ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Η ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ-β1 (TGF-β1) ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΟΜΕΝΗ ΑΠΟ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ IL-1β ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΗΣ-1 (MMP-1) ΑΠΟ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ, ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΑΓΜΑΤΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΜΕΣΩ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ Α (PKA) ΜΑΡΙΑ ΓΙΑΝΝΑΚΟΥΛΗ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2008

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. Αλετράς: Επιβλέπων Καθηγητής, Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχηµείας, Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Α. Αντωνόπουλος: Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, Καθηγητής Ρευµατολογίας, Τµήµατος Ιατρικής Πανεπιστηµίου Πατρών Ε. Γιαννοπούλου: Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φαρµακολογίας, Τµήµατος Ιατρικής Πανεπιστηµίου Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. Αλετράς: Επιβλέπων Καθηγητής, Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχηµείας, Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Α. Αντωνόπουλος: Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, Καθηγητής Ρευµατολογίας, Τµήµατος Ιατρικής Πανεπιστηµίου Πατρών Ε. Γιαννοπούλου: Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φαρµακολογίας, Τµήµατος Ιατρικής Πανεπιστηµίου Πατρών. Βύνιος: Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, Καθηγητής Βιοχηµείας. Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών. Καλπαξής: Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, Καθηγητής Βιοχηµείας. Τµήµατος Ιατρικής Πανεπιστηµίου Πατρών Ν. Καραµάνος: Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, Καθηγητής Βιοχηµείας, Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών Ν. Παπαγεωργακοπούλου: Μέλος επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βιοχηµείας, Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών

3 ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΚΑΙ ΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕ ΡΙΑ Nezi G, M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, Prothymosin A antagonizes the inhibitory effect of TGF-β1 on the IL-1βinduced production of collagonase-1 by human synovial fibroblasts XVII Πανελλήνιο Συνέδριο Ρευµατολογίας, Αθήνα 2002 Nezi G, M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, Prothymosin A antagonizes the inhibitory effect of TGF-β1 on the IL-1βinduced production of collagonase-1 by human synovial fibroblasts, Οµάδα Έρευνας Συνδετικού Ιστού, 5η Ετήσια Ηµερίδα, ΕΚΕΦΕ «ηµόκριτος», Αθήνα 2003 Nezi G, M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, Prothymosin A antagonizes the inhibitory effect of TGF-β1 on the IL-1βinduced production of collagonase-1 by human synovial fibroblasts, Annual European Congress of Rheumatology, Lisbon 2003 Nezi G, M.Giannakouli, S.Goura, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, E.Giannopoulou, A.J.Aletras, Prothymosin A suppresses the TGF-β1-enhanced production of tissue inhibitoe of metalloproteinases-1 but not of IL-6 in human synovial fibroblasts, 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Φαρµακολογίας, Θεσσαλονίκη 2004 M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, TGF-beta1 and IL-13 inhibit the IL-1beta and TNF-alpha-induced production of MMP-1 by human synovial fibroblasts, Taormina-Giardini Naxos, Italy M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, TGF-beta1 inhibits the IL-1beta -induced production of MMP-1 by human synovial fibroblasts via protein kinase A (PKA), Πανελλήνιο Συνέδριο Ρευµατολογίας, Αθήνα 2004 M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, TGF-beta1 supresses the IL-1beta-induced production of MMP-1 by human synovial fibroblasts via protein kinase A (PKA), 7 th Annual Meeting of the Hellenic Research Club for Connective Tissue & Matrix Biology, Patras 2005 M.Giannakouli, E.Giannopoulou, E.Panagiotopoulos, A.P. Andonopoulos, A.J.Aletras, TGF-beta1 supresses the IL-1beta-induced production of MMP-1 by

4 human synovial fibroblasts via protein kinase A (PKA),1 st Patras, Greece, 2005 Biosciences Meeting, M.Giannakouli, E.Giannopoulou, A.J.Aletras, Transmodulation of epidermal growth factor receptor mediates IL-1β-induced MMP-1, MMP-3 and TIMP-1 expression in human lung and nasal polyp fibroblasts, 58 th Meeting of the Hellenic society of Biochemistry and Molecular Biology, Patras 2006 I. Mantzourani, M. Giannakouli, E. Giannopoulou and A. J. Aletras. A simple and easy ELISA for the determination of extracellular matrix metalloproteinases MMP-1 and MMP-3 and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in cell cultures conditioned media. 59 th Meeting of the Hellenic society of Biochemistry and Molecular Biology, Athens 2007

5 αντί προλόγου κατά τη διάρκεια των περίπου πέντε χρόνων αυτής της διατριβής πολλοί άνθρωποι στάθηκαν δίπλα µου και µε βοήθησαν σηµαντικά, ο καθένας µε το δικό του µοναδικό τρόπο. Στις λίγες γραµµές που ακολουθούν θα ήθελα να αναφερθώ σε αυτούς και να τους ευχαριστήσω ειλικρινά. Πρώτα από όλους τον καθηγητή µου κ.αλέξη Αλετρά, ο οποίος είχε την επίβλεψη της παρούσας διατριβής. Όλο αυτό το διάστηµα ήταν πάντα δίπλα µου αφιερώνοντάς µου το χρόνο του και προσφέροντάς µου απλόχερα την πολύτιµη καθοδήγησή του µέσα από τις γνώσεις και εµπειρίες του. Ήταν πραγµατικά τιµή µου που συνεργάστηκα µαζί του. Τον καθηγητή Ρευµατολογίας κ.ανδρέα Αντωνόπουλο για τις πολύτιµες συµβουλές και παρατηρήσεις, όσον αφορούσε στην ερευνητική αυτή εργασία. Την καθηγήτρια Φαρµακολογίας κ. Ελευθερία Γαννοπούλου για τις εύστοχες παρατηρήσεις της καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής αλλά και για την καθοριστική συµβολή της στην πραγµατοποίηση των απαιτούµενων καλλιεργειών. Τους καθηγητές του Τµήµατος Χηµείας κ. Ν.Καραµάνο, κ.. Βύνιο και κ. Ν. Παπαγεωργακοπούλου που ήταν πάντα πρόθυµοι να µου προσφέρουν τη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια της εξαετούς παρουσίας µου στο εργαστήριο Βιοχηµείας, Τους µεταπτυχιακούς φοιτητές του Εργαστηρίου Βιοχηµείας, αφού ο καθένας µε το δικό του ξεχωριστό τρόπο συνέβαλε στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής. Τελευταίους άφησα τους γονείς µου, οι οποίοι ήταν πραγµατικά οι απόλυτοι συµπαραστάτες µου, σε αυτό το δύσκολο για µένα εγχείρηµα, αλλά και τους αληθινούς φίλους µου που µε κατανόηση και υποµονή στάθηκαν στο πλευρό µου. Μαρία Γιαννακούλη

6 στους γονείς µου

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ...1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Μεταγωγή σήµατος Εισαγωγικά Υποδοχείς µε επτά διαµεµβρανικές έλικες (7ΤΜ) Υποδοχείς που υφίσταται διµερισµό Υποδοχείς µε δράση κινάσης τυροσίνης Πρωτεΐνες Ras Καταρράκτης της κυκλικής AMP Μεταγραφικός παράγοντας CREB Καταρράκτης φωσφοϊνοσιτιδίων Πρωτεολυτικά ένζυµα του εξωκυτταρικού χώρου Μεταλλοπρωτεϊνάσες του εξωκυτταρικού χώρου (MMPs) Γενικά οµή µεταλλοπρωτεϊνασών Οµάδες των ΜΜΡs Βασικά χαρακτηριστικά και δράσεις Ρύθµιση των MMPs Κολλαγονάση-1 (MMP-1) Μεταγραφική ρύθµιση της MMP Ενεργοποιούσα πρωτεΐνη -1 (AP-1) Μεταγραφικοί παράγοντες Ets Μεταγραφικοί παράγοντες STAT Πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούµενες από µιτογόνα (MAPK) Γενικά Ρόλος των MAPK κινασών στην έκφραση της MMP Ρύθµιση των µεταγραφικών παραγόντων AP-1 και Ets...26

8 5. Κυτταροκίνες Γενικά Υποδοχείς κυτταροκινών Ιντερλευκίνη 1 (IL-1) Γενικά Υποδοχείς της IL Μονοπάτια µεταγωγής σήµατος Παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) Γενικά Υποδοχείς Μονοπάτια µεταγωγής σήµατος Πυρηνικός παράγοντας kb (NF-kB) Ρυθµιστικά µονοπάτια Ιντερλευκίνη 6 (IL-6) Υποδοχέας Σηµατοδοτικά µονοπάτια Αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού β (TGF-β) Γενικά Υποδοχείς Βασικό µονοπάτι µετάδοσης σήµατος SMADs Βιολογικές δράσεις του TGF-β Επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (EGF) Προσταγλανδίνη Ε 2 (PGE 2 ) Αρθρώσεις Αρθροπάθειες Ρευµατοειδής αρθρίτιδα...52

9 Παθογένεια RA Οστεοαρθρίτιδα Παθογένεια ΟΑ Ρινικό Σύστηµα Ανατοµία ρινικού συστήµατος Ρινικός Πολύποδας Παθογένεια Ρινικού Πολύποδα Νόσοι του αναπνευστικού...62 ΣΚΟΠΟΣ...65 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 1. Υλικά Βιολογικά δείγµατα Συλλογή δειγµάτων Επεξεργασία δειγµάτων Αποµόνωση κυττάρων τύπου ινοβλάστης και καλλιέργεια αυτών Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ELISA τύπου sandwich ELISA για προσδιορισµό IL ELISA συναγωνιστικού τύπου ELISA για προσδιορισµό της camp ELISA για προσδιορισµό της PGE ELISA έµµεσου τύπου ELISA για προσδιορισµό ΜMP-1, MMP-3 και TIMP Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών κατά Western (Western Blotting) Ηλεκτροφορητικές µέθοδοι Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήγµατα πολυακρυλαµιδίου

10 παρουσία SDS (SDS-PAGE) Αποµόνωση ολικού RNA από καλλιέργειες κυττάρων Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) RT-PCR ανάλυση Προσδιορισµός δραστικότητας της PKA Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων...86 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των κυτταροκινών IL-1β και TNF-α για την παραγωγή MMP-1 από ινοβλάστες και η επίδραση των µονοπατιών της camp/pka και του TGF-β1 σε αυτό Μηχανισµός της επαγωγικής δράσης της IL-1β στην παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες ιερεύνηση της υπόθεσης καταστολής της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες από το µονοπάτι camp/pka Επίδραση του TGFβ1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες Μηχανισµός της επαγωγικής δράσης του TNF-α στην παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες ιερεύνηση της υπόθεσης καταστολής της επαγόµενης από TNF-α έκφρασης της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες από το µονοπάτι camp/pka Επίδραση του TGFβ1 στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες ιερεύνηση του µηχανισµού της ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β και TNF-α έκφραση της ΜΜΡ Ρόλος των PGE 2, IL-6 και IL-1Rα Εµπλοκή του µονοπατιού camp/pka Το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος της IL-1β για την παραγωγή MMP-3 από ινοβλάστες και η επίδραση των µονοπατιών της camp/pka

11 και του TGF-β1 σε αυτό Μηχανισµός της επαγωγικής δράσης της IL-1β στην παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες ιερεύνηση της υπόθεσης καταστολής της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-3 σε ινοβλάστες από το µονοπάτι camp/pka Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες ιερεύνηση ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή TIMP-1, IL-6 και PGE 2 από ινοβλάστες ιερεύνηση ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στη διεγερθείσα από IL-1β παραγωγή TIMP-1 από ινοβλάστες ιερεύνηση ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στη διεγερθείσα από IL-1β παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες Επίδραση των κινασών τυροσίνης στην επαγόµενη από IL-1β και TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...168

12 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ

13 Συντµήσεις 1 AC Αδενυλική κυκλάση AP-1 Πρωτεΐνη ενεργοποίησης-1 APP Πρωτεΐνες οξείας φάσης APS Υπερθειϊκό αµµώνιο BSA Βόεια αλβουµίνη ορού camp Κυκλική ΑMP CBP Πρωτεΐνη που δεσµεύεται σε CREB cdna Συµπληρωµατικό δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ COX Κυκλοοξυγονάση CRE Στοιχείο απόκρισης στην κυκλική ΑMP Πρωτεΐνη δέσµευσης στο στοιχείο απόκρισης στην CREB κυκλική ΑMP DAG ιακυλογλυκερόλη DMEM Dulbecco s modified Eagle s medium DMSO ιµεθυλοσουλφοξίδιο DOC εοξυχολικό νάτριο DTT ιθειοθρεϊτόλη ECL Ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια EDTA Αιθυλενο-διαµινο-τετραοξικό οξύ EGF Επιδερµικός αυξητικός παράγοντας EGFR Υποδοχέας του EGF EP Υποδοχέας της PGE 2 Κινάσες που ρυθµίζονται από εξωκυτταρικά ERK σήµατα FCS Ορός εµβρύου µόσχου HAT Ακετυλοµεταφοράση ιστονών IL Ιντερλευκίνη IL-1R Υποδοχέας της ιντερλευκίνης 1 inos Επαγόµενη συνθάση του µονοξειδίου του N IRAK Κινάση σχετιζοµενη µε τον υποδοχέα της IL-1 IκΒ Αναστολέας του NF-κΒ εσµευόµενη πρωτεΐνη 1 στην περιοχή JAB1 ενεργοποίησης της c-jun JAK2 Κινάση 2 Ιανός JNK Κινάση Ν-τελικού άκρου της πρωτεΐνης c-jun Πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούµενες από MAPK µιτογόνα Παράγοντας διέγερσης σχηµατισµού αποικιών M-CSF µακροφάγων MMP Μεταλλοπρωτεϊνάση εξωκυτταρικού χώρου mrna Αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊκό οξύ NF-κΒ Πυρηνικός παράγοντας κβ NIK Επαγόµενη από NF kb κινάση OA Οστεοαρθρίτιδα OPD ο-φαινυλενοδιαµίνη PAI-1 Ενεργοποιητής του πλασµινογόνου-1 PBS Ρυθµιστικό 10mM φωσφορικών ph 7,2-7,4/0,14M

14 Συντµήσεις 2 NaCl PDE Φωσφοδιεστεράση Αυξητικός παράγοντας παραγόµενος από PDGF αιµοπετάλια PGE 2 Προσταγλανδίνη E 2 PIP 2 4,5-διφωσφορική ινοσιτόλη PIP 3 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη PKA Πρωτεϊνική κινάση Α PKC Πρωτεϊνική κινάση C PKI Αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης Α PLC Φωσφολιπάση C PMSF Φαινυλο-µεθυλο-σουλφονυλο-φθορίδιο ProTα Προθυµοσίνη α RA Ρευµατοειδής αρθρίτιδα Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης µε RT-PCR αντίστροφη µεταγραφή SBE Στοιχείο απόκρισης στις πρωτεΐνες Smad SDS ωδεκυλικό-θειικό νάτριο Ηλεκτροφόρηση σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου µε SDS-PAGE SDS SH2 οµική περιοχή οµόλογη αυτής της Src Παράγοντας ρύθµισης ουβινιτινυλίωσης των Smurf Smad πρωτεϊνών Παράγοντας ανταλλαγής γουανυλονουκλεοτιδίων Sos Μεταγωγέας σήµατος και ενεργοποιητής της STAT µεταγραφής TAK1 Ενεργοποιούµενη από τον TGF-β κινάση 1 TBS Ρυθµιστικό διάλυµα Tris /NaCl TEMED N,N,N',N'-τριαιθυλο-µεθυλο-αιθυλενοδιαµίνη TGF-β Αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού β T H 1 Βοηθητικά Τ-λεµφοκύτταρα τάξης 1 T H 2 Βοηθητικά Τ-λεµφοκύτταρα τάξης 2 Ενδογενής ιστικός αναστολέας των TIMP µεταλλοπρωτεϊνασών TNF-R Υποδοχέας του παράγοντας νέκρωσης όγκων-α TNF-α Παράγοντας νέκρωσης όγκων-α εσµευόµενος στον υποδοχέα του TNF TRAF 6 κυτταροπλασµατικός παράγοντας 6 Tris TβR Τρις-υδροξυµεθυλ-αµινοµεθάνιο Υποδοχέας του TGF-β

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

16 Εισαγωγή 3 1. Μεταγωγή σήµατος 1.1 Εισαγωγικά Οι πορείες µεταγωγής σήµατος ακολουθούν µια ευρύτερα κοινή πορεία, που µπορεί να θεωρηθεί ως ένα µοριακό κύκλωµα (Σχ. 1). Αρχικά, µεµβρανικοί υποδοχείς µεταφέρουν πληροφορίες από το περιβάλλον στο εσωτερικό του κυττάρου. Ένας υποδοχέας είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη, που διαθέτει τόσο ενδοκυτταρικές όσο και εξωκυτταρικές δοµικές περιοχές (Σχ. 2). Οι τελευταίες, αναγνωρίζουν το σηµατοδοτικό µόριο, γνωστό σαν πρόσδεµα ή πρώτος αγγελιοφόρος. Στη συνέχεια, µόρια που καλούνται δεύτεροι αγγελιοφόροι, µεταβιβάζουν την πληροφορία από το σύµπλοκο υποδοχέα-προσδέµατος και ενισχύουν το σήµα µέσω ενεργοποίησης πρωτεϊνικών κινασών (όπως οι PKA και PKC). Ιδιαίτερα σηµαντικοί αγγελιοφόροι είναι η κυκλική AMP, το ιόν του Ca 2+, η 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη (PIP 3 ) και η διακυλογλυκερόλη (DAG). Τελικά, πρωτεϊνικές φωσφατάσες τερµατίζουν τη διεργασία σηµατοδότησης. Σχήµα 1: Αρχές µεταγωγής σήµατος (Berg et al., 2002). 1.2 Υποδοχείς µε επτά διαµεµβρανικές έλικες (7ΤΜ) Θεωρούνται µια από τις σηµαντικότερες κατηγορίες υποδοχέων και είναι υπεύθυνοι για την διαβίβαση πληροφοριών από σήµατα όπως τα φωτόνια, οι νευροδιαβιβαστές και οι ορµόνες. Είναι γνωστοί και ως τύπου «σερπαντίνας», αφού περιέχουν επτά έλικες που διαπερνούν την κυτταρική διπλοστιβάδα. Η δέσµευση ενός προσδέµατος οδηγεί σε ενεργοποίηση µιας πρωτεΐνης G.

17 Εισαγωγή 4 Σχήµα 2: Σηµατοδότηση µέσω διαφορετικών τύπων υποδοχέων (Lodish et al., 2004). Οι πρωτεΐνες G υφίσταται ως ετεροτριµερή αποτελούµενες από υποµονάδες α, β και γ και ανακυκλώνονται µεταξύ της ενεργής µορφή τους, που δεσµεύει GTP, και της απενεργοποιηµένης που δεσµεύει GDP. Το ετεροτριµερές µε την υποµονάδα α (Gα) στη GDP µορφή είναι αγκυροβοληµένο στη µεµβράνη και βρίσκεται σε αλληλεπίδραση µε την ενδοκυτταρική περιοχή του υποδοχέα. Η δέσµευση ενός προσδέµατος στον υποδοχέα διεγείρει την ανταλλαγή της GDP µε GTP, στην Gα, µε αποτέλεσµα το διαχωρισµό της υποµονάδας αυτής από το διµερές βγ (Gβγ). Ο διαχωρισµός αυτός µεταδίδει το σήµα ότι ο υποδοχέας έχει δεσµεύσει το πρόσδεµα. Για κάθε µόριο που δεµεύεται στον υποδοχέα, εκατοντάδες µόρια Gα µετατρέπονται από τη µορφή GDP στη GTP δίνοντας έτσι ενισχυµένη απόκριση. Τελικά, η λειτουργία του σήµατος διακόπτεται µέσω των υποµονάδων Gα, οι οποίες διαθέτουν ενδογενή δραστικότητα GTPάσης και υδρολύουν τη δεσµευµένη GTP προς GDP και Pi. Η GDP µορφή της Gα επανασυνδέεται µε το διµερές Gβγ για να σχηµατιστεί πάλι η ετεροτριµερής πρωτεΐνη. Όλα τα σήµατα που λειτουργούν µέσω αυτών των υποδοχέων δεν χρησιµοποιούν τις ίδιες πρωτεΐνες G. Αντίθετα, διαφορετικές πρωτεΐνες G επιδρούν σε µεταγενέστερους στόχους µέσω διαφορετικών πορειών. Για παράδειγµα, η οικογένεια Gas διεγείρει την αδενυλική κυκλάση, ενώ η Gai την αναστέλλει και ταυτόχρονα ενεργοποιεί τα µονοπάτια µέσω MAPK κινασών. Τέλος, η Gaq αυξάνει την IP 3 και το ενδοκυτταρικό ασβέστιο. Τα µονοπάτια είναι δυνατόν να αλληλεπιδρούν µεταξύ τους και να ρυθµίζουν την έκφραση γονιδίων, όπως θα αναφερθεί στη συνέχεια (Σχ. 3).

18 Εισαγωγή 5 Σχήµα 3: Σηµατοδοτικά µονοπάτια µέσω πρωτεϊνών G ( 1.3 Υποδοχείς που υφίσταται διµερισµό Σε αυτούς, η δέσµευση του προσδέµατος οδηγεί στη δηµιουργία διµερών µορφών των υποδοχέων. Τότε, ενδοκυτταρικές περιοχές µε δράση κινάσης τυροσίνης, γνωστές σαν JAK2 (κινάση 2 Ιανός), πλησιάζουν µεταξύ τους κατά τέτοιο τρόπο ώστε να φωσφορυλιώνουν η µία την άλλη. Τέτοια σταυρωτή φωσφορυλίωση προκαλεί επιπλέον σηµατοδότηση. Μια ενεργοποιηµένη JAK2 φωσφορυλιώνει δύο µόρια του µεταγραφικού παράγοντα STAT5 (µεταγωγέας σήµατος και ενεργοποιητής της µεταγραφής 5-signal transducers and activators of transcription 5), σε ένα κατάλοιπο τυροσίνης. Το διµερές των STAT που δηµιουργείται, δεσµεύεται σε θέσεις στο DNA κοντά στους υποκινητές συγκεκριµένων µορίων και ρυθµίζει τη γονιδιακή τους έκφραση Υποδοχείς µε δράση κινάσης τυροσίνης Αυξητικοί παράγοντες όπως η ινσουλίνη, ο επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (EGF) και ο αυξητικός παράγοντας προερχόµενος από αιµοπετάλια (PDGF) δεσµεύονται στις εξωκυτταρικές περιοχές διαµεµβρανικών υποδοχέων, οι οποίοι έχουν περιοχές µε δράση κινάσης τυροσίνης στις ενδοκυτταρικές περιοχές τους. Η δράση της κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα είναι ενζυµικώς ανενεργός

19 Εισαγωγή 6 απουσία του αυξητικού παράγοντα. Η δέσµευση του αυξητικού παράγοντα προκαλεί τον υποδοχέα να διµεριστεί και να υποστεί σταυρωτή φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση. Μια προσαρµοστική πρωτεΐνη, η Grb-2, δεσµεύεται στα κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης του ενεργού υποδοχέα, µέσω των περιοχών SH2 που διαθέτει, και έλκει την πρωτεΐνη Sos. Η Sos, ως παράγοντας ανταλλαγής γουανυλονουκλεοτιδίων, δεσµεύεται σε µια πρωτεΐνη Ras και την ενεργοποιεί. Η ενεργοποιηµένη Ras δεσµεύεται σε πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/θρεονίνης, όπως οι MAPK, και τις ενεργοποιεί. Εναλλακτικά, ο ενεργοποιηµένος υποδοχέας µπορεί να διεγείρει το µονοπάτι των φωσφοϊνοσιτιδίων (Σχ. 4). Σχήµα 4: Πορεία µεταγωγής σήµατος µέσω υποδοχέων µε δράση κινάσης τυροσίνης (Lodish et al., 2004). 1.4 Πρωτεΐνες Ras Μια άλλη τάξη σηµατοδοτικών πρωτεϊνών G είναι οι µικρές πρωτεΐνες G ή αλλιώς GTPάσες. Η υπεροικογένεια αυτών των πρωτεϊνών χωρίζεται σε υποοικογένειες, τις Ras, Rho, Arf, Rab και Ran. Όπως και οι συγγενικές τους ετεροτριµερείς πρωτεΐνες G, που αναφέρθηκαν παραπάνω, οι µικρές πρωτεΐνες G ανακυκλώνονται µεταξύ µιας ενεργού (GTP) και µιας ανενεργού (GDP) µορφής, ενώ διαφέρουν στο ότι έχουν µικρότερη µοριακή µάζα (20-25 kda έναντι kda των µεγάλων) και είναι µονοµερείς.

20 Εισαγωγή Καταρράκτης της κυκλικής AMP Η κυκλική AMP (camp) ήταν το πρώτο µόριο δεύτερου αγγελιοφόρου που ταυτοποιήθηκε. Είναι ένα ενδοκυτταρικό κυκλικό νουκλεοτίδιο που τα επίπεδά του ρυθµίζονται από την ισορροπία µεταξύ της δράσης δύο ενζύµων: της αδενυλικής κυκλάσης (AC), που καταλύει τη παραγωγή του από την ΑΤΡ, και µιας φωσφοδιεστεράσης (PDE), η οποία το διασπά. Εννέα διαφορετικά είδη αδενυλικής κυκλάσης απαντώνται στα θηλαστικά, η δραστικότητα των οποίων διεγείρεται ύστερα από αλληλεπίδραση µε τις πρωτεΐνες G, καθώς και δώδεκα είδη φωσφοδιεστεράσης. ATP camp + Η 2 Ο Mg2+ AC Mg2+ PDE camp + PPi AMP Κύριος στόχος της camp είναι η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA). H PKA αποτελείται από δύο είδη υποµονάδων: ρυθµιστικές (R) 49 kda, οι οποίες έχουν µεγάλη συγγένεια για την camp και καταλυτικές (C) 38 kda. Τέσσερα γονίδια κωδικοποιούν τις R υποµονάδες (RIα, RIβ RIIα και RIIβ) και τρία τις C (Cα, Cβ, Cγ). Σχήµα 5: Μονοπάτι ενεργοποίησης της PKA (

21 Εισαγωγή 8 Απουσία της camp, οι ρυθµιστικές και καταλυτικές υποµονάδες σχηµατίζουν ένα σύµπλοκο R 2 C 2, το οποίο είναι ενζυµικά ανενεργό. Η πρόσδεση τεσσάρων µορίων camp, δύο σε κάθε µια από τις ρυθµιστικές υποµονάδες, οδηγεί στην απελευθέρωση των ρυθµιστικών υποµονάδων από τις καταλυτικές, οι οποίες στην ελεύθερη κατάστασή τους είναι ενζυµικώς ενεργές. Η ενεργός πλέον PKA φωσφορυλιώνει εξειδικευµένα κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης σε µόρια στόχους, όταν αυτά περιέχονται στην αλληλουχία Arg-Arg-X-Ser (Thr)-Z, όπου Χ ένα µικρό και Ζ ένα µεγάλο υδρόφοβο κατάλοιπο, τροποποιώντας έτσι τη δραστικότητά τους (Σχ. 5). Η δραστικότητα της PKA ρυθµίζεται από αναστολείς των πρωτεϊνικών κινασών, τους PKIs (protein kinase inhibitors), και από εξειδικευµένες πρωτεΐνες αγκυροβόλησης, τις AKAPs (PKA-anchoring proteins), οι οποίες την φέρνουν κοντά στα υποστρώµατά της. Οι φωσφατάσες PP1 και PP2 αποφωσφορυλιώνουν τα υποστρώµατα της PKA και συµβάλλουν στη διατήρηση της ισορροπίας. Η PKA φαίνεται να εµπλέκεται σε διάφορα µονοπάτια (Σχ. 6). Οδηγεί σε απενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C, µείωση της δράσης των µικρών πρωτεϊνών G, Ras και Rho, και ενεργοποίηση των MAP κινασών µέσω φωσφορυλίωσης µιας φωσφατάσης τυροσίνης (PTP). Επιπλέον, ρυθµίζει αρνητικά τη δραστικότητα των πρωτεϊνών Raf και Rho και τροποποιεί τη διαπερατότητα ενός διαύλου ιόντων καλίου. Ρυθµίζει τη µεταγραφή γονιδίων ύστερα από άµεση φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων CREB, CREM και ATF1. Οι τελευταίοι, ενεργοποιούν τη µεταγραφή αλληλεπιδρώντας µε τις πρωτεΐνες-συνενεργοποιητές CBP και p300. Η φωσφορυλίωση του NF-κB από την PKA φαίνεται πως είναι απαραίτητη γι αυτή την αλληλεπίδραση. Τέλος, µπορεί να ρυθµίσει το µονοπάτι των ΜΑΡΚ µέσω δέσµευσης µια GTPάσης, που είτε ενεργοποιεί την Β-Raf είτε αναστέλλει το µονοπάτι Ras/Raf (Fimia et al., 2001) Μεταγραφικός παράγοντας CREB Η camp ενεργοποιεί την PKA, η οποία φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη δέσµευσης στο στοιχείο απόκρισης στην κυκλική AMP (cyclic AMP response element binding protein, CREB), ένα µεταγραφικό παράγοντα ο οποίος ανήκει στη οικογένεια των CREB/CREM/ATF. Ο φωσφορυλιωµένος CREB δεσµεύεται µε ένα συνενεργοποιητή του, την πρωτεΐνη CBP (CREB binding protein). Η τελευταία, αυξάνει τη µεταγραφή διευκολύνοντας τη δέσµευση άλλων µεταγραφικών

22 Εισαγωγή 9 παραγόντων και άλλων συστατικών της µεταγραφικής συσκευής (πχ. RNA πολυµεράσης ΙΙ), αφού διαθέτοντας δράση ακετυλοµεταφοράσης των ιστονών (histone acetyltransferase, HAT) συµβάλλει στη µείωση της αλληλεπίδρασης ιστονών/dna αποκαλύπτοντας έτσι τις θέσεις των υποκινητών. Το ρυθµιστικό στοιχείο, στο οποίο δεσµεύεται ο CREB ως διµερές, καλείται CRE (CREB response element) και έχει ταυτοποιηθεί στον υποκινητή πολλών, εξαρτώµενων από την camp, γονιδίων (Mayr et al., 2001). Η φωσφορυλίωση του CREB, στη Ser133, µπορεί να πραγµατοποιηθεί και από τις MAP κινάσες, κυρίως τις ERK 1/2 και p38. Σχήµα 6: Μονοπάτια που ρυθµίζονται από την PKA (Fimia et al., 2001). 1.6 Καταρράκτης φωσφοϊνοσιτιδίων Η πορεία αυτή ξεκινά µε ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C-γ (PLC-γ) από την ενεργό πρωτεΐνη G (Gaq). Το ενεργό ένζυµο διασπά την 4,5-διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (PIP 2 ), ένα φωσφολιπίδιο που βρίσκεται στις κυτταρικές µεµβράνες. Η διάσπαση της PIP 2 οδηγεί στην παραγωγή δύο αγγελιοφόρων: της 1,4,5 τριφωσφορικής ινοσιτόλης (IP 3 ) και της διακυλογλυκερόλης (DAG). Η IP 3 είναι ένα υδατοδιαλυτό µόριο που διαχέεται µέσω του κυτταροπλάσµατος στο ενδοπλασµατικό δίκτυο. Εκεί συντελεί στη διάνοιξη διαύλων ιόντων Ca 2+ και την

23 Εισαγωγή 10 απελευθέρωση αυτών στο κυτταρόπλασµα. Η DAG παραµένει στη µεµβράνη και ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC), ένα ένζυµο που φωσφορυλιώνει κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης, που περιέχονται στην αλληλουχία X-Arg-X-X- (Ser,Thr)-Hyd-Arg-X, όπου Χ οποιοδήποτε κατάλοιπο και Hyd µεγάλο υδρόφοβο κατάλοιπο, σε πολλές πρωτεΐνες-στόχους. Σχήµα 7: Μονοπάτι ενεργοποίησης της PKC (www biocarta.com) Η PKC, ανάλογα µε την PKA, περιέχει µια καταλυτική και µια ρυθµιστική περιοχή και πριν την ενεργοποίησή της βρίσκεται ελεύθερη στο κυτταροδιάλυµα. Τα αυξηµένα επίπεδα Ca 2+ διευκολύνουν την πρόσδεση της PKC στην κυτταρική µεµβράνη, όπου και πραγµατοποιείται η ενεργοποίησή της από την διακυλογλυκερόλη. Η τελευταία, επάγοντας στερεοδοµικές αλλαγές στην PKC την καθιστά ενεργή για φωσφορυλίωση υποστρωµάτων (Σχ. 7). Η PKC φαίνεται να εµπλέκεται στον πολλαπλασιασµό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση (Ohkusu et al., 1995) και την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών (Pasinelli et al., 1995). έκα ισοµορφές της PKC είναι γνωστές και κατηγοριοποιούνται ανάλογα µε τον τρόπο ενεργοποίησής τους. Οι ισοµορφές α, βι, βιι και γ ενεργοποιούνται από φωσφατιδυλοσερίνη (PS), DAG και Ca 2+. Οι δ, ε, η και θ δεν απαιτούν Ca 2+, ενώ οι ζ και λ/ι καλούνται ατυπικές και απαιτούν µόνο φωσφατιδυλοσερίνη. Εστέρες του φορβολικού οξέος, όπως ο PMA (Phorbol 12- myristate 13-acetate), ενεργοποιούν την PKC µιµούµενοι την διακυλογλυκερόλη, το

24 Εισαγωγή 11 φυσικό προσδέτη και ενεργοποιητή των PKCs. Ο PMA αποτελεί έναν εξειδικευµένο ενεργοποιητή όλων των ισοµορφών της PKC, εκτός από τις ζ και λ/ι. Εναλλακτικά, ονοµάζεται και TPA (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate). Η διακυλογλυκερόλη είναι ένα βραχύβιο µόριο και µπορεί να υδρολυθεί τάχιστα σε γλυκερόλη και στα συστατικά της λιπαρά οξέα. Το αραχιδονικό, ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ C-20, είναι το πρόδροµο µόριο µια σειράς ορµονών µε 20 άτοµα άνθρακα, που ονοµάζονται εικοσανοειδή, µεταξύ των οποίων οι προσταγλανδίνες, τα λευκοτριένια και τα θροµβοξάνια. 2. Πρωτεολυτικά ένζυµα του εξωκυτταρικού χώρου Τα ένζυµα αυτά παράγονται από πληθώρα κυττάρων, τόσο του συνδετικού ιστού όσο και άλλων ιστών, στα πλαίσια απόκρισής τους σε ποικίλα ερεθίσµατα. Τα ερεθίσµατα αυτά µπορεί να είναι χηµικοί (κυτταροκίνες, αναπτυξιακοί παράγοντες κ.α.), µηχανικοί (εφαρµογή πίεσης στο κυτταρικό περιβάλλον), ανοσολογικοί ή άλλοι παράγοντες καθώς και συνδυασµός τους. Σηµαντικό επίσης ρόλο, για την παραγωγή τους, παίζει και η κυτταρική αλληλεπίδραση. Η ικανότητά των ενζύµων αυτών να αποικοδοµούν τα περισσότερα συστατικά του εξωκυτταρικού χώρου τα καθιστά σηµαντικά τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Η αποικοδόµηση των συστατικών της εξωκυτταρικής (θεµέλιας) ουσίας in vivo πραγµατοποιείται κυρίως σε ουδέτερο ph, µε εξαίρεση τις διεργασίες γύρω από τα φλεγµονώδη κύτταρα. Γι αυτό οι µεταλλοπρωτεϊνάσες και οι σερινοπρωτεάσες φαίνεται να παίζουν τον πιο σηµαντικό ρόλο. Κατατάσσονται σύµφωνα µε τον Werb (Werb, 1989) σε τέσσερεις κατηγορίες οι οποίες φαίνονται στον Πίνακα Μεταλλοπρωτεϊνάσες του εξωκυτταρικού χώρου (MMPs) Γενικά Οι µεταλλοπρωτεϊνάσες του εξωκυτταρικού χώρου (MMPs) ή µατριξίνες (matrixins), είναι οι κυριότερες πρωτεϊνάσες στα θηλαστικά. Στην οικογένεια των MMPs υπάγονται τουλάχιστον 20 ένζυµα τα οποία εµφανίζουν δοµική αναλογία. Οι MMPs µαζί µε τις αστακίνες, τις αδαµαλυσίνες και τις σεραλυσίνες ανήκουν στην υπεροικογένεια των metzincins, το κοινό χαρακτηριστικό των οποίων είναι ένα κατάλοιπο Met στην καρβοξυ-πλευρά του ενεργού κέντρου, που είναι υπεύθυνο για

25 Εισαγωγή 12 την τελική του διαµόρφωση. Oι MMPs είναι πρωτεολυτικά ένζυµα, που διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στην αποικοδόµηση του εξωκυτταρικού υλικού και της βασικής µεµβράνης. Για κάθε συστατικό των παραπάνω υπάρχει τουλάχιστον ένα ένζυµο αυτής της οικογένειας ικανό να το αποικοδοµήσει. Έτσι εµπλέκονται τόσο σε φυσιολογικές διαδικασίες (ανάπλαση ιστών, επούλωση τραυµάτων, αγγειογένεση), όσο και σε παθολογικές (οστεόλυση, µεταστάσεις καρκινικών όγκων, περιοδοντίτιδα, ρευµατοειδής αρθρίτιδα κ.α.) (McCawley and Matrisian, 2001). Κατηγορία Ένζυµα Βέλτιστο ph δράσης Ασπαραγινοπρωτεάσες Καθεψίνη D 3-6 Κυστεϊνοπρωτεάσες Καθεψίνη B Καθεψίνη L 3-7 Καθεψίνη N Σερινοπρωτεάσες Ελαστάση Καθεψίνη G Ενεργοποιητές πλασµινογόνου 6-10 (ιστικός και τύπου ουροκινάσης) Πλασµίνη κ.α Μεταλλοπρωτεϊνάσες MMPs 6-9 Πίνακας 1: Πρωτεϊνάσες εξωκυτταρικού χώρου (Werb, 1989) Παράγονται από διάφορα κύτταρα, όπως µακροφάγα, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, κερατινοκύτταρα κ.ά. ως απόκριση στην επίδραση κυτταροκινών και αναπτυξιακών παραγόντων. Αξιοσηµείωτο είναι ότι οι περισσότερες δεν αποθηκεύονται στα παραγωγά κύτταρα αλλά εκκρίνονται αµέσως µετά την σύνθεσή τους ως προένζυµα και για να δράσουν απαιτείται ενεργοποίησή τους, η οποία γίνεται µέσω αποµάκρυνσης από το µόριο ενός τµήµατος από το αµινοτελικό άκρο (προπεπτίδιο), όπως αναφέρεται παρακάτω (McCawley and Matrisian, 2001).

26 Εισαγωγή 13 Κοινό χαρακτηριστικό τους είναι η απαραίτητη παρουσία ιόντων ψευδαργύρου (Zn 2+ ) προκειµένου να δράσουν (Zinc-dependent) ή Ca 2+, µε αποτέλεσµα να αναστέλλεται η δράση τους παρουσία χηλικών παραγόντων (πχ. EDTA), οι οποίοι δεσµεύουν τα δισθενή µέταλλα. Η ενζυµική δράση των ενεργοποιηµένων MMPs στους ιστούς ρυθµίζεται από τους ενδογενείς ιστικούς αναστολείς των µεταλλοπρωτεϊνασών, που είναι γνωστοί ως TIMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases). Στο πλάσµα αντίθετα η δράση τους αναστέλλεται από την α2- µακροσφαιρίνη. Κατατάσσονται στις κατηγορίες που φαίνονται στον Πίνακα 2 µε βάση την ικανότητα υδρόλυσης συγκεκριµένων υποστρωµάτων αλλά και κάποιες δοµικές ιδιαιτερότητες οµή µεταλλοπρωτεϊνασών Όλα τα µέλη της οικογένειας των ΜΜΡs παρουσιάζουν οµοιότητες όσον αφορά στη βασική χηµική δοµή τους. Συγκεκριµένα το µόριό τους χαρακτηρίζεται από την παρουσία πέντε διακριτών οµόλογων περιοχών. Όλα τα ένζυµα τα οποία αναφέρονται στον Πίνακα 2 µπορεί να θεωρηθεί ότι προκύπτουν αν στην παραπάνω βασική δοµή των πέντε περιοχών προστεθούν ή αφαιρεθούν επιπλέον περιοχές. Για παράδειγµα οι κολλαγονάσες και οι στρωµαλυσίνες διαθέτουν τη σταθερή αλληλουχία των πέντε οµόλογων περιοχών ενώ η ζελατινάση Β (ΜΜΡ-9) εµφανίζει 2 επιπλέον περιοχές και αποτελεί το µεγαλύτερο µόριο από όλες τις ΜΜΡs (Takagi et al., 1996). Οι κύριες οµόλογες περιοχές αναφέρονται στη συνέχεια (Σχ. 8). Σηµατοδοτικό πεπτίδιο (signal peptide): αποτελείται από αµινοξέα και κατευθύνει το προϊόν µετάφρασης στο ενδοπλασµατικό δίκτυο ώστε να ακολουθήσει την πορεία των εκκρινοµένων ενζύµων (Birkedal-Hansen et al., 1993). Προπεπτίδιο (propeptide) αµινοτελικό άκρο: είναι το αµινοτελικό άκρο του µορίου, αποτελείται από αµινοξέα (Birkedal-Hansen et al., 1993) και επικαλύπτει το ενεργό κέντρο του ενζύµου, µέσω ενός δεσµού που αναπτύσσεται µεταξύ Zn 2+ και µιας Cys. Όταν αφαιρεθεί το προπεπτίδιο από το µόριο προκύπτει η ενεργός µορφή του ενζύµου. Καταλυτική περιοχή: αποτελείται από 165 αµινοξέα περίπου, φέρει περιοχές δέσµευσης των απαραίτητων για τη δράση δισθενών µετάλλων (Zn 2+ ή Ca 2+ ) και είναι υπεύθυνη για την υδρολυτική δράση του ενζύµου έναντι των υποστρωµάτων του καθώς και για την αυτολυτική δράση του (Murphy et al., 1997)

27 Εισαγωγή 14 Πίνακας 2: Μέλη της οικογένειας των µεταλλοπρωτεσών (Μ.Παυλάκη διδακτορική διατριβή) Ονοµατολογία ΜΜP No Υποστρώµατα / ράσεις Κολλαγοναση Ι ενδιαµέσου χώρου Κολλαγονάση των ουδετερόφιλων MMP-1 MMP-8 Κολλαγονάσες Κολλαγόνα τύπου I, II, III, VII και X, εντακτίνη, πρωτεογλυκάνες, συζευκτική πρωτεΐνη, β- καζεΐνη Κολλαγόνα τύπου I, II, III, πρωτεογλυκάνες, συζευκτική πρωτεΐνη, β-καζεΐνη και ινοσυνδετίνη Κολλαγονάση 3 ΜΜP-13 Κολλαγόνα τύπου I, II, III Κολλαγονάση 4 MMP-18 Κολλαγόνα τύπου I Ζελατινάσες Ζελατινάση Α Ζελατινάση Β ΜΜP-2 MMP-9 Ζελατίνες,κολλαγόνα τύπου I, IV, V, VII, X, XI, ινοσυνδετίνη, λαµινίνη, αγγρικάνη, ελαστίνη Ζελατίνες, κολλαγόνα τύπου IV, V, XIV, εντακτίνη, ελαστίνη, αγγρικάνη Στρωµαλυσίνη 1 Στρωµαλυσίνη 2 Στρωµαλυσίνη 3 ΜΜP-3 MMP-10 MMP-11 Στρωµαλυσίνες Αγγρικάνη, ινοσυνδετίνη, λαµινίνη, ζελατίνες, κολλαγόνα τύπου III, IV, IX Αγγρικάνη, ινοσυνδετίνη, κολλαγόνα τύπου IV, συζευκτική πρωτεΐνη, ελαστίνη, καρβοξυµεθυλιωµένη τρανσφερίνη Μέτρια δραστικότητα έναντι ινοσυνδετίνης, λαµινίνης, κολλαγόνα τύπου IV, αγγρικάνη, ζελατινών, σερπινών. MT1-MMP Μεµβρανικού τύπου MMPs MMP-14 Κολλαγόνα τύπου I, II, III, ινοσυνδετίνη, πρωτεογλυκάνες θ. δερµατάνης. Ενεργοποιεί τις pro-mmp-2, pro-mmp-13 MT2-MMP MMP-15 Άγνωστα MT3-MMP MMP-16 Ενεργοποιεί την pro-mmp-2 MT4-MMP MMP-17 Άγνωστα Ματριλυσίνη ΜΜP-7 Άλλες Αγγρικάνη, ινοσυνδετίνη, ζελατίνες, κολλαγόνα τύπου IV, ελαστίνη, εντακτίνη. Μεταλλοελαστάση MMP-12 Ελαστίνη

28 Εισαγωγή 15 Περιοχή άρθρωσης ή γέφυρα πλούσια σε Pro: το µέγεθός της µπορεί να ποικίλλει ανάλογα µε το ένζυµο. Έτσι στην περίπτωση των κολλαγονασών αποτελείται από 16 αµινοξέα ενώ στη ζελατινάση Β (ΜΜΡ-9) είναι κατά πολύ µεγαλύτερο. Στην περίπτωση των κολλαγονασών φαίνεται ότι η περιοχή αυτή, σε συνδυασµό µε το C- τελικό πεπτίδιο, παίζει σηµαντικό ρόλο στην αποδιάταξη της τριπλής έλικας του υποστρώµατος (κολλαγόνου) µε αποτέλεσµα την αποδοτικότερη δράση του ενζύµου. Κατά τη G. Murphy (1997) οι δύο παραπάνω περιοχές διατάσσονται αντικριστά εγκλωβίζοντας κατά κάποιον τρόπο το υπόστρωµα και αφού αυτό αποδιατάσσεται, υδρολύεται στην συνέχεια από την καταλυτική περιοχή του ενζύµου. Καρβοξυτελικό άκρο: αποτελείται από 200 αµινοξέα περίπου. Στην περίπτωση των κολλαγονασών (ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-8 και ΜΜΡ-13) υποστηρίζεται ότι σε συνδυασµό µε την καταλυτική και την περιοχή της άρθρωσης καθορίζουν την δέσµευση του υποστρώµατος µε το ένζυµο (Murphy et al., 1997). Επηρεάζεται µε αυτόν τον τρόπο η εξειδίκευση του ενζύµου έναντι του υποστρώµατος. Τέλος, φαίνεται να είναι η περιοχή η οποία ευθύνεται για την συµπλοκοποίηση µε τους ΤΙΜΡs, µέσω αντίδρασης µε την C-τελική περιοχή των αναστολέων. Η παραπάνω αλληλεπίδραση είναι ισχυρότατη για τις ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-13, ασθενής για την ΜΜΡ-1 και αµελητέα για τις ΜΜΡ-3 και ΜΤ-ΜΜΡ (Murphy et al., 1997). Περιοχή οµόλογη µε ινοσυνδετίνη: απαντάται µόνο στις ζελατινάσες Α και Β. Παρεµβάλλεται στην καταλυτική περιοχή, αποτελείται από 3 επαναλήψεις µιας αλληλουχίας αµινοξέων (που µοιάζει µε την ινοσυνδετίνη) και είναι υπεύθυνη για την δυνατότητα δέσµευσης της ζελατίνης από τα µόρια των ζελατινασών. ιαµεµβρανική περιοχή: απαντάται στις µεµβρανικού τύπου ΜΜΡs (ΜΤ-ΜΜΡs). Εµφανίζεται µετά το καρβοξυτελικό άκρο και ευθύνεται για την πρόσδεση των µορίων αυτών στην κυτταρική µεµβράνη Οµάδες των ΜΜΡs Βασικά χαρακτηριστικά και δράσεις Κολλαγονάσες ενδιάµεσου στρώµατος (interstitial collagenases) Ο χαρακτηρισµός τους ως κολλαγονάσες στηρίζεται στην ικανότητά τους να υδρολύουν µη µετουσιωµένο κολλαγόνο τύπου Ι, ΙΙ, ΙΙΙ σε φυσιολογικές συνθήκες. Επειδή τα κολλαγόνα αυτά βρίσκονται στο ενδιάµεσο στρώµα, χαρακτηρίζονται και ως ενδιάµεσες. Στην κατηγορία αυτήν υπάγονται η ΜΜΡ-1 (κολλαγονάση τύπου ινοβλαστών - fibroblast collagenase), για την οποία θα γίνει εκτενής αναφορά στη συνέχεια, η ΜΜΡ-8 (κολλαγονάση τύπου ουδετεροφίλων neutrofil collagenase), η ΜΜΡ-13 και η ΜΜΡ-18. Καλύτερα µελετηµένες µέχρι σήµερα είναι η ΜΜΡ-1 και η ΜΜΡ-8, ενώ πιο πρόσφατα µελετήθηκε και η ΜΜΡ-13.

29 Εισαγωγή 16 Σχήµα 8: Κατηγοριοποίηση των MMPs βάση δοµικών περιοχών (Lafleur et al., 2003) Η ΜΜΡ-1 απαντάται σε γλυκοζυλιωµένη ή µη-γλυκοζυλιωµένη µορφή µοριακής µάζας 57 και 52kDa αντίστοιχα, ενώ παράγεται από ινοβλάστες, χονδροκύτταρα, µονοκύτταρα, µακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα και κερατινοκύτταρα. Η παραγωγή της απ τα παραπάνω κύτταρα είναι αποτέλεσµα επαγωγής της de novo σύνθεσής της από αναπτυξιακούς παράγοντες, κυτταροκίνες και µόρια όπως οι εστέρες του φορβολικού οξέος. Η ΜΜΡ-8 είναι γλυκοπρωτεΐνη, µοριακής µάζας 75kDa, η οποία παράγεται και αποθηκεύεται στα ουδετερόφιλα κύτταρα. Η απελευθέρωσή της από τα

30 Εισαγωγή 17 αποθηκευτικά κυστίδια των παραπάνω κυττάρων επάγεται από χηµικούς παράγοντες, οι οποίοι διεγείρουν τα κύτταρα αυτά. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την άµεση επίτευξη της µέγιστης ενζυµικής δράσης, σε αντίθεση µε την ΜΜΡ-1 της οποίας επάγεται αρχικά η σύνθεση στα παραγωγά κύτταρα και κατόπιν η απελευθέρωση. Η ΜΜΡ-13, εκτός από τα κύρια υποστρώµατα που φαίνονται στον παραπάνω πίνακα, αποικοδοµεί ζελατίνη και πρωτεογλυκάνες. Επίσης, ενέχεται στην ενεργοποίηση της prommp-9 και σε συνδυασµό µε την ΜΤ1-ΜΜΡ στην ενεργοποίηση της proμμρ-2 (Murphy et al., 1997; McCawley et al., 2001). Ζελατινάσες (gelatinases) ή κολλαγονάσες τύπου IV Στην κατηγορία αυτήν ανήκουν η ζελατινάση Α ή ΜΜΡ-2 και η ζελατινάση Β ή ΜΜΡ-9. Οι προενζυµικές µορφές τους, prommp-2 και prommp-9, έχουν µοριακή µάζα 72 και 92kDa αντίστοιχα, και είναι µοναδικές µεταξύ των ΜΜΡs γιατί σχηµατίζουν σύµπλοκα µε τον ΤΙΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-1 αντίστοιχα, και στη µορφή του προενζύµου. Βασικό χαρακτηριστικό τους είναι η ικανότητα υδρόλυσης του κολλαγόνου τύπου IV, γι αυτό και ονοµάζονται κολλαγονάσες τύπου IV, το οποίο αποτελεί κύριο συστατικό της βασικής µεµβράνης. Η κύρια ονοµασία τους (ζελατινάσες) υποδηλώνει την ικανότητα υδρόλυσης της ζελατίνης, αφού αυτή πρώτα δεσµευθεί στην οµόλογη µε την ινοσυνδετίνη περιοχή του ενζυµικού µορίου. Η ΜΜΡ-2 παράγεται συστατικά από διάφορα κύτταρα σε καλλιέργεια, όπως ινοβλάστες, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, κερατινοκύτταρα και µονοκύτταρα (Birkedal-Hansen et al., 1993). Η ΜΜΡ-9 είναι επαγώγιµο µόριο, παράγεται και εκκρίνεται από πολλά κύτταρα, µεταξύ των οποίων και µονοκύτταρα, και η παραγωγή της αυξάνεται όταν τα κύτταρα αυτά διαφοροποιηθούν σε µακροφάγα. Εκτός από την αποικοδόµηση της βασικής µεµβράνης, οι ζελατινάσες αποικοδοµούν µετουσιωµένα κολλαγόνα, ιδιαίτερα ζελατίνη τύπου Ι και κολλαγόνο τύπου V. Στρωµαλυσίνες (stromelysines) Στην κατηγορία αυτήν ανήκουν οι ΜΜΡ-3 (στρωµαλυσίνη 1), ΜΜΡ-10 (στρωµαλυσίνη 2) και ΜΜΡ-11 (στρωµαλυσίνη 3), µε καλύτερα µελετηµένη την πρώτη. Τα παραπάνω ένζυµα έχουν ως υποστρώµατα τον πρωτεϊνικό κορµό των συζεύξιµων πρωτεογλυκανών (aggrecan), την συζευκτική πρωτεΐνη του χόνδρου (link protein), την ελαστίνη, τις ζελατίνες και την καρβοξυµεθυλιωµένη τρανσφερρίνη.

31 Εισαγωγή 18 Η ΜΜΡ-3 είναι η πιο δραστική έναντι των ανωτέρω υποστρωµάτων (διπλάσια περίπου δραστικότητα σε σχέση µε την ΜΜΡ-10). Εκκρίνεται σε δύο µορφές, µία γλυκοζυλιωµένη (µοριακής µάζας 59kDa) και µία µη-γλυκοζυλιωµένη (µοριακής µάζας 57 kda). Υδρολύει εκτός των άλλων την καζεΐνη, την ινοσυνδετίνη και τα κολλαγόνα τύπου ΙΧ και Χ. Πιστεύεται επίσης ότι παίζει ρόλο στην in situ ενεργοποίηση των ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-13 (Murphy et al., 1997; Knauper et al., 1996). Μεµβρανικού τύπου µεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΤ-ΜΜΡs) Πρόκειται για την πιο πρόσφατη οµάδα των ΜΜΡs, τα µέλη της οποίας φέρουν στο µόριό τους τη διαµεµβρανική περιοχή, η οποία και τους προσδίδει την ικανότητα να καθηλώνονται στην κυτταρική µεµβράνη. Ο σηµαντικότερος ρόλος τους είναι η ενεργοποίηση (στην πλασµατική µεµβράνη) των prommp-2 και prommp-13. Τα 4 µέλη και τα υποστρώµατά τους φαίνονται στον Πίνακα 2. Ενδογενείς ιστικοί αναστολείς των ΜΜΡs (ΤΙΜΡs) Όπως ήδη αναφέρθηκε, ένα από τα χαρακτηριστικά των ΜΜΡs είναι ότι η δράση των ενεργών µορφών τους στους ιστούς ρυθµίζεται, από τους επίσης πρωτεϊνικής φύσης, ενδογενείς ιστικούς αναστολείς (ΤΙΜΡs). Οι ΤΙΜΡs παράγονται από τα ίδια κύτταρα που παράγουν και τις ΜΜΡs. Εκτός από την ρύθµιση της δράσης των ΜΜΡs, οι ΤΙΜΡs συµπεριφέρονται και ως αυξητικοί παράγοντες σε συγκεκριµένες κυτταρικές σειρές (Murphy and Willenbrock, 1995). Μέχρι τώρα έχουν αναγνωρισθεί 4 µέλη της οικογένειας: οι ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2, ΤΙΜΡ-3 και ΤΙΜΡ-4 (Brew et al., 2000). Όλοι οι αναστολείς αυτοί εµφανίζουν µεγάλες οµοιότητες στην αλληλουχία των αµινοξέων, ενώ η ύπαρξη Cys σε συγκεκριµένες θέσεις του µορίου έχει σαν αποτέλεσµα την ανάπτυξη δισουλφιδικών δεσµών, οι οποίοι ευθύνονται τόσο για την τριτοταγή δοµή του µορίου όσο και για την σταθερότητά του. Μέσω του Ν-τελικού άκρου τους δεσµεύεται στο ενεργό κέντρο των ΜΜΡs καθιστώντας αυτές ανενεργές. Για την παραπάνω δράση απαραίτητη προϋπόθεση είναι η ακεραιότητα του µορίου των αναστολέων. Έστω και µερική πρωτεόλυση τους καθιστά ανενεργούς. Στην διαδικασία συµπλοκοποίησής τους µε τα ένζυµα-στόχους (ΜΜΡs) µπορεί το Ν-τελικό άκρο να είναι αυτό που δεσµεύεται στο ενεργό κέντρο των ενζύµων, όµως πιστεύεται ότι προηγείται αλληλεπίδραση µεταξύ των C-τελικών περιοχών ενζύµου και αναστολέα. Στην περίπτωση των προενζυµικών µορφών των ζελατινασών, που όπως αναφέρθηκε δηµιουργούν σύµπλοκα µε τους ΤΙΜΡs, η αντίδραση γίνεται µόνο µε αλληλεπίδραση των C-τελικών άκρων, µια και το ενεργό κέντρο των ενζύµων καλύπτεται από το προπεπτίδιο.

32 Εισαγωγή 19 Πιο καλά µελετηµένοι αναστολείς είναι ο ΤΙΜΡ-1 και ο ΤΙΜΡ-2. Ο ΤΙΜΡ-1 είναι µία πλούσια σε µαννόζη γλυκοπρωτεΐνη µοριακής µάζας 28 kda ενώ ο ΤΙΜΡ-2 είναι ένα µη-γλυκοζυλιωµένο µόριο µοριακής µάζας 22 kda. Ο ΤΙΜΡ-3 έχει µοριακή µάζα 21kDa αλλά ακόµη δεν έχει αποσαφηνισθεί αν είναι γλυκοζυλιωµένο το µόριό του ή όχι (Murphy and Willenbrock, 1995). 2.2 Ρύθµιση των MMPs Γενικά, η παραγωγή και δραστικότητα των MMPs είναι αυστηρά ρυθµιζόµενες in vivo. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες τα κύτταρα δεν αποθηκεύουν τις MMPs και η συστατική παραγωγή τους είναι σε χαµηλά επίπεδα. Η δραστικότητα των MMPs ρυθµίζεται κυρίως σε τρία επίπεδα: µεταγραφής, πρωτεολυτικής ενεργοποίησης του προενζύµου και αλληλεπίδρασης µε τους ειδικούς ενδογενείς αναστολείς τους, τους ΤΙΜΡs. Ρυθµίζονται επιπλέον από τον χρόνο ηµιζωής του mrna τους, την έκκριση, τον εντοπισµό και την ικανότητα µετάφρασης (Sternlicht and Werb, 2001). Σε µεταγραφικό επίπεδο, στο οποίο θα γίνει εκτενής αναφορά στη συνέχεια, κυτταροκίνες και αναπτυξιακοί παράγοντες δεσµεύονται σε εξειδικευµένους διαµεµβρανικούς υποδοχείς και επηρεάζουν µονοπάτια µεταγωγής σήµατος, όπως των πρωτεϊνικών κινασών Α και C. Γλυκοκορτικοειδή και βιταµίνη D εισέρχονται, ως σύµπλεγµα µε ενδοκυτταρικούς υποδοχείς, στον πυρήνα και επηρεάζουν τη µεταγραφή (Ries et al., 1995). Τέλος, µεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο AP-1, αποτελούν µόρια-κλειδιά στη µεταγραφική ρύθµιση των MMPs. Οι τελευταίοι, ύστερα από διέγερση από κυτταροκίνες και αναπτυξιακούς παράγοντες ή ακόµα και περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η επαφή µε τον ECM, προσδένονται σε συντηρηµένες αλληλουχίες του υποκινητή, που καλούνται ρυθµιστικά στοιχεία, επηρεάζοντας έτσι τη έκφραση των γονιδίων των MMPs (Σχ. 9). Κοινές αλληλουχίες ανάµεσα σε µέλη των MMPs υποδεικνύουν τις οµοιότητες στον τρόπο ρύθµισής τους, ενώ είναι ενδιαφέρον ότι πολλές MMPs εµφανίζουν κοινά ρυθµιστικά στοιχεία µε µέλη της οικογένειας των TIMPs. Η πρωτεολυτική ενεργοποίηση των MMPs πραγµατοποιείται τόσο από πρωτεϊνάσες, όσο και από µη πρωτεολυτικούς παράγοντες. Κοινό χαρακτηριστικό τους είναι η αποµάκρυνση της Cys από τον καταλυτικό Zn 2+ µε αποτέλεσµα την έκθεση του ενεργού κέντρου. Χαοτροπικοί παράγοντες όπως NaSCN, ουρία, NaI ή απορρυπαντικά, όπως το SDS, επάγουν αλλαγές διαµόρφωσης στην πολυπεπτιδική αλυσίδα του προενζύµου, µε αποτέλεσµα την ενεργοποίησή του (Tsceheche, 1995).

33 Εισαγωγή 20 Οι ΤΙΜΡs συνδέονται µη οµοιοπολικά µε τις MMPs σε αναλογία 1:1 και µε τους τρόπους που αναφέρθηκαν προηγούµενα συµβάλλουν στη ρύθµισή τους. Όσον αφορά στους λιγότερο µελετηµένους τρόπους ρύθµισης, έχει διαπιστωθεί ότι κυτταροκίνες και αναπτυξιακοί παράγοντες ρυθµίζουν τη σταθερότητα του mrna (Atula et al., 1997; Skobe et al., 1998). Είναι γνωστό ότι EGF, PDGF, φορβολικοί εστέρες και γλυκοκορτικοειδή σταθεροποιούν το mrna της MMP-1 και -13 σε αντίθεση µε τον TGF-β (Vincenti and Brinckerhoff, 2002). Σηµαντικός είναι επίσης ο εντοπισµός της πρωτεολυτικής ενεργότητας στον περικυτταρικό χώρο. Η αγκυροβόληση των MMPs στην κυτταρική επιφάνεια τις αποτρέπει από το να διαχέονται ταχύτατα και επίσης τις κρατά κάτω από στενό ρυθµιστικό έλεγχο. Επιπρόσθετα, η δέσµευση στην κυτταρική επιφάνεια επιτρέπει την ακινητοποίηση των MMPs για την ενεργοποίησή τους, την αλληλεπίδραση µε µόρια προσκόλλησης της κυτταρικής επιφάνειας ή µεµβρανικούς υποδοχείς, ρύθµιση της ανακύκλωσής τους και εντοπισµένη περικυτταρική πρωτεόλυση όπως στην περίπτωση της MMP-14. Έτσι έχει βρεθεί ότι η θειϊκή ηπαράνη δεσµεύει την MMP-7 στην κυτταρική επιφάνεια και πιθανότατα στη βασική µεµβράνη in vivo. Παροµοίως, η MMP-2 αλληλεπιδρά µε την ιντεγκρίνη avβ3, η MMP-9 δεσµεύεται στον υποδοχέα του υαλουρονικού οξέος CD44 της κυτταρικής επιφάνειας και στην ιντεγκρίνη avβ6, και τέλος η prommp-1 αλληλεπιδρά µε την ειδική για το κολλαγόνο τύπου Ι ιντεγκρίνη α2β1 ( invasion/regulation of MMP activity). 3. Κολλαγονάση-1 (MMP-1) Η MMP-1 κατέχει πρωταρχική θέση στην πορεία καταστροφής των οστών, δεδοµένου ότι υδρολύει τα ενδιάµεσα φυσικά κολλαγόνα (τύπου Ι, ΙΙ και ΙΙΙ). Η παραπάνω δράση, που πραγµατοποιείται και σε µικρότερο βαθµό από τις MMP-8 και MMP-13, έχει ως αποτέλεσµα τη διάσπαση της τριπλής έλικας των µορίων του κολλαγόνου και την δηµιουργία δύο τµηµάτων (¾ προς το Ν-τελικό άκρο και ¼ προς το C-τελικό άκρο), τα οποία γρήγορα µετουσιώνονται στη θερµοκρασία του σώµατος σε ζελατίνη, την οποία αποικοδοµούν στη συνέχεια άλλες ΜΜΡs, κυρίως οι ζελατινάσες (Shapiro, 1998). Η έκφρασή της παραµένει σε χαµηλά επίπεδα σε φυσιολογικές συνθήκες, ενώ αυξάνεται υπό την παρουσία κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων, µόρια που απαντώνται σε αφθονία σε ασθένειες όπως η RA και OA.

34 Εισαγωγή Μεταγραφική ρύθµιση της MMP-1 Η έκφραση του γονιδίου της MMP-1 εξαρτάται από ρυθµιστικά στοιχεία που βρίσκονται ανοδικά του σηµείου έναρξης της µεταγραφής και αποτελούν σηµεία δέσµευσης των µεταγραφικών παραγόντων. Ο υποκινητής της MMP-1, εκτός από το πλαίσιο TATA, την κύρια µεταγραφική µονάδα, που βρίσκεται στη θέση -30bp, περιέχει πλήθος ρυθµιστικών στοιχείων, που είτε αυτόνοµα είτε µετά από αλληλεπίδραση µε διπλανά ενεργοποιούν ή αναστέλλουν τη µεταγραφή (Σχ. 9). Τα πιο σηµαντικά αυτών περιγράφονται στη συνέχεια. Σχήµα 9: Ρυθµιστικά στοιχεία των υποκινητών των γονιδίων των MMPs στον άνθρωπο (Fini et al., 1998) Ενεργοποιούσα πρωτεΐνη -1 (AP-1) Η οικογένεια των µεταγραφικών παραγόντων AP-1 (activating protein-1) συνίσταται από οµοδιµερή και ετεροδιµερή των Jun (v-jun, c-jun, JunB, and JunD), Fos (v-fos, c-fos, Fra-1, Fra-2, and FosB) ή ΑΤF (ATF2, ATF3/LRF1, B-ATF) πρωτεϊνών, που ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνών φερµουάρ λευκίνης. Οι Jun πρωτεΐνες, εκτός από σταθερά ετεροδιµερή µε Fos και ΑΤF, µπορούν να

35 Εισαγωγή 22 σχηµατίζουν και οµοδιµερή µεταξύ τους. Το τελευταίο, ισχύει και για τις ΑΤF πρωτεΐνες όχι όµως και για τις Fos. Τα διµερή Jun-Jun και Jun-Fos δεσµεύονται κατά προτίµηση στο ρυθµιστικό στοιχείο TRE (TPA ή PMA respοnse element), που έχει την αλληλουχία 5'-TGACTCA-3', ενώ τα ετεροδιµερή Jun-ΑΤF και τα οµοδιµερή των ΑΤF προτιµούν τη δέσµευση στο ρυθµιστικό στοιχείο CRE (camp respοnse element) µε αλληλουχία 5 -TGACGTCA-3 (Karin M et al., 1997). Το αρχικό εύρηµα ήταν ότι η επαγωγή της µεταγραφής γονιδίων από τον φορβολικό εστέρα TPA (12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate) πραγµατοποιούνταν µε τη µεσολάβηση των AP-1 (Maki et al., 1987). Σήµερα, είναι γνωστό ότι οι AP-1 ενεργοποιούνται από κυτταροκίνες, ογκογονίδια, ενεργοποιητές Τ κυττάρων, νευροδιαβιβαστές και υπεριώδη ακτινοβολία. Το ρυθµιστικό στοιχείο TRE απαντάται στον υποκινητή πολλών ΜΜPs, µεταξύ των οποίων και η ΜΜΡ-1, όπου και εντοπίζεται στη θέση -70bp (Σχ. 9). Τα µέλη της οικογένειας ΑΡ-1 δεσµεύονται µε διαφορετική συγγένεια στο στοιχείο αυτό, γεγονός που εξηγεί και τις ποικίλες βιολογικές δράσεις τους. Για παράδειγµα, ο Chiu et al το 1989 έδειξαν ότι διαφορετικά µέλη του AP-1 επιδεικνύουν διαφορετικά αποτελέσµατα στον υποκινητή της MMP-1. Ενώ ο c-jun, ως οµοδιµερές, επάγει την παραγωγή της MMP-1, ο JunB απαιτεί την έκφραση του c-fos ή την παρουσία και άλλων AP-1 στοιχείων. Μια επιπλέον θέση δέσµευσης στο σηµείο -186bp έχει βρεθεί στους υποκινητές της MMP-1 από άνθρωπο και κουνέλι, η οποία ενεργοποιείται κυρίως από φορβολικούς εστέρες, ενώ µια τρίτη θέση εντοπίζεται µεταξύ των θέσεων -182 και -141bp. Η τελευταία, έχει µικρότερη συγγένεια δέσµευσης των AP-1 παραγόντων (Chamerlain et al., 1993). Μια νέα θέση δέσµευσης στο σηµείο -1602bp δρα µετά από συνεργασία µε µια παρακείµενη θέση Ets (-1607 bp). Η αλληλεπίδραση µεταξύ των ρυθµιστικών στοιχείων φαίνεται να είναι αρκετά συνηθισµένη. Για παράδειγµα, η επαγόµενη από IL-1 παραγωγή της MMP-1 σε ινοβλάστες από κουνέλι απαιτεί την αλληλεπίδραση µιας θέσης AP-1 (-77bp) µε ένα στοιχείο ανάλογο του NF-κB στη θέση -3030bp (Barchowsky et al., 2000). Επίσης, AP-1 στοιχεία σχηµατίζουν διµερή µε µέλη της οικογένειας των ATF/CREB (Hai et al., 1991). Συνεργασία παρατηρείται, τέλος, µεταξύ των AP-1 στοιχείων µε το ρυθµιστικό στοιχείο STAT (Korzus et al., 1997). Το τελευταίο, βρίσκεται πολύ κοντά στο TRE και φαίνεται να κατέχει σηµαντική θέση στη µεταγραφή, όπως θα αναφερθεί και στη συνέχεια. Η ρύθµιση της δραστικότητας του AP-1 λαµβάνει χώρα σε δύο κυρίως επίπεδα: εξωκυττάρια ερεθίσµατα τροποποιούν τόσο τη διαθεσιµότητα όσο και τη δραστικότητα των ΑΡ-1 πρωτεϊνών. Η διαθεσιµότητα των ΑΡ-1 πρωτεϊνών συνήθως ρυθµίζεται µε τον έλεγχο της µεταγραφής των γονιδίων τους. Όµως έχει δειχθεί ότι η

36 Εισαγωγή 23 διαθεσιµότητα τόσο του c-jun όσο και του c-fos µπορεί να ρυθµίζεται µε τροποποίηση της σταθερότητάς τους. Φωσφορυλίωση του c-jun από τις ΜΑΡ κινάσες µειώνει την ουβικιτινυλίωση της πρωτεΐνης αυτής, και συνεπώς την αποικοδόµησή της, και αφετέρου αυξάνει τη µεταγραφική της δραστικότητα (Karin et al., 1997) Μεταγραφικοί παράγοντες Ets Οι µεταγραφικοί παράγοντες Ets δεσµεύονται στο ρυθµιστικό στοιχείο PEA-3 (polyoma enhancer activator-3), το οποίο απαντάται στον υποκινητή της ΜΜΡ-1 και πολλών άλλων ΜΜΡs. Τα πιο γνωστά µέλη τους είναι οι c-ets-1, c-ets-2, Pu-1 και PEA-3. Κοινό χαρακτηριστικό τους είναι µια συντηρηµένη περιοχή 85 αµινοξέων, η Ets περιοχή, µέσω της οποίας δεσµεύονται σε µια πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία, την 5 -A/CGGAA/T-3. Μια διαφορετική θέση δέσµευσης Ets παραγόντων δηµιουργείται από τον πολυµορφισµό ενός µόνο νουκλεοτιδίου στη θέση -1607bp (5 -GGA-3 ) µε την εισαγωγή µιας επιπλέον βάσης γουανίνης (G). Τουλάχιστον ένα αντίγραφο του αλληλόµορφου 2G είναι παρόν περίπου στο 75% του ανθρώπινου πληθυσµού, όπου έχει τη δυνατότητα να αυξάνει τη µεταγραφή της MMP-1, τόσο σε φυσιολογικούς ινοβλάστες όσο και σε καρκινικά κύτταρα (Rutter et al., 1998; Nishioka et al., 2000). Τα µέλη της οικογένειας Ets συνήθως δεν δεσµεύονται απευθείας στο DNA, αλλά προτιµούν να σχηµατίζουν πρώτα σύµπλοκα µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες, και κυρίως τους AP-1. Για το λόγο αυτό χαρακτηρίζονται ως συνενεργοποιητές (Carrere et al., 1998). Παράδειγµα ο αυξητικός παράγοντας των ηπατικών κυττάρων (HGF) που αυξάνει τη δραστικότητα του υποκινητή της MMP-1 µέσω ενός µηχανισµού συνεργασίας του AP-1 και του µεταγραφικού παράγοντα Ets- 1 (Ozakil et al., 2002) Μεταγραφικοί παράγοντες STAT Οι µεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας STAT (signal transducers and activators of transcription) δεσµεύονται στον υποκινητή της MMP-1 σε ένα σηµείο κοντά στο TRE, ανάµεσα στις βάσεις -53 και -45 (Korzus et al., 1997). Οι πρωτεΐνες αυτές δεσµεύονται ως διµερή στο DNA και τροποποιούν την γονιδιακή έκφραση.

37 Εισαγωγή 24 Φαίνεται πως η δράση τους είναι σηµαντική αφού έχουν τη δυνατότητα να συνεργάζονται µε τα παρακείµενα στοιχεία AP-1. Υπάρχουν έξι τουλάχιστον STATs που επάγονται από διαφορετικές κυτταροκίνες, όπως IL-6, G-CSF και EGF, ενώ και οι MAP κινάσες φαίνεται να εµπλέκονται στην ενεργοποίησή τους. 4. Πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούµενες από µιτογόνα (MAPK) 4.1 Γενικά Οι ενεργοποιούµενοι, από κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες, µεταγραφικοί παράγοντες που αναφέρθηκαν παραπάνω, δρουν µέσω µιας σειράς φωσφορυλιώσεων που καταλήγουν στην διέγερση της µεταγραφής των MMPs. Μια σηµαντική οµάδα πρωτεϊνών που συµµετέχει σε µια τέτοια διαδικασία είναι οι ενεργοποιούµενες από µιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες (MAPKs) (Johnson et al., 2002). Οι MAPKs (mitogen-actvated protein (MAP) kinases) είναι πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/θρεονίνης που αποκρίνονται σε εξωτερικά ερεθίσµατα (µιτογόνα) και ρυθµίζουν κυτταρικές δράσεις, όπως η έκφραση γονιδίων, η µίτωση, η διαφοροποίηση και η απόπτωση. Αποτελούν συστατικά ενός ρυθµιστικού καταρράκτη τριών πρωτεϊνικών κινασών. Όλα ξεκινούν όταν το εξωτερικό ερέθισµα ενεργοποιεί τις MKKKs (MKK kinases), οι οποίες φωσφορυλιώνουν σε κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης τις MKKs (MAPK kinases), που φωσφορυλιώνουν τελικά τις MAPKs σε κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης. Είναι γνωστό ότι οι MKKKs ρυθµίζονται από τις µικρές πρωτεΐνες G (Ras, Rac και Cdc42), αλλά και από εξειδικευµένες κινάσες, τις MKKKKs (Widmann et al., 1999). Οι ενεργοποιηµένες πλέον MAPKs µεταναστεύουν στον πυρήνα προκειµένου να διεγείρουν µεταγραφικούς παράγοντες (Σχ. 10). Μέχρι σήµερα, έχουν ταυτοποιηθεί στα θηλαστικά 12 µέλη της οικογένειας των MAPK που χωρίζονται, µε βάση τη δοµική οµολογία και δράση τους, σε τρεις υποοικογένειες: ΕRK, JNK και p38. Οι ERKs (extracellular signal-regulated kinases), ERK1 και ERK2, ρυθµίζονται από εξωκυτταρικά σήµατα, όπως αυξητικούς παράγοντες και φορβολικούς εστέρες και ρυθµίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση. Οι ERKs ενεργοποιούνται από το πρωτο-ογκογονίδιο ras σύµφωνα µε το µονοπάτι Ras>Raf>MEK1,2>ERK1,2. Μεταλλάξεις που µετατρέπουν το ras σε ένα ενεργοποιηµένο ογκογονίδιο είναι υπεύθυνες για πολλά είδη καρκίνου στον

38 Εισαγωγή 25 άνθρωπο. Οι ERKs µεσολαβούν στην έκφραση των πρωτεϊνών AP-1 µέσω της φωσφορυλίωσης του Elk-1, ενός TCF παράγοντα, ο οποίος επάγει την έκφραση του γονιδίου c-fos (Karin et al.,1997). Οι JNKs (c-jun N-terminal kinases), JNK1 και JNK2, ή SAPK (stressactivated protein kinases), χαρακτηρίστηκαν ως οι κινάσες που ενεργοποιούνται από το στρες, ενώ στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι δεσµεύουν και φωσφορυλιώνουν τον µεταγραφικό παράγοντα c-jun στο Ν-τελικό άκρο. Η ρύθµιση του µονοπατιού των JNKs, MEKK1-4>MKK/MKK7>JNK/SAPKs, είναι εξαιρετικά πολύπλοκη και επηρεάζεται από πολλές MKKKs. Οι JNKs παίζουν σηµαντικό ρόλο στην απόπτωση, στον καρκίνο, ενώ αναστολείς τους έχουν δοκιµαστεί σε ζωικά µοντέλα για τη θεραπεία της RA (Han et al., 2001). Οι p38 κινάσες, που περιλαµβάνουν 4 ισοµορφές (p38α -β, -γ και -δ), και όπως οι JNKs, ενεργοποιούνται από κυτταροκίνες, υπεριώδη ακτινοβολία, προσδέµατα υποδοχέων που δεσµεύουν πρωτεΐνες G, ωσµωτικό και θερµικό σοκ και εµπλέκονται στην κυτταρική διαφοροποίηση και την απόπτωση. Το µονοπάτι των p38, TAK1>MKK3/MKK6>p38s, ρυθµίζει την έκφραση πολλών κυτταροκινών και ενεργοποιείται στα κύτταρα του ανοσοποιητικού από προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες, παίζοντας έτσι σηµαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης (Johnson et al., 2002). Σχήµα 10 : Μονοπάτια των MAP κινασών (Lodish et al., 2004).

39 Εισαγωγή 26 Οι MAPKs αποτελούν πρωταρχικούς στόχους ερευνών που σχετίζονται µε πολλές ανθρώπινες ασθένειες, δεδοµένου του ρόλου τους στον έλεγχο των κυτταρικών αποκρίσεων και στην έκφραση γονιδίων. Όλες οι υποοικογένειες των MAPKs εκφράζονται από τους ινοβλάστες αρθρικού υµένα ασθενών µε RA και ΟΑ (Han et al., 1999). Η σηµασία των JNK για την έκφραση των MMPs από τους ινοβλάστες του αρθρικού υµένα έχει τεκµηριωθεί µε µελέτες σε JNK1 και -2 knockout ποντικούς (Yamanishi et al., 2001), µε την JNK2 να εκφράζεται περισσότερο. 4.2 Ρόλος των MAP κινασών στην έκφραση της MMP Ρύθµιση των µεταγραφικών παραγόντων AP-1 και Ets Οι MAP κινάσες παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθµιση της δραστικότητας των µεταγραφικών παραγόντων AP-1 και Ets, που συνδέονται, όπως ήδη αναφέρθηκε, άµεσα µε την έκφραση του γονιδίου της MMP-1 (Σχ. 11). Στο επίπεδο της µεταγραφής οι ΜΑΡ κινάσες ρυθµίζουν την έκφραση των γονιδίων µελών του AP-1 και Ets. Για παράδειγµα οι ERKs φωσφορυλιώνουν τον παράγοντα Elk1, µέλος των µεταγραφικών παραγόντων TCF (ternary complex factor) που δεσµεύονται στο ρυθµιστικό στοιχείο SRE, διεγείροντας έτσι τη µεταγραφή του γονιδίου c-fos. Αντίθετα, το γονίδιο c-jun διεγείρεται από τη δράση των κινασών JNK επί των µεταγραφικών παραγόντων c-jun και ATF-2, που δεσµεύονται στο ρυθµιστικό στοιχείο TRE (Karin, 1995). Στο επίπεδο τροποποίησης του χρόνου ζωής και της µεταγραφικής ικανότητας, οι ΜΑΡ κινάσες µε απευθείας φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων, ρυθµίζουν τόσο το χρόνο ζωής όσο και την ικανότητα δέσµευσης στο DNA διεγείροντας έτσι τη µεταγραφή συγκεκριµένων γονιδίων. Όπως προαναφέρθηκε, τόσο η σταθερότητα όσο και η µεταγραφική ικανότητα της c-jun πρωτεΐνης αυξήθηκε ύστερα από JNK φωσφορυλίωση. Αν και οι p38 κινάσες δεν φωσφορυλιώνουν απευθείας τον παράγοντα c-jun, συνεισφέρουν στην αυξηµένη δράση του ενεργοποιώντας τους µεταγραφικούς παράγοντες ATF-2, Elk-1 και SAP-1 (Minden et al., 1997). Επιπλέον, φωσφορυλίωση της c-fos από τις ERK2 και p90rsk οδηγεί σε ενεργοποίησή της (Robinson et al., 1997), ενώ φωσφορυλίωση της c-jun µπορεί να προκαλέσει δέσµευση της CBP (CREB binding protein) στον παράγοντα CREB και ενεργοποίηση της µεταγραφής µέσω του CRE (Arias et al., 1994). Τέλος, η ενεργοποίηση των Ras µικρών πρωτεϊνών G, οδηγεί σε ενεργοποίηση των

40 Εισαγωγή 27 µεταγραφικών παραγόντων Ets, κυρίως µέσω των ERK, αλλά και µε τη συνεργασία των JNK κινασών (O Hagan et al., 1996). Πειραµατικά δεδοµένα δείχνουν ότι η αναστολή της φωσφατάσης PP2A από οκαδαϊκό οξύ (okadaic acid) οδήγησε σε αυξηµένη φωσφορυλίωση και κατ επέκταση σε επαγωγή της έκφρασης των MMP-1 και MMP-3. Επιπλέον, φαίνεται πως οι κινάσες MEK συµβάλλουν στη ρύθµιση του υποκινητή της MMP-1 µέσω του στοιχείου AP-1. Παρόµοια ήταν και τα αποτελέσµατα για την Raf-1 που φαίνεται να επηρεάζει το γονίδιο της MMP-1 µέσω αλληλεπίδρασης των AP-1 και STAT παραγόντων, ενώ σε φυσιολογικούς ινοβλάστες η αυξηµένη, από IL-1 και TNF-α, έκφραση της MMP-1 γίνεται µε τη µεσολάβηση και των τριών µονοπατιών, JNK, ERK και p38. Σχήµα 11: Ενεργοποιηµένες MAP κινάσες µεταναστεύουν στον πυρήνα όπου φωσφορυλιώνουν µεταγραφικούς παράγοντες όπως Elk-1, ATF-2, c- Jun, c-fos και Ets-1, διεγείροντας έτσι τη µεταγραφή γονιδίων, όπως c- jun, c-fos και MMPs (Vincenti and Brinckerhoff, 2001). 5. Κυτταροκίνες 5.1 Γενικά Οι κυτταροκίνες είναι µια οµάδα πρωτεϊνών ή γλυκοπρωτεϊνών, που παράγονται από διάφορα είδη κυττάρων. Συµβάλλουν στη χηµική επικοινωνία µεταξύ των κυττάρων και εµπλέκονται σε διεργασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, η ανάπλαση των ιστών και η ρύθµιση της ανοσοαπόκρισης.

41 Εισαγωγή 28 Το 1969 πρωτοεµφανίστηκαν µε τον όρο λεµφοκίνες, προκειµένου να περιγραφεί η προέλευσή τους από ενεργοποιηµένα Τ λεµφοκύτταρα, αλλά και η λειτουργία τους στο ανοσοποιητικό σύστηµα. Κατά τη δεκαετία του 1970 ο όρος διευρύνθηκε, ώστε να περιλαµβάνει και αυτές που προέρχονταν από άλλα είδη κυττάρων, ενώ το 1979 εδραιώθηκε ο όρος ιντερλευκίνη. Σήµερα, χρησιµοποιείται ο όρος κυτταροκίνες, προκειµένου να δηλωθεί µια ευρεία κατηγορία πρωτεϊνών µε διαφορετικές δοµές και βιολογικές δράσεις. Οι περισσότερες κυτταροκίνες απαντούν ως εκκρινόµενες, άλλες εµφανίζονται ως µεµβρανικές ενώ σε µερικές περιπτώσεις διατηρούνται σε ειδικά κυστίδια στο εξωκυτταρικό υλικό. Ωστόσο, είναι γενικά αποδεκτό ότι προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων-στόχων µέσω των οποίων µεταφέρουν πληροφορίες. Αρχικά θεωρήθηκε ότι οι κυτταροκίνες δρούσαν όπως οι κλασικές ορµόνες, οι οποίες παράγονται από αδένες, απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίµατος και µεταφέρονται σε αποµακρυσµένους ιστούς-στόχους όπου και δρούν µε ένα ενδοκρινή µηχανισµό. Σήµερα, είναι πλέον αποδεκτό ότι οι περισσότερες δρουν παρακρινώς στα άµεσα γειτονικά κύτταρα αυτών που τις παράγουν, ή ακόµα σε αυτά τα ίδια τα κύτταρα από τα οποία παράγονται µε ένα αυτοκρινή µηχανισµό. Κυτταροκίνες, όπως η IL-1 και ο TNF-α, µεταδίδουν το σήµα τους µέσω πρωτεϊνών της κυτταρικής µεµβράνης επηρεάζοντας, είτε αυτά καθεαυτά τα κύτταρα που εκπέµπουν το σήµα, είτε τα άµεσα γειτονικά. Είναι σχετικά µικρές πρωτεΐνες, µε µοριακή µάζα από 5-50kDa. Η ενεργός µορφή µιας κυτταροκίνης µπορεί να εµφανίζεται είτε ως µονοµερές (π.χ. IL-1β) (Σχ. 12Α), ως οµοδιµερές (π.χ. IL-8, IL-10), οµοτριµερές (π.χ. TNF-α) (Σχ. 12Β), ή ακόµα και ως ολιγοµερές (π.χ. PF-4), ενώ µικρός αριθµός εµφανίζει δραστικότητα ως ετεροδιµερές (π.χ TNF-β). Ανιχνεύονται στην κυκλοφορία του αίµατος πολλών ασθενών µε φλεγµονώδεις νόσους ενώ η ύπαρξή τους ή µη, καθώς και οι συγκεντρώσεις τους, µπορούν να αποτελέσουν ένδειξη κάποιας ασθένειας ή ακόµα και της σοβαρότητά της. ιακρίνονται σε προφλεγµονώδεις, όπως η IL-1, ο TNF και η IL-8 και αντιφλεγµονώδεις όπως η IL-4, η IL-13 και ο TGF-β. 5.2 Υποδοχείς κυτταροκινών Οι κυτταροκίνες εµφανίζουν βιολογική δράση µετά την πρόσδεσή τους σε εξειδικευµένους, υψηλής συγγένειας υποδοχείς που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια των κυττάρων στόχων. Ο αριθµός των υποδοχέων ανά κύτταρο είναι

42 Εισαγωγή 29 σχετικά χαµηλός, κυµαινόµενος από 100 έως 1000 µόρια ανά κύτταρο, ωστόσο µπορεί να αυξηθεί όταν η συγγένεια πρόσδεσης υποδοχέα-κυτταροκίνης είναι χαµηλή. Όµως η τελευταία συνήθως είναι υψηλή (χαρακτηριστική είναι η πρόσδεση της IL-1α στον υποδοχέα τύπου Ι), και η σταθερά διάστασης Kd κυµαίνεται από Μ. Β Σχήµα 12: Τριτοταγής δοµή των Α) IL-1β και Β) TNF-α ( Οι υποδοχείς των κυτταροκινών, όπως φαίνεται στο Σχήµα 13, αποτελούνται από τρεις διακριτές περιοχές µε δοµικό και λειτουργικό ρόλο: εξωκυτταρική περιοχή πρόσδεσης, στην οποία οφείλεται η εξειδικευµένη πρόσδεση των κυτταροκινών, συνήθως προς το Ν-τελικό άκρο. διαµεµβρανική περιοχή, που διασχίζει τη κυταρική µεµβράνη µέσω του υδροβοφικού τµήµατος που διαθέτει. περιοχή µεταγωγής σήµατος, που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασµα του κυττάρουστόχου και είναι υπεύθυνη για τη µεταγωγή του σήµατος, συνήθως προς το C- τελικό άκρο. Ωστόσο, δεν ακολουθούν όλοι οι υποδοχείς το παραπάνω µοντέλο. Η µεταγωγή του σήµατος πολλών κυτταροκινών πραγµατοποιείται όχι µέσου ενός µονού υποδοχέα, αλλά µέσω αλληλεπιδράσεων µε ετεροδιµερή ή οµοµοδιµερή σύµπλοκα υποδοχέων (Σχ. 13Β, C). Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί η IL-6, η οποία θα σχολιαστεί στη συνέχεια. Πολλοί υποδοχείς, όπως αυτός του TNF-α, υφίστανται ενζυµική πρωτεόλυση από MMPs. Η εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα αποκόπτεται, απελευθερώνεται στον εξωκυτταρικό χώρο και λειτουργεί πλέον ως διαλυτός υποδοχέας. Ο τελευταίος, δρα είτε ως αναστολέας, όπως στην περίπτωση της IL-1β, παρεµποδίζοντας τη δέσµευση του προσδέµατος στον υποδοχέα, είτε ως µεταφορέας του προσδέµατος στον υποδοχέα.

43 Εισαγωγή 30 Σχήµα 13 : οµή των υποδοχέων των κυτταροκινών: Α) βασικό µοντέλο υποδοχέα, Β) το πρόσδεµα-κυτταροκίνη απαιτεί την παρουσία της εξωκυτταρικής και διαµεµβρανικής περιοχής ενός δευτέρου µορίου υποδοχέα, και C) απαιτείται µόνο η παρουσία της εξωκυτταρικής-διαλυτής περιοχής ενός δευτέρου µορίου (Dinarello et al.,1999). 6. Ιντερλευκίνη 1 (IL-1) 6.1 Γενικά Η IL-1 είναι µια πολύ σηµαντική, προφλεγµονώδης κυτταροκίνη που διαθέτει πλήθος βιολογικών ιδιοτήτων. Χαρακτηριστικά, επάγει και διατηρεί την έκφραση της κυκλοοξυγονάσης-2 (COX-2) και της επαγόµενης συνθάσης του µονοξειδίου του αζώτου (inos), ενώ αυξάνει την έκφραση των µορίων προσκόλλησης, όπως τα ICAM, στο ενδοθήλιο αλλά και σε άλλες κυτταρικές επιφάνειες. Εκκρίνεται κυρίως από ενεργοποιηµένα µονοκύτταρα αλλά και από ινοβλάστες, οστεοβλάστες και καρκινικά κύτταρα. Αποτελεί ισχυρό χηµειοτακτικό παράγοντα των µακροφάγων, ενώ παράλληλα επάγει την σύνθεση του ιδίου του µορίου της από τα κύτταρα αυτά. (Mundy, 1993). Στην οικογένεια της IL-1 ανήκουν η IL-1α, η IL-1β και ο IL-1Rα, και οι τρεις προερχόµενες από το ίδιο γονίδιο. Η IL-1α και η IL-1β συντίθενται ως πρόδροµα µόρια χωρίς την παρουσία ειδικών σηµατοδοτικών πεπτιδίων έκκρισης. Στη µορφή αυτή έχουν µοριακή µάζα 31kDa, ενώ ύστερα από εξειδικευµένη πρωτεόλυση µεταπίπτουν σε ώριµα µόρια 17 kda.

44 Εισαγωγή 31 Οι δύο ισοµορφές, IL-1α και IL-1β, έχουν παρόµοια τρισδιάστατη δοµή αλλά εµφανίζουν διαφορές τόσο στη ρύθµιση της έκφρασης και σταθερότητας του mrna, όσο στη µετάφραση και έκκρισή τους. Η IL-1α αποτελεί ένα µόριο συστατικά παραγόµενο και εντοπίζεται ακόµη και σε υγιείς ιστούς, σε αντίθεση µε την IL-1β. Η πρόδροµη µορφή της είναι πλήρως ενεργή, σε αντιδιαστολή µε αυτή της IL-1β, που απαιτεί εξειδικευµένη πρωτεόλυση από µια ενδοκυτταρική πρωτεϊνάση, την ICE (IL- 1β-converting enzyme). Ο ανταγωνιστής του υποδοχέα της IL-1 (IL-1Rα) απαντά σε δύο µορφές, τη γλυκοζυλιωµένη (22 kda) και µη (17kDa). Εξαιτίας της δοµικής οµοιότητάς του µε τις άλλες µορφές της IL-1 δεσµεύεται στον υποδοχέα, παρεµποδίζοντας έτσι τη δράση τους. Χαρακτηρίζεται ως µια αντιφλεγµονώδης κυτταροκίνη, χωρίς να αποτελεί µια πρωτεΐνη-αγωνιστή, αφού η δράση του είναι έµµεση. Η συµπεριφορά του µοιάζει µε αυτή των πρωτεϊνών οξείας φάσης (APP-acute phase proteins), οι οποίες παράγονται κυρίως από ηπατοκύτταρα σε απόκριση κυτταροκινών, όπως η IL-1 και ο TNF-α, αλλά κυρίως η IL-6, µε αποτέλεσµα να εµφανίζει αυξηµένα επίπεδα στον ορό κατά τη διάρκεια φλεγµονωδών και µη καταστάσεων. 6.2 Υποδοχείς της IL-1 Υπάρχουν δύο τύποι υποδοχέων: ο τύπου Ι (IL-1RΙ), ο οποίος είναι υπεύθυνος για τη µεταγωγή του σήµατος, και ο τύπου ΙΙ (IL-1RΙΙ). Η IL-1 προσδένεται αρχικά στον IL-1RΙ προκαλώντας του δοµικές αλλαγές. Σχηµατίζεται τότε ένα σύµπλοκο IL-1/IL-1RΙ, στο οποίο δεσµεύεται η συµπληρωµατική πρωτεΐνη IL-1RAcP (IL-1 accessory protein), για να δηµιουργηθεί τελικά το ετερογενές σύµπλοκο IL-1/IL- 1RΙ/ IL-1RAcP. Αυτό, στρατολογεί την σχετιζόµενη µε τον υποδοχέα της IL-1 κινάση, IRAK (IL-1 receptor associated kinase), η οποία αλληλεπιδρά µε τις παρακείµενες περιοχές Toll και οδηγεί τελικά στη µεταγωγή του σήµατος. Αν και στο Σχήµα 14 παρουσιάζεται µόνο η IL-1β, το ίδιο µοντέλο ακολουθούν η IL-1α και ο IL-1Rα, αν και ο τελευταίος δεν έχει την ικανότητα µεταγωγής σήµατος. Ο υποδοχέας τύπου ΙΙ διαθέτει µια µικρή κυταροπλασµατική περιοχή, που δεν έχει Toll περιοχές, οπότε και δεν συµµετέχει στη µεταγωγή σήµατος. Τότε, καλείται υποδοχέας «δόλωµα» (Colotta et al., 1994), αφού εµποδίζει την πρόσδεση της IL-1 στον IL-1RΙ. Το ίδιο αποτέλεσµα έχει και η πρόσδεσή της στο διαλυτό τύπο IL-1RΙΙ.

45 Εισαγωγή 32 Σχήµα 14: Η IL-1β ενεργοποιεί ένα κύτταρο (Dinarello et al., 1999). 6.3 Μονοπάτια µεταγωγής σήµατος Όπως αναφέρθηκε, η δέσµευση της IL-1 στον υποδοχέα της οδηγεί στη στρατολόγηση πρωτεϊνών, όπως η IL-1RAcP και ενεργοποίηση κινασών, όπως οι IRAK1 και 2. Σηµαντική στο σηµείο αυτό είναι η ενεργοποίηση µιας πρωτεΐνης που καλείται TRAF6. Αυτή αποτελεί µέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών που σχετίζονται µε τον υποδοχέα του TNF, TRAF (TNF receptor associated factor), χωρίς όµως να δεσµεύεται στον υποδοχέα του TNF. Η ενεργοποίηση της TRAF6 οδηγεί σε δύο µονοπάτια µεταγωγής σήµατος (Σχ. 15). Σύµφωνα µε το πρώτο πραγµατοποιείται ενεργοποίηση των AP-1 µεταγραφικών παραγόντων µέσω των MAP κινασών. Η ενεργοποιηµένη TRAF6 σε συνδυασµό µε την TAB2 (Tak binding protein) οδηγεί σε ενεργοποίηση των MAPKK κινασών, TAK1 (transforming-growth-factor-β activated kinase 1) και Raf, που µε τη σειρά τους ενεργοποιούν τις MAPK κινάσες, MKK6, MKK4, MKK7 και MEK1. Οι τελευταίες, ενεργοποιούν τις MAP κινάσες, p38, JNK και ERK οι οποίες µεταναστεύουν στον πυρήνα. Εκεί ενεργοποιούν τους µεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας AP-1, c-jun και c-fos. Οι τελευταίοι, όπως αναφέρθηκε προηγούµενα, κατέχουν σηµαντική θέση στη µεταγραφική ρύθµιση των MMPs (Σχ. 16).

46 Εισαγωγή 33 Σχήµα 15: Σηµατοδοτικά µονοπάτια της IL-1 ( Σχήµα 16: Μονοπάτι ενεργοποίησης του AP-1 από IL-1 (Vincenti and Brinckerhoff, 2002)

47 Εισαγωγή 34 Εναλλακτικά, η TRAF6, µέσω των TAB2 και TAK1, ενεργοποιεί το µονοπάτι του NF-κB το οποίο θα αναπτυχθεί αναλυτικότερα στη συνέχεια. Όπως προαναφέρθηκε, οι MKKKs ρυθµίζονται από τις µικρές πρωτεΐνες G (Ras, Rac και Cdc42) (Widmann et al.,1999). Επιπλέον, µελέτες δείχνουν την εµπλοκή της Rac1 στην ενεργοποίηση των JNK και p38 κινασών από την IL-1 (Zhang et al., 1995; O Neill et al., 1997). Είναι πιθανή δηλαδή η συµµετοχή των µικρών πρωτεϊνών G στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL Παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) 7.1. Γενικά Ο TNF-α ανήκει σε µια οικογένεια πρωτεϊνών τα µέλη της οποίας φαίνονται στον Πίνακα 3. Συντίθενται ως πρόδροµο µόριο µοριακής µάζας 26kDa που στερείται σηµατοδοτικού πεπτιδίου. Η µεµβρανοσύνδετη αυτή πρωτεΐνη υφίσταται ενζυµική πρωτεόλυση από ένα ένζυµο διάσπασης καλούµενο TACE (TNF-α converting enzyme) και προκύπτει η διαλυτή της µορφή, µοριακής µάζας 17kDa, η οποία εύκολα ολιγοµερίζεται για να δηµιουργήσει ένα ενεργό οµοτριµερές µόριο. Παράγεται από πολλούς κυτταρικούς τύπους, όπως Β και Τ κύτταρα, µονοκύτταρα, µακροφάγα, ινοβλάστες, κερατινοκύτταρα καθώς και καρκινικά κύτταρα. Σε φυσιολογικές καταστάσεις το ποσό του TNF-α µόλις που ανιχνεύεται, ενώ εκκρίνεται σε µεγάλο βαθµό από ενεργοποιηµένα µακροφάγα. Εµπλέκεται σε διαδικασίες όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, ο µεταβολισµός και η απόπτωση πολλών διαφορετικών κυττάρων. Όπως η IL-1 επάγει την ανοσοαπόκριση. Για παράδειγµα, επάγει την παραγωγή κυτταροκινών όπως η IL-1, η IL-6 και η συνθάση του NO, ενώ αναστέλλει την παραγωγή κολλαγόνου Υποδοχείς Ο TNF-α µεταδίδει το σήµα του µέσω δέσµευσης του προσδέµατος σε δύο είδη υποδοχέων. Τον τύπου Ι (TNF-RΙ: p60 ή p65), και τον τύπου ΙΙ (TNF-RΙΙ: p80 ή p75). Και οι δύο είναι διαµεµβρανικές γλυκοπρωτεΐνες µε επαναναλαµβανόµενες δοµές κυστεΐνης στην εξωκυτταρική Ν-τελική περιοχή. Ο TNF-RΙ απαντάται σε αφθονία και είναι συστατικά παραγόµενος, σε αντίθεση µε τον TNF-RΙΙ που είναι επαγόµενος. Και οι δύο τύποι υπόκεινται σε πρωτεολυτική διάσπαση από

48 Εισαγωγή 35 µεταλλοπρωτεϊνάσες και αποχωρίζονται από την επιφάνεια των κυτάρων. ρουν τότε ως φυσικοί αναστολείς, αφού διατηρούν την ικανότητα δέσµευσης του TNF-α. Οι δύο υποδοχείς διαφέρουν, τόσο στη συγγένεια δέσµευσης, όσο και στα ενδοκυτταρικά σηµατοδοτικά µονοπάτια. Φαίνεται, πως ο TNF-RΙ είναι ο αρµόδιος για τη µεταγωγή του σήµατος, ενώ ο TNF-RΙΙ είναι πιθανόν να µεταφέρει τον TNF-α στον υποδοχέα του (Ksontini et al., 1998) ή ακόµα και να δρα ως υποδοχέας «δόλωµα» (Peschon et al., 1998). Πίνακας 3: Μέλη της υπεροικογένειας του TNF και οι υποδοχείς τους (Dinarello et al.,1999). 7.3 Μονοπάτια µεταγωγής σήµατος Η δέσµευση του TNF-α στον υποδοχέα του, σε αντιστοιχία µε αυτή της IL-1, σηµατοδοτεί τόσο την ενεργοποίηση των JNK κινασών όσο και του παράγοντα NFκB. Σύµφωνα µε το πρώτο µονοπάτι ενεργοποιείται αρχικά µια κινάση, η GCK (germinal center kinase), η οποία φωσφορυλιώνει την MEKK1. Η ενεργοποιηµένη

49 Εισαγωγή 36 πλέον MEKK1 φωσφορυλιώνει µέλη της οικογένειας των MAP κινασών, όπως οι JNK και οι p38. Οι τελευταίες ρυθµίζουν τη µεταγραφή µέσω φωσφορυλίωσης των µεταγραφικών παραγόντων c-jun και ATF. Το δεύτερο, και πιο συχνά απαντώµενο, µονοπάτι περιλαµβάνει ενεργοποίηση ενός πυρηνικού παράγοντα που φαίνεται να εµπλέκεται σε πλήθος διεργασιών, του πυρηνικού παράγοντα κβ (Σχ.17). Σχήµα 17: Σηµατοδοτικά µονοπάτια του TNF-α ( Πυρηνικός παράγοντας κb (NF-κB) O NF-κB είναι µια ετεροδιµερής πρωτεΐνη που αναγνωρίστηκε το 1986 στον πυρήνα των Β κυττάρων ως ένας παράγοντας που δεσµεύεται στον ενισχυτή της κ αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (Sen et al., 1986). Σήµερα, είναι γνωστό ότι εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους κυτταρικούς τύπους και σε ένα µεγάλο εύρος οργανισµών (Karin et al., 2005). Στην ενεργό του µορφή ρυθµίζει την έκφραση γονιδίων που συµµετέχουν σε ανοσο- ή φλεγµονώδεις αποκρίσεις, ενώ φαίνεται να εµπλέκεται στην απόπτωση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και την καρκινογένεση (Baldwin, 1996). Στόχους του αποτελούν τα γονίδια κυτταροκινών, χηµειοκινών, µορίων προσκόλλησης αλλά και πρωτεϊνασών, όπως η MMP-9. Χαρακτηριστικό είναι, ότι ρυθµίζει την έκφραση µελών της οικογένειας NF-κB, αλλά και αυτής των αναστολέων του, IκB (Aggarwal, 2004).

50 Εισαγωγή 37 Ο NF-κB αποτελείται από ετερο- ή οµο-διµερή των NF-κB1 (p50/105), NF-κB2 (p52/p100), RelA (p65), RelB, και c-rel (Rel), τα πέντε µέλη της οικογένειας των µεταγραφικών παραγόντων Rel. Οι πρωτεΐνες p50 και p52 προκύπτουν ύστερα από, επαγόµενη από φωσφορυλίωση, διάσπαση των p105 και p100 αντίστοιχα. Σε µη διεγερµένα κύτταρα ο NF-κB εντοπίζεται στο κυτταροδιάλυµα ως ετεροδιµερές των p50 και p65, δεσµευµένος µε τον αναστολέα του IκB. Ο τελευταίος, που ανήκει σε µια κατηγορία πρωτεϊνών µε επαναλαµβανόµενες δοµές αγκυρίνης, εµποδίζει τη µετανάστευση του NF-κB στον πυρήνα. Επτά µέλη του έχουν αναγνωριστεί: IκB-α, IκB-β, IκB-γ, IκB-ε, BLC3, p100 και p105. Ενεργοποίηση του NF-κB από κυτταροκίνες, όπως η IL-1 και ο TNF-α, οδηγεί σε αποικοδόµηση του IκB και µετανάστευση του NF-κB στον πυρήνα όπου ρυθµίζει τη µεταγραφή γονιδίων που περιέχουν την οµόφωνη κb αλληλουχία 5 -GGGPuNNPyPyCC-3 (Pu: πουρίνη και Py: πυριµιδίνη) Ρυθµιστικά µονοπάτια Όπως ήδη αναφέρθηκε, ο NF-κB ενεργοποιείται από διάφορα ερεθίσµατα. Παράγοντες, όπως η IL-1 και ο TNF-α, διεγείρουν το «κανονικό», όπως αναφέρεται, µονοπάτι ενώ ο CD40, ο BAFF (B-cell activating factor) και η LT-β (lymphotoxin-β) το «µη κανονικό» (Coope et al., 2002; Claudio et al., 2002). Σύµφωνα µε το πρώτο µονοπάτι (Σχ. 18), διέγερση από τον TNF-α προκαλεί τη δέσµευση των προσαρµοστικών πρωτεϊνών TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor-2), και RIP (Receptor-Interacting Protein) στην περιοχή TRADD (TNF- Associated Receptor Death Domain) του υποδοχέα και στρατολόγηση του συµπλέγµατος IKK (IκB kinase) (Devin et al., 2000). Το σύµπλεγµα αυτό, που αποτελείται από δύο καταλυτικές υποµονάδες κινάσης, IKKα, IKKβ, και τη ρυθµιστική υποµονάδα IKKγ, φωσφορυλιώνει τις IκB-α και IκB-β σε δύο κατάλοιπα σερίνης. Η φωσφορυλίωση οδηγεί σε πολυουβικιτινυλίωση του IκB, αποικοδόµησή του από το 26S πρωτεόσωµα και µετανάστευση του NF-κB στον πυρήνα όπου ρυθµίζει την έκφραση γονιδίων-στόχων. Η ενεργοποίηση του συµπλέγµατος IKK πραγµατοποιείται από κινάσες όπως οι NIK (NF-κB inducing kinase), η MEKK1 (µέλος του µονοπατιού των ERK κινασών), η PKC και η Akt (ή PKB) (Karin et al., 2005). Για παράδειγµα, η IKKα ενεργοποιείται από τον TNF-α µέσω του καταρράκτη PI 3 K-Akt, ενώ η IKKβ µέσω των κινασών p38 (Mayo et al., 2002).

51 Εισαγωγή 38 Σχήµα 18 : Μονοπάτια ενεργοποίησης του NF-κB (Okamoto, 2006) Κατά το «µη κανονικό» µονοπάτι (Σχ. 18), οι προσαρµοστικές πρωτεΐνες TRAF2, -3 και -6 σχηµατίζουν σύµπλοκο µε τον CD40 και ενεργοποιούν τις NIK και ένα οµοδιµερές IKKα. Το τελευταίο φωσφορυλιώνει τον παράγοντα p100 ο οποίος ουβικιτινυλιώνεται και αποικοδοµείται. Η προκύπτουσα υποµονάδα p52 δεσµεύεται στον RelB και το ετεροδιµερές µεταναστεύει στον πυρήνα όπου και ρυθµίζει την έκφραση των γονιδίων-στόχων (Senftleben et al., 2001). Εκτός από τη φωσφορυλίωση του IκB, η ενεργοποίηση του NF-κB απαιτεί τη φωσφορυλίωση του p65. Έχει παρατηρηθεί ότι η PKA φωσφορυλιώνει τον p65 στη Ser276 και αυξάνει τη µεταγραφική δράση του NF-κB µέσω της πρωτεΐνης CBP (CREB-binding protein) και του συνενεργοποιητή p300. Η ίδια Ser φωσφορυλιώνεται από την JNK κινάση MSK1, ύστερα από TNF-α διέγερση, και ενεργοποιεί τον NF-κB (Zhong et al.,1997). Ο NF-κB επάγει την έκφραση των IL-1 και TNF-α, ενώ τα ίδια µόρια διεγείρουν το µονοπάτι του NF-κB, δηµιουργώντας έτσι ένα φαύλο κύκλο που διαιωνίζει τις φλεγµονώδεις αποκρίσεις (Okamoto et al., 2005). Μελέτες δείχνουν ότι τα µονοπάτια NF-κB και AP-1/MAPK είναι ενεργοποιηµένα σε µακροφάγα και ινοβλάστες αρθρώσεων ανθρώπων µε RA (Badger et al., 1996; Aupperle et al., 1999). Ταυτόχρονα, τα µονοπάτια αυτά παίζουν σηµαντικό ρόλο στην, επαγόµενη

52 Εισαγωγή 39 από κυτταροκίνες, έκφραση του γονιδίου της MMP-1 (Vincenti et al., 1998a; Bondeson et al., 1999; Ridley et al., 1997) Η επαγόµενη από IL-1 έκφραση του γονιδίου της MMP-1 πραγµατοποιείται µέσω των µονοπατιών p38 και ERK καθώς και τη στρατολόγηση των µεταγραφικών παραγόντων c-jun, c-fos και JunD. Φαίνεται επίσης πως το µονοπάτι του NF-κB είναι απαραίτητο στην επαγόµενη από IL-1 µεταγραφή της MMP-1. Τα αποτελέσµατα αυτά, δείχνουν αλληλεπίδραση NF-κB και AP-1 στον υποκινητή της MMP-1 (Barchowsky et al., 2000). 8. Ιντερλευκίνη 6 (IL-6) Η ιντερλευκίνη 6 είναι µέλος µιας υπεροικογένειας κυτταροκινών (Πίνακας 4) και εµφανίζει τόσο προ- όσο και αντιφλεγµονώδεις δράσεις. Σηµαντικότερες, η ενεργοποίηση της έµφυτης ανοσίας και η ρύθµιση του αιµοποιητικού συστήµατος. Παράγεται από πολλούς κυτταρικούς τύπους. Οι κύριες πηγές της είναι τα διεγερµένα µακροφάγα, οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Παράγεται ακόµα από Τ- και Β-λεµφοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, λεία µυϊκά κύτταρα, ηωσινόφιλα, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες και διεγερµένα κερατινοκύτταρα (Heinrich et al., 1990; Helle et al., 1988). Την παραγωγή της από τα παραπάνω κύτταρα επάγουν άλλες κυτταροκίνες, όπως η IL-1 και ο TNF-α, ενώ η ίδια δρα κατασταλτικά στην έκφραση των IL-1 και TNF-α. Ο TGF-β φαίνεται να διεγείρει την παραγωγή της σε ινοβλάστες πνεύµονα και αρθρικού υµένα (Eickelberg et al., 1999a), ενώ η ίδια επάγει την έκφραση του TIMP- 1 σε χονδροκύτταρα και ινοβλάστες από άνθρωπο και µπλοκάρει την κολλαγονολυτική δράση της της IL-1β (Silacci et al., 1998). Στην RA, τα επίπεδα της IL-6 είναι υψηλά και σχετίζονται µε τη σοβαρότητα της νόσου, αν και παραµένει αδιευκρίνιστο το αν συµµετέχει στην εξέλιξη και παθογένεια της νόσου ή αν δρα ως ένας ενδοκρινής µεσολαβητής των αποκρίσεων της RA, όπως η ηπατική απόκριση οξείας φάσης (hepatic acute phase response) (Robak et al., 1998; Eickelberg et al., 1999b). Πίνακας 4: Μέλη της υπεροικογένειας της IL-6 (Dinarello et al.,1999). Inteleukin-6 (IL-6) Inteleukin-11 (IL-11) Ciliary neurotropic factor (CNTF) Oncostatin M (OSM) Leukemia inhibitory factor (LIF) Cardiotrophin-1 (CT)

53 Εισαγωγή Υποδοχέας της IL-6 Όπως σηµειώθηκε παραπάνω, η IL-6 µεταδίδει το σήµα της µέσω ενός ετεροµερούς συµπλόκου του υποδοχέα. έσµευση της IL-6 στον υποδοχέα της σχηµατίζει ένα σύµπλοκο IL-6/IL-6R το οποίο ενώνεται µε µια πρωτεΐνη µεταγωγής σήµατος, την gp130. Το σχηµατισθέν σύµπλοκο IL-6/IL-6R/gp130 δεσµεύεται σε ένα δεύτερο οπότε και πραγµατοποιείται µεταγωγή του σήµατος (Σχ. 19). Με δεδοµένο ότι ο IL-6R δεν διαθέτει µια ενδοκυτταρική περιοχή µεταγωγής σήµατος δεν είναι απαραίτητο να είναι µεµεβρανοσύνδετος. Αντίθετα, ο διαλυτός IL-6R µπορεί να δεσµεύει την IL-6 και να δρα µέσω της gp130. Σχήµα 19 : Υποδοχέας της IL-6 (Dinarello et al.,1999). 8.2 Σηµατοδοτικά µονοπάτια Η πρωτεΐνη gp130 αποτελεί χαρακτηριστικό µέλος της οικογένειας των υποδοχέων της IL-6. Η διέγερσή της οδηγεί σε ενεργοποίηση των JAK κινασών που φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τους STAT µεταγραφικούς παράγοντες, ιδιαιτέρως τους STAT3 και STAT1. Οι τελευταίοι, προσδένονται σε αντίστοιχα ρυθµιστικά στοιχεία και επηρεάζουν τη µεταγραφή. Η ενεργοποίηση των JAK φαίνεται επίσης να επικοινωνεί µε το µονοπάτι των πρωτεϊνών Ras. Μέσω αυτού πραγµατοποιείται φωσφορυλίωση των MEK και MAP κινασών οι οποίες ενεργοποιούν µεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Elk-1 και ο NF-IL-6 (C/EBP-beta).

54 Εισαγωγή 41 Τα παραπάνω, σε συνδυασµό µε την ενεργοποίηση του AP-1 και SRF, προκαλούν τις διαφορετικές δράσεις της IL-6 (Σχ. 20). Σχήµα 20 : Σηµατοδοτικά µονοπάτια της IL-6 ( 9. Αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού β (TGF-β) 9.1 Γενικά Ο TGF-β είναι µια εκκρινόµενη κυτταροκίνη µε ποικίλες βιολογικές λειτουργίες όπως ο πολλαπλασιασµός, η διαφοροποίηση, η µετανάστευση και η απόπτωση. Η υπεροικογένεια του TGF-β περιλαµβάνει περισσότερα από 30 µέλη, τα κυριότερα των οποίων φαίνονται στο Σχήµα 21. Ανακαλύφθηκε το 1983 εξαιτίας της ικανότητάς του να µετασχηµατίζει ινοβλάστες ποντικού και αρχικά ονοµάστηκε SGF (sarcoma growth factor) (Anzano et al.,1983; Roberts et al.,1983). Παράγεται κυρίως από Τ-κύτταρα αλλά και από αιµοπετάλια, µακροφάγα, ουδετερόφιλα και καρκινικά κύτταρα. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί τρεις ισοµορφές του, TGF-β1, -β2, -β3, οι οποίες προέρχονται από διαφορετικά γονίδια και χρωµοσώµατα (Roberts, 1998). Συντίθεται αρχικά ως ένα µεγάλης µοριακής µάζας πρωτεϊνικό σύµπλεγµα, που αποτελείται από το ώριµο διµερές µόριο του TGF-β, το προπεπτίδιο LAP (latency associated protein) και την πρωτεΐνη δέσµευσης LTBP (latent TGF-β binding

55 Εισαγωγή 42 protein). Ενζυµική πρωτεόλυση µε πλασµίνη, απογλυκοζυλίωση ή αλληλεπίδραση του προπεπτιδίου µε την ιντεγκρίνη ανβ6 οδηγούν στην ενεργοποίηση του TGF-β (Koli et al., 2001) (Σχ. 22). Σχήµα 21: Μέλη της υπεροικογένειας του TGF-β (Chin et al., 2004) Α Β Σχήµα 22: Α) Ενεργοποίηση της πρόδροµης µορφής του TGF-β (Massagué and Chen, 2000) σε ώριµο διµερές µόριο Β) Τριτοταγής δοµή του TGF-β (Daopin et al., 1992) 9.2 Υποδοχείς Το λειτουργικό σύµπλοκο της οικογένειας των υποδοχέων του TGF-β αποτελείται από δύο τύπου Ι (TβRI) και δύο τύπου ΙΙ (TβRIΙ) διαµεµβρανικούς υποδοχείς Ser/Thr. Ο TβRI έχει µια χαρακτηριστική αλληλουχία Gly-Ser (GS) ανοδικά της περιοχής κινάσης. Μέχρι σήµερα έχουν ταυτοποιηθεί, στα θηλαστικά, πέντε υποδοχείς τύπου ΙΙ και επτά τύπου Ι, γνωστοί και ως ALKs (Activin-receptor-like kinases) (Miyazono et al., 2001). Απουσία του προσδέµατος και οι δύο τύποι

56 Εισαγωγή 43 υπάρχουν ως οµοδιµερή στην κυτταρική επιφάνεια (Henis et al., 1994; Tsukazaki et al., 1998). Η σύσταση του τετραµερούς συµπλόκου του υποδοχέα καθορίζει, τόσο το είδος του προσδέµατος, όσο και το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος από το ίδιο πρόσδεµα (Derynck et al., 1997). Για παράδειγµα, ο TβRIΙ αλληλεπιδρά όχι µόνο µε τον TβRI/ALK5, ο οποίος ενεργοποιεί τις Smad2 και 3, αλλά και µε τον ALK1 που ενεργοποιεί τις Smad1 και 5 (Πίνακας 5). Πίνακας 5: Οι συνδυασµοί των υποδοχέων τύπου Ι και ΙΙ που καθορίζουν το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος (Lutz and Knaus, 2002). Συνεργοί υποδοχείς, όπως ο TβRIΙI (πρωτεογλυκάνη betaglycan) διευκολύνουν ή αναστέλλουν τη δέσµευση του προσδέµατος στον υποδοχέα (Blobe et al., 2001). Ο TβRIΙI είναι µια διαµεµβρανική πρωτεογλυκάνη που δεσµεύει και τις τρεις ισοµορφές του TGF-β. Παρόµοιος είναι και ο ρόλος πρωτεϊνών που είναι προσδεδεµένες στην κυτταρική µεµβράνη µεσω άγκυρας γλυκοζυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (GPI) (Tam et al.,1998; Simons et al., 2000), που αποµονώνουν ή παρουσιάζουν τον TGF-β στον υποδοχέα του, ενώ η ενδογλίνη (endoglin) είναι µια οµοδιµερής γλυκοπρωτεΐνη, που ρόλος της είναι να στρατολογεί άλλες πρωτεΐνες στο σύµπλοκο µεταγωγής σήµατος (Barbara et al., 1999). Τέλος, υποδοχείς όπως ο BAMBI (BMB and activin membrane bound inhibitor), καλούνται

57 Εισαγωγή 44 «ψευδοϋποδοχείς» και εξαιτίας της παρόµοιας δοµής µε τον TβRI εµποδίζουν τη δηµιουργία του ενεργού συµπλόκου των υποδοχέων και τη µεταγωγή σήµατος (Onichtchouk et al.,1999). Σχήµα 23: Βασικός µηχανισµός της ενεργοποίησης του υποδοχέα του TGF-β και των Smad (Dijke and Hill, 2004) 9.3 Βασικό µονοπάτι µετάδοσης σήµατος Όπως αναφέρθηκε, ο TGF-β µεταδίδει το σήµα του µέσω διαµεµβρανικών υποδοχέων σερίνης/θρεονίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 23, το πρόσδεµα δεσµεύεται στον συστατικά ενεργό υποδοχέα τύπου ΙΙ και προκαλεί τη στρατολόγηση του υποδοχέα τύπου Ι. Στο ετερογενές σύµπλοκο που δηµιουργείται ρόλος του TβRIΙ είναι να φωσφορυλιώσει τον TβRI σε µια περιοχή GS. Η φωσφορυλίωση ενεργοποιεί τον TβRI, όχι αυξάνοντας τη δράση του ως κινάση, αλλά δηµιουργώντας µια νέα θέση δέσµευσης των Smad πρωτεϊνών, που αποτελούν υποστρώµατά του TβRI (Huse et al., 2001). Ο ενεργοποιηµένος πλέον TβRI φωσφορυλιώνει επιλεγµένες πρωτεΐνες, καλούµενες R-Smads (Receptor Smads), στα κατάλοιπα σερίνης του C-

58 Εισαγωγή 45 τελικού τους άκρου. Οι R-Smads σχηµατίζουν τότε ετεροδιµερή ή ετεροτριµερή σύµπλοκα µε τη Smad4, η οποία δεν φωσφορυλιώνεται, και µεταναστεύουν στον πυρήνα, όπου ρυθµίζουν τη µεταγραφή των γονιδίων-στόχων, είτε µε απευθείας πρόσδεση στο DNA στο ρυθµιστικό στοιχείο SBE (Smad-binding DNA-element), είτε µέσω αλληλεπίδρασης µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες (CBP ή p300) (Piek et al., 1999; Massagué and Chen, 2000; Massagué and Wotton, 2000). Σχήµα 24: Επαγωγή της µεταγωγής του σήµατος του ΤGF-β µέσω Smad2/3/4 και καταστολής της µεταγωγής του σήµατος από τις Smad7 και Smurf1/2 (Dijke and Hill, 2004) Πρωτεΐνες, όπως η SARA (Smad anchor for receptor activation) (Goto et al., 2001), η Dab2 (disabled-2) (Hocevar et al., 2001) και η TRAP-1 (TβRI-assosiated protein-1) (Wurthner et al., 2001) αλληλεπιδρούν µε το σύµπλοκο του υποδοχέα ή τις Smads διευκολύνοντας έτσι τη µετάδοση του σήµατος. Αντίθετα, καταστολή της µεταγωγής του σήµατος πραγµατοποιείται από την ανασταλτική Smad7, που εµποδίζει την αλληλεπίδραση των R-Smads µε τον υποδοχέα (Hayashi et al., 1997, Nakao et al., 1997). Τέλος, οι Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης, Smurf (Smad ubiquitination regulatory factors), Smurf1 και Smurf2, µεσολαβούν στην ουβικιτινυλίωση και αποικοδόµηση των R-Smads (Zhu et al., 1999; Kavsak et al., 2000) (Σχ. 24). Εκτός από τη µετάδοση σήµατος µέσω των Smad, ο TGF-β, ενεργοποιεί και άλλα µονοπάτια, όπως αυτά των MAPK κινασών. ERK, JNK και p38 ενεργοποιούνται

59 Εισαγωγή 46 παρουσία του TGF-β, µε αδιευκρίνιστο µηχανισµό, και πιθανώς οδηγούν στην ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων c-jun και ATF-2, υποστρώµατα των JNK και p38 αντίστοιχα. Η ενεργοποίηση, τέλος, της TAK (µέλος των MAPKKK) οδηγεί σε επαγωγή της σηµατοδότησης µέσω NF-κB (Yue and Mulder, 2000; Yamaguchi et al., 1999). (Σχ. 25) Σχήµα 25: Επικοινωνία µεταξύ των µονοπατιών των Smads και των ΜΑΡ κινασών (Massagué, 2000) SMADs Οι Smad πρωτεΐνες είναι τα µόνα γνωστά, µέχρι σήµερα, υποστρώµατα του TβRI και οι µόνες που µεταδίδουν το σήµα κατευθείαν από τους υποδοχείς στην πυρηνική µεταγραφική συσκευή. Στα θηλαστικά έχουν ταυτοποιηθεί οκτώ µέλη της οικογένειας Smad, που βάσει των δοµικών και λειτουργικών ιδιοτήτων τους, χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες : R-Smads (receptor activated Smads): Αυτές φωσφορυλιώνονται από υποδοχείς τύπου Ι και περιλαµβάνουν τις Smad1,-5,-8, και τις Smad2 και -3 που ενεργοποιούνται από τις BMP και τον TGF-β, αντίστοιχα. Co-Smad (common mediator Smad): Περιλαµβάνει τη Smad4, η οποία δεν φωσφορυλιώνεται, αλλά ολιγοµερίζεται µε τις ενεργοποιηµένες R-Smads.

60 Εισαγωγή 47 Ι-Smads (inhibitory Smads): Περιλαµβάνει τις Smad6 και 7, οι οποίες ανταγωνίζονται τη δράση των R- Smads (Itoh et al., 2000). Οι R-Smads και η Smad4 αποτελoύνται από µια συντηρηµένη περιοχή στο Ν- τελικό τους άκρο, την MH1 (Mad homology 1) και µια δεύτερη, την MH2 (Mad homology 2), στο C-τελικό άκρο, που συνδέονται µε µια ενδιάµεση περιοχή-συνδέτη (linker region). Οι MH1 και MH2 εµφανίζουν σφαιρικές δοµές και συνδέονται µε µια περιοχή που ποικίλει σε µήκος, αλλά είναι πλούσια σε προλίνη. Οι Ι-Smads δεν διαθέτουν την MH2 παρά µόνο την MH1 περιοχή (Itoh et al., 2000). Όλες οι πρωτεΐνες Smad δεν έχουν ενζυµική δραστικότητα, και η δράση τους είναι συνέπεια αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και πρωτεΐνης-dna µέσω διακριτών λειτουργικών περιοχών τους (Σχ. 26). Τέλος, η φωσφορυλίωση των Smad δεν πραγµατοποιείται µόνο από τους υποδοχείς τύπου Ι, αλλά και από κινάσες όπως οι ERK, µέσω του µονοπατιού των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης (Kretzschmar et al., 1999; Funaba et al., 2002), οι JNK (Engel et al., 1999), η κινάση CamKII (Wicks et al., 2000) αλλά και η PKC (Yakymovych et al., 2001). Μέχρι σήµερα, µόνο λίγα σηµεία δέσµευσης των Smad πρωτεϊνών σε ρυθµιστικά στοιχεία έχουν ταυτοποιηθεί. Γονίδια όπως ο ενεργοποιητής του πλασµινογόνου-1 (PAI-1) και η MMP-1, που επηρεάζονται από τον TGF-β µέσω του AP-1 στοιχείου, όπως πιστευόταν (Mauviel et al., 1996; Chung et al., 1996), µπορεί να ρυθµίζονται και µέσω ρυθµιστικών στοιχείων των Smad. Είναι πιθανόν να υπάρχει αλληλεπίδραση των Smad/AP-1 ως απόκριση στον TGF-β (Verrecchia et al., 2001). 9.4 Βιολογικές δράσεις του TGF-β Ο TGF-β είναι ένας πολυλειτουργικός αναπτυξιακός παράγοντας µε µεγάλο εύρος δράσεων σε ποικιλία κυτταρικών τύπων. Συγκεκριµένα, µπορεί να επηρεάσει την κυτταρική ανάπτυξη είτε ως ενεργοποιητής είτε ως αναστολέας. Έχει βρεθεί ότι διεγείρει την έκφραση της MMP-13 (Uria et al., 1998) αλλά αναστέλλει αυτή των MMP-1, MMP-3 και MMP-9. Μειώνει επίσης, την επαγόµενη από κυτταροκίνες όπως η IL-1 και ο TNF-α, αλλά και αυξητικούς παράγοντες όπως ο EGF και ο bfgf, έκφραση της MMP-1 (Edwards et al., 1996; Mauviel et al., 1996). Επιπλέον, είναι σε θέση τόσο να διεγείρει όσο και να καταστείλλει την ανοσοαπόκριση. Στην RA φαίνεται να έχει προστατευτικό ρόλο αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασµό των λεµφοκυττάρων (Wahl et al., 1988; Kehrl et al., 1986) και τη δράση των µακροφάγων (Tsunawaki et al., 1988; Espevik et al., 1987). Ανταγωνίζεται επίσης τις βιολογικές δράσεις της IL-1. Για παράδειγµα, αναστέλλει τον

61 Εισαγωγή 48 επαγόµενο από IL-1 πολλαπλασιασµό των λεµφοκυτάρων και την έκφραση του υποδοχέα της IL-1 (Dubois et al., 1990), ενώ διεγείρει την έκφραση του ανταγωνιστή του υποδοχέα της IL-1 (IL-1Rα) σε µονοκύτταρα από άνθρωπο (Wahl et al., 1993). Σχήµα 26: οµική οργάνωση και ρόλος των περιοχών των Smads. Φαίνονται επίσης και πιθανοί διαφορετικοί στόχοι φωσφορυλίωσης από ERK και JNK κινάσες αλλά και από CamKII και PKC (Derynck and Zhang, 2003) Ο ακριβής µηχανισµός δράσης του TGF-β παραµένει άγνωστος. Ο AP-1 είχε αναγνωριστεί ως µεταγραφικός στόχος του TGF-β πριν ακόµα γίνει γνωστό το µονοπάτι του (Petrovaara et al., 1989; Mauviel et al., 1993; Kim et al., 1990). Σήµερα είναι γνωστό πως η παρουσία του TGF-β αρχικά οδηγεί σε αλληλεπίδραση Smad3/DNA, η οποία δεν είναι πλέον ανιχνεύσιµη µετά την πάροδο τριών ωρών (Vindevoghel et al.,1998). Αντίθετα, οι c-jun και JunB επάγονται αργότερα (Mauviel et al., 1996). Η επαγωγή αυτή είναι πιθανό να εξαρτάται από την αρχική δέσµευση των Smad, αφού τα ρυθµιστικά στοιχεία αυτών είναι απαραίτητα για την, εξαρτώµενη από τον TGF-β, ενεργοποίηση των υποκινητών των c-jun και JunB (Jonk et al., 1998; Wong et al., 1999). 10. Επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (EGF) Ο EGF (epidermal growth factor) αποτελεί ένα πολυπεπτίδιο 6 kda το οποίο διεγείρει την αύξηση των επιδερµικών και άλλων επιθηλιακών κυττάρων. Προκύπτει από τη διάσπαση ενός προδρόµου µορίου, το οποίο είναι µια µεγάλη διαµεµβρανική

62 Εισαγωγή 49 πρωτεΐνη. Ο υποδοχέας του, EGFR (EGF receptor), ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων µε δράση κινάσης τυροσίνης και διαθέτει µια κυτταροπλασµατική περιοχή κινάσης, µια διαµεβρανική και µια εξωκυτταρική περιοχή δέσµευσης. Η δέσµευση του EGF προκαλεί διµερισµό και αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα, που αποτελεί και το µήνυµα για την ενεργοποίησή του (Σχ. 27). Οι δράσεις του EGF µεταδίδονται µέσω διαφόρων µονοπατιών. Για παράδειγµα, ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες Ras και το µονοπάτι των MAP κινασών που οδηγούν στη φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων c-fos και Elk-1, προκαλώντας έτσι τη διέγερση της µεταγραφής µέσω AP-1. Επιπλέον, καθοριστική είναι η ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων STAT1 και STAT3, από τις JAK κινάσες, οι οποίοι όπως αναφέρθηκε ρυθµίζουν τη µεταγραφή. Τέλος, πιθανή είναι η ενεργοποίηση της PKC µε δεδοµένο ότι ο EGF συµβάλλει στη µετανάστευση αυτής στην κυτταρική µεµβράνη (Denhardt, 1996) (Σχ. 28). Α Β Σχήµα 27: Α) οµή του υποδοχέα του EGF. B) Ενεργοποίηση του υποδοχέα µε διµερισµό και σταυρωτή φωσφορυλίωση (Lodish et al., 2004). Εκτός από τον ίδιο τον EGF, κυτταροκίνες όπως η IL-1 και ο TNF-α, προκαλούν ενεργοποίηση του υποδοχέα χωρίς και να δεσµεύονται σ αυτόν (transactivation) (Bird et al.,1989; Guy et al., 1992). Έχει παρατηρηθεί ότι παρουσία του TNF-α εµφανίζεται µια δοσο- και χρονο-εξαρτώµενη διέγερση της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (Donato et al., 1992). Επιπλέον, η IL-1 επάγει τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα µε ένα χρονο- και δοσο-εξαρτώµενο τρόπο σε κερατινοκύτταρα από άνθρωπο (Wan et al., 2001). Φαίνεται επίσης πως ο EGFR εµπλέκεται σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος µέσω ενεργοποίησης MAP κινασών και συγκεκριµένα του µονοπατιού Ras/MEK/ERK (Wan

63 Εισαγωγή 50 et al., 2001), γεγονός που οδηγεί σε ενεργοποίηση της µεταγραφής των MMPs µέσω του AP-1. Σχήµα 28: Σηµατοδοτικά µονοπάτια του EGF ( 11. Προσταγλανδίνη Ε 2 (PGE 2 ) Η PGE 2 είναι ένα εικοσανοειδές παράγωγο του αραχιδονικού οξέος που συντίθεται από τις κυκλοοξυγονάσες COX-1 και -2. Εµφανίζει ποικίλες δράσεις τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η περιοδοντίτιδα και η ρευµατοειδής αρθρίτιδα. Οι διαφορετικές δράσεις της PGE 2 µπορούν να αποδοθούν στους τέσσερεις υποδοχείς της, EP1-4. Οι EP3 και EP4 εµφανίζουν τη µεγαλύτερη συγγένεια για την PGE 2 (Kd<1nM), ενώ οι EP1 και EP2 µικρότερη (Kd >10 nm). Η PGE 2, ανάλογα µε τον κυτταρικό τύπο, εµφανίζει τόσο αντιφλεγµονώδεις όσο και προφλεγµονώδεις δράσεις. Για παράδειγµα, έχει διαπιστωθεί ότι ανταγωνίζεται ή δρα σε συνέργεια στην επαγόµενη από IL-1 και TNF-α παραγωγή των MMP-1 (DiBatista et al.,1994; Zhang et al., 1998) και TIMP-1 (Takahashi et al.,1997; DiBatista et al., 1995), αντίστοιχα. Επίσης, διεγείρει την παραγωγή οστεοκλαστών αυξάνοντας τον RANKL (Miyaura et al., 2000), ενώ καταστέλλει την παραγωγή τους µειώνοντας την έκφραση του M-CSF. Οι RANKL και M-CSF, όπως θα αναφερθεί, συµβάλλουν στην ανάπτυξη των οστεοκλαστών. Ωστόσο, είναι γενικά αποδεκτό πως η PGE 2 δρα µε ένα camp-εξαρτώµενο µηχανισµό. Αλληλεπιδρά µε

64 Εισαγωγή 51 τους δεσµευµένους µε πρωτεΐνες G υποδοχείς 7TM, ενεργοποιώντας έτσι τον καταρράκτη της αδενυλικής κυκλάσης. Το τελικό αποτέλεσµα της PGE 2 στην RA φαίνεται να οδηγεί στη µείωση της φλεγµονής και την ανακατασκευή του οστού. Μελέτες δείχνουν ότι η PGE 2 αναστέλλει την παραγωγή των προφλεγµονωδών κυτταροκινών TNF-α, IL-6 και IL-8 από ενεργοποιηµένα µακροφάγα αλλά και την έκφραση του TNF-α από ώριµα δενδριτικά κύτταρα. Η τελευταία δράση πραγµατοποιείται µέσω αναστολής της έκφρασης του µεταγραφικού παράγοντα c-jun (Faour et al., 2005). Επιπλέον, αναστέλει την επαγόµενη από IL-1 και TNF-α παραγωγή της MMP-1 σε αρθρικά κύτταρα τύπου ινοβλάστη µέσω αναστολής του µονοπατιού ERK (Pillinger et al., 2003). Την ίδια δράση εµφανίζει και σε ινοβλάστες ούλων µέσω άγνωστου όµως µονοπατιού (Lin et al., 2001). Είναι πιθανό επίσης να µειώνει την επαγόµενη απο κυτταροκίνες φλεγµονή ρυθµίζοντας το µονοπάτι του NF-κB. Μελέτες έχουν δείξει ότι παρουσία PGE 2 επιτεύχθηκε αναστολή της µετανάστευσης του p65, µέσω αναστολής των ERK κινασών και αναστολή της έκφρασης του IκBα ανεξάρτητα του µονοπατιού ERK (Gomez et al., 2005). 12. Αρθρώσεις Τα οστά συνδέονται µεταξύ τους για να σχηµατίσουν τον σκελετό διαµέσου δοµών από συνδετικό ιστό. Οι δοµές αυτές καλούνται αρθρώσεις και ταξινοµούνται στις διαρθρώσεις, οι οποίες επιτρέπουν την ελεύθερη κίνηση του οστού και στις συναρθρώσεις, των οποίων οι κινήσεις είναι πολύ περιορισµένες ή δεν γίνονται. Τα οστά σε µια συνάρθρωση µπορεί να είναι ενωµένα είτε µε οστίτη ιστό, είτε µε υαλώδη χόνδρο, είτε µε πυκνό συνδετικό ιστό. Σε µια διάρθρωση σύνδεσµοι και µια κάψα από συνδετικό ιστό συνδέουν τα άκρα των οστών. Η κάψα περικλείει ένα στεγανό αρθρικό θύλακα που περιέχει ένα άχρωµο διαφανές ιξώδες υγρό που ονοµάζεται αρθρικό υγρό. Αυτό είναι διήθηµα του πλάσµατος και περιέχει µεγάλη συγκέντρωση υαλουρονικού οξέος. Η δοµή της κάψας των διαρθρώσεων, αν και µεταβάλλεται, σε γενικές γραµµές αποτελείται από δυο στοιβάδες: µια εξωτερική (ινώδης στοιβάδα) και µια εσωτερική (αρθρικός υµένας). Ο αρθρικός υµένας παρουσιάζει πτυχές οι οποίες διεισδύουν βαθιά στο εσωτερικό της αρθρικής κοιλότητας. Η εσωτερική επιφάνεια του αρθρικού υµένα συνήθως καλύπτεται από µια στοιβάδα πλακωδών ή κυβοειδών κυττάρων. Μερικά απ αυτά τα κύτταρα έχουν έντονες φαγοκυτταρικές ιδιότητες και καλούνται Α κύτταρα

65 Εισαγωγή 52 (τύπου µακροφάγων). Αυτά έχουν εκτενές σύστηµα Golgi και πολλά λυσοσώµατα, αλλά ασήµαντο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο. Το άλλο είδος κυττάρων, που ονοµάζεται Β κύτταρα (τύπου ινοβλαστών), εµφανίζουν καλά ανεπτυγµένο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο. Προς τα έξω και πάνω απ τα κύτταρα αυτά βρίσκεται µια στοιβάδα χαλαρού ή πυκνού συνδετικού ιστού µε περιοχές λιπώδους ιστού. Η ινώδης στοιβάδα αποτελείται από πυκνό συνδετικό ιστό που είναι καλύτερα αναπτυγµένος στα µέρη που υφίστανται πιέσεις. Αυτή η στοιβάδα περιβάλλει τους συνδέσµους της άρθρωσης και µερικούς απ τους τένοντες που βρίσκονται κοντά στην άρθρωση. Ο χόνδρος είναι µια εξειδικευµένη µορφή συνδετικού ιστού του οποίου η εξωκυττάρια ουσία εµφανίζει σταθερή σύσταση. Η δοµή της ουσίας αυτής είναι υπεύθυνη για τις κυριότερες ιδιότητες του χόνδρου όπως η ελαστικότητα και η ανθεκτικότητα στις πιέσεις, η αντοχή στον εφελκυσµό, η πλαστικότητα και η σταθερότητα, ιδιότητες που τον καθιστούν ικανό να εξασφαλίσει την υποστήριξη των µαλακών ιστών αλλά και την λεία επιφάνεια των αρθρώσεων. Υπάρχουν τρία είδη χόνδρων: ο υαλώδης, ο ελαστικός και ο ινώδης χόνδρος. Και τα τρία είδη περιέχουν ελάχιστα αιµοφόρα αγγεία ενώ τα κύτταρά τους διατρέφονται µε διάχυση των θρεπτικών υλικών απ τα τριχοειδή του περιχονδρίου, όταν υπάρχει, ή απ το αρθρικό υγρό των αρθρικών κοιλοτήτων, στην περίπτωση του αρθρικού χόνδρου. Ο αρθρικός χόνδρος είναι είδος υαλώδη χόνδρου που καλύπτει την επιφάνεια των οστών στις αρθρώσεις και δεν έχει περιχόνδριο. Αποτελείται από πολύ εξωκυτταρικό υλικό και λίγα κύτταρα, καλούµενα χονδροκύτταρα, που εντοπίζονται κατά οµάδες σε κοιλότητες µέσα στο εξωκυττάριο υλικό (Junqueira et al., 1991). 13. Αρθροπάθειες Οι πιο συχνά εµφανιζόµενες ασθένειες των αρθρώσεων είναι η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) και η Ρευµατοειδής αρθρίτιδα (RA). Η πιο σηµαντική διαφορά τους έγκειται στο ότι η ΟΑ είναι αυστηρά µια τοπική βλάβη του χόνδρου της άρθρωσης, που δεν προκαλείται από φλεγµονή, ενώ η RA αποτελεί ένα συστηµατικό νόσηµα, που επηρεάζει και άλλους ιστούς και όργανα, και συνοδεύεται από εκτεταµένη φλεγµονή (Σχ. 29) Ρευµατοειδής αρθρίτιδα Η ρευµατοειδής αρθρίτιδα (RA-Rheumatoid Arthritis) είναι µια συστηµατική φλεγµονώδης νόσος, που πρωτίστως εκδηλώνεται στον αρθρικό υµένα. Η

66 Εισαγωγή 53 σοβαρότητα της RA κυµαίνεται από αυτοπεριοριζόµενη έως χρονία εξελισσόµενη νόσο, προκαλώντας ποικίλου βαθµού αρθρική καταστροφή και κλινικά εµφανή εξωαρθρική οργανική προσβολή. Η χρόνια φλεγµονώδης διαδικασία προκαλεί αλλαγές στην κυτταρική σύνθεση και στην έκφραση της γονιδιακής εικόνας του αρθρικού υµένα, καταλήγοντας σε υπερπλασία των ινοβλαστών του και πρόκληση δοµικών βλαβών του χόνδρου, του οστού και των συνδέσµων. Σχήµα 29 : Φυσιολογική και αρθριτικές διαρθρώσεις γόνατος ( Η RA έχει παγκόσµια κατανοµή και προσβάλλει όλες τις εθνικές οµάδες, ενώ το µέγιστο της συχνότητας εµφάνισης είναι µεταξύ τέταρτης και έκτης δεκαετίας της ζωής. εν υπάρχουν αναφορές που να υποστηρίζουν µια λοιµώδη αιτία, ούτε έχουν προσδιοριστεί περιβαλλοντικοί παράγοντες, που να επισπεύδουν την έναρξη της νόσου. Η πιθανότητα γενετικής προδιάθεσης για την RA έχει στηριχθεί σε παρατηρήσεις εµφάνισης RA σε µέλη οικογενειών Παθογένεια RA Με δεδοµένο ότι η RA αποτελεί ένα νόσηµα µε µη αυστηρά καθορισµένη αιτιολογία, η κατανόηση της παθογένειας είναι ίσως ο µόνος τρόπος για την επινόηση πιο ειδικών, αποτελεσµατικών και ασφαλών θεραπειών. Οι αρχικές θεωρίες ενοχοποιούσαν αποκλειστικά ένα ρευµατοειδή παράγοντα, ο οποίος βρέθηκε ότι αποτελεί αντίσωµα έναντι του Fc τµήµατος της αυτόχθονης IgG (Zfeifler, 1973). Αν

67 Εισαγωγή 54 και οι θεωρίες αυτές αµφισβητήθηκαν, πρόσφατα επανήλθαν στο προσκήνιο, µε αφορµή την ανακάλυψη ενός πειραµατικού µοντέλου αυτόµατης ανάπτυξης αρθρίτιδας σε ποντίκια που παράγουν αυτοαντισώµατα έναντι ενός κοινού αντιγόνου, της ισοµεράσης της 6Ρ-γλυκόζης (GPI) (Kouskoff et al., 1996). Το επόµενο βήµα στην διαλεύκανση της παθογένειας της νόσου, αποτέλεσε η σύνδεσή της µε τα Τ λεµφοκύτταρα. Με βάση τη θεωρία αυτή ένα άγνωστο αντιγόνο, που µπορεί να είναι ρετροϊός ή µικρόβιο ή προϊόν του, παρουσιάζεται, µέσω των πρωτεϊνών τάξης ΙΙ του MHC, σε συγκεκριµένο κλώνο Τ κυττάρων. Ωστόσο, δεν έχει βρεθεί κανένα «µοναδικό» πεπτίδιο που να παρουσιάζεται ειδικά και εκλεκτικά από τα HLA-DR αλληλόµορφα που σχετίζονται µε τη νόσο (Fox et al., 1997), ενώ η θέση του «κοινού επιτόπου» στο µόριο του HLA-DR µάλλον δεν συνηγορεί για συµµετοχή του στη αντιγονοπαρουσίαση (Stern et al., 1994). Τέλος, βιολογικές θεραπείες που στρέφονται κατά κυτταροκινών, όπως ο TNF-α, έχουν ευνοϊκή επίδραση στη νόσο (Williams et al., 1994), ενώ υπάρχουν ενδείξεις τοπικής υπερπλασίας των τύπου ινοβλάστη κυττάρων, αλλά όχι Τ κυττάρων, στον αρθρικό υµένα. Κυτταροκίνες και RA Στις αρχές του 1990 διατυπώνονται θεωρίες που εµπλέκουν αυτοκρινικές και παρακρινικές διεργασίες, µε συµµετοχή παραγόντων, όπως η IL-1 και ο TNF-α, ανεξάρτητα από τα Τ λεµφοκύτταρα. Σύµφωνα µε αυτές, υµενοκύτταρα τύπου Α (µακροφάγα) και τύπου Β (ινοβλάστες) ευρισκόµενα σε επαφή µεταξύ τους στην εσώτατη στοιβάδα του αρθρικού υµένα, παράγουν κυτταροκίνες που ενεργοποιούν τα ίδια καθώς και παρακείµενα κύτταρα, αλλά και αντιφλεµονώδεις κυτταροκίνες (Σχ. 30). Έτσι, η IL-1 και ο TNF-α, παραγόµενα αµφότερα από τα κύτταρα τύπου µακροφάγου, διεγείρουν την υπερπλασία των ινοβλαστών και την παραγωγή απ αυτούς IL-6, IL-8, GM-CSF και ενεργών µορίων όπως η στρωµαλυσίνη και η κολλαγονάση. Οι ινοβλάστες καθεαυτοί, µέσω αυτοκρινούς µηχανισµού, συµβάλλουν στην απορρύθµιση της λειτουργίας τους µε την παραγωγή FGF (fibroblast growth factor). O GM-CSF που παράγεται από τους ινοβλάστες κατά τη διέγερσή τους, αλλά και από τα µακροφάγα αυτοκρινώς, αποτελεί ισχυρό διεγέρτη της έκκρισης IL-1, TNF-α και IL-8. Ιδιαίτερα ο GM-CSF σε συνδυασµό µε τον TNF-α, επάγει την έκφραση HLA-DR στην επιφάνεια του µακροφάγου, παρακάµπτοντας έτσι πιθανόν ανάγκη για IFN-γ, που ούτως ή άλλως δεν ανευρίσκεται στη βλάβη.

68 Εισαγωγή 55 Σχήµα 30: ίκτυο κυτταροκινών στην RA. ιακρίνονται προ- (+) και αντι-(-) φλεγµονώδεις κυτταροκίνες (Firestein, 2003) Η επιτόπια παραγωγή κυτταροκινών από ινοβλάστες και µακροφάγα επάγει αγγειογένεση (FGF, TNF-α, VEGF και IL-8), έκφραση προσκολλητικών µορίων (IL-1, TNF-α) και χηµειοταξία (IL-8 και άλλες χυµοκίνες). Χαρακτηριστικό είναι ότι η χορήγηση anti-tnf-α περιλαµβάνει καταστολή άλλων προφλεγµονωδών κυτταροκινών, µείωση της κυτταρικής διήθησης του αρθρικού υµένα, αναστολή της ενεργοποίησης των οστεοκλαστών και της αγγειογένεσης (Feldmann et al., 2001). Αντιφλεγµονώδεις κυτταροκίνες εµπλέκονται επίσης στο µοντέλο αυτό, όπως IL-1Rα και IL-10, παραγόµενες κατ εξοχήν από τα µακροφάγα. Εν τούτοις δεν είναι σε θέση να ελέγξουν τη φλεγµονή, πιθανότατα γιατί η ποσότητά τους είναι ανεπαρκής (Qin et al., 1998). Η προσπάθεια καταστολής προφλεγµονωδών κυτταροκινών και ενεργών µορίων οδήγησε στη διευρεύνηση των ενδοκυτταρικών µηχανισµών, δηλαδή στο ρόλο των µεταγραφικών παραγόντων και κινασών. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, µόρια όπως ο NF-κB, οι MAP κινάσες αλλά και οι µεταγραφικοί παράγοντες AP-1 βρίσκονται ενεργοποιηµένα και συµβάλλουν σηµαντικά στη ρευµατοειδή βλάβη. Παθογενετικό µοντέλο RA Με βάση τα παραπάνω, θα µπορούσε να σχηµατοποιηθεί ένα παθογενετικό µοντέλο για την RA (Firestein and Zfeifler, 2002), που αποτελείται από διάφορα, µη διακριτά στάδια. Σύµφωνα µε αυτό (Σχ. 31), πραγµατοποιείται στα αρχικά στάδια της νόσου ενεργοποίηση των µηχανισµών έµφυτης ανοσίας, γεγονός που σηµατοδοτεί και την έναρξη της φλεγµονής. ιεγέρτες των TLRs, όπως πρωτεογλυκάνες και

69 Εισαγωγή 56 βακτηριακό DNA, έχουν βρεθεί στον ρευµατοειδή αρθρικό υµένα. Εναλλακτικά, διέγερση Fc υποδοχέων θα µπορούσε να προέλθει από αυτοαντισώµατα όπως ο ρευµατοειδής παράγοντας και αντισώµατα έναντι πεπτιδίων που περιέχουν κυκλική κιτρουλίνη. Τα διεγειρόµενα δενδριτικά κύτταρα του υµένα µεταναστεύουν τότε στους λεµφαδένες, όπου ευνοούν τη στροφή διεγερµένων Τ λεµφοκυττάρων προς τον Th1 φαινότυπο. Τα λεµφοκύτταρα αυτά, µέσω των υποδοχέων χυµοκινών, όπως CCR5, έρχονται και εγκαθίστανται στον αρθρικό υµένα. Παραγωγή κυτταροκινών και έκφραση προσκολλητικών µορίων κατά τη διέγερση µηχανισµών έµφυτης ανοσίας, επιτρέπουν τη συνεχή ροή ανοσοενεργών κυττάρων. Τέλος, πρωτεολυτικά ένζυµα, όπως οι MMPs, διεγείρονται ως απόκριση σε κυτταροκίνες, όπως η IL-1 και ο TNF-α, και συµβάλλουν στην καταστροφή της άρθρωσης. Σχήµα 31: Προτεινόµενο µοντέλο των παθογενετικών µηχανισµών στην RA (Firestein, 2003) Οστεοαρθρίτιδα Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ-osteoarthritis)) είναι η συχνότερη αρθροπάθεια σε ολόκληρο τον κόσµο και αποτελεί µια από τις κύριες αιτίες πόνου στους ηλικιωµένους (Brandt et al., 1998). Η ανάπτυξη ΟΑ εξαρτάται τόσο από συστηµατικούς παράγοντες (ηλικία, φύλο, φυλή, κληρονοµικότητα και παχυσαρκία), όσο και τοπικούς παράγοντες (ορισµένες φυσικές δραστηριότητες, τραυµατισµοί και αναπτυξιακές δυσµορφίες) (Felson et al., 1998).

70 Εισαγωγή 57 Η ΟΑ µπορεί να ορισθεί ως η προϊούσα απώλεια του αρθρικού χόνδρου, η οποία συνδυάζεται µε σκλήρυνση του υποχόνδριου οστού, οστικές αναπτύξειςοστεόφυτα- στα όρια των αρθρώσεων και ήπια χρόνια, µη ειδική φλεγµονή του υµένα (Σχ. 29). Οι αλλαγές αυτές επέρχονται σε διάφορες ιστολογικές φάσεις. Φάση Ι: Η πρώτη αναγνωρίσιµη αλλαγή στην ΟΑ είναι το οίδηµα της εξωκυττάριας ουσίας. Ο χόνδρος χάνει τη λεία του όψη, εµφανίζονται µικρές ρωγµές στην επιφάνεια και παρατηρείται απώλεια χονδροκυττάρων, που εναλλάσσεται µε περιοχές πολλαπλασιασµού των χονδροκυττάρων. Φάση ΙΙ: Οι µικρορωγµές βαθαίνουν, και στο χόνδρο που εφάπτεται µε το υποχόνδριο οστό σχηµατίζονται κάθετες σχισµές. Γύρω από τις σχισµές αυτές και στην επιφάνεια εµφανίζονται συναθροίσεις χονδροκυττάρων. Φάση ΙΙΙ: Λόγω των ρωγµών προκαλείται απόσπαση και απόπτωση τµηµάτων του χόνδρου µέσα στην αρθρική κοιλότητα, οπότε και αποκαλύπτεται το υποχονδρικό οστό και αναπτύσσονται υποχονδρικές µυκροκύστες. Τα θραύσµατα του χόνδρου προκαλούν ήπια φλεγµονή του αρθρικού υµένα. Λόγω εναπόθεσης νέου οστού υπάρχει σκλήρυνση στο υποχονδρικό οστό και δηµιουργούνται οστεόφυτα των οποίων η επιφάνεια καλύπτεται από ινώδη χόνδρο Παθογένεια ΟΑ Η ΟΑ είναι αποτέλεσµα ανεπάρκειας των χονδροκυττάρων να συνθέσουν καλής ποιότητας εξωκυττάρια ουσία καθώς και αδυναµίας τους να διατηρήσουν την ισορροπία µεταξύ σύνθεσης και αποικοδόµησης της εξωκυττάριας ουσίας. Η αλλαγή στην ποιότητα οφείλεται στην διαφοροποίηση των χονδροκυττάρων που τα οδηγεί στην παραγωγή κολλαγόνων τύπου Ι και ΙΙΙ καθώς και βραχύτερων πρωτεογλυκανών (Goldring et al., 2000). Η διαταραχή ισορροπίας προκαλείται από την αυξηµένη σύνθεση των πρωτεϊνασών, που αποικοδοµούν τα κολλαγόνα και τις αγκρικάνες καθώς και ελαττωµένη σύνθεση των φυσικών αναστολέων των µετταλοπρωτεϊνασών, των ιστικών αναστολέων των µεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs). Η µη φυσιολογική αυτή σύνθεση από τα χονδροκύτταρα συµβαίνει λόγω ενεργοποίησης από κυτταροκίνες, προσταγλανδίνες, ελεύθερες ρίζες (NO, H 2 O 2 ) και συστατικά του ίδιου του χόνδρου, όπως θραύσµατα ινοσυνδετίνης. Τα ενεργοποιηµένα χονδροκύτταρα αποκτούν την ικανότητα να συνθέτουν ορισµένες πρωτεϊνάσες και φλεγµονώδεις µεσολαβητές (IL-1, TNF-α, PGE 2 ). Ο αρθρικός υµένας συµµετέχει αφού τα κύτταρά του φαγοκυτταρώνουν τα θραύσµατα του χόνδρου, γεγονός που προκαλεί φλεγµονή του αρθρικού υµένα. Στη συνέχεια, τα οστεοαρθριτικά κύτταρα παράγουν ποικιλία µεσολαβητών, που απελευθερώνονται

71 Εισαγωγή 58 στην αρθρική κοιλότητα, όπως οι µεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) και οι κυτταροκίνες, οι οποίες µε τη σειρά τους ενεργοποιούν τα χονδροκύτταρα και διαφοροποιούν την εξωκυτταρική ουσία (Σχ. 32). Τέλος κύτταρα του οστού, όπως οι οστεοβλάστες, µπορούν να συνθέσουν πρωτεολυτικά ένζυµα. Σχήµα 32: Μεταβολές που παρατηρούνται στο χόνδρο κατά την ανάπτυξη της ΟΑ 14. Ρινικό Σύστηµα Ανατοµία ρινικού συστήµατος Το ρινικό σύστηµα συνίσταται από την εξωτερική (έξω ρις) και την εσωτερική (έσω ρις) ρίνα. Η εξωτερική ρις αποτελείται από το ριζορρίνιο, το στενό άνω άκρο που συνδέεται µε το µέτωπο, και το ακρορρίνιο, η κορυφή της ρινός µε την κάτω βασική επιφάνεια που περιλαµβάνει τους ρώθωνες ή µυκτήρες (ρουθούνια). Περιλαµβάνει οστέινο και χόνδρινο σκελετό, καλύπτεται από δέρµα και µύες ενώ η είσοδός της λέγεται και πρόδροµος (Σχ 33,34). Στην εσωτερική ρίνα βρίσκεται το ρινικό διάφραγµα, το οποίο σχηµατίζεται από δύο χόνδρους, οστά και ένα µεµβρανώδες τµήµα, που τη χωρίζει σε δύο κοιλότητες, τις ρινικές θαλάµες. Οι τελευταίες, είναι το πρώτο τµήµα του αναπνευστικού συστήµατος και χρησιµεύουν στην προετοιµασία του αναπνεόµενου αέρα που στην συνέχεια µεταφέρεται στους πνεύµονες µέσω του φάρυγγα, του λάρυγγα, της τραχείας και των βρόγχων. Οι ρινικές κοιλότητες και ο φάρυγγας ονοµάζονται από κοινού ανώτερη αναπνευστική οδός και διακρίνονται από την κατώτερη αναπνευστική οδό που αρχίζει από τον λάρυγγα. Κάθε µία αρχίζει από τον

72 Εισαγωγή 59 µυκτήρα (naris) που οδηγεί στον πρόδροµο της ρινός, συνεχίζει στην ίδια ρινική κοιλότητα και µεταπίπτει προς τα πίσω µε το οπίσθιο στόµιο ή χοάνη στον φάρυγγα. Οι ρινικές χοάνες αποτελούνται από τέσσερα τοιχώµατα, τα άνω-κάτω-έσω και έξω. Στο έξω τοίχωµα βρίσκονται οι τρεις ρινικές κόγχες: η άνω, η µέση και η κάτω. Ανάµεσα στις ρινικές κόγχες σχηµατίζονται οι τρεις ρινικοί πόροι: ο άνω που βρίσκεται κάτω από την άνω ρινική κόγχη, ο µέσος που βρίσκεται κάτω από τη µέση ρινική κόγχη και ο κάτω ρινικός πόρος που βρίσκεται κάτω από την κάτω ρινική κόγχη και σε αυτόν εκβάλλει ο ρινοδακρυϊκός πόρος, µέσω του οποίου τα δάκρυα παροχετεύονται στη ρίνα. Η εσωτερική ρις καλύπτεται από το ρινικό βλεννογόνο, ο οποίος διακρίνεται σε οσφρητικό (καταλαµβάνει την άνω ρινική κόγχη και το αντίστοιχο τµήµα του διαφράγµατος) και σε αναπνευστικό (καταλαµβάνει την υπόλοιπη ρίνα και τους παραρρινικούς κόλπους). Οι παραρρινικοί κόλποι είναι αεροφόροι χώροι, που βρίσκονται σε παρακείµενα στη ρίνα οστά, και έχουν επικοινωνία µαζί της µέσω των ρινικών πόρων. Χρησιµεύουν στη µείωση του βάρους του κρανίου, στην παραγωγή βλέννας και στη διαµόρφωση της ποιότητας της φωνής. Περιλαµβάνουν το µετωπιαίο κόλπο, που βρίσκεται στο µέσο του κατώτερου µέρους του µετώπου και το ιγµόρειο άντρο ή γναθιαίο κόλπο, που είναι ο µεγαλύτερος και βρίσκεται µέσα στην άνω γνάθο. Επίσης, τις ηθµοειδείς κυψέλες, που βρίσκονται στο ηθµοειδές οστό και αποτελούν ένα σύµπλεγµα µικρών αεροφόρων κοιλοτήτων, και το σφηνοειδή κόλπο, που βρίσκεται στο σφηνοειδές οστό και χωρίζεται σε δύο µε ένα οστέινο διάφραγµα Ρινικός Πολύποδας Η πολυποδίαση είναι µια παθολογική κατάσταση του ανώτερου αναπνευστικού συστήµατος, που χαρακτηρίζεται από σχηµατισµό µορφωµάτων στις ρινικές κοιλότητες, που καλούνται ρινικοί πολύποδες. Το συνηθέστερο σηµείο έναρξης είναι το ιγµόρειο άντρο. Οι ρινικοί πολύποδες (ΡΠ), οι οποίοι εµφανίζονται συνήθως και στις δύο κοιλότητες ως λείοι καλοήθεις όγκοι σε σχήµα δακρύου, αντανακλούν το αποτέλεσµα της συσσώρευσης φλεγµονωδών κυττάρων, υγρών και οιδηµατώδους συνδετικού ιστού. Συγκεκριµένα, χαρακτηρίζονται από χρόνια φλεγµονώδη αντίδραση σε µία ποικιλία ερεθισµάτων και έντονη ανάπλαση ιστού µε αποτέλεσµα τη διόγκωση του επιθηλίου, την ανάπτυξη χαρακτηριστικών µορφωµάτων, που καλύπτονται από στρώµα βλέννας, και την απόφραξη των ανωτέρω αναπνευστικών οδών (Σχ. 35).

73 Εισαγωγή 60 Σχήµα 33: Σχηµατική απεικόνιση της ρινός (profile): 1.Ριζορρίνιο 2.Ακρορρίνιο 3.Ανω ρινική κόγχη 4.Μέση ρινική κόγχη 5.Κάτω ρινική κόγχη 6.Άνω ρινικός πόρος 7.Σφηνοειδής κόλπος 8.Μέσος ρινικός πόρος 9.Μετωπιαίος κόλπος 10. Κάτω ρινικός πόρος ( Σχήµα 34: Σχηµατική απεικόνιση ρινός-παραρρινίων κόλπων (face): 1.Ριζορρίνιο 2.Ακρορρίνιο 3.Ιγµόρειο 4.Μετωπιαίος κόλπος 5.Ρινοδακρυϊκός πόρος 6.Οστέινο διάφραγµα µετωπιαίων κόλπων 7.Ηθµοειδείς κυψέλες ( ) Η δηµιουργία τους ευνοείται σε περιπτώσεις µόλυνσης, αλλεργίας ή και από άγνωστες µέχρι σήµερα αιτίες. Εντούτοις, η εξάπλωση του ΡΠ προϋποθέτει µια εν δυνάµει ρινική ανωµαλία. Αν η µόλυνση οφείλεται σε µια περιορισµένη αιτία, όπως βλάβη του επιθηλίου, συνήθως δεν επανεµφανίζεται µετά την αποµάκρυνση του µορφώµατος. Αντίθετα, αν η ανάπτυξή του είναι αποτέλεσµα αλλεργικής ή µη ρινίτιδας και ευαισθησίας στην χορήγηση ασπιρίνης, ο πολύποδας παρουσιάζει αυξηµένη τάση επανεµφάνισης.

74 Εισαγωγή 61 Η θεραπεία του µε στεροειδή φαίνεται να έχει υψηλό ποσοστό επιτυχίας, εντούτοις αν τα µορφώµατα δυσκολεύουν την αναπνοή θα πρέπει να αφαιρούνται χειρουργικά ( Σχήµα 35: Απεικόνιση ρινικού πολύποδα στο µέσο ρινικό πόρο ( Παθογένεια Ρινικού Πολύποδα Παρά το γεγονός ότι είναι µια συνηθισµένη πάθηση της ρινός και των παραρρινικών κοιλοτήτων, η παθογένεια του ΡΠ παραµένει ακόµη άγνωστη. Επικρατέστερη θεωρία είναι αυτή που συνδέει την δηµιουργία του ΡΠ µε µια αρχική βλάβη του επιθηλιακού στρώµατος, λόγω οιδήµατος που προέρχεται είτε από αλλεργίες είτε από µολύνσεις. Η βλάβη αυτή οδηγεί σε ρήξη του επιθηλιακού στρώµατος και στην δηµιουργία πολύποδα. Η φλεγµονή ενισχύεται σε περιπτώσεις παρακώλυσης της φλεβικής κυκλοφορίας. Κατά µια δεύτερη θεώρηση η φλεγµονή εµφανίζεται αρχικώς στα πλευρικά ρινικά τοιχώµατα ως αποτέλεσµα µόλυνσης από ιό ή βακτήριο που έχει εισχωρήσει στην περιοχή. Στις περισσότερες των περιπτώσεων ο πολύποδας εµφανίζεται αρχικά στις στενές κοιλότητες της ηθµοειδούς περιοχής ιδιαίτερα σε περιπτώσεις µόλυνσης της βλεννώδους µεµβράνης. Κατά την διαδικασία επαναεπιθηλίωσης ο ιστός ενδέχεται να υποστεί τραύµα ή ρήξη λόγω της συσσώρευσης φλεγµονωδών κυττάρων στην περιοχή, το οποίο αποσταθεροποιεί τα κανάλια νατρίου στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων της βλεννώδους µεµβράνης. Η διαταραχή αυτή οδηγεί σε αυξηµένη απορρόφηση ιόντων νατρίου, κατακράτηση του νερού και δηµιουργία οιδήµατος. Ένα τυπικό χαρακτηριστικό στον πολύποδα είναι η µαζική διήθηση των ηωσινόφιλων, ένα είδος κοκκιοκυττάρων που αποτελούν τα πιο συχνά απαντώµενα

75 Εισαγωγή 62 φλεγµονώδη κύτταρα. Βασική τους λειτουργία είναι η προστασία του οργανισµού από διάφορα παράσιτα ενώ συγχρόνως συµµετέχουν στις αλλεργικές φλεγµονώδεις αντιδράσεις. Συγκεκριµένα, σε περιπτώσεις υπερευαισθησίας, όπως αναφυλαξία, τα αλλεργιογόνα δεσµεύονται στην επιφάνεια αυτών των κυττάρων προκαλώντας τη λύση τους και την απελευθέρωση χηµειοτακτικών, αγγειοενεργών µορίων και διαφόρων παραγόντων ανάπτυξης. Οι τοξικοί αυτοί παράγοντες είναι υπεύθυνοι για τη λύση των επιθηλιακών κυττάρων, καθώς και για το οίδηµα του επιθηλίου και την αυξηµένη απόκριση. Η παρατηρούµενη διήθηση των φλεγµονωδών κυττάρων συµβάλλει στη δηµιουργία των άλλων ιδιαίτερων χαρακτηριστικών του ΡΠ, όπως είναι οι τροποποιήσεις του επιθηλίου, η ανάπλαση του ιστού, που περιλαµβάνει τη διόγκωση της βασικής µεµβράνης, η τροποποίηση του αδένα, η συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας και το οίδηµα. Σε πειραµατόζωα έχει δειχθεί ότι ο σχηµατισµός του πολύποδα περιλαµβάνει υπερπλασία του εξωκυττάριου υλικού µέσω µίας αρχικά τοπικής βλάβης του επιθηλίου. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα µεγάλη δυσκολία στην αναπνοή σε σχέση µε το καθαρό µέσο άνοιγµα. Μια δεύτερη διαπίστωση είναι ο αυξηµένος χρόνος ζωής των ηωσινόφιλων σε καλλιέργειες ΡΠ. Ενώ ο συνήθης χρόνος ζωής αυτών των κυττάρων είναι 3 ηµέρες, στην περίπτωση του ΡΠ φτάνει ως τις 12. Η καθυστέρηση της απόπτωσης φαίνεται να οφείλεται τόσο στην παρεµπόδιση των Fas υποδοχεών, όσο και στην αύξηση της συγκέντρωσης της IL-5 και IL-3, καθώς και του GM-CSF που εκκρίνονται από τα Τ- λεµφοκύτταρα. Εκτός των ηωσινόφιλων, που απαντώνται σε µεγάλο ποσοστό στους ΡΠ, ανιχνεύονται επίσης σιτευτικά κύτταρα, µακροφάγα, λεµφοκύτταρα, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα ( 15. Νόσοι του αναπνευστικού Οι νόσοι του αναπνευστικού, όπως η πνευµονική ίνωση, η χρόνια αποφρακτική πνευµονοπάθεια (ΧΑΠ) και το άσθµα, αποτελούν µια από τις συχνότερες αιτίες θανάτου. Για παράδειγµα, η ΧΑΠ αποτελεί την τρίτη αιτία θανάτου στην Ευρώπη και την τέταρτη στις ΗΠΑ, ενώ η συχνότητά της αυξάνεται συνεχώς τα τελευταία χρόνια. Παρά τη σηµερινή πρόοδο στην Πνευµονολογία η διάγνωση των ανωτέρω αναπνευστικών νόσων γίνεται συνήθως καθυστερηµένα, επειδή δεν υπάρχουν πρώιµα συµπτώµατα ή βιοχηµικοί δείκτες έγκαιρης διάγνωσης κατά τα αρχικά στάδια των πνευµονοπαθειών. Η πλειονότητα των ερευνητικών προσπαθειών για την πρόληψη, έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία των παθήσεων του αναπνευστικού προσανατολίζεται στα εµπλεκόµενα κύτταρα του πνευµονικού ιστού.

76 Εισαγωγή 63 Όµως, ο συνδετικός ιστός διαδραµατίζει, επίσης, καθοριστικό ρόλο στη λειτουργία των πνευµόνων ρυθµίζοντας την κυτταρική διαφοροποίηση, τη φλεγµονή, την επούλωση και την αναδόµηση των ιστών (Davidson et al., 1990; McGowan et al., 1992; Dunsmore et al., 1996; Warburton et al 2000; Black et al., 2001; Roman et al.,1996). Η δοµή, σύνθεση και εναπόθεση του συνδετικού ιστού στους πνεύµονες και τους αεραγωγούς ρυθµίζεται από δύο µηχανισµούς: α) από τη de novo σύνθεση των µορίων του συνδετικού ιστού όπως οι GAGs, οι PGs και οι κολλαγονούχες πρωτεΐνες (Dunsmore et al., 1996; Warburton et al., 2000; Bienkowski et al., 1995) και β) από την ενζυµική διάσπαση των παραπάνω µορίων κυρίως από τις MMPs, η δράση των οποίων ρυθµίζεται από τους TIMPs (Foronjy et al., 2001; Ohnishi et al., 1998). Οι βρόγχοι, φυσιολογικά, καλύπτονται από µονόστοιβο επιθήλιο το οποίο είναι συνδεδεµένο µε βασική µεµβράνη που αποτελείται από κολλαγόνο τύπου IV, λαµινίνη, ινονεκτίνη και νιδογόνο. Κάτω από τη βασική µεµβράνη βρίσκεται το στρώµα που αποτελείται από µεσεγχυµατικά κύτταρα, ινοβλάστες και βρογχικά λεία µυϊκά κύτταρα τα οποία βρίσκονται τοποθετηµένα µέσα σε συνδετικό ιστό. Ο συνδετικός αυτός ιστός αποτελείται από κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ και ελαστίνη και διαδραµατίζει καθοριστικό ρόλο στη δοµή και λειτουργικότητα των βρόγχων (Thomas et al., 1994; Ward et al., 2002; Foronjy et al., 2001; Ohnishi et al.,1998.) Η αναπνευστική δυσλειτουργία, που αποτελεί κλινικό σηµείο των παθήσεων του αναπνευστικού, έχει συσχετιστεί µε διαταραχές στη σύνθεση, εναπόθεση και αποδόµηση των µορίων του συνδετικού ιστού. Για παράδειγµα, το εµφύσηµα, που αποτελεί κλινική εκδήλωση της ΧΑΠ, χαρακτηρίζεται από συνεχή αποδόµηση του φυσιολογικού πνευµονικού παρεγχύµατος που µπορεί να οφείλεται, είτε στη µειωµένη αναγέννηση του συνδετικού ιστού, είτε στην αυξηµένη δραστηριότητα των ΜΜΡs, είτε στην αναστολή των ΤΙΜΡs (Pardo et al., 1999; Ohnishi et al., 1998). Αντίθετα, η παθογένεση της πνευµονικής ίνωσης σχετίζεται µε αυξηµένη εναπόθεση µορίων του συνδετικού ιστού και επαγωγή αυξητικών παραγόντων όπως ο αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού (transforming growth factor, TGF) και ο αυξητικός παράγοντας του συνδετικού ιστού (connective tissue growth factor, CTGF) (Eickelberg et al., 1999c; Eickelberg et al., 2001; Lasky et al., 1998; Howell et al., 2001). Οι µεταβολές της δοµής του συνδετικού ιστού που παρατηρούνται στη ΧΑΠ και στο άσθµα παρουσιάζουν οµοιότητες αλλά και διαφορές. Ένα από τα βασικά στοιχεία της ΧΑΠ είναι η ίνωση, η οποία προκαλείται ύστερα από αύξηση του συνδετικού ιστού και της θεµέλιας ουσίας (Knight, 2001; Nagai, 2002; Jeffery, 2001), ενώ το άσθµα σχετίζεται κυρίως µε υπερπλασία των λείων µυϊκών κυττάρων των

77 Εισαγωγή 64 βρόγχων, πάχυνση της βασικής µεµβράνης και τροποποίηση της σύστασης του εξωκυτταρικού χώρου (Black et al., 2002; Johnson et al., 2001a). Στο άσθµα και στη ΧΑΠ, χρόνια ή εµµένουσα φλεγµονή προηγείται της συσσώρευσης µορίων του συνδετικού ιστού στους αεραγωγούς (Johnson et al., 2001b; Jeffery et al., 1998). Η έκφραση και εναπόθεση κολλαγόνου τύπου Ι, ΙΙΙ και ΙV αυξάνεται σε ασθµατικούς αεραγωγούς, ενώ το κολλαγόνο τύπου IV µειώνεται. Η αγγειογένεση αυξάνεται στο άσθµα, αλλά όχι στη ΧΑΠ, ενώ ο χιτώνας των λείων µυϊκών κυττάρων αυξάνεται τόσο στο άσθµα όσο και στη ΧΑΠ, στους µεγάλους και µικρούς βρόγχους αντίστοιχα. Τα κορτικοστεροειδή και οι β2 αγωνιστές µακράς διάρκειας δράσης, χρησιµοποιούνται στη θεραπεία φλεγµονών των αεραγωγών και έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν την αναδόµηση των αεραγωγών και τη σύνθεση του εξωκυττάριου χώρου του πνεύµονα (Laitinen et al., 1997; Johnson et al., 2000). Η επικρατούσα άποψη σχετικά µε το µηχανισµό δράσης των κορτικοστεροειδών είναι ότι τα φάρµακα αυτά δρουν µέσω του ειδικού υποδοχέα των κορτικοστεροειδών ο οποίος µετά την ενεργοποίησή του δρα ως µεταγραφικός παράγοντας ρυθµίζοντας απ ευθείας την έκφραση γονιδίων µέσω του GRE (glucocorticoid responsive element) που βρίσκεται στους υποκινητές πολλών γονιδίων (Adcock et al., 2000). Νεώτερες µελέτες δείχνουν ότι ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών δεν δρα µόνο ως µεταγραφικός παράγοντας, αλλά αλληλεπιδρά επίσης µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες και κυταροπλασµατικές πρωτεΐνες τροποποιώντας τη δράση τους. Οι β2 αγωνιστές ενεργοποιούν ειδικούς υποδοχείς στην κυτταρική µεµβράνη, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση πρωτεϊνών G, PKA, camp και µεταγραφικών παραγόντων (Eickelberg et al., 1999b; Rüdiger et al., 2002; Biola et al., 2000). Η υποξία, που είναι συνήθως επακόλουθο αναπνευστικών παθήσεων και µπορεί να οδηγήσει σε πνευµονική ίνωση, επηρεάζει: α) τη σύνθεση των γλυκοζαµινογλυκανών, ΜΜΡs και TIMPs σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων πνευµονικών κυττάρων και β) την επίδραση αυξητικών παραγόντων, όπως ο PDGF και ο TGF-β, στη σύνθεση και εναπόθεση των παραπάνω µορίων (Papakonstantinou et al., 2000; 2002; 2003).

78 ΣΚΟΠΟΣ

79 Σκοπός 65 Οι αρθρίτιδες, όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα και η οστεοαρθρίτιδα, η ρινική πολυποδίαση και η χρόνια αποφρακτική πνευµονοπάθεια ή το άσθµα αποτελούν νόσους που ταλαιπωρούν εκατοµµύρια ανθρώπων δηµιουργώντας σοβαρά προβλήµατα στην καθηµερινή τους ζωή. Για το λόγο αυτό υπάρχει τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον όσον αφορά στην παθογένεια και την αντιµετώπιση των παθήσεων αυτών. Κοινό χαρακτηριστικό στην παθογένεια όλων είναι η απορρύθµιση του µεταβολισµού σηµαντικών συστατικών του εξωκυτταρικού χώρου, όπως το κολλαγόνο και οι πρωτεογλυκάνες, αλλά και των διαδικασιών ανάπλασης αυτού. Σηµαντικό ρόλο στις διαδικασίες αυτές παίζουν οι µεταλλοπρωτεϊνάσες του εξωκυτταρικού χώρου θηλαστικών (MMPs) και οι ενδογενείς ιστικοί πρωτεϊνικοί αναστολείς τους, οι TIMPs. Μεταξύ των κυριότερων MMPs, η ΜΜΡ-1 και η ΜΜΡ-3, που αποικοδοµούν φυσικά κολλαγόνα τύπου Ι και ΙΙ καθώς και πρωτεογλυκάνες, ενώ από τους TIMPs πιο χαρακτηριστικός ο ΤΙΜΡ-1. Κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες ρυθµίζουν την έκφραση τόσο των συστατικών του εξωκυτταρικού χώρου όσο και των MMPs δρώντας διεγερτικά ή κατασταλτικά στη διαδικασία της µεταγραφής. Είναι καλά τεκµηριωµένο ότι η IL-1β και ο TNF-α, χαρακτηριστικές προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες, επάγουν την έκφραση πολλών MMPs, µεταξύ των οποίων της MMP-1 και MMP-3, αλλά και του ΤΙΜΡ-1, σε διάφορα κυτταρικά συστήµατα και νόσους. Ωστόσο, υπό διερεύνηση παραµένει ο ακριβής µηχανισµός και τα ενδοκυτταρικά µονοπάτια που σηµατοδοτούν, αφού φαίνεται να υπάρχουν διαφορές τόσο στα διάφορα είδη κυττάρων ενός οργανισµού, όσο και στο ίδιο είδος κυττάρων και ίδιας προέλευσης αλλά από διαφορετικό οργανισµό, ακόµη δε και στο ίδιο είδος κυττάρων διαφορετικής προέλευσης του ίδιου οργανισµού. Από τη βιβλιογραφία ήταν γνωστό ότι το µονοπάτι της camp/pka ανταγωνίζεται την επαγωγική δράση της IL-1β στην παραγωγή της ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 σε ινοβλάστες τραχήλου της µήτρας και ούλων (Takahashi et al.,1991; Lin et al., 2001). Αντίθετα, ο TGF-β1 θεωρείται ένας αντιφλεγµονώδης αυξητικός παράγοντας που εν γένει παίζει προστατευτικό ρόλο σε ασθένειες που συνδέονται µε αποικοδόµηση των συστατικών του εξωκυτταρικού χώρου, όπως οι αρθρίτιδες, αλλά παθογενετικό σε ασθένειες που συνδέονται µε συσσώρευση της εξωκυτταρικής ουσίας, όπως οι ινώσεις. Μεταξύ άλλων συµµετέχει στη ρύθµιση της παραγωγής και αποικοδόµησης των συστατικών του εξωκυτταρικού χώρου, όπως του κολλαγόνου, ενώ είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται τη διεγερτική δράση της IL-1β στην έκφραση διαφόρων βιοδραστικών µορίων, όπως της MMP-1 σε ινοβλάστες δέρµατος (Yan et al., 2001) και των µορίων συγκόλλησης σε ενδοθηλιακά κύτταρα (Grunberg et al., 1998).

80 Σκοπός 66 Σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν: α) να µελετηθούν τα σηµατοδοτικά µονοπάτια της IL-1β και του TNF-α, που ακολουθούνται κατά την παραγωγή των µεταλλοπρωτεϊνασών MMP-1 και MMP-3, σε ινοβλάστες ανθρώπου διαφορετικής προέλευσης, αλλά και να συγκριθούν µεταξύ τους. β) να διερευνηθεί εάν ο ανταγωνισµός, από το µονοπάτι της camp/pka, της επαγωγικής δράσης της IL-1β στην έκφραση της ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 συµβαίνει και σε ινοβλάστες άλλης προέλευσης και εάν αφορά και το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TNF-α. γ) να διερευνηθεί εάν η ανταγωνιστική επίδραση του TGF-β1 στη διεγερτική δράση της IL-1β στην έκφραση της ΜΜΡ-1 συµβαίνει και σε ινοβλάστες άλλης προέλευσης, εάν αφορά τον TNF-α και την ΜΜΡ-3 και µέσω ποιού µηχανισµού πραγµατοποιείται. Τα παραπάνω εντάσσονται σε ένα µακροπρόθεσµο στόχο διαλεύκανσης των παθογενετικών µηχανισµών διαφόρων νόσων, που συνδέονται µε την αποικοδόµηση ή τη συσσώρευση της εξωκυτταρικής ουσίας, µε σκοπό τη χάραξη κατάλληλης φαρµακευτικής στρατηγικής για την αντιµετώπισή τους.

81 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ

82 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά Η προµήθεια χηµικών, αντιδραστηρίων και άλλων υλικών έγινε από τις εµπορικές πηγές που αναγράφονται παρακάτω: Πολυκλωνικά αντισώµατα έναντι της MMP-1, -3, και ΤΙΜΡ-1, πρότυπα ανασυνδιασµένα IL-1β, IL-6, TNF-α, TGF-β1, MMP-1, -3, και TIMP-1 ανθρώπου, goat anti-rabbit IgG σηµασµένα µε υπεροξειδάση, στρεπταβιδίνη σηµασµένη µε υπεροξειδάση, kit χηµειοφωταύγειας (ECL) από την Chemicon (Temecula, CA, USA). Ζεύγος µονοκλωνικών αντισωµάτων έναντι της IL-6 (δέσµευσης και ανίχνευσης σηµασµένο µε βιοτίνη) από Endogen (USA). Calphostin C, Genistein, U0126, MG-132, Forskolin, IBMX, PMA, AG-1478, PGE 2, ddade, anti-il-1rα, anti-il-6 (neutralizing), Bay , ΟPD και L-NMME από την Sigma Aldrich Chemical co (St Louis, MO, USA). H-89 και SP από Biomol Research Lab. Inc. (USA) SB από Calbiochem (Germany). ELISA Kit cyclic AMP EIA kit από την εταιρία Cayman. Kit PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of camp-dependent Protein Kinase από την εταιρία Promega. RNeasy kit και One step RT-PCR kit από την εταιρία Qiagen. ELISA Kit Prostaglandin E 2 EIA Kit-Monoclonal από την εταιρία Cayman. Εκκινητές για το γονίδιο MMP-1, της IL-6, της GAPDH και TIMP-1 από την MWG (Germany). Μέσο καλλιέργειας DMEM από την Biochrome AG (Germany). Πλάκες ELISA και καλλιέργειας κυττάρων από την Greiner (Germany). Μεµβράνες ανοσοαποτύπωσης απλής νιτρικής κυτταρίνης από την Milipore (USA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθµού. 2. Βιολογικά δείγµατα 2.1 Συλλογή δειγµάτων Συλλέχθηκαν αρθρικοί υµένες από ασθενείς µε Ρευµατοειδή αρθρίτιδα και Οστεοαρθρίτιδα, που υποβλήθηκαν σε αρθοπλαστική γόνατος ή ισχίου, ρινικοί πολύποδες από ασθενείς µε χρόνια ρινίτιδα και πολυποδίαση και δείγµατα

83 Υλικά και Μέθοδοι 68 φυσιολογικού πνεύµονα κατά τη διάρκεια επέµβασης αφαίρεσης καρκίνου του πνεύµονα. Τα δείγµατα συλλέχθηκαν από την Ορθοπαιδική Κλινική, την Ωτορινολαρυγγολογική Κλινική και το Θωρακοχειρουργικό Τµήµα της Χειρουργικής Κλινικής, αντίστοιχα, του Τµήµατος Ιατρικής του Πανεπιστηµίου Πατρών, και χρησιµοποιήθηκαν για την αποµόνωση κυττάρων τύπου ινοβλάστης, όπως περιγράφεται παρακάτω. 2.2 Επεξεργασία δειγµάτων Αποµόνωση κυττάρων τύπου ινοβλάστης και καλλιέργεια αυτών Η µέθοδος αποµόνωσης των κυττάρων από τους αρθρικούς υµένες περιελάµβανε τα εξής στάδια: Τεµαχισµός των ιστών σε µικρά τµήµατα. Επώαση µε βακτηριακή κολλαγονάση (1mg/mL) σε DMEM απουσία ορού στους 37 0 C για 2h. Φυγοκέντρηση στις 2000rpm για 5min και έκπλυση του ιζήµατος 3 φορές µε DMEM που περιείχε και 10% FΒS (µέσο καλλιέργειας παρουσία ορού). Αιώρηση του ιζήµατος σε DMEM-10% FCS, διασπορά σε πλαστικές φιάλες καλλιέργειας 75 cm 2 και επώαση για 48h. Απόχυση του µέσου καλλιέργειας, έκπλυση µε DMEM-10% FCS και καλλιέργεια των προσκολληµένων κυττάρων στο ίδιο µέσο µέχρι την ολοκλήρωση της κυτταρικής µονοστοιβάδας. Τα δείγµατα ρινικού πολύποδα και πνεύµονα τεµαχίζονταν σε µικρά τµήµατα και διασπείρονταν κατευθείαν, χωρίς προηγούµενη επεξεργασία µε κολλαγονάση, σε πλαστικές φιάλες όπου και καλλιεργούνταν σε DMEM-10% FCS µέχρι την εµφάνιση και ανάπτυξη ινοβλαστών γύρω από τα τεµαχίδια του ιστού. Στην συνέχεια το µέσο καλλιέργειας µε τα µικροτεµαχίδια αποµακρύνονταν και η καλλιέργεια συνεχίζονταν σε DMEM-10% FCS µέχρι την ολοκλήρωση της κυτταρικής µονοστοιβάδας. Μετά την πλήρη ανάπτυξη της κυτταρικής µονοστoιβάδας, τα κύτταρα συλλέγονταν ύστερα από ήπια πέψη µε θρυψίνη, αραιώνονταν 1:3 και επανακαλλιεργούνταν στο ίδιο µέσο. Αναλυτικά η διαδικασία αυτή περιλάµβανε τα εξής στάδια: Έκπλυση των κυττάρων µε PBS (2 φορές). Επεξεργασία των κυττάρων µε θρυψίνη-edta (0,05% και 0,02%, αντίστοιχα) στους 37 o C για ~5 min.

84 Υλικά και Μέθοδοι 69 Τερµατισµός της αντίδρασης µε DMEM-10% FCS και συλλογή των κυττάρων µε φυγοκέντρηση στις 1400rpm για 4 min. Αιώρηση των κυττάρων σε DMEM-10% FCS και διασπορά τους σε πλαστικές φιάλες καλλιέργειας τριπλάσιας επιφάνειας σε σχέση µε την προηγούµενη καλλιέργεια. Προκειµένου να ληφθεί οµοιογενής πληθυσµός κυττάρων τύπου ινοβλάστης, η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνονταν δύο ή τρεις ακόµη φορές, δηλαδή. µέχρι 3η ή 4η γενιά (passage). Όλα τα πειράµατα έγιναν µε κύτταρα 3ης ή 4ης γενιάς. Τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε πλάκες 6 κελίων µε DMEM-10% FCS µέχρι την πλήρη ανάπτυξη της κυτταρικής µονοστoιβάδας και στη συνέχεια το µέσο αποχύνονταν και τα κύτταρα παρέµεναν για 24h απουσία ορού σε DMEM-0.2% υδρόλυµα λακταλβουµίνης (DMEM-0.2% LH). Ακολουθούσε καλλιέργεια των κυττάρων εις τριπλούν, απουσία ή παρουσία διαφόρων παραγόντων ή συνδυασµού αυτών στο ίδιο µέσο καλλιέργειας για διάφορους χρόνους. Η διάρκεια της καλλιέργειας, όπως και η συγκέντρωση του κάθε παράγοντα που χρησιµοποιήθηκε θα αναφέρονται κατά την έκθεση των αποτελεσµάτων. Μετά το πέρας της καλλιέργειας συλλέγονταν το µέσο καλλιέργειας και φυλάσσονταν στους -20 ο C, ενώ οι πλάκες µε τα προσκολληµένα κύτταρα φυλάσσονταν στους -80 ο C για την αποµόνωση ολικού RNA και τη χρήση του σε RT- PCR ανάλυση ή για άλλη χρήση. Η απουσία του FCS απαιτείται προκειµένου να αποφευχθούν οι επιδράσεις κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων, που υπάρχουν σε αυτό. Τέλος, όλες οι διαδικασίες έγιναν σε στείρες συνθήκες και τα διαλύµατα των κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων που χρησιµοποιήθηκαν αποστειρώθηκαν µε τη βοήθεια ειδικών φίλτρων (διάµετρος πόρων 0,2µm). Σχήµα 36: Κύτταρα τύπου ινοβλάστη σε καλλιέργεια

85 Υλικά και Μέθοδοι Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Η ELISA, κύριος εκπρόσωπος των ανοσοενζυµικών αναλυτικών µεθόδων, αποτελεί µία µέθοδο η οποία, στηριζόµενη στην εξειδικευµένη αντίδραση αντιγόνου αντισώµατος, επιτρέπει τόσο τον ποιοτικό όσο και τον ποσοτικό προσδιορισµό διαφόρων ουσιών που κατά την πειραµατική διαδικασία κατέχουν το ρόλο αντιγόνου. Υπάρχουν διάφορες κατηγορίες, που αναλύονται παρακάτω, οι οποίες στηρίζονται στην ίδια αρχή και διαφοροποιούνται από τη σειρά µε την οποία προστίθενται στην ειδική πλάκα πολυστυρολίου (Σχ. 37) τα αντισώµατα και το αντιγόνο. Σχήµα 37: Πλάκες πολυστυρολίου 3.1 ELISA τύπου sandwich. Στην ELISA αυτή, γίνεται αρχικά επίστρωση των κελίων (coating) µε ένα ειδικό, για το προς ανίχνευση αντιγόνο, αντίσωµα, συνήθως µονοκλωνικό (1 ο (Α) αντίσωµα). Η δέσµευση γίνεται συνήθως µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων µε το πολυστυρόλιο. Οι ελεύθερες θέσεις στα κελία δεσµεύονται µε µια κοινή πρωτεΐνη, συνήθως αλβουµίνη ορού βοός (BSA), για την αποφυγή στα επόµενα στάδια µη ειδικών αντιδράσεων. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση µε τα δείγµατα τα οποία περιέχουν την προς ανάλυση ουσία (αντιγόνο), ώστε να επιτευχθεί η αντίδραση αντιγόνου-αντισώµατος. Στην ίδια ακριβώς διαδικασία, καθώς και στις ίδιες συνθήκες χρόνου και θερµοκρασίας, υποβάλλεται γνωστή ποσότητα της προς ανάλυση ουσίας (καθαρό αντιγόνο).

86 Υλικά και Μέθοδοι έσµευση του 1 ου (Α) αντισώµατος στο κελίο 2. Έκπλυση 3. Επώαση µε δείγµα που περιέχει το αντιγόνο 4. Έκπλυση 5. Επώαση µε το 1 ο (Β) αντίσωµα 6. Έκπλυση 7. Επώαση µε το 2 ο αντίσωµα σηµασµένο µε ένζυµο 8. Επώαση µε το υπόστρωµα του ενζύµου και ανάπτυξη του χρώµατος Σχήµα 38: Σχηµατική παράσταση των σταδίων µιας ELISA τύπου sandwich Ακολουθεί το στάδιο της ανίχνευσης µε τη χρήση ενός αντισώµατος ειδικού για το ίδιο αντιγόνο, για άλλο όµως επίτοπο, (1 ο (Β) αντίσωµα), το οποίο µπορεί να είναι και συνδεδεµένο µε κάποιο ένζυµο, όπως υπεροξειδάση, ή βιοτίνη. Εάν το (1 ο (Β) αντίσωµα) δεν είναι σηµασµένο ακολουθεί επώαση µε το 2 ο αντίσωµα, σηµασµένο µε ένζυµο, και στη συνέχεια η ενζυµική αντίδραση για την εµφάνιση του χρώµατος. Εάν το (1 ο (Β) αντίσωµα) είναι σηµασµένο µε ένζυµο ακολουθεί κατευθείαν η ενζυµική αντίδραση για την εµφάνιση του χρώµατος, ενώ εάν είναι σηµασµένο µε βιοτίνη ακολουθεί επώαση µε στρεπταβιδίνη, σηµασµένη µε ένζυµο, και στη συνέχεια η ενζυµική αντίδραση για την εµφάνιση του χρώµατος (Σχ. 38).

87 Υλικά και Μέθοδοι 72 Η χρωµοαντίδραση, η οποία είναι κοινή σε όλα τα είδη ELISA που χρησιµοποιήθηκαν, αρχίζει µε την προσθήκη του υποστρώµατος της υπεροξειδάσης, δηλαδή του H 2 O 2, και µιας χρωµογόνου ουσίας που είναι η ο-φαινυλενοδιαµίνη (OPD). Από τη διάσπαση του H 2 O 2 παράγεται µοριακό οξυγόνο το οποίο οξειδώνει την OPD προς ένα διαλυτό έγχρωµο παράγωγο µε µέγιστο µήκος κύµατος 492nm. Υπεροξειδάση 2 H 2 O 2 2Η 2 Ο + Ο 2 Λόγω της ευαισθησίας της OPD στο φως η χρωµοαντίδραση πραγµατοποιείται στο σκοτάδι. Μετά τον τερµατισµό της αντίδρασης, µε προσθήκη ίσου όγκου 2Ν διαλύµατος H 2 SO 4, ακολουθεί φωτοµέτρηση σε ειδικό φωτόµετρο για πλάκες ELISA στα 492nm. Όλα τα δείγµατα (και το πρότυπο) δοκιµάζονταν εις διπλούν και εν συνεχεία υπολογίζονταν ο µέσος όρος της απορρόφησης του καθενός, η οποία είναι ανάλογη της ποσότητας του περιεχόµενου αντιγόνου. Με βάση την απορρόφηση της πρότυπης ποσότητας του αντιγόνου υπολογίζεται η ποσότητα του αντιγόνου ανά κελίο. Από όλα τα δείγµατα αφαιρούνταν ο µέσος όρος της απορρόφησης ενός δείγµατος «τυφλού», που περιείχε µόνο, ίση µε το δείγµα, ποσότητα του θρεπτικού υλικού του µέσου καλλιέργειας. Με την παραπάνω τεχνική ELISA προσδιορίσθηκαν, στο µέσο καλλιέργειας κυττάρων, τα επίπεδα της IL-6. Τα αντισώµατα και η αραίωση που χρησιµοποιήθηκαν, καθώς και οι λοιπές συνθήκες των πειραµάτων θα αναφέρονται στην παράθεση των αποτελεσµάτων ELISA για προσδιορισµό IL-6 Χρησιµοποιήθηκαν πλάκες πολυστυρολίου 96 κελίων (Greiner). Η µέθοδος περιελάµβανε τα ακόλουθα στάδια: Επίστρωση 1 ου (Α) αντισώµατος (coating): Επιστρώνονταν 100µL/κελίο, εις διπλούν για κάθε δείγµα, από διάλυµα µονοκλωνικού anti-human IL-6 (2.5µg/mL) σε PBS (10mΜ NaH 2 PO4, 140mΜ NaCl), ph:8. Επώαση στους 37 ο C για 20h. Κάλυψη ελευθέρων θέσεων κελίου (Blocking) µε 200µL/κελίο διαλύµατος 4% BSA σε PBS ph: 7.4 για 1h στους 37 ο C. Έκπλυση (τρεις φορές) µε 200µL/κελίο διαλύµατος 50mM Tris-0.2% Tween20.

88 Υλικά και Μέθοδοι 73 Προσθήκη των προς προσδιορισµό δειγµάτων (100µL/κελίο). Για τυφλό ίση ποσότητα µέσου καλλιέργειας. Πρότυπο 100µL/κελίο από διάλυµα human recombinant IL-6 (400pg/mL). Επώαση 1.5h στους 37 ο C. Έκπλυση (τρεις φορές) όπως παραπάνω. Προσθήκη 1 ου (Β) αντισώµατος: 100µL/κελίο µονοκλωνικού βιοτινυλιωµένου anti human IL-6 (500ng/mL) σε PBS ph: 7.4 4% BSA. Επώαση 1.5h στους 37 ο C. Έκπλυση (τρεις φορές) όπως παραπάνω. Προσθήκη 100µL/κελίο διαλύµατος στρεπταβιδίνης σηµασµένης µε υπεροξειδάση (1/4000) σε PBS ph: 7.4 1% BSA. Επώαση 40min στους 37 ο C. Έκπλυση (δύο φορές) όπως παραπάνω, και µία φορά µε 200µL/κελίο ρυθµιστικού διαλύµατος 0.1Μ κιτρικών ph: 5. Προσθήκη 100µL/κελίο διαλύµατος χρωστικής, 2mg/mL OPD και 1µL/mL διαλύµατος H 2 O 2 30% (λίγο πριν την προσθήκη στα κελία) σε ρυθµιστικό διάλυµα 0.1Μ κιτρικών ph: 5. Ανάπτυξη του χρώµατος µε παραµονή στο σκοτάδι για 30min. Τερµατισµός της αντίδρασης µε προσθήκη διαλύµατος 2M H 2 SO 4 (100µL/κελίο). Μέτρηση της Ο.D. στα 492nm. Η ευαισθησία της µεθόδου υπολογίστηκε στο 1pg/mL και η σχέση µεταξύ απορρόφησης στα 492nm και συγκέντρωσης ήταν γραµµική για συγκεντρώσεις pg/mL. 3.2 ELISA συναγωνιστικού τύπου Η ELISA αυτή διαφέρει από την προηγούµενη στο ότι στα κελία επιστρώνεται γνωστή ποσότητα καθαρού αντιγόνου (coating), το οποίο είναι ίδιο µε το προς ανίχνευση στα δείγµατα. Ακολουθεί η κάλυψη των ελευθέρων θέσεων στα κελία, όπως παραπάνω. Τα προς ανάλυση δείγµατα επωάζονται εκτός πλάκας µε συγκεκριµένη ποσότητα αντισώµατος (1 ο αντίσωµα), το οποίο είναι ειδικό για το προς ανίχνευση αντιγόνο, και στη συνέχεια προστίθενται στα κελία. Το ελεύθερο αντιγόνο στα δείγµατα ανταγωνίζεται µε το επιστρωµένο στα κελία για αντίδραση µε το αντίσωµα, παρεµποδίζοντάς το να δεσµευτεί στο επιστρωµένο αντιγόνο. Η παρεµπόδιση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ελεύθερου αντιγόνου στα δείγµατα. Ένα δείγµα που περιέχει µόνο το αντίσωµα θα δώσει την πλήρη δέσµευση απουσία ανταγωνιστή (100%). Η έκταση της αντίδρασης του 1 ου αντισώµατος µε το επιστρωµένο αντιγόνο διαπιστώνεται µε την αντίδραση µε το 2 ο αντίσωµα (έναντι 1 ου αντισώµατος)

89 Υλικά και Μέθοδοι 74 σηµασµένου µε ένζυµο, προσθήκη του υποστρώµατος του ενζύµου και χρωµοαντίδραση, όπως παραπάνω (Σχ. 39). 1. Πρόσδεση του αντιγόνου στο κελίο 2. Έκπλυση 3. Επώαση δείγµατος και πρότυπου µε αντίσωµα και προσθήκη στην πλάκα 4. Έκπλυση 5. Προσθήκη αντισώµατος συζευγµένου µε ένζυµο 6. Έκπλυση 7. Επώαση µε το υπόστρωµα του ενζύµου και µέτρηση του προϊόντος Σχήµα 39: Σχηµατική παράσταση των σταδίων µιας ELISA συναγωνιστικού τύπου. Η ένταση του χρώµατος για κάθε δείγµα (υπολογίζεται ο µέσος όρος των 2 απορροφήσεων) είναι αντιστρόφως ανάλογη µε την ποσότητα του περιεχόµενου αντιγόνου. Με τη χρήση δειγµάτων ελεύθερου αντιγόνου γνωστής συγκέντρωσης, υπολογίζεται η επί τοις % αναστολή για κάθε συγκέντρωση και κατασκευάζεται καµπύλη αναστολής, µε τη βοήθεια της οποίας γίνεται ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του προς ανίχνευση αντιγόνου στα άγνωστα δείγµατα.

90 Υλικά και Μέθοδοι ELISA για προσδιορισµό της camp Για τον προσδιορισµό της camp χρησιµοποιήθηκε το Kit Elisa της εταιρίας Cayman, cyclic AMP EIA kit σύµφωνα µε τις οδηγίες της εταιρίας. Η µέθοδος βασίζεται στον ανταγωνισµό, µεταξύ της camp στα προς ανάλυση δείγµατα και γνωστής ποσότητας camp σηµασµένης µε ακετυλοχολινεστεράση, για δέσµευση σε µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της camp επιστρωµένου σε πλάκες πολυστυρολίου. Η ανίχνευση της δεσµευµένης στο ακινητοποιηµένο αντίσωµα, σηµασµένης µε ακετυλοχολινεστεράση camp, γίνεται µε τη χρήση του ειδικού υποστρώµατος της ακετυλοχολινεστεράσης, ακετυλο-χολίνη, µόνο που ο Ο-εστερικός δεσµός έχει αντικατασταθεί από S-εστερικό δεσµό. Οι παραγόµενες σουλφυδρυλοµάδες, από την υδρόλυση του υποστρώµατος, ανάγουν το αντιδραστήριο ELMAN και το προκύπτον χρώµα µετράται στα 412nm. Συγκεκριµένα, µετά την επώαση των ινοβλαστών από SM, παρουσία TGF-β1, PGE 2 ή Forskolin το µέσο καλλιέργειας αποµακρύνθηκε και τα κύτταρα επεξεργάστηκαν µε 0,1Μ HCl για 20min σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 10000g για 10min, συλλογή του υπερκείµενου, λυοφιλοποίηση υπό κενό και φυγοκέντρηση, διάλυση του στερεού υπολείµατος στο ρυθµιστικό ανοσοαντίδρασης και ακετυλίωση µε οξικό ανυδρίτη. Η συγκέντρωση της camp υπολογίστηκε µε βάση την καµπύλη αναστολής που κατασκευάστηκε µε πρότυπα διαλύµατα ακετυλιωµένης camp (Σχ.40). Η ευαισθησία της µεθόδου υπολογίστηκε στα 0.07pmole/ml %B/B ,01 0, Acetylated camp (pmole/ml) Σχήµα 40: Καµπύλη αναστολής για την camp

91 Υλικά και Μέθοδοι ELISA για προσδιορισµό της PGE 2 Για τον προσδιορισµό της PGE 2 χρησιµοποιήθηκε το Kit Elisa της εταιρίας Cayman, Prostaglandin E 2 EIA Kit-Monoclonal, σύµφωνα µε τις οδηγίες της εταιρίας. Η µέθοδος βασίζεται στον ανταγωνισµό, µεταξύ της PGE 2 στα προς ανάλυση δείγµατα και γνωστής ποσότητας PGE 2 σηµασµένης µε ακετυλοχολινεστεράση, για δέσµευση σε µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της PGE 2 επιστρωµένου σε πλάκες πολυστυρολίου. Η ανίχνευση της δεσµευµένης στο ακινητοποιηµένο αντίσωµα, σηµασµένης µε ακετυλοχολινεστεράση PGE 2, γίνεται µε τη χρήση του ειδικού υποστρώµατος της ακετυλοχολινεστεράσης, ακετυλο-χολίνη, µόνο που ο Ο-εστερικός δεσµός έχει αντικατασταθεί από S-εστερικό δεσµό. Οι παραγόµενες σουλφυδρυλοµάδες, από την υδρόλυση του υποστρώµατος, ανάγουν το αντιδραστήριο ELMAN και το προκύπτον χρώµα µετράται στα 412nm. H ευαισθησία της µεθόδου υπολογίστηκε στα 10pg/mL και η σχέση µεταξύ απορρόφησης στα 412nm και συγκέντρωσης ήταν γραµµική για συγκεντρώσεις pg/mL (Σχ.41) % B/B PGE 2 ( pg/ml) Σχήµα 41: Καµπύλη αναστολής για την PGE ELISA έµµεσου τύπου Σε αυτόν τον τύπο ELISA τα δείγµατα που περιέχουν την προς ανάλυση ουσία τοποθετούνται στα κελία και τα συστατικά τους δεσµεύονται στο πολυστυρόλιο,

92 Υλικά και Μέθοδοι 77 είτε κατόπιν επώασης σε ρυθµιστικό διάλυµα κατάλληλου ph, ανάλογα µε το pι των προς δέσµευση συστατικών, συνήθως ρυθµιστικό ανθρακικών ph 9,5, είτε κατόπιν ξήρανσης του δείγµατος στα κελία στους 60 ο C. Ακολουθεί, όπως προηγούµενα, κάλυψη των ελευθέρων θέσεων µε BSA και επώαση µε το 1 ο αντίσωµα, το οποίο είναι ειδικό για το προς ανίχνευση αντιγόνο. Η διαπίστωση της ανοσοαντίδρασης γίνεται µε τη χρήση αντισώµατος έναντι του 1 ου (2 ο αντίσωµα) το οποίο φέρει οµοιοπολικά δεσµευµένο ένζυµο. Ακολουθεί προσθήκη του υποστρώµατος του ενζύµου και η ανάπτυξη του χρώµατος. Στην περίπτωση που το 1 ο αντίσωµα είναι σηµασµένο µε βιοτίνη, τότε αντί 2 ου αντισώµατος χρησιµοποιείται στρεπταβιδίνη σηµασµένη µε ένζυµο, συνήθως υπεροξειδάση, και ανάπτυξη του χρώµατος όπως παραπάνω. Η ένταση του παραγόµενου χρώµατος είναι ανάλογη της ποσότητας του προς ανίχνευση αντιγόνου (Σχ.42). 1. Πρόσδεση του αντιγόνου του δείγµατος στο κελίο 2. Έκπλυση 3. Επώαση µε το 1 ο αντίσωµα 4. Έκπλυση 5. Επώαση µε 2 ο αντίσωµα συνδεδεµένο µε ένζυµο (*) 6. Έκπλυση 7. Επώαση µε το υπόστρωµα του ενζύµου και ανάπτυξη του χρώµατος Σχήµα 42: Σχηµατική παράσταση των σταδίων µιας ELISA έµµεσου τύπου.

93 Υλικά και Μέθοδοι 78 Με την παραπάνω τεχνική ELISA προσδιορίσθηκαν στο µέσο καλλιέργειας των κυττάρων τα επίπεδα MMP-1, MMP-3, και TIMP-1. Τα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν, η αραίωση και οι λοιπές συνθήκες των πειραµάτων αναφέρονται στην έκθεση των αποτελεσµάτων ELISA για προσδιορισµό ΜMP-1, MMP-3 και TIMP-1 (Papakonstantinou et al., 2003; Μαντζουράνη, 2007) Χρησιµοποιήθηκαν πλάκες πολυστυρολίου 96 κελίων (Greiner). Η µέθοδος περιελάµβανε τα ακόλουθα στάδια : Επίστρωση δειγµάτων (coating): Επίστρωση µε 100µL/κελίο µέσου καλλιέργειας κυττάρων και ξήρανση στους 60 ο C για τουλάχιστον 3-4h. Σε δύο κελία τοποθετούνταν 100µL/κελίο από πρότυπο διάλυµα MMP-1 ή MMP-3 ή TIMP-1. Έκπλυση (τρεις φορές) µε 200µL/κελίο διαλύµατος PBS (1,5mM KH 2 PO 4, 8,1mM Na 2 HPO 4, 0,14mM NaCl, 2,7mM KCl)-0.05% Tween 20 (PBS-T). Κάλυψη ελευθέρων θέσεων (Blocking) µε 200µL/κελίο διαλύµατος 4% BSA σε PBS-T και επώαση 1h στους 37 ο C. Έκπλυση (τρεις φορές) όπως παραπάνω. Επώαση µε το 1 ο αντίσωµα: Προσθήκη 100µL/κελίο διαλύµατος πολυκλωνικού αντισώµατος έναντι MMP-1 ή MMP-3 ή TIMP-1 ανθρώπου (Chemicon) (1µg/mL) σε PBS-Τ και επώαση στους 4 ο C για 20h. Έκπλυση (τρεις φορές) όπως παραπάνω. Επώαση µε το 2 ο αντίσωµα: Προσθήκη 100µL/κελίο διαλύµατος anti rabbit IgG συζευγµένoυ µε υπεροξειδάση (1/4000) σε PBS-T και επώαση στους 37 ο C για 1h. Τα υπόλοιπα βήµατα ήταν όπως για προηγούµενες ELISA. Η ευαισθησία της µεθόδου υπολογίστηκε στα 2,6, 0,5 και 2,5ng/κελίο για τις MMP-1, -3 και TIMP-1, αντίστοιχα, και η σχέση µεταξύ απορρόφησης στα 492nm και συγκέντρωσης ήταν γραµµική για συγκεντρώσεις από 2,5-40ng/κελίο, 0,5-20ng/κελίο και 5-40ng/κελίο για τις MMP-1, -3 και TIMP-1, αντίστοιχα. 4. Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western Blotting) Μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό των πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε πήγµατα πολυακρυλαµιδίου µε SDS (SDS-PAGE), όπως περιγράφεται παρακάτω,

94 Υλικά και Μέθοδοι 79 ακολουθούσε ηλεκτροµεταφορά αυτών (transfer) από το πήγµα διαχωρισµού σε µεµβράνη απλής νιτρικής κυτταρίνης σύµφωνα µε τη µέθοδο Towbin (Towbin et al., 1979). Τα πήγµατα διαχωρισµού, µετά την αποµάκρυνσή τους από την συσκευή ηλεκτροφόρησης, εκπλένονταν για 15 min σε θερµοκρασία δωµατίου σε διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς (transfer buffer). Στο ίδιο διάλυµα, για ίσο χρόνο και σε ίδιες συνθήκες θερµοκρασίας εµβαπτιζόταν υπό ανάδευση και η µεµβράνη νιτρικής κυτταρίνης. Η ηλεκτροµεταφορά γινόταν παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος που περιείχε 25mM Tris, 0,192mM γλυκίνη και 20% (v/v) µεθανόλη (Towbin buffer). Στην ειδική συσκευή ηλεκτροµεταφοράς (BioRad) εφαρµοζόταν σταθερή τάση ρεύµατος 100V (ένταση ρεύµατος mA) για 1h, σε θερµοκρασία 0 ο C (η διατήρηση της οποίας γινόταν µε τοποθέτηση της συσκευής σε παγόλουτρο). Μετά το πέρας της ηλεκτροµεταφοράς η µεµβράνη νιτρικής κυτταρίνης ξηραινόταν στους 60 ο C για 15 min και ακολουθούσε επώασή της, υπό ανάδευση και σε θερµοκρασία περιβάλλοντος, σε ρυθµιστικό διάλυµα 20mM Tris HCl, ph:7.4, 150mM NaCl (TBS) το οποίο περιείχε 0.05% Tween 20 (TBS-Tween) και 5% σκόνη αποβουτυρωµένου γάλακτος, για 2h. Το στάδιο αυτό αποσκοπούσε στην κάλυψη (blocking) των ελευθέρων θέσεων της µεµβράνης ώστε να αποφευχθούν µη ειδικές αλληλεπιδράσεις µε τα αντισώµατα στα µετέπειτα στάδια του πειράµατος. Ακολουθούσαν τρεις 15λεπτες εκπλύσεις της µεµβράνης µε TBS-T και εν συνεχεία επώασή της, 16-20h στους 4 ο C, σε διάλυµα κατάλληλης συγκέντρωσης, του αντίστοιχου για την προς ανίχνευση πρωτεΐνη αντισώµατος (µονοκλωνικού ή πολυκλωνικού) σε TBS-T που περιείχε 1% σκόνη γάλακτος (1 ο αντίσωµα). Μετά από τρεις νέες 15λεπτες εκπλύσεις της µεµβράνης µε TBS-T ακολουθούσε επώαση µε το 2 ο αντίσωµα (anti-mouse IgG ή anti-rabbit IgG ανάλογα εάν το 1ο αντίσωµα ήταν µονοκλωνικό ή πολυκλωνικό) (1:2000) σε TBS-T, που περιείχε 1% σκόνη γάλακτος, για 2h σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Το 2 ο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε υπεροξειδάση. Ακολουθούσαν τρεις 15λεπτες εκπλύσεις της µεµβράνης µε TBS-T και στη συνέχεια ανίχνευση των πρωτεϊνών, που αντέδρασαν µε τα αντισώµατα, µε την τεχνική της χηµειοφωταύγειας (ECL method) σύµφωνα µε τις οδηγίες της εταιρίας που παρήγαγε τα απαραίτητα για την µέθοδο αυτή αντιδραστήρια (Chemicon). Οι πρωτεϊνικές ζώνες που έδιναν ανοσοαντίδραση, αποτυπώνονταν σε φωτογραφικό φιλµ ως ζώνες αµαύρωσης στα σηµεία όπου είχαν ηλεκτροφορηθεί.

95 Υλικά και Μέθοδοι Ηλεκτροφορητικές µέθοδοι 5.1 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήγµατα πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE) Ακολουθήθηκε η µέθοδος ασυνεχούς ηλεκτροφόρησης του Laemmli (Laemmli, 1970). Χρησιµοποιήθηκαν επίπεδα πήγµατα διαστάσεων 5x8x0.075cm. Τα πήγµατα αποτελούνται από δύο µέρη: Το κύριο πήγµα διαχωρισµού (separating gel) ύψους 5cm και το πήγµα επιστoίβαξης του δείγµατος (stacking gel) ύψους 1.5cm. Τα πήγµατα διαχωρισµού και επιστοίβαξης είχαν συγκέντρωση ακρυλαµιδίου 12 ή 15% και 4% αντίστοιχα. Η αναλογία ακρυλαµιδίου/δις ακρυλαµιδίου και για τα δύο πήγµατα ήταν 37:1. Το πήγµα διαχωρισµού περιείχε σε τελικές συγκεντρώσεις, 0.375Μ Tris HCl ph 8.8 και 0.1% SDS και το πήγµα επιστοίβαξης 0.125Μ Tris HCl ph 6.8 και 0.1% SDS. Ο πολυµερισµός του ακρυλαµιδίου γινόταν µε προσθήκη τετραµεθυλο-αιθυλενο-διαµίνης (TEMED) και υπερθειϊκού αµµωνίου (APS), 1.5µL/mL και 0.5mg/mL δ/τος ακρυλαµιδίου αντίστοιχα. Τα δείγµατα, όγκου 20µL, τοποθετούνταν σε ρυθµιστικό διάλυµα επεξεργασίας δειγµάτων, που περιείχε σε τελικές συγκεντρώσεις Μ Tris HCl ph 6.8, 2% (κ.β) SDS 10%(κ.ο) γλυκερόλη, 0.001% (κ.β) κυανούν της βρωµοφαινόλης ως δείκτη καθώς και 5% κ.ο β-µερκαπτοαιθανόλη, ενώ όταν η ηλεκτροφόρηση γινόταν κάτω από αναγωγικές συνθήκες, πριν την ηλεκτροφόρηση, βράζονταν για 5min. Οι ηλεκτροφορήσεις γίνονταν σε συσκευές της εταιρίας BioRad, σε θερµοκρασία δωµατίου. Το ρυθµιστικό διάλυµα των δεξαµενών ανόδου και καθόδου περιείχε σε τελικές συγκεντρώσεις 0.025Μ Tris-0.192Μ γλυκίνη ph 8.3 και 0.1% SDS. Τα δείγµατα επιστοιβάζονταν στο πήγµα και εφαρµοζόταν σταθερό ρεύµα, αρχικά έντασης 15-20mA, µέχρι την είσοδο των δειγµάτων στο πήγµα, και στη συνέχεια 25-30mA µέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης, η οποία διαρκούσε περίπου 45min. Μαζί µε τα άλλα δείγµατα ηλεκτροφορούνταν κάθε φορά και ένα δείγµα σφαιρικών πρωτεϊνών γνωστής µοριακής µάζας, που περιείχε αλβουµίνη ορού βοός (66kDa), αλβουµίνη αυγού (45kDa), αναστολέα θρυψίνης από σόγια (20kDa) και κυτόχρωµα c (12kDa). Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης ακολουθούσε εµφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών, που διαχωρίστηκαν µε βάση τη µοριακή τους µάζα, µε χρήση κατάλληλης βαφής ή ηλεκτροµεταφορά αυτών σε µεµβράνες νιτροκυτταρίνης για τα πειράµατα ανοσοαποτύπωσης, όπως περιγράφηκε παραπάνω.

96 Υλικά και Μέθοδοι Αποµόνωση ολικού RNA από καλλιέργειες κυττάρων Η αποµόνωση του RNA από τις καλλιέργειες κυττάρων πραγµατοποιούνταν µε τη χρήση του RNAeasy Mini kit της εταιρίας Qiagen. H διαδικασία γινόταν σε παγόλουτρο και περιελάµβανε τα εξής στάδια: Προσθήκη 600µL διαλύµατος λύσης RLT ανά κελίο της πλάκας (6 κελίων) καλλιέργειας των κυττάρων. Στο διάλυµα είχε προστεθεί β-µερκαπτοαιθανόλη (10 µl/ml). Λύση των κυττάρων µε αναρρόφηση και εκρόφηση του αιωρήµατος µε σύριγγα 10 φορές. Προσθήκη στο εκχύλισµα ίσου όγκου αιθανόλης 70% και φυγοκέντρηση σταδιακά σε ειδικές στήλες, στις οποίες δεσµεύεται το RNA, στις 10000rpm για 15sec. Μετά από κάθε φυγοκέντρηση το έκλουσµα απορρίπτονταν. Προσθήκη στην στήλη διαλύµατος RW-1 και φυγοκέντρηση στις 10000rpm για 15sec. Έκπλυση της στήλης µε διάλυµα RPE και φυγοκέντρηση στις 10000rpm για 15sec και στις 13000rpm για 2min Έκλουση του RNA από τη στήλη ύστερα από την προσθήκη ελεύθερου RNAase H 2 O και φυγοκέντρηση για 2min στις 10000rpm. Για να αποφευχθεί η αποικοδόµηση του RNA προσθέτονταν στα εκλούσµατα αναστολείς ριβονουκλεασών. Ο προσδιορισµός της ολικής ποσότητας RNA, η οποία αποµονώνονταν, πραγµατοποιούνταν µε µέτρηση της απορρόφησης στα 260nm λαµβάνοντας υπ όψιν ότι διάλυµα RNA συγκεντρώσεως 40µg/ml δίνει απορρόφηση ίση µε 1. Επιπρόσθετα, η καθαρότητα του RNA πιστοποιούνταν µε µέτρηση της απορρόφησης στα 280nm. Ο λόγος της απορρόφησης στα 260nm προς την απορρόφηση στα 280nm πρέπει να είναι µεγαλύτερος του Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR-polymerase chain reaction) είναι µια τεχνική, που µιµούµενη το φυσιολογικό µηχανισµό των κυττάρων, οδηγεί στον πολλαπλασισµό ειδικών τµηµάτων DNA, που βρίσκονται ανάµεσα σε περιοχές γνωστής αλληλουχίας, χιλιάδες ή εκατοµµύρια φορές. Η διαδικασία της PCR αποτελείται από τρία βασικά στάδια:

97 Υλικά και Μέθοδοι 82 Αποδιάταξη των αλυσίδων του DNA µε θέρµανση περίπου στους 95 0 C Σύνδεση των εκκινητών στις αλυσίδες του DNA ύστερα από ψύξη στους C. Επιµήκυνση των αλυσίδων, στους 74 ο C περίπου, µε τη δράση της Taq DNA πολυµεράσης, που είναι σταθερή σε υψηλές θερµοκρασίες. Τα προϊόντα ενός κύκλου χρησιµοποιούνται ως εκµαγείο για τον επόµενο έτσι ώστε κάθε κύκλος να διπλασιάζει το προϊόν του προηγούµενου, ενώ τα παραπάνω στάδια επαναλαµβάνονται µέχρι το τελικό προϊόν να είναι ανιχνεύσιµο (Σχ. 43). Σχήµα 43: Πολλαπλοί κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (Berg et al., 2001)

98 Υλικά και Μέθοδοι RT-PCR ανάλυση Η µέθοδος της RT-PCR (reverse transcriptase-pcr) περιλαµβάνει ένα πρώτο στάδιο σύνθεσης του συµπληρωµατικού DNA (cdna), χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο το RNA, µε τη δράση του ενζύµου της αντίστροφης µεταγραφάσης. Στη συνέχεια, ο πολλαπλασιασµός του cdna ακολουθεί τα παραπάνω στάδια. Χρησιµοποιήθηκε το one-step RT-PCR kit της εταιρίας Qiagen. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε αυτό της αφυδρογονάσης της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH). Η ποσότητα ολικού RNA, η οποία χρησιµοποιήθηκε ανά δοκιµή, ήταν 100ng για την MMP-1, 50ng για τον ΤΙΜΡ-1, 300ng για την IL-6 και 10ng για την GAPDH. Το µίγµα αντίδρασης περιείχε το ολικό RNA, 10 µl 5x RT-PCR Buffer, 10µL 5x Q-solution, µίγµα ενζύµων (αντίστροφη µεταγραφάση και DNA πολυµεράση), 20 pmol από τον κάθε εκκινητή (νοηµατικό και αντινοηµατικό), 10 nmol από το κάθε δεοξυτριφωσφορικό νουκλεοτίδιο (dntp) σε τελικό όγκο 50µL. Η αντίστροφη µεταγραφή πραγµατοποιούνταν για 30min στους 50 ο C. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης γινόταν σε 30 κύκλους ο καθένας των οποίων περιελάµβανε τα παρακάτω στάδια: Αποδιάταξη των αλυσίδων του DNA στους 94 ο C για 1 min. Σύνδεση των εκκινητών στις αλυσίδες του DNA (annealing) σε κατάλληλη θερµοκρασία για 1min. Επιµήκυνση των αλυσίδων στους 72 ο C για 1min. Μετά τον τελευταίο κύκλο, επώαση για επιπλέον 10min στους 72 ο C Μετά το τέλος της PCR, 10µL από το µίγµα της αντίδρασης ηλεκτροφορούνταν σε 2% πήγµα αγαρόζης παρουσία 0,01% βρωµιούχου αιθιδίου. Ο προσδιορισµός της έντασης των ζωνών πραγµατοποιούνταν µε χρήση του προγράµµατος Scion Image και ακολουθούσε σύγκριση µε την ένταση της ζώνης του δείγµατος αναφοράς της GAPDH. Oι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν, η θερµοκρασία σύνδεσης των εκκινητών και το µέγεθος των προϊόντων της PCR, φαίνονται στον Πίνακα Προσδιορισµός δραστικότητας της PKA Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα αποµονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν, κατά τα γνωστά, παρουσία TGF-β1 ή Forskolin ή PGE 2 για διάφορους χρόνους. Τα κύτταρα

99 Υλικά και Μέθοδοι 84 Πίνακας 6: Αλληλουχία εκκινητών και την MMP-1, την IL-6, τον TIMP-1 και την GAPDH ανθρώπου, θερµοκρασία σύνδεσης των εκκινητών και µέγεθος προϊόντων της PCR. ΓΟΝΙ ΙΟ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ Θ ( Ο C) ΜΕΓΕΘΟΣ (bp) GAPDH νοηµατική αντινοηµατική 5 -AACGGATACATTGGGGGTAGGAACA-3 5 -TGATGGGTGTGAACCACGAGAAATA MMP-1 (Konttinen et al., 1999) νοηµατική αντινοηµατική 5 CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3 5 -AGTCCAAGAGAATGGCCGAG TIMP-1 (Moore et al., 2000) νοηµατική αντινοηµατική 5 -CCTTCTGCAATTCCGACCTCGTC CGGGCAGGATTCAGGCTATCTGG συλλέχθηκαν ύστερα από ήπια επεξεργασία µε θρυψίνη-edta και φυλάχτηκαν στους -80 ο C. Η πορεία που ακολούθησε ήταν σύµφωνα µε τις οδηγίες του PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of camp-dependent Protein Kinase της εταιρίας Promega: Λύση των κυττάρων µε ρυθµιστικό διάλυµα 25mM Tris-HCl, ph 7.4, που περιείχε σε τελικές συγκεντρώσεις 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 10mM β-mercaptoethanol, 1µg/ml leupeptin, 1µg/ml aprotinin and 0.5mM PMSF (~ 50µl για ίζηµα κυττάρων από µία πλάκα 6 κελίων) µε επανειληµµένες αναρροφήσεις και εκροφήσεις, χρησιµοποιώντας σύριγγα ινσουλίνης µε λεπτή βελόνα. Φυγοκέντρηση στα 14000g για 5min στους 4 0 C. Συλλογή των υπερκειµένων και επώαση αυτών µε το πεπτίδιο PepTag A1 για 30min στους 30 0 C Τερµατισµός της αντίδρασης µε βρασµό των δειγµάτων για 10min Ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων όπως αναφέρεται παρακάτω. Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιήθηκε σύµφωνα µε τις οδηγίες της εταιρίας. Η µέθοδος βασίζεται στη χρήση φθοριζόντων πεπτιδίων-υποστρωµάτων της PKA. Φωσφορυλίωση του υποστρώµατος από την PKA µεταβάλλει το καθαρό του φορτίο από +1 σε -1. Αυτή η διαφορά στο φορτίο, επιτρέπει στις φωσφορυλιωµένες και µη-

100 Υλικά και Μέθοδοι 85 εκδοχές των υποστρωµάτων να διαχωριστούν γρήγορα σε πήγµα αγαρόζης. Τα φωσφορυλιωµένα είδη µεταναστεύουν προς το θετικό ηλεκτρόδιο ενώ τα µηφωσφορυλιωµένα προς το αρνητικό ηλεκτρόδιο (Σχ. 44). Η αλληλουχία του ειδικού πεπτιδίου-υποστρώµατος για την PKA, το PepTag Α1Peptide, είναι L-R-R-A-S-L-G (Kemptide). Σχήµα 44: Σχηµατική παράσταση της διαδικασίας ανίχνευσης της δραστικότητας της PKA Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε πήγµα αγαρόζης 0,8% ενώ το ρυθµιστικό διάλυµα των δεξαµενών ανόδου και καθόδου ήταν 50mM Tris-HCL (ph 8.0). Ο διαχωρισµός έγινε µε την εφαρµογή σταθερού δυναµικού 100Volt για 20min και ο προσδιορισµός της έντασης των ζωνών πραγµατοποιήθηκε µε χρήση του προγράµµατος Scion Image. H ευαισθησία της µεθόδου υπολογίστηκε στο 1.3ng PKA ανά δείγµα και η σχέση µεταξύ φωσφορυλίωσης του πεπτιδίου και PKA ήταν γραµµική για συγκεντρώσεις 0-16ng PKA.

101 Υλικά και Μέθοδοι Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης Έγινε µε την χρωµατοµετρική µέθοδο Bradford (Bradford, 1976) η οποία στηρίζεται στο σχηµατισµό έγχρωµων συµπλόκων ιοντικής φύσεως µεταξύ των θετικά φορτισµένων πλευρικών αµινοµάδων των πρωτεϊνών και της αρνητικά φορτισµένης χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250, όταν οι πρωτεΐνες βρεθούν σε όξινο ph. Το µέγιστο της απορρόφησης των συµπλόκων αυτών είναι στα 595nm. Συγκρινόµενη λοιπόν η απορρόφηση, στα 595nm, συγκεκριµένης ποσότητας δείγµατος µε την αντίστοιχη πρότυπης ποσότητας πρωτεΐνης προσδιορίζεται η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη της προς µέτρηση ποσότητας δείγµατος. 10. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε τη χρήση του unpaired student s t-test, σε επίπεδο σηµαντικότητας p<0.05.

102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

103 Αποτελέσµατα Το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των κυτταροκινών IL-1β και TNF-α για την παραγωγή MMP-1 από ινοβλάστες και η επίδραση των µονοπατιών της camp/pka και του TGF-β1 σε αυτό. 1.1 Μηχανισµός της επαγωγικής δράσης της IL-1β στην παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες Αν και είναι ήδη γνωστό ότι η IL-1β αποτελεί µια σπουδαία προφλεγµονώδη κυτταροκίνη, άγνωστο παραµένει το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος που ακολουθεί, αφού αυτό πιθανότατα διαφοροποιείται ανάλογα µε τον κυτταρικό τύπο. Ωστόσο, φαίνεται πως οι κινάσες κατέχουν σηµαντική θέση σε αυτό. Έρευνες έχουν δείξει ότι τόσο ο αναστολέας των JNK κινασών, SP (Han et al., 2001) όσο και οι αναστολείς των ΜΕΚ κινασών, PD98059 (Han et al., 1999) και των p38 κινασών, SB (Barchowsky et al., 2000), καταστέλλουν την επαγόµενη από IL-1β έκφραση της MMP-1. Τα ίδια αποτελέσµατα έχουν ληφθεί επίσης και παρουσία αναστολέων των κινασών τυροσίνης σε ινοβλάστες δέρµατος (Lambert et al., 1998), αλλά και παρουσία PGE 2, τόσο σε αρθρικά κύτταρα τύπου ινοβλάστη (Pillinger et al., 2003), όσο και σε ινοβλάστες ούλων (Lin et al., 2001). Επιπλέον, ο µεταγραφικός παράγοντας NF-κB φαίνεται να εµπλέκεται στην επαγόµενη από IL-1β έκφραση της MMP-1 (Barchowsky et al., 2000), ενώ το µονοπάτι της PKC, η εξαρτώµενη από την camp, PKA, καθώς και άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο (Bonin et al., 1990; Munoz et al., 1990; Donati et al., 1990). Προκειµένου να διευκρινιστεί ο ρόλος των ανωτέρω παραγόντων στη επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1, χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα διαφορετικής προέλευσης. Έτσι, ινοβλάστες από αρθρικό υµένα, προερχόµενο από ασθενείς µε οστεοαρθρίτιδα, ρινικό πολύποδα και πνεύµονα ανθρώπου καλλιεργήθηκαν µε IL-1β, απουσία και παρουσία αναστολέων πρωτεϊνικών και MAP κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA (Σχ. 45). Βρέθηκε ότι στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα η IL-1β προκάλεσε σηµαντική διέγερση της παραγωγής της MMP-1, η οποία ενισχύθηκε παρουσία του H-89 (αναστολέας της PKA). Αντίθετα η Calphostin C (αναστολέας της PKC) προκάλεσε ιδιαίτερα σηµαντική µείωση της παραγωγής της MMP-1, ενώ ακόµα πιο έντονη ήταν η µείωση παρουσία της Genistein (µη ειδικός αναστολέας κινασών τυροσίνης). Σηµαντική

104 Αποτελέσµατα 88 επίσης µείωση της επαγόµενης από IL-1β παραγωγής της ΜΜΡ-1 παρατηρήθηκε παρουσία των αναστολέων των ΜΑΡ κινασών, U0126 (ΜΕΚ), SP (JNK) και SB (p38). Παρατηρήθηκε επίσης ενίσχυση της δράσης της IL-1β παρουσία της Indomethacin (γενικός αναστολέας κυκλοοξυγονασών) και σηµαντική µείωση από τον αναστολέα του πρωτεοσώµατος MG-132 (Σχ. 45Α) A * * 100 # MMP-1 (ng/ml) ** ** ** ** ** ** 0 ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β H-89 Cal.C Gen. U0126 SP SB Ind. MG 120 B * 100 * 80 MMP-1 (ng/ml) # ** ** ** 20 ** ** ** 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β H-89 Cal. C Gen. U0126 SP SB Ind. M G

105 Αποτελέσµατα * Γ * 80 * MMP-1 (ng/ml) # ** 20 ** ** 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β H-89 Cal. C Gen. U0126 SP SB Ind. MG Σχήµα 45: Αντιπροσωπευτικά ιστογράµµατα της επίδρασης αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών, ΜΑΡ κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (A) (η=5), ρινικό πολύποδα (B) (η=3) και πνεύµονα (Γ) (η=2) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) απουσία και παρουσία των αναστολέων για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. ctrl: (δείγµα ελέγχου), H-89 (3µM), Cal.C: Calphostin C (0.1µM), Gen.: Genistein (100µM), U0126 (20µM), SP: SP (40µM), SB: SB (1µM), Ind.: Indomethacin (3µM), MG: MG-132 (1µM). (*) και (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση ή µείωση, αντίστοιχα, έναντι IL-1β. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση ένατι ctrl (p<0,05). Αντίστοιχα αποτελέσµατα ελήφθησαν και στις ινοβλάστες από ρινικό πολύποδα, µε µικρές διαφορές, ενώ θα πρέπει να σηµειωθεί η ιδιαίτερα σηµαντική καταστολή παρουσία του U0126 και SP (Σχ. 45Β) Ωστόσο, τα αποτελέσµατα διέφεραν αρκετά στην περίπτωση των ινοβλαστών από πνεύµονα. Εκτός του H-89 και της Indomethacin που ενίσχυσαν, όπως προηγούµενα, την επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1, ενίσχυση προκάλεσε και η Calphostin C, ενώ η Genistein και ο MG-132, αντίθετα µε προηγούµενα, δεν προκάλεσαν στατιστικά σηµαντική µεταβολή. Παρουσία των αναστολέων των ΜΑΡ κινασών, U0126, SP και SB παρατηρήθηκε και πάλι σηµαντική καταστολή της παραγωγής της ΜΜΡ-1 (Σχ. 45Γ).

106 Αποτελέσµατα 90 Τα παραπάνω αποτελέσµατα, τουλάχιστον όσον αφορούσε στις ινοβλάστες από αρθρικό υµένα, επιβεβαιώθηκαν και µε RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA, που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα, οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL- 1β (1ng/ml) απουσία και παρουσία των αναστολέων των πρωτεϊνικών και MAP κινασών, χρησιµοποιήθηκε σε RT-PCR µε ειδικούς εκκινητές για την MMP-1 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 46). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της ΜΜΡ-1 µε αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι τόσο οι αναστολείς των πρωτεϊνικών κινασών Calphostin C και η Genistein, και ιδιαίτερα η τελευταία, όσο και οι αναστολείς των MAP κινασών κατέστειλαν την παρατηρηθείσα διέγερση της έκφρασης της MMP-1 στο επίπεδο του mrna από την IL-1β. Αντίθετα ο Η-89 δεν είχε καµία επίδραση στην αυξορύθµιση της έκφρασης της MMP-1 από την IL-1β. 500bp 400bp 300bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) 200bp ctrl IL-1β IL-1β+H-89 IL-1β+Cal.C IL-1β+Gen. IL-1β+UO IL-1β + SP IL-1β + SB Σχήµα 46: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR, µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MMP-1 ανθρώπου (428bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) για 48h απουσία και παρουσία αναστολέων των πρωτεϊνικών και ΜΑΡ κινασών. Ctrl: δείγµα αναφοράς, απουσία IL-1β. Η επεξήγηση των συντµήσεων των αναστολέων που χρησιµοποιήθηκαν, όπως και η τελική συγκέντρωση αυτών, φαίνονται στη λεζάντα του σχήµατος 45. Από όλα τα παραπάνω αποτελέσµατα συµπεραίνεται ότι:

107 Αποτελέσµατα 91 α) το σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β που οδηγεί στη διέγερση της έκφρασης της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες, ανεξαρτήτως της προέλευσης αυτών, διαµεσολαβείται από την ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων AP-1 και µάλιστα ετεροδιµερών c-fos/c- Jun ή και οµοδιµερών c-jun/c-jun, δεδοµένης της µεγάλης καταστολής που παρατηρείται από τους αναστολείς των ΜΕΚ και JNK κινασών, U0126 και SP600125, αντίστοιχα. β) οι MAP κινάσες p38 (αναστολη από SB203580) φαίνεται να εµπλέκονται επίσης στο µονοπάτι της IL-1β. γ) η PKC και ιδιαίτερα οι κινάσες τυροσίνης (αναστολή από Calphostin C και Genistein, αντίστοιχα) παίζουν σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή του σήµατος της IL-1β στις ινοβλάστες από αρθρικό υµένα και ρινικό πολύποδα, όχι όµως και στις ινοβλάστες από πνεύµονα, όπου η µεν PKC φαίνεται να παίζει κατασταλτικό ρόλο, οι δε κινάσες τυροσίνης δεν εµπλέκονται. δ) η ΡΚΑ φαίνεται ότι έχει κατασταλτικό ρόλο στην επαγόµενη από IL-1β έκφραση της ΜΜΡ-1 στις ινοβλάστες, ανεξάρτητα από την προέλευση αυτών, δεδοµένου ότι παρουσία του αναστολέα της ΡΚΑ, Η-89, παρατηρήθηκε ενίσχυση της δράσης της IL-1β. ε) η παρατηρούµενη ενίσχυση της δράσης της IL-1β παρουσία της Indomethacin, στις ινοβλάστες, ανεξάρτητα από την προέλευση αυτών, υποδηλώνει και πάλι το κατασταλτικό ρόλο του µονοπατιού της camp/ρκα στο µονοπάτι της IL-1β, αφού είναι γνωστό αφενός ότι η IL-1β επάγει τη παραγωγή PGE 2 και αφετέρου ότι η PGE 2 ενεργοποιεί το µονοπάτι της camp/ρκα (DiBattista et al., 1994). στ) στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, στο µονοπάτι της IL-1β που οδηγεί στη διέγερση της έκφρασης της ΜΜΡ-1, πιθανόν να εµπλέκεται ο NF-κB, δεδοµένης της καταστολής από τον αναστολέα του πρωτεοσώµατος MG-132, το οποίο συµµετέχει στην ενεργοποίηση του µεταγραφικού αυτού παράγοντα, χωρίς να αποκλείεται και ο αυτοτελής ρυθµιστικός ρόλος του πρωτεοσώµατος στην έκφραση της ΜΜΡ-1 στις συγκεκριµένες ινοβλάστες. εν φαίνεται να ισχύει το ίδιο και για τις ινοβλάστες πνεύµονα. Από τα παραπάνω συµπεράσµατα ιδιαίτερου ενδιαφέροντος θεωρήθηκαν αφενός η υποδηλούµενη κατασταλτική δράση της ΡΚΑ στο µονοπάτι της IL-1β και αφετέρου η µεγάλη αναστολή που προκαλούσε η Genistein, αφού τα σηµατοδοτικά µονοπάτια της IL-1β δεν συνδέονται µε τη δράση κινασών τυροσίνης. Οι δύο αυτές περιπτώσεις µελετήθηκαν στη συνέχεια.

108 Αποτελέσµατα ιερεύνηση της υπόθεσης καταστολής της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες από το µονοπάτι camp/pka Από τη βιβλιογραφία ήταν γνωστό ότι η ενεργοποίηση του µονοπατιού της camp καταστέλλει την επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες ούλων δοντιών (Lin et al., 2001) και τραχήλου µήτρας (Takahashi et al., 1991). Προκειµένου να διαπιστωθεί αν το ίδιο συµβαίνει και µε ινοβλάστες άλλης προέλευσης, ινοβλάστες από αρθρικό υµένα, ρινικό πολύποδα και πνεύµονα, καλλιεργήθηκαν µε IL-1β απουσία και παρουσία ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 47). Και στις τρεις, διαφορετικής προέλευσης, ινοβλάστες παρουσία τόσο της Forskolin (ενεργοποιητής της αδενυλικής κυκλάσης) όσο και του IBMX (αναστολέας φωσφοδιεστεράσης), αλλά και της εξωγενώς προτιθέµενης PGE 2, παρατηρήθηκε σηµαντική καταστολή της επαγόµενης από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1. Όµως όταν µαζί µε τον ενεργοποιητή χρησιµοποιήθηκε και H-89 (αναστολέας της PKA), η παρατηρηθείσα καταστολή ανεστράφη πλήρως, µάλιστα δε στην περίπτωση της PGE 2 παρατηρήθηκε και ενίσχυση της επαγωγικής δράσης της IL-1β, µόνο όµως για τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα (Σχ. 47Α, Β). 180 * A MMP-1 (ng/ml) # ** ** ** ** 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β Forsk. IBMX PGE 2 Forsk. PGE H-89 H-89

109 Αποτελέσµατα B * MMP-1 (ng/ml) # ** ** ** * 25 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β Forsk. IBMX PGE 2 Forsk. PGE H-89 H Γ # 60 MMP-1 (ng/ml) ** ** ** 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β Forsk. IBM X PGE 2 Forsk. PGE H-89 H-89 Σχήµα 47: Αντιπροσωπευτικά ιστογράµµατα της επίδρασης ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (A), (η=5), ρινικό πολύποδα (B), (η=3) και πνεύµονα (Γ), (η=2), καλλιεργήθηκαν µε IL- 1β (1ng/mL), παρουσία Forskolin (Forsk.) (10µg/mL), IBMX (100µM), PGE 2 (1µg/mL), απουσία και παρουσία H-89 (3µM) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου απουσία IL-1β. (#) στατιστκά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (**) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β. (*) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία H- 89 (p<0.05).

110 Αποτελέσµατα 94 Στις ινοβλάστες πνεύµονα η παρουσία του Η-89 δεν επηρέασε την κατασταλτική δράση της Forskolin και της PGE 2 (Σχ. 47Γ). Στην περίπτωση της PGE 2, η παρατηρούµενη ενίσχυση της δράσης της IL-1β παρουσία του Η-89 (Σχ. 47Α, Β), µάλλον οφείλεται και στην αναστολή της ΡΚΑ που πιθανώς ενεργοποιήθηκε, µέσω της camp, από την ενδογενώς παραγόµενη PGE 2. Είναι γνωστό ότι η IL-1β επάγει τη παραγωγή PGE 2, µέσω COX-2, σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Crofford et al., 1994; Hulkower et al., 1994; Kawai et al., 1998), πνεύµονα (Diaz et al., 1998) και άλλων, όπως δέρµατος (Yan Z et al., 2004). Τα παραπάνω αποτελέσµατα, τουλάχιστον όσον αφορούσε στις ινοβλάστες από αρθρικό υµένα, επιβεβαιώθηκαν και µε RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA, που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL- 1β (1ng/ml) απουσία και παρουσία των ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp ή και παρουσία του Η-89, χρησιµοποιήθηκε σε RT-PCR µε ειδικούς εκκινητές για την MMP-1 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 48). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της ΜΜΡ-1 µε αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι τόσο η Forskolin όσο και ο IBMX (Σχ. 48Α) αλλά και η PGE 2 (Σχ. 48Β) κατέστειλαν την παρατηρηθείσα διέγερση της έκφρασης της MMP-1 στο επίπεδο του mrna από την IL-1β. Η προκαλούµενη από την Forskolin και PGE 2 καταστολή όµως ανεστράφη πλήρως παρουσία του Η-89 (Σχ. 48Α, Β). Α 500bp 400bp 300bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) 200bp ctr IL-1β Forsk IBMX IL-1β+Forsk IL-1β+IBMX IL-1β+H-89+Forsk

111 Αποτελέσµατα 95 Β 500bp 400bp 300bp 200bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) Ctrl IL-1β IL-1β+Indom IL-1β+PGE2 IL-1β+PGE2+Indom IL-1β+PGE2+H-89 Σχήµα 48: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR, µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MMP-1 ανθρώπου (428bp) και την GAPDH (263bp),και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) για 48h παρουσία Forskolin και IBMX (Α), και PGE 2 (Β), απουσία και παρουσία Η-89. Ctrl: δείγµα αναφοράς, απουσία IL-1β. Από τα προηγούµενα αποτελέσµατα συµπεραίνεται ότι: α) ενεργοποιητές του µονοπατιού της camp, όπως η Forskolin, ο IBMX και η PGE 2 καταστέλλουν, µέσω ενεργοποίησης της ΡΚΑ, την επαγόµενη από IL-1β έκφραση της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα. Το ίδιο πιθανόν να συµβαίνει και µε τις ινοβλάστες δέρµατος, ούλων δοντιών και τραχήλου µήτρας, στις οποίες, όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία, το µονοπάτι της camp καταστέλλει την επαγόµενη από IL-1β έκφραση της ΜΜΡ-1. Εάν αυτό πράγµατι συµβαίνει, τότε πρόκειται για ένα κοινό µηχανισµό καταστολής της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-1, µέσω ΡΚΑ, στην πλειονότητα των ινοβλαστών. β) οι ίδιοι ενεργοποιητές του µονοπατιού της camp καταστέλλουν την επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες πνεύµονα, µάλλον όµως όχι µέσω ενεργοποίησης της ΡΚΑ. Στις ινοβλάστες αυτές είναι πιθανόν η camp να δρα µέσω άλλου µονοπατιού. Είναι γνωστό ότι ανάλογα µε τα κύτταρα η camp µπορεί να

112 Αποτελέσµατα 96 ενεργοποιήσει τον ενδοκυτταρικό υποδοχέα της, καλούµενο Epac, o οποίος είναι µία κινάση, που σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της Akt (PKB) µέσω µιας κινάσης, της κινάσης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης στη θέση 3 (ΡΙ3Κ) (Mei et al., 2002). Μένει να αποδειχθεί σε ποιες άλλες ινοβλάστες παρατηρείται το ίδιο φαινόµενο, οπότε θα εξάγεται συµπέρασµα, ανάλογα µε την προέλευση των ινοβλαστών, για το µηχανισµό καταστολής της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-1 που λαµβάνει χώρα Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες Όπως αναφέρθηκε, ο TGF-β1 είναι ένας σηµαντικός αυξητικός παράγοντας µε προστατευτικό ρόλο, αφού εµφανίζει κατ εξοχήν αντιφλεγµονώδη δράση. Χαρακτηριστικό του, µεταξύ άλλων, αποτελεί η ικανότητά του να ανταγωνίζεται τη δράση της IL-1β (Gunther et al., 1994; Arend et al., 1990). Συγκεκριµένα, έχει βρεθεί ότι ανταγωνίζεται τον επαγόµενο από την IL-1 πολλαπλασιασµό των λεµφοκυττάρων (Wahl et al., 1988), ενώ καταστέλλει την έκφραση του υποδοχέα της IL-1 (Dubois et al., 1990). Επίσης έχει αναφερθεί ότι ανταγωνίζεται τη διεγερτική δράση της IL-1β, τόσο στην έκφραση των µορίων προσκόλλησης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Grunberg et al., 1998), όσο και στην έκφραση και παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες δέρµατος (Yan et al., 2001). Έτσι κρίθηκε σκόπιµο να εξακριβωθεί αν ο ανταγωνισµός αυτός λαµβάνει χώρα και σε ινοβλάστες διαφορετικής προέλευσης και συγκεκριµένα σε ινοβλάστες από αρθρικό υµένα. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα ασθενών µε οστεοαρθρίτιδα, καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και για διαφορετικούς χρόνους, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 49). Όπως φαίνεται στο Σχήµα 49 ο TGF-β1 από µόνος του δεν είχε καµία επίδραση στη παραγωγή της ΜΜΡ-1, ανεξάρτητα της συγκέντρωσής του και του χρόνου καλλιέργειας. Αντίθετα η IL-1β προκάλεσε διέγερση της παραγωγής της ΜΜΡ-1, η οποία ήταν χρονοεξαρτώµενη, όχι όµως και δοσοεξαρτώµενη αφού η διαφορά µεταξύ των συγκεντρώσεων 1 και 10ng/ml ήταν πολύ µικρή και διακριτή µετά από 48h επώαση. Όταν όµως η καλλιέργεια µε IL-1β έγινε παρουσία και TGF-β1 τότε παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση της παραγωγής της ΜΜΡ-1, περίπου στα επίπεδα του δείγµατος

113 Αποτελέσµατα 97 ελέγχου, ανεξάρτητα από το χρόνο καλλιέργειας (24 ή 48h) και τη συγκέντρωση IL-1β και TGF-β1 (1 ή 10ng/mL) h # A h # MMP-1 (ng/ml) * MMP-1 (ng/ml) * ctrl TGF β1 IL-1β IL-1β + TGF-β1 0 ctrl TGF-β1 IL-1β IL-1β + TGF-β h B h # MMP-1 (ng/ml) # * MMP-1 (ng/ml) * ctrl TGF-β1 IL-1β IL-1β + TGFβ1 0 ctrl TGFβ1 IL-1β IL-1β + TGFβ1 Σχήµα 49: Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα. Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί, σε συγκεντρώσεις 1ng/mL (Α) και 10ng/mL (Β), για 24 ή 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β (p<0.05).

114 Αποτελέσµατα 98 Τα παραπάνω αποτελέσµατα επιβεβαιώθηκαν και µε ανοσοαποτύπωση Western. είγµατα από το µέσο καλλιέργειας ινοβλαστών αρθρικού υµένα, που είχαν καλλιεργηθεί για 24 και 48h µε IL-1β ή TGF-β1 ή και τα δύο µαζί σε συγκεντρώσεις 1 και 10 ng/ml, που περιείχαν το ίδιο ποσό πρωτεΐνης, κατακρηµνίστηκαν µε αιθανόλη και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωση µε τη χρήση των ίδιων πολυκλωνικών αντισωµάτων έναντι της ΜΜΡ-1, που χρησιµοποιούνταν και στην ELISA (Σχ. 50). 24h prommp-1 52kDa TGF-β1 (ng/ml) IL-1β (ng/ml) h prommp-1 52kDa TGF-β1(ng/mL) IL-1β (ng/ml) Σχήµα 50: Ανοσοαποτύπωση Western του µέσου καλλιέργειας ινοβλαστών αρθρικού υµένα, που καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί σε συγκέντρωση 1 ή 10ng/mL για 24 και 48h, µε τη χρήση πολυκλωνικών αντισωµάτων έναντι της MMP-1. Τα ηλεκτροφορηθέντα δείγµατα περιείχαν το ίδιο ποσό ολικής πρωτεΐνης. Στα δείγµατα από την καλλιέργεια 24h µόνο µία ανοσοαντιδρώσα πρωτεϊνική ζώνη µοριακής µάζας 52kDa, ανιχνεύθηκε, που αντιστοιχεί στη µη-γλυκοζυλιωµένη µορφή του προενζύµου της ΜΜΡ-1, ενώ στα δείγµατα από την καλλιέργεια 48h ανιχνεύθηκαν δύο ανοσοαντιδρώσες πρωτεϊνικές ζώνες µοριακής µάζας 57 και 52kDa, που αντιστοιχούν στη γλυκοζυλιωµένη και µη-γλυκοζυλιωµένη µορφή του προενζύµου της ΜΜΡ-1.

115 Αποτελέσµατα 99 Από την ένταση των ζωνών φαίνεται καθαρά ότι ο TGF-β1 δεν είχε καµία επίδραση στην παραγωγή της ΜΜΡ-1, ανεξάρτητα συγκεντρώσεως και χρόνου καλλιέργειας, ενώ η IL-1β προκάλεσε διέγερση της παραγωγής της ΜΜΡ-1, που ήταν χρονοεξαρτώµενη, όχι όµως και δοσοεξαρτώµενη, αφού η διέγερση από τη συγκέντρωση 1 και 10 ng/ml ήταν στα ίδια επιπεδα. Φαίνεται ότι η επίδραση της IL-1β µετά τη συγκέντρωση 1ng/mL φτάνει σε πλατώ. Η διέγερση αυτή από την IL-1β κατεστάλη σε σηµαντικό βαθµό από τον TGF-β1, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση IL-1β και TGF-β1 και το χρόνο καλλιέργειας. Προκειµένου να διαπιστωθεί εάν όσα παρατηρήθηκαν παραπάνω στο επίπεδο της πρωτεΐνης συµβαίνουν και στο επίπεδο του mrna, ολικό RNA αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα, που καλλιεργήθηκαν για 4, 24 και 48h παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί σε συγκεντρώσεις 1 και 10ng/ml, χρησιµοποιήθηκε σε RT- PCR ανάλυση µε ειδικούς εκκινητές για την MMP-1 και τα προϊόντα της υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 51). Από τη σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την ΜΜΡ-1 προς αυτή των προϊόντων για την GAPDH, προκύπτει ότι ο TGF-β1 δεν επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου της ΜΜΡ-1, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωσή του και το χρόνο καλλιέργειας. Αντίθετα η IL-1β διέγειρε σηµαντικά την έκφραση του γονιδίου της ΜΜΡ-1 κατά χρονοεξαρτώµενο τρόπο, ενώ µε εξαίρεση τις 4h καλλιέργειας η αυξορύθµιση από την IL-1β δεν παρουσίασε διαφορά στις συγκεντρώσεις 1 και 10 ng/ml, υποδηλωτικό ότι µετά τη συγκέντρωση 1ng/ml η έκφραση της ΜΜΡ-1 φτάνει µάλλον σε πλατώ. A 4h 500bp 400bp 300bp 200bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) TGF-β 1 (ng/ml) IL-1β (ng/ml)

116 Αποτελέσµατα 100 Β 24h 500bp 400 bp 300 bp 200 bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) TGF-β 1 (ng/ml) IL-1β (ng/ml) Γ 48h 500bp 400bp 300bp 200bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) TGF-β 1 (ng/ml) IL-1β (ng/ml) Σχήµα 51: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR, µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MMP-1 ανθρώπου (428bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 4h (Α), 24h (Β), 48h (Γ) απουσία (-) ή παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί, σε συγκεντρώσεις 1 και 10 ng/ml. Ο TGF-β1, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση και το χρόνο καλλιέργειας προκάλεσε σηµαντική µείωση της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της MMP-1. Τα αποτελέσµατα αυτά ήταν σε πλήρη συµφωνία µε τα προηγούµενα αποτελέσµατα από την ELISA και την ανοσοαποτύπωση Western.

117 Αποτελέσµατα 101 Επειδή δεν παρατηρήθηκε διαφορά µε τη συγκέντρωση, τόσο στη διεγερτική δράση της IL-1β στην έκφραση της ΜΜΡ-1, όσο και στην κατασταλτική επίδραση του TGF-β1 στη δράση αυτή, όλα τα πειράµατα που θα ακολουθήσουν πραγµατοποιήθηκαν µε συγκέντρωση IL-1β και TGF-β1 1ng/ml. Επειδή οι ινοβλάστες που χρησιµοποιήθηκαν στα προηγούµενα πειράµατα προέρχονταν όλοι από ασθενείς µε οστεοαρθρίτιδα, κρίθηκε σκόπιµο να διερευνηθεί κατά πόσο η κατασταλτική δράση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β έκφραση της MMP-1 συνέβαινε και σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα υγειών ατόµων ή ασθενών µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα. Έτσι ινοβλάστες αρθρικού υµένα από ένα υγειές άτοµο, τρεις ασθενείς µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα και τέσσερεις µε οστεοαρθρίτιδα, καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL-1β (1ng/ml), απουσία και παρουσία TGF-β1 (1ng/ml) και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ΜΜΡ-1 µε ELISA (Σχ. 52) # # # # # # # # MMP-1 (ng/ml) * * * * * * * 20 0 N ctrl - RA- -OA- TGFβ1 IL-1β IL-1β +TGFβ1 Σχήµα 52: Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα υγειών ατόµων (Ν) ή ασθενών µε οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) ή ρευµατοειδή αρθρίτιδα (RA). Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί, σε συγκέντρωση 1ng/mL, για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β (p>0.05).

118 Αποτελέσµατα 102 Με εξαίρεση έναν ασθενή µε οστεοαρθρίτιδα, για όλους τους ασθενείς, ανεξάρτητα της αρθρίτιδας που έπασχαν, αλλά και για το υγειές άτοµο, παρατηρήθηκε ότι ο TGF-β1 είχε την ικανότητα να καταστέλλει την επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1, όµως η καταστολή ήταν ποικίλου βαθµού και κυµαίνονταν από περίπου 50 έως και 100%, χωρίς να υπάρχει συσχέτιση µε το είδος της νόσου. Θα πρέπει όµως εδώ να επισηµανθεί ότι οι ασθενείς µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα δεν παρουσίαζαν την εποχή λήψης του αρθρικού υµένα ενεργό νόσο. Έτσι δεν µπορεί να αποκλειστεί διαφορετική συµπεριφορά του TGF-β1, θετική ή αρνητική, απέναντι στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα ασθενών µε ενεργό ρευµατοειδή αρθρίτιδα. Το επόµενο ερώτηµα ήταν εάν η παρατηρούµενη κατασταλτική δράση του TGFβ1 στην επαγόµενη από IL-1β έκφραση της MMP-1 σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα, συνέβαινε και σε ινοβλάστες άλλης προέλευσης. Έτσι ινοβλάστες από ρινικό πολύποδα και πνεύµονα καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL-1β (1ng/ml), απουσία και παρουσία TGF-β1 (1ng/ml) και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ΜΜΡ-1 µε ELISA (Σχ. 53). Ενώ για τις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης καταστολή της επαγόµενης από IL-1β παραγωγής της MMP-1 (Σχ. 53Α), όπως και για τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, για τις ινοβλάστες πνεύµονα παρατηρήθηκε αντίθετα συνεργειακή δράση του TGF-β1 µε την IL-1β στην παραγωγή της ΜΜΡ-1 (Σχ. 53Β). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι σε µια οµάδα ινοβλαστών διαφορετικής προέλευσης, συµπεριλαµβανοµένων αυτών του αρθρικού υµένα, ανεξάρτητα του είδους της αρθρίτιδας, του ρινικού πολύποδα, του δέρµατος αλλά και άλλων πιθανώς, ο TGF-β1 ανταγωνίζεται την επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1, ενώ σε µια άλλη οµάδα ινοβλαστών διαφορετικής προέλευσης, συµπεριλαµβανοµένων αυτών του πνεύµονα, αλλά και άλλων πιθανώς, ο TGF-β1 είτε δεν επηρεάζει, είτε ενισχύει την επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1. Μένει να διερευνηθεί ποιες ινοβλάστες ανήκουν στη µία οµάδα και ποιες στην άλλη και να βρεθεί η ειδοποιός τους διαφορά. 1.2 Μηχανισµός της επαγωγικής δράσης του TNF-α στην παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες Ο TNF-α, παρόµοια µε την IL-1β, αποτελεί µια προφλεγµονώδη κυτταροκίνη, που εµπλέκεται σε πολλές παθολογικές ή µη καταστάσεις (Dinarello et al., 1992).

119 Αποτελέσµατα A # MMP-1 (ng/ml) * 0 ctrl TGFβ 1 IL-1β IL-1β + TGFβ B ** MMP-1 (ng/ml) # 20 0 ctrl TGF β1 IL-1β IL-1β + TGF β1 Σχήµα 53: Αντιπροσωπευτικά ιστογράµµατα της επίδρασης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα (A), (η=3), και πνεύµονα (B), (η=2). Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν παρουσία IL- 1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί σε συγκέντρωση 1ng/mL, για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορiστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) και (**) στατιστικά σηµαντική µείωση ή αύξηση, αντίστοιχα, έναντι IL-1β (p<0.05). Συνήθως µελετάται µαζί µε την IL-1β, αφού πιστεύεται ότι οι δύο κυτταροκίνες εµφανίζουν πολλές οµοιότητες, τόσο στη βιολογική τους δράση, όσο και στα µονοπάτια που σηµατοδοτούν. Για παράδειγµα, είναι γνωστό ότι ο TNF-α επάγει την έκφραση και παραγωγή της MMP-1 σε ινοβλάστες από ούλα ανθρώπου. Φαίνεται µάλιστα πως στη δράση αυτή εµπλέκονται τα µονοπάτια των κυκλοοξυγονασών, των κινασών τυροσίνης καθώς και των MAP κινασών (Domeij et al., 2002; Lin et al., 2001). Επιπλέον, τα µονοπάτια των MAP κινασών, και κυρίως των JNK, αλλά και αυτό του NF-κB

120 Αποτελέσµατα 104 εµφανίζονται ενεργοποιηµένα από τον TNF-α σε αρθρικούς ινοβλάστες από κουνέλι (Barchowsky et al., 2000). Προκειµένου να διαπιστωθεί κατά πόσο η παρατηρηθείσα καταστολή στην επαγόµενη από IL-1β έκφραση της ΜΜΡ-1 από το µονοπάτι της camp/pka και από τον TGF-β1 αποτελεί χαρακτηριστικό της έκφρασης της ΜΜΡ-1, ανεξάρτητα από το σηµατοδοτικό µονοπάτι που οδηγεί σ αυτή, ή σχετίζεται αποκλειστικά µε το σηµατοδοτικό µονοπάτι που πυροδοτείται από την IL-1β, κρίθηκε σκόπιµο να διερευνηθεί εάν υπάρχει επίδραση του µονοπατιού της camp/pka και του TGF-β1 και στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1. Αρχικά ινοβλάστες αρθρικού υµένα, ρινικού πολύποδα και πνεύµονα καλλιεργήθηκαν µε TNF-α απουσία και παρουσία αναστολέων πρωτεϊνικών και MAP κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. (Σχ. 54). Βρέθηκε ότι στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα ο TNF-α προκάλεσε σηµαντική διέγερση της παραγωγής της MMP-1, η οποία ενισχύθηκε ιδιαίτερα παρουσία του H-89 (αναστολέας της PKA). Αντίθετα, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική µείωση της επαγόµενης από τον TNF-α παραγωγής της MMP-1 παρουσία των αναστολέων των MAP κινασών, του µη ειδικού αναστολέα των κινασών τυροσίνης, Genistein, αλλά και του MG-132 (αναστολέας του πρωτεοσώµατος), ενώ η Calphostin C (αναστολέας της PKC) και η Indomethacin (γενικός αναστολέας κυκλοοξυγονασών) δεν επηρέασαν την επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της MMP-1 (Σχ. 54Α). Και στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, ο TNF-α προκάλεσε ιδιαίτερα σηµαντική διέγερση της παραγωγής της MMP-1. Εκτός του Η-89 (αναστολέας της ΡΚΑ), ο οποίος προκάλεσε µικρή ενίσχυση της δράσης του TNF-α, όλοι οι υπόλοιποι αναστολείς κατέστειλαν σηµαντικά την επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 (Σχ. 54Β). Όπως και στις δύο προηγούµενες περιπτώσεις, έτσι και στις ινοβλάστες πνεύµονα ο TNF-α προκάλεσε ιδιαίτερα σηµαντική διέγερση της παραγωγής της MMP- 1, η οποία κατεστάλη σηµαντικά από τους τρεις αναστολείς των ΜΑΡ κινασών και τον αναστολέα του πρωτεοσώµατος MG-132. Μικρότερη αναστολή προκάλεσε η Indomethacin (γενικός αναστολέας κυκλοοξυγονασών), ενώ ο Η-89 (αναστολέας της ΡΚΑ), η Calphostin C (αναστολέας της PKC) και η Genistein (µη ειδικός αναστολέας κινασών τυροσίνης) δεν επηρέασαν την επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1 (Σχ. 54Γ). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα συµπεραίνεται ότι:

121 Αποτελέσµατα 105 α) το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TNF-α, όπως και αυτό προηγούµενα της IL-1β, που οδηγεί στη διέγερση της έκφρασης της ΜΜΡ-1 στις ινοβλάστες, ανεξαρτήτως της προέλευσης αυτών, διαµεσολαβείται από την ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων AP-1 και µάλιστα ετεροδιµερών c-fos/c-jun ή και οµοδιµερών c-jun/c-jun, δεδοµένης της µεγάλης καταστολής που παρατηρείται από τους αναστολείς των ΜΕΚ και JNK κινασών, U0126 και SP600125, αντίστοιχα. 120 A * 100 MMP-1 (ng/ml) # ** ** ** ** 20 ** 0 Ctrl TNFα ΤΝFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα H-89 Cal. C Gen. U0 SP SB Ind. MG 100 B # * 80 MMP-1 (ng/ml) ** ** ** ** ** ** ** 0 ctrl TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα H-89 Cal.C Gen. UO SP SB Ind MG

122 Αποτελέσµατα Γ # 70 ** 60 MMP-1 (ng/ml) ** ** ** ** 0 Ctrl TNFα ΤΝFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα TNFα H-89 Cal. C Gen. U0 SP SB Ind. M G Σχήµα 54: Αντιπροσωπευτικά ιστογράµµατα της επίδρασης αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών, ΜΑΡ κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα (A) (η=3), ρινικού πολύποδα (B) (η=3) και πνεύµονα (Γ) (η=2), καλλιεργήθηκαν µε TNF-α (1ng/mL) απουσία και παρουσία των αναστολέων για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. ctrl: (δείγµα ελέγχου), H-89 (3µM), Cal.C: Calphostin C (0.1µM), Gen.: Genistein (100µM), U0126 (20µM), SP: SP (40µM), SB: SB (1µM), Ind.: Indomethacin (3µM), MG: MG-132 (1µM). (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) και (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση ή µείωση, αντίστοιχα, έναντι TNF-α (p<0,05). β) οι MAP κινάσες p38 (αναστολη από SB203580) φαίνεται να εµπλέκονται στο µονοπάτι του TNF-α, όπως προηγούµενα σε αυτό της IL-1β, στις ινοβλάστες ανεξαρτήτως της προέλευσης αυτών. γ) όπως και προηγούµενα στο µονοπάτι της IL-1β, οι κινάσες τυροσίνης (αναστολή από Genistein) παίζουν σηµαντικό ρόλο στο µονοπάτι του TNF-α στις ινοβλάστες από αρθρικό υµένα και ρινικό πολύποδα, όχι όµως και σε αυτό στις ινοβλάστες πνεύµονα. δ) η PKC (αναστολή από Calphostin C) µάλλον παίζει διαφορετικό ρόλο στο µονοπάτι του TNF-α, ανάλογα µε την προέλευση των ινοβλαστών. ιεγερτικό στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, όπως και προηγούµενα στο µονοπάτι της IL-1β, ενώ δεν παίζει ρόλο τόσο στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, αντίθετα µε ότι παρατηρήθηκε προηγούµενα µε το µονοπάτι της IL-1β, όσο και στις ινοβλάστες πνεύµονα, όπως και προηγούµενα στο µονοπάτι της IL-1β.

123 Αποτελέσµατα 107 ε) η ΡΚΑ φαίνεται ότι έχει κατασταλτικό ρόλο στην επαγόµενη από TNF-α έκφραση της ΜΜΡ-1 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, όπως και προηγούµενα στην επαγόµενη από IL-1β, δεδοµένου ότι παρουσία του αναστολέα της ΡΚΑ, Η-89, παρατηρήθηκε ενίσχυση της δράσης του TNF-α, ενώ δεν φαίνεται να παίζει ρόλο στις ινοβλάστες από πνεύµονα, αντίθετα µε ότι παρατηρήθηκε προηγούµενα µε το µονοπάτι της IL-1β. στ) αντίθετα µε ότι παρατηρήθηκε µε το µονοπάτι της IL-1β, η Indomethacin είτε δεν επηρέασε (ινοβλάστες αρθρικού υµένα) είτε κατέστειλε (ινοβλάστες ρινικού πολύποδα και πνεύµονα) την επαγόµενη από TNF-α έκφραση της ΜΜΡ-1, που υποδηλώνει ότι η PGE 2, η παραγωγή της οποίας επάγεται από τον TNF-α (Dayer et al., 1985), ή δεν παίζει ρόλο ή µεσολαβεί στην επαγόµενη από TNF-α έκφραση της ΜΜΡ-1. ζ) η δραστικότητα του πρωτεοσώµατος φαίνεται να είναι σηµαντική στο µονοπάτι του TNF-α, που οδηγεί στη διέγερση της έκφρασης της ΜΜΡ-1 και στις τρεις ινοβλάστες, όπως και προηγούµενα στο µονοπάτι της IL-1β. µε εξαίρεση τις ινοβλάστες πνεύµονα. Είναι πολύ πιθανόν στο µονοπάτι του TNF-α, αλλά και της IL-1β µε εξαίρεση τις ινοβλάστες πνεύµονα, που οδηγεί στη διέγερση της έκφρασης της ΜΜΡ-1, να εµπλέκεται ο NF-κB, δεδοµένης της καταστολής από τον αναστολέα του πρωτεοσώµατος MG-132, το οποίο είναι γνωστό ότι εµπλέκεται στην ενεργοποίηση του µεταγραφικού αυτού παράγοντα. εν µπορεί βεβαια να αποκλειστεί και ο αυτοτελής ρυθµιστικός ρόλος του πρωτεοσώµατος στην έκφραση της ΜΜΡ-1 στις συγκεκριµένες ινοβλάστες ιερεύνηση της υπόθεσης καταστολής της επαγόµενης από TNF-α έκφρασης της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες από το µονοπάτι camp/pka Με δεδοµένο την ενίσχυση της διεγερτικής δράσης του TNF-α παρουσία του H- 89 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, αλλά και της παρατήρησης σε προηγούµενο εδάφιο για τη συµβολή του µονοπατιού camp/pka στην καταστολή της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, όχι όµως και πνεύµονα, διερευνήθηκε εάν συµβαίνει κάτι αντίστοιχο και µε το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TNF-α. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα, ρινικού πολύποδα και πνεύµονα καλλιεργήθηκαν µε TNF-α απουσία και παρουσία

124 Αποτελέσµατα 108 ενεργοποιητών της camp και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 55). Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι τόσο στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, όσο και στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα (Σχ. 55Α, Β) η Forskolin (ενεργοποιητής της αδενυλικής κυκλάσης) και ο IBMX (αναστολέας της φωσφοδιεστεράσης) κατέστειλαν σηµαντικά την επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1. Ωστόσο, παρουσία του H-89 δεν παρατηρήθηκε αναστροφή του φαινοµένου, όπως προηγούµενα στο µονοπάτι της IL-1β (βλ. Σχ. 47Α, Β). Αντίθετα µε ότι είχε παρατηρηθεί µε το µονοπάτι της IL-1β (βλέπε Σχ. 47Α, Β), η PGE 2 είτε κατέστειλε, είτε ενίσχυσε την επαγωγική δράση του TNF-α στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, αντίστοιχα (Σχ. 55Α, Β), σε συµφωνία και µε τα προηγούµενα αποτελέσµατα (βλέπε Σχ. 54Α, Β) όπου φαίνεται ότι η Indomethacin δεν επηρέασε ή κατέστειλε την επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της MMP-1 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, αντίστοιχα. Παρουσία δε του Η-89 είτε ανεστράφη µερικώς η αναστολή από την PGE 2, είτε δεν επηρεάστηκε η ενισχυτική δράση της PGE 2 στην επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1, στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, αντίστοιχα (Σχ. 55Α, Β). Στις ινοβλάστες πνεύµονα, όπως και προηγούµενα µε το µονοπάτι της IL-1β (βλ. Σχ. 47Γ), η Forskolin, ο IBMX και η PGE 2 προκάλεσαν ιδιαίτερα σηµαντική καταστολή στην επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της MMP-1, η οποία δεν ανεστράφη παρουσία του Η-89 (Σχ. 55Γ). 80 A # MMP-1 (ng/ml) * * * ** 20 0 Ctrl TNF-α ΤΝF-α TNF-α TNF-α TNF-α TNF-α Forsk. IBMX PGE 2 Forsk. PGE H-89 H-89

125 Αποτελέσµατα B *** 100 # MMP-1 (ng/ml) * * 0 Ctrl TNFα ΤΝFα TNFα TNFα TNFα TNFα Forsk. + IBM + X PG + E Forsk PG + + E 2 H-89 H Γ # 60 MMP-1 (ng/ml) * * * 0 C trl TN Fα ΤΝFα TN Fα TN Fα TN Fα TNFα Forsk. + IB M + X PG + E Forsk PG + + E 2 H -89 H -89 Σχήµα 55: Αντιπροσωπευτικά ιστογράµµατα της επίδρασης ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (A), (η=3) ρινικό πολύποδα (B) (η=3) και πνεύµονα (Γ) (η=2) καλλιεργήθηκαν µε TNF-α (1ng/mL), παρουσία Forskolin (Forsk.) (10µg/mL), IBMX (100µM), PGE 2 (1µg/mL), απουσία και παρουσία H-89 (3µM) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου απουσία TNF-α. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι TNF-α. (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία H- 89. (***) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι TNF-α (p<0.05). Τα αποτελέσµατα αυτά υποδηλώνουν ότι:

126 Αποτελέσµατα 110 α) η κατασταλτική επίδραση της Forskolin και του IBMX στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα µάλλον δεν πρέπει να σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της ΡΚΑ, αλλά µε κάποιο άλλο µονοπάτι εξαρτώµενο από την camp. β) η κατασταλτική επίδραση της PGE 2 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα φαίνεται ότι σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της ΡΚΑ, αφού αναστρέφεται µε τον Η-89, µε την παραδοχή βέβαια ότι η PGE 2 ενεργοποιεί την ΡΚΑ µέσω κάποιου µονοπατιού ανεξάρτητου της camp. γ) η ενισχυτική επίδραση της PGE 2 στην επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα δεν πρέπει να σχετίζεται µε το µονοπάτι της camp/ρκα. δ) η κατασταλτική επίδραση της Forskolin, του IBMX και της PGE 2 στις ινοβλάστες πνεύµονα δεν σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της ΡΚΑ, αλλά µε κάποιο άλλο µονοπάτι εξαρτώµενο από την camp, πιθανόν το µονοπάτι του Epac, όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω (εδάφιο 1.1.1) στην περίπτωση του σηµατοδοτικού µονοπατιού της IL-1β Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες Σε προηγούµενο εδάφιο (1.1.2) µελετήθηκε η επίδραση του αντιφλεγµονώδη παράγοντα TGF-β1 στην επαγόµενη από την προφλεγµονώδη IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 και διαπιστώθηκε ότι, µε εξαίρεση τις ινοβλάστες πνεύµονα, αυτός καταστέλλει σηµαντικά την επαγωγική επίδραση της IL-1β, τόσο σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα όσο και σε ινοβλάστες ρινικού πολύποδα. Έτσι κρίθηκε σκόπιµο να διερευνηθεί κατά πόσο ο TGF-β1 έχει την ίδια επίδραση και στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της MMP-1. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα, ρινικού πολύποδα και πνεύµονα καλλιεργήθηκαν για 48h παρουσία TNF-α ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 56). Στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, όπως και µε το µονοπάτι της IL-1β (βλ. Σχ. 49 και Σχ. 53Α), παρατηρήθηκε ότι ο TGF-β1 προκάλεσε ιδιαίτερα σηµαντική καταστολή της επαγωγικής δράσης του TNF-α στην παραγωγή της ΜΜΡ-1, περίπου στα επίπεδα του δείγµατος ελέγχου (Σχ. 56Α, Β). Αντίθετα στις ινοβλάστες πνεύµονα ο TGF-β1 δεν επηρέασε την επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ- 1 (Σχ. 56Γ), κάτι αντίστοιχο µε αυτό που παρατηρήθηκε και στο µονοπάτι της IL-1β,

127 Αποτελέσµατα 111 µόνο που τότε ο TGF-β1 έδειξε συνεργειακή δράση µε την IL-1β στην παραγωγή της ΜΜΡ-1 (βλ. Σχ. 53Γ). Όπως και προηγούµενα στο µονοπάτι της IL-1β, η καταστολή της επαγόµενης από τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1, από τον TGF-β1, και τα επίπεδα αυτής σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα, δεν φάνηκε να συνδέονται µε το είδος της αρθρίτιδας, ρευµατοειδή ή οστεοαρθρίτιδα (δεν δείχνεται). 80 A # MMP-1 (ng/ml) * 0 Ctrl TNF-α TGF-β1 TNF-α + TGFβ1 80 B # 60 MMP-1 (ng/ml) * 0 Ctrl TNF-α TGF-β1 TNF-α + TGF-β1

128 Αποτελέσµατα Γ # 60 MMP-1 (ng/ml) C trl TN F-α TG F-β 1 TN F-α + TGF-β1 Σχήµα 56: Αντιπροσωπευτικά ιστογράµµατα της επίδρασης του TGF-β1 στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Α) (η=3), ρινικού πολύποδα (B) (η=3) και πνεύµονα (Γ) (η=2), καλλιεργήθηκαν µε TNF-α (1ng/mL) ή TGF-β1(1ng/mL) ή και τα δύο µαζί για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι TNF-α (p<0.05). Τα παραπάνω αποτελέσµατα επιβεβαιώθηκαν, τουλάχιστον για τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και µε αναοσοαποτύπωση Western. είγµατα από το µέσο καλλιέργειας ινοβλαστών αρθρικού υµένα, που είχαν καλλιεργηθεί για 24 και 48h µε TNF-α ή TGF-β1 ή και τα δύο µαζί σε συγκέντρωση 1ng/mL, που περιείχαν το ίδιο ποσό πρωτεΐνης, κατακρηµνίστηκαν µε αιθανόλη και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωση µε τη χρήση των ίδιων πολυκλωνικών αντισωµάτων έναντι της ΜΜΡ-1, που χρησιµοποιούνταν και στην ELISA (Σχ. 57). Στα δείγµατα από την καλλιέργεια για 24h µόνο µία ανοσοαντιδρώσα πρωτεϊνική ζώνη µοριακής µάζας 52kDa, ανιχνεύθηκε, που αντιστοιχεί στη µη-γλυκοζυλιωµένη µορφή του προενζύµου της ΜΜΡ-1, ενώ στα δείγµατα από την καλλιέργεια 48h, αν και δεν είναι ευκρινές στο σχήµα λόγω της έντονης ανοσοαντίδρασης, ανιχνεύθηκαν δύο ανοσοαντιδρώσες πρωτεϊνικές ζώνες µοριακής µάζας 57 και 52kDa, που αντιστοιχούν στη γλυκοζυλιωµένη και µη-γλυκοζυλιωµένη µορφή του προενζύµου της ΜΜΡ-1. Από την ένταση των ζωνών φαίνεται καθαρά ότι ο TGF-β1 δεν είχε καµία επίδραση στην παραγωγή της ΜΜΡ-1, ενώ ο TNF-α προκάλεσε

129 Αποτελέσµατα 113 χρονοεξαρτώµενη διέγερση της παραγωγής της ΜΜΡ-1. Η διέγερση αυτή κατεστάλη σε σηµαντικό βαθµό από τον TGF-β1, ανεξάρτητα από το χρόνο καλλιέργειας (Σχ. 57). 24h prommp-1 52kDa ctrl TGFβ1 TNF-α TGFβ1 +TNF-α 48h prommp-1 52kDa ctrl TGFβ1 TNF-α TGFβ1 +TNF-α Σχήµα 57: Ανοσοαποτύπωση Western του µέσου καλλιέργειας ινοβλαστών αρθρικού υµένα, που καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία TNF-α ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί σε συγκέντρωση 1ng/mL για 24 και 48h, µε τη χρήση πολυκλωνικών αντισωµάτων έναντι της MMP-1. Τα ηλεκτροφορηθέντα δείγµατα περιείχαν το ίδιο ποσό ολικής πρωτεΐνης. ctrl: δείγµα ελέγχου. A 4h 500bp 400bp 300bp 200bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) TGF-β TNF-α

130 Αποτελέσµατα 114 B 24h 500bp 400bp 300bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) 200bp TGF-β TNF-α Γ 48h 500bp 400bp MMP-1 (428bp) 300bp 200bp GAPDH (263bp) TGF-β TNF-α Σχήµα 58: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR, µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MMP-1 ανθρώπου (428bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 4h (Α), 24h (Β), 48h (Γ) απουσία (-) ή παρουσία (+) TNF-α ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί, σε συγκέντρωση 1ng/mL. Προκειµένου να διαπιστωθεί εάν όσα παρατηρήθηκαν παραπάνω στο επίπεδο της πρωτεΐνης συµβαίνουν και στο επίπεδο του mrna, ολικό RNA αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα, που καλλιεργήθηκαν για 4, 24 και 48h παρουσία TNF-α ή

131 Αποτελέσµατα 115 TGF-β1 ή και των δύο µαζί σε συγκέντρωση 1ng/ml, χρησιµοποιήθηκε σε RT-PCR ανάλυση µε ειδικούς εκκινητές για την MMP-1 και τα προϊόντα της υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 58). Από τη σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την ΜΜΡ-1 προς αυτή των προϊόντων για την GAPDH, προκύπτει ότι ο TGF-β1 δεν επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου της ΜΜΡ-1, ανεξάρτητα από το χρόνο καλλιέργειας. Αντίθετα ο TNF-α διέγειρε σηµαντικά την έκφραση του γονιδίου της ΜΜΡ-1 κατά χρονοεξαρτώµενο τρόπο. Ο TGF-β1, ανεξάρτητα από το χρόνο καλλιέργειας προκάλεσε σηµαντική µείωση της επαγόµενης από TNF-α έκφρασης της MMP-1. Τα αποτελέσµατα αυτά ήταν σε πλήρη συµφωνία µε τα προηγούµενα αποτελέσµατα από την ELISA και την ανοσοαποτύπωση Western. Από τα παραπάνω αποτελέσµατα, αλλά και τα αποτελέσµατα που παρουσιάστηκαν στο εδάφιο φαίνεται ότι σε µια οµάδα ινοβλαστών διαφορετικής προέλευσης, συµπεριλαµβανοµένων αυτών του αρθρικού υµένα, ανεξάρτητα του είδους της αρθρίτιδας, του ρινικού πολύποδα, του δέρµατος αλλά και άλλων πιθανώς, ο TGFβ1 ανταγωνίζεται την επαγόµενη από τις προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες IL-1β και TNFα παραγωγή της ΜΜΡ-1, ενώ σε µια άλλη οµάδα ινοβλαστών διαφορετικής προέλευσης, συµπεριλαµβανοµένων αυτών του πνεύµονα, αλλά και άλλων πιθανώς, ο TGF-β1 είτε δεν επηρεάζει, είτε ενισχύει την επαγόµενη από τις προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες IL-1β και TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1. Μένει να διερευνηθεί ποιες ινοβλάστες ανήκουν στη µία οµάδα και ποιες στην άλλη και να βρεθεί η ειδοποιός τους διαφορά. 1.3 ιερεύνηση του µηχανισµού της ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β και TNF-α έκφραση της ΜΜΡ Ρόλος των PGE 2, IL-6 και IL-1Rα Όπως έγινε φανερό από τα προηγούµενα αποτελέσµατα ο TGF-β1 καταστέλλει την επαγόµενη από IL-1β και TNF-α έκφραση και παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα αλλά και ρινικού πολύποδα. ηµιουργήθηκε το ερώτηµα µέσω ποιού µηχανισµού ο TGF-β1 επιτυγχάνει αυτή τη δράση. Από τη βιβλιογραφία ήταν γνωστό ότι ο TGF-β1 επάγει την παραγωγή IL-1Rα, PGE 2 και IL-6 από διάφορα κύτταρα (Turner et al., 1991; Diaz et al., 1998; McAnulty et al., 1995; Eickelberg et al 1999a), ενώ από

132 Αποτελέσµατα 116 παράλληλη µελέτη στο εργαστήριο Βιοχηµείας είχε βρεθεί ότι ο TGF-β1 επάγει σηµαντικά την παραγωγή των ίδιων µορίων από ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Σχ. 59). 350 A # 300 PGE 2 (pg/ml) ctrl TGF-β1 8 7 B # IL-6 (ng/ml) ctrl TGF-β 1 50 Γ # IL-1Rα (ng/ml) ctrl TGF-β 1 Σχήµα 59: Επίδραση του TGF-β1 στην παραγωγή PGE 2 (Α), IL-6 (Β) και IL-1Rα (Γ) από ινοβλάστες αρθρικού υµένα. Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν παρουσία TGFβ1 (1ng/mL) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίσθηκαν τα επίπεδα PGE 2, IL-6 και IL-1Rα µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl (p<0.05). Από τη βιβλιογραφία ήταν επίσης γνωστό ότι τα µόρια αυτά, αφενός παράγονται από διάφορα κύτταρα µε την επαγωγική δράση της IL-1β, µάλιστα δε σε κάποιες περιπτώσεις η IL-1β και ο TGF-β1 εµφανίζουν συνεργειακή δράση στην έκφρασή τους (Wahl et al., 1993; Diaz et al., 1998; Guerne et al., 1989), αφετέρου καταστέλλλουν τη

133 Αποτελέσµατα 117 δράση της IL-1β, είτε ανταγωνιζόµενα αυτήν (IL-1Rα), είτε παρεµβαίνοντας στο σηµατοδοτικό της µονοπάτι (PGE 2 µέσω του µονοπατιού camp/pka), είτε µε διέγερση της παραγωγής του IL-1Rα (IL-6) σε διάφορα κύτταρα (Dibattista et al., 1994; 1995; Gabay et al., 1997; Jordan et al., 1995; Tilg et al., 1994). Τέθηκε έτσι το ερώτηµα µήπως τα µόρια αυτά, παραγόµενα σε υψηλή συγκέντρωση από πιθανή συνέργεια IL-1β και TGF-β1, παίζουν τον ίδιο ρόλο και στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και εµµέσως είναι υπεύθυνα για τη φαινόµενη ανταγωνιστική δράση του TGF-β1; Για να απαντηθεί το ερώτηµα αυτό, ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL-1β ή TGF-β1 ή και τα δύο µαζί, απουσία και παρουσία ειδικών εξουδετερωτικών αντισωµάτων έναντι της IL-6 και του IL-1Rα, καθώς και Indomethacin, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 60). 70 # 60 MMP-1 (ng/ml) * ** 10 0 Ctrl IL-1β TGFβ1 IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β TGFβ1 TGFβ1 TGFβ1 TG Fβ1 + a-il-6 + a-il-1ra + Ind. Σχήµα 60: Επίδραση IL-6, IL-1Ra και PGE 2 στην κατασταλτική δράση του TGF-β1 επί της επαγόµενης από IL-1β παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα. Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL-1β (1ng/mL) ή TGF-β1 (1ng/mL) ή και τα δύο µαζί, απουσία και παρουσία anti-il-6 (2,5 µg/ml), anti- IL-1Ra (1µg/mL) και Indomethacin (Ind.) (3µΜ), και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl, (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β, (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του δείγµατος απουσία Indomethacin (p<0.05). Βρέθηκε ότι η εξουδετέρωση της δράσης των IL-6 και IL-1Rα µε την παρουσία των ειδικών αντισωµάτων, anti-il-6 και anti-il-1rα, δεν είχε καµιά επίδραση στην

134 Αποτελέσµατα 118 κατασταλτική δράση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1. Μόνο παρουσία της Indomethacin, (γενικός αναστολέας κυκλοοξυγονασών), παρατηρήθηκε µικρή αναστροφή (~30%) της κατασταλτικής δράσης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1. Τα αποτελέσµατα αυτά υποδηλώνουν ότι η κατασταλτική δράση του TGF-β1 δεν οφείλεται στην επαγόµενη απ αυτόν παραγωγή IL-6 και IL-1Rα, πιθανόν λόγω της µικρής τους συγκέντρωσης. Από τη βιβλιογραφία (Carter et al., 1990) είναι γνωστό ότι η απαιτούµενη συγκέντρωση του IL-1Rα για να ανταγωνιστεί τη δράση της IL-1β θα πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 100 φορές. Αντίθετα η PGE 2, η παραγωγή της οποίας επάγεται τόσο από την IL-1β όσο και τον TGF-β1, είναι πιθανόν να έχει µικρή συνεισφορά στην κατασταλτική δράση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ Εµπλοκή του µονοπατιού camp/pka Από τα αποτελέσµατα που παρουσιάστηκαν στα εδάφια 1.1. και 1.2. διαπιστώθηκε ότι το µονοπάτι της camp/pka, εµπλέκεται στην καταστολή της επαγόµενης από IL-1β και TNF-α παραγωγής της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, όχι όµως και ινοβλάστες πνεύµονα. Από τη βιβλιογραφία ήταν γνωστό ότι αφενός η πρωτεΐνη SMAD3 εµπλέκεται στην καταστολή της επαγόµενης από IL-1β παραγωγής της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες δέρµατος (Yuan and Varga, 2001) και αφετέρου ότι ο TGF-β1 επάγει την ενεργοποίηση της ΡΚΑ σε µεσαγγειακά κύτταρα νεφρικού σπειράµατος (Wang et al., 1998). Μάλιστα δε, σε επιθηλιακά κύτταρα πνεύµονα βιζόν (Mv1Lu) είχε δειχτεί ότι η ενεργοποίηση λαµβάνει χώρα κατευθείαν µέσω των πρωτεϊνών SMAD3 και 4, χωρίς την µεσολάβηση της camp (Zhang et al., 2004). Με βάση τα δεδοµένα αυτά κρίθηκε σκόπιµο να διερευνηθεί εάν ο TGF-β1 σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα µπορεί να δρα µέσω ενεργοποίησης της ΡΚΑ. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες από αρθρικό υµένα, ρινικό πολύποδα, αλλά και πνεύµονα για συγκριτικούς λόγους, καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL- 1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί απουσία και παρουσία H-89 (αναστολέας PKA) και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 61). Τα ίδια πειράµατα επαναλήφθηκαν µε τον TNF-α όµως στη θέση της IL-1β (Σχ. 62). Βρέθηκε ότι στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα ο TGF-β1 προκάλεσε καταστολή στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1, 50 και 89%,

135 Αποτελέσµατα 119 αντίστοιχα, η οποία ανεστράφη παρουσία του H-89 (αναστολέας PKA) πλήρως και κατά 14% στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, αντίστοιχα. Αντίθετα στις ινοβλάστες πνεύµονα ο TGF-β1 εµφάνισε συνεργειακή δράση µε την IL-1β στην παραγωγή της ΜΜΡ-1, η οποία δεν επηρεάστηκε καθόλου από την παρουσία του Η-89 (Σχ. 61). 100 A # *** 80 MMP-1 (ng/ml) * 20 0 C trl IL-1β TG F-β 1 IL-1β IL-1β + + TGF-β1 TGF-β1 + H B # MMP-1 (ng/ml) *** 20 * 0 Ctrl IL-1β TGF-β1 IL-1β + IL-1β + TGF-β1 TGF-β1 + H-89

136 Αποτελέσµατα Γ ** 80 MMP-1 (ng/ml) # 20 0 C trl IL-1β TG Fβ 1 IL-1β IL-1β + + TGF-β1 TGF-β1 + H-89 Σχήµα 61: Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες παρουσία του αναστολέα της ΡΚΑ Η-89. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (Α), ρινικό πολύποδα (B) και πνεύµονα (Γ) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) ή TGF-β1 (1ng/mL) ή και τα δύο µαζί απουσία και παρουσία H-89 (3µΜ) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) και (**) στατιστικά σηµαντική µείωση ή αύξηση έναντι IL-1β. (***) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία H-89 (p<0.05). 80 A # MMP-1 (ng/ml) ** 20 * 0 Ctrl TNFα TGFβ 1 TNFα TNFα + TGFβ1 + TGFβ 1 + H-89

137 Αποτελέσµατα B # MMP-1 (ng/ml) * * 20 * 0 C trl TN F-α TG F-β 1 TNF-α + TNF-α + TGF-β1 TGF-β1 + H Γ # 60 MMP-1 (ng/ml) C trl T N F -α T G F -β 1 T N F -α T N F -α + + TGF-β1 TGF-β 1 + H-89 Σχήµα 62: Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες παρουσία του αναστολέα της ΡΚΑ, Η-89. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (Α), ρινικό πολύποδα (B) και πνεύµονα (Γ) καλλιεργήθηκαν µε TNF-α (1ng/mL) ή TGF-β1 (1ng/mL) ή και τα δύο µαζί απουσία και παρουσία H-89 (3µΜ) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctr: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι TNF-α, (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία Η-89 (p<0.05). Η ίδια περίπου εικόνα ελήφθη και από τα πειράµατα µε τον TNF-α. Τόσο στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα όσο και ρινικού πολύποδα ο TGF-β1 προκάλεσε καταστολή

138 Αποτελέσµατα 122 στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 κατά 87% περίπου, η οποία ανεστράφη παρουσία του H-89 (αναστολέας PKA) κατά 61,5% και 24,5% στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, αντίστοιχα. Αντίθετα στις ινοβλάστες πνεύµονα ο TGF-β1 δεν είχε καµία επίδραση στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1, είτε απουσία είτε παρουσία του Η-89 (Σχ. 62). Προκειµένου να διαπιστωθεί εάν όσα παρατηρήθηκαν παραπάνω στο επίπεδο της πρωτεΐνης συµβαίνουν και στο επίπεδο του mrna, ολικό RNA αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα, που καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί σε συγκέντρωση 1ng/ml απουσία και παρουσία H-89, χρησιµοποιήθηκε σε RT- PCR ανάλυση µε ειδικούς εκκινητές για την MMP-1 και τα προϊόντα της υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 63). 500bp 400bp 300bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) 200bp TGF-β IL-1β H Σχήµα 63: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR, µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MMP-1 ανθρώπου (428bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h χωρίς (-) ή µε (+) IL-1β ή TGF-β1 ή και τα δύο µαζί, σε συγκέντρωση 1ng/mL απουσία (-) ή παρουσία (+) H-89 (3µΜ). Από τη σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την ΜΜΡ-1 προς αυτή των προϊόντων για την GAPDH, φαίνεται ότι ο TGF-β1 προκάλεσε σηµαντική καταστολή στην επαγόµενη από IL-1β έκφραση του γονιδίου της ΜΜΡ-1, η οποία ανεστράφη σε µεγάλο βαθµό παρουσία του Η-89. Τα αποτελέσµατα αυτά ήταν σε πλήρη συµφωνία µε

139 Αποτελέσµατα 123 τα προηγούµενα αποτελέσµατα από την ELISA, τουλάχιστον για τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα. Τα παραπάνω αποτελέσµατα αποτελούν ισχυρή ένδειξη ότι η κατασταλτική επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από τις προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες IL-1β και TNF-α έκφραση της ΜΜΡ-1 σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα είναι εξαρτώµενη από την ενεργοποίηση της ΡΚΑ. Η εξάρτηση αυτή είναι µεγάλη, σχεδόν πλήρης, στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και αρκετά µικρότερη στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα. Το τελευταίο υποδηλώνει ότι ο TGF-β1, ανάλογα µε την προέλευση των ινοβλαστών, µπορεί να εκφράζει την κατασταλτική του δράση είτε αποκλειστικά µέσω της ενεργοποίησης της ΡΚΑ, είτε και µέσω ενεργοποίησης κάποιου άλλου µονοπατιού. Στις ινοβλάστες που ο TGF-β1 δεν δείχνει κατασταλτική δράση στην επαγόµενη από τις προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες IL-1β και TNF-α έκφραση της ΜΜΡ-1, όπως στις ινοβλάστες πνεύµονα, είτε αυτός δεν έχει τη δυνατότητα ενεργοποίησης της ΡΚΑ, είτε έχει µεν την ικανότητα ενεργοποίησης, όµως κάποιο άλλο µονοπάτι ενεργοποιούµενο ισχυρά στις συγκεκριµένες ινοβλάστες παρεµποδίζει τη δράση της ενεργοποιηµένης ΡΚΑ ή τα σηµατοδοτικά µονοπάτια της IL-1β και του TNF-α που οδηγούν στην έκφραση της ΜΜΡ-1 δεν είναι ευαίσθητα στη δράση της ΡΚΑ. Άλωστε προηγούµενα φάνηκε ότι τα συγκεκριµένα αυτά µονοπάτια ενώ είναι σχεδόν ταυτόσηµα στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, διαφοροποιούνται σηµαντικά στις ινοβλάστες πνεύµονα. Κρίθηκε έτσι σκόπιµο να διερευνηθεί αν πράγµατι πραγµατοποιείται ενεργοποίηση της ΡΚΑ από τον TGF-β1. Για το σκοπό αυτό, ινοβλάστες αρθρικού υµένα, στους οποίους παρατηρήθηκε και η µεγαλύτερη αναστροφή της κατασταλτικής δράσης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β και TNF-α έκφραση της ΜΜΡ-1 από τον Η-89, καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 (1ng/mL) για διαφορετικούς χρόνους (0-120 min) και στα κύτταρα προσδιορίστηκε η ειδική ενζυµική δραστικότητα της PKA, σύµφωνα µε τις οδηγίες του kit «PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of camp- Dependent Protein Kinase», της εταιρίας Promega. Σύµφωνα µε τη µέθοδο, η ενεργοποιηµένη PKA φωσφορυλιώνει το ειδικό υπόστρωµα, το οποίο λόγω του αρνητικού φορτίου που αποκτά, µετακινείται ελαφρά προς την άνοδο κατά τη διάρκεια ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης, διαχωριζόµενο από το µη φωσφορυλιωµένο υπόστρωµα το οποίο κινείται γρήγορα προς την κάθοδο. Με βάση το ποσοστό της φωσφορυλίωσης του υποστρώµατος σε κάθε δείγµα και αυτό από τη δράση γνωστής ποσότητας πρότυπης ενεργοποιηµένης PKA, και γνωστής της συγκεντρώσεως πρωτεΐνης στο κάθε δείγµα, υπολογίστηκε η ειδική ενζυµική δραστικότητα της ΡΚΑ.

140 Αποτελέσµατα Φωσφορυλιωµένο Μη Φωσφορυλιωµένο - TGF-β 1 (1ng/mL) Nc Time (min) 2500 * PKA (units/ml µg πρωτεΐνης) * * * ** ** TGFβ 1 time (min) Σχήµα 64: Προσδιορισµός της ειδικής ενζυµικής δραστικότητας ΡΚΑ σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα που καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 (1ng/ml) για διάφορους χρόνους από 0-120min. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις διπλούν. Nc: αρνητικό δείγµα ελέγχου (µόνο ειδικό υπόστρωµα ΡΚΑ). (*) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του χρόνου µηδέν, (**) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι του χρόνου 30min (p<0.05). Παρατηρήθηκε χρονοεξαρτώµενη αύξηση της ειδικής ενζυµικής δραστικότητας της PKA µέχρι τα πρώτα 30min του χρόνου επώασης µε τον TGF-β1, οπότε και µεγιστοποιήθηκε, και στη συνέχεια µέχρι τις 2h επώαση ακολούθησε µείωση της ειδικής ενζυµικής δραστικότητας της PKA (Σχ. 64). Στη συνέχεια διερευνήθηκε εάν η παρατηρηθείσα αύξηση της ενζυµικής δραστικότητας ΡΚΑ από τον TGF-β1 ήταν ειδική αφενός και αφετέρου εάν ήταν και

141 Αποτελέσµατα 125 δοσοεξαρτώµενη. Έτσι ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων TGF-β1 (0,01-1ng/ml) ή Forskolin ή PGE 2, που είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν την ΡΚΑ µέσω της camp, για 30min, απουσία και παρουσία του ειδικού πεπτιδικού αναστολέα της ΡΚΑ, ΡΚΙ. Στα κύτταρα προσδιορίστηκε η ενζυµική δραστικότητα ΡΚΑ µε τη µέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω (Σχ. 65). + Φωσφορυλιωµένο Μη Φωσφορυλιωµένο - TGF-β 1 (ng/ml) Forsk Pc Pc Pc Nc (30min) Forsk PGE 2 PKI PKI H-89 DMSO 2000 PKA (units/ml µg πρωτεΐνης) * * * 0 0 0,01 0,1 1 Forsk. PGE 2 TGFβ 1 (ng/ml) Σχήµα 65: Προσδιορισµός της ειδικής ενζυµικής δραστικότητας ΡΚΑ σε ινοβλάστες αρθρικού υµένα, που καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,01-1ng/ml) ή Forskolin (10µg/mL) ή PGE 2 (1µg/mL), για 30min, απουσία και παρουσία του ειδικού αναστολέα της ΡΚΑ, ΡΚΙ. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις διπλούν. Ρc και Nc: θετικό (ειδικό υπόστρωµα ΡΚΑ και πρότυπη ΡΚΑ) και αρνητικό (µόνο ειδικό υπόστρωµα ΡΚΑ) δείγµα ελέγχου, αντίστοιχα. (*) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του δείγµατος απουσία TGF-β1 (p<0.05).

142 Αποτελέσµατα 126 Παρατηρήθηκε, ναι µεν, σταδιακή αύξηση της ενζυµικής δραστικότητας PKA µε αυξανόµενη τη συγκέντρωση του TGF-β1, χωρίς όµως µεγάλες διαφορές µεταξύ των διαφορετικών συγκεντρώσεων. Η αύξηση της ενζυµικής δραστικότητας από τον TGF-β1 σε συγκέντρωση 1ng/mL, ήταν στα ίδια επίπεδα µε αυτήν που προκάλεσε η PGE 2 σε συγκέντρωση 1µg/mL. Σηµαντικά µεγαλύτερη αύξηση παρατηρήθηκε από τη Forskolin. Η παρατηρούµενη αύξηση της φωσφορυλίωσης του υποστρώµατος παρουσία του TGFβ1 ή της Forskolin ήταν ειδική, προκαλούµενη από την ΡΚΑ, δεδοµένου ότι κατεστάλη πλήρως παρουσία του ειδικού αναστολέα της ΡΚΑ, του PKI. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν καθαρά ότι ο TGF-β1 έχει την ικανότητα ενεργοποίησης της PKA στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα. Μένει να διερευνηθεί εάν το ίδιο συµβαίνει και µε τις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, οι οποίες εµφανίζουν πολλές οµοιότητες µε αυτές του αρθρικού υµένα. ηµιουργήθηκε στη συνέχεια το ερώτηµα: Με ποιό τρόπο ο TGF-β1 προκαλεί την ενεργοποίηση της ΡΚΑ; Ήταν γνωστό ότι ο κύριος ενεργοποιητής της ΡΚΑ είναι η camp και ότι η δράση του TGF-β1 δεν συνδέεται µε το µονοπάτι της camp. Μήπως όµως ο TGF-β1 στη συγκεκριµένη περίπτωση προκαλεί την παραγωγή camp και µέσω αυτής την ενεργοποίηση της ΡΚΑ; Για να διελευκανθεί τι πράγµατι συµβαίνει, διερευνήθηκε αρχικά εάν η παρατηρούµενη καταστολή της επαγόµενης από την IL-1β και τον TNF-α παραγωγής της ΜΜΡ-1 από τον TGF-β1 συνδέεται µε την παραγωγή της camp. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β ή TNF-α, τόσο απουσία και παρουσία TGF-β1, όσο απουσία και παρουσία της dideoxy-adenosine (αναστολέας της αδενυλικής κυκλάσης) και στο µέσο καλλιέργειας αυτών προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Παρατηρήθηκε ότι η καταστολή της επαγόµενης από την IL-1β και τον TNF-α παραγωγής της ΜΜΡ-1 από τον TGF-β1 δεν επηρεάστηκε καθόλου από την dideoxy-adenosine, δηλαδή από την αναστολή παραγωγής της camp και άρα τη µη ενεργοποίηση της ΡΚΑ, η οποία είναι υπεύθυνη για την κατασταλτική δράση του TGF-β1 (Σχ. 66). Τα αποτελέσµατα αυτά υποδηλώνουν ότι ο TGF-β1 µάλλον δεν δρα µέσω του µονοπατιού της camp. Στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι πράγµατι ο TGF-β1 δεν διεγείρει την παραγωγή της camp. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα καλλιεργήθηκαν τόσο παρουσία TGF-β1 (1ng/ml) για χρονικό διάστηµα 0-60min, όσο και παρουσία Forkolin ή PGE 2 για 15min, και στα κύτταρα µετά τη λύση τους προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της camp µε ELISA (Σχ. 67).

143 Αποτελέσµατα A # 60 MMP-1 (ng/ml) * 10 0 Ctrl IL-1β TGF-β 1 IL-1β IL-1β + + TGF-β1 Τ GF-β1 + ddade 80 B # 70 MMP-1 (ng/ml) * 10 0 C trl TN F-α TG F-β 1 TN F-α TN F-α + + TGF-β1 TG F-β 1 + ddade Σχήµα 66: Eπίδραση της αναστολής παραγωγής camp στην καταστολή από τον TGF-β1 της επαγόµενης από IL-1β (Α) και TNF-α (Β) παραγωγής της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β ή TNF-α σε συγκέντρωση 1ng/mL, απουσία η παρουσία TGF-β1 (1ng/mL) αλλά και απουσία ή παρουσία dedeoxy-adenosine (ddade) (50µM) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β ή TNF-α (p<0.05). Ενώ τόσο η Forskolin (άµεσος ενεργοποιητής της αδενυλικής κυκλάσης), όσο και η PGE 2, που είναι γνωστό ότι δρα µέσω του µονοπατιού της camp, στα 15min της

144 Αποτελέσµατα 128 καλλιέργειας διέγειραν σηµαντικά την παραγωγή της camp, ο TGF-β1 µέχρι και στα 60min καλλιέργειας δεν επηρέασε τα επίπεδα της camp (Σχ. 67). 30 * 25 * camp (pmole/ml) TGF-β1 Forsk. PGE 2 Time (min) Σχήµα 67: Επίδραση του TGF-β1 στην παραγωγή της camp από ινοβλάστες. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 (1ng/mL) από 0-60min και στα κύτταρα προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της camp µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. (*) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του χρόνου µηδέν (p<0.05). Φαίνεται λοιπόν ότι ο TGF-β1 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα επάγει την ενεργοποίηση της PKA κατά ένα τρόπο ανεξάρτητο από το µονοπάτι της camp. Ίσως ο τρόπος αυτός να είναι ο ίδιος µε αυτόν στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύµονα βιζόν (Mv1Lu), ο οποίος πραγµατοποιείται µε την κατευθείαν ενεργοποίηση της ΡΚΑ από τις πρωτεΐνες Smad3 και Smad4 (Zhang et al., 2004). 2. Το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος της IL-1β για την παραγωγή MMP-3 από ινοβλάστες και η επίδραση των µονοπατιών της camp/pka και του TGF-β1 σε αυτό. 2.1 Μηχανισµός της επαγωγικής δράσης της IL-1β στην παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες

145 Αποτελέσµατα 129 Από όλα τα προηγούµενα αποτελέσµατα, φαίνεται ότι τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των IL-1β και TNF-α, που οδηγούν στην έκφραση της ΜΜΡ-1, εµφανίζουν οµοιότητες αλλά και διαφορές µεταξύ τους για τις ινοβλάστες συγκεκριµένης προέλευσης. Για παράδειγµα, οι MAP κινάσες, οι κινάσες τυροσίνης καθώς και η ενεργοποίηση του NF-κB, φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στα µονοπάτια IL-1β και TNF-α, τουλάχιστον στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα. Από την άλλη µεριά η ενεργοποίηση της ΡΚΑ φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την καταστολή της επαγόµενης, τόσο από IL-1β όσο και TNF-α έκφρασης της ΜΜΡ-1 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, σε αντίθεση µε τις ινοβλάστες πνεύµονα. Όµως, ενώ στο µονοπάτι της IL-1β η ενεργοποίηση της ΡΚΑ µπορεί να επιτευχθεί είτε µέσω της camp, η οποία παράγεται από την επίδραση ενεργοποιητών της αδενυλικής κυκλάσης, είτε από την κατευθείαν επίδραση των SMAD πρωτεϊνών από το µονοπάτι του TGF-β1, στο µονοπάτι του TNF-α η ενεργοποίηση της ΡΚΑ επιτυγχάνεται µόνο µε τρόπους ανεξάρτητους από την camp, συµπεριλαµβανοµένου και αυτού του TGF-β1. Άρα φαίνεται ότι, ανεξάρτητα από το σηµατοδοτικό µονοπάτι, η ΡΚΑ που ενεργοποιείται από τον TGF-β1 είναι υπεύθυνη για την καταστολή της έκφρασης της ΜΜΡ-1 κυρίως στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και λιγότερο στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα. Μπορεί λοιπόν να υποδειχθεί ότι ο στόχος της ΡΚΑ είναι παράγοντες που εµπλέκονται στο µονοπάτι της IL-1β και του TNF-α, που οδηγεί στην ενεργοποίηση των ίδιων ρυθµιστικών στοιχείων στον υποκινητή της ΜΜΡ-1. Άρα καθοριστικός παράγοντας για την καταστολή από την ΡΚΑ θα πρέπει µάλλον να είναι ο υποκινητής της ΜΜΡ-1. Προκειµένου αυτό να αποσαφηνιστεί, µελετήθηκε και µια δεύτερη µεταλλοπρωτεϊνάση, η MMP-3. Αυτή, δεν επιλέχθηκε τυχαία. Οι µεταλλοπρωτεϊνάσες MMP-1 και MMP-3 εµφανίζουν οµοιότητες στον τρόπο ρύθµισής τους εξαιτίας πολλών κοινών ρυθµιστικών στοιχείων στον υποκινητή τους (Saus et al., 1988; Wenk et al.,1999). Επιπλέον, έχει δειχθεί, σε ινοβλάστες από ούλα, ότι IL-1β και TNF-α διεγείρουν την έκφραση της MMP-3, και µάλιστα κατά τρόπο εξαρτώµενο από τις κυκλοοξυγονάσες, τις κινάσες τυροσίνης και τις MAP κινάσες (Domeij et al., 2002). Άλλα δεδοµένα επίσης δείχνουν ότι η επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες τραχήλου µήτρας αναστέλλεται από αυξηµένα επίπεδα camp (Takahashi et al., 1991). Φαίνεται δηλαδή πως το µονοπάτι camp/pka επηρεάζει επίσης και την παραγωγή της MMP-3. Έτσι ινοβλάστες από αρθρικό υµένα, όπου παρατηρήθηκε και η µεγαλύτερη συνεισφορά της ΡΚΑ στην καταστολή, από τον TGF-β1, της επαγόµενης από IL-1β

146 Αποτελέσµατα 130 παραγωγής της ΜΜΡ-1, καλλιεργήθηκαν µε IL-1β απουσία και παρουσία αναστολέων πρωτεϊνικών και MAP κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-3 µε ELISA (Σχ. 68) * MMP-3 (ng/ml) # ** ** ** ** 10 0 ** ** Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β ΙL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β H-89 Cal. C Gen. U0126 SP SB Ind. MG Σχήµα 68: Επίδραση αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών, ΜΑΡ κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (η=2), καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) απουσία και παρουσία των αναστολέων για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-3 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. ctrl: (δείγµα ελέγχου), H-89 (3µM), Cal.C: Calphostin C (0.1µM), Gen.: Genistein (100µM), U0126 (20µM), SP: SP (40µM), SB: SB (1µM), Ind.: Indomethacin (3µM), MG: MG-132 (1µM). (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) και (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση ή µείωση, αντίστοιχα, έναντι IL-1β (p<0,05). Τα αποτελέσµατα ήταν αντίστοιχα µε αυτά για την παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα (βλ. Σχ. 45Α). Παρατηρήθηκε, δηλαδή, καταστολή από τους αναστολείς των MAP κινασών, της PKC, των κινασών τυροσίνης και του πρωτεοσώµατος στην επαγόµενη από την IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-3, υποδηλωτικό της εµπλοκής των MAP κινασών, της PKC, των κινασών τυροσίνης και του NF-κΒ στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β που οδηγεί στην έκφραση της MMP-3. Σε συµφωνία

147 Αποτελέσµατα 131 µε τα προηγούµενα αποτελέσµατα για την ΜΜΡ-1, τόσο ο Η-89 όσο και η Indomethacin ενίσχυσαν σηµαντικά τη διεγερτική επίδραση της IL-1β (Σχ. 68). 2.2 ιερεύνηση της υπόθεσης καταστολής της επαγόµενης από IL-1β έκφρασης της ΜΜΡ-3 σε ινοβλάστες από το µονοπάτι camp/pka εδοµένου ότι, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες τραχήλου µήτρας αναστέλλεται από αυξηµένα επίπεδα camp (Takahashi et al., 1991), αλλά και της παρατηρηθείσας ενίσχυσης της δράσης της IL-1β παρουσία του Η-89 και της Indomethacin, διερευνήθηκε η επίδραση ενεργοποιητών της αδενυλικής κυκλάσης στην επαγόµενη από IL-1β, παραγωγή της MMP-3. Για το λόγο αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β απουσία και παρουσία ενεργοποιητών της camp και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-3 µε ELISA (Σχ. 69). Παρατηρήθηκε, όπως και προηγούµενα για την ΜΜΡ-1 (βλ. Σχ. 47Α), ότι η Forskolin, ο IBMX αλλά και η εξωγενώς προστιθέµενη PGE 2, προκάλεσαν έντονη καταστολή της δράσης της IL-β, η οποία όµως ανεστράφη σε µεγάλο βαθµό παρουσία του H-89, υποδηλωτικό ότι το µονοπάτι της camp/pka είναι υπεύθυνο, και στην περίπτωση της ΜΜΡ-3, για την καταστολή της επαγόµενης από την IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες Με βάση τα παραπάνω αποτελέσµατα κρίθηκε σκόπιµο, στη συνέχεια, να µελετηθεί η επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-3. Έτσι, ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν για 48h παρουσία IL-1β ή TGFβ1 ή και των δύο µαζί και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP- 3 µε ELISA (Σχ. 70). Παρατηρήθηκε ότι ο TGF-β1 προκάλεσε καταστολή στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-3 κατά 40% περίπου, η οποία ανεστράφη σε µεγάλο βαθµό παρουσία του H-89 (Σχ. 70), όπως είχε παρατηρηθεί και προηγούµενα µε την ΜΜΡ-1 (βλέπε Σχ. 49 και 61Α), υποδηλωτικό ότι και στην περίπτωση της ΜΜΡ-3, η

148 Αποτελέσµατα 132 κατασταλτική δράση του TGF-β1 διαµεσολαβείται από τη δράση της ενεργοποιηµένης, από αυτόν, ΡΚΑ. Τα αποτελέσµατα αυτά συνηγορούν στο ότι ο στόχος ή οι στόχοι της ΡΚΑ θα πρέπει µάλλον να εντοπίζονται στο µονοπάτι της IL-1β που ενεργοποιεί κοινά ρυθµιστικά στοιχεία στους υποκινητές της ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ MMP-3 (ng/ml) # * * * ** ** 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β Forsk. IBMX PGE 2 Forsk. PGE H-89 H-89 Σχήµα 69: Επίδραση ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp στην επαγόµενη από IL- 1β παραγωγή της MMP-3 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (η=2) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL), παρουσία Forskolin (Forsk.) (10µg/mL), IBMX (100µM), PGE 2 (1µg/mL), απουσία και παρουσία H- 89 (3µM) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-3 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου απουσία IL- 1β. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β, (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία H-89 (p<0.05). 3. ιερεύνηση ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή TIMP-1 και IL-6 από ινοβλάστες Μέχρι τώρα µελετήθηκε η ανταγωνιστική επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή µορίων στα οποία ο ίδιος δεν έχει καµία επίδραση, όπως η ΜΜΡ-1 και η ΜΜΡ-3. ηµιουργήθηκε το ερώτηµα κατά πόσο το ίδιο µπορεί να συµβαίνει και µε µόρια των οποίων την έκφραση επάγει τόσο η IL-1β όσο και ο TGF-β1, αλλά αυτό δεν

149 Αποτελέσµατα 133 γίνεται αντιληπτό λόγω της επαγωγικής δράσης και των δύο. Όπως ήδη δείχτηκε παραπάνω (βλ. Σχ. 59), ο TGF-β1 επάγει την παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα. Είναι επίσης γνωστό ότι αυτός επάγει και την παραγωγή του TIMP-1 από ινοβλάστες (Wright et al., 1991). Τα ίδια µόρια είναι, επίσης, γνωστό ότι επάγονται από την IL-1β (Guerne et al., 1989; Wright et al 1991; DiBattista et al., 1995). Έτσι στη συνέχεια διερευνήθηκε εάν πράγµατι ο TGF-β1 ασκεί ανταγωνιστική επίδραση στην παραγωγή µορίων που και ο ίδιος επάγει, όπως η IL-6 και ο ΤΙΜΡ MMP-3 (ng/ml) # * ** 10 0 C trl IL-1β TG F-β 1 IL-1β IL-1β + + TGF-β1 TGF-β1 + H-89 Σχήµα 70: Επίδραση του TGF-β1 στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-3 από ινοβλάστες παρουσία του αναστολέα της ΡΚΑ Η-89. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα (η=3), καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) ή TGF-β1 (1ng/mL) ή και τα δύο µαζί απουσία και παρουσία H-89 (3µΜ) για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-3 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β, (**) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία H-89 (p<0.05). 3.1 ιερεύνηση ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στη διεγερθείσα από IL-1β παραγωγή της TIMP-1 από ινοβλάστες Αρχικά µελετήθηκε το σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β που οδηγεί στην παραγωγή TIMP-1 από ινοβλάστες. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα

150 Αποτελέσµατα 134 καλλιεργήθηκαν µε IL-1β παρουσία αναστολέων πρωτεϊνικών και MAP κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα TIMP-1 µε ELISA (Σχ. 71). 140 # 120 TIMP-1 (ng/ml) * * * * * 20 0 ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β H-89 Cal.C Gen. U0 SP SB Ind MG Σχήµα 71: Επίδραση αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών, ΜΑΡ κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή του ΤΙMP-1 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα (η=2) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) απουσία και παρουσία των αναστολέων για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του ΤΙMP-1 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. ctrl: (δείγµα ελέγχου), H-89 (3µM), Cal.C: Calphostin C (:0.1µM), Gen.: Genistein (100µM), U0: U0126 (20µM), SP: SP (40µM), SB: SB (1µM), Ind.: Indomethacin (3µM), MG: MG-132 (1µM). (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*): στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β (p<0,05). Βρέθηκε ότι η IL-1β προκάλεσε διέγερση της παραγωγής του ΤΙMP-1, η οποία µειώθηκε σηµαντικά παρουσία της Calphostin C (αναστολέας της PKC), της Genistein (µη ειδικός αναστολέας κινασών τυροσίνης), του U0126 (αναστολέας ΜΕΚ κινασών), του SP (αναστολέας JNK) και του MG-132 (αναστολέας του πρωτεοσώµατος). Αντίθετα ο Η-89 (αναστολέας ΡΚΑ) ο SB (αναστολέας p38 κινασών) και η Indomethacin (γενικός αναστολέας κυκλοοξυγονασών) δεν επηρέασαν τη δράση της IL- 1β στην παραγωγή του ΤΙΜΡ-1 (Σχ. 71).

151 Αποτελέσµατα 135 Τα αποτελέσµατα αυτά υποδηλώνουν ότι η διέγερση της παραγωγής του ΤΙΜΡ-1 από την IL-1β είναι εξαρτώµενη από την ενεργοποίηση του ΑΡ-1 και του NF-κB και σ αυτήν εµπλέκεται το µονοπάτι της PKC και οι κινάσες τυροσίνης. Αντίθετα, το µονοπάτι της camp/pka δεν φαίνεται να παίζει ρόλο, αφού παρουσία του H-89 δεν επηρεάστηκε η δράση της IL-1β. Αν και από τα παραπάνω αποτελέσµατα δεν ήταν εµφανής η επίδραση του µονοπατιού της camp/pka στη διεγερτική δράση της IL-1β, κρίθηκε σκόπιµο να εξεταστεί εάν οι ενεργοποιητές της παραγωγής της camp επηρεάζουν τη δράση αυτή της IL-1β. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β απουσία και παρουσία ενεργοποιητών της παραγωγής camp και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του TIMP-1 µε ELISA (Σχ. 72) # * ** TIMP-1 (ng/ml) * * ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β Forsk IBMX PGE 2 Forsk + H-89 Σχήµα 72: Επίδραση ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp στη διέγερση της παραγωγής του ΤΙMP-1 από IL-1β σε ινοβλάστες. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL), παρουσία Forskolin (Forsk.) (10µg/mL), IBMX (100µM), PGE 2 (1µg/mL), απουσία και παρουσία H-89 (3µM) για 48h, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα ΤΙMP-1 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου απουσία IL- 1β. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*): στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β, (**): στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία H-89 (p<0,05).

152 Αποτελέσµατα 136 Παρατηρήθηκε ότι η Forskolin, ο IBMX και η PGE 2 προκάλεσαν µικρότερη ή µεγαλύτερη στατιστικά σηµαντική αναστολή στη διέγερση της παραγωγής του ΤΙΜΡ-1 από την IL-1β, η οποία ανεστράφη πλήρως όταν η καλλιέργεια µε IL-1β και Forskolin πραγµατοποιήθηκε παρουσία του H-89 (Σχ. 72). Τα αποτελέσµατα αυτά δείχνουν ότι το µονοπάτι της camp/ρκα παίζει µάλλον κατασταλτικό ρόλο στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β, που οδηγεί στη διέγερση της παραγωγής του ΤΙΜΡ-1, όπως συµβαίνει και µε την επαγωγή της παραγωγής ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 από την IL-1β, και αναφέρθηκε προηγούµενα (βλ. Σχ. 47Α και 69). εδοµένου ότι, όπως αποδείχθηκε προηγούµενα, ο TGF-β1 επάγει κατευθείαν, χωρίς τη µεσολάβηση της camp, την ενεργοποίηση της ΡΚΑ στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, και το σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β, που οδηγεί στην έκφραση του ΤΙΜΡ-1, εµφανίζει πολλά κοινά σηµεία µε αυτό των ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3, θεωρήθηκε ότι ο TGF-β1 µπορεί να παίζει κατασταλτικό ρόλο και στο µονοπάτι αυτό της IL-1β. Προκειµένου αυτό να εξακριβωθεί, ινοβλάστες αρθρικού υµένα τεσσάρων ασθενών καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-1β ή TGF-β1 ή και των δύο µαζί για 48h, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του ΤΙΜΡ-1 µε ΕLISA (Σχ. 73). 350 TIMP-1 (ng/ml) * * * * * * * * * * ctrl TGF-β IL-1β TGF-β1 + IL-1β Σχήµα 73: Eπίδραση του TGF-β1 και της IL-1β στην παραγωγή του ΤΙΜΡ-1 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες από αρθρικό υµένα 4 ασθενών καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 (1ng/mL) ή IL-1β (1ng/mL) ή και των δύο µαζί και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του TIMP-1 µε ELISA. Ctrl δείγµα ελέγχου. (*): στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι του ctrl (p<0.05).

153 Αποτελέσµατα 137 Παρατηρήθηκε ότι, σε τρεις από τους τέσσερεις ασθενείς που µελετήθηκαν, η IL- 1β ή ο TGF-β1 προκάλεσαν στατιστικά σηµαντική διέγερση των επιπέδων του TIMP-1. Ωστόσο, και στους τέσσερεις ασθενείς, το αποτέλεσµα της συνδυασµένης δράσης των IL-1β και TGF-β1 ήταν σηµαντικά µικρότερο από το άθροισµα των δύο επιµέρους δράσεων (Πίνακας 7), που υποδηλώνει ότι πιθανόν ο TGF-β1 προκάλεσε καταστολή στη διέγερση της παραγωγής του TIMP-1 από την IL-1β, η οποία δεν είναι όµως άµεσα αντιληπτή λόγω της διεγερτικής επίδρασης και των δύο. Πίνακας 7: Συγκέντρωση (± SD) του ΤΙΜΡ-1 (ng/ml) στο µέσο καλλιέργειας ινοβλαστών παρουσία IL-1β (1ng/mL) ή TGF-β1 (1ng/mL) ή και των δύο µαζί. Παρουσιάζονται επίσης οι µέσες τιµές της συγκέντρωσης (± SD) του ΤΙΜΡ-1 από το άθροισµα των επιµέρους δράσεων των κυτταροκινών. Ο µέσος όρος των SD υπολογίστηκε από τον τύπο: (mean1*sd1 + mean2*sd2)/(mean1 + mean2) Π Ε Ι Ρ Α Μ Α Τ Ι Κ Ε Σ A Θ Ρ Ο Ι Σ Μ Α Τ Ι Μ Ε Σ Τ Ι Μ Ω Ν C o n t r o l T G F - β 1 I L -1 β ΤGF-β1+IL-1β TGF-β1+IL-1β Aσθενής 1 104,66 ± 28,82 100,53 ± 6,90 167,16 ± 19,69 150,16 ± 14,62 267,69 ± 14,89 Ασθενής 2 106,11 ± 25,14 144,16 ± 16,53 127,47 ± 10,77 215,14 ± 33,25 271,63 ± 13,83 Ασθενής 3 22,42 ± 17,58 257,99 ± 37,73 226,23 ± 14,69 234,50 ± 26,93 484,22 ± 26,97 Ασθενής 4 133,96 ± 28,26 180,56 ± 17,32 291,65 ± 22,40 164,78 ± 13,72 472,21 ± 2Ο,46 Τα παραπάνω αποτελέσµατα επιβεβαιώθηκαν και µε RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA, που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL-1β (1ng/ml) ή TGFβ1 (1ng/ml) ή και των δύο µαζί, χρησιµοποιήθηκε σε RT- PCR µε ειδικούς εκκινητές για τον ΤΙMP-1 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 74). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο του ΤΙΜΡ-1 µε αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι τόσο η IL-1β όσο και ο TGFβ1 προκάλεσαν σηµαντική διέγερση της έκφρασης του TIMP-1, η οποία µειώθηκε σηµαντικά όταν η καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε παρουσία και των δύο κυτταροκινών µαζί. ιαπιστώνεται δηλαδή πως πράγµατι ο TGFβ1, αν και διεγείρει και ο ίδιος την έκφραση του TIMP-1, ανταγωνίζεται τελικά τη διεγερτική δράση της IL-1β στην έκφραση του TIMP-1, πιθανόν µέσω της ΡΚΑ.

154 Αποτελέσµατα bp TIMP-1(534bp) 400bp 300bp GAPDH (263bp) TGF-β IL-1β ,0 2,5 Σχτεική ένταση 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ctrl IL-1β TGF-β 1 TGF-β 1 + IL-1β Σχήµα 74: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για τον ΤΙMP-1 ανθρώπου (534bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) ή TGFβ1 (1ng/mL) ή και τα δύο µαζί για 48h. Ctrl: δείγµα αναφοράς. 3.2 ιερεύνηση ανταγωνιστικής δράσης του TGF-β1 στη διεγερθείσα από IL-1β παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες Όπως προαναφέρθηκε, η IL-6, όπως και ο TIMP-1, είναι ένα µόριο του οποίου η παραγωγή διεγείρεται, τόσο από την IL-1β, όσο και από τον TGF-β1. Όπως και στην περίπτωση του TIMP-1, µελετήθηκε αρχικά το σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β που οδηγεί στην παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β παρουσία αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών, MAP κινασών και πρωτεοσώµατος και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα IL-6 µε ELISA (Σχ. 75).

155 Αποτελέσµατα # 3 * * IL-6 (ng/ml) 2 * 1 * 0 Ctrl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β H-89 Cal. C Gen. U0126 SP SB MG Ind. Σχήµα 75: Επίδραση αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών, ΜΑΡ κινασών, κυκλοοξυγονασών και πρωτεοσώµατος στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια.ινοβλάστες αρθρικού υµένα (η=2) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) απουσία και παρουσία των αναστολέων για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. ctrl: (δείγµα ελέγχου), H-89 (3µM), Cal.C: Calphostin C (:0.1µM), Gen.: Genistein (100µM), U0126 (20µM), SP: SP (40µM), SB: SB (1µM), Ind.: Indomethacin (3µM), MG: MG-132 (1µM). (#) στατιστκά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl, (*): στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β (p<0,05). Βρέθηκε ότι η IL-1β προκάλεσε διέγερση της παραγωγής της IL-6, η οποία µειώθηκε σηµαντικά παρουσία της Genistein (µη ειδικός αναστολέας κινασών τυροσίνης), του SP (αναστολέας JNK), της Indomethacin (γενικός αναστολέας κυκλοοξυγονασών) και ιδιαίτερα του MG-132 (αναστολέας του πρωτεοσώµατος). Αντίθετα ο Η-89 (αναστολέας ΡΚΑ), η Calphostin C (αναστολέας της PKC), ο U0126 (αναστολέας ΜΕΚ κινασών) και ο SB (αναστολέας p38 κινασών) δεν επηρέασαν τη δράση της IL-1β στην παραγωγή της IL-6 (Σχ. 75). Τα αποτελέσµατα αυτά υποδηλώνουν ότι η διέγερση της παραγωγής της IL-6 από την IL-1β είναι εξαρτώµενη από την ενεργοποίηση του ΑΡ-1, µάλλον όµως από οµοδιµερή c-jun/c-jun, αφού µόνο ο αναστολέας των JNK προκάλεσε αναστολή, και του NF-κΒ, ενώ σ αυτήν εµπλέκονται οι κινάσες τυροσίνης και η προσταγλανδίνη Ε 2 (PGE 2 ).

156 Αποτελέσµατα 140 Αντίθετα, το µονοπάτι της camp/pka δεν φαίνεται να παίζει ρόλο, αφού παρουσία του H-89 δεν επηρεάστηκε η δράση της IL-1β. Προκειµένου το τελευταίο να διαπιστωθεί, κρίθηκε σκόπιµο να εξεταστεί εάν οι ενεργοποιητές της παραγωγής της camp επηρεάζουν τη διεγερτική δράση της IL-1β στην παραγωγή της IL-6. Για το σκοπό αυτό ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β απουσία και παρουσία ενεργοποιητών της παραγωγής camp και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 µε ELISA (Σχ. 76). 4 3 # IL-6 (ng/ml) C trl IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β Forsk. IB M X Forsk. + H-89 Σχήµα 76: Επίδραση ενεργοποιητών του µονοπατιού της camp στη διέγερση της παραγωγής της IL-6 από IL-1β σε ινοβλάστες. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL), παρουσία Forskolin (Forsk.) (10µg/mL) και IBMX (100µM), απουσία και παρουσία H-89 (3µM) για 48h, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα IL-6 µε ELISA. Κάθε πείραµα πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου απουσία IL-1β. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl (p<0.05). Παρατηρήθηκε ότι τόσο η Forskolin όσο και ο IBMX, απουσία ή παρουσία του Η- 89, δεν επηρέασαν τη διέγερση της παραγωγής της IL-6 από την IL-1β (Σχ. 76). Τα αποτελέσµατα αυτά δείχνουν ότι το µονοπάτι της camp/ρκα δεν παίζει κατασταλτικό ρόλο στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β, που οδηγεί στη διέγερση της παραγωγής της IL-6, αντίθετα µε ότι συµβαίνει µε τη διέγερση της παραγωγής του ΤΙΜΡ-1 και µε την επαγωγή της παραγωγής ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 από την IL-1β, που αναφέρθηκαν προηγούµενα.

157 Αποτελέσµατα 141 Με βάση τα αποτελέσµατα αυτά ήταν αναµενόµενο ο TGF-β1 να µην έχει καµία κατασταλτική επίδραση στη διέγερση της παραγωγής της IL-6 από την IL-1β. Πράγµατι, όταν ινοβλάστες αρθρικού υµένα δύο ασθενών καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-1β ή TGFβ1 ή και των δύο µαζί για 48h και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6, όχι µόνον δεν παρατηρήθηκε καταστολή στη διεγερτική δράση της IL- 1β κατά την παραγωγή της IL-6, αλλά αντίθετα φάνηκε ότι µάλλον υπήρχε συνεργειακή δράση των δύο κυτταροκινών (Σχ. 77). 15 * * 10 IL-6 (ng/ml) 5 * * * * Control TGF-β 1 IL-1β TGF-β 1 + IL-1β Σχήµα 77: Eπίδραση του TGF-β1 και της IL-1β στην παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα 2 ασθενών καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 (1ng/mL) ή IL-1β (1ng/mL) ή και των δύο µαζί και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 µε ELISA. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (*): στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl (p<0.05). Πραγµατικά η διέγερση στην παραγωγή της IL-6 παρουσία και των δύο µαζί ήταν στατιστικά σηµαντικά µεγαλύτερη από το άθροισµα των επιµέρους διεγέρσεων που επιτεύχθηκαν από τη δράση της IL-1β και του TGF-β1 (Πίνακας 8). Από τα αποτελέσµατα αυτά φαίνεται ότι οι σηµαντικές διαφορές µεταξύ της IL-6, από τη µια µεριά, και των ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-3 και ΤΙΜΡ-1 από την άλλη, όσον αφορά στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της IL-1β που οδηγεί στην έκφρασή τους, αλλά και στα ρυθµιστικά στοιχεία στον υποκινητή τους, που ρυθµίζουν µέσω µεταγραφικών παραγόντων την έκφρασή τους, είναι καθοριστικές για την έκφραση της κατασταλτικής,

158 Αποτελέσµατα 142 µέσω ΡΚΑ, επίδρασης του TGF-β1 στη διεγερτική ή επαγωγική δράση της IL-1β. Επιπλέον από τα αποτελέσµατα αυτά συµπεραίνεται ότι δεν ισχύει στις ινοβλάστες, τουλάχιστον του αρθρικού υµένα, αυτό που έχει αναφερθεί για τα χονδροκύτταρα, ότι δηλαδή η παρατηρούµενη ικανότητα του TGF-β1 να ανταγωνίζεται τη δράση της IL-1β, οφείλεται στην καταστολή της έκφρασης των υποδοχέων της (Pronost, 1995). Εάν αυτό συνέβαινε και στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, τότε θα αναµένονταν να έχει επίπτωση και στην έκφραση της IL-6. Πίνακας 8: Συγκέντρωση (± SD) της IL-6 (pg/ml) στο µέσο καλλιέργειας ινοβλαστών παρουσία IL-1β (1ng/mL) ή TGF-β1 (1ng/mL) ή και των δύο µαζί. Παρουσιάζονται επίσης οι µέσες τιµές της συγκέντρωσης (± SD) της IL-6 από το άθροισµα των επιµέρους δράσεων των δύο κυτταροκινών. Ο µέσος όρος των SD υπολογίστηκε από τον τύπο: (mean1*sd1 + mean2*sd2)/(mean1 + mean2) Π Ε Ι Ρ Α Μ Α Τ Ι Κ Ε Σ Τ Ι Μ Ε Σ Α Θ Ρ Ο Ι Σ Μ Α Τ Ι Μ Ω Ν C o n t r o l T G F - β 1 I L -1 β ΤGF-β1+IL-1β TGF-β1+IL-1β Aσθενής 1 317,85 ± 119, ,30 ± 865, ,7± 554, ,30 ± 1493, ± 662,43 Aσθενής 2 291,50 ± 262, ,50 ± 409, ,20 ± 1707, ,67 ± ,7 ± 635,10 4. Επίδραση των κινασών τυροσίνης στην επαγόµενη από IL-1β και TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες Από τη µελέτη των σηµατοδοτικών µονοπατιών της IL-1β, αλλά και του TNF-α, που οδηγούν στην έκφραση της ΜΜΡ-1, διαπιστώθηκε ότι µεταξύ των αναστολέων των πρωτεϊνικών κινασών, που κατέστειλαν την επαγόµενη από την IL-1β και τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, όχι όµως και πνεύµονα, η Genistein ήταν η πλέον δραστική (Σχ. 78 και 79). Επειδή το κύριο σηµατοδοτικό µονοπάτι, τόσο της IL-1β όσο και του TNF-α δεν είναι άµεσα εξαρτώµενο από τις κινάσες τυροσίνης, η δράση αυτή της Genistein φαίνονταν µε πρώτη µατιά ανεξήγητη. Θα µπορούσε να οφείλεται στην αναστολή της ενεργοποίησης του NF-κΒ, ο οποίος φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο στην επαγόµενη από την IL-1β και τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1.

159 Αποτελέσµατα A # 70 B # MMP-1 (ng/ml) * MMP-1 (ng/ml) * ctrl IL-1β IL-1β +Genist 0 Ctrl IL-1β IL-1β + Genist Γ # 60 MMP-1 (ng/ml) Ctrl IL-1β IL-1β + Genist Σχήµα 78: Επίδραση της Genistein στην επαγόµενη από IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Α), ρινικού πολύποδα (Β) και πνεύµονα (Γ) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) απουσία ή παρουσία Genistein (100µM) και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι IL-1β (p<0.05). Στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι η επαγωγή µορίων από την IL-1β και τον TNF-α, που εξαρτάται από την ενεργοποίηση του NF-κΒ, σε διάφορα κύτταρα, όπως η επαγωγή της COX-2 σε λεία µυικά κύτταρα και σε NCI-H292 επιθηλιακά κύτταρα από την IL-1β και τον TNF-α, αντίστοιχα, διαµεσολαβείται από κινάσες τυροσίνης που ενεργοποιούν την κινάση του αναστολέα ΙκΒ-α. Ο τελευταίος τότε φωσφορυλιώνεται και αποικοδοµείται από το πρωτεόσωµα µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση του NF-κΒ (Yang et al., 2002; Huang et al 2003). Επίσης έχει αναφερθεί ότι σε καρκινικά κύτταρα προστάτη η Genistein αναστέλλει την ενεργοποίηση του NF-κΒ µέσω αναστολής της φωσφορυλίωσης του ΙκΒ, άρα και της αποικοδόµησής του από το πρωτεόσωµα (Davis et al., 1999). Από την άλλη µεριά, από άλλους ερευνητές υποστηρίζεται ότι η

160 Αποτελέσµατα 144 παρατηρούµενη αναστολή στη δράση της IL-1β από την Genistein σε κάποια κύτταρα, όπως στην επαγωγή της COX-2 και inos σε µεσαγγειακά κύτταρα νεφρικού σπειράµατος (Tetsuka et al., 1996) ή στη διέγερση της IL-6 σε επιθηλιακά κύτταρα εντέρου ανθρώπου (Parikh et al., 1997), δεν σχετίζεται µε την αναστολή της ενεργοποίησης του NF-κΒ, χωρίς και να διευκρινίζεται τι ακριβώς επηρεάζουν οι κινάσες τυροσίνης στο µονοπάτι της IL-1β. Με δεδοµένη την απουσία από τη βιβλιογραφία σχετικής πληροφορίας για τις ινοβλάστες, δεν ήταν δυνατόν να διατυπωθεί άποψη για το τι από τα δύο συµβαίνει στα κύτταρα αυτά. 80 A # 80 B # MMP-1 (ng/ml) * MMP-1 (ng/ml) * 0 ctrl TNFα TNFα +Genist. 0 ctrl TNF-α TNF-α +Genist Γ # * 50 MMP-1 (ng/ml) ctrl TNF-α TNF-α +Genist. Σχήµα 79: Επίδραση της Genistein στην επαγόµενη από TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Α), ρινικού πολύποδα (Β) και πνεύµονα (Γ) καλλιεργήθηκαν µε TNF-α (1ng/mL) απουσία ή παρουσία Genistein (100µM) και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (#) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl. (*) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι TNF-α (p<0.05).

161 Αποτελέσµατα 145 Όµως, σε µία µελέτη µε κερατινοκύτταρα ανθρώπου είχε δειχτεί ότι η επαγόµενη από την IL-1β έκφραση της ΜΜΡ-1 διαµεσολαβείται από την έµµεση ενδοκυτταρική ενεργοποίηση του υποδοχέα του επιδερµικού αναπτυξιακού παράγοντα (EGFR) από την IL-1β (Wan et al., 2001). Υπενθυµίζεται ότι ο EGFR ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων µε δράση κινάσης τυροσίνης, ενώ ο EGF είναι δυνατόν να ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες Ras και το µονοπάτι των MAP κινασών, αλλά και τους µεταγραφικούς παράγοντες STAT. Για παράδειγµα, είναι γνωστό πως ο EGFR είναι απαραίτητος για την ενεργοποίηση των ERK κινασών (Hu et al., 1998; Wan et al., 2001). Οι τελευταίες, ενεργοποιούν το µονοπάτι του AP-1, µέσω του οποίου πραγµατοποιείται η επαγόµενη από IL-1β έκφραση της MMP-1. Γνωστή είναι επίσης η ενεργοποίηση του EGFR µέσω της Jak2 κινάσης (Yamauchi et al., 1997), γνωστής για την ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων STAT, οι οποίοι έχουν τη δυνατότητα ρύθµισης της έκφρασης της MMP-1. Με δεδοµένο ότι σε ινοβλάστες διαφορετικής προέλευσης, όπως ούλων, δέρµατος (Cury et al., 2007; Mimura et al., 2006), αλλά και αρθρικού υµένα (Brogley et al., 1999) ήταν γνωστό ότι ο EGF επάγει την έκφραση της ΜΜΡ-1, κρίθηκε σκόπιµο να διερευνηθεί εάν πράγµατι στην παρατηρούµενη επαγωγή της έκφρασης της ΜΜΡ-1 από την IL-1β και τον TNF-α στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα συµβάλλει και το σηµατοδοτικό µονοπάτι του EGF, µέσω ενεργοποίησης του EGFR από τις κυτταροκίνες αυτές, όπως και στα κερατινοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό, ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα καλλιεργήθηκαν µε IL-1β ή TNF-α ή EGF, απουσία και παρουσία του ειδικού αναστολέα της δραστικότητας κινάσης τυροσίνης του ενεργοποιηµένου EGFR, AG-1478, και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA (Σχ. 80). Παρατηρήθηκε ότι, τόσο στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Σχ. 80Α) όσο και ρινικού πολύποδα, ιδιαίτερα σ αυτές (Σχ. 80Β), ο EGF προκάλεσε σηµαντική επαγωγή της παραγωγής της ΜΜΡ-1, η οποία κατεστάλη σχεδόν πλήρως παρουσία του AG- 1478, γεγονός που αφενός επιβεβαιώνει ότι το µονοπάτι του EGF εµπλέκεται στην παραγωγή της ΜΜΡ-1 στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και αφετέρου υποδηλώνει την εµπλοκή του ίδιου µονοπατιού στην παραγωγή της ΜΜΡ-1 και στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, που αναφέρεται για πρώτη φορά. Ο αναστολέας AG-1478 προκάλεσε επίσης στατιστικά σηµαντική καταστολή στην επαγόµενη από την IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα και ρινικού πολύποδα, κατά 22% και 55%, αντίστοιχα, ενώ αυτός δεν επηρέασε την

162 Αποτελέσµατα 146 επαγόµενη από τον TNF-α παραγωγή της ΜΜΡ-1 από τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Σχ. 80Α) ή την ανέστειλε σε σηµαντικό βαθµό (42%) στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα (Σχ. 80Β). 35 A * 30 ** 25 MMP-1 (ng/ml) * * 5 0 C trl A G E G F IL -1 β T N F -α E G F IL -1 β T N F -α A G A G A G ** 25 B * 20 * MMP-1 (ng/ml) * ** ** ** 0 C trl A G E G F IL -1 β T N F -α E G F IL -1 β T N F -α A G A G A G Σχήµα 80 : Επίδραση του αναστολέα της δραστικότητας κινάσης τυροσίνης του EGFR, AG-1478, στην επαγόµενη από IL-1β και TNF-α παραγωγή της MMP-1 από ινοβλάστες. Ινοβλάστες αρθρικού υµένα (Α) και ρινικού πολύποδα (Β) καλλιεργήθηκαν µε IL-1β (1ng/mL) ή TNF-α (1ng/mL) ή EGF (100ng/mL), απουσία και παρουσία AG-1478 (10µΜ) και στο µέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της MMP-1 µε ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγµατοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγµατος έγινε εις διπλούν. Ctrl: δείγµα ελέγχου. (*) στατιστικά σηµαντική αύξηση έναντι ctrl, (**) στατιστικά σηµαντική µείωση έναντι του αντίστοιχου δείγµατος απουσία AG-1478 (p<0.05).

163 Αποτελέσµατα 147 Τα παραπάνω αποτελέσµατα, τουλάχιστον όσον αφορούσε στην επίδραση του AG-1478 στην επαγόµενη από την IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ-1 από τις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, επιβεβαιώθηκαν και µε RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA, που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h µε IL- 1β, απουσία και παρουσία AG-1478 χρησιµοποιήθηκε σε RT-PCR µε ειδικούς εκκινητές για την ΜΜΡ-1 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 81). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της ΜΜΡ-1 µε αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι ο AG-1478 κατέστειλε σηµαντικά την επαγόµενη από την IL-1β έκφραση της ΜMP bp 400 bp 300 bp 200 bp MMP-1 (428bp) GAPDH (263bp) IL-1β AG Σχήµα 81: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR µε τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MMP-1 ανθρώπου (428bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που αποµονώθηκε από ινοβλάστες αρθρικού υµένα οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h χωρίς ή µε IL-1β (1ng/ml) απουσία και παρουσία AG-1478 (10µΜ). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα συνάγεται ότι: α) στις ινοβλάστες αρθρικού υµένα, στην επαγόµενη από την IL-1β παραγωγή της ΜΜΡ- 1 συµβάλλει σε µικρό ποσοστό και το µονοπάτι του EGF, µέσω της έµµεσης ενεργοποίησης του EGFR από την IL-1β. Το υπόλοιπο και µεγαλύτερο ποσοστό της ιδιαίτερα σηµαντικής αναστολής από την Genistein, που παρατηρήθηκε προηγούµενα (βλ. Σχ. 45Α), θα πρέπει µάλλον να συνδέεται µε την αναστολή της ενεργοποίησης του