνης LI. To L1 ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (LI ORF) είναι το πιο συντηρημένο γονίδιο στους ιούς των θηλωμάτων και γι αυτό χρησιμοποιήθηκε και χρησιμοποιείται ακόμα για την ταξινόμηση νέων τύπων των ιών αυτών. Οι papilloma ιοί ομαδοποιούνται σε διαφορετικά γένη, τα ονόματα των οποίων προέρχονται από ένα γράμμα της ελληνικής αλφάβητου. Έτσι έχουμε τα γένη Alpha, Beta, Gamma, Mu, Nu- papillomavirus. Κάθε γένος διαχωρίζεται περαιτέρω σε τύπους, υπότυπους και διάφορες παραλλαγές (variants), βάση της ομοιότητας της αλληλουχίας του γονιδίου L1. Κάθε καινούργιος papilloma ιός που απομονώνεται αποτελεί διαφορετικό τύπο, αν η αλληλουχία του γονιδίου L1 διαφέρει από το γονίδιο L1 του κοντινότερου γνωστού τύπου, περισσότερο από 10%. Διαφορές μεταξύ 2% και 10% υποδηλώνουν έναν υπότυπο, ενώ διαφορές λιγότερο από 2% υποδηλώνουν μια παραλλαγή (variant) (de Villiers Ε.Μ et al., 2004). Τα γένη Alpha, Beta, Gamma, Mu και Nu περιέχουν στελέχη των papilloma ιών που έχουν απομονωθεί από τον άνθρωπο, ενώ τα υπόλοιπα γένη (Pi, Xi, Lamda, κ.α) όπως παρουσιάζεται και στη εικόνα 1.4 περιέχουν στελέχη papilloma ιών που έχουν εντοπιστεί σε μια μεγάλη ποικιλία πτηνών και άλλων θηλαστικών (Charles Ε. et al., 2007, Antonson A. et al., 2006). [15]

17 Εικόνα 1.4: Φυλογενετικό δέντρο 118 papilloma ιών που βασίζεται στην αλληλουχία του καψιδιακού γονιδίου L1. Στο δέντρο αυτό παρουσιάζονται όλα τα γένη και οι αντιπροσωπευτικοί τύποι των papilloma ιών (de Villiers Ε. Μ. et al., 2004) Alpha-papillomavirus Το γένος των Alpha-papillomaviruses είναι το μεγαλύτερο αριθμιτικά γένος από τα υπόλοιπα και περιλαμβάνει τους papilloma ιούς εκείνους που προσβάλουν το επιθήλιο του βλεννογόνου. Το γένος των Alpha-papillomaviruses επίσης συμπεριλαμβάνει και τους ιούς εκείνους που προσβάλουν το επιθήλιο του δέρματος όπως ο HPV-2, ο οποίος προκαλεί κοινά θηλώματα και σπάνια εμπλέκεται στην πρόκληση καρκίνου. Περισσότεροι από 30 διαφορετικοί τύποι είναι γνωστό ότι επιδρούν στο επιθήλιο του τραχήλου και μπορεί να προκαλέσουν καρκίνο. Αυτοί οι τύποι HPV όπως έχει ήδη αναφερθεί ταξινομούνται ως υψηλής επικινδυνότητας (High risk). Ο HPV-16 και ο HPV- 18 είναι οι κύριοι παράγοντες για την πρόκληση τραχηλικών αλλοιώσεων οι οποίες μπορούν να εξελιχθούν σε καρκίνο του τραχήλου. Έχει παρατηρηθεί ότι στο 90% των περιπτώσεων του καρκίνου του τραχήλου ανευρίσκεται DNA ιών HPV και περίπου σε ποσοστό της τάξης του 50% αυτών των περιπτώσεων ανευρίσκεται το DNA του ιού HPV- 16 (Bosch et al., 2001). Οι υπόλοιποι τύποι αυτού του γένους των ιών ταξινομούνται, ως [16]

18 ενδιάμεσου κινδύνου (Middle risk) και χαμηλού κινδύνου (Low risk), βάση της συχνότητας με την οποία εντοπίζονται σε καρκινικές αλλοιώσεις. Οι ιοί χαμηλού κινδύνου εμπλέκονται στην πρόκληση καρκίνου πολύ σπάνια, αλλά ερευνητικά και διαγνωστικά παρουσιάζουν ενδιαφέρον καθώς προκαλούν θηλώματα του ουρογεννητικού σύστηματος. (Doorbar J. et al., 2006) Beta-papillomavirus Οι τύποι HPV που προσβάλουν το δέρμα διαχωρίζονται σε τέσσερα διαφορετικά γένη (Beta, Gamma, Mu και Nu-papillomaviruses). Οι ιοί αυτοί συχνά εντοπίζονται σε δείγματα υγιούς δέρματος, αποδεικνύοντας ότι προκαλούν ασυμπωματικές μολύνσεις. Το γένος των Beta papilloma ιών διαιρείται σε τέσσερα διαφορετικά στελέχη. Τα μέλη της οικογένειας αυτής προσβάλουν το επιθήλιο του δέρματος χωρίς να προκαλούν αλλοιώσεις. Παρόλα αυτά έχει παρατηρηθεί, ότι η μόλυνση από τα στελέχη του συγκεκριμένου γένους σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και ασθενείς που πάσχουν από την κληρονομική ασθένεια EV (epidermodysplasia verruciformis), μπορούν να προκαλέσουν μη μελανωματικό καρκίνο του δέρματος (Pfister, 2003). Κυρίως τα στελέχη HPV-5 και HPV-8 εμπλέκονται στο 90% αυτών των όγκων ( Kremsdorf D. et al., 1983) Gamma, Mu, Nu Papillomavirus Τα υπόλοιπα στελέχη HPV προέρχονται από τρία άλλα γένη (Gamma, Mu and Nu) και προκαλούν δερματικά θηλώματα, τα οποία δεν εξελίσσονται σε καρκίνο. Στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 1.3) περιγράφονται συνοπτικά τα στελέχη των γενών Beta, Gamma, Mu, Nu paillomavirus (Doorbar J. et al., 2006). [17]

19 Γένος Στέλεχος Beta papillomavirus HPV- 2, 5, 8,107 Gamma Papillomavirus HPV- 101,103 Mu Papillomavirus HPV- 1, 63 Nu Papillomavirus HPV- 41 Πίνακας 1.3: Σύντομη αναφορά στα γένη και τα στελέχη των HPV. [18]

20 1.2 Δομή των Ανθρώπινων papilloma ιών (HPV) Δομή του καψιδίου Οι papilloma ιοί έχουν σφαιρικό σχήμα, είναι DNA ιοί χωρίς εξωτερικό περίβλημα και έχουν διάμετρο nm (Εικόνα 2.1). Η εξωτερική τους επιφάνεια αποτελείται από το καψίδιο, το οποίο συγκροτείται από 72 πενταμερή (καψομερίδια) της καψιδιακής πρωτεΐνης L1 (Εικόνα 2.2) (The Papillomaviruses, 2007). Η L1 είναι ο παράγοντας, ο οποίος συμβάλει στην αναγνώριση των ιικών σωματίων από το ανοσολογικό σύστημα του προσβεβλημένου ατόμου (Luxton and Sepherd 2001, Yang R. et al., 2004). Όλα τα πενταμερή μαζί σχηματίζουν ένα εικοσαεδρικό καψίδιο με triangulation number Τ=7. Η δεύτερη καψιδιακή πρωτεΐνη, η πρωτεΐνη L2, η οποία παράγεται σε μικρότερες ποσότητες από την L1, τοποθετείται εσωτερικά του καψιδίου που σχηματίζεται από τα L1 πενταμερή. Πιστεύεται ότι αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες L1 μέσω μιας υδρόφοβης περιοχής που βρίσκεται στο C-τελικό της άκρο. Κύριος ρόλος της L2 είναι το πακετάρισμα του ιικού γενώματος στα νεοσυντεθέμενα ιικά σωμάτια σε συνεργασία με την πρωτεΐνη Ε2 (Buck C.B. et al., 2004). Εικόνα 2.1: Ιός των θηλωμάτων των βοοειδών (Bovine Papillomavirus, BPV). Ηλεκτρονική μικρογραφία. (The Papillomaviruses, 2007). Εικόνα 2.2: Τρισδιάστατη απεικόνιση του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (Human Papillomavirus, HPV). Σ αυτήν την εικόνα φαίνονται τα πενταμερή της καψιδιακής πρωτεΐνης LI (Physians Research Network). [19]

21 Γενωμική οργάνωση Η οργάνωση του γενώματος είναι αρκετά συντηρημένη ανάμεσα στους ιούς των ανθρώπινων θηλωμάτων και στους ιούς των θηλωμάτων των ζώων (εικόνα 2.3). Β URR mi Ori Ε8 El Ε4 E5b Ε2 JE5a : U2 Ll Εικόνα 2.3: Γενωιιικΰ οονάνωση των PVs. Καθένας έχει ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA μήκους περίπου με βάσεων (εικόνα 2.4) το οποίο αντιγράφεται ως ένα εξωχρωμοσωμικό πλασμίδιο στον πυρήνα των μολυσμένων κερατινοκυττάρων του ξενιστή (The Papillomavirus, 2007). Εικόνα 2.4: Δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA του HPV-16. Στα ιικά σωματίδια, το DNA βρίσκεται συνδεδεμένο με κυτταρικές ιστόνες σχηματίζοντας μια μορφή που μοιάζει με χρωματίνη (Howley P.M. et al., 1996). To γένωμα περιλαμβάνει 8 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs), τα οποία εκφράζονται από [20]

22 πολυκιστρονικά mrnas που προέρχονται από την ίδια αλυσίδα DNA, και χωρίζεται σε τρεις διακριτές περιοχές, βάση των λειτουργικών και δομικών δραστηριοτήτων. Έτσι έχουμε την πρώιμη περιοχή (E=Early region), την όψιμη περιοχή (L=Late region) και την ρυθμιστική περιοχή LCR. Η πρώιμη περιοχή κωδικοποιεί για τις πρώιμες ιικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες Ε1, Ε2, Ε4, Ε5, Ε6 και Ε7 που επηρεάζουν την αντιγραφή, μεταγραφή και μετάφραση του DNA των μολυσμένων κυττάρων (Danos Ο. et al., 1982). Η όψιμη περιοχή κωδικοποιεί για τις όψιμες δομικές L1 και L2 πρωτεΐνες, που σχηματίζουν το ιικό καψίδιο. Τόσο η περιοχή Ε όσο και η περιοχή L ακολουθούνται από μια θέση πολυαδενυλίωσης (polya) (The Papillomaviruses, 2007). Η έκφραση του γενώματος των HPV τύπων υψηλού κίνδυνου (high-risk) ρυθμίζεται από δύο βασικούς υποκινητές, ο ένας από τους οποίους βρίσκεται πάνω από το Ε6 ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης και είναι υπεύθυνος για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων. Για παράδειγμα, στους HPV-16 και -31 ο υποκινητής αυτός ονομάζεται ρ97, ενώ στον HPV-18 ονομάζεται ρ105. Ο υποκινητής που είναι υπεύθυνος για την έκφραση των όψιμων γονιδίων, στον HPV-31 ονομάζεται ρ742 (Hummel Ν. et al., 1992) και στον HPV-16 ρ670 (Grassmann Κ. et al., 1996). Τέλος, η ρυθμιστική περιοχή LCR, η οποία ονομάζεται και URR (upstream regulatory region), έχει μέγεθος 850 bp και δεν περιέχει στην αλληλουχία της ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs). Η περιοχή αυτή εντοπίζεται μεταξύ του τέλους του γονιδίου L1 και στην αρχή του γονιδίου Ε6 (Demeret et al., 1995, Tan S.H. et al., 2002). H LCR περιέχει πληθώρα ρυθμιστικών στοιχείων, όπως θέσεις σύνδεσης μεταγραφικών παραγόντων, υποκινητές, καθώς και την θέση έναρξης της αντιγραφής του γονιδιώματος των HP Vs Η ιϊκή πρωτεΐνη Ε1 Η πρωτεΐνη Ε1 (εικόνα 2.5) είναι μια πολυλειτουργική πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη με χαμηλό επίπεδο έκφρασης. Έχει μέγεθος περίπου KDa και η παρουσία της είναι απαραίτητη για την αντιγραφή του ιικού γενώματος. (Ustav and Stenlund, 1991). Παρουσιάζει μια εκτεταμένη αμινοξική και λειτουργική ομολογία με το μεγάλο Τ- αντιγόνο του SV-40 και του polyoma ιού. Η πρωτεΐνη αυτή έχει την δυνατότητα να προσδένεται σε ειδικές περιοχές του DNA, έχει δραστικότητα ελικάσης, ΑΤΡάσης και [21]

23 την δυνατότητα να σχηματίζει σύμπλοκα με την Ε2 πρωτεΐνη και την μεγάλη υπομονάδα της DNA πολυμεράσης α (Van G. Wilson et al., 2002). ~ J N-terminal DNA Heliease domain domain binding domain Εικόνα 2.5: Σχηματική απεικόνιση των περιοχών της πρωτεΐνης Ε1. Η δραστικότητα της ΑΤΡάσης τοποθετείται στην C-τελική περιοχή της πρωτεΐνης. Το C-τελικό άκρο της Ε1 του HPV-11 συμβάλει στον ολιγομερισμό της σε ένα εξαμερές (Thomer L.K. et al., 1993). Αυτός ο τομέας είναι επίσης υπεύθυνος για την αλληλεπίδραση με την πολυμεράση α του ξενιστή (Masterson J. et al., 1998). Παρουσία ATP η El προσδένεται στην LCR σε μία περιοχή πλούσια σε AT προκαλώντας δομικές αλλαγές (Shawn Ε. Holt and Van G. Wilson, 1995). Σαν πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής η Ε1 έχει δύο βασικούς ρόλους. Πρώτον δρα σαν πρωτεΐνη πρόσδεσης, αναγνωρίζοντας την θέση έναρξης της αντιγραφής του DNA και δεύτερον δρα σαν ελικάση με αποτέλεσμα να ξεδιπλώνει την θέση έναρξης της αντιγραφής και να προχωρά η αντιγραφική διχάλα (Liu J.S. et al., 1995). Η El προσδένεται σε μια επαναλαμβανόμενη αλληλουχία 18 bp εντός της περιοχής έναρξης της αντιγραφής με την βοήθεια της πρωτεΐνης Ε2, η οποία λειτουργεί ως διμερής αντιγραφικός παράγοντας (Titolo S. et al., 2003). Το σύμπλοκο E1-E2 αποτελείται από ένα Ε2 διμερές και δύο μόρια Ε1. Το σύμπλοκο αυτό δρα σαν δομική μονάδα για την συγκρότηση ενός μεγαλύτερου Ε1 εξαμερούς συμπλόκου, που έχει την ιδιότητα να ξετυλίγει το DNA (Sedman J. et al., 1998). Η Ε2 επομένως λειτουργεί σαν παράγοντας που κατευθύνει την Ε1 στην περιοχή πρόσδεσής της και επιπρόσθετα σαν παράγοντας που συναρμολογεί τα Ε1 μονομερή (Liu J.S. et al., 1995). H El είναι ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη αντί-hpv φαρμάκων, καθώς η πρωτεΐνη αυτή είναι απαραίτητη για την ιική αντιγραφή και παθογένεια (Peter W. White et al., 2005). [22]

24 Η ιϊκή πρωτεΐνη Ε2 Η πρωτεΐνη Ε2 (εικόνα 2.6) έχει μέγεθος περίπου 50 kda και είναι διμερής. Οι πρωτεΐνες αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στην αντιγραφή του ιικού DNA όσο και στην ρύθμιση της μεταγραφής (Laimins L. A. et al., 1998). Αποτελείται από τρεις περιοχές: το καρβοξυ-τελικό άκρο, το οποίο διαθέτει μια διμερή δομή β-βαρελιού και είναι αυτό που συνδέεται στο DNA (Hedge R. S. et al., 1992), μια ενδιάμεση περιοχή, η οποία ονομάζεται περιοχή-αρμός (hinge region), και το αμινο-τελικό άκρο το οποίο έχει δομή α-έλικας πλούσιας σε γλουταμίνη (Antson A. A. et al., 2000, Harris S. F. et al., 1999) και αποτελεί μια περιοχή ενεργοποίησης, όταν το καρβοξυ-τελικό άκρο αλληλεπιδρά με την El (Chen G. et al., 2000) Activation Hinge DNA domain binding domain Εικόνα 2.6: Σχηματική απεικόνιση των περιοχών της πρωτεΐνης Ε2. Τα διμερή Ε2 συνδέονται σε συντηρημένες παλινδρομικές αλληλουχίες (ACCNftGGT) που ονομάζονται περιοχές σύνδεσης της Ε2 (Ε2 binding sites, E2BSs) (Laimins L. A. et al., 1998). Υπάρχουν τέσσερεις τέτοιες περιοχές στην LCR και τρεις από αυτές περιβάλλουν τις αλληλουχίες αναγνώρισης της Ε1 στην θέση έναρξης της αντιγραφής (Howley Ρ. Μ. et al., 1996). Με τον τρόπο αυτό η Ε2 βοηθά την Ε1 να συνδεθεί στην θέση έναρξης της αντιγραφής. Επίσης επιδρά στην ρύθμιση της μεταγραφής, κυρίως των Ε6 και Ε7 γονιδίων, δρώντας ως ενεργοποιητής ή καταστολέας (Cripe et al., 1987). Πιο συγκεκριμένα, η Ε2 παρουσιάζει διαφορετική συγγένεια για τις θέσεις πρόσδεσης και εξαρτάται από τη συγκέντρωση της Ε2 για τον αν θα καλυφθούν όλες οι θέσεις. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, η Ε2 συνδέεται σε απομακρυσμένες από τον υποκινητή του Ε6 γονιδίου περιοχές, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την σύνδεση κυτταρικών μεταγραφικών παραγόντων (Spl. TFIID) και την έκφραση των Ε6 και Ε7 γονιδίων. Αντίθετα, σε υψηλές συγκεντρώσεις η Ε2 δρα ως καταστολέας της μεταγραφής καθώς προσδένεται σε E2BSs [23]

25 οι οποίες επικαλύπτουν τις θέσεις πρόσδεσης του Spl και του TFIID (Demeret C. et al., 1997, Dostatni N. et al., 1991). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της σύνδεσης των παραπάνω κυτταρικών μεταγραφικών παραγόντων και κατ επέκταση την καταστολή της μεταγραφής. Κατά κανόνα, η ενσωμάτωση του γονιδιώματος των HPV στο γονιδίωμα του κυττάρου-ξενιστή γίνεται στην περιοχή του γονιδίου Ε2 του ιικού γενώματος. Δηλαδή, κατά την ενσωμάτωση παρατηρείται διάσπαση του γονιδίου Ε2. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση της παραγωγής της πρωτεΐνης Ε2 και κατ επέκταση την μη σωστή ρύθμιση και την αυξημένη παραγωγή των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Αυτό το γεγονός φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει παρατηρηθεί ότι όταν το ιικό DNA είναι σε επισωμική μορφή η μεταγραφή των γονιδίων Ε6 και Ε7 ελέγχεται από την Ε2 (Bechtold et al., 2003) Η ιική πρωτετνη Ε4 Η πρωτεΐνη Ε4 συντίθενται στην όψιμη φάση του κύκλου ζωής του HPV και εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα από όλες τις πρωτεΐνες του ιού. Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης της Ε4 μεταφράζεται μαζί με τα πέντε πρώτα αμινοξέα του Ε1 γονιδίου σχηματίζοντας την Ε1ΛΕ4 πρωτεΐνη, καθώς απουσιάζει από το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του Ε4 το κωδικόνιο λήξης AUG (Howley P.M. et al., 1996). Όλοι οι papilloma ιοί εκφράζουν την πρωτεΐνη Ε1ΛΕ4 στην όψιμη φάση του κύκλου ζωής τους. Η Ε1ΛΕ4 είναι ένας σημαντικός παράγοντας ρύθμισης της αντιγραφής του ιικού γενώματος στην όψιμη φάση της ζωής του ιού (Wilson R. et al., 2005) ενώ άλλες μελέτες εμπλέκουν την Ε1ΛΕ2 ως ρυθμιστή της όψιμης και της πρώιμης φάσης της ζωής των HPV. Παρόλα αυτά όμως η λειτουργία της Ε1ΛΕ4 μπορεί να μην είναι απαραίτητη για την αντιγραφή όλων των τύπων των papilloma ιών (Fang L. et al., 2006). Η πρωτεΐνη Ε1ΛΕ4 του FIPV-16 μπορεί να διαχωριστεί σε τρεις λειτουργικές περιοχές: Το Ν-τελικό άκρο με το πλούσιο σε λεύκινη μοτίβο (LLXLL), την κεντρική περιοχή πλούσια σε προλίνη και την C-τελική περιοχή (Roberts et al., 1994). Έχει παρατηρηθεί ότι η πρωτεΐνη Ε1ΛΕ4 αλληλεπιδρά με το δίκτυο ινιδίων κερατίνης στα διαφοροποιημένα κερατινοκύτταρα επάγοντας την καταστροφή του δικτύου και την απελευθέρωση των νεοσχηματιζόμενων ιικών σωματιδίων. Πιο συγκεκριμένα το συντηρημένο μοτίβο πλούσιο σε λεύκινη (LLXLL) στο Ν-τελικό άκρο της Ε1ΛΕ4 είναι [24]

26 απαραίτητο για την αλληλεπίδραση με το δίκτυο ινιδίων κερατίνης ενώ το C-τελικό άκρο της Ε1ΛΕ4 των HPV-16 και HPV-18 απαιτείται για την καταστροφή του. Μια ακόμη λειτουργία της Ε1ΛΕ4 των HPV-11 και HPV-16 είναι η παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2 (G2 arrest) σε μία ποικιλία κυτταρικών σειρών (Davy C.E et al., 2002). Τέλος η Ε1ΛΕ4 πρωτεΐνη του HPV-16 έχει την δυνατότητα να επάγει την απόπτωση καθώς έχει μελετηθεί η σύνδεση και αλληλεπίδραση της με τα μιτοχόνδρια (Raj et al., 1994) Η ιική πρωτεΐνη Ε5 Η πρωτεΐνη Ε5 των HP Vs υψηλού κινδύνου έχει βρεθεί, μαζί με τις πρωτεΐνες Ε6 και Ε7, ότι εμπλέκονται στην ογκογένεση. Η Ε5 είναι μια υψηλά υδρόφοβη μεμβρανοσυνδεόμενη πρωτεΐνη. Αποτελείται από 83 αμινοξέα και αλληλεπιδρά τόσο με το σύστημα Golgi, όσο και με το ενδοπλασματικό δίκτυο και την πυρηνική μεμβράνη των μολυσμένων κυττάρων. Έχει προταθεί ότι η Ε5 των HPV συνδέεται με τον υποδοχέα του EGF. Αυτό βασίζεται στο γεγονός ότι όταν έχουμε υπερέκφραση της HPV Ε5 αυξάνεται η φωσφορυλίωση του υποδοχέα του EGF με συνέπεια να αναστέλλεται η αποδόμησή του (Straight et al., 1993). Η Ε5 εκφράζεται στο όψιμο και στο πρώιμο στάδιο της ζωής του ιού. Στο πλαίσιο ολόκληρου του γενώματος του HPV-31 έχει αποδειχθεί ότι η Ε5 επηρεάζει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του EGF στα διαφοροποιημένα καθώς επίσης και στα αδιαφοροποίητα κύτταρα (Fehrmman et al., 2003). Πιο συγκεκριμέν η απώλεια της Ε5 συμβάλει στην αναστολή των όψιμων ιικών λειτουργιών στα διαφοροποιημένα κύτταρα, επιβεβαιώνοντας ότι η βασική της λειτουργία εντοπίζεται στην κατηγορία αυτή των κυττάρων (Flores E.R et al., 2000). Πρόσφατα ευρήματα προτείνουν ότι η Ε5 μπορεί να εμπλέκεται στην ικανότητα του ιού να ξεφεύγει από την ανοσολογική απάντηση κρατώντας τον MHC τύπου I, στην συσκευή Golgi, εμποδίζοντας με αυτό τον τρόπο την μεταφορά του στην κυτταρική επιφάνεια (Ashrafi et al., 2005). [25]

27 Η ιική πρωτεΐνη Ε6 Η Ε6 πρωτεΐνες, τόσο στους χαμηλού κινδύνου όσο και στους υψηλού κινδύνου ιούς των ανθρώπινων θηλωμάτων, έχουν μέγεθος περίπου 150 αμινοξέων και περιέχουν στο μόριό τους δυο περιοχές σύνδεσης ψευδαργύρου οι οποίες διαθέτουν το μοτίβο Cys- X-X-Cys (εικόνα 2.7) (zur Hausen Η. et al., 2002) Εικόνα 2.7: Η πρωτεΐνη Ε6 του HPV 16 στην οποία φαίνονται οι δυο περιοχές σύνδεσης του ψευδαργύρου. Η Ε6 των τύπων υψηλού κινδύνου εντοπίζεται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και τον πυρήνα των μολυσμένων κυττάρων. Είναι μια από τις ογκοπρωτεΐνες των ιών αυτών και μαζί με την πρωτεΐνη Ε7 προκαλούν αθανασία και εξαλλαγή των επιθηλιακών κυττάρων. Η Ε6 επιφέρει αρκετές σημαντικές αλλαγές στα κύτταρα του ξενιστή μέσω αλληλεπίδρασής της με μια πληθώρα κυτταρικών πρωτεϊνών. In vitro και in vivo μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση της Ε6 προκαλεί υπερπολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων, απώλεια της διαφοροποίησης στα επιθηλιακά στρώματα και ανάπτυξη ήπιων και κακοήθων όγκων μέσω αναστολής της απόπτωσης, αλλαγής του μεταγραφικού μηχανισμού, καταστροφής των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των κυττάρων (ένα σημαντικό στάδιο στην δημιουργία κακοήθιας) και αύξησης του χρόνου ζωής των κυττάρων. Μια από τις κύριες λειτουργίες της Ε6 είναι η αλληλεπίδρασή της με το προϊόν του ογκοκατασταλτικού γονιδίου ρ53, δηλαδή την πρωτεΐνη ρ53, η οποία είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας και λειτουργεί ως καταστολέας όγκων (Wemess et al., 1990). Αναλύσεις ανθρώπινων όγκων έχουν δείξει ότι το γονίδιο ρ53 είναι ένα από τα πιο κοινά μεταλλαγμένα γονίδια (Vogelstein et al., 1990). Καταστάσεις κυτταρικού στρες όπως για παράδειγμα υπεριώδης ακτινοβολία, υποξία ή μόλυνση από ιό προκαλούν αύξηση της κυτταρικής ρ53. Η αύξηση αυτή με την σειρά της επάγει την παραγωγή του αναστολέα της κυκλινο-εξαρτώμενης κινάσης (CdK), δηλαδή του ρ21. Μ αυτόν τον τρόπο σταματάει ο κυτταρικός κύκλος (στην φάση G1) και το κύτταρο έχει χρόνο να διορθώσει [26]

28 τις, προκαλούμενες από το στρες, βλάβες στο DNA (Κο L. et al., 1996, Kuebritz et al., 1992). Εάν η βλάβη δεν επιδιορθωθεί τότε η ρ53 οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση (Artandi S. Ε. et al.,. 2005). Η Ε6 προκαλεί αποδόμηση της ρ53 μέσω ουβικιτινίωσης. Πιο συγκεκριμένα, η Ε6 συνδέεται με μια άλλη κυτταρική πρωτεΐνη, την Ε6ΑΡ η οποία λειτουργεί ως μια Ε3 ουβικιτινική λιγάση (Huibregtse et al., 1993, Scheffner et al., 1993). To σύμπλοκο E6-E6AP προκαλεί ουβικιτινίωση της ρ53 και στην συνέχεια την αποδόμηση της από το 26S πρωτεάσωμα (εικόνα 2.8) (Hubbert Ν. L. et al., 1992, Huibregtse J. M. et al., 1993). To γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την μη αναστολή του κυτταρικού κύκλου και τον συνεχιζόμενο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επίσης, η Ε6 μπορεί να αναστείλει την ρ53 μέσω της σύνδεσής της με το p300/cbp, ο οποίος είναι ένας συνενεργοποιητής της ρ53 (Lechner Μ. S. et al., 1994, Zimmermann Η. et al., 1999). Εικόνα 2.8: Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ρ53 μέσω της δράσης της πρωτεΐνης Ε6 των HPVs (Thomas Μ. et al., 1999). 26S ΤΤρωτεάσιυμα Μια ακόμα λειτουργία της Ε6 σημαντική για την δημιουργία αθάνατων κυττάρων είναι η ενεργοποίηση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης htert (Klingelhutz et al., 1996). Η τελομεράση είναι ένα ένζυμο με τέσσερις υπομονάδες. Βασική της δράση είναι να προσθέτει εξαμερείς επαναλήψεις στο τελομερικό άκρο των χρωμοσωμάτων έτσι ώστε να αυξάνεται η σταθερότητα τους και να αποφεύγεται η σμίκρυνσή τους κατά την αντιγραφή. Η απώλεια της τελομεράσης οδηγεί στην προοδευτική σμίκρυνσή του τελομερικού DNA στα άκρα των χρωμοσωμάτων κατά την διάρκεια των κυτταρικών διαιρέσεων με αποτέλεσμα την γήρανσή τους και τελικά τον θάνατό τους (Harley et al 1990). Η τελομεράση είναι ενεργοποιημένη τουλάχιστον στο 90% των καρκινικών κυττάρων αλλά απουσιάζει από τα φυσιολογικά σωματικά κύτταρα (Kim Ν. W. et al., 1994). Η Ε6 επάγει την έκφραση της htert, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση της τελομεράσης, την διατήρηση μεγάλων τελομερικών άκρων κατά την διαίρεση των κυττάρων με άμεση συνέπεια την αναστολή της γήρανσής τους και την απόκτηση αθανασίας (Artandi S.E. et al., 2005). [27]

29 Τέλος, η Ε6 αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες της οικογένειας PDZ. Οι πρωτεΐνες της οικογένειας αυτής συνδέονται και αποδομούνται μέσω σύνδεσης τους με το C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης Ε6 των HPV υψηλού κινδύνου (εικόνα 2.9). Η αποδόμηση αυτή οδηγεί στην ανάπτυξη επιδερμικής υπερπλασίας σε πειράματα με ποντίκια (Nguyen et al., 2003). Ε6 EfcAP Εξαλλαγή Εικόνα 2.9: Η διαμεσολαβούμενη από την πρωτεΐνη Ε6 των HPV υψηλού κινδύνου αποδόμηση των πρωτεϊνών PDZ Η ιική πρωτεΐνη Ε7 Η δεύτερη ογκοπρωτεΐνη των ιών των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV), η οποία είναι υπεύθυνη τόσο για την αθανασία όσο και για την παθογένεια του ιού είναι η Ε7. Οι Ε7 πρωτεΐνες, τόσο των τύπων υψηλού όσο και των τύπων χαμηλού κινδύνου, εντοπίζονται κυρίως στον πυρήνα και έχουν μέγεθος περίπου 100 αμινοξέα (Munger Κ. et al., 1989, Riley R. et al., 2003). El κυριότερη λειτουργία της E7 είναι η αλληλεπίδρασή της με την οικογένεια των πρωτεϊνών του ρετινοβλαστώματος (Rb, ρ 107, ρ 130), οι οποίες λειτουργούν ως καταστολείς όγκων (Dyson Ν. et al., 1989). Η Ε7 διαθέτει θέσεις φωσφορυλίωσης από την καζεϊνική κινάση II στα κατάλοιπα σερίνης 31 και 32 (Chakrabarti Ο. et al., 2003). Χωρίζεται σε τρεις περιοχές: την CR1, η οποία βρίσκεται στο Ν-τελικό άκρο και περιέχει τα κατάλοιπα 1-20, την CR2 που περιέχει ένα μοτίβο LXCXE στο οποίο προσδένεται η Rb πρωτεΐνη και περιέχει τα αμινοξέα και είναι αρκετά συντηρημένη σε όλους τους τύπους υψηλού κινδύνου και τέλος την περιοχή CR3 η οποία περιέχει δυο μοτίβα δάχτυλα ψευδαργύρου, περιλαμβάνει τα αμινοξέα και βρίσκεται στο C-τελικό άκρο (εικόνα 2.10) (Dyson Ν. et al., 1989). Οι περιοχές CR1 και CR2 έχουν μεγάλη αμινοξική ομολογία με τις περιοχές CR1 και CR2 του αδενοϊού Ε1Α οι οποίες προσδένουν κι αυτές τις πρωτεΐνες του ρετινοβλαστώματος (Phelps Ρ. et al., 1988). [28]

30 CR3 CR1 r~ CR2 LXCXE M 100 Εικόνα 2.10: Η πρωτεΐνη E7. Στην εικόνα αυτή φαίνονται οι τρεις περιοχές της πρωτεΐνης. Σε επίπεδο ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου η αποφωσφορυλιωμένη μορφή της Rb δημιουργεί σύμπλοκα με τον μεταγραφικό παράγοντα E2F/DP1, ο οποίος αναστέλλει την έκφραση γονιδίων που συμβάλουν στην προώθηση του κυτταρικού κύκλου στη φάση S καθώς επίσης και στην προώθηση του κυττάρου στην απόπτωση. Κατά την μετάβαση από την φάση G1 στην φάση S τα σύμπλοκα κυκλίνης-κινάσης φωσφορυλιώνουν την prb με αποτέλεσμα να απελευθερώνεται η Rb από το σύμπλοκο που σχηματίζει με τον μεταγραφικό παράγοντα E2F/DP1 με συνέπεια να ενεργοποιείται και να επάγει η μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA (Dyson Ν. et al., 1998). FI πρωτεΐνη Ε7 δεσμεύει την αποφωσφορυλιωμένη μορφή της Rb, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του μεταγραφικού συμπλόκου E2F/DP1 και κατ' επέκταση τον συνεχή πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Επίσης, η Ε7 αλληλεπιδρά και με την απακετυλάση των ιστονών (histone deacetylase, HD AC) (Brehm A. et al., 1998). Ο φυσιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης αυτής είναι η συνεργασία της με την prb στην καταστολή του κυτταρικού κύκλου. Πιο συγκεκριμένα, σε κύτταρα τα οποία δεν έχουν μολυνθεί από HPV, η Rb προσδένει τις HDACs και τις στρατολογεί στους υποκινητές που εξαρτώνται από το μεταγραφικό παράγοντα E2F. Οι HDACs αφαιρούν ακετυλομάδες από πλούσιες σε λυσίνη αμινοτελικές ουρές ιστονών οι οποίες συγκροτούν τα νουκλεοσώματα. Επιπροσθέτως, μπορούν να απακετυλιώσουν απευθείας τους μεταγραφικούς παράγοντες E2F, με αποτέλεσμα την απενεργοποίησή τους και κατ επέκταση την απορύθμιση του κυτταρικού κύκλου (Marks Ρ. et al., 2001). Η Ε7 συνδέει ταυτόχρονα την Rb και την HDAC, γεγονός που παίζει σημαντικό ρόλο στον υπερπολλαπλασιασμό και την αθανασία των μολυσμένων κυττάρων (Liu Υ. et al., 1999). Όλα τα παραπάνω αναπαριστώνται στην εικόνα [29]

31 Τέλος, η πρωτεΐνη Ε7 συνδέεται με τις κυκλίνες Α και Ε καθώς επίσης με τους αναστολείς των κυκλίνο-εξαρτώμενων κινασών (CDKs) ρ21 και ρ27. Πιο συγκεκριμένα η Ε7 αυξάνει τα επίπεδα των Α και Ε κυκλινών και μπλοκάρουν την δράση των ρ21, ρ27 με αποτέλεσμα να επάγεται η φωσφορυλίωση της Rb και κατ επέκταση η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου. (Funk J.O et al., 1997). Στον πίνακα 2.1 αναγράφονται συνοπτικά οι ιδιότητες όλων των πρωτεϊνών του ιού. Εικόνα 2.11: Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από της πρωτεΐνες Rb, HDAC και το μεταγραφικό σύμπλοκο E2F/DP-1, καθώς και πως επηρεάζεται από την δράση της Ε7. [30]

32 Γονίδιο: Λειτουργία Ε1 Αντιγραφή του DNA, διατήρηση επισώματος, μεταγραφική καταστολή. Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Αντιγραφή του DNA (με την Ε1), έλεγχος μεταγραφής. Άγνωστη λειτουργία (έχει βρεθεί μόνο στον ιό BPV1). Εκφράζεται στην όψιμη φάση μαζί με το Ε1 σχηματίζοντας την Ε1ΑΕ4 πρωτεΐνη. Συμβάλει στην παύση του κυτταρικού κύκλου στην φάση G2. Καταστολή ογκοκατασταλτικών μηχανισμών π.χ φωσφορυλίωση του υποδοχέα του EGF. Ε6 Μετασχηματισμός των κυττάρων του ξενιστή. Αναστέλλει την δράση της ρ53, επάγει την αποδόμηση της οικογένειας των πρωτεϊνών PDZ, ενεργοποιεί την καταλυτική υπομονάδα της τελομεράσης hhert. Ε7 Ε8 L1 L2 Μετασχηματισμός των κυττάρων του ξενιστή. Αναστέλλει την δράση της prb, ενισχύει την δράση των κυκλινών Α και Ε και των κινασών τους, αλληλεπιδρά με την απακετυλάση των ιστονών (HDAC). Αγνωστη λειτουργία. Κύρια καψιδιακή πρωτεΐνη. Υπεύθυνη για τον σχηματισμό του ιικού καψιδίου. Μικρή καψιδιακή πρωτεΐνη. Εμπλέκεται στην σταθεροποίηση της δομής του καψιδίου και πιθανώς και στο πακετάρισμα του DNA. Πίνακας 2.1: Περιληπτική αναφορά όλων των λειτουργιών των πρωτεϊνών του ιού. [31]

33 1.3 Ο κύκλος ζωής των HPV Είσοδος του ιού στο κύτταρο Ο κύκλος ζωής των HPV ακολουθεί το πρόγραμμα διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων του ξενιστή (Howley and Lowy, 2001). Πιστεύεται ότι τα ιικά σωματίδια προσβάλουν τους επιθηλιακούς ιστούς μέσω μικροτραυματισμών, με αποτέλεσμα ο ιός να εισβάλει στα κύτταρα της βασικής στοιβάδα (εικόνα 3.1). Απελευθέρωση ώριμων ιών Μόλυνση τωνκιπτάρων της βασικής στοιβάδας μέσω μικροτραυματισμών ( \ 1 1 ), &Ιο Ρ )ο\ Κεράτινη στοιβάδα: Κοκκιώδης στοιβάδα Ακανθώδης στοιβάδα Βασική στοιβάδα Φυσιολογικό επιθήλιο Μολυσμένο από HPV επιθήλιο Εικόνα 3.1: Μόλυνση της βασικής στοιβάδας από HPV. Ο ιός εισέρχεται εντός των βασικών επιθηλιακών κυττάρων, μέσω της σύνδεσης του με την θειϊκή ηπαρίνη η οποία αποτελεί συστατικό των πρωτεογλυκανών, που αλληλεπιδρούν με την κυτταρική μεμβράνη (Shafti Keramat S. et al., 2003). Όπως συμβαίνει και με πολλούς άλλους ιούς, ο HPV απαιτεί την παρουσία και δεύτερου υποδοχέα για την αποτελεσματική είσοδό του στο κύτταρο ξενιστή, όπως είναι οι α6 - ιντεγκρίνες (Yoon C.S. et al., 2001). Πρόσφατα έχει αποδειχθεί, ότι η λαμινίνη-5 είναι ένας ακόμα παράγοντας ικανός να λειτουργεί ως υποδοχέας των HPV στην επιφάνεια των κερατινοκυττάρων (Culp T.D. et al., 2006). Στην συνέχεια ο ιός μετά την πρόσδεση στον υποδοχέα του, εισέρχεται εντός του κυττάρου με ενδοκυττάρωση σε κυστίδια κλαθρίνης ή καβεολίνης, ανάλογα με τον τύπο του ιού. Έπειτα τα ιικά σωμάτια αποσυναρμολογούνται στα ενδοσώματα ή/και στα λυσοσώματα και το ιικό DNA μεταφέρεται στον πυρήνα με την βοήθεια της καψιδιακής πρωτεΐνης L2 (εικόνα 3.2) (Day P.M. et al., 2004). Έχει παρατηρηθεί, ότι το γονιδίωμα του ιού βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή σε [32]

34 δύο μορφές. Μπορεί να είναι ενσωματωμένο στο DNA του κυττάρου, καθώς επίσης μπορεί να βρίσκεται σε μορφή επισώματος, χωρίς να αποκλείεται η ταυτόχρονη παρουσία και των δύο μορφών. Η ενσωμάτωση του ιικού DNA γίνεται μέσω ρήξης της συνέχειας του γονιδίου Ε2 με μεγαλύτερη συχνότητα στην θέση μεταξύ των νουκλεοτιδίων 3243 και Μελέτες ακόμα έχουν δείξει, ότι σε ορισμένες σπάνιες περιπτώσεις η ενσωμάτωση του ιικού DNA γίνεται μέσω διάσπασης της συνέχειας της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σε θέσεις κοντά στο γονίδιο El (Pulido Η. et al., 2006). bmdmg & entry V (LI Uncoating (L2-independent) Furin cleavage of L2 y Hi EhdosomaJ escape (L2-dependent) nuclear translocation (L2 and DNA) / Λ., Εικόνα 3.2: Είσοδος του HPV στο κύτταρο-ξενιστή Αντιγραφή του ιικού γενώματος Ε1 αντιγραφή του γενώματος των HPV κατά την διάρκεια του παραγωγικού κύκλου ζωής μπορεί να χωριστεί σε τρεις φάσεις: την ενσωμάτωση, την διατήρηση και την ενίσχυση (εικόνα 3.3). Κατά την διάρκεια της φάσης της ενσωμάτωσης που ακολουθεί την μόλυνση, ένα HPV γένωμα μεταναστεύει στον πυρήνα των κυττάρων της βασικής στοιβάδας και ξεκινά αρκετούς γύρους αντιγραφής και φτάνει αντίγραφα ανά κύτταρο. Σε αυτό το σημείο το ιικό γένωμα παραμένει εντός του πυρήνα ως επίσωμα. Ακολουθώντας την ενσωμάτωση, το ιικό γένωμα αντιγράφεται, μαζί με το DNA του κυττάρου ξενιστή, κατά μέσο όρο ένα σε κάθε κυτταρικό κύκλο κατά την διάρκεια της φάσης S, με την διατήρηση ενός σταθερού αριθμού αντιγράφων για περιόδους, που [33]

35 περιορίζεται σε δεκάδες εξαιτίας της ρύθμισης της έκφρασης των Ε1 και Ε2 από την Ε2 πρωτεΐνη (Steger and Corbach 1997, Stubenrauch et al., 1998b). Τα επίπεδα της E2 ρυθμίζουν την πρώιμη ιική μεταγραφή. Σε μικρό αριθμό αντιγράφων του γονιδιώματος και σε χαμηλά επίπεδα έκφρασης της Ε2, η Ε2 ενεργοποιεί την έκφραση από τον πρώιμο υποκινητή ο οποίος οδηγεί στην έκφραση των Ε1 και Ε2, ενώ, από την άλλη, η Ε2 σε υψηλά επίπεδα, παρεμποδίζει την μεταγραφή (Stubenrauch et al., 1998b). Μ αυτόν τον τρόπο, η έκφραση των ιικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αντιγραφή και ο αριθμός των αντιγράφων του ιικού γενώματος πιστεύεται ότι διατηρούνται σε ένα σταθερό, ευνοϊκό επίπεδο στα αδιαφοροποίητα κύτταρα. Κατά την διαφοροποίηση, η μεταγραφή των αντιγραφικών γονιδίων εξαρτάται, όχι πλέον από τον Ε2-ρυθμιζόμενο πρώιμο υποκινητή, αλλά από τον περισσότερο ενεργό όψιμο υποκινητή ο οποίος είναι ανεξάρτητος από την πρωτεΐνη Ε2 (Klumpp and Laimins, 1999). Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης των Ε1 και Ε2 πρωτεϊνών αντιγραφής από αυτόν τον ειδικό υποκινητή οδηγούν στην ενίσχυση του ιικού γενώματος σε χιλιάδες αντίγραφα ανά κύτταρο. Ε1 τελευταία φάση αντιγραφής του ιικού γενώματος συμβαίνει στα μολυσμένα κύτταρα των ανώτερων στοιβάδων. Σε αυτά τα κύτταρα παρατηρείται έξαρση της αντιγραφής του ιικού γενώματος με σκοπό την σύνθεση του ιικού DNA που θα εισέρθει εντός των νεοσχηματιζόμενων ιικών σωματιδίων (Hoffmann R. et al., 2006). Ανάλυση των επιπέδων των ιικών μετάγραφων κατά την διάρκεια της σύνθεσης του DNA υποδηλώνει ότι η Ε1 πρέπει να είναι ο κυριότερος ρυθμιστής της ενίσχυσης του ιικού γονιδιώματος (Ozbum and Meyers, 1998a). [34]

36 Μόλυνση Ενίσχυση Κιρατινοποιημενη Διάφορο ποίηση Κοκκώδης Ακανθώδης _ Ενσωμάτωση Διατήρηση Βασική στοιβάδα Εικόνα 3.3: Οι τρεις φάσεις της αντιγραφής του γενώματος του HPV (ενσωμάτωση, διατήρηση και ενίσχυση). Έχει παρατηρηθεί ότι γενετικές αλλαγές, όπως είναι η ενσωμάτωση του ιικού γενώματος στο χρωμόσωμα του κυττάρου ξενιστή (ρήξη και απενεργοποίηση του Ε2) (Corden S. A. et al., 1999, Pett M. R. et al., 2006) ή μεταλλάξεις στο γονίδιο Ε2 οδηγούν στην αυξημένη έκφραση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7, οι οποίες με την σειρά τους επάγουν το κυτταρικό μετασχηματισμό προκαλώντας αποσταθεροποίηση του DNA του κυττάρου, οδηγώντας τελικά στην ανάπτυξη καρκίνου. Σε χαμηλού βαθμού CIN αλλοιώσεων, το γονιδίωμα των HPV παραμένει σε επισωμική μορφή, και τα mrna τα οποία κωδικοποιούνται από τον HPV και εκφράζονται σ αυτές τις αλλοιώσεις περιέχουν μόνο ιικές αλληλουχίες. (Lehn Η. et al., 1988, Fukushima Μ. et al., 1990). Σε τραχηλικά καρκινικά κύτταρα, ωστόσο, το ιικό γονιδίωμα είναι συχνά ενσωματωμένο στα χρωμοσώματα των κυττάρων-ξενιστών (Baker C. C. et al., 1987, Schwartz F. et al., 1985, Durst M. et al., 1985). Η ενσωμάτωση του γενώματος των HPV στις περισσότερες περιπτώσεις επιδρούν στην δημιουργία των mrna τα οποία περιέχουν τα ιικά ογκογονίδια Ε6 και Ε7 καθώς και αλληλουχίες του κυτταρικού γονιδιώματος (Lehn Η. et al., 1988, Choo Κ. Β. et al., 1987). Η ενσωμάτωση του ιικού γενώματος συμβάλει στην απορύθμιση της έκφρασης των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7 (von Rnebel Doeberitz et al., 1991, Jeon S. et al., 1995). Τελικά, είναι πλήρως αποδεδειγμένο ότι η έκφραση αυτών των ογκογονιδίων είναι απαραίτητη για την πρόκληση και την διατήρηση του νεοπλασματικού φαινοτύπου των τραχηλικών [35]

37 καρκινικών κυττάρων (von Knebel Doeberitz et al., 1994). Αυτές ον πληροφορίες υποδηλώνουν ότι τα επιθηλιακά κύτταρα του τραχήλου τα οποία εκφράζουν τα ενσωματωμένα στα χρωμοσώματα ΗΡΥ ογκογονίδια παρουσιάζουν ένα μεγάλο πλεονέκτημα επιλεκτικής ανάπτυξης και είναι επιρρεπή για κλωνική ανάπτυξη σε καρκινικά κύτταρα Μεταγραφή του ιικού γενώματος Η αντιγραφή και η έκφραση των γονιδίων του ιού εξαρτάται από το πρόγραμμα διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων. Όμως ο μηχανισμός με τον οποίο η διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων των HPV δεν είναι πλήρως κατανοητός (Zhi-Ming Zheng et al., 2006). Τα πρώιμα ιικά γονίδια Ε1, Ε2, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7 εκφράζονται αμέσως μετά την μόλυνση των κυττάρων της βασικής στοιβάδας και βρίσκονται κάτω από τον αυστηρό έλεγχο του πρώιμου μεταγραφικού παράγοντα ρ97. Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών εμπλέκονται στην σταθεροποίηση και ενίσχυση του ιικού γενώματος (Ε1,Ε2) και στον ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Ε4, Ε5, Ε6, Ε7). Στην όψιμη φάση της ζωής του ιού εκφράζονται τα όψιμα γονίδια LI, L2 τα οποία είναι υπεύθυνα για την σύσταση του ιικού καψιδίου και το πακετάρισμα του γενώματος. Η έκφραση των γονιδίων αυτών βρίσκεται κάτω από την επίδραση του μεταγραφικού παράγοντα ρ670. Επίσης τα γονίδια Ε1, Ε2, Ε4, Ε5 εκφράζονται σε μεγάλες ποσότητες κατά την όψιμη φάση της ζωής του ιού ενώ συνεχίζουν να εκφράζονται και στα πλήρως διαφοροποιημένα κερατινοκύτταρα. Η έκφραση των γονιδίων αυτών βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του μεταγραφικού παράγοντα ρ670 (Grassmann Κ. et al., 1996). Η μεταγραφή παρουσιάζεται συνοπτικά στην εικόνα 3.4. [36]

38 \ Ε4 / E4/L1 V ΑιηΑευθέριυσν) του ιού \ Π «κι ταρισμα Ε4 j> Ε7/Ε-( Αντιγραφή του.ού } Πολλαπλασιασμός Διατήρηση Εικόνα 3.4: Συνοπτική απεικόνιση της μεταγραφής του ιικού γενώματος Σύνθεση των ιικών σωματιδίων και απελευθέρωση του ιού Στο τελικό στάδιο του κύκλου ζωής των HPV πραγματοποιείται η τοποθέτηση των πολλαπλών αντιγράφων του ιικού γενώματος μέσα στα νεοσυντεθέμενα ιικά καψίδια. Η συναρμολόγηση των νέων ιικών σωματιδίων πραγματοποιείται στην ανώτερη επιθηλιακή στοιβάδα, και περιλαμβάνει, εκτός από τις καψιδιακές πρωτεΐνες L1 και L2, και την πρωτεΐνη Ε2, η οποία έχει παρατηρηθεί ότι συμβάλει στην τοποθέτηση του ιικού γενώματος εντός των νεοσχηματιζόμενων καψιδίων (Buck C.B. et al., 2004). Η LI εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του ξενιστή και σχηματίζει τα L1 πενταμερή, τα οποία είναι απαραίτητα για την συγκρότηση του καψιδίου, ενώ η L2 εντοπίζεται στον πυρήνα των μολυσμένων κυττάρων και πιστεύεται ότι συμβάλει στο πακετάρισμα του ιικού γενώματος εντός των νεοσυντεθέμενων καψιδίων (Florin et al., 2002). Η ωρίμανση των ιικών σωματίων συμβαίνει όταν τα μολυσμένα από τον ιό κύτταρα ανέρθουν στην επιθηλιακή στοιβάδα. Τελικά ο ιός απελευθερώνεται από το κερατινοποιημένο κάλυμμα που έχει σχηματιστεί στην κυτταρική επιφάνεια (εικόνα 3.5). Οι HPV δεν προκαλούν λύση των μολυσμένων κερατινοκυττάρων και ο ακριβής μηχανισμός απελευθέρωσης από το κύτταρο δεν είναι γνωστός (Lehr Ε. et al., 2004). Στην εικόνα 3.6 απεικονίζεται συνολικά ο κύκλος ζωής των HPV. [37]