ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΨΥΧΟΤΡΟΠΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΨΥΧΙΑΤΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: Η ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ζ. ΙΑΚΩΒΙΔΟΥ-ΚΡΙΤΣΗ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ: Αριθμός Διατριβής: 3737 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΨΥΧΟΤΡΟΠΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΨΥΧΙΑΤΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΖΑΜΠΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΨΥΧΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΙΑΚΩΒΙΔΟΥ - ΚΡΙΤΣΗ ΖΑΦΕΙΡΟΥΛΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 2. ΓΚΙΟΥΖΕΠΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. ΓΟΥΛΑΣ ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΙΑΚΩΒΙΔΟΥ - ΚΡΙΤΣΗ ΖΑΦΕΙΡΟΥΛΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 2. ΓΚΙΟΥΖΕΠΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. ΓΟΥΛΑΣ ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 4. ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 5. ΦΙΔΑΝΗ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 6. ΦΩΚΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 7. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα». (Νόμος 5343/32, άρθρο 202, παρ.2 και Νόμος 1268/82, άρθρο 50, παρ.8) 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Δ. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ 3

4 4

5 Στην οικογένεια μου, στους καθηγητές μου, στους ψυχικά ασθενείς. 5

6 6

7 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΨΥΧΟΤΡΟΠΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΨΥΧΙΑΤΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ του Ψυχιάτρου ΖΑΜΠΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ 7

8 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... Σελ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... Σελ. 14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... Σελ Α. ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΒΛΑΒΕΣ... Σελ Γενετικό υλικό... Σελ Ανθρώπινος Καρυότυπος... Σελ Κυτταρικός κύκλος ζωής... Σελ Η φάση G 1... Σελ Η φάση S... Σελ Η φάση G 2... Σελ Η φάση μίτωσης Μ... Σελ Η φάση της κυτταροκίνησης D... Σελ Γενετικές βλάβες... Σελ Τύποι γενετικών βλαβών... Σελ Μηχανισμοί επιδιόρθωσης γενετικών βλαβών... Σελ Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair, RR)... Σελ Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair, BER) Σελ Αναντίστοιχη επιδιόρθωση (Mismatch Repair, MR) Σελ Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair, NER)... Σελ Επιδιόρθωση διπλόκλωνων θραύσεων του DNA (μετα-αντιγραφική επιδιόρθωση, DNA double strand breaks)... Σελ. 33 Β. ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ.Σελ Μέθοδοι εκτίμησης γενετικών βλαβών... Σελ Χρωματιδιακές ανταλλαγές (Sister Chromatid Exchanges, SCEs)... Σελ Ιστορική αναδρομή Ορισμοί... Σελ Τεχνική και εκτίμηση των SCEs... Σελ Αυτόματες και προκλητές SCEs... Σελ Πιθανοί μηχανισμοί πρόκλησης των SCEs... Σελ Πλεονεκτήματα της μελέτης της συχνότητας των SCEs... Σελ Μειονεκτήματα της μελέτης της συχνότητας των SCEs... Σελ

10 2.7. Ενδείξεις της μελέτης της συχνότητας των SCEs... Σελ Χρωμοσωμικές ατυπίες (Chromosome aberrations)... Σελ Μικροπυρήνες (Micronuclei)... Σελ Δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Proliferation Rate Index, PRI)... Σελ Μιτωτικός δείκτης (Mitotic Index)... Σελ. 47 Γ. ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΨΥΧΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΨΥΧΟΤΡΟΠΑ Σελ Εισαγωγή... Σελ Αντιψυχωσικά φάρμακα... Σελ Τυπικά Αντιψυχωσικά... Σελ Αλοπεριδόλη... Σελ Άτυπα Αντιψυχωσικά...Σελ Κλοζαπίνη...Σελ Ολανζαπίνη... Σελ Ρισπεριδόνη... Σελ Αμισουλπρίδη... Σελ Αριπιπραζόλη... Σελ Δ. ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΑΝΤΙΨΥΧΩΣΙΚΩΝ... Σελ ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... Σελ.73 Α. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... Σελ Υλικά και αντιδραστήρια καλλιεργειών... Σελ Εργαστηριακή υποδομή... Σελ Kαλλιέργειες και επεξεργασία παρασκευασμάτων... Σελ Ανίχνευση των SCEs και PRI των κυττάρων... Σελ Στατιστική εκτίμηση... Σελ. 80 Β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... Σελ Αποτελέσματα ανά φάρμακο... Σελ Αλοπεριδόλη... Σελ Κλοζαπίνη... Σελ Ολανζαπίνη... Σελ

11 1.4. Ρισπεριδόνη... Σελ Αμισουλπρίδη... Σελ Αριπιπραζόλη... Σελ Συγκριτικά αποτελέσματα... Σελ Συγκριτικά αποτελέσματα SCEs... Σελ Συγκριτικά αποτελέσματα PRI... Σελ Συγκριτικά αποτελέσματα συσχέτισης SCEs και PRI... Σελ. 105 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... Σελ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... Σελ ABSTRACT... Σελ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... Σελ

12 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Δεν είναι εύκολο να καθορίσει κανείς πότε διαγνώστηκε ο πρώτος ψυχικά ασθενής και από πότε υπάρχει η ψυχιατρική. Πολύ πιθανόν οι ψυχικές νόσοι να συνοδεύουν τον άνθρωπο από την αρχή της ύπαρξης του. Ως πρώτες μαρτυρίες σε αρχαιολογικά ευρήματα μπορούν να θεωρηθούν ανθρώπινα κρανία τα οποία είχαν υποβληθεί σε τρυπανισμό πιθανόν σε μια προσπάθεια θεραπείας από κάποια ψυχική διαταραχή. Άλλες μαρτυρίες μπορούμε να εντοπίσουμε μέσα από αρχαία κείμενα όπως για παράδειγμα την μελαγχολία του Οιδίποδα ή στην παλαιά διαθήκη τη ψυχική νόσο του Σαούλ. Αρχικά φαίνεται πως επικρατούσε η άποψη ότι οι ψυχικές νόσοι οφείλονταν σε εξωανθρώπινες δυνάμεις, συνήθως θεϊκές. Για τον λόγο αυτό η αντιμετώπιση τους γινόταν σε σχέση με την θρησκεία σε ναούς και ιερούς χώρους. Πρώτος ο Ιπποκράτης ήταν αυτός που υποστήριξε ότι οι ψυχικές νόσοι οφείλονται σε φυσικά αίτια και όχι σε υπερφύσικες δυνάμεις. Την οργανική αυτή αντίληψη ενίσχυσε αργότερα και ο Αριστοτέλης. Μπορεί να είναι δύσκολο να εντοπίσουμε ακριβώς από πότε αρχίζει να υφίσταται η ψυχιατρική, είναι εύκολο όμως να πούμε ότι αυτό που άλλαξε την πορεία της ψυχιατρικής, φέρνοντας επανάσταση στην αντιμετώπιση των ψυχιατρικών συμπτωμάτων ήταν η παρασκευή της χλωροπρομαζίνης το 1950 η οποία αποτέλεσε το πρώτο αντιψυχωσικό φάρμακο. Έκτοτε η ψυχοφαρμακολογική φαρέτρα έχει εμπλουτισθεί με πολλές άλλες ουσίες οι οποίες χρησιμοποιούνται καθημερινά στην ψυχιατρική κλινική πράξη. Το όφελος από την χορήγηση των αντιψυχωσικών είναι ανεκτίμητο και αδιαμφισβήτητο. Δυστυχώς όμως η χρήση των ουσιών αυτών εκτός από οφέλη έχει συνδεθεί και με ανεπιθύμητες ενέργειες. Παρόλο που για τα περισσότερα από αυτά τα σκευάσματα έχει αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός δράσης τους, η φαρμακοδυναμική και η φαρμακοκινητική τους, καθώς και οι περισσότερες παρενέργειες τους, παραμένει αδιευκρίνιστη η δράση στο κυτταρικό επίπεδο και η επίδραση τους στο γενετικό υλικό. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η κυτταρογενετική δράση κάποιων από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα αντιψυχωσικά στα λεμφοκύτταρα καλλιεργειών 12

13 περιφερικού αίματος σχιζοφρενών ασθενών που βρίσκονταν υπό αγωγή με τις συγκεκριμένες ουσίες, με σκοπό την αποσαφήνιση της κυτταροτοξικότητας και κυτταροστατικότητας τους και στόχο την ασφαλέστερη αντιψυχωσική φαρμακευτική αγωγή. Η εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας και Γενετικής του Τμήματος Ιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με την συγκατάθεση και υπό την επίβλεψη της Διευθύντριας, Καθηγήτριας κυρίας Ζαφειρούλας Ιακωβίδου - Κρίτση. Θα ήθελα στο σημείο αυτό να την ευχαριστήσω για την υπόδειξη του θέματος, την καθοδήγησή της κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας, την πρακτική και θεωρητική της υποστήριξη και τις υποδείξεις της κατά τη συγγραφή της διατριβής. Επίσης ευχαριστώ θερμά τους καθηγητές της Β Πανεπιστημιακής ψυχιατρικής κλινικής και ιδιαίτερα τον ομότιμο καθηγητή κύριο Γκιουζεπα Ιωάννη και τον καθηγητή κύριο Γαρύφαλλο Γεώργιο για την βοήθεια και την αμέριστη συμπαράσταση τους στην εκπόνηση της διατριβής καθώς επίσης και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακολογίας κύριο Γούλα Αντώνιο για τις υποδείξεις και την καθοδήγηση του στην εκπόνηση και τη συγγραφή της μελέτης αυτής. Επιπρόσθετα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το προσωπικό του Εργαστηρίου Βιολογίας και Γενετικής για την ένθερμη στήριξη που μου παρείχε, καθ όλη την διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής μου, καθώς και τους συνεργάτες μου στο Εργαστήριο και ιδιαίτερα τις κ.κ. Ελένη Παπαδοπούλου και Άννα Λευκελίδου και τον κ. Γεώργιο Δεμιρτζόγλου για την πρακτική συμπαράσταση και υποστήριξή τους για την διενέργεια του πειραματικού σκέλους της μελέτης. Θερμά επίσης ευχαριστώ όλους τους συναδέλφους ψυχιάτρους όπως και την νοσηλεύτρια της Β Πανεπιστημιακής ψυχιατρικής κλινικής κ. Ελένη Αντωνούλη για την μεγάλη βοήθεια που μου παρείχαν στην συλλογή του δείγματος. Τέλος ευχαριστώ την οικογένειά μου για την ουσιαστική συμπαράσταση και υποστήριξη που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια, καθώς χωρίς αυτήν, η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας δεν θα ήταν δυνατή. 13

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Απαραίτητη προϋπόθεση για την δημιουργία και συνέχιση της ζωής καθώς και για τη διατήρηση των ειδών αποτελούν οι πληροφορίες οι οποίες είναι αποθηκευμένες και κωδικοποιημένες στο γενετικό υλικό 1. Κανείς ίσως δεν μπορούσε τότε να προβλέψει ότι η ανακάλυψη από τους Watson και Crick (1953) της στερεοχημικής δομής και της διπλής έλικας του DNA θα οδηγούσε σήμερα σε τόσες πολλές εφαρμογές οι οποίες έφεραν επανάσταση στην αναγνώριση της γενετικής βάσης χαρακτηριστικών, ιδιοτήτων, αλλά και νόσων 2 και βοήθησαν στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση και θεραπεία ασθενειών. Σήμερα η ιατρική αναζητεί συστηματικά πληροφορίες και ψάχνει λύσεις για κάθε νοσολογική οντότητα και στο γενετικό υλικό 3. Η διασφάλιση της πιστής αντιγραφής του DNA και κατά συνέπεια της πιστής αντιγραφής όλων των κωδικοποιημένων πληροφοριών που περιέχει εξασφαλίζονται τόσο μέσω του μηχανισμού αντιγραφής του DNA, όσο και με την διαδικασία επιδιόρθωσής του 4. Τελικό προϊόν της αντιγραφής του DNA είναι δυο πιστά αντίγραφα, με συχνότητα λάθους 1 χ 10-9, κατά την αντιγραφή. Το γενετικό υλικό, ωστόσο, είναι εκτεθειμένο σε ποικίλους ενδογενείς και εξωγενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες, οι οποίοι επιδρούν κατά τη διαδικασία αντιγραφής 5 και δυνητικά αυξάνουν τη συχνότητα λάθους. Οι βλαπτικοί αυτοί παράγοντες ονομάζονται μεταλλαξιγόνοι 6, ενώ η εγκατάσταση βλαβών που κληρονομούνται ονομάζονται μεταλλάξεις. Οι παράγοντες αυτοί διακρίνονται σε φυσικούς (ακτινοβολίες, θερμοκρασία), βιολογικούς (ιοί, ογκογονίδια) και χημικούς. Στην κατηγορία των χημικών μεταλλαξιογόνων συμπεριλαμβάνονται χημικές ουσίες με κοινό χαρακτηριστικό την επίδραση στη δομή ή στη λειτουργία του γενετικού υλικού, όπως κάποιες φαρμακευτικές ουσίες με διαπιστωμένη κυτταροτοξική δράση 7. Το κύτταρο διαθέτει ποικίλους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του DNA, με σκοπό να αποτρέψει τη μόνιμη εγγραφή και μεταφορά των βλαπτικών αλλαγών του γενετικού υλικού στις επόμενες κυτταρικές γενιές. Στην περίπτωση των τελικά διαφοροποιημένων κυττάρων, κινητοποιούν τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης οι γενετικές βλάβες κινητοποιούν μηχανισμούς επιδιόρθωσης. Τέτοιου είδους 15

16 μηχανισμοί είναι η κινητοποίηση επιδιορθωτικών ενζύμων, η μεταγραφή παραγόντων επιδιόρθωσης, η απόπτωση και η αναχαίτιση του κυτταρικού κύκλου. Στην περίπτωση, όμως, των ταχέως πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων οι ίδιου τύπου γενετικές βλάβες ενεργοποιούν τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) 8. Τα σημεία αυτά σταματούν τον κυτταρικό κύκλο, ούτως ώστε να ενεργοποιηθούν οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί με απώτερο στόχο τη μη μετάδοση των γενετικών αλλαγών στην επόμενη κυτταρική γενιά 9. Τυχόν αποτυχία επιδιόρθωσης βλαβών του DNA μπορεί να προκαλέσει πρόκληση διαφόρων ασθενειών, αναπτυξιακές διαταραχές, καθώς επίσης και πρόωρη γήρανση και καρκινογένεση 10. Οι παράγοντες οι οποίοι είναι ικανοί να επάγουν βλάβες στο γενετικό υλικό, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, η ιονίζουσα ακτινοβολία και οι περισσότεροι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες μπορούν να χρησιμοποιηθούν και θεραπευτικά, στην αντιμετώπιση σοβαρών ασθενειών όπως του καρκίνου

17 Α. ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΒΛΑΒΕΣ 1. Γενετικό υλικό 1.1. Ανθρώπινος Καρυότυπος Φορέας των γενετικών πληροφοριών τόσο στον άνθρωπο, όσο και στους άλλους οργανισμούς είναι το DNA, το οποίο αποτελείται από ένα σκελετό σακχάρου φωσφορικής ρίζας από τον οποίο εξέχουν αζωτούχες βάσεις, πουρίνες και πυριμιδίνες. Στο DNA υπάρχουν δύο είδη πουρινών, η αδενίνη (Α) και η γουανίνη (G) και δύο είδη πυριμιδινών, η θυμίνη (Τ) και η κυτοσίνη (C). Κάθε αζωτούχος βάση ενώνεται με γλυκοσιδικό δεσμό με το άτομο άνθρακα 1 ενός σακχάρου. Η φωσφορική ομάδα συνδέει το 3 άτομο άνθρακα ενός μορίου σακχάρου με το 5 άτομο άνθρακα του επόμενου. Κάθε επαναλαμβανόμενη μονάδα αποτελούμενη από την πουρίνη ή την πυριμινίδη, το σάκχαρο και τη φωσφορική ομάδα ονομάζεται νουκλεοτίδιο (noucleotide) 12. Το μόριο του DNA αποτελείται από δύο μακρές νουκλεοτιδικές αλυσίδες, οι οποίες περιελίσσονται δεξιόστροφα, η μία γύρω από την άλλη σχηματίζοντας μια διπλή έλικα. Μεταξύ των δύο αλυσίδων του DNA η διάταξη των βάσεων είναι συμπληρωματική και συγκεκριμένη. Η γουανίνη της μιας αλυσίδας συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου μόνο με την κυτοσίνη στην άλλη αλυσίδα και αντίστοιχα η αδενίνη μόνο με την θυμίνη. Ως μονάδα μήκους του DNA ορίστηκε το ζεύγος βάσεων. Τα ανθρώπινα χρωμοσώματα αποτελούν μακρομόρια που περιέχουν 50x10 6 έως 250x10 6 ζεύγη βάσεων. Θεωρητικά, σε πλήρη αποελίκωση του DNA, το μήκος των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων έχει υπολογιστεί σε 1,7-8,5 εκατοστά 14. Η αυτοτέλεια των χρωμοσωμάτων γίνεται ορατή κατά τη μίτωση στη φάση της μετάφασης ή προμετάφασης, όπου το ακανόνιστο δίκτυο της χρωματίνης του μεσοφασικού πυρήνα αποκτά το μέγιστο βαθμό συσπείρωσης, δημιουργώντας ορατούς, χαρακτηριστικούς σχηματισμούς, τα χρωμοσώματα. Στο στάδιο της μετάφασης, ένα τυπικό χρωμόσωμα αποτελείται από τις δύο αδερφές χρωματίδες, που έχουν προκύψει κατά τον αναδιπλασιασμό του DNA 15. Οι αδελφές χρωματίδες 17

18 συγκρατούνται ενωμένες μεταξύ τους με μία πρωτογενή περίσφιξη, το κεντρομερίδιο. Ανάλογα με την θέση του κεντρομεριδίου, τα χρωμοσώματα ονομάζονται μετακεντρικά, όταν το κεντρομερίδιο βρίσκεται στο μέσο του μήκους τους, τελοκεντρικά όταν το κεντρομερίδιο βρίσκεται στο ένα από τα άκρα τους, και υπομετακεντρικά, όταν το κεντρομερίδιο βρίσκεται κάπου ενδιάμεσα μεταξύ των δύο προηγούμενων θέσεων. Όταν το κεντρομερίδιο δεν βρίσκεται ακριβώς στο άκρο του χρωμοσώματος, αλλά μεσολαβεί ένας πολύ μικρός βραχίονας, τα χρωμοσώματα αναφέρονται ως ακροκεντρικά. Επιπλέον, ενδέχεται να υπάρχουν και δευτερογενείς περισφίξεις, οι οποίες μπορεί να βρίσκονται σε οποιαδήποτε περιοχή κατά μήκος των χρωμοσωμάτων. Συχνότερα, οι περισφίξεις αυτές βρίσκονται κοντά στο ένα από τα άκρα του χρωμοσώματος, διαχωρίζοντας ένα μικρό τελικό τμήμα, τον δορυφόρο 16. Σύμφωνα με τις τρέχουσες βιβλιογραφικές ενδείξεις, θεωρείται ότι το DNA ενός χρωματοσώματος είναι ένα ενιαίο μόριο, το οποίο για να διατηρήσει την ακεραιότητα του πρέπει να περιέχει τις ακόλουθες βασικές αλληλουχίες: α) αλληλουχίες έναρξης της αντιγραφής του, που διασφαλίζουν την πιστή αναπαραγωγή της γενετικής πληροφορίας, β) αλληλουχία του κεντρομεριδίου όπου αναπτύσσεται ο κινητοχώρος, περιοχή υπεύθυνη για την μετακίνηση των χρωματοσωμάτων και γ) αλληλουχίες των άκρων του χρωμοσώματος (τελομερή). Τα τελομερή είναι αλληλουχίες πλούσιες σε επαναλαμβανόμενα τμήματα (TTAGGG)v, οι οποίες διευκολύνουν την πλήρη αντιγραφή του χρωμοσώματος, παρά την βράχυνση που συμβαίνει, λόγω απώλειας των ακραίων νουκλεοτιδίων κατά την αντιγραφή. Τα τελομερή παρουσία του ενζύμου τελομεράση πολυμερίζονται, αυξάνονται οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που περιέχουν και έτσι αποκαθίσταται η απώλεια των ακραίων νουκλεοτιδίων 15,17,18. Τα χαρακτηριστικά (αριθμός, σχήμα, μέγεθος) των χρωματοσωμάτων σε ένα κύτταρο αποτελούν τον καρυότυπο. Ο ανθρώπινος καρυότυπος περιλαμβάνει 46 χρωμοσώματα (44 αυτοσωμικά και δύο φυλετικά, XX στη γυναίκα και ΧΥ στον άνδρα). Το μέγεθος τους κυμαίνεται μεταξύ 1-5 μm 19. Ο ανθρώπινος καρυότυπος, συγκριτικά με άλλους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, βρίσκεται περίπου στη μέση αναφορικά με τον αριθμό και το μέγεθος των χρωμοσωμάτων 20. Βάσει του 18

19 μεγέθους και της σχετικής θέσης των κεντρομεριδίων, τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα στον αντρικό και γυναικείο καρυότυπο διακρίνονται σε 7 ομάδες (A-G), όπως παρατηρείται στην Εικόνα 1. Σύμφωνα με την ταξινόμηση αυτήν, η πρόοδος από την ομάδα Α προς την ομάδα G συνοδεύεται από μείωση του μεγέθους των χρωμοσωμάτων. Ως προς την θέση του κεντρομεριδίου, τα ζεύγη 1 και 3 της ομάδας Α και τα ζεύγη 19 και 20 της ομάδας F είναι μετακεντρικά, το ζεύγος 2 της ομάδας A, τα ζεύγη 4 και 5 της ομάδας Β, τα ζεύγη 6-12 της ομάδας C, τα ζεύγη της ομάδας Ε και το χρωμόσωμα Χ είναι μετακεντρικά ή υπομετακεντρικά, ενώ τα ζεύγη της ομάδας D, τα ζεύγη της ομάδας G και το χρωμόσωμα Υ είναι ακροκεντρικά και συνήθως φέρουν δορυφόρους 21. Εικόνα 1: Ανθρώπινος καρυότυπος ( 19

20 1.2. Κυτταρικός κύκλος ζωής Σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, η ικανότητα αύξησης και πολλαπλασιασμού εξαρτάται από διεργασίες που γίνονται στο κυτταρικό επίπεδο. Η διαίρεση και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, καθιστά αναγκαία την αντιγραφή του γενετικού τους υλικού (DNA), που ακολουθείται από τη διαίρεση του πυρήνα και το διαχωρισμό του κυτταροπλάσματος, προκειμένου να δημιουργηθούν δύο θυγατρικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει: τη μεσόφαση (interphase), που διακρίνεται σε τρείς επιμέρους φάσεις G1 (Gap), S (Synthesis), G2 (Gap 2), και την μίτωση (Μ: Mitosis) η οποία υποδιαιρείται στην πρόφαση, προμετάφαση, μετάφαση, ανάφαση, τελόφαση και την επακόλουθη διαίρεση του κυτταροπλάσματος ή κυτταροκίνηση D (Cell Division) 23. Αυτή η διαδοχική ενορχηστρωμένη διαδικασία εναλλαγής των φάσεων G1-S-G2-M-D είναι γνωστή ως κυτταρικός κύκλος ή κύκλος ζωής του κυττάρου 22. Ο πρώτος που χρησιμοποίησε τον όρο μίτωση (από τον ελληνικό όρο μίτος που σημαίνει νήμα) περιγράφοντας την διαδικασία διαίρεσης του πυρήνα ήταν ο Fleming, το Στην αρχική εκείνη παρατήρηση, τα κύτταρα εκτιμήθηκαν ως ανενεργά κατά τον υπόλοιπο κυτταρικό κύκλο, ο οποίος ονομάστηκε φάση ηρεμίας ή μεσόφαση 23. Η αρχική αυτή εκτίμηση για τη μεσόφαση αναθεωρήθηκε από μεταγενέστερες παρατηρήσεις, αφού κατά την διάρκειά της το κύτταρο παρουσιάζει έντονη δραστηριότητα καθώς προετοιμάζεται για την κυτταρική διαίρεση, με προεξάρχουσα την αντιγραφή του γενετικού υλικού που συμβαίνει κατά την διάρκεια της φάσης σύνθεσης S του DNA της μεσόφασης 24. Στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης, τα κύτταρα ακολουθούν επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιγραφής του DNA (φάση S), πυρηνικής και κυτταρικής διαίρεσης (φάση μίτωσης Μ) με πολύ μεγάλη ταχύτητα. Η διαδικασία αντιγραφής του DNA αρχίζει αμέσως μετά την ολοκλήρωση της μίτωσης και η χρονική διάρκεια ενός κυτταρικού κύκλου ζωής εκτιμάται πως είναι περίπου μισή ώρα 25. Με την πρόοδο της εμβρυογένεσης, η ανάγκη ελέγχου της σωστής δομής, διαμόρφωσης, αλλά και επιδιόρθωσης του DNA, ώστε να αποφευχθούν σφάλματα που θα μεταβιβαστούν στην επόμενη κυτταρική γενιά, επιφέρουν την εισαγωγή δυο 20

21 διορθωτικών φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Όπως παρατηρείται και στην διαγραμματική παράσταση του κυτταρικού κύκλου της εικόνας 2, οι απαιτούμενες επιδιορθώσεις του DNA, μπορούν να πραγματοποιηθούν, είτε κατά τη διάρκεια της φάσης G 1 (first gap φάση), η οποία μεσολαβεί ανάμεσα στην πυρηνική διαίρεση (Μ φάση) και την σύνθεση του DNA (S φάση), είτε κατά τη διάρκεια της φάσης G 2 (second gap Φάση), η οποία ακολουθεί τη φάση S 26. Ως αποτέλεσμα της διεύρυνσης του κυτταρικού κύκλου, αυξάνεται ο χρόνος ολοκλήρωσής του. Η σχετική διάρκεια της κάθε φάσης παρατίθεται ενδεικτικά στον Πίνακα 1. Πίνακας 1: Ενδεικτική χρονική διάρκεια φάσεων του κυτταρικού κύκλου Φάση κυτταρικού κύκλου Διάρκεια (ώρες) G S 6-10 G Μ 1-2 Εικόνα 2: Φάσεις του κυτταρικού κύκλου ( 21

22 Η φάση G 1 Η χρονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται κυρίως από τη φάση G 1. Η φάση αυτή επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από περιβαλλοντικούς παράγοντες και ποικίλει σημαντικά μεταξύ διαφόρων κυτταρικών τύπων, αλλά και μεταξύ κυττάρων του ίδιου πληθυσμού. Περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως ο περιορισμός θρεπτικών συστατικών, οδηγούν το κύτταρο από τη φάση G 1 στη φάση αναστολής (φάση G 0 ), η οποία θεωρείται τμήμα της G 1 φάσης και έχει διάρκεια από ημέρες έως και χρόνια. Τα κύτταρα που βρίσκονται σε αυτή τη φάση έχουν συνεχή δραστηριότητα, συνθέτουν πρωτεΐνες, κινούνται ή εκκρίνουν ουσίες. Αντιστοίχως, με την επίδραση κατάλληλων περιβαλλοντικών ερεθισμάτων, το κύτταρο μπορεί να μεταβεί και από τη από την φάση G 0 στην φάση G 1. Κατά τη διάρκεια της φάσης G 1, έχουν αναγνωριστεί δύο σημεία ελέγχου (checkpoints) της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, το σημείο περιορισμού (G 1 restriction checkpoint) και το σημείο ελέγχου για βλάβη του DNA (G 1 DNA damage checkpoint). Εφόσον δεν εμποδιστεί η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα σημεία αυτά, το κύτταρο, ανεξαρτήτως των περιβαλλοντικών συνθηκών, συνεχίζει και ολοκληρώνει τον κυτταρικό κύκλο Η φάση S Η χρονική διάρκεια της φάσης S, όπως και των ακόλουθων φάσεων G 2 και M, σε αντίθεση με τη φάση G 1, δεν επηρεάζεται από την επίδραση περιβαλλοντικών συνθηκών και είναι σταθερή και χαρακτηριστική για κάθε κυτταρικό τύπο, ενώ ποικίλει μεταξύ διαφορετικών τύπων κυττάρων 28. Στη φάση αυτή λαμβάνει χώρα η αντιγραφή του DNA. Η αντιγραφή των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων αρχίζει από πολλαπλά ανεξάρτητα σημεία (για το ανθρώπινο γονιδίωμα υπολογίζονται περίπου σε 2x ), λόγω του μεγάλου μεγέθους τους (κατά μέσο όρο 150x10 6 ζεύγη βάσεων). Η ύπαρξη των πολλών αυτών ανεξάρτητων σημείων έναρξης έχει ως αποτέλεσμα την ταχύτερη αντιγραφή του γενετικού υλικού. Η ταχύτητα αντιγραφής των νουκλεοτιδίων μπορεί να φτάσει σε 22

23 2000 νουκλεοτίδια/sec 29. Ωστόσο, αν θεωρητικά υπήρχε μόνο ένα σημείο έναρξης αντιγραφής, θα απαιτούνταν πολύ περισσότερος χρόνος. Υπολογίζεται ότι σε αυτήν την περίπτωση η πλήρης αντιγραφή μόνο ενός χρωμοσώματος θα απαιτούσε μέχρι και 800 ώρες, κάτι που θα είχε επίπτωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 18. Κατά τη διάρκεια της φάσης G 1 τα χρωμοσώματα τροποποιούνται, με σκοπό την προετοιμασία για την επόμενη φάση S, με προσκόλληση των πρωτεϊνών στα σημεία όπου πρόκειται να αρχίσει η αντιγραφή. Έτσι, σχηματίζονται αντιγραφικά συμπλέγματα (pre-replication complexes). Προκειμένου να αποτραπεί η διπλή αντιγραφή του ίδιου τμήματος του γενετικού υλικού μέσα στον ίδιο κυτταρικό κύκλο, στη φάση S, τα αντιγραφικά αυτά συμπλέγματα απενεργοποιούνται. Σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση των παραπάνω διαδικασιών διαδραματίζουν οι μεταβολές δραστηριότητας των κυκλινών (cyclins) και των αντίστοιχων κινασών (cyclindependent kinases) 30. Ως ρεπλικόνιο (replicon) ορίζεται όλη η χρωμοσωμική περιοχή της οποίας η αντιγραφή έχει ένα κοινό σημείο έναρξης. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, μια ομάδα ρεπλικονίων η οποία αντιγράφεται σε διαφορετικούς χρόνους μέσω μίας ασύγχρονης διαδικασίας στοιχειοθετεί μία αντιγραφική μονάδα. Γενικά, οι περιοχές ενεργού μεταγραφής του γονιδιώματος, καθώς και οι περιοχές που εκφράζουν γονίδια που είναι ενεργά σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού (γονίδια οικονομίας κυττάρου housekeeping genes), αντιγράφονται πρώτες κατά τη φάση S, ενώ οι περιοχές ανενεργού ετεροχρωματίνης (π.χ. η περιοχή του κεντρομεριδίου) αντιγράφονται αργότερα, προς το τέλος της φάσης S 15, Η φάση G 2 Ο έλεγχος πιθανών βλαβών και της ακεραιότητας της δομής του DNA, πριν το κύτταρο προχωρήσει στην επόμενη φάση της μίτωσης M, πραγματοποιείται κατά τη φάση G 2. Ένα από τα στάδια της φάσης G 2 είναι το σημείο ελέγχου βλαβών του DNA (G 2 DNA damage checkpoint). Κατά το στάδιο αυτό, στην περίπτωση ανίχνευσης γενετικής βλάβης ενεργοποιείται μια σειρά πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες απενεργοποιούν τις κινάσες που είναι υπεύθυνες για την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης 31. Ενδεχόμενη γονοτοξική επίδραση και βλάβη του γενετικού υλικού 23

24 ενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα p53 με αποτέλεσμα την ανακοπή της φάσης G 2 (G 2 arrest), ούτως ώστε, είτε να επιδιορθωθεί η βλάβη, είτε στην περίπτωση μη επιδιορθώσιμης βλάβης, το κύτταρο να οδηγηθεί σε απόπτωση 32. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση ή την αποτυχία ολοκλήρωσης του κυτταρικού κύκλου Η φάση της μίτωσης Μ Κατά τη διάρκεια της μίτωσης όπου συμβαίνει και η κυτταροκίνηση, τα χρωματοσώματα και το κυτταρόπλασμα διαιρούνται και σχηματίζονται δύο θυγατρικά κύτταρα. Η μίτωση διακρίνεται σε πέντε επιμέρους φάσεις, την πρόφαση, την προμετάφαση, τη μετάφαση, την ανάφαση και την τελόφαση. Αυτά τα μιτωτικά στάδια ακολουθούνται από τη φάση της κυτταροκίνησης (Εικόνα 3). Κατά την πρόφαση ξεκινά η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων. Στο κυτταρόπλασμα, λαμβάνουν χώρα μεταβολές της κινητικής των μικροσωληνίσκων, των οποίων ο χρόνος ημίσειας ζωής μειώνεται από 10 λεπτά σε 30 δευτερόλεπτα, και συνοδεύεται από διαχωρισμό των διπλασιασμένων κεντροσωματίων, καθένα από τα οποία συμμετέχει στο σχηματισμό του ενός πόλου της μιτωτικής ατράκτου. Στον πυρήνα επέρχεται ρήξη του πυρηνικού περιβλήματος και εξαφανίζεται ο πυρηνίσκος, γεγονός που υποδηλώνει την ελάττωση της μεταγραφικής δραστηριότητας, η οποία ολοκληρώνεται και παύει στο τέλος της πρόφασης 33. Κατά την προμετάφαση το πυρηνικό περίβλημα διαλύεται και γίνεται η τυχαία σύνδεση των χρωμοσωμάτων στους μικροσωληνίσκους που συνδέουν τους δύο πόλους της μιτωτικής ατράκτου. Τα χρωμοσώματα μετακινούνται με αργό ρυθμό στον ισημερινό του κυττάρου, ως αποτέλεσμα της σύνδεσης των κινητοχώρων τους με τους αντίθετους πόλους της μιτωτικής ατράκτου 34. Κατά τη μετάφαση ολοκληρώνεται η δέσμευση των χρωμοσωμάτων στα ινίδια της ατράκτου. Στο στάδιο του σημείου ελέγχου της μετάφασης (metaphase checkpoint) ή του σημείου ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoint) πραγματοποιείται ο έλεγχος του διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων και η πλήρης ευθυγράμμισή τους στην μιτωτική άτρακτο, έχοντας ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση διαχωρισμού των αδερφών χρωματίδων

25 Για τη μετάβαση του κυττάρου στην επόμενη φάση, την ανάφαση, προηγείται πρωτεολυτική αποδόμηση της πρωτεϊνης CLIP καθώς και άλλων μορίων, τα οποία ελέγχουν το ζευγάρωμα των αδερφών χρωματίδων. Η διαδικασία αυτή εξαρτάται από την τοποϊσομεράση-ιι. Ακολούθως, στο στάδιο της ανάφασης, πραγματοποιείται διαχωρισμός των αδερφών χρωματίδων και κίνησή τους προς τους δύο αντίθετους πόλους της μιτωτικής ατράκτου (ανάφαση Α), οι οποίοι στη συνέχεια απομακρύνονται μεταξύ τους (ανάφαση Β). Το στάδιο αυτό έχει τη μικρότερη χρονική διάρκεια, η οποία υπολογίζεται ότι διαρκεί μερικά λεπτά. Κατά την τελόφαση, τα χρωμοσώματα φθάνουν στους πόλους, αποσυσπειρώνονται και λαμβάνουν την χαρακτηριστική μορφή της μεσοφασικής χρωματίνης. Τέλος, δημιουργείται το πυρηνικό περίβλημα και ο πυρηνίσκος, σχηματίζοντας τον πυρήνα Η φάση της κυτταροκίνησης D Κατά την κυτταροκίνηση, οι δύο νεοδιαμορφωμένοι πυρήνες περιβάλλονται από τον συσταλτό δακτύλιο (contractile ring), ο οποίος αποτελείται από ακτίνη και μυοσίνη, διαχωρίζοντας το κυτταρόπλασμα στα δύο νέα κύτταρα. Εικόνα 3: Φάσεις της μίτωσης ( 25

26 2. Γενετικές βλάβες 2.1. Τύποι γενετικών βλαβών Οι γενετικές βλάβες διαχωρίζονται στις αυτόματες, αν τα αίτιά πρόκλησής τους δεν είναι γνωστά, και τις προκλητές, αν οφείλονται στην επίδραση γνωστών μεταλλαξιογόνων παραγόντων. Με βάση την έκταση της βλάβης, διακρίνονται σε εκτεταμένες και περιορισμένης έκτασης. Οι εκτεταμένες γενετικές βλάβες ονομάζονται χρωμοσωμικές ατυπίες και μπορούν να γίνουν ορατές μερικές φορές και με το οπτικό μικροσκόπιο. Οι περιορισμένης έκτασης γενετικές βλάβες ονομάζονται μεταλλάξεις, δεν είναι ορατές και μπορεί να αφορούν ακόμη και ένα μόνο νουκλεοτίδιο (σημειακές). Με βάση την εκδήλωση των βλαβών, οι γενετικές βλάβες διακρίνονται σε δομικές και ποσοτικές 36 (Εικόνα 4). Στις δομικές βλάβες του DNA περιλαμβάνονται 37 : 1. Τροποποίηση βάσεων (π.χ. μεταστροφή: αντικατάσταση πουρίνης από πυριμιδίνη, Α από C, ή G από, ή T ή Α από Τ, ή G από C ή μετάπτωση: αντικατάσταση πουρίνης από πουρίνη, Α από G και πυριμιδίνης από πυριμιδίνη, C απόt) 2. Σχηματισμός διμερών πυριμιδινών (δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ γειτονικών μορίων πυριμιδινών, κυρίως Τ) 3. Αποπουρίνωση (διάσπαση του Ν-γλυκοσιδικού δεσμού μεταξύ πουρίνης και δεοξυριβόζης και απώλεια πουρίνης) 4. Απαμίνωση (οπότε μετατρέπεται συνήθως η C σε U) Στις ποσοτικές βλάβες του DNA περιλαμβάνονται 37,38 : 1. Έλλειψη ή προσθήκη νουκλεοτιδίων (deletion ή insertion). Όταν η προσθήκη ή απαλοιφή νουκλεοτιδίων δεν είναι ακριβές πολλαπλάσιο του τρία σε περιοχή κωδικοποίησης του DNA, προκαλείται μετατόπιση ολόκληρου του πλαισίου μεταγραφής του mrna (frameshiftmutation), μεταβάλλοντας ολόκληρη την αλληλουχία αμινοξέων από το σημείο της μετάλλαξης και μετά. 26

27 2. Χημική προσθήκη, παρεμβολή (intercalation) μεταξύ των βάσεων του DNA 3. Σχηματισμός χιαστών δεσμών i) εσωτερικών (μεταξύ βάσεων των δύο αλυσίδων) ii) εξωτερικών (μεταξύ βάσεων της ίδιας αλυσίδας) iii) συνδετικών μεταξύ DNA και πρωτεϊνών (crosslinks) 4. Μονόκλωνες ή δίκλωνες θραύσεις-ρήξεις στο μόριο του DNA υπό την επίδραση κλαστογόνων παραγόντων. Ο κάθε παράγοντας μπορεί να προκαλέσει διαφορετικού τύπου βλάβες. Ακολουθεί η κατάταξη των αρχικών βλαβών που προκαλούνται από την επίδραση διαφόρων παραγόντων, όπως δημιουργήθηκε από τον Cleaver το : 1. Υπεριώδης ακτινοβολία Διμερή πυριμιδίνης 2. Αλκυλιωτικοί παράγοντες Αλκυλίωση 3. Αλκυλιωτικοί παράγοντες Αποπουρίνωση 4. BrdU, νιτρικό οξύ Λάθος ενσωμάτωση βάσεων 5. Ιονίζουσα ακτινοβολία, αλκυλιωτικοί παράγοντες Θραύση αλυσίδων 6. Αλκυλιωτικοί παράγοντες διπλής δράσης (bifunctional) Χιαστές συνδέσεις (δεσμοί) 7. Πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες, ακριδίνη Παρεμβολή μεταξύ των βάσεων 8. Καφεΐνη, θεοφυλλίνη, 3-αμινοβενζαμίδιο Αναστολή επιδιόρθωσης του DNA 27

28 Εικόνα 4: Τύποι βλαβών του DNA και μηχανισμοί επιδιόρθωσης (Courtesy of Nature Reviews, Cancer) 2.2. Μηχανισμοί επιδιόρθωσης γενετικών βλαβών Οι κύριοι μηχανισμοί επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA των ευκαριωτικών κυττάρων 40 είναι οι ακόλουθοι: 1. Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair, RR) 2. Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair, BER) 3. Αναντίστοιχη επιδιόρθωση (Mismatch Repair, MMR) 4. Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair, NER) 5. Επιδιόρθωση διπλόκλωνου σπασίματος του DNA (DNA Double-Strand Break Repair) Από τους ανωτέρω μηχανισμούς, η επιδιόρθωση με ανάταξη συναντάται τόσο σε προκαρυωτικά όσο και ευκαριωτικά κύτταρα, ενώ οι υπόλοιποι συναντούνται κυρίως σε ευκαρυωτικά κύτταρα. 28

29 Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair, RR) Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης, η επιδιόρθωση ενός σταδίου από την Ο 6 μεθυλογουανίνη-dna μεθυλοτρανσφεράση (single step repair by MGMT), η ανάταξη βλάβης του DNA από τα ομόλογα της AlkB και η φωτοεπιδιόρθωση (photoreactivation). Ο πρώτος μηχανισμός ενεργοποιείται με στόχο την επιδιόρθωση σημειακών βλαβών που είναι συνέπεια αλκυλιωτικών παραγόντων, όπως είναι η περίπτωση βλάβης με την δημιουργία Ο 6 -αλκυλογουανίνης (π.χ. Ο 6 μέθυλο- ή αίθυλο-γουανίνη), που μετατρέπει το ζεύγος GC σε AT 41. Ο δεύτερος μηχανισμός ενεργοποιείται με στόχο την επιδιόρθωση βλαβών που σχετίζονται με τη μεθυλίωση της μίας (single stranded), ή και των δύο (double stranded) αλυσίδων του DNA, υπό την επίδραση ομόλογων πρωτεϊνών της οικογένειας AlkB (AlkB 1, AlkB 2, AlkB 3 ) 42. Ο τρίτος από τους μηχανισμούς της επιδιόρθωσης με ανάταξη ενεργοποιείται με στόχο την αποκατάσταση βλαβών που έχουν προκληθεί ως συνέπεια υπεριώδους ακτινοβολίας. Οι βλάβες αυτές σχετίζονται με την δημιουργία διμερών πυριμιδίνης, τα οποία διασπώνται σε μονομερή μέσω της δράσης πρωτεϊνών της οικογένειας των φωτολυασών/κρυπτοχρωμάτων. Η σύνδεση των φωτολυασών γίνεται στο σημείο βλάβης του DNA με μηχανισμούς ανεξάρτητους από το φως. Η αντίδραση όμως επιδιόρθωσης προϋποθέτει την επίδραση της ενέργειας φωτός μήκους κύματος nm. Οι φωτολυάσες δεν έχουν ανιχνευθεί στον άνθρωπο, αλλά εντοπίζονται μόνο σε κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και σε ορισμένα φυτά. Στον άνθρωπο, έχουν εντοπιστεί κάποιες ομόλογες πρωτεΐνες των φωτολυασών, οι οποίες συμμετέχουν στη ρύθμιση του κιρκάδιου ρυθμού όχι όμως στη διαδικασία επιδιόρθωσης του DNA Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair, BER) Η ενεργοποίηση του μηχανισμού αυτού πραγματοποιείται με σκοπό την απομάκρυνση κατεστραμμένων βάσεων του DNA, τις οποίες έχουν αναγνωρίσει ειδικά ένζυμα, οι DNA γλυκοζυλάσες. Οι κυριότερες βλάβες που υπόκεινται σε αυτόν 29

30 το μηχανισμό προκύπτουν τυχαία εντός του κυττάρου, μέσω παραγωγής ελευθέρων ριζών προερχόμενων από τον κυτταρικό μεταβολισμό ή από φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Επίσης, εξωγενείς παράγοντες, όπως η ακτινοβολία, και αλκυλιωτικοί παράγοντες ενδέχεται να προκαλέσουν τη συγκεκριμένου τύπου βλάβη του γενετικού υλικού 44. Η επιδιορθωτική αυτή διαδικασία υλοποιείται με τα ακόλουθα 5 βήματα: 1. Αναγνώριση της βλάβης της αζωτούχου βάσης, απομάκρυνση της βάσης και διάνοιξη. Το πρώτο βήμα πραγματοποιείται από τις DNA γλυκοζυλάσες, οι οποίες αναγνωρίζουν και απομακρύνουν την λάθος βάση με υδρόλυση του Ν- γλυκοσιδικού δεσμού 45. Στα κύτταρα των θηλαστικών έχουν αναγνωριστεί 11 διαφορετικές γλυκοζυλάσες με διαφορετική εξειδίκευση υποστρωμάτων και διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης 44. Αυτές διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: στην κατηγορία Ι ανήκουν εκείνες που απομακρύνουν την κατεστραμμένη βάση αφήνοντας μια απουρινική/απυριμιδινική ΑΡ (apurinic/apyrimidinic) περιοχή στο DNA, ενώ στην κατηγορία ΙΙ ανήκουν οι γλυκοζυλάσες, οι οποίες μετά την απομάκρυνση της βάσης διασπούν την περιοχή ΑΡ με μία ενδογενή 3 ενδονουκλεάση, δημιουργώντας μονόκλωνη θραύση στην περιοχή. 2. Εισαγωγή νουκλεοτιδίου. Η εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου είναι ανεξάρτητη από την χημική δομή της ΑΡ περιοχής. 3. Επιλογή απομάκρυνσης μικρής ή μεγάλης έκτασης νουκλεοτιδίων που εμπεριέχουν τη βλάβη (short or long patch BER). Η απομάκρυνση του 5' drp (5 deoxyribose-5phosphate) που ακολουθεί την εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου καθορίζει και το μέγεθος της έκτασης της επιδιόρθωσης με εκτομή βάσης. 4. Αποκατάσταση της μονόκλωνης θραύσης και επιδιορθωτική σύνθεση DNA με μεγάλης έκτασης BER. Με την δράση των πολυμερασών δ και ε (ΡοΙ δ και ΡοΙ ε ), σε συνεργασία με τις ΡCNA και RF-C μπορεί να επιτευχθεί επέκταση της επιδιόρθωσης σε μεγαλύτερα τμήματα που μπορεί να φθάνουν και τα 10 νουκλεοτίδια Σύγκλιση (ligation). Στο στάδιο αυτό συμμετέχουν οι DNA λιγκάσες I και III. Η λιγκάση I αλληλεπιδρά με τις ΡοΙ β και PCNA, στην περίπτωση επιδιόρθωσης 30

31 μεγάλης έκτασης βλαβών, ενώ η λιγκάση III αλληλεπιδρά κυρίως με τις ΡοΙ β και PARP-1 (poly (ADP-ribose) polymerase I) στις μικρής έκτασης επιδιορθώσεις Αναντίστοιχη Επιδιόρθωση (Mismatch Repair, MMR) Η ενεργοποίηση του μηχανισμού αυτού γίνεται με σκοπό την απομάκρυνση μη συμπληρωματικών βάσεων που προκύπτουν είτε από λάθη κατά την αντιγραφή, είτε από τυχαία ή προκλητή απαμίνωση, οξείδωση ή μεθυλίωση των βάσεων 48. Κύριοι στόχοι της MMR είναι τα λανθασμένα ζεύγη βάσεων όπως τα G/T (που προκύπτουν από την απαμίνωση της 5-μεθυλ-κυτοσίνης), καθώς και τα G/G, A/C και C/C. Η διαδικασία επιδιόρθωσης μη συμπληρωματικής βάσης πραγματοποιείται με τα ακόλουθα 3 βήματα: 1. Αναγνώριση των βλαβών του DNA. Το σύμπλεγμα MutSa, που περιλαμβάνει τις ομόλογες πρωτεΐνες MSΗ 2 και MSH 6, αναγνωρίζει τις χημικά αλλοιωμένες βάσεις. Προϋπόθεση της αποτελεσματικής σύνδεσης του συμπλέγματος με τις περιοχές λάθους είναι η φωσφορυλίωσή του. Λόγω του ότι κάθε σύμπλεγμα έχει διαφορετικά υποστρώματα, έχει και διαφορετική συμμετοχή στην διαδικασία MMR. 2. Διάκριση μεταξύ μητρικής και θυγατρικής αλυσίδας του DNA. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η διάκριση της μητρικής από τη θυγατρική αλυσίδα του DNA δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Τα δύο μοντέλα που έχουν προταθεί αναγνωρίζουν τη συμμετοχή του ΑΤΡ στη διαδικασία. 3. Εκτομή και επιδιορθωτική σύνθεση. Μετά τη σύνδεση του συμπλέγματος MutSa με την περιοχή της λανθασμένης βάσης, όπως περιγράφηκε παραπάνω, ακολουθεί αλληλεπίδραση με το MutL, ένα άλλο ετεροδιμερές σύμπλεγμα που περιλαμβάνει τις ομόλογες επιδιορθωτικές πρωτεΐνες ML H1 και PM S2. Με τη δράση της εξωνουκλεάσης I γίνεται εκτομή του λανθασμένου τμήματος DNA και η νέα σύνθεση DNA πραγματοποιείται από την πολυμεράση δ. 31

32 Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair, NER) Ο μηχανισμός αυτό ενεργοποιείται για την επισκευή μεγάλων βλαβών του DNA, οι οποίες έχουν προκληθεί από την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας. Τα ποικίλα φωτοπροϊόντα (6-4 photoproducts) διμερή πυριμιδίνης, οι χιαστές συνδέσεις εντός της ίδιας αλυσίδας (cross links) και οι μεγάλες χημικές προσθήκες (adducts) που προκαλούνται από γονοτοξικούς παράγοντες, όπως η α-τοξίνη, το βενζοπυρένιο κ.α. αποτελούν τους πιο συχνούς τύπους τέτοιων βλαβών 49. Η διαδικασία αυτή διακρίνεται σε δύο τύπους, τη γενική επιδιόρθωση του γονιδιώματος (Global Genomic Repair, GGR) και την επιδιόρθωση συνδεδεμένη με τη μεταγραφή (Transcription Coupled Repair, TCR). Η γενική επιδιόρθωση είναι ανεξάρτητη από τη μεταγραφή και απομακρύνει βλάβες που βρίσκονται σε μη μεταγραφόμενες περιοχές του γονιδιώματος ή στο μη μεταγραφόμενο τμήμα μεταγραφόμενων περιοχών. Αντίθετα, η επιδιόρθωση συνδεδεμένη με τη μεταγραφή απομακρύνει βλάβες με ανασταλτική δράση στην RNA-πολυμεράση από τις μεταγραφόμενες περιοχές των ενεργών γονιδίων 50. Τα στάδια του μηχανισμού γενικής επιδιόρθωσης του γονιδιώματος είναι τα ακόλουθα: 1. Αναγνώριση της βλάβης του DNA. 2. Ξεδίπλωμα του DNA (DNA unwinding). 3. Αποκοπή της βλάβης. 4. Επιδιορθωτική σύνθεση του DNA. Τα στάδια του μηχανισμού της συνδεδεμένης με τη μεταγραφή επιδιόρθωσης είναι τα ακόλουθα: 1. Αναστολή της RNA-πολυμεράσης II (RNA-PII). 2. Αποκοπή της βλάβης. 3. Επιδιορθωτική σύνθεση του DNA. 32

33 Επιδιόρθωση διπλόκλωνων θραύσεων του DNA (μετα-αντιγραφική επιδιόρθωση, DNA double strand breaks) Η διπλή θραύση των δύο αλυσίδων του DNA αποτελεί την πιο επικίνδυνη γονοτοξική βλάβη, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρού βαθμού χρωμοσωμικές ανωμαλίες (θραύσεις χρωμοσωμάτων, μετατοπίσεις, ανταλλαγές κ.α.) ή ακόμα και τον κυτταρικό θάνατο 51. Για το λόγο αυτό η άμεση και αποτελεσματική επιδιόρθωση της βλάβης έχει ιδιαίτερη βιολογική σημασία. Η επιδιόρθωση των διπλόκλωνων θραύσεων του DNA γίνεται με δύο τύπους μηχανισμών, είτε με τη μη ομόλογη σύνδεση των άκρων (non homologous endjoining, NHEJ) είτε με τον ομόλογο ανασυνδυασμό (homologous recombination, HR). Η επιλογή του τύπου επιδιόρθωσης σχετίζεται μεταξύ άλλων και με την φάση του κυτταρικού κύκλου, στην οποία προκύπτει η βλάβη. Στη φάση G 0 /G 1 κυρίως πραγματοποιείται η μη ομόλογη σύνδεση, ενώ ο ομόλογος ανασυνδυασμός συμβαίνει προς το τέλος της S ή της G 2 φάσης, καθώς απαιτείται να έχει προηγηθεί ο αναδιπλασιασμός του DNA και ο σχηματισμός των δύο αδερφών χρωματίδων 52. Στη μη ομόλογη σύνδεση των άκρων, τα άκρα των θραυσμένων χρωμοσωμάτων συνδέονται, χωρίς να εξασφαλίζεται απαραίτητα η ομολογία των βάσεων στα σημεία σύνδεσης, με αποτέλεσμα να υπάρχει το ενδεχόμενο λαθών και απώλειας γενετικής πληροφορίας. Στον ομόλογο ανασυνδυασμό, το μη κατεστραμμένο τμήμα DNA της αδερφής χρωματίδας γειτνιάζει με το ομόλογο τμήμα DNA με την βλάβη και λειτουργεί ως πρότυπο για την διαδικασία επιδιόρθωσης, με αποτέλεσμα ο τύπος αυτός να είναι απαλλαγμένος από το ενδεχόμενο λαθών. 33

34 Β. ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 1. Μέθοδοι εκτίμησης γενετικών βλαβών Όπως αναφέρεται και παραπάνω, ποικίλες βλάβες του γενετικού υλικού μπορεί να είναι αποτέλεσμα επίδρασης πλήθους χημικών, φυσικών (ακτινοβολίες) και βιολογικών (ιοί, μικρόβια και προϊόντα αυτών) παραγόντων. Μερικές από τις βλάβες ενδέχεται να μην καταστεί δυνατό να επιδιορθωθούν. Η πιθανή επίδραση κάθε παράγοντα και οι επαγόμενες βλάβες ελέγχονται και ανιχνεύονται με κυτταρογενετικές, βακτηριδιακές (δοκιμασία ελέγχου κατά AMES) και βιοχημικέςανοσοϊστοχημικές μεθόδους ανίχνευσης. Δεδομένου ότι η παρούσα διατριβή εστιάζει το ενδιαφέρον της στην κυτταρογενετική επίδραση (επίδραση στη δομή και τη λειτουργία του DNA) συγκεκριμένων αντιψυχωσικών (χημικών) παραγόντων, στη συνέχεια θα γίνει αναφορά στις κυριότερες διαθέσιμες κυτταρογενετικές μεθόδους, οι οποίες είναι οι ακόλουθες: 1. Xρωματιδιακές ανταλλαγές (Sister Chromatid Exchanges, SCEs) 2. Χρωμοσωμικές ατυπίες (Chromosome Aberrations, CA) 3. Μικροπυρήνες (Micronuclei test, MT) 4. Δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Proliferation Rate Index, PRI) 5. Μιτωτικός δείκτης (Mitotic Index, MI) Ένα από τα πλεονεκτήματα, το οποίο αποτελεί και κοινό χαρακτηριστικό των μεθόδων αυτών είναι το ότι διεξάγονται κυρίως σε δείγματα περιφερικού αίματος και ειδικότερα σε πληθυσμούς λεμφοκυττάρων. Προστίθενται μερικές σταγόνες ολικού αίματος (10-12) σε ειδικό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία βρωμιοδεοξυουριδίνης (BrdU) και ειδικών μέσων χρώσης και ακολούθως επωάζονται για 3-4 ημέρες. Τα Τ- λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται με διαδοχικές μιτωτικές διαιρέσεις, απομονώνονται τα χρωμοσώματά τους και παρατηρούνται με οπτικό μικροσκόπιο. 34

35 2. Χρωματιδιακές ανταλλαγές (Sister Chromatid Exchanges, SCEs) 2.1. Ιστορική αναδρομή ορισμοί Χρωματιδιακές ανταλλαγές (Sister Chromatid Exchanges, SCEs) ονομάζονται οι ανταλλαγές τμημάτων γενετικού υλικού μεταξύ γονιδιακά ομόλογων θέσεων δύο αδελφών χρωματίδων, οι οποίες βρίσκονται σε φάση αντιγραφής πριν από τον διαχωρισμό τους σε δύο αυτοτελή χρωμοσώματα. Προκειμένου να δημιουργηθούν οι ανταλλαγές αυτές, απαιτείται ρήξη και επανασυγκόλληση ανάμεσα στους δύο κλώνους του DNA 54. Οι SCEs μπορούν να διατηρηθούν για πολλούς κυτταρικούς κύκλους, καθώς δεν έχει διαπιστωθεί να επιφέρουν κυτταρικό θάνατο 55. Πρώτοι ο J. Herbert Taylor και οι συνεργάτες του παρατήρησαν το φαινόμενο των SCEs. Μετά από ενσωμάτωση στο DNA σεσημασμένης με ραδιενεργό τρίτιο θυμιδίνης [ 3 Η], μελέτησαν αυτοραδιογραφικά την διαφοροποίηση των αδελφών χρωματίδων και παρατήρησαν την μεταβίβαση των σεσημασμένων χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα με ημισυντηρητικό τρόπο. Μετά από 15 χρόνια, η μέθοδος εξελίχθηκε από την ομάδα των Zakharov και Egolina, οι οποίοι χρησιμοποίησαν εναλλακτικά την 5-βρωμιοδεοξυουριδίνη (BrdU), ένα ανάλογο της θυμίνης, την οποία ενσωμάτωσαν στο DNA λεμφοκυττάρων σινικού κρικητού (1972) 57. Παρατήρησαν πως, αφού πραγματοποιηθούν δύο μιτωτικοί κύκλοι παρουσία BrdU, και μετά από χρώση των χρωματοσωμάτων με Giemsa, οι δύο αδελφές χρωματίδες διαφοροποιούνται, με αποτέλεσμα οι χρωματιδιακές ανταλλαγές 58 να καθίστανται ορατές κατά τη μετάφαση της δεύτερης μιτωτικής διαίρεσης. Το ,60, ο Latt με τη χρησιμοποίηση της φθορίζουσας χρωστικής Hoechst πέτυχε μεγαλύτερη ευκρίνεια των SCEs σε εφαρμογή επί ανθρωπίνων πλέον λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος. Το , οι Wolff, Bodycotte και Painter εξέτασαν την επαγωγή των SCEs σε κινέζικα χάμστερ με την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας και ανακάλυψαν πως οι ανταλλαγές μπορούν να πραγματοποιηθούν μόνο σε χρωμοσώματα που υφίστανται ή είναι έτοιμα να υποστούν αντιγραφή, αλλά δεν πραγματοποιούνται σε χρωμοσώματα μετά την αντιγραφή. Επιπλεόν, την ίδια χρονική περίοδο, οι Wolff και Perry χρησιμοποίησαν 35

36 τον συνδυασμό χρωστικής Hoechst με υπεριώδη ακτινοβολία και τελική χρώση των αδελφών χρωματίδων με Giemsa (τεχνική FPG, Fluorescence Plus Giemsa) 62. Η χρήση αλκαλικών διαλυμάτων, που κατέστησε πιο ευδιάκριτες τις SCEs, η βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης της χρωστικής Hoechst 33258, των τιμές του pη του καλλιεργητικού υλικού, της θερμοκρασία και του μήκους κύματος έκθεσης των χρωματίδων στην υπεριώδη ακτινοβολία αποτελούν σημαντική εξέλιξη της μεθόδου 63. Η μεταγενέστερη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων IgG έναντι του σεσημασμένου με BrdU μονόκλωνου DNA, επέφερε επιπλέον αλλαγή των δεδομένων στη μελέτη των SCEs Τεχνική και εκτίμηση των SCEs Η μέθοδος ανίχνευσης των SCEs είναι μια ιδιαίτερα ευαίσθητη κυτταρογενετική μέθοδος ελέγχου βλαβών του γενετικού υλικού και πιθανής γονοτοξικής επίδρασης ουσιών, ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Η μέθοδος αυτή διαθέτει υψηλή ακρίβεια και αξιοπιστία, ενώ παράλληλα δεν απαιτεί χρόνο και κόστος. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν κύτταρα από θηλαστικά, φυτά, διάφορους ιστούς, ακόμα και καρκινικά κύτταρα. Η μελέτη μπορεί να περιλαμβάνει την διερεύνηση της in vitro γονοτοξικής βλάβης παραγόντων ή ουσιών σε καλλιέργειες, αλλά και της in vivo γονοτοξικής επίδρασης σε ζώντες οργανισμούς (πειραματόζωα). Για την εκτίμηση των SCEs, πιο ενδεδειγμένη και ιδιαίτερα διαδεδομένη σε κυτταρογενετικές μελέτες είναι η χρήση ανθρώπινων λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος. Τα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα παρουσιάζουν συγκριτικά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλους κυτταρικούς τύπους 65 : 1. Οι πειραματικές συνθήκες, όπως ο χρόνος προσθήκης των υπό μελέτη ουσιών, η συγκέντρωση ουσιών και η διάρκεια έκθεσης των κυττάρων (στα in vitro πειράματα) μπορούν να καθοριστούν εύκολα χωρίς ιδιαίτερες απαιτήσεις, καθώς επίσης ως πειραματικό υλικό είναι προσιτό και άφθονο. 2. Στα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα παρατηρούνται ελάχιστες χρωματιδιακές ανταλλαγές. 36

37 3. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκτός από την in vitro και για την in vivo μελέτη πιθανής γονοτοξικής επίδρασης παραγόντων. 4. Από τα έμμορφα στοιχεία του περιφερικού αίματος, μόνο τα Τ- λεμφοκύτταρα της φάσης G 0 του κυτταρικού κύκλου έχουν την δυνατότητα να πολλαπλασιάζονται υπό την επίδραση κατάλληλου μιτογόνου παράγοντα, όπως είναι η φυτοαιμοσυγκολλητίνη Τα λεμφοκυττάρα κυκλοφορούν σε όλους τους ιστούς του σώματος και ένα ποσοστό τους έχει μεγάλη διάρκεια ζωής, με αποτέλεσμα να υφίστανται συνεχώς και αθροιστικά την επίδραση διαφόρων εξωτερικών παραγόντων (π.χ. ακτινοβολίες). Έτσι, αποτελούν το δ ο σ ί μ ε τ ρ o της γονοτοξικής έκθεσης του οργανισμού, καθώς κάθε βλάβη που παρατηρείται σε αυτά αντανακλά την αντίστοιχη βλάβη που έχουν υποστεί όλα τα κύτταρα του οργανισμού Είναι εφικτό, με την χρήση μικροσωματίων ήπατος ή άλλων μεταβολικών ενζύμων, όπως το S-9 mix κατά AMES, να μελετηθεί η δράση των προϊόντων μεταβολισμού ποικίλων χημικών ουσιών, τα οποία ενδέχεται να εμφανίζουν διαφοροποιημένη γονοτοξική επίδραση συγκριτικά με τις αρχικές ουσίες Τα λεμφοκύτταρα έχουν αντίστοιχους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς με τα καρκινικά κύτταρα. Έτσι, η χρήση λεμφοκυττάρων ενδείκνυται για την εκτίμηση της ευαισθησίας, των παρενεργειών και της αποτελεσματικότητας πιθανών χημειοθεραπευτικών σχημάτων 69. Για να μπορούν να είναι ορατές και παρατηρήσιμες οι χρωματιδιακές ανταλλαγές, απαραίτητη προϋπόθεση είναι η αντικατάσταση της θυμιδίνης από την BrdU και η ενσωμάτωση της δεύτερης στο DNA κατά τη διάρκεια τουλάχιστον του πρώτου από δύο συνεχείς κυτταρικούς κύκλους. Οι SCΕs της πρώτης φάσης S του κυτταρικού κύκλου γίνονται ορατές μόνο μετά την δεύτερη φάση S 2. Αυτό συμβαίνει εξαιτίας του ημισυντηρητικού τρόπου αναδιπλασιασμού του DNA, του αυστηρού περιορισμού της επανασυγκόλλησης μεταξύ των τεσσάρων αλυσίδων κατά την διαδικασία της ανταλλαγής, συνεπεία της πολικότητας του DNA, και λόγω της τυχαίας κατανομής των χρωματίδων στα νέα κύτταρα. 37

38 Με την παρουσία της BrdU κατά την διάρκεια δύο κυτταρικών κύκλων καθίστανται ορατές όλες οι SCEs που συνέβησαν στην συνολική διάρκεια των δύο αυτών μιτωτικών κύκλων 70. Στη μετάφαση της δεύτερης μιτωτικής διαίρεσης, οι δύο αδερφές χρωματίδες των χρωμοσωμάτων είναι διαφορετικά χρωματισμένες. Στην περίπτωση που τα χρωμοσώματα δεν φέρουν ανταλλαγές, η μία χρωματίδα φαίνεται ωχρή και η άλλη σκούρη, ενώ εάv έχουν επισυμβεί ανταλλαγές, παρατηρούνται στην κάθε χρωματίδα ωχρές και σκούρες περιοχές 71. Η περιοχή που στη μία χρωματίδα φαίνεται σκούρα, στην αδελφή χρωματίδα θα εμφανίζεται ωχρή (Εικόνα 5 και 6). Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση των SCEs ( 38

39 Εικόνα 6: Φωτογραφία των SCEs, όπου φαίνονται οι εναλλαγές σκούρων και ωχρών ομόλογων περιοχών των χρωματίδων στη μετάφαση της 2 ης μίτωσης. ( Προκειμένου να επιτευχθεί η οπτικοποίηση των SCEs τα λεμφοκύτταρα καλλιεργούνται παρουσία BrdU, η οποία αντικαθιστά τη θυμιδίνη στη φάση της αντιγραφής του DNA. Αφού ολοκληρωθούν δύο μιτωτικοί κύκλοι, εφαρμόζεται η χρώση των χρωμοσωμάτων με την φθορίζουσα χρωστική Hoechst και ακολουθεί έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία. Τέλος, τα χρωμοσώματα βάφονται με τη χρωστική Giemsa. Με την διαδικασία αυτή, οι χρωματίδες καθίστανται ιδιαίτερα ευδιάκριτες, καθώς, η χρωματίδα στην οποία έγινε διπλή αντικατάσταση από την BrdU, εμφανίζεται ωχρή (η BrdU μειώνει το φθορισμό της χρωστικής Hoechst), ενώ αντίθετα, όπου έγινε μονή αντικατάσταση από την BrdU, η χρωματίδα εμφανίζεται σκούρη

40 2.3. Αυτόματες και προκλητές SCEs Οι χρωματιδιακές ανταλλαγές διακρίνονται σε προκλητές, όταν δημιουργούνται ως αποτέλεσμα επίδρασης κάποιου γνωστού γονοτοξικού παράγοντα και σε αυτόματες, όταν προκαλούνται χωρίς την παρουσία βλαπτικού παράγοντα. Πολλά εργαστήρια έχουν μελετήσει τη συχνότητα των SCEs, με σκοπό την αποσαφήνιση των φυσιολογικών ορίων, τα οποία θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την συγκριτική μελέτη της επίδρασης γονοτοξικών παραγόντων 73. Η ενσωμάτωση της BrdU στη δομή του DNA καθιστά ορατές τις αυτόματες SCEs κάτι που επαληθεύεται και από τις εργασίες των Natarajan και Obe 74 με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων IgG. Μελέτες σε μύες (επίμυες, σινικούς κρικητούς) και σε φυτικά κύτταρα φακής κατέδειξαν ότι οι αυτόματες SCEs έχουν ένα εύρος 0,05-0,08 SCEs/pg DNA ανά μιτωτικό κύκλο 75. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται μεγάλη διακύμανση του μέσου όρου της συχνότητας τ ω ν SCEs μεταξύ διαφόρων δειγμάτων πληθυσμού, η οποία κυμαίνεται από 5-14 SCEs α ν ά κ ύ τ τ α ρ ο 53. Σύμφωνα με τον Kanda η συνήθης συχνότητα των αυτόματων SCEs κυμαίνεται μεταξύ 1,5-2 ανά κύτταρο και εξαρτάται από το D Ν Α κάθε κυττάρου 76. Οι διαφορές αυτές μπορεί να οφείλονται είτε σε πραγματικές διαφορές στα υπό μελέτη δείγματα των αντίστοιχων πληθυσμών, λόγω ιδιοσυγκρασιακών, γενετικών ή περιβαλλοντικών παραγόντων είτε στις διαφορετικές μεθόδους αξιολόγησης. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι σε μια εκτενή αξιολόγηση των Morgan και Crossen, οι οποίοι μελέτησαν πάνω από 1000 κύτταρα σε 50 υγιή άτομα, διαπίστωσαν ότι η μέση συχνότητα ήταν 7,9 SCEs ανά κύτταρο, με μεγάλη, όμως, διακύμανση της τάξης 1-21 SCEs ανά κύτταρο 77. Στη μελέτη των Bender και συνεργατών, η μέση συχνότητα ήταν 8,29 SCEs ανά κύτταρο 78, ενώ μελέτες σε δείγμα ε λ λ η ν ι κ ο ύ π λ η θ υ σ μ ο ύ υγιών εθελοντών και των δύο φύλων, ηλικίας ετών, κατέδειξαν ότι η μ έ σ η σ υ χ ν ό τ η τ α ή τ α ν 9,3 SCEs ανά κύτταρο με διακύμανση από 4,3-14,4 SCEs ανά κύτταρο 53. Όσον αφορά το κατά πόσο παράγοντες όπως το φύλο και η ηλικία επηρεάζουν τη συχνότητα των SCEs, οι Bolognesi και συνεργάτες 82 αναφέρουν πως όσο αυξάνεται η ηλικία αυξάνεται και η συχνότητα των χρωματιδιακών ανταλλαγών, ενώ, όπως αναφέρεται στις μελέτες των Alhadeff και συνεργάτών 79, Morgan και συνεργάτών 80 και Bonassi και συνεργάγτών 81, το φύλο δεν επηρεάζει τη συχνότητά 40

41 τους. Άλλοι παράγοντες όπως ο αλκοολισμός 83, το κάπνισμα 84 και η χρόνια χρήση ινδικής κάνναβης 85 και ηρωίνης 86 φαίνεται να αυξάνουν σημαντικά την συχνότητα των SCEs, χωρίς όμως η επίδραση αυτή να επηρεάζεται από την ηλικία των χρηστών. Η BrdU σε υψηλές συγκεντρώσεις μπορεί να προκαλέσει αύξηση της συχνότητας των SCEs, ενώ σε χαμηλές συγκεντρώσεις, έως και 10μg/ml, δεν επηρεάζει ή προκαλεί ασήμαντη αύξηση της συχνότητας. Σε περιπτώσεις ιογενών λοιμώξεων και ασθενών που πάσχουν από κληρονομικά νοσήματα (π.χ. σύνδρομο Bloom 88, αναιμία Fanconi, μελαγχρωματική ξηροδερμία και αταξία-τηλεαγγειεκτασία), όπου παρατηρούνται υψηλή χρωμοσωμική ευθραυστότητα, μεγάλη αστάθεια του γονιδιώματος και ανεπάρκεια των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA 89, αυξάνεται η συχνότητα των χρωματιδιακών ανταλλαγών Πιθανοί μηχανισμοί πρόκλησης των SCEs Αναφορικά με τη διερεύνηση της βιολογικής σημασίας και των μηχανισμών δημιουργίας των SCEs υπάρχει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η αύξηση της συχνότητας των SCEs αντιπροσωπεύει αυξημένες μη επιδιορθώσιμες βλάβες του DNA 90-92, ενώ ως προς την αιτιολογία της δημιουργίας των SCEs, διαπιστώνεται πως οι SCEs επάγονται προκειμένου να υπερκεραστούν οι μη επιδιορθώσιμες βλάβες κατά την αντιγραφή του DNA 89, Οι Natarajan και συνεργάτες 97 και Kato 98, αναφέρουν ως θέση δημιουργίας των SCEs στα ρεπλικόνια, τα σημεία της έναρξης της αντιγραφής του DNA, ενώ ο Painter 99, θεωρεί ως προϋπόθεση δημιουργίας μιας χρωματιδιακής ανταλλαγής, έναν διπλόκλωνο ανασυνδυασμό στις περιοχές επαφής δύο ρεπλικονίων. Διάφοροι γονοτοξικοί παράγοντες μπορεί να καθυστερήσουν ή να αναστείλουν την επιμήκυνση του DNA, κυρίως στην περιοχή των ρεπλικονίων και η επαγόμενη ανταλλαγή τμημάτων των δύο χρωματίδων να πραγματοποιηθεί μεταξύ μιας ήδη και μιας μη αντιγραφείσας περιοχής. Η κατανομή των SCEs στα χρωμοσώματα, κατά τους Kushima και συνεργάτες 100, δεν είναι τυχαία, αλλά εντοπίζεται στις αλληλουχίες των περιοχών επαφής μεταξύ ευχρωματίνης και ετεροχρωματίνης, οι οποίες εμφανίζουν διαφορετική ταχύτητα αντιγραφής. Έτσι η πιθανότητα δημιουργίας χρωματιδιακών ανταλλαγών και διπλόκλωνων ρήξεων του DNA στα σημεία επαφής δύο ρεπλικονίων 41

42 με διαφορετικό ρυθμό αντιγραφής, είναι αυξημένη. Σύμφωνα με τον Shafer η δημιουργία των SCEs κατά την αντιγραφή του DNA μπορεί να αποτελεί ένα εναλλακτικό μηχανισμό παράκαμψης μιας ανεπιδιόρθωτης βλάβης, όπως μιας χιαστής σύνδεσης 101. Παρά τη συνεχή έρευνα παραμένουν ακόμη αρκετά αδιευκρίνιστα σημεία ως προς τον μηχανισμό δημιουργίας των SCES Πλεονεκτήματα της μελέτης της συχνότητας των SCEs Η προσδιορισμός της συχνότητας των SCEs σε καλλιεργημένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα θεωρείται μια ιδιαίτερα ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδος διερεύνησης της πιθανής γενοτοξικής δράσης διαφόρων παραγόντων σε ευκαρυωτικά κύτταρα 102. Η μελέτη των SCEs υπερτερεί έναντι της μέτρησης των χρωμοσωμικών ατυπιών λόγω της αυξημένης ευαισθησίας (μεγαλύτερη συχνότητα SCEs) σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις κυτταρογενετικά ενεργών ουσιών 103. Η μελέτη των SCEs αποτελεί μια απλή, γρήγορη και φθηνή μέθοδο, η οποία δύναται να ανιχνεύσει χρωμοσωμικές βλάβες σε κάθε ένα κύτταρο ενός κυτταρικού πληθυσμού, όπως και να αποκαλύψει πιθανή διαφοροποίηση της κυτταρικής ευαισθησίας έναντι κάποιου παράγοντα σε διάφορους κυτταρικούς υποπληθυσμούς ενός και μόνο όγκου 104. Έτσι με βάση τα πειράματα των Τofilon και συνεργατών 104 και Deen και συνεργατών 105, η μελέτη των SCEs έχει προταθεί ως ενδεδειγμένη μέθοδος για την αξιολόγηση και βελτίωση της χημειοθεραπείας. Επιπλέον, η χρήση της μπορεί να επεκταθεί στην ανίχνευση κληρονομικών και επίκτητων νοσημάτων, όπως και στη μελέτη της γονοτοξικής επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων Μειονεκτήματα της μελέτης της συχνότητας των SCEs Η μελέτη των SCEs έχει μεγαλύτερη ευαισθησία, αλλά μικρότερη εξειδίκευση, συγκρινόμενη με άλλες κυτταρογενετικές μεθόδους. Ως ευαισθησία καθορίζεται η εκατοστιαία (%) αναλογία των βλαπτικών παραγόντων (γενοτοξικών ουσιών), που δίνουν θετικό αποτέλεσμα με τη μέθοδο, ενώ με τον όρο εξειδίκευση αναφερόμαστε στην εκατοστιαία (%) αναλογία των μη γενοτοξικών ουσιών, που δίνουν αρνητικό 42

43 αποτέλεσμα. H μεγαλύτερη ευαισθησία στην περίπτωση της μεθόδου των SCEs υποδηλώνει πως υπάρχει μεγαλύτερη πιθανότητα να επισημανθεί η γενοτοξική δράση μιας ουσίας, αλλά η μικρότερη εξειδίκευση συνδέεται με μεγαλύτερη πιθανότητα μια μη γενοτοξική ουσία να δώσει θετικό αποτέλεσμα Ενδείξεις της μελέτης της συχνότητας των SCEs Η μελέτη των SCEs συμβάλλει στην ανίχνευση της μεταλλαξιγόνου και καρκινογόνου δράσης διαφόρων ουσιών Με τη μέθοδο αυτή έχει αναγνωριστεί η καρκινογόνος δράση ουσιών, οι οποίες αποτελούν τμήμα της διατροφής του ανθρώπου, όπως είναι οι μεθυλοξανθίνες θεοβρωμίνη, θεοφυλλίνη αλλά και η καφεΐνη 110. Με τη μελέτη των SCEs είναι επίσης εφικτό να ανιχνευτεί η προστατευτική δράση ουσιών, όπως οι βιταμίνες Α και C (σε μικρές συγκεντρώσεις) 111 και το χαμομήλι 112, έναντι γνωστών νεοπλασματικών παραγόντων. Επιπλέον, η μελέτη των χρωματιδιακών ανταλλαγών χρησιμοποιείται στην αξιολόγηση της αντινεοπλασματικής χημειοθεραπείας in vitro, in vivo και συνδυαστικά. Σε in vitro μελέτες έχει διαπιστωθεί συνεργική αύξηση των SCEs κατά την ταυτόχρονη παρουσία αντινεοπλασματικών αλκυλιωτικών παραγόντων και καφεΐνης 113, αλκυλιωτικών παραγόντων με προσταγλανδίνες E 1 και E 114 2, αλλά και carboplatin με νιασίνη Χρωμοσωμικές ατυπίες (Chromosome aberrations) Οι χρωμοσωμικές ατυπίες, οι οποίες έχουν καθιερωθεί ως σημαντικός βιολογικός δείκτης (biomarker) της γονοτοξικής έκθεσης των κυττάρων σε ουσίες και στην ιονίζουσα ακτινοβολία (Εικόνα 7), είναι οι διαφοροποιήσεις των χρωμοσωμάτων που προκύπτουν από την έλλειψη, προσθήκη ή ανώμαλη θέση τμημάτων ή και ολόκληρων χρωμοσωμάτων. Αναλόγως της μορφή της ατυπίας, διαχωρίζονται σε δομικές (ανευπλοειδίες) και αριθμητικές (διαγραφές, διπλασιασμοί, μεταθέσεις, αντιστροφές, προσθήκες, δακτύλιοι, ισοχρωμοσώματα). Ανεξαρτήτως της ειδικής μορφής τους, όλες οι χρωμοσωμικές ατυπίες έχουν συσχετιστεί με 43

44 δυσμενείς καταστάσεις, όπως νεοπλασίες στους ενήλικες και συγγενείς ανωμαλίες σε νεογέννητα (σύνδρομα Down και Turner). Στα νεογέννητα, οι τυχαίες (spontaneous) χρωμοσωμικές ατυπίες που δεν προκαλούνται από γνωστό γονοτοξικό παράγοντα έχουν χαμηλή συχνότητα, της τάξης του 0,6%. Ωστόσο το 50% των τυχαίων αποβολών συσχετίζεται με αυξημένη συχνότητα χρωμοσωμικών ατυπιών 116. Στη μελέτη των Hagmar και συνεργάτών, αναφέρεται θετική συσχέτιση της συχνότητας χρωμοσωμικών ατυπιών στα λεμφοκύτταρα με την επακόλουθη εμφάνιση καρκίνου 117, κάτι που επιβεβαιώνεται και από άλλους ερευνητές. Έτσι οι χρωμοσωμικές ατυπίες αποτελούν πρωταρχικό προγνωστικό δείκτη ανάπτυξης καρκίνου συγκριτικά με άλλους κυτταρογενετικούς δείκτες με μικρότερη προγνωστική αξία, όπως οι χρωματιδιακές ανταλλαγές και η μελέτη των μικροπυρήνων 118. Η σχέση χρωμοσωμικών ατυπιών και ανάπτυξης καρκίνου, σε ατομικό επίπεδο επηρεάζεται από ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες. Οι πρώτοι σχετίζονται με τα ένζυμα μεταβολισμού καρκινογόνων παραγόντων και του φολικού οξέος, το οποίο λειτουργεί προστατευτικά για την ακεραιότητα του DNA, καθώς επίσης και με τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού 119. Στους εξωγενείς παράγοντες ανήκουν το κάπνισμα, η διατροφή, η επαγγελματική ή ιατρική έκθεση σε μεταλλαξιογόνους παράγοντες (π.χ. ιονίζουσα ακτινοβολία) κ.α.. Συνεπώς, από τα παραπάνω γίνεται σαφής η ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση προκειμένου να έχουμε μια πιο ξεκάθαρη εικόνα για την προγνωστική αξία των χρωμοσωμικών ατυπιών, δεδομένου της ύπαρξης και άλλων διαμεσολαβούμενων παραμέτρων για την ανάπτυξη καρκίνου 119,

45 Εικόνα 7: Τύποι χρωμοσωμικών ατυπιών και σχηματισμός μικροπυρήνων (Courtesy of 4. Μικροπυρήνες (Micronuclei) Κατά την κυτταρική διαίρεση, όταν ένα χρωμόσωμα ή τμήμα του δεν ενσωματώνεται σε ένα από τους θυγατρικούς πυρήνες, σχηματίζονται μικροί 45

46 πυρήνες, οι οποίοι ονομάζονται μικροπυρήνες. Η δημιουργία τους σχετίζεται άμεσα με το κεντρομέρος και τα μικροσωληνάρια της μιτωτικής ατράκτου. Η αύξηση του αριθμού των μικροπυρήνων προκαλείται από την καταστροφή του κεντρομεριδίου ή την αναστολή λειτουργίας των μικροσωληναριών υπό την επίδραση κάποιου παράγοντα 121. Ουσίες οι οποίες είναι γνωστό ότι επιδρούν στα μικροσωληνάρια της μιτωτικής ατράκτου με την επαγωγή αποπολυμερισμού των τουμπουλινών (α και β) είναι οι χημειοθεραπευτικές ουσίες, όπως η μπλεομυκίνη 122, η βινκριστίνη, το κυκλοφωσφαμίδιο και η μιτομυκίνη C, καθώς και φυτικής προέλευσης ουσίες, όπως η κολχικίνη, οι επιποδοφυλλοτοξίνες και η φαλλοειδίνη 123. Ο αποπολυμερισμός των τουμπουλινών και η απότοκη δημιουργία ρηγμάτων στα μικροσωληνάρια, έχει ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της μετακίνησης των θυγατρικών χρωμοσωμάτων προς τους πόλους των κυττάρων. Η διαφορετική ταχύτητα με την οποία μετακινούνται προς τους πόλους, έχει ως συνέπεια την ολοκλήρωση των διαδικασιών κυτταροκίνησης, πριν προλάβουν να ενσωματωθούν όλα τα χρωματοσώματα στους νεοσχηματιζόμενους πυρήνες με τελικό αποτέλεσμα τα εναπομείναντα εκτός πυρήνα χρωματοσώματα να εμφανίζονται ως μικροπυρήνες κατά τη μεσόφαση 124. Ο σχηματισμός των μικροπυρήνων μπορεί να προκληθεί από την απευθείας κλαστογόνο δράση παραγόντων, όπως η μιτομυκίνη C, η μπλεομυκίνη, αλλά και από δράση ακτινοβολίας, όπως ακτίνων Χ στα χρωμοσώματα, που επιφέρουν την δημιουργία ρήξεων ή ατυπιών σε αυτά 124. Τα θραύσματα των χρωμοσωμάτων δεν μεταφέρονται έγκαιρα στους νεοσχηματιζόμενους πυρήνες κατά την κυτταροκίνηση και σχηματίζουν μικροπυρήνες στο κυτταρόπλασμα. Οι Miller και συνεργάτες αναφέρουν ότι η συσχέτιση δημιουργίας μικροπυρήνων και χρωμοσωμικών ατυπιών αγγίζει το 100%, φαινόμενο αναμενόμενο, καθώς έχουν και κοινή αιτιολογία δημιουργίας υπό την επίδραση γονοτοξικών παραγόντων Δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων (PRI) Ο υπολογισμός του PRI θεωρείται μία αξιόπιστη μελέτη του ρυθμού πολλαπλασιασμού ενός κυτταρικού πληθυσμού και αποτελεί μια εκτίμηση της εκατοστιαίας αναλογίας των μεταφάσεων της πρώτης (Μ 1 ), δεύτερης (Μ 2 ), τρίτης 46

47 (Μ 3+ ) ή περαιτέρω κυτταρικών διαιρέσεων. Η μέθοδος προσδιορισμού εφαρμόζεται στα ίδια παρασκευάσματα και απαιτεί την ίδια τεχνική και χρώση (FPG) που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των SCEs. Κατά την συγκεκριμένη τεχνική, τα χρωμοσώματα των κυττάρων που έχουν ολοκληρώσει την πρώτη κυτταρική διαίρεση εμφανίζουν και τις δύο αδελφές χρωματίδες σκούρες, όσα έχουν ολοκληρώσει την δεύτερη κυτταρική διαίρεση έχουν την μία χρωματίδα σκούρη και την άλλη ωχρή, ενώ τα χρωμοσώματα που ολοκλήρωσαν ή ξεπέρασαν την τρίτη κυτταρική διαίρεση έχουν και τις δύο χρωματίδες ωχρές. Ο τύπος υπολογισμού του δείκτη ρυθμού πολλαπλασιασμού είναι: PRI = (Μ 1 + 2Μ 2 + 3Μ 3+ ) / 100 όπου Μ 1 είναι η επί % αναλογία μεταφάσεων της πρώτης, Μ 2 της δεύτερης και Μ 3+ της τρίτης και κάθε επόμενης κυτταρικής διαίρεσης. Ο δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της κυτταροστατικής, αλλά και γενοτοξικής δράσης διαφόρων παραγόντων Μιτωτικός δείκτης (Mitotic Index) Ο μιτωτικός δείκτης ορίζεται ως ο λόγος του αριθμού των κυττάρων, που βρίσκονται σε μίτωση, προς το συνολικό αριθμό κυττάρων. Αποτελεί μέθοδο εκτίμησης της δυνατότητας πολλαπλασιασμού ενός κυτταρικού πληθυσμού. Στην περίπτωση που ο κυτταρικός κύκλος ολοκληρώνεται σπάνια ή αργά, τότε ο μιτωτικός δείκτης θα είναι χαμηλός, ενώ σε μια ομάδα κυττάρων που διαιρείται γρήγορα θα είναι υψηλός 127. Η μέθοδος εφαρμόζεται στα ίδια παρασκευάσματα και απαιτεί την ίδια τεχνική που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της συχνότητας των SCEs και του PRI. Για την εκτίμηση του δείκτη ρυθμού πολλαπλασιασμού, καταμετρώνται περίπου πυρήνες όλων των μεταφάσεων (1 ης, 2 ης, 3 ης και περαιτέρω κυτταρικών διαιρέσεων) και υπολογίζεται ο λόγος του αριθμού των πυρήνων σε μίτωση προς τον συνολικό αριθμό πυρήνων. 47

48 Γ. ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΨΥΧIKΩΝ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ - ΨΥΧΟΤΡΟΠΑ 1. Εισαγωγή Για την αντιμετώπιση των ψυχιατρικών διαταραχών απαιτείται συνήθως μακροχρόνια αγωγή με ψυχότροπα φάρμακα, τα οποία ποικίλουν ως προς την χημική σύσταση, την οδό μεταβολισμού, τα μεταβολικά παράγωγα και το μηχανισμό δράσης. Οι ψυχότροπες αυτές ουσίες εκτός από επιθυμητές δράσεις, έχουν πληθώρα ανεπιθύμητων ενεργειών σε διάφορα συστήματα του οργανισμού καθώς και αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα. Παράλληλα κάποια από αυτά έχουν ενοχοποιηθεί για τερατογόνο δράση. Ως ψυχοτρόπα ορίζονται τα φάρμακα τα οποία μεταβάλλουν την ψυχική κατάσταση και συμπεριφορά του ατόμου. Διακρίνονται οι εξής κατηγορίες ψυχοτρόπων φαρμάκων 128 : 1. Αντιψυχωσικά ή μείζονα ηρεμιστικά 2. Αγχολυτικά ή ήπια ηρεμιστικά 3. Αντικαταθλιπτικά ή θυμοληπτικά 4. Ψυχοδιεγερτικά 5. Ψυχομιμητικά (ψευδαισθησιογόνα ή παραισθησιογόνα) 2. Αντιψυχωσικά Φάρμακα Οι κυριότερες ενδείξεις χορήγησης των αντιψυχωσικών φαρμάκων είναι η σχιζοφρένεια, η σχιζοσυναισθηματική διαταραχή, η παραληρητική διαταραχή και άλλες ψυχωσικές διαταραχές. Άλλες ενδείξεις χορήγησης είναι η διπολική διαταραχή, η μείζονα κατάθλιψη, κάποιες αγχώδεις διαταραχές και οι διαταραχές συμπεριφοράς στα πλαίσια άνοιας. Βελτιώνουν τις διαταραχές της σκέψης, της αντίληψης, του συναισθήματος, την υπερκινητική συμπεριφορά και επηρεάζουν θετικά την επανασύνδεση των ασθενών με το περιβάλλον τους. H χορήγηση των αντιψυχωσικών επιτρέπει τον αποτελεσματικό έλεγχο των οξέων ψυχωσικών επεισοδίων και την πρόληψη υποτροπών της νόσου, για τον λόγο αυτό συνιστάται μακροχρόνια χορήγηση τους. 48

49 Τα αντιψυχωσικά διακρίνονται στα τυπικά ή πρώτης γενιάς αντιψυχωσικά και στα άτυπα ή δεύτερης γενιάς αντιψυχωσικά 129. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν κυρίως τα παράγωγα της φαινοθειαζίνης (χλωροπρομαζίνη), της βουτυροφαινόνης και του θειοξανθενίου. Τα τυπικά αντιψυχωσικά είναι αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση των θετικών συμπτωμάτων της σχιζοφρένειας. Ως πιο πιθανός τρόπος δράσεως θεωρείται ο αποκλεισμός των μετασυναπτικών υποδοχέων D 2 της ντοπαμίνης 129. Η εμφάνιση εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων αποδίδεται στην αντιντοπαμινεργική τους δράση. Οι κυριότερες παρενέργειες τους είναι: κινητικές διαταραχές (εξωπυραμιδικά συμπτώματα 130, δυσκινησία), κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο 131, καταστολή, διαταραχές σωματικού βάρους, υπερπρολακτιναιμία και φωτοευαισθησία. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα άτυπα ή δεύτερης γενιάς αντιψυχωσικά, τα οποία διαφέρουν σε δομή και δράση τόσο με τα άτυπα αντιψυχωσικά, όσο και μεταξύ τους. Έχουν τα εξής χαρακτηριστικά: α) Αποτελεσμάτικότητα έναντι των θετικών συμπτωμάτων της σχιζοφρένειας και πιθανόν καλύτερη επίδραση στα αρνητικά σε σχέση με τα τυπικά αντιψυχωσικά 132. β) Αποτελούν φάρμακα πρώτης εκλογής για ψυχωσικούς ασθενείς σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες. γ) Προκαλούν σπανιότερα κινητικές παρενέργειες σε σχέση με τα τυπικά. δ) Αποτελούν τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα αντιψυχωσικά σήμερα. ε) Τα περισσότερα από αυτά μπορεί να αυξάνουν τον κίνδυνο για σακχαρώδη. διαβήτη, δυσλιπιδαιμία και αύξηση του σωματικού βάρους. στ) Έχουν μεγαλύτερο κόστος σε σχέση με τα τυπικά αντιψυχωτικά. Ο μηχανισμός δράσης τους θεωρείται ο εξής 133 : Μεγαλύτερη συγγένεια και ικανότητα δέσμευσης σε πολλαπλούς σεροτονινεργικούς υποδοχείς (5-HT) και ιδίως στον 5HT 2A υποδοχέα. Λιγότερο ισχυρή δέσμευση των D 2 υποδοχέων της ντοπαμίνης σε σχέση με τα τυπικά αντιψυχωσικά. 49

50 2.1. Τυπικά Αντιψυχωτικά Τα τυπικά αντιψυχωσικά ή όπως αλλιώς ονομάζονται αντιψυχωσικά πρώτης γενιάς αποτελούν μια κατηγορία των αντιψυχωσικών φαρμάκων, η οποία άρχισε να αναπτύσσεται τη δεκαετία του Χρησιμοποιούνται στη θεραπεία των ψυχώσεων και ειδικότερα της σχιζοφρένειας. Άλλες θεραπευτικές ενδείξεις τους είναι στη θεραπεία της μανιακών επεισοδίων και των διαταραχών συμπεριφοράς. Τα πρώτα τυπικά αντιψυχωτικά που εισήλθαν στην κλινική πράξη είναι οι φαινοθειαζίνες (Εικόνα 8), ενώ η πρώτη φαινοθειαζίνη που χρησιμοποιήθηκε είναι η χλωροπρομαζίνη (Εικόνα 9). Εικόνα 8: Χημική δομή των φαινοθειαζινών (C 12 H 9 NS) Eικόνα 9: Χημική δομή της χλωροπρομαζίνης Στα τυπικά αντιψυχωτικά ανήκουν οι ακόλουθες φαρμακευτικές ουσίες: Χλωροπρομαζίνη Περφεναζίνη Ντροπεριδόλη Προχλωροπεραζίνη Φλουπενθιξόλη Προμαζίνη Φλουφαιναζίνη Θειοριδαζίνη 50

51 Αλοπεριδόλη Λεβομεπρομαζίνη Λοξαπίνη Μεσοριδαζίνη Μολινδόνη Θειοθιξένη Τριφλουοπεραζίνη Τριφλουπρομαζίνη Ζουκλοπενθιξόλη Το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο τυπικό αντιψυχωσικό σήμερα είναι η αλοπεριδόλη. Τα υπόλοιπα τυπικά αντιψυχωτικά χρησιμοποιούνται σπανιότερα εώς καθόλου πλέον στην κλινική πράξη Αλοπεριδόλη Η αλοπεριδόλη είναι ένα τυπικό αντιψυχωσικό φάρμακο και αποτελεί παράγωγο της βουτυροφαινόνης (Εικόνα 10). Εικόνα 10: Χημική δομή της αλοπεριδόλης Πίνακας 2: Χαρακτηριστικά αλοπεριδόλης Συστηματική ονομασία 4-[4-(4-chlorophenyl)-4-hydroxy-1-piperidyl]-1-(4- (IUPAC) fluorophenyl)-butan-1-one Χημικός τύπος Μοριακό βάρος C21H23ClFNO2 375,864 g/mol 51

52 Βιοδιαθεσιμότητα περίπου 50 με 60% Χρόνος ημίσειας ζωής Μεταβολισμός Απέκριση Χορήγηση ~ ώρες Ηπατικός Στην χολή και στα ούρα Από το στόμα, ενδομυικά, ενδοφλέβια, δεκανοική μορφή Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των ψυχωσικών διαταραχών, στην διαταραχή Τourette, σε περιπτώσεις σοβαρών προβλημάτων συμπεριφοράς σε παιδιά με μαχητική, εκρηκτική υπερδιέγερση, σε δ/χες συμπεριφοράς στην άνοια, στην διπολική δ/χη και στο delirium. Eνεργεί αποκλείοντας τους D 2 ντοπαμινεργικούς υποδοχείς. Το σύνηθες δοσολογικό εύρος στην από του στόματος χορήγηση είναι από 1 εώς 40 mg με μέγιστη δόση τα 100 mg ημερησίως. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που μπορεί να προκαλέσει η χορήγηση αλοπεριδόλης είναι υπερπρονακτιναιμία με συνεπακόλουθη γαλακτόρροια, αμηνόρροια στις γυναίκες και στυτική δυσλειτουργία στους άνδρες, επιδείνωση των αρνητικών και γνωστικών συμπτωμάτων, ζάλη, καταστολή, υπόταση, αύξηση του σωματικού βάρους, δυσλιπιδαιμία και σακχαρώδη διαβήτη, ακαθησία, εξωπυραμιδικά συμπτώματα, ξηροστομία και δυσκοιλιότητα. Σπάνια μπορεί να προκαλέσει κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο, σπασμούς, ίκτερο και ακοκκιοκυτταραιμία. Λόγω της συχνής εμφάνισης εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων συχνά με την αλοπεριδόλη συγχορηγείται και το αντιχολινεργικό φάρμακο βιπεριδίνη Άτυπα αντιψυχωσικά Τα άτυπα ή δεύτερης γενιάς αντιψυχωσικά αποτελούν τα φάρμακα πρώτης εκλογής για την αντιμετώπιση της σχιζοφρένειας και των ψυχώσεων. Το πρώτο 52

53 φάρμακο αυτής της κατηγορίας που ανακαλύφθηκε είναι η κλοζαπίνη. Κύριο πλεονέκτημα της χρήσης των άτυπων αντιψυχωσικών σε ασθενείς με ψύχωση σε σχέση με τα τυπικά αντιψυχωσικά είναι η σπανιότερη εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών, όπως για παράδειγμα η πρόκληση εξωπυραμιδικής συμπτωματολογίας ή υπερπρολακτιναιμίας. Διαπιστώνεται καλύτερη συμμόρφωση με την θεραπεία και οι ασθενείς λιγότερο συχνά χρειάζεται να επανεισαχθούν στο νοσοκομείο συγκριτικά με όσους λαμβάνουν τυπικά αντιψυχωσικά 134. Τα άτυπα αντιψυχωσικά ενδείκνυνται για την αντιμετώπιση των ψυχωσικών διαταραχών (όπως η σχιζοφρένεια), της διπολικής διαταραχής 135, της ιδεοψυχαναγκαστικής καταναγκαστικής διαταραχής, της κατάθλιψης 136, των διαταραχών προσωπικότητας, των αγχωδών διαταραχών, των διαταραχών του αυτιστικού φάσματος και της επιθετικότητας. Στην αντιμετώπιση της σχιζοφρένειας, η αποτελεσματικότητα τους θεωρείται καλή σε ποσοστό 40-50% των περιπτώσεων, μερική σε ποσοστό 30-40% των περιπτώσεων και απούσα σε ποσοστό 20% 137. Αν και θεωρούνται ασφαλέστερα των τυπικών αντιψυχωσικών, τα άτυπα έχουν ανεπιθύμητες ενέργειες, όπως όψιμη δυσκινησία, αύξηση σωματικού βάρους, επιδείνωση σακχαρώδη διαβήτη, υπερλιπιδαιμία, κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο, μειωμένη σεξουαλική διέγερση και επίδοση, διαταραχές εκσπερμάτισης και εμμήνου ρύσεως, υπογονιμότητα λόγω υπερπρολακτιναιμίας, αυξημένο κίνδυνο αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου, καρδιαγγειακής νόσου, αιφνίδιου καρδιακού θανάτου και θρομβωτικών επισοδίων Κλοζαπίνη Η κλοζαπίνη (Εικόνα 11), η οποία αποτελεί το πρώτο άτυπο αντιψυχωσικό, κυκλοφόρησε τη δεκαετία του To 1975, εξαιτίας επαγόμενης ακοκκιοκυτταραιμίας, αποσύρθηκε προσωρινά από την κλινική πράξη, για να επανέλθει ακολούθως μετά τη βελτίωση παρακολούθησης των ανεπιθύμητων ενεργειών της και την διαπίστωση με την πρόοδο των ερευνών, της αποτελεσματικότητάς της στην περίπτωση ανθεκτικής στη θεραπεία σχιζοφρένειας. 53

54 Εικόνα 11: Χημικός τύπος κλοζαπίνης Πίνακας 3: Χαρακτηριστικά κλοζαπίνης Συστηματική ονομασία 8-chloro-11-(4-methylpiperazin-1-yl)- (IUPAC) 5H-dibenzo[b,e][1,4]diazepine Χημικός Τύπος Μοριακό βάρος C18H19ClN g/mol Βιοδιαθεσιμότητα 60-70% Χρόνος ημίσειας ζωής 6-26 ώρες Μεταβολισμός Ήπαρ(CYP450 1A2, CYP450 2D6, CYP450 3A4) Απέκκριση Xορήγηση Ούρα, χολή Από το στόμα Η κλοζαπίνη ενεργεί ως ανταγωνιστής σεροτονίνης ντοπαμίνης. Αποκλείει τους D 2 υποδοχείς της ντοπαμίνης ελαττώνοντας τα θετικά συμπτώματα της ψύχωσης και σταθεροποιώντας τα συμπτώματα που αφορούν την διάθεση. Η χημική συγγένεια της κλοζαπίνης προς τους D 2 υποδοχείς της ντοπαμίνης είναι σχετικά χαμηλή σε σύγκριση με τις αντίστοιχες των κλασικών αντιψυχωσικών 54

55 παραγόντων , ενώ η συνάφεια της προς τους D 1 και D 4 υποδοχείς της ντοπαμίνης είναι σχετικά υψηλή. O αποκλεισμός των υποδοχέων της σεροτονίνης 5HT 2A, oδηγεί στην ενίσχυση απελευθέρωσης ντοπαμίνης σε κάποιες περιοχές του εγκεφάλου, μειώνοντας έτσι τις κινητικού τύπου ανεπιθύμητες ενέργειες και, πιθανώς, βελτιώνοντας τα γνωστικά και τα συμπτώματα που αφορούν την διάθεση. Η αλληλεπίδραση της με πολυάριθμους άλλους υποδοχείς νευροδιαβιβαστών μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα της κλοζαπίνης. Συγκεκριμένα, η δράση της στους 5HT 2C και 5HT 1A υποδοχείς, μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα της κλοζαπίνης στα συμπτώματα κάποιων ασθενών που αφορούν τις γνωστικές λειτουργίες και το συναίσθημα. Επίσης η κλοζαπίνη επιδεικνύει αξιόλογη συγγένεια προς τους χολινεργικούς μουσκαρινικούς υποδοχείς 160, τους ισταμινικούς και αδρενεργικούς υποδοχείς. Το σύνηθες δοσολογικό εύρος καθορίζεται στα mg / ημέρα, με μέγιστη δόση τα 900 mg /ημέρα. Δυνητικά πλεονεκτήματα της κλοζαπίνης είναι η αποτελεσματικότητα της στην ανθεκτική στη θεραπεία σχιζοφρένεια, σε βίαιους, επιθετικούς ασθενείς, σε ασθενείς με αυτοκτονική συμπεριφορά και σε ασθενείς με όψιμη δυσκινησία. Επίσης έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία των L-dopa επαγώμενων ψυχωτικών συμπτωμάτων σε ασθενείς με νόσο Parkinson 129. Στις περισσότερες χώρες δεν θεωρείται θεραπεία πρώτης εκλογής λόγω των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών που μπορεί να παρουσιαστούν με τη χρήση της 144. Τέτοιου είδους ανεπιθύμητες ενέργειες μπορεί να είναι η αύξηση του κινδύνου εμφάνισης διαβήτη και δυσλιπιδαιμίας, η ακοκκιοκυτταραιμία, η σιελόρροια, η ζάλη, η καταστολή, η κεφαλαλγία, η ταχυκαρδία, η εφίδρωση, η υπόταση, η ναυτία, η δυσκοιλιότητα, η ξηροστομία, η αύξηση βάρους, οι επιληπτικές κρίσεις, το κακόηθες σύνδρομο από νευροληπτικά, η πνευμονική εμβολή, η μυοκαρδίτιδα και ο αυξημένος κίνδυνος θανάτου ή αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων σε ηλικιωμένους ασθενείς με ψύχωση που σχετίζεται με άνοια. Η κλοζαπίνη είναι δυνατόν να αλληλεπιδράσει με άλλες φαρμακευτικές ουσίες σε περίπτωση συγχορήγησης τους. Έτσι είναι πιθανό να αυξηθούν στο πλάσμα τα 55

56 επίπεδα φαρμάκων, τα οποία εμφανίζουν υψηλά ποσοστά δέσμευσης με τις πρωτείνες (π.χ. βαρφαρίνη, διγοξίνη), εάν τα φάρμακα αυτά χορηγηθούν ταυτόχρονα με την κλοζαπίνη. Επίσης οι ουσίες αυτές είναι δυνατό να υποκαταστήσουν την κλοζαπίνη στις ενώσεις που σχηματίζει με τα πρωτεϊνικά μόρια, με αποτέλεσμα να σημειωθούν αυξημένες συγκεντρώσεις κλοζαπίνης στο πλάσμα 145. Αύξηση των συγκεντρώσεων της κλοζαπίνης στο πλάσμα μπορεί επίσης να προκληθεί όταν χορηγείται ταυτόχρονα με φάρμακα που αναστέλλουν τα ένζυμα του κυττοχρώματος P450 και πιο συγκεκριμένα τα ισοένζυμα 1Α2, 2D6, 3A4, όπως για παράδειγμα η φλουβοξαμίνη, η σιπροφλοξασίνη η νορφλοξασίνη, η φλουοξετίνη και η παροξετίνη. Φάρμακα ή ουσίες τα οποία επάγουν τα ισοένζυμα 1Α2, 2D6, 3A4 όπως η καρβαμαζεπίνη και το κάπνισμα ενδέχεται να μειώσουν τις συγκεντρώσεις της κλοζαπίνης στο πλάσμα. Η υποτασική δράση των αντιυπερτασικών φαρμάκων και η αντιχολινεργική δράση των φαρμάκων που ομοιάζουν με την ατροπίνη μπορεί να ενισχυθούν από την κλοζαπίνη. Ο συνδυασμός κλοζαπίνης με βενζοδιαζεπίνες ή άλλα ψυχοτρόπα φάρμακα μπορεί να προκαλέσει αναπνευστική ή/και καρδιακή ανακοπή. Οι επιδράσεις της ταυτόχρονης χορήγησης βαλπροϊκού οξέος και κλοζαπίνης εμφανίζονται ως αμφιλεγόμενες. Σε δύο μικρής κλίμακας μελέτες, με τη συμμετοχή 4 και 7 σχιζοφρενών ασθενών αντίστοιχα, στους οποίους χορηγήθηκε κλοζαπίνη και βαλπροϊκό οξύ, οι συγκεντρώσεις της κλοζαπίνης στον ορό ήταν μειωμένες 146. Αντίθετα, οι Centorrino και συνεργάτες 147 ανέφεραν ελαφρά αύξηση των συγκεντρώσεων της κλοζαπίνης στον ορό, όταν αυτή χορηγήθηκε ταυτόχρονα με βαλπροικό οξύ σε 11 ασθενείς. Έχουν επίσης αναφερθεί περιστατικά αλληλεπίδρασης μεταξύ κλοζαπίνης και αμπικιλλίνης, ερυθρομυκίνης, λιθίου ή καφεΐνης, με αποτέλεσμα να εμφανισθούν φαινόμενα τοξικότητας από την κλοζαπίνη Ολανζαπίνη H ολανζαπίνη η οποία εγκρίθηκε από τον FDA για χρήση στη σχιζοφρένεια το 1996 κυκλοφόρησε στην Ελλάδα το Η χημική δομή (Εικόνα 12) και το προφίλ της ολανζαπίνης η οποία είναι παράγωγο της θειενοβενζοδιαζεπίνης 56

57 ομοιάζουν περισσότερο με την κλοζαπίνη σε σχέση με τα υπόλοιπα άτυπα αντιψυχωσικά. Η ολανζαπίνη χρησιμοποιείται στη θεραπεία της σχιζοφρένειας, της διπολικής διαταραχής, άλλων ψυχωσικών διαταραχών, στην μονοπολική κατάθλιψη που δεν απαντά στα αντικαταθλιπτικά, στις διαταραχές συμπεριφοράς στις άνοιες και στη μεταιχμιακή δ/χη της προσωπικότητας. Εικόνα 12: Χημική δομή της ολανζαπίνης Πίνακας 4: Χαρακτηριστικά ολανζαπίνης Συστηματική ονομασία 2-methyl-4-(4-methyl-1-piperazinyl)-10Hthieno[2,3-b][1,5]benzodiazepine (IUPAC) Χημικός τύπος Μοριακό Βάρος C17H20N4S g/mol Βιοδιαθεσιμότητα 87 % Μεταβολισμός Ηπατικός( CYP450 1A2, CYP450 2D6) Χρόνος ημίσειας ζωής Απέκκριση Χορήγηση ώρες Ούρα, κόπρανα Από το στόμα, Ενδομυϊκα, Σκευασμα για παρατεταμένη αποδέσμευση(im) 57

58 Η ολανζαπίνη δρα αποκλείοντας τους D 2 τύπου υποδοχείς της ντοπαμίνης, ελαττώνοντας τα θετικά συμπτώματα της ψύχωσης και σταθεροποιώντας τα συμπτώματα που αφορούν την διάθεση. Ο αποκλεισμός των τύπου 2Α υποδοχέων σεροτονίνης αυξάνει την απελευθέρωση ντοπαμίνης σε κάποιες περιοχές του εγκεφάλου, ελαττώνοντας έτσι τις κινητικού τύπου ενέργειες και πιθανώς βελτιώνοντας τα συμπτώματα που αφορούν τις γνωστικές λειτουργίες και τη διάθεση. Η δράση της σε πολυάριθμους άλλους υποδοχείς νευροδιαβιβαστών μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα της ολανζαπίνης, όπως και στην περίπτωση της κλοζαπίνης. Συγκεκριμένα, η δράση της ως ανταγωνιστής των 5-HT 2C υποδοχέων της σεροτονίνης μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα της ολανζαπίνης στα συμπτώματα κάποιων ασθενών που αφορούν τις γνωστικές λειτουργίες και το συναίσθημα. Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες έδειξαν ότι η ολανζαπίνη εκλεκτικά μείωσε το ρυθμό πυροδότησης των μεσομεταιχμιακών (Α10) ντοπαμινεργικών νευρώνων, ενώ είχε μικρή επίδραση στη ραβδωτή οδό (Α9) η οποία εμπλέκεται στην κινητική λειτουργία. Το σύνηθες δοσολογικό εύρος είναι τα mg /ημέρα. Σε κάποιες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί και μεγαλύτερες δόσεις (25-40 mg/ημέρα). Υπάρχουν μελέτες στις οποίες η ολανζαπίνη σε ακόμη μεγαλύτερες δόσεις (50-60mg/ημέρα) βελτιώνει την κοινωνική λειτουργικότητα και την ψυχοπαθολογία σχιζοφρενικών ασθενών. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που μπορεί να εμφανιστούν μετά από τη χρήση της ολανζαπίνης είναι αύξηση του κινδύνου εμφάνισης σακχαρώδη διαβήτη και δυσλιπιδαιμίας, ζάλη, καταστολή, ηωσινοφιλία, περιφερικό οίδημα, αρθραλγία, ταχυκαρδία, ορθοστατική υπόταση, πρόσληψη βάρους και αυξημένος κίνδυνος θανάτου και αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων σε ηλικιωμένους με άνοια. Σπάνια μπορεί να προκληθεί κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο, όψιμη δυσκινησία, εξάνθημα κατά την έκθεση στον ήλιο και επιληπτικές κρίσεις. Επειδή η ολανζαπίνη μεταβολίζεται μέσω του CYP1A2 (κυτόχρωμαp450), οι ουσίες που προκαλούν επαγωγή ή αναστολή ειδικά του ισοενζύμου αυτού, ενδέχεται να επηρεάσουν τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες της ολανζαπίνης. Ουσίες οι οποίες επάγουν το CYP1A2 όπως η καρβαμαζεπίνη ή το κάπνισμα, ενισχύουν τον 58

59 μεταβολισμό της ολανζαπίνης με αποτέλεσμα να παρατηρηθεί μείωση των συγκεντρώσεων της. Οι κλινικές επιπτώσεις αναμένεται να είναι περιορισμένες αλλά συνιστάται η κλινική παρακολούθηση των ασθενών και αν κριθεί απαραίτητο μπορεί να γίνει αύξηση της δόσης της ολανζαπίνης. Ουσίες οι οποίες αναστέλλουν το CYP1A2 όπως η φλουβοξαμίνη μπορεί να αναστείλουν τον μεταβολισμό της ολανζαπίνης. Η μέση αύξηση της μέγιστης συγκέντρωσης (Cmax) της ολανζαπίνης, μετά τη χορήγηση της φλουβοξαμίνης, ήταν 54% σε γυναίκες μη καπνίστριες και 77% σε άνδρες καπνιστές. Η μέση αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας της ολανζαπίνης ήταν 52% και 108% αντίστοιχα. Η χορήγηση μικρότερης δόσης έναρξης της θεραπείας με ολανζαπίνη θα πρέπει να εξετάζεται σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν φλουβοξαμίνη ή άλλους αναστολείς του CYP1A2, όπως η σιπροφλοξασίνη. Σε περίπτωση έναρξης θεραπείας με έναν αναστολέα του CYP1A2, το ενδεχόμενο μείωσης της δοσολογίας της ολανζαπίνης θα πρέπει να εξετάζεται Ρισπεριδόνη Η ρισπεριδόνη (Εικόνα 13) παρασκευάστηκε από την εταιρεία Janssen Pharmaceuticals και εισήχθη στην αγορά με την εμπορική ονομασία Risperdal στις αρχές της δεκαετίας του Ανήκει στα άτυπα αντιψυχωσικά αν και παρουσιάζει ορισμένες από τις εξωπυραμιδικές ανεπιθύμητες ενέργειες των τυπικών αντιψυχωσικών ιδιαίτερα σε υψηλές δοσολογίες. Χρησιμοποιείται στη θεραπεία της σχιζοφρένειας, της διπολικής διαταραχής, άλλων ψυχωσικών διαταραχών και διαταραχών συμπεριφοράς στις άνοιες. Eικόνα 13: Χημική δομή της Ρισπεριδόνης 59

60 Πίνακας 5: Χαρακτηριστικά ρισπεριδόνης Συστηματική ονομασία 4-[2-[4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)- (IUPAC) 1-piperidyl]ethyl]-3-methyl- 2,6-diazabicyclo[4.4.0]deca-1,3-dien-5-one Χημικός τύπος Μοριακό Βάρος C23H27FN4O2 410,485 g/mol Βιοδιαθεσιμότητα 70 % Μεταβολισμός Χρόνος ημίσειας ζωής Απέκκριση Χορήγηση Ήπαρ(CYP450 2D6,CYP450 3A4/5) 20 ώρες Ούρα Από το στόμα, Ενδομυϊκή για παρατεταμένη αποδέσμευση Η ρισπεριδόνη δρα αποκλείοντας τους D 2 υποδοχείς της ντοπαμίνης, ελαττώνοντας τα θετικά συμπτώματα της ψύχωσης και σταθεροποιώντας τα συμπτώματα που αφορούν την διάθεση. Ο αποκλεισμός των τύπου 2Α υποδοχέων σεροτονίνης, που παρατηρείται σε δόσεις που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη, αυξάνει την απελευθέρωση ντοπαμίνης σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, ελαττώνοντας έτσι τις κινητικού τύπου ανεπιθύμητες ενέργειες και πιθανώς, βελτιώνοντας τα συμπτώματα που αφορούν τις γνωστικές διαταραχές και τη διάθεση. Η δράση της σε πολυάριθμους άλλους υποδοχείς νευροδιαβιβαστών μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα της ρισπεριδόνης 60

61 Το σύνηθες δοσολογικό εύρος είναι 2-8 mg /ημέρα από το στόμα ή mg βραδείας αποδέσμευσης ενδομυικά κάθε 2 εβδομάδες. Για τους περισσότερους ασθενείς οι αποτελεσματικότερες δόσεις κυμαίνονται μεταξύ 4 και 6 mg ημερησίως. Δόσεις μεγαλύτερες από 10mg την ημέρα δεν παρουσίασαν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα από αυτήν χαμηλότερων δόσεων, ενώ μπορεί να προκαλέσουν περισσότερες ανεπιθύμητες ενέργειες. Επειδή η ασφάλεια δόσεων μεγαλύτερων από 16mg την ημέρα δεν έχει εκτιμηθεί, δόσεις μεγαλύτερες αυτών δεν πρέπει να χορηγούνται. Αν είναι απαραίτητη επιπρόσθετη καταστολή στη θεραπεία με ρισπεριδόνη, είναι δυνατόν να προστεθεί στην αγωγή μια βενζοδιαζεπίνη. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που μπορεί να εμφανιστούν μετά από τη χρήση της ρισπεριδόνης είναι αύξηση του κινδύνου εμφάνισης σακχαρώδη διαβήτη και δυσλιπιδαιμίας, δοσοεξαρτώμενα εξωπυραμυδικά συμπτώματα, δοσοεξαρτώμενη υπερπρολακτιναιμία, σπάνια όψιμη δυσκινησία, ζάλη, αυπνία, κεφαλαλγία, ναυτία, πρόσληψη βάρους, σεξουαλική δυσλειτουργία, αυξημένος κίνδυνος θανάτου και αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων σε ηλικιωμένους με ψύχωση που σχετίζεται με άνοια και σπάνια κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο. Το ενδεχόμενο τερατογένεσης της ρισπεριδόνης μελετήθηκε σε τρεις μελέτες Segment II με πειραματόζωα αρουραίους των φυλών Wistar και Spraque-Dawley και σε μια μελέτη Segment II με πειραματόζωα κουνέλια New Zealand. Η συχνότητα εμφάνισης διαμαρτιών της διάπλασης δεν ήταν αυξημένη στους απογόνους των αρουραίων ή των κουνελιών, στους οποίους χορηγείτο το φάρμακο σε δόσεις 0,4 εώς 6 φορές μεγαλύτερες από την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2. Σε τρείς μελέτες αναπαραγωγής σε αρουραίους, οι οποίοι ελάμβαναν ρισπεριδόνη σε δόσεις 0,3 εώς 3 φορές μεγαλύτερες από την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2 υπήρξε μια αύξηση στους θανάτους των νεογνών κατά τη διάρκεια των πρώτων τεσσάρων ημερών της γαλουχίας. Δεν έγινε γνωστό αν αυτοί οι θάνατοι οφείλονταν σε άμεση επίδραση στα έμβρυα ή στα νεογνά ή σε έμμεση επίδραση από τις μητέρες. Δεν βρέθηκε δόση στην οποία δεν παρατηρείται επίδραση για αυξημένη θνησιμότητα σε νεογνά αρουραίων. Σε μια μελέτη Segment III, σημειώθηκε μια αύξηση σε θνησιγενή νεογνά αρουραίων, όταν το φάρμακο χορηγήθηκε σε δόση 1,5 φορά μεγαλύτερη από την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2. Μεταφορά της ρισπεριδόνης μέσω του πλακούντα 61

62 παρατηρήθηκε σε νεογνά αρουραίων. Δεν έγιναν επαρκείς και καλά ελεγχόμενες μελέτες σε εγκύους. Η ρισπεριδόνη ενδέχεται να αλληλεπιδράσει με άλλα φάρμακα σε ταυτόχρονη χορήγηση. Θα πρέπει να χορηγείται με προσοχή με άλλα φάρμακα που έχουν δράση στο ΚΝΣ. Η ρισπεριδόνη μπορεί να ανταγωνίζεται τη δράση της λεβοντόπα και άλλων αγωνιστών της ντοπαμίνης. Η τοπιραμάτη μειώνει μετρίως τη βιοδιαθεσιμότητα της ρισπεριδόνης, αλλά όχι του ενεργού αντιψυχωσικού κλάσματος. Για το λόγο αυτό, είναι απίθανο αυτή η αλληλεπίδραση να έχει κλινική σημασία. Η καρβαμαζεπίνη έχει δείξει ότι ελαττώνει τα επίπεδα στο πλάσμα του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη της ρισπεριδόνης. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί με άλλους επαγωγείς ηπατικών ενζύμων. Σε διακοπή της χορήγησης της καρβαμαζεπίνης ή των άλλων επαγωγέων ηπατικών ενζύμων, η δοσολογία της ρισπεριδόνης πρέπει να επανεκτιμάται και εάν είναι απαραίτητο να ελαττώνεται. Φαινοθειαζίνες, τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά και ορισμένοι β-αναστολείς μπορούν να προκαλέσουν αύξηση των επιπέδων της ρισπεριδόνης στο πλάσμα, αλλά όχι και του αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Η σιμετιδίνη και η ρανιτιδίνη αυξάνουν τη βιοδιαθεσιμότητα της ρισπεριδόνης αλλά μόνο οριακά αυτή του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Η φλουοξετίνη και η παροξετίνη, αναστολείς του CYP 2D6, αυξάνουν τα επίπεδα της ρισπεριδόνης στο πλάσμα, αλλά σε μικρότερο βαθμό αυτών του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη 151. Όταν αρχίζει ή διακόπτεται η ταυτόχρονη χορήγηση φλουοξετίνης ή παροξετίνης, ο θεράπων γιατρός θα πρέπει να επαναξιολογεί τη δοσολογία της ρισπεριδόνης. Όταν η ρισπεριδόνη χορηγείται ταυτόχρονα με άλλα φάρμακα που έχουν υψηλή πρωτεϊνική σύνθεση, δεν υπάρχει σημαντικά κλινικά σημαντική εκτόπιση, είτε της ρισπεριδόνης είτε των άλλων φαρμάκων, από τις πρωτεΐνες του πλάσματος Αμισουλπρίδη Η αμισουλπρίδη (Εικόνα 14) ανήκει στα άτυπα ή δεύτερης γενιάς αντιψυχωσικά και στην χημική ομάδα των βενζαμιδών. Οι βενζαμίδες οι οποίες είναι παράγωγα του βενζοϊκού οξέος είναι ελάχιστα διαλυτές στο νερό. Στην κατηγορία των βενζαμιδών ανήκουν ουσίες με αναλγητικές ιδιότητες (σαλικυλαμίδη κ.α.), 62

63 αντιεμετικές (σισαπρίδη, ντομπεριδόνη, μετοκλοπραμίδη κ.α.), αντιψυχωσικές (αμισουλπρίδη, σουλπιρίδη, σουλτοπρίδη, τιαπρίδη, ρεμοξιπρίδη κ.α.) και άλλες (εντινοστάτη, ετικλοπρίδη, προκαρμπαζίνη κ.α.). Η αμισουλπρίδη κυκλοφόρησε την δεκαετία του 1990 από την εταιρεία Sanofi- Aventis και η πρωτότυπη πατέντα έχει λήξει το Το εμπορικό της όνομα στην Ευρώπη είναι Solian. Εικόνα 14: Χημική δομή της Αμισουλπρίδης Πίνακας 6: Χαρακτηριστικά αμισουλπρίδης Συστηματική ονομασία 4-amino-N-[(1-ethylpyrrolidin-2-yl)methyl]- (IUPAC) 5-ethylsulfonyl-2-methoxy-benzamide Χημικός Τύπος Μοριακό βάρος C 17 H 27 N 3 O 4 S g/mol Βιοδιαθεσιμότητα 48% Χρόνος ημίσειας ζωής Απέκκριση Χορήγηση 12 ώρες Ούρα Από το στόμα. Ενδομυική Η αμισουλπρίδη έχει ένδειξη για την θεραπεία της σχιζοφρένειας, των ψυχωσικών διαταραχών, των μανιακών επεισοδίων της διπολικής διαταραχής και σε 63

64 κάποιες χώρες έχει εγκριθεί η χρήση της για την δυσθυμία 153. Έχει χρησιμοποιηθεί επίσης σε πειραματικές μελέτες για την αντιμετώπιση της μετεγχειρητικής υπερέμεσης 154, της ψυχωτικής κατάθλιψης 155 και της κατάθλιψης που ακολουθεί την χημειοθεραπεία καρκινοπαθών 156. Σε χαμηλές δόσεις θεωρητικά η αμισουλπρίδη αποκλείει επιλεκτικά τους ανασταλτικούς προσυναπτικούς αυτοϋποδοχείς της ντοπαμίνης διευκολύνοντας έτσι την δραστηριότητα της ντοπαμίνης 157 με αποτέλεσμα τη βελτίωση της δυσθυμίας. Θεωρητικά σε υψηλότερες δόσεις αποκλείει τους μετασυναπτικούς υποδοχείς ντοπαμίνης τύπου 2. Ενδέχεται να λειτουργεί ως μερικός αγωνιστής των υποδοχέων τύπου 2 ντοπαμίνης, οδηγώντας σε μείωση της απελευθέρωσης της ντοπαμίνης όταν οι συγκεντρώσεις της είναι υψηλές και σε αύξηση της απελευθέρωσης όταν οι συγκεντρώσεις της ντοπαμίνης είναι χαμηλές. Ο αποκλεισμός των τύπου 3 υποδοχέων της ντοπαμίνης, συμβάλλει επίσης στην κλινική της δράση. Σε αντίθεση με τα υπόλοιπα άτυπα αντιψυχωτικά, η αμισουλπρίδη δεν έχει σημαντικές επιδράσεις στους υποδοχείς της σεροτονίνης. Η αμισουλπρίδη και η συγγενική της σουλπιρίδη συνδέονται επίσης και ενεργοποιούν τον υποδοχέα του γάμμα υδροξυβουτυρικού (GHB) με θεραπευτικές επιδράσεις 158. Η συνήθης δοσολογία χορήγησης της αμισουλπρίδης σε ασθενείς με σχιζοφρένεια είναι mg/ημέρα με μέγιστη δόση τα 1200 mg/ημέρα, για τα αρνητικά συμπτώματα mg/ημέρα και για τη δυσθυμία 50 mg/ημέρα. Η απόλυτη βιοδιαθεσιμότητα της υπολογίζεται στο 48%, η σύνδεσή της με πρωτεϊνες είναι 16% και ο χρόνος ημίσειας ζωής της εκτιμάται στις 12 ώρες 159. Μεταβολίζεται ελάχιστα στο ήπαρ ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό της απεκκρίνεται χωρίς να έχει υποστεί μεταβολισμό με τα ούρα (23 46%) και τα κόπρανα 160. Έχουν αναφερθεί ανεπιθύμητες ενέργειες από τη χρήση της αμισουλπρίδης, όπως ανησυχία, άγχος, αϋπνία ή υπνηλία, σιελόρροια, κεφαλαλγία, ναυτία, έμετος, υπερπρολακτιναιμία με απότοκη γαλακτόρροια, αμηνόρροια και σεξουαλικές διαταραχές, αύξηση βάρους, αντιχολινεργικές ανεπιθύμητες ενέργειες (ξηροστομία, δυσκοιλιότητα, θολή όραση) και εξωπυραμιδικά συμπτώματα (δυστονία, τρόμος, ακαθησία, παρκινσονισμός) 161. Σπανιότερα μπορεί να προκαλέσει όψιμη δυσκινησία, επιληπτικές κρίσεις, υπόταση, αιματολογικές διαταραχές (λευκοπενία, ουδετεροπενία 64

65 και ακοκκιοκυτταραιμία)βραδυκαρδία, αίσθημα παλμών και διαταραχές του διαστήματος QT της ηλεκτρικής αγωγής του καρδιακού ρυθμού Αριπιπραζόλη Η αριπιπραζόλη, με χημικό τύπο C 23 H 27 Cl 2 N 3 O 2 (Εικόνα 15), ανήκει επίσης στην κατηγορία των άτυπων αντιψυχωσικών. Το 2002 εγκρίθηκε για την θεραπεία της σχιζοφρένειας στις Ηνωμένες Πολιτείες και δύο χρόνια αργότερα στην Ευρώπη. Κυκλοφόρησε στην Ιαπωνία από την εταιρεία Otsuka και η πατέντα της έληξε τον Οκτώβριο Στο εμπόριο βρίσκεται με τα ονόματα Abilify ή Aripiprex. Εικόνα 15: Χημική δομή της αριπιπραζόλης Πίνακας 7 : Xαρακτηριστικά αριπιπραζόλης Χημικός τύπος C 23 H 27 Cl 2 N 3 O 2 Συστηματική ονομασία (IUPAC) Μοριακό Βάρος 7-[4-[4-(2,3-dichlorophenyl) piperazin-1-yl] butoxy]- 3,4-dihydro- 1H-quinolin- 2-one g/mol 65