ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΙΧΑΗΛ Ν. ΛΕΟΤΣΙΝΙΔΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινικές-Κλινικοεργαστηριακές Ιατρικές Ειδικότητες» ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΩΝ ΑΝΘΕΛΜΙΝΘΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΟ ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΤΣΙΜΠΟΥΚΗΣ Κτηνίατρος, M.Sc. Εφαρμοσμένης Δημόσιας Υγείας & Περιβαλλοντικής Υγιεινής ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2013

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΙΧΑΗΛ Ν. ΛΕΟΤΣΙΝΙΔΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινικές-Κλινικοεργαστηριακές Ιατρικές Ειδικότητες» ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΩΝ ΑΝΘΕΛΜΙΝΘΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΟ ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΤΣΙΜΠΟΥΚΗΣ Κτηνίατρος, M.Sc. Εφαρμοσμένης Δημόσιας Υγείας & Περιβαλλοντικής Υγιεινής ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Μιχαήλ Λεοτσινίδης Αν. Καθηγητής Υγιεινής Πανεπιστημίου Πατρών Επιβλέπων Καθηγητής, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Ελένη Γελαστοπούλου Αν. Καθηγήτρια Υγιεινής Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Ελένη Ιωσηφίδου Αν. Καθηγήτρια Υγιεινής Τροφίμων Ζωικής Προέλευσης Α.Π.Θ. Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Μιχαήλ Λεοτσινίδης Αν. Καθηγητής Υγιεινής Πανεπιστημίου Πατρών Επιβλέπων Καθηγητής, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Ελένη Γελαστοπούλου Αν. Καθηγήτρια Υγιεινής Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Ελένη Ιωσηφίδου Αν. Καθηγήτρια Υγιεινής Τροφίμων Ζωικής Προέλευσης Α.Π.Θ. Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Ευάγγελος Αναστασίου Καθηγητής Μικροβιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Χριστόδουλος Φλωρδέλλης Καθηγητής Φαρμακολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γεώργιος Ντίνος Αν. Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Απόστολος Βανταράκης Επ. Καθηγητής Υγιεινής Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής 2

4 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ ΜΕ ΚΡΙΤΕΣ 1. Tsiboukis D, Sazakli E, Gortzi O, Hadjichristodoulou C, Matara C and Leotsinidis M. Assessing quality of raw milk in southern Greece in the aspect of certain benzimidazole residues. Food Additives and Contaminants Part B 2010;3: Tsiboukis D, Sazakli E, Jelastopulu E and Leotsinidis M. Anthelmintics residues in raw milk. Assessing intake by a children population. Polish Journal of Veterinary Sciences 2013;1: ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. Tsiboukis D, Sazakli E, Jelastopulu E, Iosifidou E and Leotsinidis M. Benzimidazoles in raw milk. Presented at IDF International Symposium on Sheep, Goat and other non-cow Milk, Athens, Greece, May

5 Στους γονείς μου, Νικόλαο και Ευφροσύνη και στον αδελφό μου Βασίλειο, με αγάπη Στη σύζυγό μου Κωνσταντίνα και στα παιδιά μας Στη μνήμη του παππού μου, Δημητρίου και των θείων μου, Ανδρέα και Αθανασίου 4

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 7 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ) 9 I. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή Κτηνιατρικά φάρμακα και ασφάλεια τροφίμων Τοξικολογικοί κίνδυνοι Φαρμακολογικοί κίνδυνοι Μικροβιολογικοί κίνδυνοι Ανοσολογικοί κίνδυνοι Κίνδυνοι διαταραχής ενζύμων Οι Βενζιμιδαζολες Γενικά περί Βενζιμιδαζολών Χρήση και τρόπος δράσης βενζιμιδαζολών Φυσικοχημικές ιδιότητες Φαρμακοκινητική BZ -Γενικά NETO, ABZ, ABZ-SO FEB, FBZ, OFZ MBZ Παράγοντες που επηρεάζουν το μεταβολισμό των ΒΖ Απέκκριση των ΒΖ στο γάλα Παρακολούθηση για υπολείμματα ΒΖ στα τρόφιμα Τοξικότητα Η διάχυση των βενζιμιδαζολών στο περιβάλλον Τρόποι μεταφοράς στο περιβάλλον Διάχυση στα εδαφικά οικοσυστήματα Διάχυση στα υδάτινα οικοσυστήματα 52 II. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 54 III. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 57 Α. Περιγραφή της μελέτης Δειγματοληψία Υλικά και μέθοδοι Συσκευές Αντιδραστήρια Χημική Ανάλυση Εκχύλιση Καθαρισμός 63 5

7 3.3 Ανάλυση με HPLC Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση Πιστότητα και ακρίβεια Εκτίμηση κατανάλωσης γάλακτος 72 Β. Αποτελέσματα 73 Γ. Συζήτηση 84 Δ. Συμπεράσματα 91 Ε. Προτάσεις για την αντιμετώπιση του προβλήματος 92 IV. ΠΕΡΙΛΗΨΗ-ABSTRACT 95 ΣΥΜΒΟΛΕΣ-CREDITS 99 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 100 6

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Υπηρετώντας ως πρωτοδιοριζόμενος νέος επιστήμονας στα Αγροτικά Κτηνιατρεία της Κλειτορίας και της Πάτρας και αργότερα ως ελεγκτής του ΟΠΕΚΕΠΕ, διαπίστωσα ότι η χορήγηση κτηνιατρικών φαρμάκων στους κτηνοτρόφους παρουσίαζε κάποιες ιδιαιτερότητες. Συγκεκριμένα παρατήρησα ότι η πλειοψηφία των παραγωγών, αγόραζαν κτηνιατρικά φάρμακα χωρίς να έχουν τη σχετική συνταγή και μάλιστα πολλές φορές η αγορά αυτή γινόταν χωρίς να έχουν συμβουλευτεί κτηνίατρο. Δηλαδή προσέρχονταν σε κάποιο κατάστημα πώλησης κτηνιατρικών φαρμάκων (φαρμακείο, καταστήματα γεωπόνων) και αγόραζαν ό,τι αυτοί έκριναν κατάλληλο ή ό,τι τους χορηγούσε ο πωλητής κάθε φορά. Σε ορεινές-απομακρυσμένες περιοχές όπου δεν υπήρχε κτηνίατρος το φαινόμενο αυτό ήταν κανόνας. Αναλογιζόμενος τους πιθανούς σχετικούς κινδύνους για τη Δημόσια Υγεία, από την αλόγιστη αυτή χρήση των κτηνιατρικών φαρμακευτικών ουσιών, έθεσα τους προβληματισμούς μου στον Αναπληρωτή Καθηγητή Υγιεινής του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Μιχάλη Λεοτσινίδη. Ο κ. Λεοτσινίδης αντιλήφθηκε από την πρώτη στιγμή το πρόβλημα της ορθής χρήσης των κτηνιατρικών φαρμάκων και μου εμπιστέυθηκε την παρούσα Διατριβή. Η εκπόνησή της, δεν ήταν αποτέλεσμα μονομερούς εργασίας. Κατά τη διάρκεια της διεκπεραίωσής της, χρειάστηκε η συμβολή πολλών μελών του επιστημονικού, επαγγελματικού και οικογενειακού μου χώρου, στα οποία απευθύνεται το ακόλουθο ευχαριστήριο σημείωμα. Εκφράζοντας την ικανοποίησή μου για τη συνεργασία και τη συμβολή τους, απευθύνομαι στους: Αναπληρωτή Καθηγητή Υγιεινής του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Μιχάλη Λεοτσινίδη ο οποίος παρείχε αμέριστα τη βοήθειά του σε κάθε δυσκολία που παρουσιάστηκε, σε όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Κοντά του είχα τη σπάνια ευκαιρία, ως νέος επιστήμονας να εμβαθύνω στην Ενόργανη Ανάλυση και ως άνθρωπος να διδαχθώ πολλά για τη μετέπειτα ζωή μου. Τον ευχαριστώ ολόψυχα για τη εμπιστοσύνη και την υπομονή που επέδειξε κατά την επίβλεψη της Διδακτορικής μου Διατριβής. Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών, κυρία Ελένη Γελαστοπούλου, για τις ουσιαστικές συμβουλές και παρατηρήσεις της, κατά τη διάρκεια της διεκπεραίωσης του παρόντος έργου. Εξαίρετη επιστήμονας, ήταν πάντα διαθέσιμη να συμβάλλει με τις γνώσεις της, στην επίλυση κάθε δυσκολίας που παρουσιάστηκε. Αναπληρώτρια Καθηγήτρια της Κτηνιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κυρία Ελένη Ιωσηφίδου, για την καθοδήγηση και τις ουσιαστικές παρατηρήσεις της στη συγγραφή της παρούσας διατριβής. Από την περίοδο των βασικών σπουδών μου ακόμα, η κυρία Ιωσηφίδου με βοήθησε να αποκτήσω την κατάλληλη για εμένα θεώρηση, αυτής της μεγάλου εύρους επιστήμης που λέγεται Κτηνιατρική. Επιστημονική Συνεργάτιδα του Εργαστηρίου Υγιεινής του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών, Δρ Υγιεινής-Χημικό, κα Ελένη Σαζακλή για τις πολύτιμες συμβουλές και την καθοδήγησή της, τόσο στο εργαστηριακό μέρος, όσο και στη συγγραφή της παρούσας Διατριβής. Πολύτιμη βοήθεια μου παρείχαν οι συνάδελφοί μου Αστέριος Χριστοδούλου (Κτηνίατρος ΕΛ.Γ.Α.) Ιωάννα Τσιλιγιάννη (Κτηνίατρος ΕΛ.Ο.ΓΑ.Κ.), Αντώνιος Φωτόπουλος (Κτηνίατρος ΕΛ.Ο.ΓΑ.Κ.), Αθηνά Τραχήλη (Πρόεδρος Πανελληνίου Κτηνιατρικού Συλλόγου), καθώς και ο Δρ Χημικός Νεκτάριος Τζαβέλλας. 7

9 Θα ήταν παράλειψη να μην aναφερθώ στην άριστη συνεργασία που είχαμε με την κυρία Βασιλική Παπαδοπούλου, παρασκεύαστρια του Εργαστηρίου Υγιεινής του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους υπευθύνους του ΕΛ.Ο.ΓΑ.Κ., και της Ένωσης Αγροτικών Συνεταιρισμών Καλαβρύτων, οι οποίοι μου παρείχαν κάθε βοήθεια για τη συλλογή των δειγμάτων γάλακτος. Οι συνάδελφοί μου στον Ο.Π.Ε.Κ.Ε.Π.Ε. Πελοποννήσου, Δυτικής Ελλάδος και Ιονίου, μου συμπαραστάθηκαν σε αυτή την προσπάθεια, και ιδιαιτέρως οι: Σοφία Αυγεράκη, Χριστίνα Παπαδοπούλου, Δημήτρης Νικολούζος, Μηλιά Σιώχου, Ιωάννα Φραγκοπαναγιώτη και Σοφία Γκορόγια. Τις ευχαριστίες μου οφείλω και στον εξάδελφό μου, Χρήστο Α. Τσιμπούκη, για τη βοήθειά του. Τέλος, η παρούσα διατριβή δε θα είχε ολοκληρωθεί χωρίς την υπομονή και την υποστήριξη της συζύγου μου Κωνσταντίνας και το γέλιο των τριών παιδιών μας, Δέσποινας, Ζωής και της νεογέννητης κορούλας μας. Δημήτριος Τσιμπούκης Απρίλιος

10 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ) ABZ Albendazole Αλβενδαζόλη ADI Acceptable Daily Intake Αποδεκτή Ημερήσια Πρόσληψη Καταλοίπου AUC Area Under the Concentration Curve Περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης φαρμάκου BHT 2.6-Di-tert-butyl-4-methylphenol BZ Benzimidazoles Βενζιμιδαζόλες CAM Cambendazole Καβενδαζόλη DAD Diode Array Detector Ανιχνευτής Συστοιχίας Διόδων DMSO Dimethylsulfoxide Διμεθυλοσουλφοξείδιο EDI Estimated Daily Intake Εκτιμώμενη Ημερήσια Πρόσληψη FAO Food and Agriculture Organization Παγκόσμιος Οργανισμός Τροφίμων και Γεωργίας FARAD Βάση Δεδομένων Αποφυγής Food Animal Residue Avoidance Καταλοίπων στα Τρόφιμα Ζωικής Databank Προέλευσης FBZ Fenbendazole Φαινβενδαζόλη FEB Febantel Φαιβαντέλη FFQ Food Frequency Questionnaire Ερωτηματολόγιο Συχνότητας Κατανάλωσης Τροφίμων FLU Flubendazole Φλουβενδαζόλη FMO Flavoprotein Mono Ogygenase Φλαβο-Μονοοξυγενάση GOT Glutamic Oxaloacetic Transaminase Γλουταμική Οξαλοξική Τρανσαμινάση GPT Glutamic Pyruvic Transaminase Γλουταμική Πυρουβική Τρανσαμινάση GVP Good Veterinary Practice Ορθή Κτηνιατρική Πρακτική (Ο.Κ.Π.) HACCP Hazard Analysis Critical Control Points Ανάλυση Επικινδυνότητας και Κρίσιμων Σημείων Ελέγχου HPLC High Performance Liquid Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Chromatography Απόδοσης i.r. intraruminal Ενδοστομαχικός IVM Ivermectin Ιβερμεκτίνη LC Liquid Chromatography Υγρή Χρωματογραφία LOD Limit of Detection Όριο Ανίχνευσης LOQ Limit of Quantification Όριο Ποσοτικοποίησης LUX Luxabendazole Λουξαβενδαζόλη MBZ Mebendazole Μεβενδαζόλη 9

11 MRL Maximum Residue Limit Ανώτατο Όριο Καταλοίπου MS Mass Spectometry Φασματομετρία Μάζας NaH 2 PO 4 Sodium Dihydrogen Phosphate Δισόξινο Φωσφορικό Νάτριο NETO Netobimin Νετοβιμίνη -NH 2 Amine functional group Αμινική ρίζα NOAEL No Observed Adverse Effect Level Επίπεδο συγκέντρωσης καταλοίπου, στο οποίο δεν παρατηρούνται δυσμενείς επιπτώσεις για την υγεία OFZ Oxfendazole Οξφαινδαζόλη -OH Hydroxyl functional group Υδροξυλική ρίζα OXI Oxibendazole Οξιβενδαζόλη ΡΒΖ Parbendazole Παρβενδαζόλη p.o. per os Από του στόματος χορήγηση s.c. subcutaneously υποδορίως S/N Signal to Noise Σήμα προς Θόρυβο -SO Sulfoxide Σουλφοξειδική ρίζα -SO 2 Sulfone Σουλφονική ρίζα ΤΒΖ Thiabendazole Θιαβενδαζόλη TCB Triclabendazole Τρικλαβενδαζόλη ΓΕΣ Gastrointestinal Tract Γαστρεντερικός Σωλήνας ΕΛ.Ο.ΓΑ.Κ. Greek Milk and Meat Organization Ελληνικός Οργανισμός Γάλακτος και Κρέατος ΕΟΦ National Organization for Medicines Εθνικός Οργανισμός Φαρμάκων Ε.Φ.Ε.Τ. Hellenic Food Authority Ενιαίος Φορέας Ελέγχου Τροφίμων κ.φ.ο. Veterinary Drug Substances Κτηνιατρικές Φαρμακευτικές Ουσίες σβ body weight σωματικό βάρος 10

12 I. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

13 1. Εισαγωγή Τα τρόφιμα ως γνωστόν, περιέχουν συστατικά τα οποία έχουν θρεπτική αξία για τους καταναλωτές. Όμως συχνά η κατανάλωση διαφόρων τροφίμων, είναι δυνατό να εκθέτει τον καταναλωτή σε διατροφικούς κινδύνους. Ως διατροφικός κίνδυνος, ορίζεται κάθε βιολογικός, φυσικός ή χημικός παράγοντας/ιδιότητα ενός τροφίμου, η κατανάλωση του οποίου μπορεί να έχει δυσμενείς επιπτώσεις στην υγεία του καταναλωτή [1]. Ανάμεσα σε ένα μεγάλο αριθμό χημικών κινδύνων, όπως είναι τα συντηρητικά και οι διοξίνες, υπάρχει και ο κίνδυνος της εμφάνισης καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων στα τρόφιμα ζωικής προέλευσης. Στις σύγχρονες πρακτικές εκτροφής, οι φαρμακευτικές ουσίες χρησιμοποιούνται ευρέως. Το γεγονός αυτό συνδέεται με την εντατικοποίηση των κτηνοτροφικών μονάδων. Σε αντίθεση με το παρελθόν όπου οι εκτροφές ήταν εκτατικές και το ζωικό κεφάλαιο περιπλανιόταν ελεύθερο σε μεγάλες εκτάσεις της υπαίθρου για την ανεύρεση χορτονομής, σήμερα η εκτροφή λαμβάνει χώρα σε περιορισμένες εκτάσειςπολλές φορές και με συνωστισμό-γεγονός που έχει αυξήσει ραγδαία την εμφάνιση και την εξάπλωση ασθενειών. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο αυξήθηκε η ανάγκη χρήσης θεραπευτικών παραγόντων στα ζώα [2]. Τα φάρμακα χρησιμοποιούνται στην εκτροφή αγροτικών ζώων για διάφορους λόγους, όπως η θεραπεία και η πρόληψη νοσημάτων ή ο συγχρονισμός του οίστρου. Λόγω του ότι όλες οι ουσίες που χρησιμοποιούνται στις εκτροφές δεν έχουν θεραπευτική δράση, είθισται να αναφέρονται ως «κτηνιατρικά φάρμακα» στην Ευρωπαϊκή Ένωση οποιεσδήποτε φαρμακολογικά ενεργές ουσίες, ακόμη και τα εμβόλια, ανεξάρτητα από το εάν χρησιμοποιούνται σε ζώα συντροφιάς ή παραγωγικά ζώα [3]. Λόγω της εκτεταμένης χρήσης των φαρμάκων στη ζωική παραγωγή, είναι δυνατό, το ίδιο το φάρμακο ή οι μεταβολίτες του, να εμφανισθούν υπολειμματικά σε εδώδιμα ζωικά προϊόντα. Αν και οι περιπτώσεις που έχουν καταγραφεί διεθνώς και αφορούν ανθρώπινη ασθένεια, η οποία έχει πιστοποιηθεί ότι οφείλεται σε κατανάλωση καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων, μέσω της τροφής, είναι ελάχιστες, η τοξικότητα πολλών κτηνιατρικών φαρμάκων έχει περιγραφεί και δε θα πρέπει να παραβλέπεται [4]. 12

14 1.1 Κτηνιατρικά φάρμακα και ασφάλεια τροφίμων Είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί, ότι ο δραστικός περιορισμός της τροφής, ως μέσο για την ελαχιστοποίηση της πιθανότητας πρόσληψης τοξικών χημικών καταλοίπων, δεν αποτελεί την ενδεδειγμένη λύση σε αυτό το πρόβλημα. Ένας τέτοιος περιορισμός, στερεί από τον οργανισμό τις απαραίτητες θρεπτικές ουσίες και κατά συνέπεια ενέχει μεγαλύτερο κίνδυνο για την υγεία του καταναλωτή σε σχέση με τον κίνδυνο που προκύπτει από τη σταδιακή πρόσληψη κάποιων καταλοίπων τοξικών ουσιών που συμβαίνει να εμφανίζονται στα τρόφιμα [5]. Οι τροφές περιέχουν φυσικά, σκοπίμως ή άσκοπα, ένα ευρύ φάσμα ουσιών οι οποίες είναι είτε επιθυμητές (θρεπτικά συστατικά, πρόσθετα, διαιτητικές ίνες), είτε αδιάφορες (για τις οποίες ίσως να μη γνωρίζουμε τις συνέπειες που προκαλούν ή τις ιδιότητές τους), είτε ανεπιθύμητες (φυσικές τοξίνες, κατάλοιπα γεωργικών και κτηνιατρικών φαρμάκων, μυκοτοξίνες ή υπερβολικά αυξημένες συγκεντρώσεις θρεπτικών ουσιών) [6]. Όλες οι προαναφερόμενες ουσίες σε χαμηλές ή υψηλές συγκεντρώσεις είναι δυνατό να αποτελούν κίνδυνο. Τα επίπεδα συγκέντρωσης αυτών των ουσιών στα τρόφιμα, είναι η βασική παράμετρος που εξετάζεται από την πλευρά της δημόσιας υγείας [5]. Τα κτηνιατρικά φάρμακα, μπορούν να χρησιμοποιούνται μετά από έγκριση για συγκεκριμένη εφαρμογή. Στη συνέχεια, η παρουσία ή απουσία των ουσιών αυτών από τις τροφές, εξαρτάται από την ορθή χρήση τους, από τους κτηνιάτρους, οι οποίοι θα πρέπει να τις χρησιμοποιούν σκεπτόμενοι, όχι μόνο την ευζωία του ζωικού κεφαλαίου, αλλά και την υγεία του καταναλωτή των προϊόντων που προκύπτουν από τα ζώα αυτά [7]. Μερικά κτηνιατρικά φάρμακα χρησιμοποιούνται ευρέως για την πρόληψη ασθενειών (π.χ. βενζιμιδαζόλες), αλλά αρκετά άλλα χρησιμοποιούνται μόνο σε περίπτωση ανάγκης (π.χ. αντιφλεγμονώδη). Η χρήση τους διέπεται από τους κανόνες της Ορθής Κτηνιατρικής Πρακτικής (Ο.Κ.Π.-Good Veterinary Practice-GVP) [1]. Για παράδειγμα για κάθε φάρμακο έχει ορισθεί συγκεκριμένος χρόνος αναμονής, ανάμεσα στη χορήγηση και τη σφαγή ή το άρμεγμα. Έχοντας ως δεδομένο ότι τα εγκεκριμένα κτηνιατρικά φάρμακα χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τις αναγραφόμενες οδηγίες και τους όρους αδειοδότησής τους, καθώς και ότι οι χρόνοι αναμονής τηρούνται από τους κτηνοτρόφους, κατάλοιπά τους δε θα πρέπει να εμφανίζονται σε επικίνδυνα για τον άνθρωπο επίπεδα συγκέντρωσης στην τροφή [8]. Με τον όρο χρόνος αναμονής, ορίζεται η αναγκαία χρονική περίοδος που πρέπει να μεσολαβεί μεταξύ της τελευταίας χορήγησης του κτηνιατρικού φαρμάκου σε ζώα υπό κανονικές 13

15 συνθήκες χρήσης, και της παραγωγής τροφίμων από τα εν λόγω ζώα, ώστε να προστατεύεται η δημόσια υγεία δια της διασφαλίσεως ότι τα εν λόγω τρόφιμα δεν περιέχουν κατάλοιπα σε ποσότητες που υπερβαίνουν τα ανώτατα όρια καταλοίπων δραστικών ουσιών [9]. Επιπλέον, για λόγους δημόσιας υγείας, ένας μεγάλος όγκος δεδομένων απαιτείται να παρουσιαστεί από τις φαρμακευτικές εταιρείες, που να διασφαλίζει την καταλληλότητα του κτηνιατρικού φαρμάκου, πριν εγκριθεί η κυκλοφορία του στην αγορά. Κανένα κτηνιατρικό φάρμακο δεν κυκλοφορεί στην αγορά εάν δεν υπάρχει έγκριση από τον αρμόδιο κρατικό φορέα. Οι δοκιμές που διεξάγονται για την έγκρισητοξικολογικές, καρκινογένεσης, μεταλλαξιγένεσης, τερατογένεσης-έχουν ως κύριο στόχο τον προσδιορισμό ενός επιπέδου δόσης, στο οποίο δεν παρατηρείται καμία δυσμενής επίπτωση σε ζωικούς οργανισμούς [10]. Αυτή η δόση είναι γνωστή με τη διεθνή ορολογία ως «no observed adverse effect level» ή NOAEL (Επίπεδο συγκέντρωσης καταλοίπου, στο οποίο δεν παρατηρούνται δυσμενείς επιπτώσεις για την υγεία) [11]. Από τη στιγμή που ορίζεται μία τιμή NOAEL, χρησιμοποιώντας ένα συντελεστή ασφαλείας, μπορεί να υπολογισθεί μία τιμή ADI (Acceptable Daily Intake-Αποδεκτή Ημερήσια Πρόσληψη Καταλοίπου), η οποία αντιστοιχεί στην ποσότητα που μπορεί να προσλαμβάνει ο καταναλωτής ημερησίως και για όλη τη διάρκεια της ζωής του, χωρίς την πιθανότητα εκδήλωσης δυσμενών επιπτώσεων [11]. Το μέγεθος του συντελεστή ασφαλείας είναι 100 και προκύπτει από το γινόμενο δύο άλλων συντελεστών καθένας από τους οποίους ισούται με 10. Ο ένας συντελεστής αφορά το γεγονός ότι οι άνθρωποι θεωρούνται 10 φορές πιο ευαίσθητοι από τα πειραματόζωα και ο άλλος αφορά την πιθανή διαφορά στην ευαισθησία μεταξύ των ανθρώπων. Αφού ορισθεί μία ADI, θα πρέπει να καθοριστεί ένα ανώτατο όριο καταλοίπου (Maximum Residue Limit-MRL), σε κάθε προϊόν ζωικής προέλευσης, ώστε η ανθρώπινη κατανάλωση να μην οδηγεί σε ποσότητες καταλοίπου οι οποίες να υπερβαίνουν την ADI. Ο καθορισμός των MRLs, εξαρτάται από έναν αριθμό παραγόντων, όπως η πιθανότητα κατανάλωσης ενός προϊόντος και οι διατροφικές συνήθειες του πληθυσμού. Το κατά πόσο οι παράγοντες αυτοί απεικονίζουν την πραγματικότητα, είναι αντικείμενο συζήτησης. Επίπεδα συγκέντρωσης καταλοίπων σε ένα τρόφιμο κοντά στο MRL, συνήθως οδηγούν σε καταναλώσεις, αρκετά χαμηλότερες της ADI [10]. Η συγκέντρωση του καταλοίπου, θα πρέπει να είναι πολλές φορές μεγαλύτερη του MRL σε ένα τρόφιμο για να προσεγγισθεί η τιμή της ADI από τον καταναλωτή. 14

16 Κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρμάκων εμφανίζονται στο κρέας, το γάλα, τα αυγά και το μέλι σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Έχουν καταγραφεί και κάποιες παρενέργειες που δε σχετίζονται με την ποσότητα κατανάλωσης του καταλοίπου, όπως είναι οι αλλεργικές αντιδράσεις σε ευαισθητοποιημένους καταναλωτές [12]. Σε περιπτώσεις όμως όπου συμβαίνει υπερβολική χρήση ή μη συμμόρφωση με τους χρόνους αναμονής, πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις υπολειμμάτων μπορεί να εμφανισθούν σε εδώδιμους ιστούς και προϊόντα. Το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε διάφορες επικίνδυνες καταστάσεις για τη δημόσια υγεία, όπως τοξικολογικοί, μικροβιολογικοί φαρμακολογικοί και άλλοι κίνδυνοι [12] Τοξικολογικοί κίνδυνοι Τα κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρμάκων που εμφανίζονται σε διάφορες τροφές είναι δυνατό να προκαλέσουν άμεσα τοξικά αποτελέσματα. Οι πιθανοί κίνδυνοι εκδήλωσης άμεσων τοξικολογικών συνεπειών, αφορούν την απλαστική αναιμία που προκαλείται από τη χλωραμφαινικόλη, αλλεργικές αντιδράσεις από τις β-λακτάμες και αδρενεργικά συμπτώματα, οφειλόμενα σε β 2 -αγωνιστές, ενώ οι χρόνιες επιπτώσεις, σχετίζονται με ανοσοκαταστολή, μεταλλαξιγένεση, τερατογένεση και καρκινογένεση [13]. Ωστόσο η μοναδική περίπτωση μαζικών και οξέων δηλητηριάσεων που οφείλονται σε κατανάλωση τροφίμου που περιέχει κατάλοιπα κτηνιατρικού φαρμάκου, αφορά την κλενβουτερόλη [14]. Ένα μείζον ζήτημα που αφορά τα κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρμάκων είναι η πιθανότητα εμφάνισης καρκινογενέσεων. Οι διεθνείς ωστόσο αναφορές [15-18], οι οποίες κάνουν λόγο για διαπιστωμένη ή πιθανή καρκινογένεση οφειλόμενη σε κτηνιατρικές φαρμακευτικές ουσίες (κ.φ.ο.), αφορούν ουσίες οι οποίες δε χρησιμοποιούνται σήμερα στην Ελλάδα ως κτηνιατρικά φάρμακα [19]. Αρκετές μελέτες υπάρχουν, όπως θα αναφερθεί σε επόμενο κεφάλαιο, για την τερατογόνο δράση ορισμένων κ.φ.ο. [12]. Πρόκειται για ουσίες που επιδρούν στα σωματικά κύτταρα του αναπτυσσόμενου εμβρύου, με αποτέλεσμα την ελαττωματική ανάπτυξη των οργάνων του [20]. Κατά την εμβρυική ζωή, λαμβάνει χώρα το στάδιο της οργανογένεσης, στο οποίο το κύημα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στην τοξική επίδραση των φαρμάκων. Η εκδήλωση της τερατογένεσης, είναι πιθανό να συμβεί μετά από παροδική έκθεση σε έναν εμβρυοτοξικό παράγοντα κατά τη διάρκεια της κρίσιμης περιόδου των αρχικών σταδίων της κύησης [20-21]. Η τερατογένεση είναι δυνατό να 15

17 εμφανισθεί μετά από μία και μόνο έκθεση στο χημικό παράγοντα. Διάφορα κτηνιατρικά φάρμακα είναι γνωστά για την τερατογόνο δράση τους, ανάμεσά τους όπως αναφέρεται και στη συνέχεια, είναι και οι βενζιμιδαζόλες (ΒΖ) [22]. Αν και η εθελοντική λήψη θεραπείας κατά την ανθρώπινη κύηση αποφεύγεται, πάντα υπάρχει ο κίνδυνος ακούσιας πρόσληψης τερατογόνων ουσιών, μέσω της τροφής [20]. Ένα από τα κρίσιμα ζητήματα για την αποφυγή μιάς τέτοιας έκθεσης, είναι η γνώση του πότε μία κύηση θεωρείται ότι βρίσκεται σε πρώιμο στάδιο. Και μπορεί μέσω των πειραμάτων να είναι γνωστές οι ημερομηνίες ζευγαρώματος και οι υπόλοιπες κρίσιμες ημερομηνίες για τα πειραματόζωα, δεν ισχύει όμως το ίδιο και για τον άνθρωπο. Σε γυναίκες που εμφανίζουν ακανόνιστους κύκλους εμμήνου ρήσεως, δεν είναι δυνατό να γίνει άμεσα αντιληπτό εάν υπάρχει κύηση [12]. Μέχρι να γίνει αυτό, οι τερατογόνες επιδράσεις ενός καταλοίπου-που έχει ακουσίως προσληφθεί με την τροφή-στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, θα έχουν ήδη λάβει χώρα. Ένας μεγάλος αριθμός γυναικών σε αναπαραγωγική ηλικία, είναι πιθανό να εκτεθούν σε τέτοιους κινδύνους, πριν ακόμη αναγνωρισθεί η κύησή τους [12, 20] Φαρμακολογικοί κίνδυνοι Ένα γνωστό παράδειγμα είναι η πρόκληση δυσμενών αποτελεσμάτων στα δόντια και τα οστά των αναπτυσσόμενων παιδιών, λόγω πρόσληψης τετρακυκλινών, από οποιαδήποτε πηγή, και από τα τρόφιμα [12]. Ωστόσο οι ποσότητες που προσλαμβάνονται από τα τρόφιμα πολύ δύσκολα θα προσεγγίσουν τη θεραπευτική δόση, πόσο μάλλον την τοξικολογική Μικροβιολογικοί κίνδυνοι Έχει παρατηρηθεί ανάπτυξη αντιβιοτικοαντοχής από εντερόκοκκους ζώων, στη βανκομυκίνη. Στα ζώα αυτά χορηγούνταν αντιβιοτικά στο σιτηρέσιό τους ως αυξητικοί παράγοντες. Στην ίδια περιοχή παρατηρήθηκε ταυτόχρονη ανάπτυξη αντιβιοτικοαντοχής για τα αντίστοιχα βακτήρια του ανθρώπου [23]. Ανάλογη εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών στον άνθρωπο λόγω κατανάλωσης τροφίμων που περιέχουν κατάλοιπα αντιβιοτικών, έχει σχετικά μικρές πιθανότητες να συμβεί, καθώς οι ποσότητες καταλοίπων που περιέχουν τα τρόφιμα, είναι πολύ μικρότερες της θεραπευτικής [12]. 16

18 Ανοσολογικοί κίνδυνοι Τα φαρμακευτικά κατάλοιπα σε τρόφιμα ζωικής προέλευσης έχουν ενοχοποιηθεί και για την εμφάνιση αλλεργικών αντιδράσεων. Υπάρχουν περιπτώσεις πρόκλησης αλλεργίας από τρόφιμα που περιέχουν κυρίως κατάλοιπα πενικιλλίνης. Πρόκειται συνήθως για γάλα [24] ή κρέας που προέρχεται από τη μυική μάζα, της ενδομυικής χορήγησης του αντιβιοτικού [25]. Το τελευταίο, δεν είναι σπάνιο, αφού ένας Ευρωπαίος καταναλωτής, είναι δυνατό να καταναλώσει ως και τέσσερις φορές το χρόνο ποσότητα κρέατος από τη μυϊκή μάζα του σώματος ζώου, όπου έγινε έγχυση κ.φ.ο. [25] Κίνδυνοι διαταραχής ενζύμων Κάποιοι άλλοι κίνδυνοι οι οποίοι δεν έχουν ευρέως εξετασθεί, αφορούν την επίδραση των καταλοίπων στα ενζυμικά συστήματα του καταναλωτή των τροφίμων. Αν και είναι δύσκολο να εκτιμηθεί η επίδραση των καταλοίπων στη λειτουργία των ηπατικών ενζυμικών συστημάτων και συνεπώς στην υγεία του ανθρώπου, ένας τέτοιος κίνδυνος δεν πρέπει να παραβλέπεται [12]. Ειδικά όταν πρόκειται για ευαίσθητες ομάδες πληθυσμού, όπως οι ηλικιωμένοι, τα παιδιά και οι κυοφορούσες. 2. Βενζιμιδαζόλες 2.1. Γενικά περί Βενζιμιδαζολών Οι Βενζιμιδαζόλες (ΒZ), είναι μία μεγάλη ομάδα χημικών ουσιών, με ευρύ φάσμα δράσης, εναντίον των ελμίνθων (σκώληκες). Χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην κτηνιατρική, εναντίον των ενδοπαρασιτικών λοιμώξεων των παραγωγικών κυρίως ζώων (μικρά και μεγάλα μηρυκαστικά, χοίροι, πτηνά, ιχθύες). Πέραν αυτού οι ουσίες αυτές είναι και μυκητοκτόνες και χρησιμοποιούνται για να προστατεύσουν σοδειές καθώς και αποθηκευμένα φρούτα και λαχανικά [26]. Η σημασία των ΒΖ, σε παγκόσμιο επίπεδο, προκύπτει από τη μεγάλη ποικιλία ουσιών, καθώς και φαρμακοτεχνικών μορφών και δοσολογικών σχημάτων [27]. Όσον αφορά την 17

19 Ελλάδα, ο Εθνικός Οργανισμός Φαρμάκων (ΕΟΦ), αναφέρει για παράδειγμα, δύο σκεύασματα για την Μεβενδαζόλη (MBZ), εικοσιεπτά για την Αλβενδαζόλη (ABZ), τρία για τη Νετοβιμίνη (NETO), δώδεκα για τη Φαιβαντέλη (FEB) και δεκαέξι για τη Φαινβενδαζόλη (FBZ) [19]. Οι ελμινθικές παρασιτώσεις, είναι το πιο σημαντικό αίτιο απώλειας παραγωγικότητας των ζώων και μία από τις κύριες αιτίες ανθρώπινης νοσηρότητας παγκοσμίως [28]. Τα εκτρεφόμενα ζώα καταναλώνουν υλικό από το έδαφος, τους βοσκοτόπους, τις ζωοτροφές, τα οποία έχουν μολυνθεί με κόπρανα που περιέχουν αυγά και προνύμφες παρασίτων. Με αυτό τον τρόπο μολύνονται και ο κύκλος της απέκκρισης και της επαναμόλυνσης διαιωνίζεται, εάν δεν υπάρξει ικανοποιητική θεραπεία. Η επαναμόλυνση μπορεί να συμβεί και λίγο μετά τη θεραπεία. Οι επιζωοτίες προκαλούνται όταν υπάρχει ο βέλτιστος συνδυασμός υγρασίας και θερμοκρασίας ή όταν παρατηρείται συνωστισμός υπό συνθήκες υγρασίας. Οι επιπτώσεις της μολύνσεως στα ζώα, ποικίλλουν ανάλογα με το είδος του παρασίτου. Οι ενήλικες ταινίες είναι σχετικά ακίνδυνες, αλλά μερικά είδη νηματωδών παρασίτων είναι εξαιρετικά παθογόνα. Στις περισσότερες των περιπτώσεων η κλινική εκδήλωση της νόσου, οφείλεται στις προνύμφες, παρά στις ενήλικες μορφές [29]. Η Θειαβενδαζόλη (ΤΒΖ) ήταν η πρώτη ΒΖ που παράχθηκε εμπορικά πριν 50 περίπου χρόνια [30]. Χρησιμοποιήθηκε ευρύτατα για τον έλεγχο των νηματωδών σκωλήκων και ως μηκυτοκτόνο. Την παραγωγή της ΤΒΖ ακολούθησαν και άλλες ΒΖ που είχαν παρόμοια δράση, όπως είναι η Παρβενδαζόλη (ΡΒΖ), η Καβενδαζόλη (CAM), η MBZ και η Οξιβενδαζόλη (OXI). Ακολούθως, παράχθηκαν ΒΖ οι οποίες κατέχουν σουλφιδικές ή σουλφοξειδικές δραστικές ομάδες, προσφέροντας ευρύτερο φάσμα δράσης και βελτιωμένη αποτελεσματικότητα. Η ABZ, η FBZ και η Οξφαινδαζόλη (OFZ) ήταν οι πρώτες από αυτές τις ΒΖ που χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία για την καταπολέμηση όλων των σταδίων ανάπτυξης των γαστρεντερικών νηματωδών. Επίσης, μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν και εναντίων πνευμονικών παρασίτων, ταινιών και των ενηλίκων μορφών των τρηματωδών σκωλήκων του ήπατος. Η Τρικλαβενδαζόλη (TCB) παράχθηκε αργότερα για την καταπολέμηση όλων των σταδίων ζωής των τρηματωδών σκωλήκων του ήπατος, αλλά ήταν αναποτελεσματική στην κατάπολέμηση των νηματωδών. Η Λουξαβενδαζόλη (LUX) είναι άλλη μία ΒΖ της οποίας όμως, δεν επιτρέπεται η κυκλοφορία στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Η NETO και η FEB είναι οι πρόδρομες ουσίες της ΑΒΖ και της FBZ, αντίστοιχα [26]. 18

20 2.2. Χρήση και τρόπος δράσης Βενζιμιδαζολών Ανάλογα με το είδος του ζώου επιλέγονται οι αντίστοιχες ΒΖ, για την καταπολέμηση των παρασιτικών νοσημάτων. Στα βοοειδή, οι ΤΒΖ και ΟΧΙ στη συστηνόμενη δόση για τα βοοειδή [66 mg kg -1 σωματικού βάρους (σβ) και 10 mg kg -1 σβ, αντίστοιχα], είναι αποτελεσματικές μόνο εναντίον των ενηλίκων και αναπτυσσόμενων προνυμφικών μορφών των κοινών γαστρεντερικών ασκαρίδων. Η FEB είναι επιπλέον δραστική και για τους πνευμονικούς σκώληκες. Ο μεταβολίτης της ΑΒΖ, ABZ-SO (Albendazole sulfoxide) καθώς και οι FBZ και OFZ έχουν ευρύτερο φάσμα δράσης που περιλαμβάνει και τις αναπτυσσόμενες προνύμφες νηματωδών [30]. Ο έτερος μεταβολίτης της ΑΒΖ, ΑΒΖ- SO 2 (Albendazole sulfone), είναι δραστικός εναντίον των ενηλίκων προνυμφών [26]. Οι ABZ-SO, καθώς και η OFZ, είναι επιπλέον αποτελεσματικές εναντίον των πλατυελμίνθων ή ταινιών. Οι ΝΕΤΟ και ΑΒΖ είναι επιπλέον δραστικές εναντίον των ενήλικων τρηματωδών παρασίτων. Η TCB, μπορεί να είναι αναποτελεσματική εναντίον των νηματωδών και των κεστωδών, είναι όμως δραστική ενάντια σε όλα τα στάδια των τρηματωδών [30]. Όσον αφορά τα πρόβατα, η ΟΧΙ είναι αποτελεσματική εναντίον ενήλικων και αναπτυσσόμενων προνυμφικών σταδίων των κοινών γαστρεντερικών ασκαρίδων. Οι ΤΒΖ και ΜΒΖ έχουν επιπρόσθετη δράση εναντίον των πνευμονικών παρασίτων, αν και η ΤΒΖ απαιτεί αυξημένη δοσολογία. Η ΜΒΖ είναι δραστική και έναντι των πλατυελμίνθων. Οι FEB, FBZ, OFZ και ABZ-SO είναι αποτελεσματικές για όλα τα στάδια ανάπτυξης των γαστρεντερικών ασκαρίδων, των πνευμονικών παρασίτων και των πλατυελμίνθων. Οι ΝΕΤΟ και ΑΒΖ έχουν παρόμοια δράση με την προηγούμενη ομάδα και είναι επιπλέον δραστικές εναντίον των ενήλικων τρηματωδών παρασίτων. Η TCB δρα εναντίον όλων των σταδίων των τρηματωδών παρασίτων [26]. Ο μεταβολισμός γενικά των ΒΖ στα πρόβατα, είναι λιγότερο έντονος σε σχέση με τα βοοειδή. Αυτό σημαίνει ότι στα βοοειδή η βιοδιαθεσιμότητά τους, είναι μικρότερη από ότι στα πρόβατα και κατά συνέπεια να είναι απαραίτητη η χορήγηση υψηλότερης δόσης [31]. Για τις αίγες, οι ΜΒΖ και FBZ είναι δραστικές εναντίον όλων των σημαντικών γαστρεντερικών, πνευμονικών και πλατυελμινθικών παρασίτων [30]. 19

21 Στους ίππους, όλες οι ΒΖ και προ-βζ είναι δραστικές έναντι όλων των ενήλικων γαστρεντερικών ασκαρίδων. Επιπλέον, οι FBZ και OFZ παρεμποδίζουν τη μετανάστευση των προνυμφών των παραπάνω παρασίτων [26], όμως γενικά χρειάζονται μεγαλύτερες και επαναλαμβανόμενες δόσεις [31]. Όσον αφορά τους χοίρους, οι ΟΧΙ, FEB και η Φλουβενδαζόλη (FLU) καταπολεμούν τις γαστρεντερικές ασκαρίδες. Οι FLU, FEB και FBZ καταπολεμούν και τα πνευμονικά παράσιτα [30]. Μόνο στη Δανία αναφέρθηκε ανάπτυξη ανθεκτικών στις ΒΖ, στελεχών Oesophagostomum spp στους χοίρους [31]. Τέλος στα πουλερικά, η CAM δρα στις γαστρεντερικές ασκαρίδες, η ΜΒΖ και στα παράσιτα των αεροφόρων οδών, ενώ η FLU προσφέρει το ευρύτερο φάσμα, καταπολεμώντας και τις πλατυέλμινθες σε οικόσιτα και θηραματικά πτηνά [26]. Επίσης, χρησιμοποιείται και η FBZ [31]. Διάφοροι μηχανισμοί δράσης έχουν αναφερθεί για τις ΒΖ. Η ΑΒΖ παρεμποδίζει την πρόσληψη της γλυκόζης από τις προνυμφικές και ενήλικες μορφές των ευαίσθητων παρασίτων, προκαλώντας τη μείωση των αποθεμάτων γλυκογόνου και κατά συνέπεια την αναστολή του σχηματισμού ΑΤΡ. Παρόμοιο τρόπο δράσης έχουν η ΜΒΖ και η ΤΒΖ. Αναφέρεται επίσης και η αναστολή από τις ΒΖ του ενζύμου αναγωγάση του φουμαρικού οξέος του παρασίτου, που οδηγεί στην ανάσχεση του σχηματισμού του σουξινικού οξέος. Έτσι διαταράσσεται ο κύκλος του δικαρβοξυλικού οξέος που αντικαθιστά τον κύκλο του Krebs στα αναερόβια παράσιτα. Το αποτέλεσμα αυτού του μηχανισμού δράσης, είναι ο θάνατος του παρασίτου λόγω στέρησης των πηγών ενέργειας [26]. Η παρεμπόδιση του σχηματισμού των μικροσωληνίσκων έχει αναφερθεί ως ο κύριος τρόπος δράσης των ΒΖ [30]. Οι μικροσωληνίσκοι συνδέονται με τις ακόλουθες κυτταρικές λειτουργίες: Σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου κατά την κυτταρική διαίρεση, διατήρηση του σχήματος του κυττάρου, κινητικότητα του κυττάρου, κυτταρική έκκριση, απορρόφηση θρεπτικών ουσιών και ενδοκυτταρικές μετακινήσεις. Γίνεται αντιληπτό ότι η καταστροφή των μικροσωληνίσκων είναι δυνατό να επηρεάσει αρνητικά πολλές κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες και συνεπώς να οδηγήσει στο θάνατο του παρασίτου. 20

22 2.3. Φυσικοχημικές ιδιότητες Η εκτίμηση πρόσληψης ενός καταλοίπου διαμέσου των τροφών εξαρτάται και από τη φύση του. Αυτή δεν περιλαμβάνει μόνο την προέλευση της ουσίας (φυσικής ή ανθρώπινης προέλευσης, τοξική ή όχι κτλ.), αλλά και τις φυσικοχημικές της ιδιότητες [5]. Γενικά, οι ΒΖ διαθέτουν ένα δακτύλιο ιμιδαζολίου που περιέχει τόσο όξινα όσο και βασικά άτομα αζώτου. Υπό τις κατάλληλες συνθήκες, το μόριο μπορεί να δεχθεί (pk α 5-6) ή να αποβάλλει πρωτόνια (pk α 12), όπως φαίνεται στην Εικόνα 1. Εικ. 1. Ιονισμός του μορίου ΒΖ υπό όξινες (A) και αλκαλικές (B) συνθήκες. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). Η ΤΒΖ και η CAM είναι θειαζολικές ΒΖ [32]. Αυτό σημαίνει ότι στη θέση R 1 υπάρχει η θειαζολική ομάδα (Σχήμα 1). 21

23 Σχήμα 1. Κύριες πλευρικές ομάδες (R 1 και R 2 ), των ΒΖ. Επίσης, υπάρχουν οι καρβαμιδικές ΒΖ (MBZ, FLU, OXI, LUX, PBZ, ABZ, FBZ, OFZ ABZ-SO), οι αλογονομένες ΒΖ (TCB) και οι προ-βενζιμιδαζόλες ΝΕΤΟ και FEB [33]. Στις καρβαμιδικές ΒΖ η θέση R 1 καταλαμβάνεται από την καρβαμιδική ομάδα (NHCO 2 CH 3 ). Τα μεμονωμένα μέλη των καρβαμιδικών ΒΖ, προκύπτουν από την υποκατάσταση των διαφόρων πλευρικών αλυσίδων και ριζών [π.χ. benzoyl (βενζοϋλιο) ή arylsulfinil (αριλιοθειονυλική), alkyl (αλκύλιο) και aryloxy (αριλόξυ)], στη θέση 5(6)- ή R 2 του βενζολικού δακτυλίου (Σχήμα 1) [34]. Η ΝΕΤΟ είναι νιτροφαινυλγουανιδίνη και μετατρέπεται ταχύτατα σε ΑΒΖ, στο ζωντανό οργανισμό, μετά από αναγωγή της νιτρικής σε αμινική ομάδα [35]. Η FEB είναι φαινυλγουανιδίνη, η οποία υδρολύεται με αφαίρεση μίας ομάδας μεθοξυακετυλίου και στη συνέχεια, με σχηματισμό ενός δακτυλίου προκύπτει η FBZ [35]. Σύμφωνα με τους Danaher και συν. [26], πολλές πληροφορίες σχετικά με τις φυσικές και χημικές ιδιότητες των ΒΖ, μπορούν να βρεθούν σε βιβλία αναφοράς, από προμηθευτές χημικών ουσιών. Ωστόσο, δεδομένα σχετικά με σημαντικές ιδιότητες που αφορούν τον καθορισμό της σταθεράς οξύτητας (pk α ), της διαλυτότητας, ή του συντελεστή κατανομής οκτανόλης νερού (K ow ), για τις ΒΖ (είτε με τη χρήση πειραμάτων ή και λογισμικού) σε γενικές γραμμές είναι ελάχιστες [30, 36-39]. Αυτές οι ιδιότητες και ειδικά της διαλυτότητας και του K ow, παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη δραστικότητα και την κατανομή των καταλοίπων. Συγκεκριμένα, οι ΒΖ, μετά τη χορήγησή τους, φθάνουν στα παράσιτα-στόχους, είτε με πρόσληψη από την πεπτική οδό, είτε με διάχυση μέσω της εξωτερικής επιφάνειας του 22

24 παρασίτου, είτε με συνδυασμό των δύο παραπάνω τρόπων [40]. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την παθητική διάχυση των κ.φ.ο. μέσω της εξωτερικής επιφάνειας του παρασίτου Ascaris suum, είναι ο συντελεστής διαχωρισμού λιπιδίων-ύδατος, η σχέση pk α -ph και το Μοριακό Βάρος (ΜΒ) [41]. Όσο περισσότερο λιποφιλική είναι μία ΒΖ, τόσο πιο εύκολα διαπερνά το εξωτερικό περίβλημα των πλατυελμίνθων, με διάχυση [42]. Συγκεκριμένα, οι ABZ, MBZ και FBZ, οι οποίες είναι περισσότερο λιποφιλικές και έχουν μεγαλύτερο K ow, βρέθηκαν σε μεγαλύτερες ποσότητες από τις συγκριτικά λιγότερο λιποφιλικές και περισσότερο πολικές OFZ, ABZ-SO, TBZ, στο εσωτερικό του παρασίτου Moniezia benedeni [42]. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ΒΖ, είναι σημαντικές όχι μόνο για την απορρόφησή τους από τα παράσιτα, αλλά και για το μεταβολισμό τους εντός του ξενιστή. Οι ΒΖ, οι οποίες χορηγούνται με τη μορφή εναιωρήματος, θα πρέπει να διαλυθούν πρώτα για να απορροφηθούν από το Γαστρεντερικού Σωλήνα (ΓΕΣ) [43]. Η διαλυτότητα των ΒΖ στο ύδωρ, είναι μεγαλύτερη σε χαμηλές τιμές ph και συνεπώς μεγαλύτερη στο ήνυστρο σε σχέση με τη μεγάλη κοιλία (βλ. επόμενο κεφάλαιο) [33]. Αλλά και η απορρόφηση των ΒΖ στο ΓΕΣ, εξαρτάται από το πόσο λιπόφιλη είναι μία ένωση και ποιος είναι ο βαθμός ιονισμού της σε διαφορετικά επίπεδα ph [43]. Για παράδειγμα, η περισσότερο υδατοδιαλυτή TBZ απορροφάται, μεταβολίζεται και απεκκρίνεται σε πιο σύντομο χρονικό διάστημα, σε σχέση με την FBZ, η οποία είναι αδιάλυτη στο νερό [33]. Γενικά, οι καρβαμιδικές ΒΖ, όπως η FBZ, λόγω της χαμηλής διαλυτότητάς τους σε υδάτινο περιβάλλον, παρουσιάζουν περιορισμένη απορρόφηση από το ΓΕΣ, βραδύτερους ρυθμούς εισόδου στην κυκλοφορία του αίματος και πολύ βραδύτερα ποσοστά αποβολής. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε αύξηση του χρόνου παραμονής των καρβαμιδικών ΒΖ και των μεταβολιτών τους, στον οργανισμό του ξενιστή. Κατά συνέπεια ο χρόνος δράσης τους, είναι μεγαλύτερος από αυτόν των υδατοδιαλυτών ΒΖ, γεγονός που τους αποδίδει μεγαλύτερες ανθελμινθικές δυνατότητες και ευρύτερο φάσμα δρασης [33]. Επίσης, ο K ow είναι αρκετά χρήσιμος για την επιλογή των κατάλληλων διαλυτών, για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό των ΒΖ, με υγρή χρωματογραφία [26]. Τα περισσότερα από αυτά τα μόρια έχουν παρόμοιες τιμές K ow, οι οποίες γενικά κυμαίνονται από 0,8-3,3. Ωστόσο, η FBZ και τα κατάλοιπα TCBs φαίνεται να είναι πολύ πιο λιποφιλικής φύσης από τις άλλες ΒΖ. Επίσης, από τις παραπάνω τιμές του συντελεστή οκτανόλης-νερού, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι ΒΖ, έχουν σε 23

25 γενικές γραμμές μέτρια βιοσυσσωρευτική ικανότητα, αφού ναι μεν είναι λιποφιλικές ουσίες, αλλά σε μέτριο βαθμό [26]. Δεν υπάρχει μέχρι σήμερα, βάση δεδομένων διαθέσιμη, η οποία να αναφέρει πειραματικά προσδιορισμένες τιμές της διαλυτότητας, του K ow, ή της pk α, για τις ΒΖ. Αυτά τα δεδομένα, είναι δυνατό να υπολογισθόυν, με τη βοήθεια λογισμικών [39]. Μια περίληψη των τιμών pk α και των συντελεστών κατανομής οκτανόλης-νερού (K ow ) περιλαμβάνεται στον Πίνακα 1 [26]. Πίνακας 1. Κατάλογος των σημαντικών φυσικών και χημικών ιδιοτήτων των ΒΖ (Τιμές pk a, K ow και Εύρος ph στο οποίο οι ουσίες ευρίσκονται σε ουδέτερη κατάσταση). Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). BΖ Συντελεστής κατανομής οκτανόλης-νερού Τιμές pk a Πειραματικός Υπολογισμένος Πειραματική pk a Υπολογισμένη Έυρος ph ουσίας σε ουδέτερή κατάσταση. Αλκαλικές ομάδες Όξινες ομάδες ABZ 2,2 2,92 N: 5,54 N: 13,11 7,7 11,2 ABZ-SO 0,82 0,94 7,8 N: 5,69 N: 13,25 7,6 11,2 ABZ-SO 2 0,9 1,01 N: 3,50 N: 11,20 5,5 9,2 ABZ-NH 2-0,69 0,75 N: 5,98 N: 13,30 7,9 11,3 SO 2 FBZ 1,95 3,07 4,01 N: 5,12 N: 12,72 7,1 9,8 OFZ 1,88 2,13 N: 4,13 N: 11,79 6,1 9,8 FBZ-SO 2 2,13 3,30 N: 3,41 N: 11,12 5,4 9,2 FLU 1,98 2,41 N: 4,10 N: 11,76 6,1 9,8 FLU-HMET 1,72 N: 6,58 N: 13,87 6,5 11,9 FLU-RMET 1,94 N: 5,57 N: 13,14 7,6 11,2 OH: 13,68 MBZ 2,44 2,52 3,5 N: 4,13 N: 11,79 6,1 9,8 MBZ-OH 2,22 2,61 9,8 N: 5,60 N: 13,16 7,6 11,2 OH: 13,77 MBZ-NH 2 1,84 2,27 5,5 N: 6,61 N: 13,89 8,6 11,9 OXI 1,86 2,63 N: 6,26 N: 13,78 8,2 11,8 TBZ 5,3 6,2 1,58 1,76 2,5,4,7 N: 5,22 N: 12,83 7,2 10,9 5-OH-TBZ 1,29 1,37 4,5 N: 7,65 Phenol: 5,46 Πάντα σε ιοντική μορφή N: 15,10 TCB 4,90 6,66 10,5, 2,5 N: 5,31 N: 12,91 7,3 11,0 N: 1,82 TCB-SO 3,39 3,66 N: 3,00 N: 10,95 5,0 9,0 N: 1,82 TCB-SO 2 3,58 5,14 N: 1,86 N: 9,99 3,8 8,0 N: 1,82 CAM 1,81 1,91 N: 5,44 N: 13,04 7,4 13,1 N: 4,62 N: 15,97 MBC 1,29 1,69 9,52 N: 5,52 N: 13,09 7,5 11,1 Benzimidazole 1,5 0,8 0,95 4,36, 16,4 N: 5,30 N: 12,90 7,3 10,9 PAR 1,86 2,63 N: 5,99 N: 13,53 7,9 11,6 N: ιονιζόμενο άτομο αζώτου, OH: ιονιζόμενη ομάδα υδροξυλίου, Phenol: Φαινολική ομάδα 24

26 2.4. Φαρμακοκινητική ΒΖ-Γενικά Για την καλύτερη κατανόηση της φαρμακοκινητικής των ΒΖ, είναι σκόπιμο να παρατεθούν εν συντομία, κάποια στοιχεία ανατομίας και φυσιολογίας του πεπτικού κυρίως συστήματος των μηρυκαστικών που παράγουν γάλα για ανθρώπινη κατανάλωση, τα οποία τα διαφοροποιούν από τον άνθρωπο και τα υπόλοιπα μονογαστρικά είδη. Ο στόμαχος των μηρυκαστικών αποτελείται κατά σειρά, από τον 1 ο στόμαχο ή μεγάλη κοιλία, το 2 ο στόμαχο ή κεκρύφαλο, τον 3 ο στόμαχο ή εχίνο και τον 4 ο στόμαχο ή ήνυστρο. Πρόκειται για τέσσερις πλήρως χωρισμένους θυλάκους, από τους οποίους οι τρεις πρώτοι αποτελούν τον προστόμαχο και ο τέταρτος αποτελεί την αδενική μοίρα του στομάχου και είναι όμοιος με το στόμαχο των μονογαστρικών θηλαστικών [44]. Στο εσωτερικό των τεσσάρων στομάχων σχηματίζεται η γαστρική αύλακα, η οποία συνδέει το καρδιακό στόμιο (σημείο εισόδου του οισοφάγου στη μεγάλη κοιλία), με το ήνυστρο [44]. Οποιαδήποτε από του στόματος (p.o.), χορήγηση τροφής ή φαρμακευτικής αγωγής, είναι δυνατό να καταλήξει στο ήνυστρο με παράκαμψη (by pass), του προστομάχου. Αυτό συμβαίνει με το σχηματισμό συνεχούς «σωλήνα», από το καρδιακό στόμιο, ως το στόμιο κεκρυφάλου-εχίνου. Πρόκειται για αντανακλαστικό φαινόμενο το οποίο οφείλεται σε σύσπαση της αύλακας του κεκρυφάλου και χάλαση του στομίου κεκρυφάλου-εχίνου και του τοιχώματος του ηνύστρου [45]. Το αντανακλαστικό αυτό, υπάρχει όσο τα νεαρά μηρυκαστικά θηλάζουν, αλλά σε αρκετά ζώα διατηρείται και μετά τον απογαλακτισμό [46]. Επίσης, από τη μεγάλη κοιλία έως το ήνυστρο απαντώνται εντελώς διαφορετικές συνθήκες, καθώς το ph του ηνύστρου είναι περίπου 2, ενώ της μεγάλης κοιλίας κυμαίνεται στο 6-7, με την τελευταία να διαθέτει πολύ μεγαλύτερο αριθμό βακτηρίων και πρωτοζώων μικροβιακής χλωρίδας σε σχέση με το ήνυστρο [45]. Αμέσως μετά τη χορήγησή τους, οι ΒΖ ακολουθούν έντονο μεταβολισμό, όπου η αρχική ουσία-π.χ. ΑΒΖ-μεταβολίζεται ταχύτατα, και στο πλάσμα του αίματος, τους ιστούς, το γάλα, τα απεκκρίματα του ξενιστή αλλά και στα παράσιτα, απαντώνται κυρίως τα παράγωγα του μεταβολισμού τους [26, 33, 47]. Η χαμηλή υδατοδιαλυτότητα των ΒΖ, περιορίζει την ποικιλία φαρμακοτεχνικών μορφών [33], με αποτέλεσμα να χορηγούνται συνήθως p.o. ή ενδοστομαχικά (i.r.), ή σε ζωοτροφές [26]. Ωστόσο στο εξωτερικό, έχουν γίνει προσπάθειες για την παρασκεύη ενέσιμων 25

27 υδατικών διαλυμάτων για παρεντερική χορήγηση των ABZ-SO και OFZ [43]. Γενικά, όποια και αν είναι η μορφή χορήγησής τους, πριν εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος, οι ΒΖ, θα πρέπει να απελευθερωθούν από τη φαρμακοτεχνική μορφή, να διαλυθούν, να διέλθουν το επιθήλιο του ΓΕΣ και να φθάσουν στο ήπαρ [33]. Στη συνέχεια, οι FEB, NETO, ABZ, FBZ, αφού ακολουθήσουν τη μεταβολική οδό της οξείδωσης στο ήπαρ, μετατρέπονται αρχικά σε σουλφοξείδια και τελικά στους περισσότερο πολικούς και λιγότερο δραστικούς, σουλφονικούς μεταβολίτες. Από τα ενζυμικά συστήματα του ήπατος, αυτό της φλαβο-μονοοξυγενάσης (FMO), είναι υπεύθυνο για τη διαδικασία της σουλφοξείδωσης και η μονοοξυγενάση του κυτοχρώματος, για το μεταγενέστερο σχηματισμό των σουλφονικών μεταβολιτών [47]. Ειδικά, οι τελευταίοι μεταβολίτες, απαντώνται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα βοοειδή σε σχέση με τα πρόβατα, λόγω της μεγαλύτερης οξειδωτικής ικανότητας των ενζυμικών τους συστημάτων [30]. Η κύρια μεταβολική οδός που ακολουθεί η MBZ, είναι η αναγωγή της καρβονυλικής της ρίζας σε δευτεροταγή αλκοόλη (MBZ- OH). Η αντίδραση αυτή λαμβάνει χώρα κυρίως στο έντερο, από ένα ένζυμο που ευρίσκεται και σε άλλα όργανα, την κετονική αναγωγάση [32]. Ο ρυθμός διάλυσης των ΒΖ, επηρεάζει το ρυθμό και την έκταση της απορρόφησης τους από το βλεννογόνο του ΓΕΣ, τη μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα και τη μετέπειτα διανομή στους ιστούς και την κινητική κατανομής τους [26]. Αφού περάσουν στην κυκλοφορία του αίματος, μετακινούνται στους διάφορους ιστούς και αντίστροφα. Όσο περισσότερο διαρκεί το φαινόμενο της αμφίδρομης μετακίνησης των ΒΖ, τόσο παρατείνεται ο χρόνος δράσης τους [28]. Οι ΒΖ, που περνούν στην κυκλοφορία του αίματος, μετακινούνται αμφίδρομα προς το ήπαρ και το ΓΕΣ [46]. Οι ποσότητες των ΒΖ, οι οποίες φθάνουν τελικά στο ήπαρ, αφού υποστούν την επίδραση των ενζυμικών συστημάτων του ήπατος, επανεκκρίνονται μέσω της χολής στο έντερο [46, 48]. Κατά συνέπεια, με τα κόπρανα, δεν απεκκρίνεται μόνο η ποσότητα των ΒΖ η οποία δεν απορροφήθηκε μετά τη χορήγηση, αλλά και μέρος αυτής που απορροφήθηκε και μεταβολίσθηκε. Με τα ούρα, απεκκρίνονται κυρίως οι ABZ και PBZ (σε ποσοστό 69% και 80% της αρχικής δόσης, αντίστοιχα) και σε αρκετά μικρότερες ποσότητες οι FEB, FBZ, OFZ, TBZ, και MBZ [46, 49]. Επιπλέον, στο ΓΕΣ των μηρυκαστικών και ιδιαίτερα στη μεγάλη κοιλία, λαμβάνει χώρα η αναγωγή των σουλφοξειδίων ΒΖ (π.χ. OFZ, ABZ-SO), στην αρχική τους μορφή (FBZ, ABZ) [33,46]. Αυτός είναι και ο λόγος που ενώ οι αρχικές μορφές των ΒΖ δεν απαντώνται 26

28 στο πλάσμα, είναι δυνατό να ανιχνευθούν στο ήνυστρο, τη μεγάλη κοιλία ή το λεπτό έντερο [33] NETO, ABZ, ABZ-SO Οι Gyurik και συν. [50], αναφέρουν ότι ο κύριος μεταβολίτης της ΑΒΖ στα βοοειδή, τα πρόβατα, το μύ και τον επίμυ, είναι η ABZ-SO (σουλφοξείδιο), ακολουθούμενη από τις ABZ-SO 2 (σουλφόνη) και ABZ-NH 2 -SO 2 (αμινοσουλφόνη). Αυτοί οι τρεις μεταβολίτες (Εικόνα 2), είναι τα κύρια συστατικά των καταλοίπων που απομονώνονται από τους ιστούς, ασχέτως εάν τα ζώα έλαβαν θεραπεία με ΝΕΤΟ, ΑΒΖ ή ABZ-SO [51]. Η ABZ-SO, η οποία απαντάται με τη μορφή δύο εναντιομερών, του R+ και του S-, προκύπτει από την οξείδωση του σουλφιδικού τμήματος της ABZ [50, 52-53]. Η περαιτέρω οξείδωση της ABZ-SO, οδηγεί στο σχηματισμό της ABZ- SO 2 [54]. Η ABZ-NH 2 -SO 2, προκύπτει μετά από διπλή ακετυλίωση της ABZ-SO 2 [50, 55]. Στα μηρυκαστικά και ιδίως στα βοοειδή, η απορρόφηση μίας p.o. δόσης της ΑΒΖ, μπορεί να φθάσει και το 50% [51]. Μετά από μία p.o. χορήγηση της ΝΕΤΟ σε βοοειδή και πρόβατα, η ΑΒΖ απομονώθηκε μετά από δέκα ώρες, από το ήπαρ (βοοειδή) και επιπλέον από τους νεφρούς, το μυϊκό ιστό και το λίπος, στα πρόβατα, μετά από δεκαοκτώ ώρες [56]. Μόνο στο ήπαρ του προβάτου, απομονώθηκε η ΑΒΖ, σε χρονικό διάστημα μετά την 1 η ημέρα από τη χορήγηση. Η ABZ-NH 2 -SO 2, ενώ στα βοοειδή, εμφανίζεται μόνο στο ήπαρ έως τη 14 η ημέρα μετά τη χορήγηση της ΝΕΤΟ, στα πρόβατα εμφανίζεται και στους νεφρούς, το μυϊκό ιστό (10 η ημέρα) και το λίπος (3 η ημέρα) [56]. Η ABZ-SO στα βοοειδή απομονώνεται από όλους τους προαναφερόμενους ιστούς, μόνο δέκα ώρες μετά τη χορήγηση ΝΕΤΟ. Αντίθετα στο πρόβατο, ανιχνεύται ως και την 3 η ημέρα στους νεφρούς και ως την 20 η ημέρα στο ήπαρ. Τα ίδια ισχύουν και για την ABZ-SO 2, με τη διαφορά ότι στο πρόβατο, απομονώνεται από το ήπαρ ως την 3 η ημέρα και από τους νεφρούς, ως τη 10 η ημέρα μετά τη θεραπεία με ΝΕΤΟ [56]. Μετά από μία p.o. χορήγηση της ΑΒΖ σε μόσχους, η μητρική ουσία ήταν εκχυλίσιμη από το ήπαρ, μόνο την 1 η ημέρα μετά τη χορήγηση. Οι τρεις μεταβολίτες, απομονώθηκαν από το ήπαρ και τους νεφρούς ως και τη 10 η ημέρα. Στο μυϊκό ιστό και το λίπος, τα κατάλοιπα εμφανίζονται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις [51]. Στα πρόβατα μετά από μία p.o. χορήγηση της ΑΒΖ, η μητρική ουσία δε βρέθηκε σε 27

29 κανένα ιστό. Οι τρεις κύριοι μεταβολίτες της, βρέθηκαν ως και οκτώ ημέρες μετά τη θεραπεία κατά κύριο λόγο στο ήπαρ και τους νεφρούς [51]. Οι ABZ-SO και ABZ-SO 2, ήταν οι ουσίες που ανιχνεύθηκαν στο ήπαρ, τους νεφρούς, το μυϊκό ιστό και το λίπος, μετά από χορήγηση μίας p.o. δόση της ABZ-SO σε πρόβατα. Μετά την 7 η ημέρα, οι συγκεντρώσεις των ουσιών αυτών, δεν ξεπερνούσαν τα 25 μg kg -1, στους παραπάνω ιστούς. Στα βοοειδή, μετά από λήψη της ίδιας θεραπείας, οι ABZ-SO και ABZ-SO 2, απομονώθηκαν από το ήπαρ έως και την 3 η ημέρα, ενώ από τους νεφρούς έως και τη 2 η ημέρα μετά τη χορήγηση [57]. Εικ. 2. Κύριοι μεταβολίτες της νετοβιμίνης και της αλβενδαζόλης σε ζωικούς ιστούς και γάλα. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier) FEB, FBZ, OFZ Η FEB in vivo, μετά από υδρολυτική αφαίρεση μίας ομάδας μεθοξυακετυλίου και σχηματισμό δακτυλίου, μετατρέπεται στην FBZ (Εικόνα 3) [58-59]. Με τη βοήθεια ηπατικών ενζύμων όπως προαναφέρθηκε, η FBZ μετατρέπεται με σουλφοξείδωση σε 28

30 OFZ. Όμως η OFZ ανάγεται και πάλι σε FBZ εντός των υγρών της μεγάλης κοιλίας των μηρυκαστικών [33, 46, 49, 60]. Επιπλέον, η οξείδωση του ατόμου του θείου της FEB, οδηγεί στο σχηματισμό του αντίστοιχου σουλφοξειδίου (FEB-SO). Από τη FEB- SO με υδρόλυση και σχηματισμό δακτυλίου, σχηματίζεται και πάλι η OFZ [58-59]. Από την περαιτέρω οξείδωση της OFZ, προκύπτει ο σουλφονικός μεταβολίτης (FBZ- SO 2 ), ενώ άλλος ένας μεταβολίτης που απαντάται σε όλα τα είδη πλην του προβάτου, είναι η p-hydroxyfenbendazole (FBZ-OH) [60]. Στα μηρυκαστικά, η μεγάλη κοιλία ενεργεί ως δεξαμενή, απελευθερώνοντας σταδιακά τις FEB, FBZ και OFZ στο περιεχόμενο του ΓΕΣ. Στα μονογαστρικά είδη δεν υπάρχει το φαινόμενο της δεξαμενής. Ο ιστός στόχος για τις FEB, FBZ και OFZ, είναι το ήπαρ [49, 61-62]. Μετά από χορήγηση p.o. δόσης FEB σε βοοειδή, τα κατάλοιπα απομονώθηκαν μέχρι και την 7 η ημέρα, μόνο από το ήπαρ και το λίπος [49]. Στα πρόβατα η p.o. δόση FEB, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση των μεταβολιτών της, την 3 η ημέρα σε ήπαρ, μυϊκό ιστό, νεφρούς και λίπος και την 7 η σε ήπαρ, νεφρούς και λίπος. Σε i.r. χορήγηση της FEB σε πρόβατα, τέσσερις και οκτώ ημέρες μετά, απομονώθηκαν οι μεταβολίτες της από όλους τους προαναφερόμενους ιστούς. Μετά την 28 η ημέρα, σε όλους τους ιστούς, κανένα κατάλοιπο FEB ή μεταβολίτη της, δεν ανιχνεύθηκε [49]. Η p.o. χορήγηση της FBZ σε βοοειδή, έδειξε ότι την 7 η ημέρα μετά τη θεραπεία, οι σχετικοί μεταβολίτες απομονώθηκαν κυρίως από το ήπαρ, αλλά και από τους νεφρούς, το λίπος και το μυϊκό ιστό. Την 21 η ημέρα δεν ανιχνεύθηκαν κατάλοιπα σε κανένα ιστό. Στα πρόβατα στα οποία δόθηκε p.o. αγωγή με FBZ, οι σχετικοί μεταβολίτες ήταν παρόντες σε όλους τους παραπάνω ιστούς και κυρίως στο ήπαρ, πέντε και εννέα ημέρες μετά [63]. Σε βοοειδή τα οποία έλαβαν αγωγή με OFZ, απομονώθηκαν κατάλοιπα στο ήπαρ από τη 10 η ως τη 18 η ημέρα, στο λίπος μόνο τη 10 η, ενώ στο μυϊκό ιστό και τους νεφρούς δεν απομονώθηκαν κατάλοιπα σε αυτό το χρονικό διάστημα. Μετά από χορήγηση OFZ σε πρόβατα, μόνο στο ήπαρ βρέθηκαν τα σχετικά κατάλοιπα από τη 10 η ως την 24 η ημέρα μετά τη θεραπεία. Δεν αναφέρονται δεδομένα για την ύπαρξη και κατανομή των καταλοίπων, πριν τη δέκατη ημέρα [61]. 29

31 Εικ. 3. Κύριοι μεταβολίτες της φαιβαντέλης και της φαινβενδαζόλης σε ζωικούς ιστούς και γάλα. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier) MBZ Οι Iosifidou και συν. [64], αναφέρουν ότι οι κύριοι μεταβολίτες της MBZ στα ζωϊκά είδη, είναι η MBZ-OH και η MBZ-NH 2 (Εικόνα 4), ενώ στους ανθρώπους, η NH 2 - OH-MBZ. Πριν την απέκκρισή της στη χολή η ΜΒΖ, μεταβολίζεται στο ήπαρ [32, 65-66]. Η MBZ-OH, είναι το αποτέλεσμα κετονοαναγωγής, η MBZ-NH 2 προκύπτει από την καρβαμιδική υδρόλυση της ΜΒΖ και η NH 2 -OH-MBZ προκύπτει μετά από συνδυασμό κετονοαναγωγής και καρβαμιδικής υδρόλυσης [32, 67]. Ύστερα από p.o. χορήγηση της ΜΒΖ στον επίμυ και τον άνθρωπο, παρατηρήθηκε απορρόφηση μεγαλύτερου ποσοστού από τον ΓΕΣ. Επιπλέον, αναφέρεται μεγαλύτερη απορρόφηση στους ανθρώπους μετά από χορήγηση της ίδιας δόσης με τη συνοδεία γεύματος [67]. Οι Pandey και Roy [65], αναφέρουν ότι κατάλοιπα MBZ, παραμένουν στο πλάσμα του αίματος και στα υγρά της μεγάλης κοιλίας για 120 ώρες, ύστερα από μία p.o. χορήγηση 40 mg kg -1 σε αίγες. Οι ίδιοι διαπίστωσαν ότι μετά από i.v. χορήγηση 5 mg kg -1, η ΜΒΖ, παρέμεινε στο πλάσμα του αίματος για περισσότερες από εικοσιτέσσερις ώρες, ενώ στα υγρά της μεγάλης κοιλίας έφθανε σε μη ανιχνεύσιμες 30

32 ποσότητες, μετά από ενενήντα λεπτά της ώρας. Σε πρόβατα που έλαβαν μία p.o. δόση, μία μέρα μετά, απομονώθηκαν κατάλοιπα (μεταξύ των οποίων και η μητρική ΜΒΖ) από το ήπαρ, το λίπος, τους νεφρούς και το μυϊκό ιστό. Στις επτά και δεκατέσσερις ημέρες κατάλοιπα της ΜΒΖ, απομονώνονται κυρίως από το ήπαρ και τους νεφρούς, με κύριο μεταβολίτη την MBZ-OH [67]. Το ίδιο μεταβολικό πρότυπο παρατηρήθηκε και μετά από p.o. χορήγηση σε αίγες, με τη διαφορά ότι οι MBZ-OH και MBZ-NH 2, εξακολουθούν να απομονώνονται από το ήπαρ, έως την 28 η ήμερα μετά τη χορήγηση [67]. Μία άλλη έρευνα, αναφέρει ότι μετά από p.o. χορήγηση σε πρόβατα, ούτε η ΜΒΖ, ούτε οι μεταβολίτες της δεν απομονώνονται από το ηπαρ, τους νεφρούς, τους μυϊκούς ιστούς ή το λίπος, πέρα των επτά ημερών, εκτός της MBZ-OH, η οποία απαντάται ως και τις δεκατέσσερις ημέρες στο ήπαρ, σε πολύ χαμηλες συγκεντρώσεις [68]. Εικ. 4. Κύριοι μεταβολίτες της μεβενδαζόλης σε ιστούς. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). Οι χημικές δομές των υπολοίπων ΒΖ, που χρησιμοποιούνται στην Κτηνιατρική, καθώς και των μεταβολιτών τους, φαίνονται στις Εικόνες

33 Εικ. 5. Κύριοι μεταβολίτες της φλουβενδαζόλης σε ζωικούς ιστούς και αυγά. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). Εικ. 6. Κύριοι μεταβολίτες της τρικλαβενδαζόλης σε αίγες και πρόβατα. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). 32

34 Εικ. 7. Κύριοι μεταβολίτες της θειαβενδαζόλης σε ιστούς και γάλα. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). Εικ. 8. Χημικές δομές των: οξυβενδαζόλη, καβενδαζόλη, παρβενδαζόλη και λουξαβενδαζόλη. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [26], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). 33

35 Παράγοντες που επηρεάζουν το μεταβολισμό των ΒΖ Μπορεί οι ΒΖ, να έχουν μία βασική πορεία φαρμακοκινητικής, όμως το τελικό αποτέλεσμα, όσον αφορά για παράδειγμα τη βιοδιαθεσιμότητα, εξαρτάται από διάφορους παράγοντες [27, 33]. Με τον όρο βιοδιαθεσιμότητα εννοούμε την έκταση και το ρυθμό με τον οποίο μία δραστική ουσία ή δραστικό μοριακό της τμήμα αποδίδεται από μία φαρμακοτεχνική μορφή στη γενική κυκλοφορία του αίματος [69]. Όταν ένα φάρμακο χορηγείται από το στόμα (όπως συμβαίνει με τις ΒΖ), η βιοδιαθεσιμότητα υπολογίζεται από την εξίσωση: Βιοδιαθεσιμότητα = AUC από το στόμα AUC ενδοφλεβίως 100%. AUC (Area Under the Concentration Curve) είναι η περιοχή κάτω από την καμπύλη που σχηματίζεται με τη σημείωση των συγκεντρώσεων στο πλάσμα του αίματος σε σχέση με το χρόνο (Σχήμα 2) [70]. Σχήμα 2. Περιοχή (γκρίζα σκίαση) κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης φαρμάκου στο πλάσμα του αίματος σε σχέση με το χρόνο (AUC). Cmax είναι η μέγιστη συγκέντρωση του φαρμάκου στο πλάσμα του αίματος, η οποία εμφανίζεται σε χρόνο tmax. 34

36 Με αυτό τον τρόπο η βιοδιαθεσιμότητα ενός φαρμάκου υπολογίζεται συγκρίνοντας τις συγκεντρώσεις του φαρμάκου στο πλάσμα του αίματος, στη διάρκεια ωρών ή ημερών, ύστερα από χορήγηση, τόσο από το στόμα, όσο και ενδοφλεβίως. Ύστερα από ενδοφλέβια χορήγηση, όλη η δόση του φαρμάκου ευρίσκεται στη γενική κυκλοφορία του αίματος (βιοδιαθεσιμότητα 100%), ενώ ύστερα από χορήγηση από το στόμα ένα μέρος της δόσης του φαρμάκου μπορεί να περάσει στη γενική κυκλοφορία, λόγω ελλειπούς απορρόφησης και/ή μεταβολισμού κατά την πρώτη δίοδο από το ήπαρ [70]. Η βιοδιαθεσιμότητα των ΒΖ εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την οδό χορήγησης και τα χαρακτηριστικά του κάθε φαρμακευτικού σκεύασματος [26-27, 33]. Για παράδειγμα η ABZ-SO παρουσιάζει μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα μετά από υποδόρια (s.c.) χορήγηση, σε σύγκριση με την i.v. και την i.r. χορήγηση στα πρόβατα [71]. Επιπλέον, στην p.o. χορήγηση, είναι δυνατό να λάβει χώρα το αντανακλαστικό της παράκαμψης του προστομάχου, το οποίο οδηγεί στην περιορισμένη απορρόφηση των ΒΖ, από το ΓΕΣ και κατά συνέπεια στη μείωση της βιοδιαθεσιμότητάς τους [33]. Όταν η χορήγηση των ΒΖ γίνεται μεσω φαρμακούχων ζωοτροφών ή νερού, παρατηρείται μεγάλη διακύμανση στα επίπεδα των ΒΖ στο πλάσμα των ζώων της ίδιας εκμετάλλευσης. Αυτό οφείλεται στο ότι κάθε ζώο προσλαμβάνει διαφορετικές ποσότητες νερού και τροφής [26, 33]. Η σίτιση των ζώων είναι άλλος ένας παράγοντας που επηρεάζει τη φαρμακοκινητική των ΒΖ [33]. Συγκεκριμένα η ποσότητα και η ποιότητα της τροφής καθορίζουν τις φυσικές και χημικές ιδιότητες του περιεχομένου του ΓΕΣ. Από τη διαλυτότητα των ΒΖ στο περιεχόμενο του ΓΕΣ, εξαρτάται η ταχύτητα και η έκταση της απορρόφησης και κατά συνέπεια και της βιοδιαθεσιμότητας των ΒΖ [27]. Για παράδειγμα η μείωση της χορηγούμενης τροφής, αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα των ΒΖ, καθώς παρατείνεται ο χρόνος παραμονής τους στο ΓΕΣ, αφού η κινητικότητα του τελευταίου, ελαττώνεται [33, 46, 48]. Επίσης, ο τύπος της τροφής επηρεάζει διαφορετικά τη φαρμακοκινητική των ΒΖ στα μονογαστρικά είδη και στα μηρυκαστικά [27]. Η βιοδιαθεσιμότητα της ΑΒΖ σε μόσχους που τρέφονταν σε βοσκοτόπους, ήταν χαμηλότερη σε σχέση με σταβλισμένους μόσχους που τρέφονταν με δημητριακά [72]. Τα αποτελέσματα αντιστρέφονται στην περίπτωση των χοίρων, οι οποίοι είναι μονογαστρικό είδος [73]. Ένας πολύ σημαντικός παράγοντας, είναι η χορήγηση ΒΖ, σε ζώα που ήδη νοσούν από κάποιο είδος παρασιτικής νόσου. Έχει παρατηρηθεί ότι σε αυτές τις περιπτώσεις ο μεταβολισμός των ΒΖ περιορίζεται και οι ουσίες παραμένουν για μεγαλύτερο 35

37 χρονικό διάστημα στον ξενιστή (ειδικά όταν η παρασίτωση προσβάλλει και το ήπαρ). Για αυτό το λόγο οι χρόνοι αναμονής των ΒΖ, για τα προϊόντα των νοσούντων ζώων, θα πρέπει να είναι μεγαλύτεροι [27]. Επίσης, η ταυτόχρονη ή διαδοχική χορήγηση άλλου φαρμάκου, είναι δυνατό να επηρεάσει τη φαρμακοκινητική των ΒΖ. Για παράδειγμα η ταυτόχρονη χορήγηση ΑΒΖ και Ivermectin (IVM), οδήγησε σε αυξημένες συγκεντρώσεις στο πλάσμα του αίματος, λόγω ανταγωνιστικής συμπεριφοράς των δύο φαρμάκων [27]. Άλλοι σημαντικοί παράγοντες, που είναι δυνατό να επηρεάσουν τη φαρμακοκινητική των ΒΖ, στα γαλακτοπαραγωγά κατοικίδια ζώα, είναι το είδος, το φύλο και η ηλικία. Στην περίπτωση του είδους και της ηλικίας, οι αποκλίσεις οφείλονται κυρίως, στα διαφορετικά σε κάθε περίπτωση ένζυμα μετασχηματισμού. Οι ορμονικές διαφορές των δύο φύλων είναι υπεύθυνες για τις διαφορές του μεταβολισμού των ΒΖ, σε άτομα του ίδιου είδους, αλλά διαφορετικού φύλου [27] Απέκκριση των ΒΖ στο γάλα Μετά τη χορήγησή τους, οι ΒΖ εκτός από τους διάφορους ιστούς, κατανέμονται και στο μαστό και κατά συνέπεια απεκκρίνονται και στο γάλα των κατοικιδίων μηρυκαστικών. Συγκεκριμένα, οι ΑΒΖ και ΝΕΤΟ, δεν ανιχνεύθηκαν στο γάλα προβάτων και βοοειδών μετά από χορήγηση της ΝΕΤΟ. Σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα για τις πρώτες 84 ώρες μετά τη θεραπεία ήταν και η ABZ-NH 2 -SO 2 [56]. Τόσο στα πρόβατα, όσο και στα βοοειδή, ο κύριος μεταβολίτης που απαντάται στο γάλα ως τις πρώτες 8 ώρες είναι η ABZ-SO. Η ABZ-SO 2, εμφανίζεται σε μεγαλύτερη αναλογία από τις 8 ως τις 23 περίπου ώρες μετά τη θεραπεία. Το σύνολο των καταλοίπων, φθάνει σε επίπεδα κάτω από τα 100 μg kg -1, στις 71 ώρες. Σε γενικές γραμμές, το γάλα των προβάτων περιείχε μεγαλύτερη ποσότητα μεταβολιτών της ΝΕΤΟ, σε σύγκριση με αυτό των βοοειδών [56]. Τόσο στα πρόβατα, όσο και στα βοοειδή, μετά τη λήψη μίας p.o. δόσης ΑΒΖ, παρατηρήθηκε μέγιστη συγκέντρωση του συνόλου των καταλοίπων στις 11 ώρες και πτώση της συγκέντρωσής τους κάτω των επιπέδων των MRLs, 72 ώρες μετά [51]. Στις πρώτες 24 ώρες οι κύριοι μεταβολίτες, είναι οι ABZ-SO και ABZ-SO 2 [74-75], ενώ η ABZ-NH 2 -SO 2, φθάνει τη μέγιστη συγκέντρωσή της στις 36 ώρες [75] και είναι ο επικρατέστερος μεταβολίτης από το χρονικό διάστημα αυτό και ύστερα [75-76], 36

38 μετά από p.o. χορήγηση σε βοοειδή. Η ΑΒΖ, απομονώνεται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στο γάλα βοοειδών, επιβεβαιώνοντας το γεγονός ότι υφίσταται έντονο μεταβολισμό στο ήπαρ, αμέσως μετά τη χορήγησή της [74]. Το σύνολο των καταλοίπων ευρίσκεται σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες του MRL, μετά τις 48 ώρες από τη θεραπεία [75]. Σε βοοειδή και πρόβατα που έλαβαν θεραπεία με ABZ-SO, ανιχνεύθηκαν στο γάλα οι ABZ-SO, ABZ-SO 2 και ABZ-NH 2 -SO 2 και η συνολική τους συγκέντρωση έπεσε κάτω από τα MRLs, μετά από 48 ώρες [57]. Μετά από χορήγηση p.o. θεραπείας με FEB σε πρόβατα και βοοειδή, παρατηρήθηκαν υψηλότερες συγκεντρώσεις καταλοίπων στο γάλα των προβάτων. Επίσης, οι συγκεντρώσεις αυτές βρέθηκαν σε επίπεδα χαμηλότερα των MRLs (10 μg kg -1 ) για το γάλα 82 και 96 ώρες μετά τη θεραπεία σε βοοειδή και πρόβατα, αντίστοιχα [49]. Οι Delatour και συν. [77], αναφέρουν ότι 12 ώρες μετά τη χορήγηση FEB (7,5 mg kg -1 p.o.), το σύνολο των καταλοίπων στο γάλα βοοειδών είναι περίπου 400 μg kg -1. Μετά τις 60 ώρες οι συγκεντρώσεις τους είναι μη ανιχνεύσιμες, με τη μητρική FEB, να εμφανίζεται για περισσότερο χρόνο. Οι OFZ και FBZ-SO 2 είναι οι κύριοι μεταβολίτες που εμφανίζονται στο γάλα μετά από τη χορήγηση της FBZ σε βοοειδή [78]. Επιπλέον, όταν η FBZ, χορηγήθηκε σε βοοειδή ως πόσιμο εναιώρημα, ως φύραμα και ως πρόσθετο τροφής, τα συνολικά κατάλοιπα των FBZ και FBZ-SO 2, ήταν υψηλότερα στην περίπτωση του φυράματος [79]. Επίσης, ύστερα από χορήγηση FBZ, με τη μορφή εναιωρήματος σκόνης και βόλων-στην ίδια δοσολογία-σε βοοειδή, παρατηρήθηκαν δύο φορές και πλέον υψηλότερες συγκεντρώσεις καταλοίπων και μεγαλύτερος κατά δεκαεπτά ώρες ο χρόνος παραμονής τους στο γάλα, στην περίπτωση των βόλων [63]. Βοοειδή τα οποία έλαβαν p.o. θεραπεία με OFZ, εμφάνισαν τη μέγιστη συγκέντρωση καταλοίπων στο γάλα ύστερα από 36 ώρες. Η συγκέντρωση αυτή βρέθηκε σε επίπεδα μικρότερα των MRLs (10 μg kg -1 ) για το γάλα, 108 ώρες μετά τη θεραπεία [61]. Οι Moreno και συν. [43], συνέκριναν την απέκκριση των καταλοίπων στο γάλα, ύστερα από χορήγηση σε 4 διαφορετικές ομάδες βοοειδών υποδορίως (subcutaneously-s.c.), ABZ-SO και OFZ, και p.o. ABZ και OFZ. Παρατήρησαν ότι το προϊόν της αναγωγής της OFZ, η FBZ, απομονώθηκε από το γάλα, μόνο μετά την p.o. χορήγησή της OFZ. Η ΑΒΖ, αντίθετα, δεν ανιχνεύθηκε σε καμμία περίπτωση στο γάλα. Οι κύριοι μεταβολίτες μετά την s.c. χορήγηση ήταν η FBZ-SO 2 και η ABZ-SO, ενώ μετά την p.o. χορήγηση ήταν η OFZ και η ABZ-SO 2. Στην περίπτωση της ΑΒΖ, 37

39 κανένας μεταβολίτης δεν ανιχνεύθηκε 36 ώρες μετά την p.o. και s.c. χορήγηση. Για την OFZ, τα κατάλοιπα μετά την p.o. χορήγηση απομονώθηκαν από το γάλα, ως τις 72 ώρες, ενώ μετά την s.c. χορήγηση απομονώθηκαν ως τις 48 ώρες. Σύμφωνα με τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Φαρμάκων (European Medicines Agency), η ΜΒΖ δεν επιτρέπεται να χρησιμοποιείται σε ζώα τα οποία παράγουν γάλα για ανθρώπινη κατανάλωση [67]. Μόνο οι Pandey και Roy εξέτασαν την απέκκριση της ΜΒΖ στο γάλα αιγών, μετά από p.o. χορήγηση [65]. Στις δώδεκα ώρες μετά τη χορήγηση, η ΜΒΖ παρουσίασε τη μέγιστη συγκέντρωσή της (~10,05 μg kg -1 ) και βρέθηκε σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις μετά τις 96 ώρες Παρακολούθηση για υπολείμματα ΒΖ στα τρόφιμα Οι μέθοδοι ανάλυσης δειγμάτων γάλακτος για τον προσδιορισμό ΒΖ, με υγρή χρωματογραφία (Liquid Chromatography-LC), περιλαμβάνουν διαδικασίες εκχύλισης, καθαρισμού και ποσοτικού προσδιορισμού των καταλοίπων [80]. Συγκεκριμένα η εκχύλιση είναι δυνατό να γίνει ενδεικτικά με οξικό αιθυλεστέρα ή ακετονιτρίλιο, ύστερα από προσαρμογή του ph με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος. Το στάδιο του καθαρισμού γίνεται συνήθως με εκχύλιση στερεής φάσης, χρησιμοποιώντας την αντίστοιχη στήλη, η οποία είναι συνήθως τύπου C 18. Ακολουθεί έκλουση με ένα κατάλληλο διαλύτη-συνήθως μεθανόλη-και εξάτμιση μέχρι ξηρού (συνήθως με τη χρήση περιστροφικού εξατμιστήρα). Αφού γίνει η αποκατάσταση του καταλοίπου με κατάλληλο εκλουστικό διάλυμα, ακολουθεί η διαδικασία ανίχνευσής του, η οποία συνήθως γίνεται με LC και τη χρήση διαφόρων ανιχνευτών, όπως ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιοδίων, ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού, ηλεκτροχημικού δυναμικού, φθορισμού και φασματομετρίας μάζας (Mass Spectometry-MS). Και ενώ η LC-MS, είναι με διαφορά η πιο αξιόπιστη μέθοδος, χρησιμοποιείται συνήθως μόνο για την πιστοποίηση και επιβεβαίωση προηγούμενων μετρήσεων, λόγω υψηλού κόστους [80]. Επίσης, μπορεί ο ανιχνευτής φθορισμού να επιτυγχάνει καλύτερη ανίχνευση από αυτόν της συστοιχίας διόδων, όμως δεν εμφανίζουν όλες οι ουσίες το φαινόμενο του φθορισμού. Ένας ανιχνευτής συστοιχίας διόδων, επιτρέπει την καταγραφή απορροφήσεων σε πολλαπλά μήκη κύματος και το φάσμα που προκύπτει, μπορεί να συγκριθεί με τα φάσματα προτύπων ουσιών για επιβεβαίωση. 38

40 Έχουν περιγραφεί και άλλες μέθοδοι για την ανίχνευση των ΒΖ, όπως ανοσοχημικές, βιοδοκιμές, άμεσης φασματομετρίας, χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας και αέριας χρωματογραφίας [80]. Έχει αποδειχθεί ότι είκοσι περίπου διαφορετικοί μεταβολίτες ΒΖ θα μπορούσαν να προκύψουν σε ζωικούς ιστούς. Ωστόσο, είναι δύσκολο να αναπτυχθεί μια ικανή μέθοδος ανίχνευσης, για την ανίχνευση όλων των μεταβολιτών. Μια τέτοια μέθοδος θα απαιτήσει κατά πάσα πιθανότητα την εφαρμογή δαπανηρών τεχνολογιών όπως η LC-MS. Μια εναλλακτική προσέγγιση θα ήταν να επιλεγεί το πιθανότερο κατάλοιπο της κάθε ΒΖ που θα μπορούσε να οδηγήσει σε παραβίαση των MRL, ή αυτού που θα είναι πιο ανθεκτικό στους ιστούς (για την ταυτοποίηση μη εγκεκριμένης χρήσης) [26]. Είναι σημαντικό να γνωρίζουμε την κατανομή των υπολειμμάτων ΒΖ στους ιστούς πριν από την ανάπτυξη μιας μεθόδου. Για τις περισσότερες ΒΖ, το κατάλοιπο δείκτης ορίζεται ως το άθροισμα του πρόδρομου φαρμάκου ή/και των κύριων ή πιο ανθεκτικών μεταβολιτών τους. Για την προάσπιση της Δημόσιας Υγείας, η Ευρωπαϊκή Ένωση με τον κανονισμό 37/2010, θέσπισε ανώτατα όρια καταλοίπων στους ιστούς-στόχους, για τις φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, με βάση την επιστημονική αξιολόγηση της ασφάλειας των εν λόγω ουσιών [81]. Οι φαρμακολογικώς δραστικές ΒΖ και η ταξινόμησή τους όσον αφορά τα ανώτατα όρια καταλοίπων περιλαμβάνονται στον Πίνακα 2. 39

41 Πίνακας 2. Τρέχουσα λίστα MRLs για τις διάφορες ΒΖ [81]. Φαρμακολογικώς Δραστική Ουσία Κατάλοιπο δείκτης Είδος ζώου MRL (μg*kg -1 ) Ιστός - στόχος NETO, ABZ Άθροισμα ABZ-SO, ABZ-SO 2, και ABZ-NH 2 -SO 2, FEB, FBZ και OFZ εκφρασμένο ως ABZ Όλα τα μηρυκαστικά 100 Γάλα 100 Μύες 100 Λίπος 1000 Ήπαρ 500 Νεφροί Άθροισμα εκχυλίσιμων κατάλοιπων που μπορεί να Όλα τα μηρυκαστικά 10 Γάλα οξειδώνονται σε FBZ-SO 2 Όλα τα μηρυκαστικά, 50 Μύες χοίροι και ιπποειδή 50 Λίπος 500 Ήπαρ 50 Νεφροί FLU Άθροισμα της FLU και FLU-HMET Χοίροι, πουλερικά 50 Μύες TBZ Άθροισμα της TBZ και της 5-OH-TBZ 50 Δέρμα και λίπος 400 Ήπαρ 300 Νεφροί Πουλερικά 400 Αυγά Βοοειδή, αίγες 100 Μύες 100 Λίπος 100 Ήπαρ 100 Νεφροί 100 Γάλα OXI OXI Χοίροι 100 Μύες TCB MBZ Άθροισμα εκχυλίσιμων κατάλοιπων που ενδέχεται να οξειδώνονται προς ketotriclabendazole Άθροισμα των MBZ, MBZ-OH και MBZ-NH 2 που εκφράζεται ως MBZ Όλα τα μηρυκαστικά 225 Πρόβατα, αίγες και ιπποειδή 500 Δέρμα και λίπος 200 Ήπαρ 100 Νεφροί 100 Μύες Λίπος 250 Ήπαρ 150 Νεφροί 60 Μύες 60 Λίπος 400 Ήπαρ 60 Νεφροί 40

42 2.7. Τοξικότητα Αρκετές μελέτες, επισημαίνουν ότι η δυνατότητα των ΒΖ, να αναστέλλουν τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων, μπορεί να είναι και υπεύθυνη για την εκδήλωση εμβρυοτοξικότητας σε θηλαστικά. Παραμορφώσεις σπονδύλων, όπως συνένωση σπονδυλικών σωμάτων, ασύμμετρη αμφοτερόπλευρη παραμόρφωση σπονδύλων, απλασία σπονδυλικών σωμάτων, συνενωμένα πλευρικά οστά, δυσμορφία πυέλου και απλασία κνήμης, παρατηρήθηκαν σε έμβρυα θηλαστικών που εκτέθηκαν σε ΑΒΖ [82-83] (Εικ. 9). 41

43 Εικ. 9. 4: Σπονδυλικές διαμαρτίες διάπλασης σε έμβρυο μυός, στη μητέρα του οποίου χορηγήθηκε 10 mg kg -1 ABZ-SO. Σύντηξη σπονδυλικών τόξων (μεγάλο βέλος). Σύντηξη σπονδυλικών σωμάτων (λεπτό βέλος). Ασύμμετρες αμφοτερόπλευρες ατέλειες σπονδύλων (κεφαλές βελών). Ατελής ανάπτυξη σπονδυλικών σωμάτων (*). 5: Στερνοσχιστία (*) σε έμβρυο μυός. Η σκελετική αυτή δυσμορφία, ήταν μακροσκοπικά ορατή ως θωρακοσχιστία με εκτοπία καρδιάς. 6: Πολλαπλή σύντηξη πλευρών σε έμβρυο μυός. 7a: Δυσμορφία οπισθίου άκρου εμβρύου μυός. Σε αυτή την περίπτωση παρατηρείται απλασία κνήμης με γωνίωση περόνης. 7b: Φυσιολογικό οπίσθιο άκρο. I: Λαγόνιο οστό, Fe: Μηριαίο οστό, F: Περόνη, T: Κνήμη. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [82], με την άδεια του εκδότη (Elsevier). Οι αναφορές για οξεία τοξικότητα σε ζώα από τις ΒΖ είναι περιορισμένες. Η κύρια τοξική επίδραση των ΒΖ, σχετίζεται με την ικανότητά τους να προκαλούν τερατογενέσεις. Δυσμορφίες που προκύπτουν από τη χορήγηση ΒΖ κατά τη διάρκεια 42

44 της κύησης σε προβατίνες, έχουν παρατηρηθεί για την CAM και την ΑΒΖ [35, 84]. Υπάρχουν αναφορές για ηπατοτοξικότητα και τοξικότητα των γεννητικών αδένων σε διάφορα είδη θηλαστικών, μετά από θεραπεία με ΑΒΖ, κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος, της κύησης και της περιόδου μετά τον τοκετό [51]. Οι Dewa και συν. [85], αναφέρουν ότι η OFZ μπορεί να προκαλέσει νεοπλασματικές αλλοιώσεις στο ήπαρ πειραματοζώων, λόγω οξειδωτικού stress που προσβάλλει τα συστήματα αποτοξικοποίησης. Όσον αφορά τη FEB, αναφέρεται ότι τόσο αυτή όσο και οι FBZ, OFZ και ένας μεταβολίτης της, η Febantel sulphoxide (FEB-SO), είναι τερατογόνες σε διάφορα ζωικά είδη [86-88], ενώ η FBΖ είναι δυνατό να προκαλέσει καθυστέρηση στην ανάπτυξη των οστών σε πειραματόζωα [62]. Επιπλέον, μετά από p.o. χορήγηση FEB σε σκύλους, παρατηρήθηκαν αιματολογικές διαταραχές και υποπλασία ή μειωμένο βάρος γεννητικών αδένων. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν μείωση των επιπέδων του αιματοκρίτη, της αιμοσφαιρίνης, των ερυθροκυττάρων και αύξηση των επιπέδων των ηπατικών ενζύμων, ατροφία γεννητικών αδένων και λεμφογαγγλίων (και του σπλήνα) [49]. Εκτός από την ΑΒΖ και η ABZ-SO έχει διαπιστωθεί ότι είναι τερατογόνος ουσία [35, 51]. Η ΑΒΖ είναι τερατογόνος σε πειραματόζωα σε δοσολογικά επίπεδα που δεν προκαλούν τοξικότητα στις μητέρες [89]. Η ABZ-SO απαντάται στο πλάσμα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από την ΑΒΖ και για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα [90]. Ανάμεσα σε διάφορες μορφολογικές ανωμαλίες που παρατηρήθηκαν σε έμβρυα πειραματοζώων, οι Mantovani και συν. [89], αναφέρουν αγκιστροειδή κεφαλή με προσθιοπίσθια πλάτυνση και μικρό πρόσθιο εγκεφαλικό κυστίδιο που συνοδεύεται από εξοιδημένο ρομβοειδή εγκέφαλο, μετά από p.o. χορήγηση ΑΒΖ. Οι Delatour και Richard [91], συσχέτισαν την τερατογόνο δράση των ΒΖ σε πειραματόζωα, με αύξηση του μιτωτικού δείκτη σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Δυσμορφίες σπλαγχνικών οργάνων, αλλά και δυσμορφίες κρανίου και προσώπου καθώς και άλλα ελαττώματα οστών όπως βράχυνση άκρων παρατηρήθηκαν στην εν λόγω έρευνα. Η ΑΒΖ μπορεί να προκαλέσει μειωμένη ανάπτυξη και επιβίωση των νεογεννήτων σε πειραματόζωα, κατά την περίοδο της γαλουχίας [51]. Τερατογόνα αποτελέσματα (απουσία οφθαλμών, μικροφθαλμία και πολλαπλές σκελετικές σπονδυλικές αλλοιώσεις) αναφέρθηκαν σε έμβρυα μυών, μετά από χορήγηση FEB στις μητέρες (πειραματόζωα). Επίσης, παρατηρήθηκε αύξηση των παλινδρομήσεων και καθυστέρηση της ανάπτυξης των εμβρύων. Επίπλέον, η χορήγηση FEB ή OFZ από την όγδοη ως και τη δεκατηπέμπτη ημέρα της κυήσεως, προκάλεσε τερατογόνα αποτελέσματα σε πειραματόζωα [49]. Οι Hurtt και συν. [22], 43

45 αναφέρουν εμβρυοτοξικότητα για την FBZ. Οι Delatour και συν. [90] επισημαίνουν ότι υπάρχει συσχέτιση ανάμεσα στην εμβρυοτοξικότητα και στη συγκέντρωση μεταβολιτών με τέτοια δράση στο πλάσμα του αίματος. Η χορήγηση OFZ στην τροφή μυών-γονέων στα επίπεδα του MRL, είχε σημαντικά αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη των εμβρύων τους (Εικ ) [92]. Εικ. 10. Φωτογραφία μίας φυσιολογικής μήτρας μυός κατά τη 18 η ημέρα της κύησης (Α) και μίας μήτρας που παρουσιάζει απορρόφηση εμβρύων (Β), λόγω χορήγησης OFZ στη μητέρα, σε επίπεδα συγκέντρωσης ίσα με το MRL. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [92], με την άδεια του εκδότη (EDP Sciences). 44

46 Εικ. 11. Φωτογραφία εμβρυικών σκελετών μυών κατά τη 18 η ημέρα της κύησης. (Α) Φυσιολογικός σκελετός, (Β) σκελετός εμβρύου, του οποίου η μητέρα έλαβε OFZ στα επίπεδα του MRL, με ατελή οστεοποίηση ιερών και ουραίων σπονδύλων (sa-ca), ηβικών οστών (bp) της πυελικής ζώνης. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [92], με την άδεια του εκδότη (EDP Sciences). 45

47 Εικ. 12. Φωτογραφία εμβρύου μυός 18 ημερών- στου οποίου τη μητέρα χορηγήθηκε OFZ-που εμφανίζει εξωτερικό αιμάτωμα (βέλος). Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [92], με την άδεια του εκδότη (EDP Sciences). Όσον αφορά την ΜΒΖ υπάρχουν αναφορές για τερατογόνο δράση σε πειραματόζωα, που αφορούν δυσμορφίες στην καρδιά το ήπαρ και το νεφρό. Επίσης προκαλεί εξεγκεφαλία, κηλόσωμα, συνένωση πλευρικών οστών, σκολίωση, απουσία ή βράχυνση της ουράς, υδροκεφαλία και νέκρωση των εμβρύων [67]. Οι Delatour και Richard [91] αναφέρουν ότι η ΜΒΖ προκάλεσε τερατογενέσεις σε πειραματόζωα με κύριο σύμπτωμα την υδροκεφαλία, όταν τους έγινε χορήγηση από την όγδοη ως και τη δεκατηπέμπτη ημέρα της κύησης. Η ΜΒΖ παρεμποδίζει τον αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων σε στελέχη του Aspergillus nidulans [93]. Οι El-Makawy και συν. [92], κατέληξαν στο ότι όταν η OFZ χορηγηθεί στα επίπεδα του MRL στην τροφή των μυών προκαλεί αύξηση του συνολικού πρωτεϊνικού 46

48 περιεχομένου του ήπατος, των νεφρών και των ωοθηκών, ενώ προκαλεί και μείωση του DNA και του RNA των ιστών. Επίσης, η OFZ στα επίπεδα του MRL προκαλεί αύξηση των ηπατικών ενζύμων (GOT και GPT) [94]. Οι Karmakar και συν. [95], αναφέρουν ότι η αύξηση της συγκέντρωσης των ηπατικών ενζύμων, συνοδεύεται από χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε κύτταρα του μυελού των οστών. Κατά συνέπεια, σύμφωνα με τις παραπάνω μελέτες, ο μεταβολίτης της FEB, η OFZ, είναι γενοτοξικός παράγοντας. Αύξηση των επιπέδων των GOT και GPT έχει αναφερθεί και για την ΤΒΖ, μετά από προσθήκη της στην τροφή πειραματοζώων (μυών) [96]. Επίσης, σε επίπεδο κυττάρου θηλαστικών, οι ABZ και ABZ-SO, βρέθηκαν να είναι in-vivo μεταλλαξιγόνες σε σωματικά κύτταρα [51]. Οι Ramirez και συν. [97], συμπέραναν ότι οι ABZ και ABZ-SO σταματούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αυξάνουν το σχηματισμό των πυρηνίσκων σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Ο σχηματισμός πυρηνίσκων ευνοεί την εμφάνιση ανευπλοειδιών. Οι Whittaker και Faustman [83, 98], κατέληξαν στο ότι οι ABZ και ABZ-SO εκτός από αναστολείς της κυτταρικής διαίρεσης, εμποδίζουν και τη διαφοροποίηση των οργάνων σε συγκεντρώσεις επιπέδου nanomole και παράλληλα αναστέλλουν και την ανάπτυξη. Τα ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα Chang είναι πιο ευαίσθητα στις κυτταροτοξικές ιδιότητες της ΜΒΖ από τα ηπατικά κύτταρα του μυός ή του επίμυος [99]. Αν και η ΜΒΖ δεν είναι άμεσα ενεργό μεταλλαξιγόνο, προκαλεί ανευπλοειδίες σε σωματικά κύτταρα θηλαστικών [67]. Σύμφωνα με τους Holden και συν. [100], οι ΜΒΖ, FBZ, CAM και PBZ προκαλούν συσσώρευση της μετάφασης, η οποία βρέθηκε ότι εξαρτάται από τη δόση και το χρόνο έκθεσης στις ουσίες αυτές. Όσον αφορά το μεταβολίτη της FEB, OFZ, αναφέρεται ότι προκαλεί απόπτωση των μειωτικών σπερματικών κυττάρων κυρίως λόγω καταστροφής των μικροσωλινίσκων [101]. Επίσης, στην προηγούμενη μελέτη αναφέρεται και εκφύλιση των κυττάρων του Sertoli με διάταση του ενδοπλασματικού δικτυωτού και συγκέντρωση λιπιδίων. Οι El- Makawy και συν. [92], αναφέρουν ότι όταν στην τροφή των μυών προστίθεται η OFZ, στα επίπεδα του MRL, αυξάνεται σημαντικά η εμφάνιση πολυπλοειδιών (κύτταρα του μυελού των οστών, σπερματικά κύτταρα και κύτταρα εμβρύων) (Εικ. 13). 47

49 Εικ. 13. Διαφορετικοί τύποι χρωμοσωμικών ανωμαλιών που προκαλούνται από την OFZ, σε κύτταρα του μυελού των οστών. (Α) κενό (g), θραύση (b), (Β) διαγραφή, (C) ανασυνδυασμός άκρων, (D) κεντρική σύντηξη, (Ε) πολυπλοειδία και (F) ενδομίτωση. Ανατύπωση από τη βιβλιογραφική αναφορά [92], με την άδεια του εκδότη (EDP Sciences). Στο σημείο αυτό, αξίζει να αναφερθεί, ότι οι ΒΖ είναι ιδιαίτερα ανθεκτικές στα διάφορα στάδια παραγωγής των τροφίμων. Συγκεκριμένα, οι Rose και συν. [102] αναφέρουν ότι το μαγείρεμα δεν καταστρέφει τα κατάλοιπα, (αν και μπορεί να επηρεάσει το σημείο ισορροπίας μεταξύ OFZ, FBZ-SO 2, FBZ και κάποιων άλλων μεταβολιτών). Επιπροσθέτως, οι Arminshaw και συν. [103], εξέτασαν τη σταθερότητα των ιδίων ΒΖ, οι οποίες προστέθηκηκαν σε ομογενοποιημένο πρόβειο ήπαρ, το οποίο αποθηκεύτηκε σε βαθειά κατάψυξη για 181 ημέρες. Τα αποτελέσματα, όπως και της προηγούμενης έρευνας, έδειξαν ότι καμία από τις ουσίες αυτές δεν καταστράφηκε. Οι 48

50 Fletouris και συν. [75], αναφέρουν σταθερότητα των ΑΒΖ-SO, ΑΒΖ-SO 2 και ABZ- NH 2 -SO 2, ύστερα από προσθήκη τους σε δείγματα γάλακτος και αποθήκευσή τους στους -18 C, για τρείς και οκτώ μήνες. Τέλος οι Cooper και συν. [104], διαπίστωσαν ότι το συμβατικό μαγείρεμα (ψήσιμο για 40 λεπτά στους 190 C και τηγάνισμα για 8 έως 20 λεπτά) του βοδινού (μυικός ιστός και ήπαρ), δεν αποτελεί προστατευτικό μηχανισμό ενάντια στη βρώση καταλοίπων ABZ, FBZ και MBZ. Συνοψίζοντας τα ανωτέρω, υπάρχει πλήθος εργασιών που επιβεβαιώνουν, τόσο την τοξικολογική και τερατογόνο δράση των ΒΖ, όσο και την ανθεκτικότητά τους στις διάφορες μεθόδους επεξεργασίας των τροφίμων. Για τους λόγους αυτούς οι ΒΖ αποκτούν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη Δημόσια Υγεία Η διάχυση των βενζιμιδαζολών στο περιβάλλον Τρόποι μεταφοράς στο περιβάλλον Σύμφωνα με τους Slone και συν. [105], ζούμε σε μία θάλασσα χημικών ουσιών, που δεν έχουν ελεγχθεί ως προς τις καρκινογόνες ή τις τερατογόνες ιδιότητές τους. Οι ΒΖ, όπως και ποικίλες χημικές συνθετικές ουσίες, που χρησιμοποιούνται με όλο και πιο αυξημένο ρυθμό στη βιομηχανία, στη γεωργία (ζιζανιοκτόνα, εντομοκτόνα, χημικά λιπάσματα κ.ά.), στις οικίες, στην κτηνοτροφία κλπ, ρυπαίνουν σοβαρά το περιβάλλον, με δυσμενείς συνέπειες όχι μόνο στο οικοσύστημα, αλλά και πιθανώς στην υγεία ανθρώπου και ζώων [20]. Παρόλο που η χρήση ορισμένων από τις ουσίες αυτές (CAM, LUX, PBZ) έχει περιοριστεί σημαντικά σε πολλές χώρες, αρκετές εξακολουθούν να διασπείρονται ή να παραμένουν στο περιβάλλον και να αποτελούν απειλή (κίνδυνο) για τα ζώα (άγρια και αγροτικά) και πιθανώς για τον άνθρωπο. Από την ανακάλυψη της πρώτης ΒΖ (1961), ως σήμερα, εκατομμύρια τόνοι αυτών των κ.φ.ο. έχουν χρησιμοποιηθεί. Για παράδειγμα μόνο στην Κορέα για το έτος 2006 πωλήθηκαν 356 τόνοι FBZ [36]. Οι ΒΖ μετά τη χορήγησή τους στα ζώα για θεραπευτικούς λόγους, είναι δυνατόν να καταλήξουν σε υδάτινα ή εδαφικά οικοσυστήματα, ή να καταναλωθούν από τον άνθρωπο ως κατάλοιπα σε τρόφιμα ζωικής ή φυτικής προέλευσης [92,106]. Οι ΒΖ, όπως και όλα τα φάρμακα, είναι δυνατό να διοχετευθούν στο περιβάλλον, λόγω εκπομπών κατά τη σύνθεση και την παρασκευή τους. Αυτό συμβαίνει κυρίως κατά τη διαδικασία καθαρισμού της ενεργού φαρμακευτικής ουσίας, όπου 49

51 προκύπτουν κατάλοιπα, τα οποία λόγω ανεπαρκών διαδικασιών αποικοδόμησης (π.χ. υδρόλυση, φωτόλυση), καταλήγουν στο περιβάλλον [107]. Οι ιχθυοκαλλιέργειες είναι ένα άλλο πεδίο στο οποίο βρίσκουν εφαρμογή οι ΒΖ [108]. Χορηγούνται είτε μέσω της στοματικής οδού, είτε με θεραπευτικά λουτρά, για τη θεραπεία παρασιτικών νοσημάτων των ιχθύων [109]. Σε αυτή την περίπτωση οι ΒΖ μεταβολίζονται από τους ιχθύες και εν μέρει απεκκρίνονται στο υδάτινο περιβάλλον, είτε με την αρχική τους μορφή, είτε με τη μορφή μεταβολιτών. Εάν η νόσος των ιχθύων προκαλεί και ανορεξία τότε η τροφή που περιέχει τις ΒΖ, δεν καταναλώνεται και οι ΒΖ απελευθερώνονται στο υδάτινο περιβάλλον [8]. Όλα αυτά προκαλούν περαιτέρω επιβάρυνση για τους υπόλοιπους υδρόβιους οργανισμούς, μερικοί από τους οποίους είναι δυνατό να καταναλωθούν και από τον άνθρωπο. Μεγάλες ποσότητες ΒΖ χρησιμοποιούνται στην κτηνοτροφία κυρίως, αλλά και στη γεωργία. Μετά το μεταβολισμό τους στο σώμα του ζώου, οι ουσίες αυτές απεκκρίνονται με τα κόπρανα και τα ούρα. Με τις διαδικασίες καθαρισμού των ζωικών αποβλήτων από τον άνθρωπο ή με τη βοήθεια των βροχών οι ουσίες αυτές είναι δυνατό να καταλήξουν σε υδάτινες συλλογές ή άλλα εδάφη, πέραν της εκτροφής [106]. H ABZ απεκκρίνεται σε μικρότερο ποσοστό με τα κόπρανα σε σχέση με τα ούρα. Αντίθετα, οι μεταβολίτες της FEB, δηλαδή η FBZ και η OFZ, απεκκρίνονται σε ποσοστό 65% με τα κόπρανα και 20% με τα ούρα [110]. Tα ζώα συντροφιάς (σκύλος, γάτα), λόγω της περιορισμένης και εξατομικευμένης εφαρμογής των ΒΖ, δεν αποτελούν σημαντική πηγή ρύπανσης [106]. Επίσης, οι ΒΖ είναι δυνατό να βρεθούν στο περιβάλλον, με την απόρριψη των περιεκτών τους, των ιατρικών εργαλείων για τη χορήγησή τους (π.χ. σύριγγες), ποσοτήτων οι οποίες εμφανίζουν κάποιο ελάττωμα, ή των οποίων η περίοδος χρήσης έχει λήξει. Αυτό έχει ως συνέπεια τον κίνδυνο παρουσίας καταλοίπων σε επιφανειακά και υπόγεια ύδατα. Σε αυτές τις περιπτώσεις η αποτέφρωση ή η υγειονομική ταφή τους θα ήταν οι ορθότερες λύσεις [107]. 50

52 Διάχυση στα εδαφικά οικοσυστήματα Από τη στιγμή που μία κτηνιατρική, φαρμακευτικά δραστική ουσία ή κάποιος μεταβολίτης της, βρεθεί σε ένα εδαφικό οικοσύστημα, η περαιτέρω τύχη της, εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητές της και από τις ειδικές κάθε φορά συνθήκες που επικρατούν στο σημείο εναπόθεσής της (θερμοκρασία, οργανική ύλη, pη) [110]. Οι ΒΖ εν προκειμένω, έχουν μετρίου βαθμού μεταβολισμό, και για το λόγo αυτό στα ούρα και τα κόπρανα των ζώων απαντώνται και οι μεταβολίτες και οι πρόδρομες ουσίες [110]. Η μορφή με την οποία είναι δυνατό να απαντηθούν στο εδαφικό οικοσύστημα μπορεί να είναι αυτή του μεταβολίτη, ή αυτή του συνδεδεμένου καταλοίπου. Από την αρχικά χορηγηθείσα ποσότητα μιας κ.φ.ο., 7-90% μπορεί τελικά να βρεθεί στο έδαφος με τη μορφή συνδεδεμένων καταλοίπων [111]. Σε μία εργασία που αφορούσε την τύχη των ΒΖ σε ζωικά απόβλητα και έδαφος, και συγκεκριμένα για τις FLU και FBZ, αναφέρεται ότι και οι δύο αυτές ουσίες και οι μεταβολίτες τους βρίσκονταν ως και πάνω από έξι μήνες, σε εκχυλίσιμη μορφή στα ζωικά απόβλητα και το λιπασμένο με αυτά έδαφος [112]. Επίσης, η έκπλυση των ΒΖ από το έδαφος είναι σημαντικός παράγοντας για την εκτίμηση της έκθεσης σε αυτές. Η έκπλυσή τους ποικίλλει ακόμα και μεταξύ γειτονικών περιοχών, επηρεαζόμενη από τη χρήση της γης και την ετερογένεια των τοποθεσιών. Οι Weiss και συν. [113], διερεύνησαν το θέμα αυτό για τη FLU, συγκρίνοντας την έκπλυσή της από καλλιεργήσιμες εκτάσεις και από βοσκοτόπους. Στους βοσκότοπους η έκπλυση της FLU ήταν 5-6 φορές μεγαλύτερη από ότι στις καλλιεργήσιμες εκτάσεις. Ο λιποφιλικός χαρακτήρας των ΒΖ εκτός των άλλων συντελεί και στη γρήγορη προσρόφησή τους από τις ρίζες καλαμποκιού [114]. Αυτή η πληροφορία είναι σημαντική, γιατί μπορεί να εξηγήσει το πέρασμα των ΒΖ στην τροφική αλυσίδα από το έδαφος. Ωστόσο, για την περαιτέρω ανάπτυξη μοντέλων έκθεσης και εκτίμησης κινδύνου που αφορούν τα εδαφικά οικοσυστήματα απαιτούνται περισσότερα δεδομένα για τη διάχυση των ουσιών αυτών σε πραγματικές συνθήκες (εκτός εργαστηρίου), την επίδραση της αποθήκευσης και της επεξεργασίας ζωικών λυμάτων, την ταυτόχρονη χρήση πολλών κ.φ.ο., την εφαρμογή γεωργικών πρακτικών, κ.α. [110]. 51

53 Διάχυση στα υδάτινα οικοσυστήματα Αν και υπάρχουν δεδομένα για τους τρόπους μεταφοράς των κ.φ.ο. στους υδάτινους αποδέκτες, λίγα είναι γνωστά για τη διάχυσή τους, τον περαιτέρω μεταβολισμό τους και τους κινδύνους που απορρέουν. Για παράδειγμα οι εκτιμήσεις κινδύνου δε λαμβάνουν υπόψη τις πολλαπλές εφαρμογές κ.φ.ο., όπως αυτές προκύπτουν για παράδειγμα σε περιοχές κοντά σε υδάτινους αποδέκτες οι οποίες φιλοξενούν πολλές κτηνοτροφικές και γεωργικές εγκαταστάσεις, των οποίων τα απόβλητα καταλήγουν στο νερό της περιοχής, κυρίως μετά από βροχοπτώσεις [115]. Επίσης για να εκτιμηθεί ο κίνδυνος που μπορεί να προκύψει για τους οργανισμούς ενός υδάτινου οικοσυστήματος, θα πρέπει να είναι γνωστή και η μορφή (κολλοειδή ή εναιωρήματα στερεών) με την οποία εισέρχεται σε αυτό μία ΒΖ, καθώς και τα χαρακτηριστηκά του οικοσυστήματος, π.χ. ph, σκληρότητα, διαλυμμένη ποσότητα οργανικού άνθρακα, κ.α. [116]. Είναι δυνατό να αναπτυχθούν προϊόντα μεταβολισμού στο νερό ή τα ιζήματα, με διαφορετική διάρκεια παραμονής από αυτή της αρχικής κ.φ.ο.. Οι ουσίες αυτές μπορεί να έχουν και διαφορετική επίπτωση (χειρότερη ή όχι) στους οργανισμούς της υδρόσφαιρας [117]. Εκτός αυτού, οι κ.φ.ο. σπανίως απαντώνται μόνες στο υδάτινο περιβάλλον. Συνήθως ευρίσκονται εντός μειγμάτων με άλλες ουσίες [118]. Αυτό δυσκολεύει περισσότερο την εκτίμηση κινδύνου έκθεσης σε αυτές. Ένας παράγοντας σημαντικός για την εκτίμηση κινδύνου για τους ασπόνδυλους αρχικά υδρόβιους οργανισμούς και άρα για την τροφική αλυσίδα (ιχθύες, πτηνά, θηλαστικά), είναι η τάση μιας κ.φ.ο., να συσσωρεύεται στα ιζήματα [119]. Πρόσφατα οι Kim και συν. [36], εκτίμησαν τον συντελεστή προσρόφησης των FBZ, ABZ, TBZ και FLU σε υποκατάστατα διαλυμένης οργανικής ύλης και λάσπη υπονόμων. Μια τέτοια εκτίμηση είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό της προβλεπόμενης περιβαλλοντικής συγκέντρωσης (PEC) των ΒΖ. Επίσης, τα επίπεδα της μέσης δραστικής συγκέντρωσης (EC 50 ), για τις FBZ, FLU, FEB, OFZ, TBZ και ABZ (16,5-1168,4 μg L -1 ), για την Daphnia magna (υδρόβιος ασπόνδυλος οργανισμός), ήταν παρόμοια με τα επίπεδα συγκέντρωσης της FLU (25-56 μg L -1 ), σε αρδευτικά νερά, μετά από καταιωνισμό εκτάσεων λιπασμένων με κοπριά ζώων στα οποία είχε χορηγηθεί η FLU [113,120]. Ωστόσο, όσον αφορά το υδάτινο περιβάλλον, πολλά μένουν ακόμα να διερευνηθούν. Και αυτό γιατί η τρέχουσα μεθοδολογία χρησιμοποιεί 52

54 πρότυπους οργανισμούς (ασπόνδυλα, ιχθύες) και καταληκτικά σημεία (θνητότητα, ανάπτυξη, αναπαραγωγή) για τα πειράματα. Στην πράξη, η βιοδιαθεσιμότητα και τα μοντέλα έκθεσης, είναι δυνατό να διαφέρουν από τα αντίστοιχα στο εργαστήριο, και κάποιες έμμεσες επιπτώσεις των κ.φ.ο. να μην αναγνωρίζονται [ ]. 53

55 II. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 54

56 Στην εποχή μας, οι καταναλωτές τροφίμων ζωικής προέλευσης, έχουν τη δυνατότητα πρόσβασης μέσω του τύπου, ακόμη και σε θέματα, όπως είναι η ύπαρξη καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων στα τρόφιμα [123]. Φυσικό επακόλουθο μιας τέτοιας πληροφόρησης, είναι ο προβληματισμός και η απαίτηση των καταναλωτών για περισσότερη ενημέρωση σχετικά με την ασφάλεια των τροφίμων που διατίθενται στην αγορά. Το πρόβλημα της εμφάνισης καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων στα τρόφιμα, οφείλεται κυρίως στην ανεξέλεγκτη χρήση των κτηνιατρικών φαρμάκων. Ο Πανελλήνιος Κτηνιατρικός Σύλλογος, ως ο πλέον αρμόδιος επιστημονικός φορέας, ασκούσε διαχρονικά πιέσεις για τη θέσπιση υποχρεωτικής συνταγογράφησης των κτηνιατρικών φαρμάκων, ως μέτρο ελέγχου της διάθεσής τους στην αγορά. Τελικά με την Υπουργική Απόφαση /Β/2009, καθορίστηκε το θεσμικό πλαίσιο συνταγογράφησης κτηνιατρικών φαρμάκων στα παραγωγικά ζώα [124]. Όμως αυτή η υπάρχουσα εν ισχύ νομοθεσία, που απαγορεύει την πώληση κτηνιατρικών φάρμακων χωρίς συνταγή κτηνιάτρου, δεν εφαρμόζεται [125]. Πέραν αυτού, η νομοθεσία της χώρας μας-και σε αντίθεση με τις υπόλοιπες χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης-παραχωρεί το δικαίωμα πώλησης και διακίνησης κτηνιατρικών φαρμάκων σε πολλές και μη συναφείς με το αντικείμενο (κτηνιατρική φαρμακολογία) κατηγορίες επιστημόνων, όπως π.χ. γεωπόνους, τεχνολόγους γεωπόνους, με συνέπεια να πωλούν φάρμακα και άλλοι επαγγελματίες παντελώς ξένοι με το επιστημονικό αυτό πεδίο, π.χ. μη κτηνίατροι-ιδιοκτήτες pet shop κλπ [125]. Ύστερα από τα παραπάνω, είναι λογική η διατύπωση αμφιβολιών για την ορθή χορήγηση και χρήση κτηνιατρικών φαρμάκων και επίσης για το αν τελικά αυτή η χρήση οδηγεί στην παραγωγή τροφίμων απαλλαγμένων ή όχι από τα κατάλοιπα αυτών των φαρμάκων. Ο μόνος τρόπος για να δοθεί απάντηση στις ανησυχίες του κοινού, είναι η διεξαγωγή μελετών στα διάφορα είδη τροφίμων για τον προσδιορισμό καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων και η εκτίμηση της πρόσληψης αυτών των καταλοίπων από τον άνθρωπο. Η παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ακριβώς για αυτό το σκοπό. Το προς διερεύνηση τρόφιμο, επιλέχθηκε να είναι το νωπό γάλα, διότι: 1. Πρόκειται για τρόφιμο ευρείας κατανάλωσης, είτε με τη μορφή του γάλακτος είτε με τη μορφή γαλακτοκομικών προϊόντων (τυρί, βούτυρο, γιαούρτη). 55

57 2. Υφίσταται ελάχιστη επεξεργασία, σε σχέση με άλλα τρόφιμα όπως είναι το νωπό κρέας, το οποίο υφίσταται βρασμό, κατάψυξη, ψήσιμο, τηγάνισμα κ.α. και συνεπώς τα χημικά κατάλοιπα που υπάρχουν σε αυτό επηρεάζονται ελάχιστα. Ως προς διερέυνηση κ.φ.ο., επιλέχθηκαν οι βενζιμιδαζόλες και οι προβενζιμιδαζόλες, καθώς παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη Δημόσια Υγεία, διότι: 1. Όπως ήδη αναφέρθηκε οι ανθελμινθικές αυτές ουσίες, χορηγούνται για την πρόληψη και θεραπεία των παρασιτώσεων των παραγωγικών ζώων. Αυτό σημαίνει ότι κατά κανόνα, χορηγούνται μαζικά, δηλαδή στο σύνολο του ζωικού κεφαλαίου και όχι σε εξατομικευμένες θεραπείες εντός του ποιμνίου. Κατά συνέπεια, δεδομένου ότι σύμφωνα με το Υπουργείο Υγείας η νομοθεσία για την κτηνιατρική συνταγογράφηση, δεν εφαρμόζεται στην πράξη [125], είναι λογικό επακόλουθο, ουσίες οι οποίες χορηγούνται μαζικά στα ποίμνια, να πωλούνται χωρίς έλεγχο και σε μεγαλύτερες από τις προβλεπόμενες ποσότητες, με σκοπό το οικονομικό κέρδος και μόνο. 2. Έχουν γενοτοξική και τερατογόνο δράση. 3. Τα κατάλοιπά τους είναι ανθεκτικά στα διάφορα στάδια επεξεργασίας των τροφίμων. Συνοψίζοντας, ο σκοπός της παρούσας μελέτης, ήταν η διερεύνηση των συγκεντρώσεων καταλοίπων ανθελμινθικών κτηνιατρικών φαρμάκων στο νωπό γάλα μεγάλων και μικρών μηρυκαστικών, από νομούς της Νοτίου Ελλάδας και η εκτίμηση της πρόσληψής τους από τον άνθρωπο. Αξίζει να σημειωθεί, ότι στη Διεθνή Βιβλιογραφία, δεν αναφέρεται καμμία έρευνα σχετικά με τον προσδιορισμό των FEB, FBZ, FBZ-SO 2, ABZ, MBZ, ABZ-SO και ABZ-SO 2, σε νωπό γάλα και την εκτίμηση πρόσληψής τους από τον άνθρωπο. Ως μέρος του σκοπού της παρούσας μελέτης, η εκτίμηση της πρόσληψης αυτών των καταλοίπων από τον άνθρωπο, θα ήταν δυνατό να αποτελέσει μία από τις βάσεις για μελλοντική έρευνα, όσον αφορά τη συσχέτιση των επιπέδων των τερατογόνων και γενοτοξικών αυτών ουσιών στο πλάσμα του αίματος, με περιπτώσεις διαταραχών ανάπτυξης εμβρύου στον άνθρωπο. 56

58 III. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 57

59 Α. Περιγραφή της μελέτης Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε στα ακόλουθα στάδια: α) Λήψη δειγμάτων νωπού γάλακτος από εκτροφές αιγοπροβάτων και βοοειδών της Νοτίου Ελλάδος, με τυχαία στρωματοποιημένη δειγματοληψία. β) Επιλογή της μεθόδου που περιγράφεται από τους Su και συν. [126], για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των προαναφερόμενων καταλοίπων με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography-HPLC). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε από τους συγγραφείς, για τον προσδιορισμό των ΤΒΖ, ΤΒΖ-ΟΗ, ABZ, MBZ, ABZ-SO, ABZSO 2 -NH 2 και ABZ-SO 2, σε διάφορους ιστούς και στο γάλα. Στο εργαστήριό μας χρησιμοποιήθηκε και για τoν προσδιορισμό των FEB, FBZ, FBZ-SO 2. Επίσης, οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν, ανιχνευτές φθορισμού και συστοιχίας φωτοδιοδίων, ενώ στο εργαστήριό μας χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής συστοιχίας διόδων, υπεριώδους (UV). γ) Αξιολόγηση της μεθόδου και υπολογισμός των ανακτήσεων και των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των διερευνώμενων καταλοίπων. δ) Διεξαγωγή αναλύσεων των δειγμάτων νωπού γάλακτος και αποθήκευση των αποτελεσμάτων σε βάση δεδομένων. ε) Από προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου Υγιεινής του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, ελήφθησαν πληροφορίες για τις διατροφικές συνήθειες δείγματος που αφορά πληθυσμό παιδιών, ηλικίας ετών (Ερωτηματολόγιο FFQ). Αξίζει να σημειωθεί ότι το νωπό γάλα που καταναλώνεται από αυτές τις ηλικίες είναι το αγελαδινό. Η µεγαλύτερη ποσότητα του αιγοπρόβειου γάλακτος, χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη μεταποίησης (παραγωγή τυροκομικών προϊόντων σε βιομηχανίες, βιοτεχνίες και οικοτεχνίες) [127]. Ένα γαλακτοκομικό προϊόν από αιγοπρόβειο γάλα, το οποίο καταναλώνεται ευρέως από αυτές τις ηλικίες, είναι το τυρί φέτα (βλ. κεφ. 8). Επειδή, στα πλαίσια της παρούσας μελέτης οι ΒΖ προσδιορίσθηκαν μόνο σε νωπό γάλα και όχι σε τυροκομικά προϊόντα, για τη σχετική εκτίμηση της πρόσληψης, αξιοποιήθηκαν τα δεδομένα που υπάρχουν στη Διεθνή Βιβλιογραφία. Με το συνδυασμό των παραπάνω, είναι δυνατό να εξαχθούν εκτιμήσεις για τη πρόσληψη των ΒΖ από τον άνθρωπο, με την κατανάλωση γάλακτος. 58

60 1. Δειγματοληψία Για τη δειγματοληψία επελέγησαν όλοι οι νομοί της Πελοποννήσου και ενδεικτικά δύο της Στερεάς Ελλάδος. Στις περιοχές αυτές της Νοτίου Ελλάδος, όπου έγινε η δειγματοληψία, παράγεται το 12,74% του συνολικού γάλακτος που παραδίδεται στις βιομηχανίες γάλακτος της χώρας. Όσον αφορά την παραγωγή ανά είδος γάλακτος, παράγεται το 18,31% πρόβειου, το 23,17% αιγείου και το 6,74% αγελαδινού [ ]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η Ελλάδα περιλαμβάνει 52 συνολικά νομούς, οι 9 νομοί της Ν. Ελλάδας είναι πολύ σημαντικές περιοχές, ως επί το πλείστον για την παραγωγή του πρόβειου και αιγείου γάλακτος και λιγότερο για το γάλα από βοοειδή (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Ποσότητες γάλακτος που παραδόθηκαν στις γαλακτοβιομηχανίες το έτος 2008, από εκτροφές των εννέα νομών της Ν. Ελλάδος. Περιοχή Ποσότητα πρόβειου γάλακτος * (tons) Ποσότητα αίγειου γάλακτος * (tons) Ποσότητα βόειου γάλακτος (tons) Αχαϊα Ηλεία Κορινθία Αρκαδία Αργολίδα Μεσσηνία Λακωνία Φωκίδα Αττική Σύνολο *[128] [129] Τελικά 123 δείγματα γάλακτος, συγκεντρώθηκαν από ίσο αριθμό εκτροφών, μικρών και μεγάλων μηρυκαστικών, κατά τη διάρκεια της άνοιξης και του φθινοπώρου του Κάθε δείγμα αντιστοιχούσε σε διαφορετική εκτροφή αιγών, προβάτων και 59

61 βοοειδών. Η δειγματοληψία έλαβε χώρα σε εννέα ευρύτερες περιοχές της Νοτίου Ελλάδος (Αργολίδα, Αρκαδία, Αττική, Αχαϊα, Ηλεία, Κορινθία, Λακωνία, Μεσσηνία και Φωκίδα), με τη συνδρομή του Ελληνικού Οργανισμού Γάλακτος και Κρέατος (ΕΛ.Ο.ΓΑ.Κ.), και της Ένωσης Αγροτικών Συνεταιρισμών Καλαβρύτων. Η λήψη των δειγμάτων γάλακτος έγινε από την ψυκτική δεξαμενή όπου το γάλα συγκεντρώνεται αμέσως μετά το άρμεγμα και πριν παραδοθεί στα βυτιοφόρα φορτηγά των γαλακτοβιομηχανιών. Κατά συνέπεια κάθε δείγμα αποτελούσε ένα μέσο δείγμα διότι λαμβανόταν από το σύνολο του γάλακτος της εκτροφής και όχι από γάλα μεμονωμένων ζώων. Για τη συλλογή των δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δοχεία πολυπροπυλενίου, χωρητικότητας 100 ml, τα οποία αμέσως μετά τη δειγματοληψία μεταφέρονταν με ισοθερμικό περιέκτη, στο Εργαστήριο Υγιεινής του Πανεπιστημίου Πατρών, όπου αποθηκεύονταν στους -18 C. Οι επιλεγμένες εκτροφές παρήγαγαν και πωλούσαν γάλα στις γαλακτοβιομηχανίες και δεν το κρατούσαν για οικιακή χρήση μόνο. Συνεπώς το γάλα που παραγόταν από αυτές μπορούσε να βρεθεί σε αστικές και αγροτικές περιοχές σε οποιαδήποτε μορφή. Η δειγματοληψία σχεδιάσθηκε ώστε τα ποσοστά των δειγμάτων που λαμβάνονταν από κάθε περιφέρεια, να είναι σε αναλογία με τις παραδιδόμενες ποσότητες γάλακτος στις βιομηχανίες. Τέλος όλες οι εκτροφές παρακολουθούνταν από τις επίσημες κτηνιατρικές αρχές και ήταν εγκεκριμένες για την παραγωγή και διανομή νωπού γάλακτος. 2. Υλικά και μέθοδοι 2.1. Συσκευές (α) HPLC/DAD (Diode Array Detector-Ανιχνευτής Συστοιχίας Διόδων) αποτελούμενη από ένα Varian 9010, σύστημα διανομής διαλυτικού μέσου και ένα Varian 9065 Polychrom ανιχνευτή, (β) Στήλη LC (Pursuit 5, C18, 250 4,6 mm-varian, Middelburg, The Netherlands), (γ) Περιστροφικός εξατμιστήρας (RE 100) και υδατόλουτρο (RE 100B) (Bibby Sterlin Ltd, Stone Staffordshire, England), 60

62 (δ) Μεταλλικό υδατόλουτρο (Edelstahl, W. Germany), (ε) Φυγόκεντρος GL Minifuge (Heraeus, Osterode, Germany), (στ) Mεμβράνες διαμέτρου 0,2 mm (Spartan 13/0,2 RC Whatman GmbH, Dassel, Germany) Αντιδραστήρια (α) Διαλύτες: Ακετονιτρίλιο (Acetonitrile gradient grade) για υγρή χρωματογραφία, Μεθανόλη (Methanol gradient grade) για υγρή χρωματογραφία, ν-εξάνιο (n-hexane) για υγρή χρωματογραφία, Διμεθυλοσουλφοξειδιο (Dimethylsulfoxide- DMSO G.R.) και 1-Προπανόλη (1-Propanol) για υγρή χρωματογραφία αποκτήθηκαν από την εταιρεία Merck KGaA, Darmstadt, Germany. (β) Απεσταγμένο νερό. (γ) Όξινο ανθρακικό νάτριο (BDH Chemicals Ltd, Poole, England), Ανθρακικό Νάτριο (Merck, Darmstadt, Germany) και Ένυδρο δισόξινο φωσφορικό νάτριο (Merck, Darmstadt, Germany). (δ) BHT (2.6-Di-tert-butyl-4-methylphenol) αποκτήθηκε από τη Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Germany. (ε) Πρότυπες ουσίες Βενζιμιδαζολών και Προβενζιμιδαζολών: Albendazole (ABZ 98%), Febantel (FEB 99%) και Mebendazole (MBZ 98%) αποκτήθηκαν από την εταιρεία Neochema (Bodenheim, Germany), Fenbendazole (FBZ 99,0%), Αlbenazole sulfoxide (ABZ-SO 98.5%) και 61

63 Αlbenazole sulfone (ABZ-SO 2 99%) αποκτήθηκαν από την εταιρεία Laboratory Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany). Τέλος, η Fenbendazole sulfone (FBZ-SO 2 ), με καθαρότητα άνω του 99%, αποκτήθηκε από την εταιρεία Witega Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH. Όλες οι ουσίες ευρίσκονταν σε στερεή μορφή. (στ) Ενδιάμεσα διαλύματα προτύπων ουσιών, συγκεντρώσεως από 50 μg ml -1 για την κάθε ουσία, παρασκεύασθηκαν με κατάλληλη διάλυση σε καθαρή μεθανόλη για τις ABZ, ABZ-SO, ABZ-SO 2, FBZ και FBZ-SO 2 σε DMSO για την MBZ και σε ακετονιτρίλιο για τη FEB. Μεικτά διαλύματα εργασίας που περιείχαν και τις επτά ουσίες, σε συγκεντρώσεις 20, 50, 100 και 2000 ng ml -1 παρασκεύασθηκαν σε διάλυμα αποτελούμενο από μεθανόλη/ακετονιτρίλιο/nah 2 PO 4 (1/1/3). 3. Χημική Ανάλυση 3.1. Εκχύλιση 5 ml δείγματος γάλακτος τοποθετήθηκαν σε ένα φυγοκεντρικό σωλήνα μαζί με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος (κορεσμένο όξινο ανθρακικό νάτριο, το οποίο ρυθμίστηκε σε ph 10 με κορεσμένο ανθρακικό νάτριο). Επίσης, στο σωλήνα προστέθηκαν και 1 ml διαλύματος BHT, 1% και 15 ml ακετονιτριλίου. Η προσθήκη του αντιοξειδωτικού παράγοντα BHT αποσκοπεί στην παρεμπόδιση της περεταίρω οξείδωσης των διερευνώμενων καταλοίπων κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας των δειγμάτων. Η ουσία αυτή δεν προκάλεσε καμία παρεμβολή κατά τη διάρκεια της χρωματογραφικής ανάλυσης. Ακολούθησε ανακίνηση του φυγοκεντρικού σωλήνα για 5 min και φυγοκέντρησή του στις 3500 στροφές ανά λεπτό για 5 min. Η υγρή φάση του φυγοκεντρημένου δείγματος μεταφέρθηκε από το φυγοκεντρικό σωλήνα σε μία κωνική φιάλη. Στη συνέχεια προστέθηκαν άλλα 15 ml ακετονιτριλίου στο σωλήνα και οι διαδικασίες της ανακίνησης και της φυγοκέντρησης επαναλήφθηκαν, και πάλι η υγρή φάση μεταφέρθηκε στην κωνική φιάλη. Το περιεχόμενο της κωνικής φιάλης μεταφέρθηκε σε μία διαχωριστική χοάνη η οποία περιείχε 30 ml ν-εξανίου κορεσμένου με ακετονιτρίλιο. Η διαχωριστική χοάνη ανακινήθηκε για 5 min και η στοιβάδα του ακετονιτριλίου μεταφέρθηκε σε σφαιρική φιάλη. Αφού προστέθηκαν 5 62

64 ml προπανόλης-1, στη σφαιρική φιάλη, αυτή τοποθετήθηκε σε περιστροφικό εξαερωτήρα, μέχρι εξατμίσεως στους 40 C Καθαρισμός Το αποξηραμένο περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης ανασυστάθηκε με 5 ml υδατικού διαλύματος μεθανόλης 10% και μεταφέρθηκε σε μία σύριγγα LiChrolut RP 18, από την οποία προηγουμένως είχαν διέλθει 5 ml μεθανόλης και στη συνέχεια 5 ml μεθανόλης 10%. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε άλλη μία φορά και το έκλουσμα απορρίφθηκε. Η ίδια φιάλη συγκεντρώσεως εκπλύθηκε δύο φορές με 4 ml ακετονιτριλίου και το διάλυμα που προέκυπτε κάθε φορά περνούσε μέσα από την ίδια σύριγγα. Το προϊόν των διαδοχικών εκλούσεων συλλέχθηκε σε σφαιρική φιάλη συγκεντρώσεως η οποία τοποθετήθηκε σε περιστροφικό εξαερωτήρα, μέχρι εξατμίσεως στους 40 ο C. Το περιεχόμενο της φιάλης ανασυστάθηκε με 2 ml διαλύματος Μεθανόλης/Ακετονιτριλίου/0,02Μ δισόξινου φωσφορικού νατρίου (1/1/3). Ακολούθησε ανακίνηση του διαλύματος και δίοδός του από μεμβράνες διαμέτρου 0,2 mm, πριν την ανάλυσή του με HPLC. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την ανάλυση των επτά ουσιών φαίνεται συνοπτικά στο Σχήμα 3. Δείγμα γάλακτος 5 ml Προσθήκη 1 ml ρυθμιστικού δ/τος (μείγμα κορεσμένου NaHCO3 και Na2CO3), έως ph 10. Προσθήκη 1 ml δ/τος BHT και ανατάραξη με ακετονιτρίλιο (15 ml) 2 φορές. Διαχωρισμός με 30 ml ν-εξανίου, κορεσμένου με ακετονιτρίλιο. Η στοιβάδα του ακετονιτριλίου εξατμίζεται μέχρι ξηρού. Το κατάλοιπο διαλύεται σε 5 ml δ/τος μεθανόλης 10%. Πέρασμα από στήλη C18. Έκπλυση με 5 ml δ/τος μεθανόλης 10%. Εκχύλιση με 4 ml ακετονιτριλίου 2 φορές. Εκχύλισμα εξατμίζεται μέχρι ξηρού. Το κατάλοιπο διαλύεται σε 2 ml δ/τος Μεθανόλη/Ακετονιτρίλιο/NaH2PO4 (1/1/3). HPLC Σχήμα 3. Σύντομη περιγραφή της διαδικασίας χημικής ανάλυσης που ακολουθήθηκε. 63

65 3.3. Ανάλυση με HPLC Σύστημα HPLC, αποτελούμενο από ένα σύστημα διανομής διαλυτικού μέσου (Varian 9010) και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων (Polychrom 9065), χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των καταλοίπων των κτηνιατρικών φαρμάκων στα δείγματα γάλακτος. Ο ανιχνευτής DAD, λειτούργησε σε εύρος nm. Η στήλη για το διαχωρισμό των ΒΖ ήταν η Pursuit 5U C ,6 mm. Για την κινητή φάση επιλέχθηκε σύσταση από ακετονιτρίλιο και δισόξινο φωσφορικό νάτριο με pη 3,3. H ροή της βαθμιαίας έκλουσης που χρησιμοποιήθηκε παρουσιάζεται στον πίνακα 4. Ο ρυθμός ροής της κινητής φάσης ορίστηκε στο 1 ml min -1. Ο όγκος της ένεσης των δειγμάτων ήταν 50 μl. Πίνακας 4. Ροή βαθμιαίας έκλουσης. Χρόνος (min) Διαλύτης A Διαλύτης B (%) (%) Διαλύτης A: Ακετονιτρίλιο. Διαλύτης B: 0,02M Δισόξινο Φωσφορικό Νάτριο (ph 3,3) 3.4. Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση Δημιουργήθηκε μία βιβλιοθήκη η οποία περιείχε τα UV φάσματα των ABZ, ABZ-SO, ABZ-SO 2, MBZ, FBZ, FBZ-SO 2 και FEB σε μήκη κύματος από 190 έως 367 nm. Τα φάσματα αυτά λήφθηκαν μετά από ανάλυση των πρότυπων διαλυμάτων σε διαφορετικά επίπεδα συγκέντρωσης. Τα φάσματα των ερευνώμενων ουσιών παρουσιάζονται στις Εικ Δύο τυπικά χρωματογραφήματα δειγμάτων γάλακτος, στα οποία προστέθηκαν οι πρότυπες ουσίες φαίνονται στις εικόνες 21 και 22. Η ανίχνευση του καταλοίπου ABZ-SO 2 σε ένα τυχαίο δείγμα γάλακτος φαίνεται 64

66 στην εικόνα 23. Στα χρωματογραφήματα των δειγμάτων γάλακτος παρουσιάστηκαν οι απορροφήσεις των ουσιών στα 292 nm. Η επιβεβαίωση της παρουσίας ενός καταλοίπου σε κάποιο δείγμα επιτεύχθηκε με τη σύγκριση τόσο των φασμάτων σε εύρος nm, όσο και του χρόνου εμφάνισης-συγκράτησης. Η υπό προσδιορισμό ουσία θεωρούταν ταυτοποιημένη μόνο όταν το UV φάσμα της παρουσίαζε ομοιότητα άνω του 97%, με τα φάσματα των προτύπων ουσιών, λαμβάνοντας υπόψη ένα παράθυρο χρόνου συγκράτησης ± 0.3 min. Ο λόγος σήμα προς θόρυβο (signal to noise - S/N), ορίστηκε στο 4. Για την ποσοτικοποίηση των καταλοίπων των επτά δραστικών ουσιών εφαρμόσθηκε βαθμονόμηση με εξωτερικά πρότυπα σε τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις. Εικ. 14. Φάσμα UV της ΑΒΖ. Εικ. 15. Φάσμα UV της ΑΒΖ-SO. 65

67 Εικ. 16. Φάσμα UV της ΑΒΖ-SO 2. Εικ. 17. Φάσμα UV της FEB. 66

68 Εικ. 18. Φάσμα UV της FΒΖ. Εικ. 19. Φάσμα UV της FΒΖ-SO 2. 67

69 Εικ. 20. Φάσμα UV της MΒΖ. Εικ. 21. Χρωματογράφημα δείγματος γάλακτος, στο οποίο προστέθηκαν οι πρότυπες ουσίες. 68

70 Εικ. 22. Χρωματογράφημα δείγματος γάλακτος, στο οποίο προστέθηκαν οι πρότυπες ουσίες ΑΒΖ, ΑΒΖ-SO και ΑΒΖ-SO 2. 69

71 Εικ. 23. Χρωματογράφημα τυχαίου δείγματος γάλακτος, στο οποίο ανιχνεύεται η ABZ- SO Πιστότητα και ακρίβεια Στους πίνακες 5α-5β και 6, παρουσιάζονται στοιχεία για τις ανακτήσεις των επτά ερευνώμενων καταλοίπων και για την απόδοση της αναλυτικής μεθόδου. Η ποσοστιαία ανάκτηση προσδιορίστηκε για τέσσερα επίπεδα συγκεντρώσεων (20, 50, 100, 2000 ng ml -1 ), προτύπων ουσιών σε ενοφθαλμισμένο δείγμα γάλακτος 5 ml από τρείς φορές (n=3). Τα όρια ανίχνευσης (Limits of Detection LOD) στα 292 nm, προσδιορίστηκαν στα 5 ng ml -1 για το FEB, 10 ng ml -1 για τις MBZ, ABZ-SO και την ABZ-SO 2 και 15 ng ml -1 για τις ABZ, FBZ και την FBZ-SO 2. Όσον αφορά την επαναληψιμότητα της μεθόδου, η ενδοημερήσια διακύμανση των αποτελεσμάτων υπολογίσθηκε σε 1-2%, ενώ η διαημερήσια, ήταν 3-4%. 70

72 Πίνακας 5α. Ανακτήσεις ABZ, ABZ-SO, ABZ-SO 2 και MBZ, σε 4 διαφορετικά επίπεδα συκέντρωσης. Επίπεδο Συγκέντρωσης (ng ml -1 ) n Μέση τιμή ανάκτησης (ng) ABZ ABZ-SO ABZ-SO 2 MBZ Τυπική απόκλιση Ανάκτηση (%) Μέση τιμή ανάκτησης (ng) Τυπική απόκλιση Ανάκτηση (%) Μέση τιμή ανάκτησης (ng) Τυπική απόκλιση Ανάκτηση (%) Μέση τιμή ανάκτησης (ng) Τυπική απόκλιση ,64 1,43 88,2 20,3 1,73 101,5 19,76 1,28 98,8 18,88 1,47 94, ,35 2,21 86,7 53,8 3,60 107,6 49,3 2,22 98,6 47,6 2,81 95, ,20 4,17 85,2 99,3 5,26 99,3 97,9 3,52 97,9 89,4 3,84 89, ,00 65,76 82, ,65 97, , ,98 90,6 Ανάκτηση (%) Πίνακας 5β. Ανακτήσεις FEB, FBZ και FBZ-SO 2, σε 4 διαφορετικά επίπεδα συκέντρωσης. FEB FBZ FBZ-SO 2 Επίπεδο Συγκέντρωσης (ng ml -1 ) n Μέση τιμή ανάκτησης (ng) Τυπική απόκλιση Ανάκτηση (%) Μέση τιμή ανάκτησης (ng) Τυπική απόκλιση Ανάκτηση (%) Μέση τιμή ανάκτησης (ng) Τυπική απόκλιση Ανάκτηση (%) ,7 1, ,82 2,00 89,1 18,48 1,20 92, ,05 2, ,1 3,62 88,2 48,2 2,65 96, ,3 4, ,4 5,81 85,4 93,2 4,01 93, , ,60 87, ,02 91,7 71

73 Πίνακας 6. Στοιχεία αναλυτικής απόδοσης της μεθόδου για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των διερευνώμενων ουσιών. Κατάλοιπο Υπόστρωμα LOD (ng*ml -1 ) 1 LOQ (ng*ml -1 ) RSD r % (n=12) Μέτρηση Αβεβαιότητας MBZ γάλα C ABZ γάλα C ABZ-SO γάλα C ABZ-SO 2 γάλα C FEB γάλα C FBZ γάλα C FBZ-SO 2 γάλα C LOQ = Limit of Quantification (Όριο ποσοτικοποίησης) 2 C = Συγκέντρωση καταλοίπου. 4. Εκτίμηση κατανάλωσης γάλακτος Ο πληθυσμός για τον οποίο έλαβε χώρα η εκτίμηση κατανάλωσης διαφόρων τροφίμων, αφορούσε παιδιά ηλικίας, ετών, από περιοχές της Νοτίου Ελλάδος και συγκεκριμένα μαθητές των τριών τελευταίων τάξεων δημοτικών σχολείων των Νομών Αχαΐας και Ηλείας. Η επιλογή των σχολείων και ο αριθμός τους βασίσθηκε στην κατανομή του πληθυσμού στους δύο νομούς σε αστικές και αγροτικές περιοχές. Εκπαιδευμένος ερευνητής μετά από επισκέψεις σε δημοτικά σχολεία, διεξήγαγε προσωπικές συνεντεύξεις σε τυχαίως επιλεγμένα παιδιά από το κάθε σχολείο, βασιζόμενος σε ένα ημιποσοτικό FFQ επτά ημερών [130]. Τα παιδιά ηλικίας άνω των δέκα ετών είναι σε θέση να δώσουν τις δικές τους αξιόπιστες απαντήσεις, σε σχέση με παιδιά μικρότερων ηλικιών [130]. Λήφθησαν 723 προσωπικές συνεντεύξεις, οι οποίες αφορούσαν τις εβδομαδιαίες καταναλώσεις βασικών ομάδων τροφίμων. Σε αυτές συμπεριλαμβανόταν ο αριθμός ποτηριών νωπού γάλακτος (250 ml) και οι μερίδες του τυριού φέτα που καναλώνονται εβδομαδιαία. Τηρήθηκε αυστηρό χρονικό πλαίσιο (10 λεπτά της ώρας), για κάθε συνέντευξη. Τα δεδομένα που ελήφθησαν από αυτές τις συνεντεύξεις, συνδυάστηκαν με τα δεδομένα που προέκυψαν από τις αναλύσεις των δειγμάτων (Γεωμετρικός μέσος συγκεντρώσεων καταλοίπων). Με την παραδοχή ότι καταναλώνεται γάλα στο οποίο ανευρέθηκαν υπολείμματα των υπό 72

74 διερεύνηση ενώσεων, σε μετρήσιμες ποσότητες, έγινε προσδιορισμός της Εκτιμώμενης Ημερήσιας Πρόσληψης (Estimated Daily Intake/EDI) και σύγκρισή της με την ADI. Β. Αποτελέσματα Εξετάσθηκαν συνολικά 123 δείγματα γάλακτος (42 αίγειο, 69 πρόβειο, 12 αγελαδινό), για κατάλοιπα των επτά ερευνώμενων ουσιών (Γράφημα 1). Στον Πίνακα 7, φαίνεται ο αριθμός των δειγμάτων που συνελέγησαν ανά περιοχή και τα αντίστοιχα θετικά δείγματα. Παρουσιάστηκε σημαντική γεωγραφική διακύμανση, ανάμεσα στις εννέα περιοχές της Νοτίου Ελλάδος, όσον αφορά τη συχνότητα εμφάνισης των ερευνώμενων ουσιών στα δείγματα γάλακτος. Για παράδειγμα, το 78% των δειγμάτων από τη Μεσσηνία ήταν ρυπασμένα, ενώ μόνο το 10% των δειγμάτων της Αττικής περιείχαν αυτές τις ουσίες. Τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 16,7% για την Αργολίδα, 17,6% για την Αρκαδία, 19,1% για την Αχαΐα, 58,3% για την Ηλεία, 28,6% για την Κορινθία, 20% για τη Λακωνία και 50% για τη Φωκίδα (Πίνακας 7, Γράφημα 2). Γράφημα 1. Αριθμός συλλεχθέντων δειγμάτων ανά είδος γάλακτος. 73

75 Πίνακας 7. Αριθμός δειγμάτων γάλακτος που συλλέχθηκαν ανά γεωγραφική περιοχή και αριθμός θετικών δειγμάτων. FBZ FBZ-SO 2 ABZ ABZ-SO ABZ-SO 2 MBZ FEB Περιοχή N Συνολικό N Θετικό N Θετικό N Θετικό N Θετικό N Θετικό N Θετικό N Θετικό Αχαΐα 47 Δ.Α.* Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 Δ.Α. 9 Ηλεία 12 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α Κορινθία 7 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 Δ.Α. 1 Αρκαδία 17 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 1 Δ.Α. 1 Αργολίδα 12 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 Δ.Α. 2 Μεσσηνία 9 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 3 Δ.Α. 3 Λακωνία 5 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 Δ.Α. Δ.Α. Φωκίδα 4 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 2 Δ.Α. 1 Αττική 10 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α. 1 Δ.Α. Δ.Α. Σύνολο 123 Δ.Α. Δ.Α. Δ.Α * Δ.Α.: Δεν Ανιχνεύθηκε 74

76 Γράφημα 2. Ανά περιοχή κατανομή αρνητικών και θετικών δειγμάτων. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 8, δεν υπάρχει συσχέτιση ανάμεσα στο είδος του γάλακτος και τη συχνότητα εμφάνισης καταλοίπων των ανθελμινθικών αυτών ουσιών. Αν και φαίνεται ότι το αίγειο γάλα τείνει να περιέχει τα κατάλοιπα αυτά λιγότερο συχνά, ωστόσο η διαφορά ανάμεσα στο πρόβειο, το αίγειο και το βόειο γάλα δεν είναι στατιστικά σημαντική (p=0.548, Fischer s exact test). 75

77 Πίνακας 8. Θετικά και μη αποδεκτά δείγματα, ανά είδος γάλακτος. Είδος γάλακτος Αριθμός δειγμάτων n Θετικά δείγματα n (%) Αίγειο 42 9 (21,4) 1 Μη αποδεκτά δείγματα n (%) 5 (11,9) Πρόβειο (30,4) 7 (10,1) Σύνολο Αιγοπρόβειο (27) 12 (10,8) Αγελαδινό 12 4 (33,3) 2 (16,7) Σύνολο (27,6) 14 (11,4) 1 Δείγματα στα οποία η προσδιορισθείσα συγκέντρωση των ανθελμινθικών ουσιών είναι ανώτερη του MRL, ή ανιχνεύθηκαν κατάλοιπα απαγορευμένης ουσίας. Τα 34 από τα 123 δείγματα (27.6%), βρέθηκαν θετικά σε κατάλοιπα ανθελμινθικών ουσιών (Πίνακας 8, Γράφημα 3). Από τα θετικά δείγματα, τρία (2 αίγεια και 1 πρόβειο) περιείχαν ταυτόχρονα, κατάλοιπα FEB και ABZ-SO 2 και συλλέχθηκαν από τη Φωκίδα την Αργολίδα και την Αχαΐα κατά τη διάρκεια της άνοιξης. Ένα δείγμα πρόβειου γάλακτος περιείχε ταυτόχρονα MBZ και FEB και συλλέχθηκε από την Ηλεία κατά τη διάρκεια της άνοιξης. Από τα 34 θετικά δείγματα, 21 περιείχαν FEB, 13 ABZ-SO 2, 3 ABZ-SO και μόνο 1 MBZ (Γράφημα 4). Τέλος οι ABZ, FBZ και FBZ-SO 2, δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα δείγμα. 76

78 Γράφημα 3. Ποσοστό δειγμάτων με ή χωρίς κατάλοιπα. Γράφημα 4. Συχνότητα εμφάνισης των καταλοίπων επί του συνόλου των θετικών δειγμάτων (αριθμός θετικών δειγμάτων=34). 77

79 Ο συνολικός αριθμός μη αποδεκτών δειγμάτων, δηλαδή αυτών που τα επίπεδα συγκέντρωσης των διερευνώμενων ουσιών βρέθηκαν να είναι πάνω από τις θεσπισμένες τιμές MRLs της Ευρωπαϊκής Ένωσης, ήταν 14 (11.4%). Αυτά τα δείγματα περιείχαν μόνο FEB και MBZ (Γράφημα 5). Οι ABZ-SO και ABZ-SO 2 δεν ανιχνεύθηκαν σε τιμές συγκεντρώσεων οι οποίες να υπερβαίνουν αυτές των MRLs. Γράφημα 5. Κατανομή δειγμάτων που υπερβαίνουν το MRL. Στο γράφημα 6, παρουσιάζονται αναλυτικά όλα τα κατάλοιπα που προσδιορίσθηκαν ανά περιοχή και το επίπεδο συγκέντρωσής τους. 78