ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ. Σοφία Ρίζου Χηµικός Μηχανικός ΑΠΘ, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Σοφία Ρίζου Χηµικός Μηχανικός ΑΠΘ, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια ιπλωµατική εργασία µε τίτλο: Παρακολούθηση της επίδρασης της άρδευσης στο αρωµατικό δυναµικό σταφυλιών από την ποικιλία Vitis vinifera L. cv. Cabernet-Sauvignon, µε τη βοήθεια του προσδιορισµού της δεσµευµένης µέσω γλυκοζιτικών δεσµών µε ενώσεις µη φαινολικού τύπου γλυκόζης (phenol free glycosyl-glucose, PFGG) Στα πλαίσια του ΠΜΣ του Τµήµατος Χηµείας µε έµφαση στη Χηµεία και Τεχνολογία Τροφίµων Επίβλεψη: Χατζηδηµητρίου Ευφηµία (Λέκτορας) Θεσσαλονίκη, 2008

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Σοφία Ρίζου Χηµικός Μηχανικός ΑΠΘ, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια ιπλωµατική εργασία µε τίτλο: Μελέτη επίδρασης της άρδευσης στο αρωµατικό δυναµικό σταφυλιών από την ποικιλία Vitis vinifera L. cv. Cabernet-Sauvignon, µε προσδιορισµό της δεσµευµένης µέσω γλυκοζιτικών δεσµών µε ενώσεις µη φαινολικού τύπου γλυκόζης (phenol free glycosyl-glucose) Στα πλαίσια του ΠΜΣ του Τµήµατος Χηµείας µε έµφαση στη Χηµεία και Τεχνολογία Τροφίµων Τριµελής εξεταστική επιτροπή Μαρία Τσιµίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Στέφανος Κουνδουράς, Λέκτορας Ευφηµία Χατζηδηµητρίου, Λέκτορας Επίβλεψη: Ευφηµία Χατζηδηµητρίου (Λέκτορας) Θεσσαλονίκη,

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού ιπλώµατος Ειδίκευσης στη Χηµεία µε έµφαση στη Χηµεία και Τεχνολογία Τροφίµων, στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, κατά το χρονικό διάστηµα Ιανουάριος Μάρτιος Το θέµα της παρούσας εργασίας εισηγήθηκε η κ. Ε. Χατζηδηµητρίου, η οποία καθοδηγούσε και επέβλεπε όλη την πορεία των πειραµάτων. Η εργασία αυτή δε θα είχε ολοκληρωθεί χωρίς τη συνεχή βοήθειά της, τις συµβουλές και τις υποδείξεις της, αλλά κυρίως για το ενδιαφέρον της καθ όλη τη διάρκεια των πειραµάτων. Για το λόγο αυτό, αλλά και για την άψογη συνεργασία µας και το γενικότερα ευχάριστο περιβάλλον, θα ήθελα να την ευχαριστήσω µε όλη µου την καρδιά. Ευχαριστώ ακόµα, τα µέλη της τριµελούς εξεταστικής επιτροπής: κ. Μ. Τσιµίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια και κ. Σ. Κουνδουρά, Λέκτορα αµπελουργίας Α.Π.Θ., για τις εποικοδοµητικές παρατηρήσεις τους κατά τη διόρθωση της διπλωµατικής εργασίας, αλλά και για τη γενικότερη συµβολή τους στην εκπόνηση της. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλο το προσωπικό του εργαστηρίου (καθηγητές, διδάκτορες, µεταπτυχιακούς φοιτητές) για το ενδιαφέρον και τις υποδείξεις τους σε όλη την πορεία των πειραµάτων και για το φιλικό και ευχάριστο κλίµα συνεργασίας. Επιπρόσθετα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων για την προσφορά της αναγκαίας υλικοτεχνικής υποδοµής για τη διεξαγωγή των πειραµάτων, αλλά και όλο το ανθρώπινο δυναµικό για τη βοήθεια και τη συµπαράστασή του. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς µου, τους παππούδες µου και τους φίλους µου για τη συνεχή συµπαράσταση και την υποµονή τους καθ όλη τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών, όπως επίσης και τους ανθρώπους που πίστεψαν σε µένα και µε ενθάρρυναν να ολοκληρώσω τις σπουδές µου. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

4 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ...5 Abstract ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το σταφύλι Το άρωµα του οίνου Το πρωτογενές άρωµα Τερπένια C 13 -νορισοπρενοειδή Μεθοξυπυραζίνες Θειούχες ενώσεις (θειόλες, µερκαπτοκετόνες) Γλυκοζίτες οσµηρών πτητικών ενώσεων Παράγοντες που επηρεάζουν το σχηµατισµό των οσµηρών πτητικών ενώσεων του σταφυλιού Εξέλιξη του αρώµατος κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης και επίδραση διαφόρων παραγόντων Παροχή νερού µε το σύστηµα στάγδην άρδευσης Προσδιορισµός των γλυκοζιτών σε γλεύκη και οίνους Αποµόνωση των γλυκοζιτών Υδρόλυση των γλυκοζιτών και προσδιορισµός των ελεύθερων οσµηρών πτητικών ενώσεων Προσδιορισµός της δεσµευµένης µέσω γλυκοζιτικών δεσµών γλυκόζης (Glycosyl Glucose, G-G) και της δεσµευµένης µέσω γλυκοζιτικών δεσµών µε ενώσεις µη φαινολικού τύπου γλυκόζης (phenol-free glycosyl glucose, PFGG) Εφαρµογές της µεθόδου προσδιορισµού της PFGG Εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (SPE) ως τεχνική προκατεργασίας φυτικών δειγµάτων Στάδια της εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού Υλικά πλήρωσης στην εκχύλιση στερεάς φάσης Σκοπός της εργασίας ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ είγµατα

5 2.2. Πρότυπες ενώσεις Αντιδραστήρια - ιαλύτες Συσκευές Όργανα Γυάλινα σκεύη Λοιπός εξοπλισµός Μέθοδοι Προσδιορισµός της PFGG Παρασκευή πρότυπων διαλυµάτων n-οκτυλο-β-d-γλυκοπυρανοζίτη Χρωµατοµετρικός προσδιορισµός των ολικών φαινολικών συστατικών µε τη µέθοδο Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965) Στατιστική επεξεργασία αποτελεσµάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ιερεύνηση των συνθηκών του αναλυτικού προσδιορισµού της PFGG ιαλύτης εκχύλισης ιαχωρισµός των µη φαινολικών από τους φαινολικούς γλυκοζίτες Επιλογή του κατάλληλου υλικού πλήρωσης της στήλης SPE ιαλύτης έκλουσης των µη φαινολικών γλυκοζιτών Έλεγχος αξιοπιστίας της µεθόδου προσδιορισµού της PFGG Προσδιορισµός της ακρίβειας και της επαναληψιµότητας της µεθόδου προσδιορισµού της PFGG Εφαρµογή της µεθοδολογίας για τον προσδιορισµό της PFGG σε δείγµατα σταφυλιών...53 PFGG ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ - ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...63 Ελληνική Βιβλιογραφία...63 Ξένη βιβλιογραφία

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία υιοθετήθηκε µια µέθοδος προσδιορισµού των γλυκοζιτών που αποτελούν πρόδροµες ενώσεις πτητικών οσµηρών ενώσεων, και κατ επέκταση προσδιορισµού του αρωµατικού δυναµικού, στα σταφύλια, το γλεύκος και τους οίνους. Πιο συγκεκριµένα, προσδιορίσθηκε η δεσµευµένη µέσω γλυκοζιτικών δεσµών µε ενώσεις µη φαινολικού τύπου γλυκόζη (Phenol Free Glycosyl Glucose, PFGG) µε εφαρµογή ενός πρωτοκόλλου που περιλαµβάνει 4 στάδια: εκχύλιση των γλυκοζιτών, αποµόνωση των µη φαινολικών γλυκοζιτών, υδρόλυση για την απελευθέρωση της γλυκόζης και προσδιορισµό της γλυκόζης µε ενζυµική µέθοδο. Ο έλεγχος αξιοπιστίας της µεθόδου ήταν ικανοποιητικός και µας επέτρεψε να συνεχίσουµε και να τη χρησιµοποιήσουµε για την παρακολούθηση της επίδρασης διαφορετικών επιπέδων άρδευσης στο αρωµατικό δυναµικό σταφυλιών από την ποικιλία Cabernet-Sauvignon. Το πείραµα πραγµατοποιήθηκε για δύο συνεχόµενες χρονιές και δύο υποκείµενα. Τα πρώτα αποτελέσµατα δείχνουν κάποιες διαφορές στην περιεκτικότητα σε PFGG και συνεπώς στο αρωµατικό δυναµικό κάτω από τις συγκεκριµένες συνθήκες του παρόντος πειραµατισµού, ανάλογα κυρίως µε τα επίπεδα άρδευσης και τη χρονιά, ενώ για την επίδραση του υποκειµένου δεν προκύπτει κάτι ξεκάθαρο. Η µέθοδος προσδιορισµού της PFGG αποδεικνύεται χρήσιµη στην παρακολούθηση µεταβολών στο αρωµατικό δυναµικό των σταφυλιών. Για να µπορέσουµε ωστόσο, να βγάλουµε κάποια ασφαλή συµπεράσµατα, κρίνεται απαραίτητη η ανάλυση περισσότερων δειγµάτων από διαφορετικές ποικιλίες καθώς και περιοχές καλλιέργειας. Λέξεις κλειδιά: σταφύλια, αρωµατικό δυναµικό, γλυκοζίτες, SPE, PFGG, Cabernet-Sauvignon 5

7 Monitoring the influence of different irrigation levels on the aroma potential of Vitis vinifera L. cv Cabernet-Sauvignon grapes by means of determination of phenol free glycosyl-glucose (PFGG) Abstract In the present study we adopted a method for the determination of glycosides precursors of odorant volatiles, and thus determination of aromatic potential of grapes, musts and wines. More precisely, we determined the Phenol Free Glycosyl Glucose (PFGG), by applying an analytical protocol consisting of four steps: extraction of glycosides, isolation of non-phenolic glycosides, hydrolysis for the release of glucose and enzymatic determination of glucose. The accuracy and precision of the assay were found satisfactory and the method was used to monitor the effect of different irrigation levels on the aroma potential of Vitis vinifera L. cv Cabernet-Sauvignon grapes. The experiment was applied for two consecutive years and two rootstocks. The first results show some variations in the PFGG content and aromatic potential of grapes under the experimental conditions of the present study, mainly according to the irrigation level and year. The influence of rootstock wasn t clearly shown. The method of PFGG determination proved to be a useful tool to monitor the effect of different irrigation levels on the aroma potential of Vitis vinifera grapes, yet more samples from different grape varieties and regions need to be analysed to reach safer conclusions. Key words: Grapes, aroma, glycosides, SPE, PFGG, Cabernet-Sauvignon 6

8 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1. Το σταφύλι Το σταφύλι είναι ο βρώσιµος καρπός της αµπέλου και ως πρώτη ύλη στην παραγωγή του οίνου, ασκεί σπουδαία επίδραση στον τύπο και την ποιότητα αυτού. Το µέγεθος της επίδρασης εξαρτάται τόσο από την ποιότητα του σταφυλιού, όσο και από τις τεχνικές οινοποίησης οι οποίες χρησιµοποιούνται (Σουφλερός, 1997). Το σταφύλι αποτελείται από το βόστρυχο και τις ράγες. Οι ράγες αποτελούν το εδώδιµο και οινοποιήσιµο τµήµα του σταφυλιού. Αποτελούνται από το φλοιό (10-20% κ.β.), το σαρκώδες µέρος ή σάρκα (74-87% κ.β.) και τα γίγαρτα (0-6% κ.β.). Τα ποσοστά αυτά κυµαίνονται ανάλογα µε την ποικιλία του σταφυλιού, τις εδαφοκλιµατολογικές συνθήκες και το βαθµό ωρίµανσης (Σουφλερός, 1997). Η χηµική σύσταση της σάρκας είναι: νερό 65-80% (κ.β.), σάκχαρα 10-30%, άλλα συστατικά 5-6%. Στην τελευταία κατηγορία περιλαµβάνονται οργανικά οξέα, ανόργανα συστατικά (κυρίως κάλιο και ασβέστιο), αζωτούχες ενώσεις, πηκτίνες και οσµηρές πτητικές ενώσεις (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Τα κυριότερα φυσικοχηµικά φαινόµενα που συµβαίνουν κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης των ραγών και τα οποία παρουσιάζουν οινολογικό ενδιαφέρον είναι τα ακόλουθα: η διόγκωση των ραγών, η συσσώρευση των σακχάρων, η µείωση της οξύτητας, ο σχηµατισµός των χρωστικών και των ταννινών, ο σχηµατισµός των οσµηρών πτητικών ενώσεων (Σουφλερός, 1997) Το άρωµα του οίνου Στους οίνους υπάρχουν δύο κατηγορίες οσµηρών πτητικών ενώσεων. Εκείνες που συνιστούν το άρωµα στους νέους οίνους και εκείνες που συνιστούν το «µπουκέτο» στους παλαιωµένους, δηλαδή µια σύνθεση διαφόρων αρωµάτων που προέρχεται από την παλαίωση (Τσέτουρας, 2003). Αναλυτικότερα, το άρωµα του νέου οίνου συντίθεται από το πρωτογενές και το δευτερογενές άρωµα. Το πρωτογενές ή ποικιλιακό άρωµα 7

9 οφείλεται σε πτητικές ενώσεις που προέρχονται από το σταφύλι και αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό κάθε ποικιλίας. Το δευτερογενές άρωµα παράγεται κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύµωσης των σακχάρων του γλεύκους. Είναι χαρακτηριστικό των ζυµοµυκήτων που συµµετέχουν στη ζύµωση και των συνθηκών της ζύµωσης (Clarke & Bakker, 2004). Η ανάπτυξη του τριτογενούς αρώµατος ή «µπουκέτου» κατά την παλαίωση του οίνου προκύπτει από το µετασχηµατισµό των συστατικών του αρώµατος των νέων οίνων. Ο µετασχηµατισµός αυτός για τους περισσότερους τύπους «λεπτών» οίνων λαµβάνει χώρα απουσία οξυγόνου, κατά την παλαίωση τους στη φιάλη (Σουφλερός, 1997). Είναι γνωστό σήµερα ότι το άρωµα και το µπουκέτο των οίνων οφείλονται, κυρίως, στις ανώτερες αλκοόλες και τους εστέρες. Σηµαντική θεωρείται, ωστόσο, η συµµετοχή και άλλων οσµηρών ενώσεων, όπως είναι οι αλδεΰδες, οι κετόνες, τα τερπένια, οι πυραζίνες, οι λακτόνες και φουρανόνες, τα πτητικά οξέα, οι αµίνες, οι φαινόλες και οι θειούχες ενώσεις (Clarke & Bakker, 2004) Το πρωτογενές άρωµα Ανάµεσα στα συστατικά του αρώµατος του οίνου, οι οσµηρές πτητικές ενώσεις που προέρχονται από το σταφύλι, χαρακτηριστικές της ποικιλίας και της έκφρασής της ανάλογα µε τις εδαφοκλιµατικές συνθήκες, παίζουν αποφασιστικό ρόλο στην ποιότητα και τυπικότητα των οίνων. Αυτές αποτελούν το «ποικιλιακό» άρωµα των οίνων. Το ποικιλιακό άρωµα του οίνου µπορεί να είναι διαφορετικό από το άρωµα που προσδίδουν οι ενώσεις που βρίσκονται σε ελεύθερη κατάσταση στο σταφύλι. Οι ποικιλίες που θεωρούνται «αρωµατικές» όπως το Μοσχάτο, έχουν συνήθως και γλεύκη «αρωµατικά» και το άρωµα αυτό µοιάζει πολύ µε του οίνου ο οποίος παράγεται. Αντίθετα, τα γλεύκη «απλών», µη αρωµατικών, ποικιλιών είναι πρακτικά άοσµα, παρόλα αυτά, οι οίνοι που προκύπτουν έχουν ιδιαίτερα αρώµατα, χαρακτηριστικά της ποικιλίας του σταφυλιού από την οποία προήλθαν. Αυτό ισχύει για τις περισσότερες ξενικές «ευγενείς» ποικιλίες όπως Merlot, Cabernet-Sauvignon, Cabernet franc, Sauvignon blanc, Semillon, Pinot noir, Gamay, Chardonnay, Chenin blanc. Οι πρόδροµες 8

10 ενώσεις -οι άοσµες δηλαδή µορφές- οσµηρών πτητικών ενώσεων που υπάρχουν στο σταφύλι παίζουν στην περίπτωση αυτή σηµαντικότατο ρόλο στη διαµόρφωση του ποικιλιακού αρώµατος του οίνου (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Ο όρος «ποικιλιακό άρωµα» δεν υπονοεί παρόλα αυτά ότι κάθε ποικιλία έχει ιδιαίτερα πτητικά συστατικά. Στην πραγµατικότητα, µε λίγες εξαιρέσεις, οι ίδιες οσµηρές ενώσεις και οι πρόδροµες αυτών βρίσκονται στα γλεύκη και στους οίνους όλων των ποικιλιών. Η ιδιαίτερη αρωµατική προσωπικότητα που έχουν οι οίνοι που προέρχονται από διαφορετικές ποικιλίες οφείλεται στους πολλούς συνδυασµούς των συγκεντρώσεων των ενώσεων αυτών στους οίνους. Οι πτητικές οσµηρές ενώσεις σταφυλιών από ποικιλίες Vitis vinifera που θεωρούνται ότι διαµορφώνουν το ποικιλιακό άρωµα ανήκουν σε 4 βασικές οικογένειες: τερπένια, νορισοπρενοειδή µε 13 άτοµα άνθρακα, µεθοξυπυραζίνες καθώς και ορισµένες θειούχες ενώσεις (Ribéreau-Gayon et al., 2000) Τερπένια Η µεγάλη χηµική οικογένεια των τερπενίων (περίπου 4000 συστατικά) είναι ευρέως διαδεδοµένη στο φυτικό βασίλειο. Ανάµεσά τους, τα µονοτερπένια (C 10 H 16 ) και τα σεσκιτερπένια (C 15 H 24 ) που σχηµατίζονται από δύο και τρεις µονάδες ισοπρενίου (C 5 H 8 ), αντίστοιχα, περιλαµβάνουν οσµηρές πτητικές ενώσεις. Στα σταφύλια (κυρίως στο φλοιό των ραγών και λιγότερο στη σάρκα) και στους οίνους έχουν ταυτοποιηθεί περίπου σαράντα τερπενικές ενώσεις, τόσο οσµηρά πτητικά ελεύθερα τερπένια όσο και γλυκοζίτες αυτών (Maicas & Mateo, 2005). Τα µονοτερπένια απαντούν µε τη µορφή απλών υδρογονανθράκων (λεµονένιο, µυρκένιο), αλδεϋδών (γερανιάλη), αλκοολών (γερανιόλη), οξέων (γερανικό οξύ) ή εστέρων (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Οι ενώσεις που συνεισφέρουν περισσότερο στο άρωµα καθώς χαρακτηρίζονται από χαµηλό κατώφλι αντίληψης ( µg/l σε οίνο, Ribéreau-Gayon et al., 2000) είναι οι µονοτερπενικές αλκοόλες λιναλοόλη, κιτρονελόλη, γερανιόλη, νερόλη, α-τερπινεόλη (Σχήµα 1), καθώς και τα οξείδια 9

11 της λιναλοόλης (0,2µg/L κατώφλι αντίληψης), µε οσµή ανθέων που θυµίζει κυρίως το τριαντάφυλλο. Συνεισφέρουν σηµαντικά στο άρωµα ποικιλιών όπως τα Μοσχάτα, Gewürtztraminer, Riesling, Viognier καθώς απαντούν σε περιεκτικότητα µεγαλύτερη από το κατώφλι αντίληψης αντίθετα µε ποικιλίες όπως Sauvignon, Syrah, Cabernet-Sauvignon, Merlot, όπου η συγκέντρωση τους είναι πολύ µικρότερη από το κατώφλι αντίληψης (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Λιναλοόλη γερανιόλη νερόλη α-τερπινεόλη Σχήµα 1. Χαρακτηριστικές µονοτερπενόλες που απαντούν σε σταφύλια και οίνους Οι µονοτερπενικές πολυόλες (διόλες και τριόλες) οι οποίες απαντούν στα σταφύλια σε συγκεντρώσεις ελαφρά µεγαλύτερες του 1mg/L, δεν είναι ιδιαίτερα οσµηρές. Μπορεί, ωστόσο, µε υδρόλυση σε όξινο ph να προκύψουν από αυτές άλλα µονοτερπένια, µερικά από τα οποία είναι οσµηρά (Williams et al., 1980; Ribéreau-Gayon et al., 2000; Maicas & Mateo, 2005). Άοσµες είναι και οι συζευγµένες µε σάκχαρα µορφές των µονοτερπενίων. Οι µονοτερπενικοί γλυκοζίτες απαντούν στα σταφύλια σε συγκέντρωση από 2 έως και 8 φορές µεγαλύτερη σε σχέση µε τα ελεύθερα πτητικά οσµηρά τερπένια αποτελώντας µία εξαιρετικά σηµαντική δεξαµενή ποικιλιακού αρώµατος (Günata et al., 1985). Η κατηγορία αυτή των πτητικών ενώσεων έχει τραβήξει από πολύ νωρίς το ενδιαφέρον των ερευνητών και αποτελεί ένα διαρκές αντικείµενο µελέτης γι αυτό και θα αναφερθούµε αναλυτικότερα σε επόµενη παράγραφο C 13 -νορισοπρενοειδή Τα νορισοπρενοειδή µε 13 άτοµα άνθρακα (C 13 -νορισοπρενοειδή), αποτελούν τη δεύτερη σηµαντική κατηγορία πτητικών οσµηρών ενώσεων των σταφυλιών και των οίνων (Schreier et al., 1976; Strauss et al., 1987b; 10

12 Winterhalter et al., 1990; Cabrita et al., 2006). Προέρχονται από την αποικοδόµηση των καροτενοειδών (Σχήµα 2) όπως το β-καροτένιο, η λουτεϊνη, η νεοξανθίνη και βιολαξανθίνη (Kanasawud et al., 1990; Mordi et al., 1991) κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης των σταφυλιών (Baumes et al., 2002). Σχήµα 2. Σχηµατισµός C 9, C 10, C 11 και C 13 - νορισοπρενοειδών στα σταφύλια από την αποικοδόµηση των καροτενοειδών (Enzel, 1985, σε Ribéreau-Gayon et al., 2000) Οι κετόνες β-δαµασκηνόνη και β-ιονόνη καθως και τα TDN (1,1,6- τριµεθυλο-1,2-διϋδροναφθαλένιο) και βιτισπιράνιο (Σχήµα 3) αποτελούν τις πιο γνωστές πτητικές ενώσεις της οικογένειας των C 13 -νορισοπρενοειδών που απαντούν στους οίνους (Falcão et al., 2007) ενώ έχουν ταυτοποιηθεί επίσης οι 3-οξο-α-ιονόλη, 3-υδροξυ-β-δαµασκόνη, β-δαµασκόνη και ακτινιδόλη (Cabrita et al., 2006). β-ιονόνη β- αµασκηνόνη TDN Σχήµα 3. Χαρακτηριστικές C 13 -νορισοπρενοειδείς ενώσεις που απαντούν στα σταφύλια Η β-δαµασκηνόνη (3,5,8-µεγαστιγµατριεν-7-όνη) µε σύνθετη οσµή ανθέων, τροπικών φρούτων και κοµπόστας µήλου, και πολύ χαµηλό κατώφλι οσφρητικής αντίληψης (3,5 ng/l σε νερό, 45 ng/l σε υδατοαλκοολικό διάλυµα, 5µg/L σε οίνο) αποτελεί σηµαντικό συστατικό του αρώµατος σταφυλιών και 11

13 οίνων από ποικιλίες όπως Μοσχάτο, Merlot, Cabernet-Sauvignon, Cabernet franc όπου απαντά σε συγκεντρώσεις µεταξύ 5 και 6460 ng/l (Ribéreau- Gayon et al., 2000). H β-ιονόνη µε χαρακτηριστικό άρωµα βιολέττας και κατώφλι οσφρητικής αντίληψης ίσο µε 120 ng/l σε νερό, 800 ng/l σε υδατοαλκοολικό διάλυµα και 4µg/L σε λευκό οίνο (Ribéreau-Gayon et al., 2000; Darriet, 1993), βρίσκεται στους οίνους σε συγκεντρώσεις από 0 έως 2415ng/L (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Τα νορισοπρενοειδή µε 13 άτοµα άνθρακα απαντούν τόσο σε ελεύθερη οσµηρή πτητική µορφή στα σταφύλια όσο και, κυρίως, µε τη µορφή γλυκοζιτών (Ribéreau-Gayon et al., 2000) Μεθοξυπυραζίνες Οι µεθοξυπυραζίνες αποτελούν αζωτούχες ετεροκυκλικές ενώσεις. Η 2- µεθοξυ-3-ισοβουτυλοπυραζίνη (Σχήµα 4) µε έντονη οσµή που θυµίζει πράσινη πιπεριά και σπαράγγι ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά σε σταφύλια Cabernet- Sauvignon από τους Bayonove et al. το 1975 (σε Ribéreau-Gayon et al., 2000). Με πολύ χαµηλό κατώφλι αντίληψης [1ng/L στο νερό, 15ng/L σε ερυθρό οίνο (Ribéreau-Gayon et al., 2000; Roujou De Boubée et al., 2000)] αποτελεί µαζί µε την α- και β-ιονόνη και τη β-δαµασκηνόνη χαρακτηριστικό συστατικό του αρώµατος (key aroma component) σε οίνους από τις ποικιλίες Sauvignon blanc, Cabernet-Sauvignon, Cabernet franc και Merlot (Falcão et al., 2007). Σε οίνους από Sauvignon blanc και Cabernet- Sauvignon βρίσκεται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (0,5 έως 50 ng/l, Ribéreau-Gayon et al., 2000) σε σχέση µε άλλες ποικιλίες, ιδιαίτερα όταν η ωρίµανση είναι ανεπαρκής (Roujou De Boubée et al., 2000), προσδίδοντας τους τον ανεπιθύµητο χαρακτήρα της «πράσινης πιπεριάς». Σχήµα 4. Συντακτικός τύπος 2-µεθοξυ-3-ισοπροπυλοπυραζίνης (IPMP), δευτεροταγούς βουτυλοµεθοξυπυραζίνης (SBMP) και 2-µεθοξυ-3- ισοβουτυλοπυραζίνης (IBMP) 12

14 Οι µεθοξυπυραζίνες απαντούν σε ελεύθερη πτητική οσµηρή µορφή στα σταφύλια ενώ δεν έχουν αναγνωριστεί πρόδροµες άοσµες µορφές (Ribéreau- Gayon et al., 2000) Θειούχες ενώσεις (θειόλες, µερκαπτοκετόνες) Οι θειούχες ενώσεις που ανήκουν στην οικογένεια των θειολών (µερκαπτανών) θεωρούνται γενικά υπεύθυνες για άσχηµες οσµές στους οίνους (off-flavours). Ωστόσο, συστατικά αυτής της οικογένειας π.χ. 4- µερκαπτο-4-µεθυλο-πενταν-2-όνη (4MMP), 3-µερκαπτο-εξαν-1-όλη (3MH) (Σχήµα 5), οξικός εστέρας της 3-µερκαπτο-εξαν-1-όλης, γνωρίζουµε σήµερα ότι συµβάλλουν στο χαρακτηριστικό άρωµα των οίνων από Sauvignon blanc (Darriet, 1993; Tominaga et al., 1998a). Στο σταφύλι απαντούν µε µορφή πρόδροµων άοσµων ενώσεων συζευγµένων µε το αµινοξύ κυστείνη (Tominaga et al., 1998b). Σχήµα 5. Συντακτικοί τύποι 4ΜΜP και 3MH Γλυκοζίτες οσµηρών πτητικών ενώσεων Η έρευνα των τελευταίων δεκαετιών έχει αποκαλύψει ότι ένας µεγάλος αριθµός οσµηρών πτητικών ενώσεων των οίνων απαντά στο σταφύλι µε τη µορφή µη πτητικών γλυκοζιτών (Williams et al., 1982b; Zoecklein et al., 2000; Whiton & Zoecklein, 2002; Cabrita et al., 2006). Ο όρος «γλυκοζίτες» περιλαµβάνει ένα ευρύ φάσµα ενώσεων που έχουν ένα κοινό χαρακτηριστικό γνώρισµα: αποτελούνται από ένα τουλάχιστον µόριο σακχάρου ενωµένο µε ένα άλλο συστατικό το οποίο αναφέρεται ως αγλυκόνη. Οι γλυκοζίτες αποτελούν προϊόντα συµπύκνωσης και σχηµατίζονται από το υδρογόνο του ηµιακεταλικού υδροξυλίου και την υδροξυλοµάδα από µια άλλη ένωση (Μπόσκου, 1997). Στα σταφύλια οι κύριες µονοτερπενόλες και οι τερπενικές πολυόλες απαντούν και µε τη µορφή γλυκοζιτών (Williams et al., 1982; Voirin et al., 1990, Allen et al. 1989; Schwab et al. 1990; Sarry and Gunata 2004) στους 13

15 οποίους συµµετέχουν 4 βασικά σάκχαρα: γλυκόζη, αραβινόζη, ραµνόζη και απιόζη. Τέσσερις τύποι γλυκοζιτών έχουν ταυτοποιηθεί (Σχήµα 6): τρεις διγλυκοζίτες (6-Ο-α-L-αραβινοφουρανοζυλο-β-D-γλυκοπυρανοζίτης, 6-Ο-α-Lραµνοπυρανοζυλο-β-D-γλυκοπυρανοζίτης, 6-Ο-β-D-απιοφουρανοζυλο-β-Dγλυκοπυρανοζίτης) και ένας µονογλυκοζίτης (β-d-γλυκοπυρανοζίτης) (Maicas and Mateo, 2005). Σχήµα 6. Συντακτικοί τύποι των τερπενικών γλυκοζιτών (ή νορισοπρενοειδών) που απαντούν στα σταφύλια. R= τερπενόλη ή C 13 -νορισοπρενοειδές (ή τερπενικές πολυόλες ή πτητικές φαινόλες ή φαινολικά οξέα) Επίσης, οι C 13 -νορισοπρενοειδείς ενώσεις απαντούν στα σταφύλια κυρίως µε τη µορφή πρόδροµων µη πτητικών ενώσεων (καροτενοειδών και γλυκοζιτών). Οι γλυκοζίτες αυτοί µέχρι στιγµής έχουν ταυτοποιηθεί µόνο µονογλυκοζίτες (Ribéreau-Gayon et al., 2000)- είναι δυνατό, σε όξινο περιβάλλον, να υποστούν χηµικές µετατροπές οι οποίες οδηγούν στις αντίστοιχες οσµηρές πτητικές ενώσεις π.χ. β-δαµασκηνόνη (Skouroumounis et al., 1992; Naiker, 2001), βοµιφολιόλη, 3-οξο-α-ιονόλη, 3-υδροξυδαµασκόνη (Skouroumounis and Winterhalter, 1994). Ποικιλίες πλούσιες σε C 13 -νορισοπρενοειδείς γλυκοζίτες είναι οι Cabernet- Sauvignon, Syrah, Merlot, Semillon και Chardonnay (Πίνακας 1), οι οποίες χαρακτηρίζονται γενικότερα ως ουδέτερες ποικιλίες καθώς το άρωµά τους δεν στηρίζεται στα τερπένια (Mateo & Jiménez, 2000). Τέλος, οξείδια της λιναλοόλης, γραµµικές ή κυκλικές αλκοόλες (εξανόλη, φαινυλοαιθανόλη, βενζυλική αλκοόλη), φαινολικά οξέα και πτητικές φαινόλες όπως η βανιλίνη, απαντούν επίσης µε τη µορφή γλυκοζιτών (Günata 14

16 et al., 1985; Allen et al. 1989; Schwab et al. 1990; Mateo & Jiménez, 2000; Zoecklein et al., 2000; Whiton & Zoecklein, 2002; Sarry & Gunata 2004; Maicas & Mateo, 2005). Πίνακας 1. Παράδειγµα κατανοµής των ελεύθερων και συζευγµένων µορφών των κύριων µονοτερπενολών και C 13 -νορισοπρενοειδών σε ώριµα σταφύλια Ποικιλία Ελεύθερες Τερπενοειδείς C 13 -νορισοπρενοειδείς Αναφορά τερπενόλες (µg/l) γλυκοζίτες (µg/l) γλυκοζίτες (µg/l) α Μοσχάτα: Αλεξανδρείας Α β Άσπρο Α Αµβούργου Α Ottonel Α Gewurztraminer Α Riesling Günata (1984) Sauvignon blanc Semillon Syrah Chardonnay Razungles et al. (1993) Cabernet-Sauvignon Ribéreau-Gayon et al., 2000 α Οι C 13 -νορισοπρενοειδείς γλυκοζίτες περιλαµβάνουν: 3-υδροξυ-β-D-δαµασκόνη, οξο-3-α-ιονόλη, οξο- 4-β-ιονόλη, υδροξυ-3-β-ιονόλη και υδροξυ-3-διϋδρο-7, 8-β- ιονόλη β Α.= δεν ανιχνεύτηκε Οι γλυκοζίτες βρίσκονται σε µεγαλύτερη συγκέντρωση στα κύτταρα του φλοιού της ράγας (στη στοιβάδα της επιδερµίδας) σε σχέση µε τη σάρκα (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Καθώς πολλές οσµηρές πτητικές ενώσεις απαντούν στα σταφύλια σε µεγαλύτερη συγκέντρωση µε τη µορφή των γλυκοζιτών παρά ως ελεύθερες ενώσεις, οι τελευταίοι αποτελούν µια πολύ σηµαντική πρόσθετη πηγή αρώµατος το οποίο απελευθερώνεται µέσω της ήπιας όξινης υδρόλυσης που πραγµατοποιείται φυσικά κατά τη διάρκεια της οινοποίησης και της παλαίωσης των οίνων (Sefton, 1994; Zoecklein et al., 2000; Naiker, 2001; Cabrita et al., 2006; Arevalo Villena et al., 2006). 15

17 Από τη βιβλιογραφία προκύπτει τέλος, ότι οι γλυκοζίτες πρόδροµοι οσµηρών πτητικών ενώσεων δεν είναι παρόντες σε όλες τις ποικιλίες σταφυλιών, και όπου εµφανίζονται δεν βρίσκονται πάντα στις ίδιες συγκεντρώσεις, αλλά οι αναλογίες τους διαφέρουν ανάλογα µε την ποικιλία (Gunata et al., 1985; Nicolini et al., 1993; Arrhenius et al., 1996; McCloskey et al., 1996; Lao et al., 1997; Reynolds & Wardle, 1997; Zoecklein et al., 1997; Garcia-Moruno et al., 2000; Reyero et al., 2000; Maicas & Mateo, 2005) Παράγοντες που επηρεάζουν το σχηµατισµό των οσµηρών πτητικών ενώσεων του σταφυλιού Η σύσταση και η ποιότητα του σταφυλιού ασκούν καθοριστικό ρόλο στην ποιότητα του οίνου. Οι παράγοντες από τους οποίους επηρεάζονται διακρίνονται σε σταθερούς, των οποίων η επίδραση δεν αλλάζει από τη µια χρονιά στην άλλη και µεταβλητούς, πολλοί από τους οποίους είναι υπεύθυνοι για το χαρακτήρα µιας συγκεκριµένης σοδειάς Στους σταθερούς παράγοντες περιλαµβάνονται: α) η ποικιλία της αµπέλου, κύριος παράγοντας που καθορίζει το χρόνο ωρίµανσης των σταφυλιών και την ποιότητα του προϊόντος β) το υποκείµενο, παίζει σηµαντικό ρόλο στη ζωηρότητα και πρωιµότητα επηρεάζοντας τον τελικό βαθµό της ωριµότητας των σταφυλιών γ) οι αποστάσεις φύτευσης δ) το κλίµα και ε) το έδαφος. Στους µεταβλητούς παράγοντες περιλαµβάνονται: α) οι καιρικές συνθήκες της εκάστοτε εσοδείας, β) η ηλικία του φυτού, γ) οι καλλιεργητικές τεχνικές στις οποίες ανήκουν π.χ. η περιποίηση του εδάφους, η λίπανση, η άρδευση, το κλάδεµα, και δ) οι ασθένειες της αµπέλου (Σουφλερός, 1997) Εξέλιξη του αρώµατος κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης και επίδραση διαφόρων παραγόντων Οι ελεύθερες και συζευγµένες µε σάκχαρα µορφές των τερπενολών αρχίζουν να συσσωρεύονται στα σταφύλια από το στάδιο του περκασµού (αλλαγή του χρώµατος του φλοιού της ράγας) και συνεχίζουν κατά την ωρίµανση (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Ορισµένοι ερευνητές αναφέρουν µια διαρκή συσσώρευση των µονοτερπενίων ακόµη και σε υπερώριµα σταφύλια (Wilson et al., 1984; Park et al., 1991) ενώ άλλοι υποστηρίζουν την πιο 16

18 διαδεδοµένη άποψη ότι τα ελεύθερα µονοτερπένια αρχίζουν να µειώνονται πριν από την πλήρη ωρίµανση των ραγών. Ανάλογη θεωρείται και η πορεία των νορισοπρενοειδών µε 13 άτοµα άνθρακα. Καθώς µειώνεται η συγκέντρωση των καροτενοειδών κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης παρατηρείται µια αύξηση της συγκέντρωσης των παραγώγων των C 13 -νορισοπρενοειδών (TDN, βιτισπιράνιο), κυρίως µε τη µορφή γλυκοζιτών (Baumes et al., 2002). Οι κλιµατολογικές συνθήκες και διάφορες αµπελοκοµικές πρακτικές έχουν µεγαλύτερη επίδραση στη συγκέντρωση παρά στον τύπο των οσµηρών πτητικών ενώσεων που υπάρχουν σε µια ποικιλία σταφυλιού (Cabrita et al., 2006). Η έκθεση των σταφυλιών στον ήλιο κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης επιταχύνει την αποικοδόµηση των καροτενοειδών και συνοδεύεται από αύξηση στο περιεχόµενο των γλυκοζιλιωµένων παραγώγων των C 13 - νορισοπρενοειδών (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι, αν και τα ζεστά κλίµατα είναι ευνοϊκά για την συσσώρευση των σακχάρων, δεν αποτελούν απαραίτητα τις καλύτερες προϋποθέσεις για την παραγωγή οίνων ποιότητας (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Επιζήµια, για την ποιότητα των σταφυλιών θεωρείται και η υψηλή εδαφική ή ατµοσφαιρική υγρασία κατά την περίοδο της ωρίµανσης (Σουφλερός, 1997). Η άµπελος (Vitis vinifera L.) είναι παραδοσιακά µια ανθεκτική στην ξηρασία µη αρδευόµενη καλλιέργεια, η οποία καταλαµβάνει µια εκτενή γεωργική περιοχή στα ξηρά εδάφη και τις ηµιάγονες περιοχές (Cifre et al., 2005). Κάτω από τις συνθήκες του µεσογειακού κλίµατος ωστόσο, η διαχείριση του νερού στον αµπελώνα είναι µεγάλης σπουδαιότητας για τον έλεγχο των επιπτώσεων της ξηρασίας στην ποιότητα σταφυλιών και οίνου. Η αναπλήρωση π.χ. µέσω της άρδευσης, του νερού που χρειάζεται το αµπέλι για την οµαλή ανάπτυξη του και µέρος του οποίου χάνεται λόγω εξάτµισης και διαπνοής, αποτελεί µια πρακτική η οποία µπορεί να επηρεάσει το µεταβολισµό της αµπέλου επηρεάζοντας και τον οίνο που τελικά παράγεται (Esteban et al., 1999). Η άρδευση αυξάνει αισθητά τη φωτοσύνθεση, και η παραγωγή του φυτού αυξάνεται κατά 1,5-4 φορές, ανάλογα µε τη χρονική στιγµή εφαρµογής, την ποσότητα νερού, την ποικιλία, τις περιβαλλοντικές συνθήκες καθώς και 17

19 άλλες καλλιεργητικές πρακτικές (Bravdo et al., 1985; Hepner et al., 1985; Matthews et al., 1987; Schultz, 1996; Williams, 1996; Escalona et al., 2003, Cifre et al., 2005). Έχει παρατηρηθεί ότι, µέχρι µια ορισµένη ποσότητα προστιθέµενου νερού, δεν υπάρχει αρνητική επίδραση στην ποιότητα των σταφυλιών και του οίνου, ακόµα και όταν αυξάνεται η παραγωγή του φυτού (Bravdo et al., 1985; Hepner et al., 1985). Εντούτοις, περαιτέρω παροχή νερού έχει αρνητική επίπτωση στην ποιότητά τους. Οι ερευνητές αναφέρουν κυρίως απώλεια χρώµατος, χαµηλές περιεκτικότητες σε σάκχαρα και ανισορροπία οξέωνσακχάρων (Bravdo et al., 1985; Hepner et al., 1985; Matthews et al., 1988; Matthews et al., 1990; Cacho et al., 1992; Sipiora et al., 1998; Esteban et al., 1999, 2001; Kennedy et al., 2000; Cifre et al., 2005). Η έλλειψη νερού µπορεί να επηρεάσει τη σύσταση των σταφυλιών και τα χαρακτηριστικά του οίνου µε περισσότερους από έναν τρόπους. Τα σταφύλια που εκτίθενται σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης έχει παρατηρηθεί ότι παρουσιάζουν υψηλότερη περιεκτικότητα σε ολικές φαινόλες και ανθοκυάνες (Matthews et al., 1988; Sipiora et al., 1998; Esteban et al., 2001). Η υδατική καταπόνηση ως αποτέλεσµα της µειωµένης παροχής νερού, επιδρά στη φυσιολογία της αµπέλου (π.χ. κλείσιµο των στοµατίων των φύλλων, µειωµένη φωτοσύνθεση (Goodwin, 2002)). Επίσης, µπορεί να έχει άµεσα και έµµεσα αποτελέσµατα στο άρωµα του οίνου (Bruwer et al., 2004). Ως άµεσα αποτελέσµατα αναφέρονται: 1) η µείωση της ανάπτυξης, η οποία συνεπάγεται την αύξηση της έκθεσης των σταφυλιών στο φως και οδηγεί σε µια µεταβολή στην αρωµατική ισορροπία αρωµάτων φρούτων / φυτικών αρωµάτων και 2) η περιορισµένη παραγωγή και µεταφορά σακχάρων στα σταφύλια, γεγονός που µειώνει τη διαθεσιµότητα των µεταβολιτών και µπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή οίνων και γλευκών µε υψηλότερο ph (Goodwin, 2002). Τα έµµεσα αποτελέσµατα αποδίδονται στις αλλαγές στην ισορροπία µεταξύ της βλαστικής και αναπαραγωγικής ανάπτυξης: εάν το νερό είναι περιορισµένο, πρέπει να εφαρµοστεί άρδευση ώστε να αποφευχθεί η υδατική καταπόνηση κατά τη διάρκεια της άνθησης και της καρπόδεσης. Η υδατική καταπόνηση πρέπει να αποφευχθεί επίσης κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης της ράγας (Goodwin, 2002). 18

20 Τα ήπια ελλείµµατα ύδατος έχουν θετικά αποτελέσµατα στη µείωση του µεγέθους της ράγας εάν εφαρµόζονται κατά τη διάρκεια της φάσης Ι της ανάπτυξης των ραγών (Smart, 1974), και µπορούν έτσι να ενισχύσουν τη συγκέντρωση των πτητικών συστατικών που απαντούν στη ράγα εφ' όσον δεν υπάρχουν δυσµενείς επιπτώσεις σε άλλες µεταβολικές διαδικασίες (Bruwer, 2004). Εάν το νερό είναι απεριόριστο, τότε η ελεγχόµενη υδατική καταπόνηση (η παροχή δηλαδή λιγότερου νερού από το απαιτούµενο για τη βέλτιστη αύξηση και ανάπτυξη του φυτού) µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη βελτίωση της ποιότητας των σταφυλιών. Αυτή η τεχνική είναι γνωστή ως Regulated Deficit Irrigation, RDI (Goodwin, 2002), και έχει ως στόχο να κρατήσει το φυτό υπό ελεγχόµενες συνθήκες υδατικής καταπόνησης. Η RDI αποτελεί για τους αµπελουργούς ένα εργαλείο για τον καλύτερο έλεγχο του µέγεθους των ραγών, της βλαστικής αύξησης και της φωτοσύνθεσης (Goodwin, 2002) Παροχή νερού µε το σύστηµα στάγδην άρδευσης Αντίθετα µε τις συµβατικές µεθόδους άρδευσης, τα συστήµατα στάγδην άρδευσης δεν εξαρτώνται από τη χρησιµοποίηση του χώµατος ως δεξαµενή ύδατος. Η τεχνική απαιτεί τη συχνή παροχή νερού προκειµένου να περιοριστεί η διήθηση στα εδαφολογικά στρώµατα που βρίσκονται κάτω από την ζώνη του κύριου ριζικού συστήµατος. Η συχνότητα καθορίζεται από τρεις σηµαντικούς παράγοντες: τις ιδιότητες του εδάφους, το ρυθµό απώλειας λόγω εξάτµισης και διαπνοής και το ρυθµό παροχής νερού του συστήµατος άρδευσης. Τα συστήµατα στάγδην άρδευσης σχεδιάζονται κανονικά για να παρέχουν την απαίτηση ύδατος µιας ηµέρας τουλάχιστον, στην εποχή που τα φυτά έχουν την µεγαλύτερη ανάγκη για νερό. ( ) 19

21 1.3. Η ποικιλία Cabernet-Sauvignon Η διεθνής ποικιλία Cabernet-Sauvignon, καταγόµενη από το Bordeaux της Γαλλίας, είναι η πιο ονοµαστή ερυθρή ποικιλία για την παραγωγή ερυθρών οίνων που προορίζονται για µακρόχρονη παλαίωση. Στην Ελλάδα πρωτοκαλλιεργήθηκε στο Μέτσοβο αλλά γρήγορα η καλλιέργειά της επεκτάθηκε σε αρκετές περιοχές σε ολόκληρο τον ελλαδικό χώρο (από την Κρήτη µέχρι τη Θράκη, είναι επιτρεπόµενη ή συνιστώµενη σε 23 νοµούς) (Σπινθηροπούλου, 2000). Στα κατάλληλα εδάφη, και σε σχέση πάντα µε το επίπεδο της παραγωγής, η ποικιλία αυτή δίνει οίνους που χαρακτηρίζονται από βαθύ µαυροπόρφυρο χρώµα, αρωµατική πολυπλοκότητα, σώµα και υψηλή περιεκτικότητα σε ταννίνες. Στην νεότητά τους θυµίζουν πράσινη πιπεριά, φραγκοστάφυλα, αγριοκέρασα ενώ µετά από µακρόχρονη παλαίωση, αναδύουν φινετσάτο µπουκέτο. Οι οίνοι από Cabernet-Sauvignon χρησιµοποιούνται πολύ συχνά σε αναµείξεις µε οίνους άλλων ποικιλιών, καθώς η παρουσία τους ακόµα και σε µικρό ποσοστό, συνήθως 5-20%, ενισχύει και στηρίζει το χρώµα, το άρωµα, το σώµα, τη γευστική ισορροπία και πληρότητα, δίνοντας χαρακτήρα στο τελικό προϊόν (Σπινθηροπούλου, 2000). Οι οίνοι που παράγονται από την ποικιλία Cabernet-Sauvignon χαρακτηρίζονται από µια πολυπλοκότητα και ένταση γεύσης που καθιστά τη µελέτη µιας τέτοιας ποικιλίας ιδιαίτερα ελκυστική ως πηγή πρόδροµων ευχυµικών ενώσεων. Ωστόσο, η συγκέντρωση αυτών των ενώσεων συνήθως είναι πολύ χαµηλή: µερικά µg/kg ή ακόµη και ng/kg, γεγονός που δυσχεραίνει τον προσδιορισµό τους. Επιπλέον, η εκχύλιση τους, ιδιαίτερα κάτω από συνθήκες συγκρίσιµες µε αυτές που επικρατούν κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, συνοδεύεται από µια αφθονία φαινολικών συστατικών ιδιαίτερης πολυπλοκότητας. Παράλληλα, πολλές φαινολικές ενώσεις σταφυλιών απαντούν µε τη µορφή γλυκοζιτών, οι οποίοι πρέπει να αποµακρυνθούν, κάτι που αυξάνει τις δυσκολίες διαχωρισµού, ενώ µερικά φαινολικά συστατικά οξειδώνονται εύκολα ή πολυµερίζονται, συµβάλλοντας στην αυξανόµενη πολυπλοκότητα του υποστρώµατος του δείγµατος προς ανάλυση (Naiker, 2001). 20

22 1.4. Προσδιορισµός των γλυκοζιτών σε γλεύκη και οίνους Οι δευτερογενείς γλυκοζυλιωµένοι µεταβολίτες του σταφυλιού (γλυκοζίτες πτητικών οσµηρών ενώσεων, ανθοκυάνες, παράγωγα του σικιµικού οξέος) χρησιµοποιήθηκαν και χρησιµοποιούνται από τους ερευνητές ως δείκτες προκειµένου να µελετηθεί το οινολογικό δυναµικό των διαφόρων ποικιλιών αλλά και η επίδραση παραγόντων όπως το έδαφος, το κλίµα, οι καλλιεργητικές και οινολογικές πρακτικές στη σύσταση και την ποιότητα του σταφυλιού και του οίνου που προκύπτει (Arevalo Villena et al., 2006). Για το λόγο αυτό η έρευνα στράφηκε από πολύ νωρίς στην εύρεση και ανάπτυξη µεθόδων ανάλυσης και ποσοτικού προσδιορισµού τους (Williams et al., 1982; Günata et al., 1985; Voirin et al., 1992a, b). Στην παρούσα εργασία θα µας απασχολήσουν οι µέθοδοι προσδιορισµού των γλυκοζιτών που αποτελούν πρόδροµες µορφές οσµηρών πτητικών ενώσεων. Οι µέθοδοι που χρησιµοποιούνται για την ανάλυση της συγκεκριµένης κατηγορίας γλυκοζιτών εµπλέκουν γενικά σύνθετες διαδικασίες συνδυασµένης εκχύλισης, αποµόνωσης και ανίχνευσης µε αέρια χρωµατογραφία (Voirin et al., 1992a, b; Arevalo Villena et al., 2006). Επιπλέον, τόσο το γλεύκος όσο και ο οίνος αποτελούν δύο δύσκολα υποστρώµατα. Στο γλεύκος, η παρουσία γλυκόζης και φρουκτόζης καθώς και άλλων σακχάρων σε ελεύθερη µορφή και υψηλή συγκέντρωση, καθιστά τον προσδιορισµό των µικρών ποσοτήτων των γλυκοζιτών εξαιρετικά δύσκολη. Στον οίνο, η παρουσία µετά την αλκοολική ζύµωση, γλυκερόλης και των 2,3-βουτανοδιολών, εξίσου περιπλέκει τα πράγµατα (Mateo & Jiménez, 2000). Στη βιβλιογραφία αναφέρονται δοκιµές διαφόρων τεχνικών απευθείας προσδιορισµού των γλυκοζιτών: εκχύλιση υγρού και TLC, διήθηση gel filtration, χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (Larson et al., 1965; Lindberg & Slessor, 1967; Angyal et al., 1979). Καθώς στην πλειονότητά τους υπήρξαν ανεπιτυχείς, η έρευνα επικεντρώθηκε στη συνέχεια στην διερεύνηση µεθόδων αποµόνωσης καταρχήν και προσδιορισµού των γλυκοζιτών στη συνέχεια Αποµόνωση των γλυκοζιτών Η αποµόνωση των γλυκοζιτών από γλεύκη και οίνους µέσω της εκλεκτικής συγκράτησής τους σε µικροστήλες εκχύλισης στερεής φάσης (SPE) 21

23 είναι µια ευρέως χρησιµοποιούµενη τεχνική. Ακολουθεί η έκπλυση της στατικής φάσης µε νερό για την αποµάκρυνση των ελεύθερων σακχάρων και άλλων πολικών συστατικών. Τέλος, εκλούονται οι λιγότερο πολικοί γλυκοζίτες µε τη βοήθεια οργανικού διαλύτη. Ο Williams et al. (1982) χρησιµοποίησαν χρωµατογραφία στήλης µε C 18 ως υλικό πλήρωσης, για την εκχύλιση γλυκοζιτών από γλεύκος ή οίνο. Ο Günata et al. (1985) πρότειναν τη χρησιµοποίηση της ρητίνης Amberlite XAD- 2, καθώς κατέχει µια άριστη ικανότητα συγκράτησης των ελεύθερων τερπενολών από το γλεύκος, παρόµοια εκείνης του C 18. Εντούτοις, ακόµη και µετά από εκτενή έκπλυση, τόσο η Amberlite XAD-2 όσο και η Amberlite XAD- 16, µε µεγαλύτερη επιφάνεια και ικανότητα συγκράτησης σε σχέση µε την Amberlite XAD-2, παρουσίαζαν το µειονέκτηµα της συγκράτησης ελεύθερης γλυκόζης επιπλέον των επιθυµητών γλυκοζιτών (Williams et al., 1995). Σύµφωνα µε τους ίδιους ερευνητές, το διοξείδιο του πυριτίου (silica gel), αποτελεί ένα ιδιαίτερα κατάλληλο υλικό για την αποµόνωση των τερπενίων τα οποία βρίσκονται µε τη µορφή γλυκοζιτών (Williams et al., 1995). Η εµπορική διαθεσιµότητα του σε οµοιόµορφες, προσυσκευασµένες µικροστήλες είναι ένα πρόσθετο πλεονέκτηµα στην χρήση του (Maicas & Mateo, 2005). Στη βιβλιογραφία αναφέρεται επίσης η εκχύλιση γλυκοζιτών από γλεύκος µε τη βοήθεια µικροκυµάτων (Bureau et al., 1996). Αν και απαιτείται περαιτέρω καθαρισµός των εκχυλισµάτων, η µέθοδος παρέχει τα πλεονεκτήµατα της ταχύτητας, της ευκολίας εκχύλισης και της δυνατότητας να εκχυλιστούν οι ράγες χωρίς να απαιτείται αποµάκρυνση των γιγάρτων ή οµογενοποίηση (Maicas & Mateo, 2005) Υδρόλυση των γλυκοζιτών και προσδιορισµός των ελεύθερων οσµηρών πτητικών ενώσεων Την αποµόνωση των γλυκοζιτών από το γλεύκος ή τον οίνο, ακολουθεί η υδρόλυση τους και ο προσδιορισµός των ελεύθερων πτητικών οσµηρών ενώσεων που απελευθερώνονται. Η υδρόλυση µπορεί να είναι όξινη ή ενζυµική ενώ για τον προσδιορισµό αναφέρεται στη βιβλιογραφία η χρησιµοποίηση αέριας χρωµατογραφίας (Günata et al., 1985, Voirin et al., 1992a,b) ή αέριας χρωµατογραφίας/φασµατοσκοπίας µαζών (GC/MS) 22

24 (Williams et al., 1982a, b). Μεµονωµένοι γλυκοζίτες έχουν επίσης αποµονωθεί µε χρωµατογραφία κατά αντιρροή και προσδιοριστεί µε GC/MS (Winterhalter et al., 1990) ή πυρηνικό µαγνητικό συντονισµό (NMR) και MS, ή υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και FAB-MS (Marinos et al., 1994) Προσδιορισµός της δεσµευµένης µέσω γλυκοζιτικών δεσµών γλυκόζης (Glycosyl Glucose, G-G) και της δεσµευµένης µέσω γλυκοζιτικών δεσµών µε ενώσεις µη φαινολικού τύπου γλυκόζης (phenol-free glycosyl glucose, PFGG) Οι υπάρχουσες µέθοδοι ποσοτικού προσδιορισµού των γλυκοζιτών στα σταφύλια και τους οίνους είναι κοπιώδεις, χρονοβόρες και απαιτούν εξεζητηµένη οργανολογία. Την απαίτηση για µια απλή και γρήγορη αναλυτική µέθοδο, απαραίτητη στην αµπελουργική και οινολογική έρευνα, κάλυψαν οι Abbott et al. (1993), Williams et al. (1995) και Iland et al. (1996) οι οποίοι πρότειναν τη µέθοδο προσδιορισµού της G-G και προχώρησαν στη βελτιστοποίησή της, αντίστοιχα. Σύµφωνα µε τους ερευνητές, η υδρόλυση των γλυκοζυλιωµένων δευτερογενών µεταβολιτών που υπάρχουν στα σταφύλια, αποδίδει µια ισοµοριακή αναλογία αγλυκόνης και D-γλυκόζης η οποία ορίζεται ως δεσµευµένη µέσω γλυκοζιτικών δεσµών γλυκόζη. Με βάση αυτό το συλλογισµό, ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης της G-G επιτρέπει την έµµεση εκτίµηση της συνολικής συγκέντρωσης των γλυκοζυλιωµένων δευτερογενών µεταβολιτών που υπάρχουν στο σταφύλι (Williams et al., 1995). Η µέθοδος περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια: α) αποµόνωση των γλυκοζιτών µε εκλεκτική συγκράτηση σε υλικό πλήρωσης C 18 αντίστροφης φάσης, β) υδρόλυση των γλυκοζιτών για την απελευθέρωση της γλυκόζης, και γ) προσδιορισµό της συγκέντρωσης της γλυκόζης µε ενζυµική µέθοδο µέσω της εξοκινάσης / δεϋδρογονάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης (HK / G6P-DH) (Williams et al., 1995). 23

25 Αρχή µεθόδου ενζυµικού προσδιορισµού γλυκόζης (AOAC, 1995) Παρουσία 5'-τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP), το ένζυµο εξοκινάση (HK) φωσφορυλιώνει τη γλυκόζη και σχηµατίζεται 6-φωσφορική γλυκόζη (G- 6-P) και 5'-διφωσφορική αδενοσίνη (ADP) (1) HK (1) Γλυκόζη + ATP G-6-P + ADP Η 6-φωσφορική γλυκόζη οξειδώνεται από το νικοτιναµιδο-αδενινο δινουκλεοτίδιο (NADP + ) παρουσία του ενζύµου δεϋδρογονάση της 6- φωσφορικής γλυκόζης (G6P-DH) σε 6-φωσφορικό γλυκονικό οξύ µε ταυτόχρονο σχηµατισµό NADPH (2). G6P-DH (2) G-6-P + NADP + 6-φωσφορικό γλυκονικό οξύ + NADPH + H + Η ποσότητα του NADPH που σχηµατίζεται σε αυτήν την αντίδραση είναι ανάλογη µε τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο δείγµα. Η µέτρηση της αύξησης του NADPH γίνεται µε τη βοήθεια της απορρόφησης στα 334, 340 ή 365 nm. Το 2000, ο Zoecklein et al. τροποποίησε τη µέθοδο ώστε να διαχωρίσει τους φαινολικούς γλυκοζίτες από τους υπόλοιπους γλυκοζίτες και να µπορέσει να προσδιορίσει µε µεγαλύτερη ακρίβεια το κλάσµα των µη φαινολικών γλυκοζιτών (phenol-free glycosides) οι περισσότεροι από τους οποίους είναι πρόδροµοι αρώµατος και ευχυµίας, µε στόχο την εκτίµηση του αρωµατικού δυναµικού των σταφυλιών. Για το σκοπό αυτό η εκχύλιση των γλυκοζιτών γίνεται σε αλκαλική τιµή ph ώστε να διαχωριστούν εκείνοι οι γλυκοζίτες που δεν έχουν φαινολικές ή άλλες λειτουργικές οµάδες που ιονίζονται σε τιµή ph 10 (Zoecklein et al., 2000). Πραγµατοποιώντας την εκχύλιση των γλυκοζιτών σε αλκαλική τιµή ph ( 10) οι φαινολικές ενώσεις µεταξύ αυτών και οι φαινολικοί γλυκοζίτες - µετατρέπονται σε φαινολικά άλατα σύµφωνα µε την αντίδραση που ακολουθεί. Τα άλατα αυτά διίστανται και δεν συγκρατούνται από το υλικό 24

26 πλήρωσης της στήλης. Ο διαχωρισµός των φαινολικών γλυκοζιτών µπορεί να ενισχυθεί µε την αύξηση του ph του δείγµατος προς εκχύλιση σε τιµές µεγαλύτερες του 10 (οι συγγραφείς προτείνουν ph=13). OH + NaOH O - Na + + H 2 O Φαινόλη Φαινοξείδιο του νατρίου Μετά τη διέλευση του δείγµατος από τη στήλη SPE, οι φαινολικοί γλυκοζίτες αποµακρύνονται πολύ εύκολα, µαζί µε την ελεύθερη γλυκόζη, µέσω της έκπλυσης του πληρωτικού υλικού µε νερό. Οι µη φαινολικοί γλυκοζίτες εκλούονται µε τη βοήθεια οργανικού διαλύτη, ακολουθεί όξινη υδρόλυση τους και ενζυµικός προσδιορισµός της γλυκόζης η οποία ορίζεται ως «δεσµευµένη µέσω γλυκοζιτικών δεσµών µε ενώσεις µη φαινολικού τύπου γλυκόζη», και στο εξής για λόγους συντοµίας θα αναφέρεται ως PFGG. Ο προσδιορισµός της PFGG επιτρέπει την έµµεση εκτίµηση της συγκέντρωσης των γλυκοζυλιωµένων δευτερογενών µεταβολιτών που υπάρχουν στο σταφύλι και αποτελούν πρόδροµες µορφές πτητικών οσµηρών συστατικών (Zoecklein et al., 2000; Whiton & Zoecklein, 2002) Εφαρµογές της µεθόδου προσδιορισµού της PFGG Ο προσδιορισµός των πτητικών δευτερογενών µεταβολιτών των σταφυλιών αλλά και του οίνου υιοθετείται όλο και περισσότερο προκειµένου να µελετηθεί η επίδραση της ποικιλίας στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του οίνου που παράγεται (Cabrita et al., 2006). Οι γλυκοζυλιωµένοι δευτερογενείς µεταβολίτες τραβούν το ερευνητικό ενδιαφέρον καθώς µπορούν να αποτελέσουν δείκτες της ποιότητας των σταφυλιών και κατά συνέπεια των οίνων (Abbott et al., 1993; Iland et al., 1996; Zoecklein et al., 2000; Arevalo Villena et al., 2006). Η µέθοδος προσδιορισµού της PFGG αναπτύχθηκε µε στόχο να προσφέρει µια µέτρηση της σύστασης των σταφυλιών σχετική µε την ευχυµία του οίνου. Παρέχει στα οινοποιεία µια απλή, γρήγορη δοκιµή µε την οποία προσδιορίζεται το αρωµατικό δυναµικό (πρόδροµες µορφές πτητικών συστατικών) των γλευκών και των οίνων καθώς και η αποτελεσµατικότητα 25

27 των ενζυµικών επεξεργασιών που εφαρµόζονται (Arevalo Villena et al., 2006) Επίσης, χρησιµοποιείται για να αξιολογηθεί η επίδραση των αµπελουργικών πρακτικών στη σύσταση των ραγών, συγκριθεί η ανάπτυξη των γλυκοζιτών στα σταφύλια από διαφορετικούς αµπελώνες κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης παρατηρηθούν διαφορές µεταξύ των αµπελώνων κατά τη συγκοµιδή παρατηρηθούν οι διαφορές µεταξύ των σταφυλιών που συγκοµίζονται από την ίδια τοποθεσία από τη µια χρονιά στην άλλη αξιολογηθεί η επίδραση των µεθόδων οινοποίησης ελεγχθεί η σύσταση του οίνου κατά τη διάρκεια της παλαίωσης (Zoecklein et al., 2000; Whiton & Zoecklein, 2002) Εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (SPE) ως τεχνική προκατεργασίας φυτικών δειγµάτων Η εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (Solid Phase Extraction, SPE) -στο εξής θα αναφέρεται για λόγους συντοµίας ως SPE-, είναι µια τεχνική η οποία εφαρµόζεται για την εκλεκτική αποµόνωση, παραλαβή και προσυγκέντρωση των προσδιοριζόµενων συστατικών. Άρχισε να εφαρµόζεται από τη δεκαετία του 1970 ως εναλλακτική µέθοδος της εκχύλισης υγρού-υγρού, και βρίσκει πολυάριθµες εφαρµογές στη βιβλιογραφία (Παπαδογιάννης, 2004; Μπακέα, 2005). Η αρχή της SPE περιλαµβάνει κατανοµή των εκχυλιζόµενων συστατικών ανάµεσα σε δύο φάσεις: µία στερεή, τη στατική φάση, και µία υγρή, το υγρό υπόστρωµα το οποίο περιλαµβάνει και τις πιθανές παρεµποδίσεις. Πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια µικροστήλης µιας χρήσης, πληρωµένης µε κατάλληλο χρωµατογραφικό υλικό. Τα προσδιοριζόµενα συστατικά πρέπει να έχουν µεγαλύτερη συγγένεια προς τη στερεή φάση, απ ότι προς το υπόστρωµα του δείγµατος, ώστε να λάβει χώρα συγκράτηση. Τα συστατικά αυτά στη συνέχεια αποµακρύνονται µε έκλουση µε τη βοήθεια διαλύτη, ο οποίος έχει µεγαλύτερη συγγένεια προς τα συστατικά (Παπαδογιάννης, 2004). 26

28 Οι εφαρµογές της SPE σε τρόφιµα και ποτά συνήθως αναπτύσσονται είτε στα πλαίσια ποιοτικού ελέγχου (για παράδειγµα, ανίχνευση χρωστικών, σακχάρων και οξέων στο κρασί, ιχνοστοιχείων σε βρεφικές τροφές) είτε ανίχνευσης - ταυτοποίησης φάρµακων, φυτοπροστατευτικών ενώσεων ή µικροβιολογικών τοξινών. Ο σκοπός είναι η εξασφάλιση της ασφάλειας του καταναλωτή (Simpson, 2002; Oasis Applications Notebook, 2003) Στάδια της εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού Η διαδικασία της εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού περιλαµβάνει τα εξής στάδια (Σχήµα 7): 1. Εξισορρόπηση (conditioning) της στατικής φάσης µε έναν ή περισσότερους διαλύτες. Είναι απαραίτητη, προκειµένου να ενεργοποιηθούν οι λειτουργικές οµάδες του υλικού πλήρωσης της στήλης. 2. Προσθήκη του δείγµατος. Την ενεργοποίηση της στατικής φάσης ακολουθεί η µεταφορά του δείγµατος, διαλυµένου σε κατάλληλο διαλύτη, στη στήλη, και η διέλευσή του µέσω του πληρωτικού υλικού. Στο στάδιο αυτό οι προσδιοριζόµενες ενώσεις του δείγµατος και µερικά ανεπιθύµητα συστατικά αλληλεπιδρούν και δεσµεύονται από τη στατική φάση ενώ ο διαλύτης και οι παρεµποδίσεις περνούν µέσω της στήλης και αποµακρύνονται (Van Horne, 1985; Christie, 2002; Simpson, 2002; Παπαδογιάννης, 2004). 3. Έκπλυση της στατικής φάσης µε τους ανάλογους διαλύτες. Αποσκοπεί στην αποµάκρυνση των ανεπιθύµητων πολικών συστατικών του υποστρώµατος. Ο διαλύτης που επιλέγεται πρέπει να είναι ασθενής (νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα) ώστε τα συστατικά που µας ενδιαφέρουν να µην αποµακρυνθούν από τη στατική φάση (Simpson, 2002; Παπαδογιάννης, 2004). 4. Έκλουση (elution) των προσδιοριζόµενων συστατικών από τη στατική φάση. Η έκλουση επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια ενός διαλύτη, µε τον οποίο τα συστατικά έχουν µεγαλύτερη χηµική συγγένεια από ότι έχουν µε τη στατική φάση. Aντικειµενικός σκοπός της έκλουσης είναι η ποσοτική παραλαβή των συστατικών που ενδιαφέρουν τον αναλυτή σε µια συµπυκνωµένη µορφή κατάλληλη για ανάλυση (McDonald et al., 1995; Simpson, 2002; Παπαδογιάννης, 2004). 27

29 Σχήµα 7. Στάδια εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού Συνήθως χρησιµοποιούνται ειδικές µικροστήλες µιας χρήσης, στις οποίες το κατάλληλο πληρωτικό υλικό βρίσκεται ανάµεσα σε δυο ηθµούς πολυπροπυλενίου (Guide ITS, Gilson Guide, 2005). Tο κόστος των µικροστηλών ωστόσο, δεδοµένου ότι είναι µιας χρήσης, αποτελεί σηµαντικό µειονέκτηµα της τεχνικής Υλικά πλήρωσης στην εκχύλιση στερεάς φάσης Τα τελευταία χρόνια, µια ποικιλία από υλικά πλήρωσης σχεδιασµένα για την προκατεργασία του δείγµατος, προσφέρονται στο εµπόριο. Τα υλικά αυτά περιλαµβάνουν κυρίως ιοντοανταλλακτικές ρητίνες και δεσµευµένο διοξείδιο του πυριτίου (bonded silica gel), ενώ σπανιότερα χρησιµοποιούνται η αλουµίνα, ο ενεργός άνθρακας, το πυριτικό µαγνήσιο και το µη δεσµευµένο διοξείδιο του πυριτίου (Παπαδογιάννης, 2004). Το διοξείδιο του πυριτίου είναι το υλικό που χρησιµοποιείται κυρίως για την παραγωγή υλικών δεσµευµένης φάσης. Με τον τρόπο αυτό δίνεται η δυνατότητα να δηµιουργήσουµε υδρόφοβα παράγωγα µακριάς ανθρακικής αλυσίδας (π.χ. µέχρι 18 άτοµα άνθρακα) (Παπαδογιάννης, 2004; Μπακέα, 2005). Τα πυριτικά υλικά που χρησιµοποιούνται στην SPE αντίστροφης φάσης περιλαµβάνουν παράγωγα µε δεκαοκτυλο- (C 18 ), οκτυλο- (C 8 ), αιθυλο- (C 2 ), κυκλοεξυλο-, φαινυλο-, βουτυλο- (C 4 ) οµάδες (Datta, 2005; Παπαδογιάννης, 2004). Τα υλικά C-8 και C-18 (silica C 8 και C 18 ) είναι από τα 28

30 πλέον χρησιµοποιούµενα στην προκατεργασία των δειγµάτων (Μπακέα, 2005). Άλλα υλικά τα οποία χρησιµοποιούνται στην SPE αντίστροφης φάσης είναι διάφορα πολυµερή τα οποία συνδέονται µε το πυριτικό υπόστρωµα. Αντί πυριτίου είναι εξίσου συνηθισµένη η χρήση πολυµερών υλικών ως υποστρωµάτων στήριξης των χαρακτηριστικών οµάδων κατά την SPE αντίστροφης φάσης (Μπακέα, 2005). Τα τελευταία χρόνια έχουν κυκλοφορήσει επίσης στην αγορά νέα υδρόφιλα - υδρόφοβα πολυµερή υλικά, στα οποία µπορεί να λάβει χώρα η συγκράτηση ακόµη και αν το υλικό αφεθεί να στεγνώσει. Τέτοια υλικά είναι το συµπολυµερές Oasis της εταιρείας WATERS (Simpson, 2002; Παπαδογιάννης, 2004). Το συµπολυµερές Oasis HLB είναι ένα πολυµερικό υλικό SPE αντίστροφης φάσης το οποίο εισήγαγε στην αγορά η εταιρεία Waters το 1996 (Simpson, 2002; Oasis Applications Notebook, 2003; Bouvier et al., 2004). Πρόκειται για ένα µακροπορώδες συµπολυµερές το οποίο αποτελείται από µια ισορροπηµένη αναλογία δύο µονοµερών, του υδρόφοβου διβινυλοβενζολίου το οποίο παρέχει ιδιότητες συγκράτησης αντίστροφης φάσης και της υδρόφιλης Ν βινυλοπυρρολιδόνης (δέκτης Η, που αυξάνει την ικανότητα διαβροχής του πολυµερούς και τη συγκράτηση πολικών οργανικών ενώσεων) (Σχήµα 8) (Παπαδογιάννης, 2004). Το αποτέλεσµα είναι βελτιωµένη ικανότητα συγκράτησης λόγω σχηµατισµού ενός «polar-hook» που επιτρέπει καλύτερη συγκράτηση των πολικών ενώσεων και µια εξαιρετική ικανότητα διαβροχής από το νερό (Oasis Applications Notebook, 2003; Παπαδογιάννης, 2004; Datta, 2005). 29