ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΑΡ ΙΑ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΑΡ ΙΑ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ ΣΤΥΛΙΑΝΟΥ Π. ΣΕΡΑΣΚΕΡΗ ΒΙΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τµήµα Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2002

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY DEPARTMENT OF ZOOLOGY LABORATORY OF ANIMAL PHYSIOLOGY INTRACELLULAR SIGNAL TRANSDUCTION MECHANISMS IN THE RAT HEART SERASKERIS P. STYLIANOS BIOLOGIST Doctorate Thesis submitted to the School of Biology of the Faculty of Sciences Aristotle University of Thessaloniki THESSALONIKI 2002

3 Eπιβλέπουσα Αντιγόνη Λάζου, Καθηγήτρια Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή Αντιγόνη Λάζου, Καθηγήτρια Αικατερίνη Γαϊτανάκη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βασίλης Μιχαηλίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Επταµελής Εξεταστική Επιτροπή Ισίδωρος Μπέης, Καθηγητής (Εθνικό Καπποδιστριακό Πανεπιστήµιο Αθηνών) Γεώργιος Θεοφιλίδης, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Ζαχαρίας Σκούρας, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Αντιγόνη Λάζου, Καθηγήτρια (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Αικατερίνη Γαϊτανάκη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια (Εθνικό Καπποδιστριακό Πανεπιστήµιο Αθηνών) Βασίλης Μιχαηλίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) «Η έγκρισις τη ς παρου σης διδακτορικη ς διατριβη ς υπό του Τµήµατος Βιολογίας της Σχολη ς Θετικω ν Επιστηµω ν του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δέν υποδηλοι αποδοχήν τω ν γνωµω ν του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρον 202, παρ. 2 καί ν. 1268/82, άρθρ. 50, παρ. 8).

4 Στους γονείς µου

5 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ATP: τριφωσφορική αδενοσίνη BAPTA: 1,2-δι(2-αµινοφαίνοξυ)αιθάν-Ν, Ν, Ν, Ν, τετραοξικό οξύ BAPTA-AM: κετοξυµεθυλεστέρας του ΒΑΡΤΑ Bmax: µέγιστη συγκέντρωση δεσµευµένων µορίων του συνδέτη BMY 7378: διυδροχλωρική 8[2-[4(2-µεθοξυλφαινυλ)-1-πιπεραζινυλ]αιθυλ]-8- αζάσπιρο[4,5]δεκαν-7,9-διόνη BSA: αλβουµίνη ορού βοδιού camp: κυκλική µονοφωσφορική αδενοσίνη CEC: χλωροαιθυλκλονιδίνη CF: στεφανιαία ροή cgmp: κυκλική µονοφωσφορική γουανοσίνη DAG: διακυλογλυκερόλη DMSO: διµεθυλσουλφοξίδιο DPM: ραδιενεργές διασπάσεις ανά λεπτό EDTA: αιθύλενο-διάµινο-τετραοξικό οξύ ΕC 50 : συγκέντρωση αγωνιστή, στην οποία παρατηρείται το 50% της µέγιστης απόκρισης GDP: διφωσφορική γουανοσίνη G i : ανασταλτική G πρωτεΐνη GPCR: υποδοχέας που συζεύγνυται µε G πρωτεΐνη G s : διεγερτική G πρωτεΐνη GTP: τριφωσφορική γουανοσίνη ΗR: συχνότητα καρδιακού ρυθµού HSP: πρωτεΐνη θερµικού σοκ IC 50 : συγκέντρωση ανταγωνιστή, στην οποία παρατηρείται 50% αναστολή της απόκρισης ΙnsP: φωσφορική ινοσιτόλη InsP 3 : τριφωσφορική ινοσιτόλη K d : σταθερά διάστασης του συµπλόκου συνδέτη-υποδοχέα Κ i : σταθερά αναστολής KHB: διάλυµα Krebs-Henseleit

6 LDH: αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος LVDP: αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας LVEDP: τελοδιαστολική πίεση αριστερής κοιλίας MAPKAP: κινάση 2: πρωτεινική κινάση που ενεργοποιείται από τις MAPKs MAPKs: πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται από µιτογόνα ΝΟ: µονοξείδιο του αζώτου PKC: πρωτεϊνική κινάση C pk d : αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της K d pk i : αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της Κ i PLC: φωσφολιπάση C PMA: φορβολικός εστέρας PtdIns: φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη PtdInsP 2 : διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη T.T.C.: χλωριούχο τριφαινυλτετραζόλιο

7 1 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 5 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6 1. Ενδοκυτταρική µεταγωγή µηνυµάτων 6 2. Υποδοχείς που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες οµή και λειτουργία των G πρωτεϊνών Μονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων που ενεργοποιούνται από υποδοχείςσυζευγµένους µε G πρωτεΐνες Αδρενεργικοί υποδοχείς α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς Υποτύποι των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Ειδικοί αγωνιστές και ανταγωνιστές των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Έκφραση και κατανοµή των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Μονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων που ενεργοποιούνται από τους α 1 - αδρενεργικούς υποδοχείς Συµµετοχή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων σε φυσιολογικές διεργασίες του µυοκαρδίου 23 Ινοτροπισµός 23 Χρονοτροπισµός 24 Αρρυθµιογόνος δράση 25 Μεταβολικές επιδράσεις 25 Υπερτροφία της καρδιάς Ισχαιµία του µυοκαρδίου Επιπτώσεις της ισχαιµίας στο µυοκάρδιο Ισχαιµική προετοιµασία Μηχανισµοί καρδιοπροστατευτικής δράσης της ισχαιµικής προετοιµασίας Σκοπός της εργασίας 33 II. ΥΛΙΚΑ 36 1.ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΧΗΜΙΚΑ- ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΡΑ ΙΟΧΗΜΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΚΤΙΚΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ 38 III. ΜΕΘΟ ΟΙ Εµποτισµός αποµονωµένης καρδιάς αρουραίου Προετοιµασία της καρδιάς για τον εµποτισµό Παρακολούθηση και καταγραφή αιµοδυναµικών παραµέτρων της καρδιάς Προσδιορισµός του ποσοστού νέκρωσης του µυοκαρδίου Παρασκευή κυτταρικών µεµβρανών καρδιάς αρουραίου Πειράµατα σύνδεσης µε ραδιενεργά σηµασµένο συνδέτη Ανάλυση δεδοµένων 43

8 2 5. Αποµόνωση καρδιακών µυοκυττάρων Προσδιορισµός της υδρόλυσης των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης ύστερα από αδρενεργική διέγερση ιαχωρισµός ραδιενεργά σηµασµένης φωσφορικής ινοσιτόλης µε ιοντοανταλλακτική χρωµατογραφία Ρύθµιση της εξωκυτταρικής και ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ιόντων Ca Επίδραση CEC στα καρδιακά µυοκύτταρα Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεΐνης µε τη χρωµατοµετρική µέθοδο Bradford Πειραµατική διαδικασία για τη µελέτη της επίδρασης της διέγερσης των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων στη λειτουργική ανάκτηση της καρδιάς και το ποσοστό του νεκρωµένου µυοκαρδίου µετά την ισχαιµία Στατιστική επεξεργασία 53 ΙV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μελέτη των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων Προσδιορισµός των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά ενήλικου αρουραίου Επίδραση του BMY 7378 στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή φωσφορικής ινοσιτόλης (InsP) Συµµετοχή των ιόντων Ca 2+ στη λειτουργία των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Επίδραση της συγκέντρωσης του εξωκυτταρικού Ca 2+ στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή φωσφορικών ινοσιτολών ([ 3 H]InsP) Ρύθµιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων Ca Επίδραση της ιονοµυκίνης στην παραγωγή [ 3 H]InsP απουσία αδρεναλίνης και µετά από διέγερση µε αδρεναλίνη Επίδραση των ανταγωνιστών των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (α 1Α - και α 1Β -) στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή InsP Επίδραση ανταγωνιστών των καναλιών Ca 2+ (νιφεδιπίνη, Ni 2+, Co 2+ ) στην παραγωγή [ 3 H]InsP που επάγει η αδρενεργική διέγερση Η διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην ισχαιµική προετοιµασία Επίδραση του εµποτισµού µε φαινυλεφρίνη στην ανάκτηση της καρδιάςµετά την ισχαιµία Επίδραση των ανταγωνιστών των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην προστατευτική δράση της φαινυλεφρίνης στην καρδιά Επίδραση του εµποτισµού µε µεθοξαµίνη στην ανάκτηση της καρδιάς µετά την ισχαιµία 92 V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Προσδιορισµός των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά αρουραίου Έκφραση του υποτύπου α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά αρουραίου Συµµετοχή των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων στην υδρόλυση των PtdIns Ο ρόλος του Ca 2+ στην υδρόλυση των φωσφολιπιδίων που επάγει η α 1 - αδρενεργική διέγερση. 108

9 Συµµετοχή των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην εξαρτώµενη από το ασβέστιο παραγωγή [ 3 Η]InsPs Ο ρόλος των καναλιών Ca 2+ στην παραγωγή των [ 3 H]InsPs Ρόλος των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στη προσαρµογή της καρδιάς στην ισχαιµία Συµµετοχή των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στους µηχανισµούς προσαρµογής της καρδιάς στην ισχαιµία Πιθανός προσαρµοστικός µηχανισµός της καρδιάς στην ισχαιµία που συνδέεται µε τη διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Συµπεράσµατα 126 VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 130 VIΙ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 158 VIII. SUMMARY 161

10 4

11 5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων του Τοµέα Ζωολογίας του Τµήµατος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης από το 1998 έως το Στην ολοκλήρωση της διατριβής συνέβαλαν αρκετοί άνθρωποι, αλλά η τελική ευθύνη βαρύνει αποκλειστικά και µόνον εµένα. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην επιβλέπουσα της διδακτορικής διατριβής, Καθηγήτρια Αντιγόνη Λάζου, η οποία µου εµπιστεύθηκε την εκπόνηση αυτής της διατριβής και παρείχε συνεχώς την πολύτιµη καθοδήγησή της σε όλα τα στάδια της διατριβής, καθώς και για την υποµονή της και τη συµπαράστασή της στην αντιµετώπιση διαφόρων εµποδίων που τυχόν ανέκυψαν κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της. Ευχαριστώ τα µέλη της Συµβουλευτικής Επιτροπής, Αναπλ. Καθηγήτρια, Αικατερίνη Γαϊτανάκη και Αναπλ. Καθηγητή, Βασίλη Μιχαηλίδη, για την αµέριστη συµπαράσταση και τη συνεχή υποστήριξή τους. Θερµές ευχαριστίες εκφράζω στα µέλη της Εξεταστικής Επιτροπής, Καθηγητή Ισίδωρο Μπέη, Καθηγητή Γεώργιο Θεοφιλίδη, Καθηγητή Ζαχαρία Σκούρα και Αναπλ. Καθηγήτρια Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά για τις χρήσιµες παρατηρήσεις και υποδείξεις τους. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω τον ιδάκτορα του Τµήµατος Ιατρικής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, Καρδιοχειρουργό Ευσταθίου Ανδρέα, επειδή αποτέλεσε για µένα ανεξάντλητη πηγή πολύτιµων πληροφοριών, έµπνευσης και κριτικής σκέψης, ενώ παράλληλα υπήρξε πολύτιµος βοηθός και ακούραστος συνεργάτης καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της διατριβής. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Φυσιολογίας Ζώων για το ευχάριστο κλίµα οµόνοιας, σύµπνοιας και συνεργασίας.

12 6 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Ενδοκυτταρική µεταγωγή µηνυµάτων Μία βασική ιδιότητα των ζωντανών οργανισµών είναι η ικανότητά τους να αποκρίνονται σε διάφορα ερεθίσµατα. Κάθε κύτταρο, είτε είναι µονοκύτταρος οργανισµός είτε ανήκει σε έναν πολυκύτταρο οργανισµό, διαθέτει την ικανότητα να λαµβάνει και να επεξεργάζεται ένα πλήθος πληροφοριών-µηνυµάτων από το περιβάλλον. Στις περισσότερες περιπτώσεις, το µήνυµα είναι µία χηµική ένωση που αλληλεπιδρά µε έναν υποδοχέα της πλασµατικής µεµβράνης του κυττάρου. Η θεωρία περί της ύπαρξης ειδικών υποδοχέων που λειτουργούν ως δέκτες µηνυµάτων, ρυθµίζοντας έτσι την απόκριση των κυττάρων, έχει τις βάσεις της στις εργασίες του Langley (1906) σχετικά µε τις δράσεις της νικοτίνης και του κουραρίου και του Ehrlich (1908) για τη δράση ορισµένων τοξινών. Στον τελευταίο αποδίδεται και η χαρακτηριστική φράση «corpora non agunt nisi fixata», δηλαδή «οι ενώσεις δεν επιδρούν, αν πρώτα δεν δεσµευτούν». Η θεωρία των υποδοχέων, διαµορφωµένη στη σηµερινή της µορφή, υποστηρίζει ότι µία χηµική ένωση, ενδογενούς ή εξωγενούς προέλευσης, προκαλεί ένα συγκεκριµένο βιολογικό αποτέλεσµα, αλληλεπιδρώντας χηµικά µε ένα ειδικό πρωτεϊνικό µόριο (υποδοχέας) του βιολογικού συστήµατος στο οποίο επιδρά. Η ανάπτυξη χηµικών δεσµών µεταξύ της ένωσης και του µορίου υποδοχέα µεταβάλλει τη λειτουργία του τελευταίου, προκαλώντας τελικά την εµφάνιση ενός µετρήσιµου βιολογικού αποτελέσµατος (Goldstein και συν. 1974). Η αλληλεπίδραση της χηµικής ένωσης, που χαρακτηρίζεται ως συνδέτης (ligand), µε τον αντίστοιχο υποδοχέα είναι ταχεία και αντιστρεπτή, επιτρέποντας έτσι τη γρήγορη εκδήλωση και την καθορισµένη διάρκεια, που θα πρέπει να χαρακτηρίζει µια φυσιολογική απόκριση (Scatchard 1949, Kahn και συν. 1976, Boeyaems και Dumont 1977). Η σύνδεση του συνδέτη µε τον ειδικό υποδοχέα αποτελεί ουσιαστικά το πρώτο βήµα µιας ακολουθίας γεγονότων µε την οποία επιτυγχάνεται η ενδοκυτταρική µεταβίβαση του µηνύµατος προς ένα τελικό µόριο που λειτουργεί ως τελικός αποδέκτης (Hardie 1990, Barritt 1992). Αυτή η ακολουθία (cascade) χηµικών διεργασιών, χάρη στην οποία ένα εξωκυττάριο µήνυµα επιδρά στα κύτταρα-στόχους προκαλώντας την εκδήλωση µιας συγκεκριµένης απόκρισης, ονοµάζεται µονοπάτι ενδοκυτταρικής µεταγωγής µηνύµατος.

13 7 Στα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων η διέγερση των υποδοχέων οδηγεί στην ενεργοποίηση πρωτεϊνών-τελεστών (effector proteins), όπως είναι η φωσφολιπάση C (PLC), η αδενυλική κυκλάση (AC) ή κανάλια ιόντων (ασβεστίου, καλίου). Οι πρωτεΐνες αυτές ρυθµίζουν µε τη σειρά τους την παραγωγή διαφόρων µορίων ή ιόντων, όπως το κυκλικό AMP, το κυκλικό GMP, τα ιόντα Ca 2+ η τριφωσφορική ινοσιτόλη (InsP 3 ) και η διακυλογλυκερόλη (DAG), που αποτελούν τα λεγόµενα δεύτερα µηνύµατα. Ονοµάζονται δεύτερα µηνύµατα, επειδή ως πρώτο µήνυµα θεωρείται το αντίστοιχο εξωκυττάριο µόριο που δεσµεύεται στον υποδοχέα, το οποίο λέγεται επίσης και αγωνιστής. Τα δεύτερα µηνύµατα συµµετέχουν στα ενδιάµεσα στάδια των διαφόρων µονοπατιών, µεσολαβώντας στη µεταγωγή του εξωκυττάριου µηνύµατος (Hepler και Gilman 1992, Tang και Gilman 1992, Berridge 1993, Raymond 1995). Αυτού του είδους τα µονοπάτια (σηµατοδοτικοί µηχανισµοί) ενεργοποιούνται κυρίως από µια µεγάλη οµάδα υποδοχέων που ανήκουν στην κατηγορία των υποδοχέων GPCR, δηλαδή των υποδοχέων που συνδέονται µε G πρωτεΐνες (G-Protein Coupled Receptors) (McFarland και συν. 1989, Strader και συν. 1989, Raymond και συν. 1990). Γενικά, υπάρχουν τρεις µεγάλες κατηγορίες υποδοχέων. Εκτός από τους GPCR υποδοχείς (G-Protein Coupled Receptors), που δρουν µέσω της ενεργοποίησης ειδικών G πρωτεϊνών, υπάρχουν και οι υποδοχείς µε δράση κινάσης της τυροσίνης (Receptor Tyrosine Kinases). Οι ενεργοποιηµένοι υποδοχείς της κατηγορίας αυτής φωσφορυλιώνουν διάφορες πρωτεΐνες σε συγκεκριµένες τυροσίνες του µορίου τους (Waterfield 1989, Williams 1989, Fantl και συν. 1993). Τέλος, υπάρχουν και οι υποδοχείς που συνδέονται µε κανάλια ιόντων (Ion-Channel-Linked-Receptors) η ενεργοποίηση των οποίων προκαλεί τη διαµετακίνηση ιόντων (Jan και Jan 1989, Krueger 1989, Montal 1990). Συνήθως, το τελευταίο βήµα σε ένα µονοπάτι ενδοκυτταρικής µεταγωγής µηνύµατος είναι η φωσφορυλίωση συγκεκριµένων πρωτεϊνών-στόχων και η επακόλουθη ενεργοποίηση ή αναστολή τους. Για το λόγο αυτό, οι πρωτεϊνικές κινάσες, καθώς επίσης και οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες κατέχουν κοµβική θέση σε πολλά µονοπάτια, αφού ο βαθµός φωσφορυλίωσης µιας πρωτεΐνης εξαρτάται από τις σχετικές δραστικότητες της κινάσης που τη φωσφορυλιώνει και της φωσφατάσης που την αποφωσφορυλιώνει (Nishizuka 1992, Fantl και συν. 1993, Nishida και συν. 1993, Lowry και Willumsen 1993). Η ενεργοποίηση ή η αναστολή του τελικού µορίου αποδέκτη, το οποίο µπορεί να είναι ένα ένζυµο του µεταβολισµού ή κάποια

14 8 ρυθµιστική πρωτεΐνη, διαµορφώνει τελικά την απόκριση του κυττάρου στο αρχικό µήνυµα. Επειδή η παρούσα µελέτη ασχολήθηκε µε υποδοχείς που ανήκουν στην κατηγορία των GPCR, παρατίθεται στη συνέχεια µια σύντοµη επισκόπηση των δεδοµένων που έχουν προκύψει µέχρι σήµερα, σχετικά µε τους υποδοχείς της κατηγορίας αυτής. 2. Υποδοχείς που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες Βασικό γνώρισµα των υποδοχέων της κατηγορίας GPCR είναι η σύζευξή τους µε την πρωτεΐνη-τελεστή (effector) µε τη µεσολάβηση ετεροτριµερών πρωτεϊνών, που έχουν την ικανότητα να δεσµεύουν και να υδρολύουν µόρια τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) και οι οποίες ονοµάζονται G πρωτεΐνες (Northup και συν. 1980, Hepler και Gilman 1992, Linder και Gilman 1992, Neer 1995). Στα κύτταρα των θηλαστικών έχουν, ήδη, αναγνωριστεί πολλοί υποδοχείς που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες, οι οποίοι διεγείρονται από µια µεγάλη ποικιλία αγωνιστών που περιλαµβάνουν βιογενείς αµίνες, όπως η αδρεναλίνη και η νοραδρεναλίνη, µικρά πεπτίδια, όπως οι εγκεφαλίνες και η ουσία Ρ, γλυκοπρωτεΐνες µεγάλου µοριακού βάρους, όπως η ωχρινοποιητική ορµόνη κ.α. (Casey και Gilman 1988, Limbird 1988, McFarland και συν. 1989, Birnbaumer και Brown 1990, Raymond και συν. 1990). Παρά την ποικιλία των αντίστοιχων συνδετών, όλοι οι υποδοχείς που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες έχουν παρόµοια δοµή. Συγκεκριµένα, περιέχουν επτά υδροφοβικά τµήµατα τα οποία εκτιµάται ότι σχηµατίζουν ισάριθµες διαµεµβρανικές έλικες (Dixon και συν. 1986, Strader και συν. 1994). Στην πραγµατικότητα, πρόκειται για µία υπεροικογένεια πρωτεϊνών-υποδοχέων, που έχουν ως κοινό χαρακτηριστικό το πρότυπο των επτά διαµεµβρανικών ελίκων (seven-transmembrane helices receptor proteins), µε µακρά εξελικτική ιστορία, αφού το ίδιο µοτίβο εµφανίζεται και σε βακτηριακές µεµβρανικές πρωτεΐνες, όπως για παράδειγµα η βακτηριοροδοψίνη (Henderson και συν. 1990). Οι οµολογίες της αλληλουχίας των αµινοξέων µεταξύ των µελών της οικογένειας κυµαίνονται από 20 έως 30% για τους υποδοχείς µε διαφορετικούς συνδέτες και από 50 έως 80% για τους υποδοχείς µε ίδιους ή παρόµοιους συνδέτες (Gluchowski και συν. 1993, Strader και συν. 1994). Οι υποδοχείς που συζεύγνυνται µε πρωτεΐνες G και φυσικά οι αντίστοιχοι ενδογενείς αγωνιστές τους διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της φυσιολογίας πολλών σηµαντικών οργάνων και συστηµάτων των διαφόρων

15 9 οργανισµών. Σε κάθε περίπτωση, όµως, η λειτουργία των υποδοχέων αυτών εξαρτάται σε σηµαντικό βαθµό από τη συνδεόµενη πρωτεΐνη G, η οποία µεσολαβεί στην µεταγωγή του µηνύµατος. Έτσι, µία σύντοµη περιγραφή της δοµής και λειτουργίας των G πρωτεϊνών θεωρείται απαραίτητη για την πληρέστερη κατανόηση των µηχανισµών δράσης των υποδοχέων της κατηγορίας GPCR οµή και λειτουργία των G πρωτεϊνών Πρόκειται για µεµβρανικές πρωτεΐνες, τοποθετηµένες στην κυτταροπλασµατική πλευρά της πλασµατικής µεµβράνης, οι οποίες σε συνεργασία µε τον ενεργοποιηµένο υποδοχέα ρυθµίζουν την παραγωγή και µετάδοση διαφόρων ενδοκυτταρικών µηνυµάτων. Είναι ετεροτριµερείς πρωτεΐνες αποτελούµενες από τις υποµονάδες α (39-46 KDa), β (37 KDa) και γ (8 KDa) (Birnbaumer και συν. 1987, Spiegel 1987, Ross 1990, Hepler και Gilman 1992, Linder και Gilman 1992). Υπάρχει µεγάλη ετερογένεια ιδίως όσον αφορά στις α υποµονάδες, οι οποίες ανήκουν σε µία µεγάλη οικογένεια ενζύµων (GTPασες) που υδρολύουν την τριφωσφορική γουανοσίνη (Bourne και συν. 1990, Raymond 1995). Υπάρχουν τέσσερις οικογένειες α υποµονάδων που διακρίνονται µεταξύ τους µε βάση τα ιδιαίτερα βιοχηµικά και µοριακά χαρακτηριστικά τους (Strathmann και συν. 1989, Bourne και συν. 1990, Strathmann και Simon 1991, Inglese και συν. 1992). Οι οικογένειες αυτές είναι η G s α, η G i/o α, η G q/11 α και η G 12/13 α. Ο χαρακτηρισµός κάθε G πρωτεΐνης γίνεται µε βάση τη συγκεκριµένη α υποµονάδα που µετέχει στη σύνθεση του ολιγοµερούς (Hepler και Gilman 1992). Σε ορισµένες G πρωτεΐνες, η α υποµονάδα παρουσιάζει ευαισθησία σε συγκεκριµένες βακτηριακές τοξίνες. Έτσι, υπάρχουν G πρωτεΐνες, οι οποίες καθίστανται µόνιµα ενεργές από την τοξίνη του βακτηρίου της χολέρας, καθώς η α υποµονάδά τους χάνει την δραστικότητα GTPάσης (Hepler και Gilman 1992, Raymond 1995). Οι πρωτεΐνες αυτές είναι µέλη της οικογένειας Gs, ενώ υπάρχουν και ορισµένες που ανήκουν στην G i (G t1, G t2 ). Άλλες G πρωτεΐνες, µέλη της οικογένειας G i, χάνουν την ικανότητα ενεργοποίησης από τον αντίστοιχο υποδοχέα, εξαιτίας των δοµικών τροποποιήσεων που υφίστανται από την τοξίνη του βακτηρίου του γένους Pertussis (Hepler και Gilman 1992, Raymond 1995). Όπως είναι γνωστό, οι ετεροτριµερείς G πρωτεΐνες µπορούν να διαχωρίζονται αντιστρεπτά στις επιµέρους α και βγ (σύµπλοκο β και γ υποµονάδων) υποµονάδες τους. Ο διαχωρισµός προάγεται από τη σύνδεση τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) στην α υποµονάδα, ενώ αναστέλλεται από τη σύνδεση διφωσφορικής αδενοσίνης

16 10 (GDP) σε αυτήν. Γενικά, η λειτουργία των G πρωτεϊνών χαρακτηρίζεται από δύο ανεξάρτητους κύκλους που περιλαµβάνουν την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων γουανίνης και τη διάσταση/ επανασύνδεση των υποµονάδων τους. Η ανενεργή G πρωτεΐνη που είναι δεσµευµένη µε GDP ενεργοποιείται καθώς το GDP αντικαθίσταται από το GΤP, µια διαδικασία που επάγεται από τον ενεργοποιηµένο υποδοχέα. Η σύνδεση του GΤP προκαλεί τη διάσταση του τριµερούς συµπλόκου. Από τη άλλη, όµως, η ενεργοποιηµένη G πρωτεΐνη υδρολύει µε αργό ρυθµό το δεσµευµένο GΤP, αυτοκαταλύοντας µε τον τρόπο αυτό την απενεργοποίηση της και την επακόλουθη επαναφορά της στη βασική κατάσταση του ανενεργού τριµερούς συµπλόκου, που είναι δεσµευµένο µε GDP. Σ αυτήν ακριβώς την αργή υδρολυτική δράση οφείλεται η συµπεριφορά της G πρωτεΐνης ως µοριακού χρονοδιακόπτη, που παραµένει ενεργοποιηµένος για ένα καθορισµένο χρονικό διάστηµα, γενικά λίγων δευτερολέπτων, πριν επανέλθει στη βασική κατάσταση, έχοντας όµως στο µεταξύ πυροδοτήσει µία αλληλουχία γεγονότων που θα µεταγάγουν ενδοκυτταρικά το εξωκυττάριο µήνυµα. (Stryer 1986, Gilman 1987, Hepler και Gilman 1992) Μονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων που ενεργοποιούνται από υποδοχείςσυζευγµένους µε G πρωτεΐνες Αν και τα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων αυτής της κατηγορίας είναι πράγµατι πολυσύνθετα, βασίζονται σε τρεις βασικούς παράγοντες. Συγκεκριµένα, σε έναν υποδοχέα του εξωκυττάριου µηνύµατος, στην G πρωτεΐνη που είναι συζευγµένη µε αυτόν και στην πρωτεΐνη που ενεργοποιείται και παράγει το δεύτερο µήνυµα. Συνήθεις πρωτεΐνες που µετέχουν σε αυτά τα µονοπάτια είναι η αδενυλική κυκλάση, η γουανυλική κυκλάση και διάφορες φωσφολιπάσες, µεταξύ των οποίων και η φωσφολιπάση C. Η ενεργοποίηση του τελεστή προκαλεί την παραγωγή κάποιου δεύτερου µηνύµατος, όπως το κυκλικό ΑΜΡ (camp) (Casey και Gilman 1988, Limbird 1988), το κυκλικό GMP (cgmp) (Schulz και συν. 1989), τα ιόντα Ca 2+ (Hokin 1985, Brown και Birnbaumer 1989, Williamson και Monck 1989), η τριφωσφορική ινοσιτόλη ή η διακυλογλυκερόλη (DAG) (Berridge 1987, Exton 1990, Michell 1992, Berridge 1993). Η αύξηση της συγκέντρωσης του δεύτερου µηνύµατος προκαλεί µε τη σειρά της τη µεταβολή της δραστικότητας συγκεκριµένων πρωτεϊνικών κινασών που εξαρτώνται από αυτά, όπως η εξαρτώµενη από το camp πρωτεϊνική κινάση A, η εξαρτώµενη από το cgmp πρωτεϊνική κινάση G, η εξαρτώµενη από την καλµοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση ή η πρωτεϊνική κινάση C

17 11 (Cohen 1992, Nishizuka 1992, Posada και Cooper 1992, Schulman 1993) Ο βαθµός φωσφορυλίωσης συγκεκριµένων πρωτεϊνών µεταβάλλεται από τη δράση των πρωτεϊνικών κινασών. Οι κινάσες αυτές προκαλούν τη φωσφορυλίωση διαφόρων πρωτεϊνικών υποστρωµάτων, µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση µιας σειράς γεγονότων και την τελική απόκριση του κυττάρου στο εξωκυττάριο σήµα (Cohen 1985). Ενώ, µέχρι πρότινος, ήταν γενικά αποδεκτό ότι στην ενδοκυτταρική µεταγωγή µηνυµάτων µέσω των παραπάνω µονοπατιών σηµαντικότερο ρόλο κατείχαν οι α υποµονάδες των G πρωτεϊνών, µε τις βγ υποµονάδες να περιορίζονται σε βοηθητικό, κυρίως, ρόλο, η αντίληψη αυτή τείνει να µεταβληθεί (Raymond 1995). Πρόσφατα δεδοµένα υποστηρίζουν την ενεργό συµµετοχή των βγ υποµονάδων στα ενδοκυτταρικά µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων, καθώς είναι σε θέση να ενεργοποιούν τις ισοµορφές ΙΙ και ΙV της αδενυλικής κυκλάσης ή να αναστέλλουν την ισοµορφή Ι της αδενυλικής κυκλάσης. Ενεργοποιούν, επίσης, διάφορες µορφές της φωσφολιπάσης C (β 2 και β 3 ). Επιπλέον, το σύµπλοκο βγ ενεργοποιεί διάφορα ιοντικά κανάλια που συνδέονται µε G πρωτεΐνες, όπως κανάλια ιόντων Κ + και πιθανόν ιόντων Na + (Birnbaumer 1992, Inglese και συν. 1992, Pitcher και συν. 1992, Clapham και Neer 1993, Sternweis 1994, Touhara και συν. 1994, Clapham και Neer 1997, Jan και Jan 1997, Schneider και συν. 1997). Έχει αναφερθεί, επίσης, ότι διάφορες ισοµορφές της 3-κινάσης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης ενεργοποιούνται, επίσης, από το σύµπλοκο Gβγ (Tang και Downes 1997), ενώ στη ζύµη οι υποµονάδες βγ ενεργοποιούν το µονοπάτι των ΜΑΡ κινασών (Whiteway και συν. 1995). Ένα σηµαντικό ερώτηµα που προκύπτει από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά αυτής της κατηγορίας µονοπατιών σχετίζεται µε το ρόλο της G πρωτεΐνης. Γιατί να υπάρχουν τρεις βασικοί παράγοντες (υποδοχέας του εξωκυττάριου µηνύµατος, G πρωτεΐνη συζευγµένη µε αυτόν και πρωτεΐνη τελεστής- effector) και όχι δύο, ή, µε άλλα λόγια, γιατί χρειάζεται η µεσολάβηση της G πρωτεΐνης, ενώ πιθανόν ο υποδοχέας θα µπορούσε να ενεργοποιεί απευθείας την πρωτεΐνη τελεστή. Αρκετά είναι τα πλεονεκτήµατα που αποκοµίζει το σύστηµα, συµπεριλαµβάνοντας αυτό το ενδιάµεσο στάδιο στο µονοπάτι µεταγωγής του µηνύµατος. Οι G πρωτεΐνες, κατ αρχάς, αυξάνουν την ευαισθησία του συστήµατος, καθώς προσφέρουν ένα επιπλέον βήµα που επιτρέπει την ενίσχυση του µηνύµατος. Έτσι, οι υποδοχείς είναι σε θέση να δρουν καταλυτικά, ενεργοποιώντας πολλές G πρωτεΐνες, οι οποίες µε τη σειρά τους ρυθµίζουν τη δράση πολλών τελεστικών µορίων. Επιπλέον, ο

18 12 διαµεσολαβητικός τους ρόλος, όσον αφορά στη δράση των υποδοχέων, τους δίνει τη δυνατότητα να συγκεντρώνουν τα διαφορετικά µηνύµατα προκαλώντας την εκδήλωση µιας τυποποιηµένης απόκρισης. Για παράδειγµα, διάφορες ορµόνες που επάγουν τη σύνθεση του camp δρουν µέσω της ενεργοποίησης µιας συγκεκριµένης G πρωτεΐνης. Όµως, έχουν και την εναλλακτική δυνατότητα να δρουν ως σηµεία απόκλισης του µηνύµατος προς διαφορετικές κατευθύνσεις, καθώς µπορούν να ρυθµίζουν τη δράση διαφορετικών τελεστικών µορίων. Τελικά, αυτή η αλληλεπίδραση µεταξύ των πολλαπλών συστατικών επιτρέπει τη δυναµική απόκριση στα µηνύµατα του περιβάλλοντος (Sternweis 1996). 3. Αδρενεργικοί υποδοχείς Στην κατηγορία των GPCR υποδοχέων ανήκουν και οι υποδοχείς που συνδέονται ειδικά µε τις βιογενείς αµίνες, αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη. Σηµαντικοί εξωκυττάριοι µηνύτορες, οι αµίνες αυτές εκδηλώνουν την ορµονική ή νευροδιαβιβαστική τους δράση µέσω των αδρενεργικών υποδοχέων, ρυθµίζοντας έτσι διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισµού. Ως µέλη της οικογένειας υποδοχέων που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες, οι αδρενεργικοί υποδοχείς περιέχουν στο µόριό τους τη συντηρητική δοµή των επτά διαµεµβρανικών ελίκων. Στην ίδια οικογένεια ανήκει ένα πλήθος διαφόρων υποδοχέων µεταξύ των οποίων είναι και οι υποδοχείς της αδενοσίνης, οι µουσκαρινικοί υποδοχείς, οι υποδοχείς ενδοθηλίνης κ.α. (Dohlman και συν. 1987, Nathanson 1987, Dixon και συν. 1988, Jelinek και συν. 1993, Huang και συν. 1994, Iismaa και συν. 1994). Από πολύ νωρίς έγινε αντιληπτό ότι πρόκειται για µια ετερογενή οµάδα υποδοχέων αποτελούµενη από διακριτούς τύπους, καθένας από τους οποίους έχει ειδικούς αγωνιστές ή διαφορετική συγγένεια για τον ίδιο αγωνιστή, καθώς επίσης και διαφορετική φυσιολογική δράση. Τα αποτελέσµατα σχετικών µελετών σε αποµονωµένους ιστούς προέτρεψαν τον Ahlquist (1948) να διαχωρίσει τους αδρενεργικούς υποδοχείς σε δύο τύπους. Πρότεινε την ύπαρξη των τύπων α- και β-, υποστηρίζοντας παράλληλα ότι οι α-αδρενεργικοί υποδοχείς έχουν πρωτεύοντα διεγερτικό ρόλο, όπως για παράδειγµα η αγγειοσυστολή ή σύσπαση του σπλήνα, ενώ οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς σχετίζονται µε ανασταλτικά αποτελέσµατα, όπως η αγγειοδιαστολή ή η χαλάρωση των λείων µυών του αναπνευστικού συστήµατος. Οι σύγχρονες απόψεις για τους αδρενεργικούς υποδοχείς εξακολουθούν να βασίζονται

19 13 στην αρχική ταξινόµηση του Ahlquist (1948), παρέχουν όµως λεπτοµερέστερη και αναλυτικότερη περιγραφή της ετερογένειας που χαρακτηρίζει τους αδρενεργικούς υποδοχείς. Έτσι, ακολούθησε η αναγνώριση διακριτών υποτύπων των β- αδρενεργικών υποδοχέων (Lands και συν. 1967), ενώ το ίδιο συνέβη και στη συνέχεια και για τους α-αδρενεργικούς υποδοχείς µε την ανακάλυψη των υποτύπων α 1 - και α 2 - (Berthelsen και Petinger 1977). Αυτοί οι τέσσερις υποτύποι αναφέρονται συχνά στη βιβλιογραφία ως κλασικοί (Schwinn και συν. 1991). Ωστόσο, η ανάπτυξη επιλεκτικότερων συνδετών και η εφαρµογή εξελιγµένων µοριακών µεθόδων είχε ως αποτέλεσµα την ανακάλυψη και άλλων υποτύπων. Μέχρι σήµερα τουλάχιστον εννέα υποτύποι αδρενεργικών υποδοχέων έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί µε βάση τη συγγένειά τους για συγκεκριµένους αγωνιστές/ανταγωνιστές (Lefkowitz και Caron 1988, Minneman 1988, Harrison και συν. 1991, Lomasney και συν. 1991, Bylund 1992, Rockman και συν. 2002). Έτσι, η οικογένεια των αδρενεργικών υποδοχέων υποδιαιρείται µε βάση τις ιδιότητες τους, τις οµολογίες της δοµής τους και τα συναφή µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων στις ακόλουθες κατηγορίες: α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς µε τρεις υποτύπους, α 1Α -, α 1Β -, α 1D -, α 2 -αδρενεργικοί υποδοχείς που µε τη σειρά τους υποδιαιρούνται σε τρεις υποτύπους, α 2A, α 2B -, α 2C - και, β-αδρενεργικοί υποδοχείς µε τρεις επιµέρους υποτύπους, β 1 -, β 2 - και β 3 - (Minneman και Esbenshade, 1994, Zhong και Minneman, 1999) (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Ταξινόµηση των µελών της οικογένειας των αδρενεργικών υποδοχέων µε βάση τις ιδιότητες και τις δοµικές οµολογίες τους (Michellotti και συν. 2000). Ένας αδρενεργικός υποδοχέας, ανεξάρτητα από την κατηγορία στην οποία ανήκει, συνδέεται ειδικά µε τις ενδογενείς κατεχολαµίνες, αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη. Ωστόσο, η συγγένεια των αγωνιστών αυτών διαφέρει µεταξύ των αδρενεργικών

20 14 υποδοχέων του α- και του β-τύπου. Επιπλέον, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς έχουν διαφορετική συγγένεια για τις ενδογενείς κατεχολαµίνες ανάλογα µε τον υποτύπο στον οποίο ανήκουν. Γενικά, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς συνδέονται, µέσω G s πρωτεΐνης, µε την αδενυλική κυκλάση. ιέγερση των υποδοχέων αυτών από τη νοραδρεναλίνη ή άλλο αγωνιστή ενεργοποιεί το συγκεκριµένο ένζυµο, µέσω της G s, προκαλώντας την αύξηση της συγκέντρωσης του camp, το οποίο δρα ως δεύτερο µήνυµα (Zhong και Minneman 1999, Michelotti και συν. 2000). Οι α-αδρενεργικοί υποδοχείς έχουν παρόµοια συγγένεια για την αδρεναλίνη και την νοραδρεναλίνη. Από αυτούς, οι α 2 -αδρενεργικοί υποδοχείς είναι συζευγµένοι µε την αδενυλική κυκλάση µέσω µιας ανασταλτικής G i πρωτεΐνης. Έτσι, η διέγερση των α 2 -αδρενεργικών υποδοχέων έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του δεύτερου µηνύµατος camp (Smiley 1998, Zhong και Minneman 1999, Michelotti και συν. 2000). Η διέγερση των α 1 -υποδοχέων ενεργοποιεί µέσω µιας G q/11 πρωτεΐνης τη φωσφολιπάση C, η οποία υδρολύει την 4,5 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη, προκαλώντας έτσι την παραγωγή δύο δεύτερων µηνυµάτων, της 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης και της διακυλογλυκερόλης (Graham και συν. 1996, Zhong και Minneman 1999, Michelotti και συν. 2000). 4. α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς Το γεγονός ότι οι ενδογενείς κατεχολαµίνες έχουν παραπλήσια συγγένεια για τους α-αδρενεργικούς υποδοχείς δεν διευκόλυνε την αναγνώριση των διαφορετικών α- αδρενεργικών υποτύπων. Η ύπαρξη διακριτών υποτύπων α-αδρενεργικών υποδοχέων διαπιστώθηκε µόνο ύστερα από την ανάπτυξη ειδικών ανταγωνιστών, όπως της πραζοσίνης για τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς και της γιοµπίνης για τους α 2 - αδρενεργικούς υποδοχείς (Minneman 1988, Michelotti και συν. 2000). Έτσι, οι α 1 - αδρενεργικοί υποδοχείς αναγνωρίζονται µε βάση την ευαισθησία τους σε ορισµένους ανταγωνιστές ή την συγγένειά τους για ειδικούς αγωνιστές. Συγκεκριµένα, αναστέλλονται ισχυρά από τους συναγωνιστικούς ανταγωνιστές (competitive antagonsists) φαιντολαµίνη και πραζοσίνη, αναστέλλονται µη αντιστρεπτά από τον αλκυλιωτικό παράγοντα φαινοξυβενζαµίνη και διεγείρονται επιλεκτικά από τους ειδικούς αγωνιστές φαινυλεφρίνη και µεθοξαµίνη. Επιπροσθέτως και άλλες ενώσεις είναι διαθέσιµες για τη διάκριση των υποδοχέων αυτών από τους υπόλοιπους αδρενεργικούς υποδοχείς. Σε αυτές συµπεριλαµβάνονται ειδικοί ανταγωνιστές (ΒΕ

21 , WB 4101), αλκυλιωτικοί παράγοντες (διβεναµίνη) και αγωνιστές (κιραζολίνη και 6-φλουορονοραδρεναλίνη) (Minneman 1988). Η αναγνώριση της ετερογένειας και η ταυτοποίηση διαφορετικών υποτύπων των αδρενεργικών υποδοχέων συµβάλλει στην αποσαφήνιση του ρόλου που έχουν οι υποδοχείς αυτοί σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες. Έτσι, η αναγνώριση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων συνοδεύτηκε από ένα πλήθος δεδοµένων που συνδέουν τους υποδοχείς αυτούς µε διάφορες φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές καταστάσεις της καρδιάς (Graham 1990, Michel και συν. 1995, Graham και συν. 1996, Rockman και συν. 2002) Υποτύποι των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Από µελέτες σχετικά µε τις λειτουργικές αποκρίσεις, που προκαλεί η αδρενεργική διέγερση σε διάφορους ιστούς, προέκυψαν τα πρώτα στοιχεία σχετικά µε την ύπαρξη διαφορετικών υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (McGrath 1982, Ruffolo 1985). Οι Morrow και Creese (1986) ήταν οι πρώτοι που παρατήρησαν την ύπαρξη διακριτών υποτύπων των α 1 -υποδοχέων, ύστερα από έρευνες σε µεµβράνες εγκεφαλικών κυττάρων, όπου µελετήθηκε η σύνδεση ραδιενεργά σηµασµένης πραζοσίνης ([ 3 Η]-πραζοσίνη) (Morrow και Creese 1986). Η ανάλυση των καµπυλών αναστολής της σύνδεσης της [ 3 Η]πραζοσίνης στις µεµβράνες από το WB 4101 κατεδείκνυε µια ετερογένεια των ειδικών θέσεων σύνδεσης. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, προτάθηκε ότι υπάρχουν 2 υποτύποι των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων που συνδέονται µε την [ 3 Η]-πραζοσίνη. Ο υποτύπος που είχε µεγάλη συγγένεια για το WB 4101 και τη φαιντολαµίνη ονοµάστηκε α 1Α - και αυτός µε τη µικρότερη συγγένεια α 1Β -. Αργότερα, βρέθηκε ότι ο αλκυλιωτικός παράγοντας χλωροαιθυλκλονιδίνη (CEC) απενεργοποιούσε µόνο ένα υποπληθυσµό των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Han και συν. 1987, Johnson και Minneman 1987) σε αντίθεση µε άλλους αλκυλιωτικούς παράγοντες, όπως η φαινοξυβενζαµίνη και η µπενεξταµίνη, οι οποίοι απενεργοποιούν τους α 1 -υποδοχείς χωρίς επιλεκτικότητα (Minneman και Esbenshade 1994). Τελικά, η πρόταση των Morrow και Creese (1986) για την υποδιαίρεση των α 1 -αδρενεργικών υποτύπων σε δύο υποτύπους, α 1Α - και α 1Β -, έγινε αποδεκτή από τη στιγµή που διαπιστώθηκε ότι οι ειδικές θέσεις σύνδεσης που δεν επηρεάζονται από το CEC συσχετίζονται πολύ καλά µε αυτές που εµφανίζουν µεγάλη συγγένεια για το WB 4101 (Minneman και συν. 1988, Minneman 1988).

22 16 Η ταξινόµηση αυτή όµως περιπλέχτηκε, προσωρινά, από νέα δεδοµένα που προέκυψαν από την εφαρµογή µεθόδων µοριακής κλωνοποίησης στη µελέτη των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων. Και ενώ τα αποτελέσµατα µελετών µε τη χρήση ειδικών αγωνιστών/ανταγωνιστών υποδείκνυαν την ύπαρξη δύο υποτύπων, οι τεχνικές µοριακής κλωνοποίησης οδήγησαν στην κλωνοποίηση 3 cdna ή γονιδίων που κωδικοποιούσαν τουλάχιστον έναν επιπλέον υποτύπο (Graham και συν. 1996, Zhong και Minneman 1999). Οι υποτύποι κατά τη χρονολογική σειρά µε την οποία κλωνοποιήθηκαν είναι: α 1B - (Cotecchia και συν. 1988), α 1D - (Schwinn και συν. 1990, Perez και συν. 1991) και α 1A - (Lomasney και συν. 1991, Laz και συν. 1994, Perez και συν. 1994). Ο συνδυασµός των ευρηµάτων από τις δύο πειραµατικές προσεγγίσεις δηµιούργησε µια σύγχυση ως προς την κατάταξη και την ταυτοποίηση των υποτύπων α 1D - και α 1A - των αδρενεργικών υποδοχέων (Ford και συν. 1994, Graham και συν. 1996). Ωστόσο, µε βάση την πρόταση της επιτροπής IUPHAR (International Union of Pharmacology) (Hieble και συν. 1995), το ζήτηµα έχει πλέον διευθετηθεί. Σύµφωνα µε την IUPHAR ισχύουν τα εξής: ο φυσικός υποτύπος α 1Α - αντιστοιχεί στον κλωνοποιηµένο α 1a -, που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωµόσωµα 8 και προηγουµένως χαρακτηριζόταν ως α 1c - ή α 1Α/c - αδρενεργικός υποδοχέας. Ο φυσικός υποτύπος α 1Β - αντιστοιχεί στον κλωνοποιηµένο α 1b - που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωµόσωµα 5 και χαρακτηριζόταν από αρχής ως α 1b -αδρενεργικός υποδοχέας. Ο φυσικός υποτύπος α 1D - αντιστοιχεί στον κλωνοποιηµένο α 1d -, που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωµόσωµα 20 και προηγουµένως χαρακτηριζόταν ως α 1a -, α 1d - ή α 1a/d - αδρενεργικός υποδοχέας. Οι δείκτες µε κεφαλαία γράµµατα συµβολίζουν τους υποτύπους που προσδιορίστηκαν µε τη χρήση ειδικών αγωνιστών/ανταγωνιστών, ενώ οι δείκτες µε µικρά γράµµατα συµβολίζουν τους κλωνοποιηµένους υποτύπους των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων Ειδικοί αγωνιστές και ανταγωνιστές των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Η συγγένεια και η επιλεκτικότητα διαφόρων ενώσεων για τους διάφορους υποτύπους των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων έχει καθοριστεί κυρίως από πειράµατα σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένων συνδετών σε ανασυνδυασµένους υποτύπους που εκφράστηκαν ετερόλογα. Οι περισσότεροι ανταγωνιστές, συµπεριλαµβανοµένης και της πραζοσίνης που θεωρείται ο πρωτότυπος (prototype) α 1 -ειδικός ανταγωνιστής, είναι ελάχιστα έως καθόλου επιλεκτικοί, όσον αφορά τους τρεις υποτύπους. Το

23 17 γεγονός αυτό σχετίζεται άµεσα µε τη δοµική οµολογία που εµφανίζουν οι τρεις υποτύποι στις διαµεµβρανικές περιοχές τους (Hancock 1996, Zhong και Minneman 1999). Ωστόσο, αρκετές ενώσεις µε διαφορετικό βαθµό επιλεκτικότητας έχουν αναγνωριστεί µέχρι σήµερα. Όσον αφορά στους α 1Α -υποδοχείς, η προσπάθεια ανάπτυξης ειδικών ανταγωνιστών ήταν ιδιαίτερα επιτυχής. Ο πρώτος α 1Α -ειδικός ανταγωνιστής που αναγνωρίστηκε ήταν το WB 4101 (2-(2,6-διµέθοξυφαινοξυέθυλ)- άµινοµεθυλ-1,4 βενζοδιοξάνη) (Morrow και Creese 1986). Ο ανταγωνιστής αυτός επιδεικνύει 20 φορές περίπου µεγαλύτερη συγγένεια ως προς τους α 1Α - σε σχέση µε τους α 1Β -, ενώ η συγγένειά του για τους α 1D - είναι ενδιάµεση. Σήµερα η επιλεκτικότητα αυτής της ένωσης θεωρείται περιορισµένη, καθώς αναγνωρίστηκαν άλλες ενώσεις περισσότερο ειδικές. Έτσι, η 5 -µεθυλουραπιδίλη (Gross και συν. 1988) και η (+)-νιγουλδιπίνη (Boer και συν. 1989) εµφανίζουν µεγαλύτερη επιλεκτικότητα για τους α 1Α - ( φορές µεγαλύτερη σε σχέση µε τους α 1Β -) και µικρή συγγένεια για τους α 1D -, γεγονός που τις καθιστά καταλληλότερες για τη διάκριση των υποτύπων στα διάφορα πειράµατα δοκιµασίας σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένου συνδέτη (Han και Minneman 1991). Όµως, ορισµένες ιδιότητες των ενώσεων αυτών περιορίζουν τη χρήση τους στα διάφορα πειράµατα, καθώς η 5 - µεθυλουραπιδίλη είναι αγωνιστής των υποδοχέων σεροτονίνης 5-ΗΤ 1Α, ενώ η (+)- νιγουλδιπίνη εκτός των άλλων είναι ανταγωνιστής των τασοελεγχόµενων καναλιών Ca 2+, τα οποία εξαρτώνται από τη διυδροπυριδίνη. Ένα παράγωγο της (+)- νιγουλδιπίνης, το SNAP 5089, το οποίο αναπτύχθηκε αργότερα (Wetzel και συν. 1995), παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για τους α 1Α - µε σηµαντικά χαµηλότερη συγγένεια για τα τασεοελεγχόµενα κανάλια ιόντων Ca 2+. Οι προσπάθειες για την ανεύρεση ειδικών ανταγωνιστών για τους υποτύπους α 1Β - και τους α 1D - δεν ήταν τόσο αποδοτικές, όσο στην περίπτωση του υποτύπου α 1Α - των αδρενεργικών υποδοχέων. Η χλωροαιθυλκλονιδίνη (CEC) αναγνωρίστηκε ως αλκυλιωτικός παράγοντας ειδικός για τους α 1Β -υποδοχείς (Han και συν. 1987), ενώ η κυκλαζοσίνη και η σπιπερόνη αναφέρονται ως ανταγωνιστές µέτριας εξειδίκευσης για τους α 1Β - (Hancock 1996), σε βαθµό που περιορίζει τη χρήση τους για τη διάκριση των διαφόρων υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων. Από την άλλη πλευρά, ο µερικός αγωνιστής των υποδοχέων σεροτονίνης 5ΗΤ 1Α, ΒΜΥ 7378 αποδείχθηκε ότι δρα ως ειδικός ανταγωνιστής του υποτύπου α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων, µε 100 φορές περίπου µεγαλύτερη συγγένεια για τους α 1D - σε σχέση µε τους α 1Α - και α 1Β - (Goetz και συν. 1995).

24 18 Όσον αφορά στους ειδικούς αγωνιστές των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, οι σχετικές πληροφορίες είναι περιορισµένες κυρίως λόγω του γεγονότος ότι η σύγκριση της συγγένειας των αγωνιστών για τους υποτύπους παρουσιάζει µεγαλύτερες δυσκολίες απ ότι η σύγκριση της συγγένειας των ανταγωνιστών (Zhong και Minneman 1999). Γενικά, είναι γνωστό ότι τόσο η αδρεναλίνη όσο και η νοραδρεναλίνη ενεργοποιούν και τους τρεις υποτύπους, επιδεικνύοντας 20 φορές µεγαλύτερη συγγένεια για τους α 1D-, σε σχέση µε τους άλλους δύο υποτύπους (Lomasney και συν. 1991, Perez και συν. 1991, Minneman και συν. 1994). Η οξυµεταζολίνη έχει 20 φορές µεγαλύτερη συγγένεια για τους α 1Α -, όπως φαίνεται από πειράµατα σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένων συνδετών (Minneman και συν. 1988, Hancock 1996). Επίσης, φαίνεται ότι η οξυµεταζολίνη και η µεθοξαµίνη ενεργοποιούν επιλεκτικά λειτουργικές αποκρίσεις που εξαρτώνται από τον υποτύπο α 1Α - (Tsujimoto και συν. 1989) Έκφραση και κατανοµή των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων Με βάση τις δοκιµασίες σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένων συνδετών, έχει αποδειχθεί ότι οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς εκφράζονται σε ένα µεγάλο πλήθος ιστών που προέρχονται από διάφορα είδη. Η χαρτογράφηση της κατανοµής των τριών υποτύπων έχει πραγµατοποιηθεί εν µέρει µε ανάλυση της έκφρασης του mrna. Μελέτες χαρτογράφησης έχουν πραγµατοποιηθεί κυρίως στον άνθρωπο και τον αρουραίο, παρόλο που έχουν δηµοσιευθεί σχετικές πληροφορίες προερχόµενες και από άλλα είδη (Graham και συν. 1996, Zhong και Minneman 1999). Υψηλά επίπεδα έκφρασης και των τριών υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων έχουν παρατηρηθεί σε περιοχές του εγκεφάλου τόσο του ανθρώπου όσο και του αρουραίου, αν και υπάρχουν ουσιαστικές διακυµάνσεις στην έκφραση του κάθε υποτύπου σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου (Price και συν.1994a,b, Rokosh και συν. 1994, Scofield και συν. 1995). Οι τρεις υποτύποι των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων εκφράζονται επίσης στην καρδιά και των δύο ειδών, αν και ο υποτύπος α 1Α - φαίνεται να είναι ο κυρίαρχος υποτύπος στην καρδιά του ανθρώπου (Price και συν. 1994a,b). Στον σπερµατικό αγωγό και σε άλλους λείους µύες φαίνεται να εκφράζονται κυρίως οι υποτύποι α 1Α - και α 1D -, αν και έχει αναφερθεί ο εντοπισµός και του υποτύπου α 1Β -, τόσο σε επίπεδο mrna, όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο (Piascik και συν. 1997). Το ήπαρ του αρουραίου περιέχει κυρίως α 1Β -αδρενεργικούς υποδοχείς (Rokosh και συν. 1994), ενώ ο υποτύπος α 1Α - υπάρχει κυρίως στο ήπαρ του

25 19 ανθρώπου (Price και συν. 1994b). Η πλειονότητα των υπολοίπων ιστών εκφράζει συνδυασµούς των τριών υποτύπων, ενώ τα σχετικά επίπεδα έκφρασης που αναφέρονται στις διάφορες µελέτες γενικά διαφέρουν. Η ανίχνευση του mrna ενός υποτύπου δε συµφωνεί πάντοτε µε τις αντίστοιχες µελέτες σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι η περίπτωση των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων της καρδιάς. Ενώ το αντίστοιχο mrna έχει εντοπιστεί στα καρδιακά κύτταρα (Rokosh και συν. 1994, Stewart και συν. 1994, Scofield και συν. 1995, Wenham και συν. 1997), η έκφρασή τους σε πρωτεϊνικό επίπεδο αµφισβητείται από ορισµένες µελέτες (Hanft και Gross 1989, Deng και συν. 1996a, Yang και συν. 1997). Γενικά, ο συνδυασµός των δεδοµένων ανάλυσης του mrna µε τα αντίστοιχα αποτελέσµατα πειραµάτων λειτουργικής απόκρισης και σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένων συνδετών δείχνει ότι οι περισσότεροι ιστοί εκφράζουν µίγµα των τριών υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων. Οι υποτύποι αυτοί φαίνεται να συνυπάρχουν σε διαφορετικές πυκνότητες και αναλογίες, και στις περισσότερες περιπτώσεις η απόκριση στους ειδικούς α 1 -αδρενεργικούς αγωνιστές οφείλεται πιθανώς στην ενεργοποίηση περισσοτέρων του ενός υποτύπων (Zhong και Minneman 1999). Το γεγονός αυτό προκαλεί µία ασάφεια όσον αφορά στις συγκεκριµένες ιδιότητες των φυσικών υποτύπων αφού ιστοί που χρησιµοποιήθηκαν παλαιότερα ως µοντέλα για τον χαρακτηρισµό των ιδιοτήτων τους (α 1Α : σπερµατικός αγωγός αρουραίου, α 1B : σπλήνας αρουραίου, ήπαρ αρουραίου, α 1D : αορτή αρουραίου) είναι πιθανό να εκφράζουν πολλαπλούς υποτύπους. Εξαίρεση φαίνεται να αποτελεί το ήπαρ του αρουραίου, το οποίο φαίνεται να εκφράζει µόνο τον α 1Β - υποδοχέα ( Price και συν. 1994a, Rokosh και συν. 1994, Scofield και συν. 1995) Μονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων που ενεργοποιούνται από τους α 1 - αδρενεργικούς υποδοχείς Η διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί, µέσω µίας G πρωτεΐνης της οικογένειας G q/11, την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C και στη συνέχεια την υδρόλυση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης [PtdIns(4,5)Ρ 2 ] (Terzic και συν. 1993, Divecha και Irvine 1995, Graham και συν. 1996, Zhong και Minneman 1999, Varma και Deng 2000). Η οικογένεια G q/11 πρωτεϊνών, µέσω των οποίων µεταγάγεται το σήµα της α 1 αδρενεργικής διέγερσης, συµπεριλαµβάνει τέσσερις α υποµονάδες, τις α q και α 11, που συνυπάρχουν στους περισσότερους τύπους κυττάρων και τις α 14 και α 16 που έχουν περιορισµένη κατανοµή. Σύµφωνα µε ορισµένες απόψεις

26 20 και οι τρεις υποτύποι των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων προκαλούν ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C µέσω των υποµονάδων α q και α 11, ενώ µέσω της υποµονάδας α 14, οι α 1Α και α 1Β υποτύποι. Υποστηρίζεται ακόµη ότι ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C µέσω της α 16 προκαλείται µόνον ύστερα από διέγερση των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων (Wu και συν. 1992, Wise και συν. 1995). Άρα, είναι πιθανό ένας υποδοχέας να συνδέεται µε διαφορετικές α υποµονάδες των G πρωτεϊνών, χωρίς ταυτόχρονα να αποκλείεται το ενδεχόµενο κάθε υποτύπος α 1 -αδρενεργικού υποδοχέα να ενεργοποιεί µία συγκεκριµένη G πρωτεΐνη. Το µονοπάτι της διέγερσης των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων περιλαµβάνει τα παρακάτω βήµατα (Εικόνα 2.). Εικόνα 2. Το κλασικό µονοπάτι µεταγωγής µηνύµατος που ενεργοποιείται από τους α 1 - αδρενεργικούς υποδοχείς. Η σύνδεση της νοραδρεναλίνης/αδρεναλίνης στον µεµβρανικό υποδοχέα ενεργοποιεί µια ετεροτριµερή G πρωτεΐνη της οικογένειας G q/11. Η α υποµονάδα αποχωρίζεται από το σύµπλοκο βγ και ενεργοποιεί την φωσφολιπάση C (PLC β ). Το ένζυµο αυτό υδρολύει την 4,5-διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη [PtdIns(4,5)P 2 ] σε δύο προϊόντα, την 1,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη [Ins(1,4,5)P 3 ] και την διακυλογλυκερόλη (DAG). H Ins(1,4,5)P 3 δεσµεύεται σε ειδικούς υποδοχείς του ενδοπλασµατικού δικτύου προκαλώντας την απελεύθερωση ασβεστίου από αυτό. Το απελευθερωµένο ασβέστιο σε συνδυασµό µε την (DAG) ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC), η οποία µε τη σειρά της φωσφορυλιώνει διάφορες πρωτεΐνες στόχους, τροποποιώντας τη λειτουργία τους (Zhong και Minneman 1999). Η διέγερση του α 1 -αδρενεργικού υποδοχέα από τον αγωνιστή ενεργοποιεί µέσω µίας G q/11 πρωτεΐνης ένα µεµβρανικό ένζυµο, τη φωσφολιπάση C. Στους ιστούς των θηλαστικών έχουν αναγνωριστεί τρεις οµάδες φωσφολιπάσης C (PLC), η PLCβ, η PLCγ και η PLCδ. Κάθε οµάδα περιλαµβάνει περισσότερες από µία ισοµορφές. Όλες οι ισοµορφές, που έχουν αποµονωθεί µέχρι σήµερα, υδρολύουν την 4,5 διφωσφορική

27 21 φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη [PtdIns(4,5)Ρ 2 ] (Varma και Deng 2000). Στο τυπικό µονοπάτι µεταγωγής µηνυµάτων που ενεργοποιείται από τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς, η ισοµορφή PLC β είναι αυτή που υδρολύει την 4,5 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη [PtdIns(4,5)P 2 ], ένα µεµβρανικό φωσφολιπίδιο που απαντά σε πολύ µικρές ποσότητες στην εσωτερική διπλοστιβάδα της κυτταρικής µεµβράνης. Η PLCβ αποκόπτει την υδρόφιλη φωσφοσακχαριτική κεφαλή του φωσφολιπιδίου, παράγοντας την 1,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη Ins(1,4,5)P 3 και αφήνει τη λιπιδική ουρά, τη διακυλογλυκερόλη (DAG), ενσωµατωµένη στην κυτταρική µεµβράνη. Τόσο η Ins(1,4,5)P 3, όσο και η DAG είναι δεύτερα µηνύµατα που παίζουν σηµαντικό ρόλο στα ποικίλα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων (Berridge 1984, Majerus και συν. 1984, Hokin 1985, Abdel-Latif 1986, Nahorski και συν. 1986, Νishizuka 1986, Berridge 1987, Nishizuka 1988, Berridge και Irvine 1989, Rana και Hokin 1990, Ferris και Snyder 1992, Henzi και McDermott 1992). H Ins(1,4,5)P 3, που παράγεται διαχέεται στο κυτταρόπλασµα για να προσδεθεί τελικά σε ειδικούς υποδοχείς του ενδοπλασµατικού δικτύου, προκαλώντας τη διάνοιξη ιοντικών καναλιών Ca 2+. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την ταχεία εκροή ιόντων Ca 2+, τα οποία είναι αποθηκευµένα στο ενδοπλασµατικό δίκτυο (συνδεδεµένα µε ειδικές πρωτεΐνες), προκαλώντας µια απότοµη αύξηση της συγκέντρωσης των ελεύθερων ιόντων Ca 2+ στο κυτταρόπλασµα. (Streb και συν. 1983, Berridge 1987, Biden και συν. 1984, Carstem και Miller 1985, Joseph και συν. 1984, O Rourke και συν. 1985, Plentki και συν. 1984, Streb και συν. 1984, Exton 1990). Τα απελευθερωµένα ιόντα Ca 2+ επηρεάζουν ποικίλες πρωτεΐνες, µεταξύ των οποίων και τις πρωτεΐνες που συνδέονται µε ιόντα Ca 2+ (Ca 2+ binding proteins). Η πιο γνωστή πρωτεΐνη αυτής της κατηγορία είναι η καλµοδουλίνη, η οποία όταν συνδεθεί µε ιόντα Ca 2+ υφίσταται µεταβολές στη διαµόρφωσή της και αποκτά µε τον τρόπο αυτό την ικανότητα να προσδένεται σε πρωτεΐνες-στόχους (π.χ. CaM-κινάσες), τροποποιώντας τη δραστικότητά τους (Manalan και συν. 1984, Schulman 1993). Η διακυλογλυκερόλη, το άλλο δεύτερο µήνυµα που παράγεται από την ενεργοποιηµένη φωσφολιπάση C, παραµένει στην κυτταρική µεµβράνη όπου σε συνεργασία µε τα ιόντα Ca 2+ συµβάλλει στην ενεργοποίηση µιας άλλης σηµαντικής πρωτεϊνικής κινάσης, που ονοµάζεται πρωτεϊνική κινάση C (Kishimoto και συν. 1980, Berridge 1984, 1987, Nishizuka 1984, Hirasawa και συν. 1985, Kikkawa 1986, Nishizuka1986). Στην ανενεργό µορφή του, το ένζυµο αυτό βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα. Ιόντα Ca 2+, που απελευθερώνονται από το ενδοπλασµατικό δίκτυο

28 22 ύστερα από αδρενεργική διέγερση, δεσµεύονται στην πρωτεϊνική κινάση C, προκαλώντας τη µετατόπιση και πρόσδεσή της στην εσωτερική επιφάνεια της πλασµατικής µεµβράνης. Στη θέση αυτή ενεργοποιείται από την DAG. Η ενεργοποιηµένη πρωτεϊνική κινάση C φωσφορυλιώνει διάφορες πρωτεΐνες στόχους, ρυθµίζοντας µε τον τρόπο αυτό διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η ιοντική οµοιόσταση, η σύσπαση των µυοκυττάρων, ο αγγειακός τόνος κ.α. (Minneman 1988, Hieble 1995, Cohen 1992, Asaoka και συν. 1992, Bell 1986). Ας σηµειωθεί ακόµη ότι οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς συνδέονται και µε άλλους σηµατοδοτικούς µηχανισµούς. Έτσι, είναι γνωστό ότι η ενεργοποίησή τους προκαλεί εισροή ιόντων Ca 2+ διαµέσου τασεοελεγχόµενων και µη τασεοελεγχόµενων καναλιών ιόντων Ca 2+ (Ljung και Kjellstedt 1987, Terzic και συν. 1993). Η α 1 -αδρενεργική διέγερση προκαλεί, επίσης, την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης D (PLD) (Llahi και συν. 1992, Balboa και Insel 1998, Ruan και συν. 1998). Η PLD καταλύει την υδρόλυση ενός άλλου φωσφολιπιδίου της πλασµατικής µεµβράνης, της φωσφατιδυλοχολίνης. Από την υδρόλυση παράγεται φωσφατιδικό οξύ, το οποίο µετατρέπεται σε DAG, µέσω της υδρολάσης της DAG. Αν και το µονοπάτι που οδηγεί από την α 1 αδρενεργική διέγερση στην ενεργοποίηση της PLD δεν έχει εξακριβωθεί ακόµη (Zhong και Minneman 1999, Varma και Deng 2000), πιστεύεται ότι στην αλληλουχία µετάδοσης του µηνύµατος ενεργοποίησης, σηµαντικό ρόλο έχει η PKC. Συγκεκριµένα, έχει προταθεί ότι η DAG, που παράγεται από την υδρόλυση της PtdIns(4,5)P 2 ύστερα από α 1 αδρενεργική διέγερση, δηµιουργεί ένα αρχικά ταχύ, αλλά παροδικό σήµα που προκαλεί την ενεργοποίηση της PKC. Η ενεργοποιηµένη PKC διεγείρει τη δραστικότητα της PLD προκαλώντας εκ νέου την παραγωγή DAG σε µία δεύτερη φάση, η οποία διαρκεί περισσότερο χρόνο από την πρώτη. Έτσι, παράγεται ένα παρατεταµένο χρονικά σήµα, το οποίο διατηρεί την PKC σε ενεργοποιηµένη κατάσταση για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Πιστεύεται ότι το µονοπάτι αυτό λειτουργεί σε κυτταρικές αποκρίσεις οι οποίες είναι χρονοβόρες, π.χ. κυτταρική αύξηση (Nishizuka 1992, 1995). Η φωσφολιπάση Α 2 (PLA 2 ) είναι ένα ακόµη ένζυµο το οποίο ενεργοποιείται από τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς. Η PLA 2 υδρολύει τη φωσφατιδυλοχολίνη προκαλώντας το σχηµατισµό αραχιδονικού οξέος και λυσοφωσφατιδυλοχολίνης. Και τα δύο αυτά µόρια είναι σε θέση να ενεργοποιήσουν την PKC (Zhong και Minneman 1999). Οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς ενεργοποιούν την PLA 2 µέσω µιας G πρωτεΐνης, που είναι ευαίσθητη στην τοξίνη του βακτηρίου της χολέρας (Terzic και συν. 1993),

29 23 ενώ θεωρείται πιθανό στην ενεργοποίηση να συµµετέχει το σύµπλοκο G βγ (Nishizuka 1992, 1995) Συµµετοχή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων σε φυσιολογικές διεργασίες του µυοκαρδίου Οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα σηµαντικοί για την καρδιά, καθώς η λειτουργία τους σχετίζεται µε την οµοιοστατική ρύθµιση του καρδιαγγειακού συστήµατος (Rockman και συν. 2002). Γενικά, η ενεργοποίηση των αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί θετικό ινοτροπισµό και χρονοτροπισµό και αγγειοσυστολή. Η αναστολή της ενεργοποίησής τους προκαλεί αντίθετα αγγειοδιαστολή, µείωση του καρδιακού ρυθµού και αρνητικό ινοτροπισµό. Ακολούθως παρατίθενται αναλυτικότερα τα στοιχεία που υπάρχουν σχετικά µε το ρόλο των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στη ρύθµιση διαφόρων λειτουργιών του µυοκαρδίου. Ινοτροπισµός Ίσως, η καλύτερα χαρακτηρισµένη λειτουργία των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά είναι η αύξηση της συσταλτικότητας ή αλλιώς η θετική ινότροπος δράση τους. Η α 1 -αδρενεργική διέγερση επιφέρει θετικό ινότροπο αποτέλεσµα σε διάφορα καρδιακά παρασκευάσµατα (ολόκληρες καρδιές, θηλοειδείς µύες, λωρίδες ιστού κοιλιών, κόλποι, αποµονωµένα µυοκύτταρα) από διάφορα θηλαστικά, όπως αρουραίο, κουνέλι, ινδικό χοιρίδιο, γάτα κ.α. (Wagner και Brodde 1978, Shibata και συν. 1980, Terzic και Vogel 1990, Fedida και Bouchard 1992, Gambassi και συν. 1992, Skomedal και συν. 1983, Bruckner και συν. 1985, Osnes και συν. 1985, Endoh, 1991, 1992, Puceat και συν. 1992). Η θετική ινότροπος δράση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων ποικίλει σε µέγεθος µεταξύ των διαφόρων ειδών. Μεγαλύτερες αυξήσεις της συσταλτικότητας έχουν παρατηρηθεί στον αρουραίο και το κουνέλι, σε σχέση µε τις αντίστοιχες που έχουν παρατηρηθεί στο σκύλο και το ινδικό χοιρίδιο (Scholz και συν. 1986). Πιστεύεται ότι οι διαφορές αυτές είναι αποτέλεσµα της διαφορετικής πυκνότητας του πληθυσµού των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων που υπάρχει σε κάθε είδος (Mukherjee και συν. 1983, Endoh και συν.1991). Στην καρδιά του αρουραίου, και πιο συγκεκριµένα στους θηλοειδείς µύες, η απόκριση στην α 1 -αδρενεργική διέγερση φαίνεται να είναι τριφασική (Osnes και συν. 1978, Skomedal και συν. 1982). Στην πρώτη φάση, εµφανίζεται µία παροδική θετική ινότροπος δράση διάρκειας αρκετών δευτερολέπτων. Ακολουθεί η δεύτερη φάση,

30 24 κατά την οποία η συσταλτικότητα ελαττώνεται σε τιµές κατώτερες του φυσιολογικού (παροδική αρνητική ινότροπος δράση που φτάνει σε ένα µέγιστο στα δευτερόλεπτα). Η τρίτη φάση αποτελεί ουσιαστικά την κύρια εκδήλωση της α 1 - αδρενεργικής επίδρασης και χαρακτηρίζεται από παρατεταµένη, θετική, ινότροπο συµπεριφορά που διαρκεί περισσότερο από 20 λεπτά. Στο µυοκάρδιο άλλων ειδών δεν έχει παρατηρηθεί ανάλογη τριφασική απόκριση. Αυτό είναι αποτέλεσµα του γεγονότος ότι στα είδη αυτά οι δύο πρώτες φάσεις είναι πολύ σύντοµες και παροδικές (Li και συν.1997). Υποστηρίζεται η άποψη ότι τόσο οι α 1Α - όσο και οι α 1Β - υποτύποι των αδρενεργικών υποδοχέων εµφανίζουν θετική ινότροπο δράση στους αρουραίους (Williamson και συν. 1994, Deng και συν. 1996), αν και οι τελευταίοι φαίνεται να παίζουν σηµαντικότερο ρόλο (Michel και συν. 1994, Yu και Han 1994). Ο υποτύπος α 1D - φαίνεται να είναι λιγότερο σηµαντικός όσον αφορά στην θετική ινότροπο δράση των α 1 -αδρενεργικών αγωνιστών σε κοιλίες ενήλικου αρουραίου (Deng και συν. 1996), ενώ ουσιαστικά δε φαίνεται να έχει κανένα ρόλο στις καρδιές νεογέννητων αρουραίων (Deng και Varma 1997, Varma και Deng 2000). Όσον αφορά στο µηχανισµό µέσω του οποίου εκδηλώνεται η ινοτρόπος δράση των α 1 -αδρενεργικών αγωνιστών, επικρατούν δύο θεωρίες. Σύµφωνα µε την πρώτη, η ενεργοποίηση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί τελικά αύξηση της ευαισθησίας των µυοϊνιδίων στα ιόντα Ca 2+ (Puceat και συν. 1990), ενώ η δεύτερη αποδίδει σηµαντικό ρόλο στην εισροή ιόντων Ca 2+, που προκαλεί η α 1 -αδρενεργική διέγερση, η οποία οδηγεί στην αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης Ca 2+ (Endoh και Blinks 1988, Fedida και Bouchard 1992, O Rourke και συν. 1992). Χρονοτροπισµός Θεωρείται δεδοµένο ότι στην καρδιά φυσιολογικών αρουραίων οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς προκαλούν θετικό ινοτροπισµό, χωρίς να µεταβάλλουν τον καρδιακό ρυθµό (Wagner και Brodde 1978, Osnes και συν. 1989). Αυτό πιθανόν να οφείλεται στο γεγονός ότι οι α 1 -υποδοχείς δεν επηρεάζουν το βηµατοδοτικό ρυθµό του φλεβόκοµβου (Terzic και συν. 1993). Ωστόσο έχει διαπιστωθεί ότι οι α 1 -αγωνιστές µεταβάλλουν τον αυτοµατισµό λανθανόντων βηµατοδοτικών κυττάρων, όπως για παράδειγµα οι αποµονωµένες ίνες Purkinje (Rosen και συν. 1988). Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήµατα σε κύτταρα καρδιάς νεογέννητων αρουραίων, όπου η α 1 - αδρενεργική διέγερση έχει θετικά χρονότροπα αποτελέσµατα την τρίτη ηµέρα της καλλιέργειας, αλλά αρνητικά χρονότροπα αποτελέσµατα την έβδοµη ηµέρα (Kimura και συν. 1993).

31 25 Αρρυθµιογόνος δράση Οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς συµµετέχουν στην εµφάνιση συγκεκριµένων αρρυθµιών (Sheridan 1986), όπως αυτές που παράγονται κατά τον επανεµποτισµό που ακολουθεί την απόφραξη της στεφανιαίας αρτηρίας σε αποµονωµένες καρδιές ινδικών χοιριδίων (Culling και συν. 1987), σε αναισθητοποιηµένους σκύλους και χοίρους (Benfey και συν. 1984, Sheridan 1986, Benfey 1993). Είναι χαρακτηριστικό ότι η αναστολή της λειτουργίας των υποδοχέων αυτών µειώνει τη συχνότητα εµφάνισης των πρώιµων κοιλιακών συσπάσεων, των κοιλιακών µαρµαρυγών και της ταχυκαρδίας που παρατηρούνται κατά την επαναιµάτωση (Sheridan και συν. 1980, Penny και συν. 1985, Culling και συν. 1987). Στην αρρυθµιογόνο δράση των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων φαίνεται ότι συµβάλλει η παραγωγή InsP 3 που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της ισχαιµίας (Woodcock 1995, Woodcock και συν. 1997). Μεταβολικές επιδράσεις Η α 1 -αδρενεργική διέγερση επηρεάζει το µεταβολισµό της γλυκόζης προκαλώντας αύξηση της πρόσληψής της, διέγερση της γλυκόλυσης και αναστολή της σύνθεσης του γλυκογόνου (Terzic και συν. 1993, Varma και Deng 2000). Επιπλέον, οι α 1 - αδρενεργικοί υποδοχείς ρυθµίζουν το µονοπάτι των πεντοζών, αυξάνοντας τη δραστικότητα της αφυδρογονάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης. Η απόκριση αυτή θεωρείται προσαρµοστικός µηχανισµός που αντισταθµίζει την αυξηµένη κατανάλωση ενέργειας λόγω της θετικής ινότροπης δράσης των κατεχολαµινών (Zimmer H.G. και συν. 1992). Άλλες µεταβολικές επιδράσεις των α 1 -αδρενεργικών αγωνιστών είναι η αυξηµένη κατανάλωση Ο 2 από τα µιτοχόνδρια και η αύξηση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Υπερτροφία της καρδιάς Οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς ενεργοποιούν µιτογονικές αποκρίσεις σε ποικίλους κυτταρικούς τύπους, διαδραµατίζοντας σηµαντικό ρόλο στην κυτταρική αύξηση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Για πολύ καιρό εθεωρείτο ότι οι αποκρίσεις των κυττάρων σε µιτογόνες ενώσεις σχετίζονται αποκλειστικά µε υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, όπως ο υποδοχέας του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα (EGF) ή ο νευρικός αυξητικός παράγοντας (NGF). Οι υποδοχείς αυτοί εµφανίζουν ενδογενή δραστικότητα κινάσης της τυροσίνης. Ωστόσο, έχει εξακριβωθεί ότι και οι υποδοχείς που συνδέονται µε G πρωτεΐνες µπορούν να επάγουν µιτογονικές αποκρίσεις, ενεργοποιώντας τις MAPKs (Graham και συν. 1996, Zhong και Minneman 1999).

32 26 Ιδιαίτερα στα καρδιακά κύτταρα φαίνεται ότι εµπλέκονται στην εκδήλωση της υπερτροφίας (Ramirez και συν. 1997, Spector και συν. 1997, Alexandrov 1998, Lazou και συν. 1998). Η υπερτροφία της καρδιάς είναι µια προσαρµοστική απόκριση του µυοκαρδίου απέναντι σε µια ποικιλία φυσιολογικών, χηµικών, ορµονικών και νευρικών ερεθισµάτων, όπως το στρες, η υπέρταση, το έµφραγµα του µυοκαρδίου, διάφορες µορφές συγγενών καρδιακών νοσηµάτων, η αγγειοτενσίνη ΙΙ, η θυροξίνη και οι κατεχολαµίνες. Τα βασικότερα γνωρίσµατα αυτού του φαινοµένου είναι η αύξηση του µεγέθους των καρδιακών µυοκυττάρων, µεταβολές της οργάνωσης των σαρκοµεριδίων και η επαγωγή της έκφρασης συγκεκριµένων γονιδίων (Li και συν. 1997, Zhong και Minneman 1999, Michelotti και συν. 2000, Varma και Deng 2000, Simpson 1988, Simpson και συν. 1991, Terzic και συν. 1993, Glennon 1995, Knowlton 1991, Bishopric και συν. 1987, Bishopric και Kedes 1991, Waspe και συν. 1990, Simpson 1988, Meidell και συν. 1986, Fuller και συν. 1991, Chien 1991, Allo 1992, Deng και συν. 1998). 5. Ισχαιµία του µυοκαρδίου Η ισχαιµία του µυοκαρδίου αποτελεί, εδώ και πολλά χρόνια, πεδίο έντονης και συστηµατικής µελέτης. Ετυµολογικά, ο όρος ισχαιµία σηµαίνει τον περιορισµό της παροχής αίµατος στο µυοκάρδιο, έννοια που υποδηλώνει καταρχάς ότι το αίµα αποτελεί το µοναδικό µέσο εµποτισµού της καρδιάς και επίσης ότι για την εκδήλωσή της προαπαιτείται ο περιορισµός της στεφανιαίας ροής. Καθώς όµως, στα πλαίσια της µελέτης της µυοκαρδιακής ισχαιµίας, έχουν αναπτυχθεί διάφορα πειραµατικά µοντέλα στα οποία αποµονωµένες καρδιές εµποτίζονται µε οξυγονωµένα ηλεκτρολυτικά διαλύµατα και µε δεδοµένο επίσης το γεγονός ότι σε ορισµένες περιπτώσεις η ισχαιµία χαρακτηρίζεται από αύξηση της στεφανιαίας ροής, ο ορισµός της ισχαιµίας µε βάση την ετυµολογική της έννοια είναι ανεπαρκής. Σύµφωνα µε έναν άλλο ορισµό εξίσου έγκυρο και περιεκτικότερο, ισχαιµία είναι η διαταραχή του ισοζυγίου ανάµεσα στο ποσό του οξυγόνου που προσφέρεται στο µυοκαρδιακό µυ και στο ποσό που απαιτείται για την διατήρηση της φυσιολογικής του λειτουργίας (Hearse 1994, Jennings και συν. 1975, Ferrari και συν. 1998, Verdonw και συν. 1998). Αν και στην πλειονότητα των περιπτώσεων η έλλειψη οξυγόνου οφείλεται στη διακοπή της στεφανιαίας ροής, υπάρχουν καταστάσεις στις οποίες η διαταραχή του ισοζυγίου προκαλείται από τη µείωση του περιεχοµένου οξυγόνου στο αίµα

33 27 (υποξία/ανοξία). Έτσι, όταν η έλλειψη οξυγόνου οφείλεται απλώς στη µείωση του περιεχόµενου οξυγόνου στο αίµα, η διατήρηση της στεφανιαίας ροής επιτρέπει τη συνεχή αποµάκρυνση των προϊόντων του αναερόβιου µεταβολισµού. Αντίθετα, στις περιπτώσεις ισχαιµίας, όπου η έλλειψη οξυγόνου οφείλεται στη διακοπή της στεφανιαίας ροής, τα µεταβολικά προϊόντα που παράγονται συσσωρεύονται στο ισχαιµικό µυοκάρδιο. (Ytrehus 2000, Hearse και συν. 2000). Πειραµατικά η ισχαιµία µπορεί να ασκείται in vivo, σε αποµονωµένες καρδιές, ακόµα και σε αποµονωµένα κύτταρα. Μπορεί επίσης να αφορά τµήµα ή ολόκληρη την καρδιά [περιοχική(τοπική) ή ολική ισχαιµία αντίστοιχα] Επιπτώσεις της ισχαιµίας στο µυοκάρδιο Οι επιπτώσεις της ισχαιµίας στο µυοκάρδιο εκδηλώνονται στο µεταβολικό, στο δοµικό και στο λειτουργικό επίπεδο. Η διαταραχή του ισοζυγίου Ο 2 αναστέλλει την οξειδωτική φωσφορυλίωση, προκαλώντας την εξάντληση των φωσφορικών ενώσεων και τη συσσώρευση των µεταβολικών προϊόντων της αναερόβιας γλυκόλυσης, διαδικασίες που οδηγούν στην οξέωση, στη διαταραχή της ιοντικής οµοιόστασης, στην απώλεια της συστολικής ικανότητας και στην αλλοίωση της δοµής του ισχαιµικού κύτταρου [Jennings και συν.1975b, Jennings και συν. 1990, Kenneth 1981, Winfred και συν. 1981). Αναλυτικότερα, οι κυριότερες µεταβολικές και ηλεκτροφυσιολογικές µεταβολές, που προκαλούνται προοδευτικά από την ισχαιµία, είναι οι εξής (Hegstad και συν. 1999): Αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, ταχύτατη εξάντληση των αποθεµατικών ενώσεων υψηλής ενέργειας [~p] (τριφωσφορική αδενοσίνη [ATP] και φωσφοκρεατίνη [CP]) και ενεργοποίηση της αναερόβιας γλυκόλυσης. Συσσώρευση των τελικών προϊόντων της γλυκολυτικής οδού, µείωση της έντασης της συστολής Παραγωγή νέων µορίων υψηλής ενέργειας µε ρυθµούς που δεν καλύπτουν τις ενεργειακές απαιτήσεις του κύτταρου. Συστολική ανεπάρκεια, αναστολή ή και τροποποίηση της δράσης πολλών µεµβρανικών αντλιών που ρυθµίζουν το ιοντικό περιβάλλον του κύτταρου, αναστολή της σύνθεσης πολλών µακροµορίων και εξάντληση των αποθεµάτων των νουκλεοτιδίων αδενοσίνης του κυττάρου

34 28 Οξέωση των ισχαιµικών κύτταρων, περαιτέρω µείωση της έντασης της συστολής, αύξηση των ενδοκυτταρικών συγκεντρώσεων ιόντων Νa +, Ca 2+ Απώλεια ιόντων Κ + στον εξωκυττάριο χώρο, βράχυνση της διάρκειας του δυναµικού δράσης, απώλεια της ηλεκτρο-µηχανικής σύζευξης Αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+, ενεργοποίηση υδρολυτικών ενζύµων, καταστροφή µιτοχονδρίων Οι µεταβολικές και ιοντικές αλλαγές που εµφανίζονται κατά την εξέλιξη της ισχαιµίας συνοδεύονται από τη σταδιακή αποδιοργάνωση της αρχιτεκτονικής δοµής των κυττάρων. Είναι γενικά παραδεκτό ότι µικρή περίοδος ισχαιµίας προκαλεί ήπιες αλλοιώσεις στη λεπτή δοµή των κυττάρων. Παρατηρείται µείωση των κοκκίων γλυκογόνου, µέτρια διόγκωση του κυτταροπλάσµατος και των µιτοχονδρίων, µετρίου βαθµού περιφερική διάταξη σε σειρές της χρωµατίνης του πυρήνα και ήπια διάταση των µυοϊνιδίων (Jennings και συν. 1975, 1978). Καθώς η ισχαιµία παρατείνεται (>20 λεπτά), οι αλλοιώσεις γίνονται εντονότερες, ενώ κάνουν την εµφάνιση τους και άλλες που συνιστούν µε την παρουσία τους εκδηλώσεις βαριάς ισχαιµικής βλάβης. Συγκεκριµένα, εντείνεται η διόγκωση των κυττάρων, ενώ στα µιτοχόνδρια παρατηρείται διάσπαση της µιτοχονδριακής ακρολοφίας και συσσώρευση στη µήτρα τους άµορφων πυκνών συσσωµατώσεων λιπιδίων και µετουσιωµένων πρωτεινών. Η χρωµατίνη του πυρήνα εµφανίζει πιο έντονη διάταξη στην περιφέρεια του πυρήνα. Τα µυονηµάτια παρουσιάζουν αποπροσανατολισµό, λέπτυνση και διάσταση. Όσο η ισχαιµία παρατείνεται, τα κύτταρα αποκτούν χαρακτηριστικά µη αναστρέψιµης ισχαιµικής βλάβης. Εµφανίζονται άµορφοι σχηµατισµοί φωσφορικού ασβεστίου στα διογκωµένα µιτοχόνδρια, πολλά από τα οποία αποδιοργανώνονται πλήρως. Επίσης, το κυτταροσκελετικό πρωτεϊνικό σύµπλεγµα που συνδέει την κυτταροπλασµατική µεµβράνη µε τους δίσκους Ζ των σαρκοµεριδίων διασπάται, µε αποτέλεσµα η κυτταρική µεµβράνη να διαρρηγνύεται. ( Jennings και Reimer 1981, Jennings και συν. 1990) Ισχαιµική προετοιµασία Από τις αρχές της δεκαετίας του 70 ξεκίνησε µια έντονη ερευνητική δραστηριότητα µε σκοπό την ανεύρεση εφαρµογών και µεθόδων περιορισµού των επιπτώσεων της ισχαιµίας στο µυοκάρδιο. Αρχικά, επικρατούσε η πεποίθηση ότι µικρά διαδοχικά επεισόδια ισχαιµίας είχαν αθροιστικό αποτέλεσµα σε ότι αφορούσε

35 29 στις βλάβες του µυοκαρδίου. Παρόλα αυτά, η µελέτη των επιδράσεων επαναλαµβανόµενων ισχαιµικών επεισοδίων σε αναισθητοποιηµένους σκύλους οδήγησε σε ορισµένα συµπεράσµατα, τα οποία καθιστούσαν πιθανή την ύπαρξη ενός µηχανισµού ενδογενούς προσαρµογής του µυοκαρδίου στην ισχαιµία (Reimer και συν. 1986). Λίγο αργότερα, ο Murry και οι συνεργάτες του (1986), βασιζόµενοι στα προγενέστερα ευρήµατα που αφορούσαν στην ενεργειακή προσαρµογή της καρδιάς σε συνθήκες επαναλαµβανόµενου ισχαιµικού stress, ανακοίνωσαν µια φαινοµενικά παράδοξη παρατήρηση. Συγκεκριµένα, ανέφεραν ότι καρδιές σκύλων, που προετοιµάστηκαν µε σύντοµα, διαδοχικά επεισόδια ισχαιµίας-επαναιµάτωσης πριν από την έκθεσή τους σε µεγάλη περίοδο ισχαιµίας, εµφάνισαν µικρότερο ποσοστό νέκρωσης, σε σχέση µε τις καρδιές που υποβλήθηκαν κατ ευθείαν σε παρατεταµένο ισχαιµικό επεισόδιο. Η οµάδα αυτή ανέφερε ότι το ποσοστό νέκρωσης που προκαλεί η 40λεπτη απόφραξη ενός κλάδου µιας στεφανιαίας αρτηρίας, σε αναισθητοποιηµένους σκύλους, φτάνει περίπου το 30% της ισχαιµικής περιοχής. Αντίθετα, σε σκύλους που υποβλήθηκαν σε 4 κύκλους 5λεπτης ισχαιµίαςεπανεµποτισµού πριν την 40λεπτη ισχαιµία, µόνο το 7% του «εν κινδύνω» µυοκαρδίου νεκρώθηκε. Είναι φανερό ότι, στους σκύλους που υποβλήθηκαν σε ισχαιµική προετοιµασία, παρά τη µεγαλύτερη, αθροιστικά, χρονική διάρκεια της στεφανιαίας απόφραξης, το ποσοστό νέκρωσης ήταν µόλις το ένα τέταρτο εκείνου που παρατηρήθηκε στους µάρτυρες. Το ίδιο καρδιοπροστατευτικό αποτέλεσµα έχει παρατηρηθεί σε όλα ανεξαιρέτως τα είδη και πειραµατικά µοντέλα που έχουν ως τώρα µελετηθεί (σκύλος, κουνέλι, χοίρος και αρουραίος), αποδεικνύοντας ότι πρόκειται για ένα φαινόµενο που δεν εξαρτάται από το είδος του πειραµατόζωου (Lasley και συν. 1990, Li και συν. 1990, Toombs και συν. 1993, Burns και συν. 1995, Schultz και συν. 1995, Schulz και συν. 1998). Το φαινόµενο αυτό ονοµάζεται «ισχαιµική προετοιµασία» (ischemic preconditioning) και περιγράφεται εν συντοµία ως εξής: µικρής διάρκειας περίοδοι ισχαιµίας, που συνοδεύονται από επανεµποτισµό και προηγούνται µιας παρατεταµένης ισχαιµικής περιόδου, προστατεύουν την καρδιά από τις ισχαιµικές βλάβες και βελτιώνουν την καρδιακή λειτουργία κατά τη διάρκεια της επαναιµάτωσης. Εκτός από τη µείωση του ποσοστού νέκρωσης του µυοκαρδίου που φαίνεται να αποτελεί το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του φαινοµένου, η ισχαιµική προετοιµασία φαίνεται ότι προστατεύει από τις αρρυθµίες (Lauson και συν. 1993), επιβραδύνει τον

36 30 ενεργειακό µεταβολισµό κατά τα πρώτα στάδια της ισχαιµίας (Μurry και συν. 1990, Steenburgen και συν. 1993), ενισχύει την ανάκτηση της καρδιακής λειτουργίας µετά από ένα παρατεταµένο ισχαιµικό επεισόδιο (Asimakis και συν. 1992, Cave και Hearse 1992, Banerjee και συν. 1993, Asimakis και συν. 1994, Asimakis και Conti 1995, Tosaki και συν. 1995, Perez και συν. 1999) και προστατεύει το ενδοθήλιο των στεφανιαίων αγγείων (Richard και συν. 1994, Tofukuzi και συν. 1998, Τhourani και συν. 1999). Το φαινόµενο της ισχαιµικής προετοιµασίας µελετάται σε καρδιές πειραµατόζωων διαφόρων ειδών µε την εφαρµογή ποικίλων πειραµατικών διατάξεων. Ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον παρουσιάζει η διερεύνηση των ενδοκυτταρικών µηχανισµών, που ενεργοποιούνται κατά την ισχαιµική προετοιµασία και επιφέρουν τα καρδιοπροστατευτικά αποτελέσµατα που αναφέρονται παραπάνω. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκαν και εφαρµόστηκαν πειραµατικά µοντέλα, στα οποία το σύντοµο ισχαιµικό ερέθισµα αντικαθίσταται από τον εµποτισµό της καρδιάς µε διάλυµα εµποτισµού, το οποίο περιέχει διάφορες φαρµακευτικές ουσίες, κυρίως αγωνιστές συγκεκριµένων υποδοχέων που εκφράζονται στα καρδιακά µυοκύτταρα. Σε αρκετά από αυτά τα πειραµατικά µοντέλα παρατηρήθηκε παρόµοια καρδιοπροστατευτική δράση µε αυτήν της ισχαιµικής προετοιµασίας (Lasley και συν. 1990, Tsuchida και συν. 1992, Banerjee και συν. 1993, Tsuchida και συν. 1994, Tosaki και συν. 1995, Schulz και συν. 1998). Η µίµηση της προστατευτικής δράσης της ισχαιµικής προετοιµασίας από τις επιδράσεις φαρµακευτικών ουσιών στις οποίες εκτίθεται η καρδιά, αντί του σύντοµου ισχαιµικού επεισοδίου, ονοµάζεται «φαρµακολογική προετοιµασία». Πέραν της ιδιαίτερα σηµαντικής συµβολής τους στην κατανόηση των προσαρµοστικών µηχανισµών του µυοκαρδίου που σχετίζονται µε την ισχαιµική προετοιµασία, τα πειραµατικά µοντέλα «φαρµακολογικής προετοιµασίας» αναµένεται να αποτελέσουν τη βάση για τη σχεδίαση πρωτότυπων θεραπευτικών στρατηγικών, που θα καθιστούν το ανθρώπινο µυοκάρδιο ανθεκτικότερο στις βλάβες από την ισχαιµία (Przyklenk και Kloner 1998) Μηχανισµοί καρδιοπροστατευτικής δράσης της ισχαιµικής προετοιµασίας Αν και στην πορεία των σχετικών µελετών η γνώση για το φαινόµενο της ισχαιµικής προετοιµασίας έχει διευρυνθεί, δεν έχει ακόµη πλήρως διευκρινιστεί ποιά είναι η αλληλουχία των κυτταρικών γεγονότων που ενεργοποιούνται από µία

37 31 σύντοµη περίοδο ισχαιµίας και προστατεύουν το µυοκάρδιο, µειώνοντας το ποσοστό νέκρωσης της καρδιάς και βελτιώνοντας τη µετα-ισχαιµική καρδιακή λειτουργία. Η προστασία που παρέχει στο µυοκάρδιο η ισχαιµική προστασία είναι πιθανό να οφείλεται στην ενεργοποίηση ενός ή περισσοτέρων τύπων υποδοχέων. Κατά τη διάρκεια της ισχαιµίας απελευθερώνεται από τα µυοκύτταρα ένας µεγάλος αριθµός ουσιών, µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται η αδενοσίνη, οι κατεχολαµίνες, η αγγειοτενσίνη II, η βραδυκινίνη και η ενδοθηλίνη. Όλες αυτές οι ενώσεις είναι δυνατόν να συνδέονται µε αντίστοιχους υποδοχείς των καρδιακών κυττάρων και να ενεργοποιούν µια σειρά από ενδοκυττάρια µονοπάτια, που οδηγούν τελικά στην εκδήλωση της προστατευτικής δράσης της ισχαιµικής προετοιµασίας (Przyklenk και Kloner1998). Πράγµατι, όπως έγινε εµφανές από ένα πλήθος σχετικών ερευνών, οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς (Banerjee και συν. 1993, Bankwala και συν. 1994, Tsuchida και συν. 1994, Tosaki και συν. 1995), οι υποδοχείς Α 1 αδενοσίνης (Lasley και συν. 1990, Tsuchida και συν. 1992, Schulz και συν. 1998, Yao και Gross 1994), αλλά και οι υποδοχείς της αγγειοτενσίνης II (Liu και συν. 1995), οι Μ 2 µουσκαρινικοί υποδοχείς (Brown και συν. 1985), οι υποδοχείς Β a της βραδυκινίνης (Schulz και συν. 1998, Brew και συν. 1995), οι υποδοχείς ενδοθηλίνης (Wang και συν. 1996) και οι σ- οπιοειδείς υποδοχείς (Schultz και συν. 1995) εµπλέκονται στους µηχανισµούς της καρδιοπροστατευτικής δράσης του φαινοµένου. εδοµένου ότι το κοινό στοιχείο µεταξύ των διαφόρων αυτών τύπων υποδοχέων είναι η σύξευξή τους µε G πρωτεΐνες (Fleming και συν. 1992, Hu και Nattel 1995), θεωρείται πιθανό ότι η ενεργοποίηση των G πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του σύντοµου ισχαιµικού επεισοδίου (Niroomand και συν. 1995) ή και άλλων πρωτεϊνών, που συµµετέχουν σε µεταγενέστερα στάδια των µονοπατιών που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες, να αποτελούν τα απαραίτητα σήµατα ενεργοποίησης του προστατευτικού µηχανισµού. Μεταξύ των πρωτεϊνών αυτών η PKC, η οποία ενεργοποιείται από την DAG και τα ιόντα Ca 2+, φαίνεται να αποτελεί βασικό παράγοντα του φαινοµένου της ισχαιµικής προετοιµασίας (Kikkawa και Nishizuka 1986, Nishizuka 1992, Toombs και συν. 1993, Liu και συν. 1994, Tsuchida και συν. 1994, Bugge και Ytrehus 1995, Hu και Nattel 1995). Συγκεκριµένα, έχει παρατηρηθεί ότι 10 λεπτά ισχαιµίας σε αποµονωµένη καρδιά αρουραίου προκάλεσαν ενεργοποίηση και µετατόπιση της PKC από το κυτταρόπλασµα στις µεµβράνες των µυοκυττάρων (Strasser και συν. 1992). Στη θέση αυτή το ένζυµο µπορεί να προκαλεί τη φωσφορυλίωση κατάλληλων µεµβρανικών πρωτεινών επάγοντας έτσι την µείωση του ποσοστού νέκρωσης στο µυοκάρδιο.

38 32 Επιπλέον, µελέτες στην καρδιά του κουνελιού έδειξαν ότι η χορήγηση ειδικών αναστολέων της PKC, όπως η σταυροσπορίνη και η πολυµυξίνη Β, µετά το σύντοµο ισχαιµικό ερέθισµα, παρεµπόδισε το ευεργετικό αποτέλεσµα της ισχαιµικής προετοιµασίας. Αντίθετα, η χορήγηση ενεργοποιητών της PKC, όπως το ΡΜΑ, προστάτεψαν την αποµονωµένη καρδιά κουνελιού έναντι µιας παρατεταµένης στεφανιαίας απόφραξης (Liu και συν. 1994, Ytrehus και συν. 1994). Έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον επικεντρώθηκε πρόσφατα στον πιθανό ρόλο της p38 ΜΑΡ κινάσης στο µηχανισµό που επάγει το προστατευτικό αποτέλεσµα της ισχαιµικής προετοιµασίας, µετά την ενεργοποίηση της PKC. Η κινάση αυτή ενεργοποιείται κάτω από συνθήκες κυτταρικού stress, όπως επίδραση ενδοτοξίνης, υπεροξειδίου του υδρογόνου, θερµότητα και ισχαιµία (Seger και Krebs 1995, Waskiewicz και Cooper 1995, Sugden και Clerk 1998, Widmann και συν. 1999). Το υπόστρωµα της p38 ΜΑΡ κινάσης είναι µια άλλη πρωτεϊνική κινάση γνωστή ως ΜΑΡΚΑΡ κινάση 2, η οποία µε τη σειρά της φωσφορυλιώνει την µικρού µοριακού βάρους πρωτεΐνη HSP 27 (Stokoe και συν. 1992, McLayghlin και συν. 1996, Huot και συν. 1997). Σε ορισµένους τύπους κυττάρων, η φωσφορυλίωση αυτής της πρωτεΐνης οδηγεί σε πολυµερισµό της ακτίνης του κυτταρικού σκελετού, αυξάνοντας την ανθεκτικότητά του σε καταστάσεις stress (Landry και Huot 1995, Lambert και συν. 1999). Έχει βρεθεί ότι η ισχαιµική προετοιµασία προκαλεί αύξηση της δραστικότητας τόσο της p38 ΜΑΡΚ, όσο και της ΜΑΡΚΑΡΚ2 (Baines και συν. 1998, Maulik και συν. 1998, Fryer και συν. 1999). Ενεργοποίηση της PKC και ταυτόχρονη αύξηση στη δραστικότητα της ΜΑΡΚΑΡΚ2 παρατηρήθηκε επίσης σε καρδιακά κύτταρα νεογέννητων αρουραίων (Goldberg και συν. 1996). Παρ όλα αυτά, σύµφωνα µε τα συµπεράσµατα άλλων εργασιών (Iliodromitis και συν. 2002), η συµµετοχή της p38 ΜΑΡΚ στο µηχανισµό της ισχαιµικής προετοιµασίας δε θεωρείται πιθανή. Αµφισβητήσιµος είναι επίσης και ο ρόλος της PKC, καθώς τα αποτελέσµατα ορισµένων ερευνών είναι αρνητικά όσον αφορά στη σηµασία της στην εκδήλωση του φαινοµένου (Przyklenk και συν. 1995, Simkhovich και συν. 1996). Άλλοι παράγοντες, εκτός των υποδοχέων, που φαίνεται να συµµετέχουν στο φαινόµενο της ισχαιµικής προετοιµασίας είναι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, τα ιόντα Ca 2+ καθώς και το µονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ). Αν και η µαζική παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου έχει αναδειχθεί ως ένας βασικός βλαπτικός παράγοντας των µυοκυττάρων κατά την ισχαιµία και ιδιαίτερα

39 33 κατά την επαναιµάτωση που ακολουθεί, η µικρής κλίµακας παραγωγή τους κατά το σύντοµο ισχαιµικό ερέθισµα της ισχαιµικής προετοιµασίας έχει προταθεί ως ένας από τους παράγοντες κινητοποίησης των µηχανισµών που σχετίζονται µε το φαινόµενο. Ο τρόπος µε τον οποίο οι ελεύθερες ρίζες προετοιµάζουν το µυοκάρδιο δεν έχει ξεκαθαρισθεί, ωστόσο πιθανολογείται ότι µπορούν να ενεργοποιήσουν κατ ευθείαν τις πρωτεΐνες G (Das και συν. 1999), την πρωτεϊνική κινάση C (Tritto και συν. 1997) ή τα κανάλια ιόντων K + που εξαρτώνται από ATP (Tokube και συν. 1996). Αξίζει να σηµειωθεί επίσης ότι σύντοµα ισχαιµικά επεισόδια, όπως αυτά που εφαρµόζονται στα πειράµατα της ισχαιµικής προετοιµασίας, προκαλούν παροδική, αναστρέψιµη αύξηση των κυτταροπλασµατικών συγκεντρώσεων ιόντων Ca 2+. Όπως είναι γνωστό, τα ιόντα Ca 2+ αποτελούν βασικό συστατικό των ενδοκυττάριων µονοπατιών µεταγωγής µηνυµάτων και θεωρούνται ως ένας ισχυρός ενεργοποιητής της δράσης της πρωτεϊνικής κινάσης C (Node και συν. 1997, Miyawaki και Ashraf 1997). Τέλος όσον αφορά το ΝΟ, έχει προταθεί ότι προάγει τη µετατόπιση της πρωτεϊνικής C από το κυτταρόπλασµα στην κυτταρική µεµβράνη, θέση στην οποία ασκεί τη δράση της µέσω διαδικασιών φωσφορυλίωσης (Lochner και συν. 2000, Nakano και συν. 2000a). Γενικά η ταυτοποίηση του τύπου των υποδοχέων, της τελικής πρωτεΐνης στόχου και κυρίως ο προσδιορισµός του ενδιάµεσου µονοπατιού συνεχίζουν να αποτελούν αντικείµενο µελετών καθώς αποδεικνύεται ότι οι µηχανισµοί που ενεργοποιούνται κατά την ισχαιµική προετοιµασία είναι ιδιαίτερα περίπλοκοι. 6. Σκοπός της εργασίας Οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς παίζουν σηµαντικό ρόλο στη φυσιολογία της καρδιάς επηρεάζοντας τις συσταλτικές, ηλεκτροφυσιολογικές και µεταβολικές ιδιότητές της. Η αποσαφήνιση των µηχανισµών µεταγωγής µηνυµάτων µέσω των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον µια και οι υποδοχείς αυτοί θεωρούνται ότι συµµετέχουν σε διαδικασίες κάτω από παθοφυσιολογικές καταστάσεις της καρδιάς όπως είναι η ισχαιµία και η υπερτροφία.. Συγχρόνως όµως, η διερεύνηση και αποσαφήνιση των φυσιολογικών µηχανισµών καθίσταται πολύπλοκη λόγω της ύπαρξης πολλαπλών υποτύπων των υποδοχέων αυτών. Τα ερωτήµατα που τίθενται αφορούν τόσο στην έκφραση των συγκεκριµένων υποτύπων σε διάφορους ιστούς όσο και στους πιθανόν διαφορετικούς µηχανισµούς που

40 34 ενεργοποιούν και στη φυσιολογική τους σηµασία. Έτσι, αν και θεωρείται δεδοµένη η ύπαρξη τριών υποτύπων α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, δεν είναι ακόµη σαφής, ιδιαίτερα όσον αφορά τον α 1D -που ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα, η ακριβής κατανοµή τους στους διάφορους ιστούς. Όσον αφορά στην καρδιά συγκεκριµένα, η εκτίµηση των ευρηµάτων από µελέτες σε πρωτεϊνικό επίπεδο και από πειράµατα µοριακής βιολογίας έχει επιφέρει µια σύγχυση σχετικά µε την έκφραση των α 1D - υποδοχέων. Μολονότι το mrna του υποδοχέα αυτού είναι ανιχνεύσιµο στα καρδιακά κύτταρα δεν συµβαίνει το ίδιο και µε την αντίστοιχη πρωτεΐνη, τουλάχιστον όπως προκύπτει από ορισµένες µελέτες µε ειδικούς αγωνιστές και ανταγωνιστές. Ένα σκέλος της παρούσης µελέτης αφορούσε ακριβώς το ζήτηµα της έκφρασης των α 1D - υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου. Επιδιώχθηκε κατ αρχάς να διαπιστωθεί αν ο υποδοχέας αυτός είναι ανιχνεύσιµος στα καρδιακά κύτταρα του αρουραίου. Για το σκοπό αυτό, χρησιµοποιήθηκε ο ειδικός ανταγωνιστής των α 1D - υποδοχέων ΒΜΥ 7378 σε πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης σε µεµβράνες των κυττάρων αυτών παρουσία [ 3 Η]πραζοσίνης. Επιπλέον, διερευνήθηκαν τυχόν διαφοροποιήσεις στο µονοπάτι µεταγωγής µηνυµάτων που συνδέεται µε τον κάθε υποτύπο των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων ξεχωριστά µε σκοπό να διευκρινιστεί αν ο α 1D - υποτύπος είναι συζευγµένος µε την ενεργοποίηση του µονοπατιού της υδρόλυσης των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης. Επίσης, όσον αφορά στους υποτύπους α 1Α - και α 1Β - για τους οποίους είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν το παραπάνω µονοπάτι στην καρδιά του αρουραίου, η έρευνα προσανατολίστηκε σε ορισµένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του σηµατοδοτικού τους µηχανισµού. Συγκεκριµένα, διερευνήθηκε η πιθανή συµµετοχή των ιόντων Ca 2+ στην υδρόλυση των µεµβρανικών φωσφολιπιδίων που προκαλείται από την α 1 -αδρενεργική διέγερση. Επίσης, χρησιµοποιήθηκαν ειδικοί αναστολείς των α 1Α - και α 1Β -υποτύπων των αδρενεργικών υποδοχέων, µε σκοπό να διαπιστωθεί αν ο πιθανός ρόλος του ασβεστίου στη µεταγωγή µηνυµάτων που προκαλεί η α 1 -αδρενεργική διέγερση συνδέεται αποκλειστικά µε ένα συγκεκριµένο υποτύπο. Ένας επιπλέον στόχος της εργασίας ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των α 1 - υποδοχέων σε µια φυσιολογική διαδικασία που σχετίζεται άµεσα µε την καρδιά, στην προσαρµογή του µυοκαρδίου στην ισχαιµία. Σ αυτό το στάδιο ο σκοπός ήταν να προσδιοριστεί η πιθανή φυσιολογική σηµασία των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων. Η συµµετοχή του καθενός υποτύπου στους προστατευτικούς

41 35 µηχανισµούς της καρδιάς έναντι της ισχαιµίας διερευνήθηκε µε τη χρήση ειδικών αναστολέων σε κατάλληλα σχεδιασµένους εµποτισµούς. Ο συνδυασµός των επί µέρους αποτελεσµάτων και η προσεκτική τους ερµηνεία ελπίζουµε ότι θα συµβάλλει στην πληρέστερη κατανόηση του ρόλου των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά..

42 36 II. ΥΛΙΚΑ 1.ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Ως βιολογικό υλικό χρησιµοποιήθηκε η καρδιά (καρδιακός µυς) ενήλικου αρουραίου. Τα πειραµατόζωα ήταν αρσενικοί αρουραίοι της φυλής Wistar, σωµατικού βάρους g. Τα ζώα εκτρέφονταν σε ειδικό χώρο του Τµήµατος Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. και µεταφέρονταν στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων του Τµήµατος Βιολογίας. Εκεί φυλάσσονταν, σε ειδικό χώρο, µέχρι να χρησιµοποιηθούν στα πειράµατα -για διάστηµα περίπου δεκαπέντε ηµερών-, µέσα σε κλωβούς µε ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Η µεταχείριση των ζώων ήταν σύµφωνη µε τις Οδηγίες που εκδόθηκαν από την Ελληνική κυβέρνηση (160/1991), βάση ειδικών κανονισµών της Ευρωπαϊκής Ένωσης (86/609), για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών Ζώων. 2. ΧΗΜΙΚΑ- ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Τα κοινά χηµικά αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προέρχονταν από τους οίκους Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερµανία) και Merck (Darmstadt, Γερµανία). Η κολλαγενάση που χρησιµοποιήθηκε για την αποµόνωση µυοκυττάρων από τις κοιλίες της καρδιάς ήταν του τύπου 1 της εταιρείας Worthington. Η αλβουµίνη ορού βοδιού (κλάσµα V) ήταν από τον οίκο Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Γερµανία). Για την παρασκευή διαλυµάτων Krebs-Henseleit καθορισµένης συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+, χρησιµοποιήθηκε η χηλική ένωση ΒΑΡΤΑ (1,2- bis(aminophenoxy)ethane-ν,ν,ν,ν -tetraacetic acid) του οίκου Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Γερµανία). Η ένωση BAPTA-AM[1,2-bis(2-aminophenoxy) ethane-ν,ν,ν,ν -tetraacetic acid tetra (acetoxy methyl) ester], που χρησιµοποιήθηκε για τη ρύθµιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+, ήταν της εταιρείας Calbiochem (La Jolla, CA). Η νιφεδιπίνη, αναστολέας των L-τύπου καναλιών των ιόντων Ca 2+, ήταν από τον οίκο Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Γερµανία). Η ιονοµυκίνη, ιονοφόρος ουσία που προάγει την εισροή ιόντων Ca 2+, ήταν του οίκου Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Γερµανία).

43 37 Για την ταχεία διήθηση δειγµάτων υπό κενό, χρησιµοποιήθηκαν φίλτρα του τύπου GF/C, της εταιρίας Whatman (Kent, UK). Για την αναισθητοποίηση του πειραµατόζωου, χρησιµοποιήθηκε νατριούχος πεντοθάλη (Abbott Laboratories, SpA, Italy). Η ηπαρίνη που χρησιµοποιήθηκε ως αντιπηκτικό ήταν της εταιρίας Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Denmark). Για τον ποσοτικό προσδιορισµό της πρωτεΐνης µε τη χρωµατοµετρική µέθοδο Bradford, χρησιµοποιήθηκε η χρωστική Coomasie Brilliant Blue G-250 (Biorad Protein Assay). Οι αγωνιστές των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων που χρησιµοποιήθηκαν παρατίθενται παρακάτω: Αδρεναλίνη, µη ειδικός αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisenhofen, Γερµανία). Φαινυλεφρίνη, ειδικός αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisenhofen, Γερµανία). Μεθοξαµίνη, ειδικός αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Γερµανία). Χρησιµοποιήθηκαν ακόµη οι παρακάτω ανταγωνιστές των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων: Πραζοσίνη, ειδικός ανταγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisenhofen, Γερµανία). Φαιντολαµίνη, µη ειδικός ανταγωνιστής των α-αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisenhofen, Γερµανία). Προπανολόλη, ανταγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Γερµανία). 5 -µεθυλουραπιδίλη, ειδικός ανταγωνιστής των α 1Α -υποδοχέων (Research Biochemicals International, Natick, MA). CEC, (chloro-ethyl-clonidine), µη αντιστρεπτός ανταγωνιστής των α 1B -υποδοχέων (Research Biochemicals International, Natick, MA).

44 38 BMY 7378, 8[2-[4(2-methoxylphenyl)-1-piperazinyl]ethyl]-8-azaspiro[4.5] decane-7,9-dione dihydrochloride, ειδικός ανταγωνιστής των α 1D -υποδοχέων (Research Biochemicals International, Natick, MA). 3. ΡΑ ΙΟΧΗΜΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Στα πειράµατα σύνδεσης µε ραδιενεργό συνδέτη χρησιµοποιήθηκε [ 3 Η]πρασοζίνη, ειδικής δραστικότητας 77,2 Ci/mmol, της εταιρίας New England Nuclear (Boston, MA). Για τη σήµανση των φωσφολιπιδίων των κυτταρικών µεµβρανών χρησιµοποιήθηκε µυο-[ 3 Η]ινοσιτόλη, ειδικής δραστικότητας 18 Ci/mmol, που αγοράστηκε από την εταιρeία Amersham Pharmacia Biotech (Merck Hellas, Γλυφάδα). 4. ΥΛΙΚΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΚΤΙΚΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Χρησιµοποιήθηκε η ανιοανταλλακτική ρητίνη AG1x 8 formate ( mesh), του οίκου Bio-Rad.

45 39 III. ΜΕΘΟ ΟΙ 1. Εµποτισµός αποµονωµένης καρδιάς αρουραίου Για την εκτέλεση όλων των πειραµάτων εµποτισµού της καρδιάς χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος του Langendorff (1895) µε ορισµένες τροποποιήσεις. Σύµφωνα µε τη µέθοδο, αυτή ο εµποτισµός της καρδιάς γίνεται αντίθετα προς την in vivo ροή του αίµατος. Συγκεκριµένα, το διάλυµα εµποτισµού διοχετεύεται µέσω της αορτής στα αγγεία της στεφανιαίας κυκλοφορίας και έτσι εµποτίζεται ολόκληρος ο καρδιακός µύς. Η συσκευή εµποτισµού αποτελείται από τρία γυάλινα δοχεία Α, Β και Γ, τοποθετηµένα σε ύψος 100 cm από το εµποτιζόµενο όργανο, µε αποτέλεσµα η καρδιά να εµποτίζεται υπό σταθερή πίεση 75 mmhg. Τα δοχεία αυτά έχουν διπλά τοιχώµατα, όπου κυκλοφορεί νερό µε τη βοήθεια ενός κυκλοφορητή, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η επιθυµητή θερµοκρασία (37 ο C). Η καρδιά προφυλάσσεται, επίσης, από ένα παρόµοιο διπλότοιχο δοχείο, για να διατηρείται η θερµοκρασία της σταθερή σε όλη τη διάρκεια του πειράµατος. Το δοχείο Α περιέχει το φυσιολογικό διάλυµα εµποτισµού (διάλυµα KHB), ενώ τα δοχεία Β και Γ περιέχουν τα πειραµατικά διαλύµατα εµποτισµού (όπως για παράδειγµα εκείνα µε οποία χορηγούνται στην καρδιά διάφοροι αδρενεργικοί αγωνιστές και ανταγωνιστές). Το φυσιολογικό διάλυµα εµποτισµού Krebs-Henseleit (KHB) είναι ρυθµιστικό διάλυµα διττανθρακικών που περιέχει: 25 mm NaHCO 3, mm NaCl, 4.7 mm KCl, 1.2 mm MgSO 4, 1.2 mm KH 2 PO 4, 2.5 mm CaCl 2 και 10 mm γλυκόζη, pη 7.4. Από κάθε δοχείο ξεκινά σωλήνας που οδηγεί στη µεταλλική κάνουλα, στην οποία προσαρµόζεται η αορτή της καρδιάς. Η επιλογή του διαλύµατος µε το οποίο εµποτίζεται η καρδιά, όπως και η διακοπή της παροχής διαλύµατος εµποτισµού (ολική ισχαιµία) γίνεται µε τη χρήση βαλβίδων δύο δρόµων. Μία περισταλτική αντλία διατηρεί σταθερή και σε ορισµένο ύψος τη στάθµη του διαλύµατος σε κάθε δοχείο, έτσι ώστε η καρδιά να εµποτίζεται υπό σταθερή πίεση. Η οξυγόνωση των διαλυµάτων εµποτισµού, που υπάρχουν σε κάθε ένα από τα τρία δοχεία (Α, Β, Γ), επιτυγχάνεται µε παροχή µίγµατος αερίων 95% Ο 2-5% CO 2. Το διάλυµα, το οποίο αντλείται από την καρδιά, είτε αποµακρύνεται είτε ανακυκλώνεται µε περισταλτική αντλία.

46 40 Η καρδιά εµποτίζεται για 20 λεπτά µε το φυσιολογικό διάλυµα εµποτισµού KHB, προκειµένου να σταθεροποιηθεί η λειτουργία της και στη συνέχεια εφαρµόζεται η εκάστοτε πειραµατική διαδικασία. Όταν οι διάφοροι αδρενεργικοί αγωνιστές ή ανταγωνιστές, που χορηγούνται στην καρδιά, χρησιµοποιούνται παρουσία διαλυτών ή αντιοξειδωτικών (DMSO, ασκορβικό οξύ αντίστοιχα), τότε εµποτίζονται, επίσης, καρδιές αποκλειστικά µε τις ουσίες αυτές ή τον διαλύτη τους, και χρησιµοποιούνται ως µάρτυρες Προετοιµασία της καρδιάς για τον εµποτισµό Το ζώο αναισθητοποιείται µε ενδοπεριτοναϊκή έγχυση νατριούχου πεντοθάλης (Αbbott Laboratories SpA, Italy), 100 mgr/kgr βάρους σώµατος. Χορηγείται ηπαρίνη (300 iu/kgr) (Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Denmark) µέσω της µηριαίας φλέβας και στη συνέχεια η καρδιά αφαιρείται από το σώµα του ζώου µαζί µε τους γύρω ιστούς. Αµέσως, όλο το παρασκεύασµα τοποθετείται σε διάλυµα εµποτισµού KHB, θερµοκρασίας 0 ο C (κρυοπληγικό διάλυµα), ώστε να σταµατήσει να συσπάται η καρδιά και να περιοριστούν οι συνέπειες της ισχαιµίας. Μετά την αποµάκρυνση των γύρω ιστών, η καρδιά προσαρµόζεται µέσω της αορτής σε ειδικά διαµορφωµένη κάνουλα της συσκευής εµποτισµού, όπου και στερεώνεται µε περίδεση ράµµατος (silk 410). Κατά την ανάρτηση της καρδιάς στη συσκευή αυτή, ρέει από την κάνουλα διάλυµα εµποτισµού, ώστε να αποτρέπεται τυχόν παγίδευση φυσαλίδων αέρα. Με την παροχή διαλύµατος εµποτισµού KHB, η καρδιά συσπάται κανονικά. Ο χρόνος που µεσολαβεί από την αφαίρεση της καρδιάς µέχρι την ανάρτησή της στη συσκευή δεν ξεπερνά τα 1-2 λεπτά Παρακολούθηση και καταγραφή αιµοδυναµικών παραµέτρων της καρδιάς Κατά τον εµποτισµό αποµονωµένης καρδιάς µε τη µέθοδο του Langendorff, ο όγκος του διαλύµατος, που ρέει στα στεφανιαία αγγεία, παροχετεύεται στον στεφανιαίο κόλπο και εξέρχεται από την πνευµονική αρτηρία. Έτσι, κατά τη διάρκεια του εµποτισµού, γίνεται µέτρηση της ροής της στεφανιαίας κυκλοφορίας (ml/λεπτό) µε τη συλλογή του εκρέοντος από την καρδιά διαλύµατος σε ογκοµετρικό σωλήνα. Επίσης, καταγράφονται η τελική διαστολική και συστολική πίεση της αριστερής κοιλίας και η συχνότητα του καρδιακού ρυθµού (HR). Για τη µέτρηση των πιέσεων της αριστερής κοιλίας και της συχνότητας του καρδιακού ρυθµού χρησιµοποιείται

47 41 ένας ειδικός καθετήρας, που στο ένα άκρο του φέρει ένα µικρό µπαλονάκι, το οποίο εισάγεται στην αριστερή κοιλία της καρδιάς. Το άλλο άκρο του καθετήρα συνδέεται σε σειρά µε µεταγωγέα πίεσης, µε οθόνη (monitor) συνεχούς καταγραφής (Albury Instruments, Aviesbury, England), παλµογράφο (HM Ηameg GmbH, Frankfurt, Germany) και ηλεκτρονικό υπολογιστή µε κατάλληλο υπολογιστικό πρόγραµµα. Για την κατασκευή του καθετήρα χρησιµοποιείται σκληρός αγωγός από πολυαιθυλένιο, ώστε να αποφευχθούν τυχόν αλλοιώσεις του κύµατος των πιέσεων στα τοιχώµατα του αγωγού. Το άκρο του καθετήρα, το οποίο φέρει το µπαλονάκι, κλείνεται µε σιλικόνη και στην πλάγια επιφάνειά του δηµιουργείται µια µικρή οπή. Το µπαλονάκι, κατασκευασµένο από ειδικό ελαστικό υλικό (latex), προσαρµόζεται έτσι ώστε να καλύπτει την οπή αυτή υδατοστεγώς. Ο καθετήρας (και το µπαλονάκι) γεµίζει µε νερό, ενώ παράλληλα αφαιρείται κάθε φυσαλίδα αέρα που θα µπορούσε να αλλοιώσει την ακρίβεια των µετρήσεων. Για την είσοδο του καθετήρα στην αριστερή κοιλία, γίνεται µια µικρή τοµή στην οροφή του αριστερού κόλπου της καρδιάς. Από την τοµή αυτή ο καθετήρας εισέρχεται στην αριστερή κοιλία, αφού διαπεράσει τη µιτροειδή βαλβίδα. Τότε, το µπαλονάκι που φέρει στο άκρο του διατείνεται σε όγκο µε νερό, ώστε η διαστολική πίεση αριστερής κοιλίας που αναγράφεται στην οθόνη (monitor) να είναι 6-10 mmhg. Ο όγκος του µπαλονιού, αφού ρυθµιστεί µε νερό, παραµένει αµετάβλητος σε όλη τη διάρκεια του πειράµατος. Από τις τιµές της τελικής διαστολικής και συστολικής πίεσης της αριστερής κοιλίας, υπολογίζεται η διαφορά τους, η οποία ορίζεται ως αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (LVDP). Επίσης, υπολογίζεται το γινόµενο της αναπτυσσόµενης πίεσης επί τον καρδιακό ρυθµό (LVDP HR), το οποίο αποτελεί δείκτη της συσταλτικότητας της καρδιάς. 2. Προσδιορισµός του ποσοστού νέκρωσης του µυοκαρδίου Ο προσδιορισµός της περιοχής του µυοκαρδίου που έχει νεκρωθεί έγινε µε χρώση µε χλωριούχο 2,3,5 τριφενυλτετραζόλιο (T.T.C.). Για την εφαρµογή της τεχνικής αυτής, στο τέλος κάθε πειράµατος εµποτισµού, η καρδιά τοποθετείται στην κατάψυξη, στους 20 ο C. H παγωµένη καρδιά, αφού αφαιρεθούν οι κόλποι και τα µεγάλα αγγεία, τεµαχίζεται, κατά µήκος του µεγάλου άξονά της, σε 6 φέτες πάχους 2mm περίπου. (Το µήκος της καρδιάς των αρουραίων που χρησιµοποιήθηκαν ήταν

48 42 σχεδόν ίδιο, 1.2 cm περίπου, χωρίς τους κόλπους και τα µεγάλα αγγεία.) Οι φέτες από κάθε καρδιά χωριστά, αφού ζυγιστούν, επωάζονται σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (ph 7.4), που περιέχει 1% χλωριούχο 2,3,5 τριφενυλτετραζόλιο (T.T.C.), σε θερµοκρασία 37 ο C, για 20 λεπτά. Με αυτή τη χρώση, ο ζωντανός ιστός βάφεται έντονα κόκκινος, ενώ ο νεκρωµένος παραµένει άβαφος και έτσι, διακρίνεται το νεκρό από το βιώσιµο µυοκάρδιο. Προκειµένου να ενισχυθεί η αντίθεση µεταξύ βαµµένου και άβαφου ιστού, µετά τη χρώση, οι φέτες από κάθε καρδιά βυθίζονται σε 10% διάλυµα φορµόλης. Στη συνέχεια, αυτές οι φέτες τοποθετούνται ανάµεσα σε διαφάνειες και σχεδιάζεται, στο στερεοσκόπιο, πάνω στη διαφάνεια η κάθε φέτα, έτσι ώστε να αποτυπώνεται στη σχεδίαση η βαµµένη και η άβαφη περιοχή. Τα σχέδια µεταφέρονται µεγενθυµένα ( 10) σε χαρτί και µετράται µε πλανίµετρο η ολική επιφάνεια και η επιφάνεια που αντιστοιχεί στο νεκρωµένο ιστό. Το ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου εκφράζεται ως % του ολικού όγκου της καρδιάς. Ο όγκος της καρδιάς υπολογίζεται πολλαπλασιάζοντας την επιφάνεια που µετράται µε το πλανίµετρο µε το πάχος που έχουν οι φέτες της καρδιάς. 3. Παρασκευή κυτταρικών µεµβρανών καρδιάς αρουραίου Η αποµονωµένη καρδιά εµποτίζεται µε διάλυµα KHB για πέντε λεπτά. Έτσι, επιτυγχάνεται η αποµάκρυνση του αίµατος από τα στεφανιαία αγγεία. Στη συνέχεια, αποκόπτονται οι κόλποι της καρδιάς και οι κοιλίες οµογενοποιούνται σε 9πλάσιο όγκο (v/w) διαλύµατος που περιέχει: 50 mm Tris, 100 mm NaCl, 2mM EDTA, ph 7.4 (διάλυµα Α), στους 4 ο C, µε οµογενοποιητή Polytron. Για την αποµόνωση του µεµβρανικού κλάσµατος, το οµογενοποίηµα φυγοκεντρείται στα g, για 20 λεπτά, σε θερµοκρασία 4 ο C. Το ίζηµα που προκύπτει επαναιωρείται σε διαλύµα µε την εξής σύσταση: 50 mm Tris, 1mM EDTA, ph 7.4 (διάλυµα Β). Ακολουθεί επώαση του εναιωρήµατος στους 37 ο C για 10 λεπτά. Η παραπάνω διαδικασία, φυγοκέντρηση-επαναιώρηση, επαναλαµβάνεται 2 ακόµη φορές. Τελικά, το ίζηµα επαναιωρείται στο διάλυµα Β, έτσι ώστε οι κυτταρικές µεµβράνες να βρίσκονται σε συγκέντρωση mg/ml διαλύµατος Β. Τα παρασκευάσµατα των µεµβρανών διατηρούνται στην υπερκατάψυξη (-80 ο C), µέχρι να χρησιµοποιηθούν.

49 43 4. Πειράµατα σύνδεσης µε ραδιενεργά σηµασµένο συνδέτη Ο πληθυσµός των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων σε κλάσµατα κυτταρικών µεµβρανών καρδιάς προσδιορίστηκε µε πειράµατα σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένου ειδικού ανταγωνιστή των υποδοχέων αυτών. Κλάσµατα µεµβρανών, που ισοδυναµούν µε 30 mgr αρχικού υγρού βάρους, εναιωρούνται σε τελικό όγκο 2 ml του διαλύµατος Β (50 mm Tris, 1mM EDTA, ph 7.4) και επωάζονται µε [ 3 Η]πραζοσίνη (ειδικής δραστικότητας 77,2 Ci/mmol) η συγκέντρωση της οποίας κυµαίνεται από 0.05 nm µέχρι 0.7 nm. Η επώαση πραγµατοποιείται στους 37 ο C για 45 λεπτά, απουσία ή παρουσία φαιντολαµίνης 10 µμ. Η συγκεκριµένη ένωση είναι µη ειδικός ανταγωνιστής των α-αδρενεργικών υποδοχέων (Minneman 1988) και χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της µη ειδικής σύνδεσης της [ 3 Η]πραζοσίνης. Μετά το πέρας των 45 λεπτών, η επώαση τερµατίζεται µε ταχεία διήθηση σε κενό του διαλύµατος επώασης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται φίλτρα Whatman τύπου GF/C. Τα φίλτρα πλένονται µε τη διέλευση 15 ml ψυχρού (4 ο C) διαλύµατος Β. Στη συνέχεια, τα φίλτρα εµβαπτίζονται σε 1 ml δις-απιονισµένου νερού και τοποθετούνται σε φιαλίδια υγρού σπινθηρισµού. Σε κάθε φιαλίδιο προστίθενται 10 ml ειδικού διαλύµατος σπινθηρισµού. Η µέτρηση της ραδιενέργειας γίνεται σε µετρητή υγρού σπινθηρισµού LKB-Wallac. Τα δεδοµένα που προκύπτουν, ύστερα από τον προσδιορισµό της ειδικής σύνδεσης, αναλύονται µε τη µέθοδο Scatchard. Η ανίχνευση των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων στα κύτταρα της καρδιάς του αρουραίου έγινε µε πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης στις µεµβράνες της [ 3 Η]πραζοσίνης, παρουσία του ΒΜΥ 7378, ενός ειδικού ανταγωνιστή των υποδοχέων αυτού του υποτύπου (Goetz και συν. 1995, Kenny και συν., 1995). Εναιωρήµατα κυτταρικών µεµβρανών επωάζονται µε ΒΜΥ 7378 σε συγκεντρώσεις που κυµαίνονται από έως 5 x 10 5 Μ, παρουσία 0.2 nm [ 3 Η]πραζοσίνης. Για τον προσδιορισµό της µη ειδικής σύνδεσης χρησιµοποιείται η φαιντολαµίνη σε τελική συγκέντρωση 10 µμ. Οι συνθήκες επώασης και η επακόλουθη διαδικασία είναι παρόµοια µε αυτή που αναφέρθηκε παραπάνω. Από τα αποτελέσµατα των πειραµάτων αυτών, υπολογίζεται η σταθερά αναστολής του ΒΜΥ Ανάλυση δεδοµένων Η προσαρµογή των δεδοµένων σε καµπύλες έγινε µε τη χρήση του ειδικού λογισµικού προγράµµατος Prism της εταιρείας GraphPad Software (San Diego, CA).

50 44 1. Για τον υπολογισµό του µέγιστου αριθµού των ειδικών θέσεων σύνδεσης (Bmax) καθώς και της συγγένειάς τους, εκφραζόµενης ως σταθερά διάστασης K d, για την [ 3 Η]-πραζοσίνη, τα δεδοµένα των αντίστοιχων πειραµάτων προσαρµόστηκαν σε ορθή υπερβολή (καµπύλη κορεσµού). Η καµπύλη αυτή ακολουθεί την εξίσωση Υ= (Bmax x X ) / (K d +X) όπου Χ: η συγκέντρωση σε nm του ραδιενεργά σηµασµένου συνδέτη Υ: η ειδική σύνδεση εκφραζόµενη σε fmol/mg πρωτεΐνης Η επεξεργασία των δεδοµένων αυτών έγινε επίσης και µε τη µέθοδο Scatchard, µε βάση την οποία επιτυγχάνεται η γραµµοποίηση (linearization) της καµπύλης κορεσµού. Η εξίσωση της ευθείας είναι: B/F = (-1/K d )B + (Bmax/K d ) όπου Β: η συγκέντρωση των µορίων του συνδέτη που δεσµεύτηκαν στον υποδοχέα F: η συγκέντρωση των µη δεσµευµένων µορίων Το σηµείο τοµής της ευθείας µε τον οριζόντιο άξονα αντιστοιχεί στην τιµή Bmax, ενώ η κλίση της ευθείας ισούται µε -1/K d. 2. Τα αποτελέσµατα των πειραµάτων ανταγωνιστικής σύνδεσης καθώς και της αναστολής υδρόλυσης των PtdIns, που επάγεται από αδρεναλίνη παρουσία ΒΜΥ 7378, προσαρµόστηκαν σε µονοφασικές ή διφασικές καµπύλες ανταγωνιστικής σύνδεσης. Η µονοφασική καµπύλη ακολουθεί την εξίσωση: y= A + (B-A) / [1+(10 C / 10 x )] όπου y: ραδιενεργές διασπάσεις ανά λεπτό (DPM) που αντιστοιχούν στο δεσµευµένο συνδέτη(για τα πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης) ή στα παραγόµενα [ 3 Η]InsP (για τα πειράµατα αναστολής της υδρόλυσης των PtdIns ). x: ο δεκαδικός λογάριθµος της συγκέντρωσης του συνδέτη Α: η εκτιµώµενη ελάχιστη τιµή του y Β: η εκτιµώµενη µέγιστη τιµή του y C: ο λογάριθµος της συγκέντρωσης του συνδέτη στην οποία παρατηρείται 50% αναστολή της υδρόλυσης (IC 50 ). Η διφασική καµπύλη ακολουθεί την εξίσωση: y= A + [(B-A)/100] x { C / (1+10 D/x ) + [(100 C) / ( E/x )]} όπου D: ο δεκαδικός λογάριθµος της τιµής IC 50 που αντιστοιχεί στις θέσεις χαµηλής συγγένειας Ε: ο δεκαδικός λογάριθµος της τιµής IC 50 που αντιστοιχεί στις θέσεις υψηλής συγγένειας.

51 45 Η προσαρµογή των δεδοµένων στο µοντέλο δύο θέσεων προτιµήθηκε µόνο στις περιπτώσεις στις οποίες ήταν σηµαντικά καλύτερη σε σχέση µε την προσαρµογή στο µοντέλο µίας θέσης. Η σύγκριση της προσαρµογής των δεδοµένων στα δύο µοντέλα έγινε µε τη δοκιµασία F (επίπεδο σηµαντικότητας Ρ<0.05). Οι τιµές IC 50 από τα πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης µετατράπηκαν σε αντίστοιχες τιµές K i µε τη βοήθεια της εξίσωσης Cheng-Prusoff (Cheng και Prusoff 1973) K i = IC 50 / [1 + (x/κ d )] όπου x: η συγκέντρωση του συνδέτη υπό την προϋπόθεση ότι ο συντελεστής Hill δεν απέκλινε σηµαντικά από τη µονάδα. Οι τιµές IC 50 από τα πειράµατα αναστολής της επαγόµενης από αδρεναλίνη υδρόλυσης των PtdIns από το ΒΜΥ 7378 µετατράπηκαν σε αντίστοιχες τιµές K b µε τη βοήθεια της ισοδύναµης εξίσωσης Cheng-Prusoff, που εφαρµόζεται σε πειράµατα λειτουργικής απόκρισης (Lazareno και Birdsall 1993, Leff και Dougall 1993): Κ b =IC 50 / [2+(A f / EC 50 ) b ] 1/b 1 όπου A f : η σταθερή συγκέντρωση του αγωνιστή EC 50 : συγκέντρωση του αγωνιστή στην οποία παρατηρείται το 50% της µέγιστης υδρόλυσης των PtdIns b: συντελεστής της καµπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης Εναλλακτικά, η ανασταλτική ισχύς (potency) του ειδικού ανταγωνιστή των α 1D - αδρενεργικών υποδοχέων, ΒΜΥ 7378, εκφράστηκε και ως τιµή pa 2. Η συγκεκριµένη τιµή προέκυψε από τη γραφική παράσταση του δεκαδικού λογάριθµου της απόκρισης στη δόση µείον τη µονάδα (log [DR-1]) σε σχέση µε το δεκαδικό λογάριθµο της συγκέντρωσης του ανταγωνιστή, γνωστή και ως γράφηµα Schild. Ισχύει η σχέση DR-1= [Β] / K d όπου B: συγκέντρωση ανταγωνιστή Το σηµείο τοµής της ευθείας µε τον άξονα x, όπου αντιστοιχίζονται οι τιµές του δεκαδικού λογάριθµου της συγκέντρωσης ανταγωνιστή, είναι η τιµή pa 2. Η τιµή αυτή ελήφθη υπόψη µόνο στις περιπτώσεις που η κλίση της ευθείας, που αντιστοιχεί στο γράφηµα Schild, δε διέφερε σηµαντικά από τη µονάδα (Arunlakashana και Schild 1959). Οι καµπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης για την παραγωγή [ 3 Η]-InsP που επάγεται από την αδρεναλίνη (concentration-response data) προσαρµόστηκαν µε την ανάλυση της παλινδρόµησης σε λογιστική εξίσωση τεσσάρων παραµέτρων.

52 46 5. Αποµόνωση καρδιακών µυοκυττάρων Τα καρδιακά µυοκύτταρα αποµονώθηκαν από τις κοιλίες της καρδιάς, µετά από εµποτισµό της καρδιάς και πέψη του µυοκαρδίου µε διάλυµα κολλαγενάσης, σύµφωνα µε τους Lazou και συν. (1994). Κατ αρχάς, η καρδιά εµποτίζεται για πέντε λεπτά µε διάλυµα KHB χαµηλής συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+ (10µΜ). Ο εµποτισµός συνεχίζεται µε διάλυµα ΚΗΒ το οποίο περιέχει το πρωτεολυτικό ένζυµο κολλαγενάση (0.5 mgr/ml διαλύµατος εµποτισµού), αλβουµίνη ορού βοδιού (BSA) 2% και Ca 2+ σε τελική συγκέντρωση 100µΜ. Ο εµποτισµός µε το διάλυµα κολλαγενάσης διαρκεί περίπου 45 λεπτά και γίνεται µε ανακύκλωση του διαλύµατος. Στο τέλος του εµποτισµού, αφαιρούνται από την καρδιά οι κόλποι και η αορτή, και ο ιστός, που είναι πλέον πολύ µαλακός, κόβεται σε 3-4 σηµεία για να απλωθεί σε αστεροειδές σχήµα. Στη συνέχεια, για να αποµονωθούν και να συλλεχθούν τα καρδιακά µυοκύτταρα, ο ιστός επωάζεται σε διάλυµα ΚΗΒ που περιέχει κολλαγενάση υπό ταυτόχρονη ανακίνηση στους 37 ο C για λεπτά. Στη διάρκεια της επώασης, το διάλυµα της κολλαγενάσης οξυγονώνεται µε παροχή µίγµατος αερίων 95% Ο 2-5% CO 2. Τα µυοκύτταρα που αποµονώνονται συλλέγονται σε ένα δοκιµαστικό σωλήνα µετά από διήθηση από κατάλληλο πορώδες υλικό. Αφού καθιζάνουν τα κύτταρα, αφαιρείται το υπερκείµενο και ξεπλένονται 2-3 φορές µε διάλυµα ΚΗΒ. Τελικά, τα καρδιακά µυοκύτταρα επαναιωρούνται σε ΚΗΒ στο οποίο προστίθεται σταδιακά επιπλέον Ca 2+ µέχρι τελικής συγκέντρωσης 1mM (το διάλυµα αυτό θα αναφέρεται στη συνέχεια ως διάλυµα επώασης). Περίπου 3x10 6 µυοκύτταρα λαµβάνονται από κάθε καρδιά και χρησιµοποιούνται άµεσα σε πείραµα. Μετά την αποµόνωση και την τελική επαναιώρησή τους, το 70-90% των κυττάρων αυτών έχουν ραβδόµορφο σχήµα και βρίσκονται σε κατάσταση ηρεµίας. 6. Προσδιορισµός της υδρόλυσης των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης ύστερα από αδρενεργική διέγερση Για τον προσδιορισµό της υδρόλυσης των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης, τα καρδιακά µυοκύτταρα επισηµάνθηκαν µε µυο-[ 3 Η]ινοσιτόλη και στη συνέχεια µετρήθηκαν οι φωσφορικές ινοσιτόλες [ 3 Η]InsPs, µετά από αποµόνωση µε ιοντοανταλλακτική χρωµατογραφία. Τα καρδιακά κύτταρα, που αποµονώνονται και προετοιµάζονται µε τη διαδικασία που αναφέρεται παραπάνω, επωάζονται σε διάλυµα ΚΗΒ, που περιέχει 30µCi µυο-

53 47 [ 3 Η]ινοσιτόλη, για 60 λεπτά, σε θερµοκρασία 37 ο C. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, τα µυοκύτταρα ανακινούνται και οξυγονώνονται συνεχώς µε παροχή αερίου µίγµατος 95% Ο 2-5% CO 2. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα συλλέγονται και ξεπλένονται τρεις φορές µε φρέσκο διάλυµα επώασης. Τελικά, επαναιωρούνται σε διάλυµα, στο οποίο προστίθεται 10 mm LiCl. Το LiCl είναι αναστολέας της φωσφατάσης της µονοφωσφορικής ινοσιτόλης, µε αποτέλεσµα να αναστέλλεται ο περαιτέρω µεταβολισµός των φωσφορικών ινοσιτολών. Το αιώρηµα των καρδιοµυοκυττάρων (0.5 ml) µεταφέρεται σε γυάλινους σωλήνες επώασης, τα τοιχώµατα των οποίων έχουν επικαλυφθεί µε σιλικόνη. Τα κύτταρα, αφού διεγερθούν µε την προσθήκη αδρεναλίνης, επωάζονται για 30 λεπτά. Στην περίπτωση που χρησιµοποιούνται ανταγωνιστές, αυτοί προστίθενται πριν από την αδρεναλίνη. Κάθε φορά συµπεριλαµβάνεται ένα δείγµα-µάρτυρας, στο οποίο δεν έχει προστεθεί αδρεναλίνη. Στο τέλος της επώασης, τα δείγµατα φυγοκεντρούνται σε φυγόκεντρο Eppendorf για 1-2 δευτερόλεπτα. Το υπερκείµενο αφαιρείται και προστίθεται 1 ml διαλύµατος 0.8 Μ HClO 4. Τα δείγµατα ανακινούνται έντονα σε συσκευή Vortex και τοποθετούνται στον πάγο για 30 λεπτά. Η πρωτεΐνη που καθιζάνει αποµακρύνεται µε φυγοκέντρηση και τα υπερκείµενα κλάσµατα εξουδετερώνονται µε διάλυµα 0.8 Μ ΚΟΗ/0.2 Μ Tris. Το KClO 4, που καθιζάνει ως αποτέλεσµα της εξουδετέρωσης αποµακρύνεται µε φυγοκέντρηση, ενώ συλλέγονται και διατηρούνται τα υπερκείµενα κλάσµατα ιαχωρισµός ραδιενεργά σηµασµένης φωσφορικής ινοσιτόλης µε ιοντοανταλλακτική χρωµατογραφία Με την ιοντοανταλλακτική χρωµατογραφία, τα µόρια διαχωρίζονται µε βάση το φορτίο τους (Peterson και Sober 1956). Η µέθοδος αυτή χρησιµοποιείται ευρέως και θεωρείται αρκετά ευαίσθητη, διότι µπορεί να διαχωρίσει ακόµη και µόρια µε πολύ µικρές διαφορές στο ηλεκτρικό τους φορτίο (Peterson 1970, Rossomando 1990). Οι ιοντοανταλλάκτες αποτελούνται από ένα υλικό αδιάλυτο στο νερό (συνήθως κυτταρίνη, δεξτράνια, αγαρόζη ή πολυστυρένιο), πάνω στο οποίο έχουν συνδεθεί οµοιοπολικά χαρακτηριστικές δραστικές οµάδες που ιονίζονται, οµάδες δηλαδή που είναι αρνητικά ή θετικά φορτισµένες, σε ένα όσο το δυνατό µεγαλύτερο εύρος ph. Η χρωµατογραφία ανταλλαγής ιόντων βασίζεται κυρίως στις ηλεκτροστατικές δυνάµεις, που αναπτύσσονται µεταξύ αυτών των φορτισµένων οµάδων και των φορτισµένων

54 48 οµάδων των µορίων διαφόρων ουσιών. Στη χρωµατογραφία ανταλλαγής ιόντων, ο διαχωρισµός επιτυγχάνεται µε αντιστρεπτή προσρόφηση και έκλουση. Η ταχύτητα, µε την οποία κινούνται και εκλούονται διάφορα µόρια σε µια ιοντοανταλλακτική στήλη, εξαρτάται κυρίως από το ηλεκτρικό τους φορτίο, καθώς και από την ιονική ισχύ του περιβάλλοντος. Το ph και η ιονική ισχύς της κινητής φάσης επηρεάζουν σε µεγάλο βαθµό αυτές τις αλληλεπιδράσεις. Στην εργασία αυτή εφαρµόστηκε η µέθοδος διαχωρισµού [ 3 Η]-φωσφορικής ινοσιτόλης που περιγράφεται από τους Berridge και συν. (1983). εν έγινε προσπάθεια να διαχωριστούν οι διάφορες φωσφορυλιωµένες µορφές της ινοσιτόλης, αλλά µετρήθηκαν συνολικά. Το εκχύλισµα των µυοκυττάρων, που λαµβάνεται µετά την εξουδετέρωση, «φορτώνεται» σε στήλες ρητίνης διαστάσεων 0.5x2.5 cm, τύπου Bio-Rad AG1x 8 formate, οι οποίες έχουν εξισορροπηθεί µε απιονισµένο νερό. Στη συνέχεια, οι στήλες εκλούονται διαδοχικά µε 2 ml απιονισµένου νερού, 3 ml διαλύµατος που περιέχει 5 mm τετραβορικό δινάτριο και 60 mm µυρµηγκικό νάτριο και τελικά 3 ml διαλύµατος που περιέχει 0.1 Μ µυρµηγκικό οξύ και 1.0 M µυρµηγκικό αµµώνιο, τα οποία και συλλέγονται. Στο διάλυµα, που συλλέγεται µετά την τελευταία έκλουση, προστίθεται σπινθηριστικό υγρό και η ραδιενέργεια µετριέται σε φωτόµετρο υγρού σπινθηρισµού. 7. Ρύθµιση της εξωκυτταρικής και ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+ Για την παρασκευή διαλυµάτων καθορισµένης συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+, χρησιµοποιήθηκε η χηλική ένωση ΒΑΡΤΑ, η οποία έχει µεγάλη επιλεκτικότητα για το ασβέστιο. Συγκεκριµένα, τα ρυθµιστικά διαλύµατα ασβεστίου ετοιµάζονται σε διάλυµα εµποτισµού Krebs-Heinseleit που περιέχει 1 mm ΒΑΡΤΑ. Η ποσότητα του CaCl 2 που απαιτείται να προστεθεί στο διάλυµα, ώστε να προκύψει η κατάλληλη συγκέντρωση ελεύθερων ιόντων Ca 2+, υπολογίστηκε µε βάση τις σταθερές συγγένειας του BAPTA (για τα διάφορα δισθενή ιόντα) που έχουν ήδη δηµοσιευθεί, χρησιµοποιώντας κατάλληλο λογισµικό (EqCal Biosoft, Cambridge, UK). Στα πειράµατα ρύθµισης της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου Ca 2+, τα καρδιακά µυοκύτταρα επωάζονται παρουσία της εστεροποιηµένης µορφής του ΒΑΡΤΑ (ΒΑΡΤΑ-ΑΜ), η οποία µπορεί να διαπερνά την κυτταρική µεµβράνη. Η επώαση γίνεται σε συγκέντρωση 10 µμ ΒΑΡΤΑ-ΑΜ, για 15 λεπτά, στους 37 ο C. Στη

55 49 συνέχεια, τα καρδιοµυοκύτταρα πλένονται τρεις φορές µε διάλυµα επώασης και τελικά επαναιωρούνται σε διάλυµα επώασης, το οποίο περιέχει την κατάλληλη συγκέντρωση ιόντων Ca Επίδραση CEC στα καρδιακά µυοκύτταρα Τα καρδιακά µυοκύτταρα αποµονώνονται από τις κοιλίες, επωάζονται µε µυο- [ 3 Η]ινοσιτόλη, όπως περιγράφηκε παραπάνω, και πλένονται µε διάλυµα επώασης από το οποίο απουσιάζει η BSA, και περιέχει 1 mm Ca 2+. Ακολουθεί η επώαση τους µε 100 µμ CEC, για 15 λεπτά, στους 37 ο C. Στη συνέχεια, αποµακρύνεται το CEC µε διαδοχικές πλύσεις και τελικά τα καρδιοµυοκύτταρα επαναιωρούνται σε διάλυµα επώασης, το οποίο περιέχει 2% BSA και 1 mm Ca 2+. Τα µυοκύτταρα, που χρησιµοποιούνται ως µάρτυρες, υποβάλλονται στην ίδια διαδικασία χωρίς την προσθήκη του CEC. 9. Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεΐνης µε τη χρωµατοµετρική µέθοδο Bradford Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 (Biorad Protein Assay) να συνδέεται µε πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον, µεταβάλλοντας το χρώµα της. Η ελεύθερη χρωστική έχει µέγιστο απορρόφησης στα 465 nm, ενώ το σύµπλοκο πρωτεΐνης-χρωστικής έχει µέγιστο απορρόφησης στα 595 nm. Για τον υπολογισµό της περιεκτικότητας των δειγµάτων σε πρωτεΐνη, κατασκευάζεται πρότυπη καµπύλη αναφοράς, µε διαλύµατα που αντιστοιχούν σε αυξανόµενες ποσότητες αλβουµίνης ορού βοδιού (1-15 µg πρωτεΐνης). Τα πρωτεϊνικά δείγµατα αραιώνονται µε απιονισµένο νερό, έτσι ώστε οι τιµές της πρωτεΐνης να βρίσκονται µέσα στα όρια της πρότυπης καµπύλης. Σε κάθε περίπτωση, 2 µl αραιωµένου πρωτεϊνικού δείγµατος αναµιγνύονται µε 1ml του αντιδραστηρίου της χρωστικής (Biorad Protein assay), το οποίο προηγουµένως έχει αραιωθεί 5 φορές µε απιονισµένο νερό. Όλα τα δείγµατα αναδεύονται σε Vortex και µετά από 5 περίπου λεπτά µετριέται η απορρόφηση στα 595 nm. Ως τυφλό, κατά τη φωτοµέτρηση, χρησιµοποιείται 1ml του αραιωµένου διαλύµατος χρωστικής.

56 Πειραµατική διαδικασία για τη µελέτη της επίδρασης της διέγερσης των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στη λειτουργική ανάκτηση της καρδιάς και το ποσοστό του νεκρωµένου µυοκαρδίου µετά την ισχαιµία Πριν από κάθε πείραµα, η καρδιά εµποτίζεται για είκοσι λεπτά µε το διάλυµα KHB για να σταθεροποιηθεί η λειτουργία της και στο τέλος αυτής της περιόδου, καταγράφονται οι τιµές των διαφόρων αιµοδυναµικών παραµέτρων της καρδιάς. Η συγκέντρωση της φαινυλεφρίνης που χρησιµοποιήθηκε για τη διέγερση των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων επιλέχτηκε, αφού προηγουµένως δοκιµάστηκαν διάφορες συγκεντρώσεις φαινυλεφρίνης σε προκαταρκτικά πειράµατα εµποτισµού. Τα πειράµατα αυτά πραγµατοποιήθηκαν τόσο παρουσία, όσο και απουσία του β- αδρενεργικού αναστολέα, προπρανολόλη. Οι καρδιές κατανεµήθηκαν τυχαία στις εξής 14 οµάδες: i) ΝΡ-µάρτυρες, καρδιές που υποβάλλονται σε 45 λεπτά ισχαιµίας και 60 λεπτά επανεµποτισµού ii) ΙΡ, καρδιές που υποβάλλονται σε έναν κύκλο 5λεπτης ισχαιµίας και 10λεπτου επανεµποτισµού, πριν από την 45λεπτη ισχαιµία iii) ΡΕ, καρδιές στις οποίες χορηγείται ο α 1 -αδρενεργικός αγωνιστής φαινυλεφρίνη (ΡΕ) για 5 λεπτά και ακολουθεί 10λεπτος επανεµποτισµός µε διάλυµα ΚΗΒ, πριν από την 45λεπτη ισχαιµία iv) PRA, καρδιές στις οποίες χορηγείται ο ειδικός ανταγωνιστής των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων πραζοσίνη (PRA) για 10 λεπτά, και ακολουθεί 5λεπτος επανεµποτισµός µε διάλυµα ΚΗΒ πριν από την 45λεπτη ισχαιµία v) MU, καρδιές που υποβάλλονται στο ίδια διαδικασία εµποτισµού µε την οµάδα (iv), µε τη διαφορά ότι αντί για πραζοσίνη χορηγείται 5 -µεθυλουραπιδίλη (MU) vi) CEC, καρδιές που υποβάλλονται στο ίδια διαδικασία εµποτισµού µε τις δύο προηγούµενες οµάδες, µε τη διαφορά ότι στις καρδιές της οµάδας αυτής χορηγείται CEC vii) ΡΕ+PRA, καρδιές στις οποίες χορηγείται φαινυλεφρίνη, όπως στην οµάδα iii, και επίσης πραζοσίνη. Η πραζοσίνη χορηγείται για διάστηµα 10 λεπτών πριν από τη χορήγηση φαινυλεφρίνης, µαζί µε τη φαινυλεφρίνη, και επίσης κατά τη

57 51 διάρκεια των πρώτων 5 λεπτών του 10λεπτου επανεµποτισµού µε ΚΗΒ πριν από την 45λεπτη ισχαιµία viii) ΡΕ+MU, καρδιές στις οποίες χορηγείται φαινυλεφρίνη, όπως στην οµάδα iii, και επίσης 5 -µεθυλουραπιδίλη (MU) για διάστηµα 10 λεπτών πριν από τη χορήγηση φαινυλεφρίνης, µαζί µε τη φαινυλεφρίνη, και επίσης κατά τη διάρκεια των πρώτων 5 λεπτών του 10λεπτου επανεµποτισµού µε ΚΗΒ, στο οποίο δεν περιέχεται η φαινυλεφρίνη ix) PE+CEC, καρδιές στις οποίες χορηγείται φαινυλεφρίνη, όπως στην οµάδα iii, και επίσης CEC για διάστηµα 10 λεπτών πριν από τον 5λεπτο εµποτισµό µε φαινυλεφρίνη x) ΜΕΤH 0.1, καρδιές στις οποίες χορηγείται µέσω του διαλύµατος εµποτισµού ΚΗΒ, 0.1 µmol/l µεθοξαµίνης (ΜΕΤH) για πέντε λεπτά, και ακολουθεί 10λεπτος επανεµποτισµός, µε διάλυµα ΚΗΒ στο οποίο δεν περιέχεται η µεθοξαµίνη, πριν από την 45λεπτη ισχαιµία και τον 60λεπτο επανεµποτισµό xi) ΜΕΤH 0.5, καρδιές στις οποίες χορηγείται µεθοξαµίνη 0.5 µmol/l, όπως και στην οµάδα x xii) ΜΕΤH 1, καρδιές στις οποίες χορηγείται 1 µmol/l µεθοξαµίνης, όπως και στην οµάδα x xiii) ΜΕΤH 1+ΜU, καρδιές στις οποίες χορηγείται 1 µmol/l µεθοξαµίνης, όπως στην οµάδα xii, και επίσης 5 -µεθυλουραπιδίλη (MU), όπως και στην οµάδα viii xiv) ΜΕΤH 1+CEC, καρδιές στις οποίες χορηγείται 1 µmol/l µεθοξαµίνης, όπως στην οµάδα xii, και επίσης CEC, όπως στην οµάδα ix Η εικόνα 1. δείχνει σχηµατικά τους διάφορους εµποτισµούς που εφαρµόστηκαν.

58 52 NP IΣΧΑΙΜΙΑ ΕΠΑΝΕΜΠΟΤΙΣΜΟΣ PRA, MU ή CEC PRAή MU ή CEC IΣΧΑΙΜΙΑ ΕΠΑΝΕΜΠΟΤΙΣΜΟΣ PE ή MET PE ή ΜΕΤ IΣΧΑΙΜΙΑ ΕΠΑΝΕΜΠΟΤΙΣΜΟΣ PE ή MET PRA, MU PRA+MU PRA + PRA+ MU + MU PE ή ΜΕΤ IΣΧΑΙΜΙΑ ΕΠΑΝΕΜΠΟΤΙΣΜΟΣ PE ή MET CEC CEC PEή ΜΕΤ IΣΧΑΙΜΙΑ ΕΠΑΝΕΜΠΟΤΙΣΜΟΣ 20 min min 60 min Εικόνα 1. Σχηµατική αναπαράσταση των εµποτισµών που ακολουθήθηκαν στις διάφορες πειραµατικές οµάδες της µελέτης. Η κλίµακα στο κάτω µέρος της εικόνας προσδιορίζει τη χρονική διάρκεια των επιµέρους φάσεων των εµποτισµών. Τα ανοιχτά πλαίσια αντιστοιχούν σε φάσεις όπου πραγµατοποιείται εµποτισµός µε φυσιολογικό διάλυµα ΚΗΒ. ΡΕ, φαινυλεφρίνη, ΜΕΤ, µεθοξαµίνη, PRA, πραζοσίνη, MU, 5 -µεθυλουραπιδίλη, CEC, χλωροαιθυλκλονιδίνη.

59 Στατιστική επεξεργασία Οι τιµές εκφράζονται ως µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα. Η σύγκριση της προσαρµογής σε µονοφασικές ή διφασικές καµπύλες έγινε σύµφωνα µε το F τεστ. Για τη σύγκριση της µέσης τιµής διαφορετικών οµάδων, έγινε στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων µε τη χρήση του στατιστικού προγράµµατος Instat (Graphpad software, San Diego, CA). Συγκεκριµένα, εφαρµόστηκε η ανάλυση διασποράς (ANOVA one way), συνοδευόµενη από το Dunnet test. Στις περιπτώσεις που η σύγκριση αφορούσε δύο οµάδες µόνο, έγινε το Student s t-test. Σε κάθε περίπτωση, στατιστικά σηµαντικές θεωρήθηκαν οι διαφορές για τις οποίες ήταν P<0.05.

60 54 ΙV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Μελέτη των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων Παρά το γεγονός ότι µε πειράµατα µοριακής κλωνοποίησης έχουν αναγνωριστεί τρεις υποτύποι α 1 αδρενεργικών υποδοχέων, α 1Α -, α 1Β - και α 1D -, η παρουσία των α 1D - στην καρδιά των θηλαστικών και ο λειτουργικός τους ρόλος έχει αµφισβητηθεί. Έτσι, έγινε προσπάθεια να προσδιοριστούν οι α 1D -αδρενεργικοί υποδοχείς στην καρδιά του αρουραίου, µε πειράµατα σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένου συνδέτη. Επίσης, διερευνήθηκε κατά πόσο οι υποδοχείς αυτοί επάγουν την παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης, η οποία είναι ο δεύτερος µηνύτορας µετά τη διέγερση των α 1Α - και α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων Προσδιορισµός των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά ενήλικου αρουραίου Για να προσδιοριστεί η ύπαρξη του α 1D - υποτύπου των αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου, έγιναν πειράµατα σύνδεσης ραδιενεργά σηµασµένου συνδέτη σε µεµβράνες µυοκυττάρων της καρδιάς. Ως συνδέτης χρησιµοποιήθηκε η [ 3 Η]πραζοσίνη η οποία είναι ειδικός ανταγωνιστής των α 1 αδρενεργικών υποδοχέων. Κατ αρχάς, προσδιορίστηκε η συγγένεια (σταθερά σύνδεσης, K d ) και η µέγιστη ικανότητα σύνδεσης (ο µέγιστος αριθµός ειδικών θέσεων, Bmax) της πραζοσίνης στις µεµβράνες των καρδιακών µυοκυττάρων, κάτω από τις πειραµατικές συνθήκες της εργασίας αυτής. Σε προκαταρκτικά πειράµατα επιβεβαιώθηκε ότι η σύνδεση της πραζοσίνης στις µεµβράνες ήταν αντιστρεπτή και παρουσίαζε κινητική κορεσµού. Η ειδική σύνδεση εξαρτώταν γραµµικά από τη συγκέντρωση των µεµβρανών. Ο αριθµός των α 1 -αδρενεργικών θέσεων σύνδεσης και η συγγένεια προσδιορίστηκαν µετά από επώαση των µεµβρανών µε [ 3 Η]πραζοσίνη, που κυµαινόταν από 0.05 nm έως 0.7 nm (Εικόνα 1.1.Α). Τα γραφήµατα Scatchard ήταν γραµµικά, γεγονός που υποδεικνύει την ύπαρξη οµογενούς πληθυσµού θέσεων σύνδεσης (Εικόνα 1.1.Β). Μετά την ανάλυση των δεδοµένων, η τιµή της σταθεράς σύνδεσης K d που προέκυψε ήταν 0.194±0.062 nm (pk d : 9.71±0.095) και ο αριθµός των θέσεων σύνδεσης Βmax 23±11.2 fmol/mg πρωτεΐνης (Πίνακας 1.1). Η τιµή της K d κυµαίνεται στα επίπεδα τιµών που είναι

61 55 A 35 εσµευµένες θέσεις ( fmol / mg πρωτ. ) [ 3 Η]-Πραζοσίνη, [nm] B εσµευµένες / Ελεύθερες Θέσεις Ειδικής έσµευσης ( fmol / mg πρωτ. x nm ) εσµευµένες Θέσεις Ειδικής έσµευσης (fmol / mg πρωτ.)

62 56. γνωστά στη βιβλιογραφία για τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς στην καρδιά διαφόρων ειδών θηλαστικών. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η ύπαρξη του α 1D -υποτύπου των αδρενεργικών υποδοχέων στα καρδιακά µυοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό, έγιναν πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης µε [ 3 Η]πραζοσίνη, χρησιµοποιώντας τον ειδικό ανταγωνιστή BMY Ο ΒΜΥ 7378 είναι 100 φορές πιο επιλεκτικός για τους α 1D - σε σχέση µε τους α 1Α - και α 1Β - αδρενεργικούς υποδοχείς (Goetz και συν. 1995, Kenny και συν. 1995). Για το σκοπό αυτό, µεµβράνες καρδιακών µυοκυττάρων επωάστηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του BMY 7378 από 0.01 nm µέχρι 50 µμ, παρουσία 0.2 nm [ 3 Η]πραζοσίνης. Μετά από µη γραµµική ανάλυση παλινδρόµησης των δεδοµένων της αναστολής της σύνδεσης της [ 3 Η]πραζοσίνης στις διαφορετικές συγκεντρώσεις BMY 7378, προέκυψε η καµπύλη ανταγωνισµού που φαίνεται στην εικόνα 1.2. ιαπιστώθηκε σηµαντικά καλύτερη προσαρµογή των δεδοµένων στο πρότυπο δύο ειδικών θέσεων σύνδεσης του BMY 7378, µε διαφορετική τιµή συγγένειας, από ό,τι στο πρότυπο µιας θέσης σύνδεσης (P<0.001). Η σταθερά για τη θέση σύνδεσης υψηλής συγγένειας βρέθηκε ίση µε 0.64 nm (pk i : 9.19±0.26) και για τη θέση σύνδεσης χαµηλής συγγένειας 0.22 µμ (pk i : 6.64±0.09). Το ποσοστό των θέσεων υψηλής συγγένειας ήταν 28±2% του συνολικού αριθµού α 1 -αδρενεργικών θέσεων σύνδεσης (Πίνακας 1.1.). Από τη σύγκριση των τιµών της σταθεράς συγγένειας µε αντίστοιχες που υπάρχουν για κλωνοποιηµένους υποτύπους των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, φαίνεται ότι οι θέσεις σύνδεσης υψηλής συγγένειας που προέκυψαν για το BMY 7378 αντιστοιχούν στην παρουσία του α 1D -υποτύπου, ενώ οι θέσεις σύνδεσης χαµηλής συγγένειας στην παρουσία των α 1A - και α 1B - αδρενεργικών υποδοχέων. Εικόνα 1.1. Α. Καµπύλη κορεσµού της σύνδεσης της [ 3 Η]πραζοσίνης σε µεµβράνες καρδιάς αρουραίου. Οι µεµβράνες επωάστηκαν στους 30 ο C για 30 min µε αυξανόµενες συγκεντρώσεις [ 3 Η]πραζοσίνης. Η ολική (ανοικτά τετράγωνα) και η µη ειδική (ανοικτοί κύκλοι) σύνδεση προσδιορίστηκαν απουσία και παρουσία 10µΜ φαιντολαµίνης, αντίστοιχα. Η ειδική σύνδεση (κλειστά τετράγωνα) υπολογίστηκε αφαιρώντας την µη ειδική σύνδεση από την ολική. Β. Γράφηµα Scatchard των δεδοµένων που προέκυψαν από πειράµατα σύνδεσης [ 3 Η]πραζοσίνης. Στον οριζόντιο άξονα τοποθετείται η συγκέντρωση (σε fmol / mg πρωτεΐνης) της δεσµευµένης πραζοσίνης (Β) που υπολογίζεται και στον κάθετο άξονα οι αντίστοιχες τιµές του λόγου της δεσµευµένης προς την µη δεσµευµένη πραζοσίνη (B / F) (fmol / mg πρωτεΐνης x nm). Figure 1.1. Α. Saturation curves of [ 3 Η]prazosin binding to membrane preparations from rat heart. Membranes were incubated at 30 o C for 30 min with increasing concentrations of [ 3 Η]prazosin. Total (open squares) and non-specific (open circles) binding were determioned in the absence and presence of 10 µm fentolamine. Specific binding (closed squares) was calculated by subtracting nonspecific from total binding. B. Scatchard plot from experiments of [ 3 Η]prazosin binding. Abscissa: Concentration in fmol / mg protein of bound prazosin Ordinate: Ratio of bound to free [ 3 Η]prazosin (B / F) in fmol / mg protein x nm.

63 57 ΠΙΝΑΚΑΣ 1.1. Ανταγωνισµός για τη σύνδεση της [ 3 Η]πραζοσίνης σε παρασκευάσµατα µεµβρανών καρδιάς αρουραίου. Competition between [ 3 Η]prazosin and BMY 7378 for binding to membrane preparations of adult rat hearts. Mία θέση σύνδεσης ύο θέσεις σύνδεσης Αναστολέας pk i pk ih pk il % R H Πραζοσίνη 9.71± ΒΜΥ ± ± ±2 Οι καµπύλες ανταγωνισµού έγιναν σε παρασκευάσµατα µεµβρανών όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδοµένα προσαρµόστηκαν σε µονοφασικές (µία θέση σύνδεσης) ή διφασικές (δύο θέσεις σύνδεσης) καµπύλες. Οι τιµές είναι ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα από 6 διαφορετικά πειράµατα. pk i είναι ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της σταθεράς αναστολής (Κ i ). K ih και K il είναι οι σταθερές ψηλής και χαµηλής συγγένειας αντίστοιχα. R H είναι οι θέσεις σύνδεσης ψηλής συγγένειας. Competition curves were made from membrane preparations as described in Methods. Data were fitted in one-site or two-site competition curves. Values represent the mean ± SEM from 6 separate experiments. pk i represents the negative logarithm of inhibition constant (Κ i ). K ih ard K il correspond to high and low affinity respectively. R H represents high affinity binding sites.

64 % έσµευση [ 3 H]πραζοσίνης [BMY], log M Εικόνα 1.2. Καµπύλη συναγωνιστικής σύνδεσης µεταξύ [ 3 Η]πραζοσίνης και του ειδικού αναστολέα των α 1D - υποδοχέων ΒΜΥ 7378 σε µεµβράνες µυοκυττάρων καρδιάς ενήλικου αρουραίου. Μεµβρανικά κλάσµατα µυοκυττάρων προετοιµάστηκαν κατάλληλα και επωάστηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις ΒΜΥ 7378 µε την ταυτόχρονη παρουσία [ 3 Η]πραζοσίνης 0.2 nm. Η σύνδεση της [ 3 Η]πραζοσίνης για κάθε µία συγκέντρωση του αναστολέα εκφράζεται ως % της σύνδεσης που παρατηρείται απουσία του αναστολέα αφαιρούµενης της τιµής που αντιστοιχεί στη µη ειδική σύνδεση. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± SEM από 6 µεµβρανικά παρασκευάσµατα στα οποία έγιναν διπλά πειράµατα.. Τα δεδοµένα προσαρµόζονται σηµαντικά καλύτερα σε καµπύλη δύο θέσεων σύνδεσης (διφασική καµπύλη, Ρ<0.001 σε σύγκριση µε την προσαρµογή σε µονοφασική καµπύλη). Στα σηµεία που φαίνονται ως µονές µετρήσεις, οι µπάρες σφάλµατος καλύπτονται από το αντίστοιχο σύµβολο. Figure 1.2. Competition between [ 3 H]prazosin and BMY 7378 for binding to membrane preparations of adult rat heart. Membrane fractions of heart were prepared and incubated with various concentrations of BMY 7378 in the presence of 0.2 nm [ 3 H]prazosin. [ 3 H]prazosin binding is expressed as a percentage of binding in the absence of BMY 7378 following subtraction of blanks. Data are the mean ± SEM of six separate preparations, where assays were performed in duplicate. A two-site curve fit (r 2 =0.995) was significantly better than onesite curve (P<0.001). Where no error bars are shown, their size is smaller than the size of the symbol

65 Επίδραση του BMY 7378 στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή φωσφορικής ινοσιτόλης (InsP) Τα προηγούµενα αποτελέσµατα υποδεικνύουν την παρουσία α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων στα καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Είναι γνωστό ότι τόσο ο α 1Α -, όσο και ο α 1Β - υποτύπος των αδρενεργικών υποδοχέων διεγείρουν την υδρόλυση των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης (PtdIns) και την παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης [Ins(1,4,5)P 3 ], µέσω της ενεργοποίησης της φωσφολιπάσης C. Ετσι, θεωρήθηκε σκόπιµο να διαπιστωθεί αν η ενεργοποίηση των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων οδηγεί και αυτή στο ίδιο αποτέλεσµα. Για το σκοπό αυτό, διερευνήθηκε η ικανότητα του ΒΜΥ 7378, ο οποίος όπως αναφέρθηκε παραπάνω είναι ένας ειδικός ανταγωνιστής των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων, να αναστέλλει την υδρόλυση των PdtIns, που επάγεται από τη διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων σε αποµονωµένα µυοκύτταρα καρδιάς. Η υδρόλυση των PtdIns προσδιορίστηκε από τη µέτρηση της [ 3 Η]φωσφορικής ινοσιτόλης, που προκύπτει µετά από σήµανση των κυττάρων µε µυο-[ 3 Η]ινοσιτόλη και α 1 -αδρενεργική διέγερση. Ως α 1 -αδρενεργικός αγωνιστής επιλέχτηκε η αδρεναλίνη, επειδή προκαλεί τη µέγιστη σχετική διέγερση για υδρόλυση των PdtIns σε σύγκριση µε τη νοραδρεναλίνη και τη φαινυλεφρίνη σχεδόν επταπλάσια σε σχέση µε τον µάρτυρα (Lazou και συν. 1994). Επειδή η παραγόµενη τριφωσφορική ινοσιτόλη µεταβολίζεται αµέσως σε δι- και µονοφωσφορική ινοσιτόλη, µετρήθηκαν συνολικά και ελήφθησαν υπόψη και τα τρία είδη φωσφορικής ινοσιτόλης που παράγονται από την υδρόλυση των PdtIns. Αποµονωµένα καρδιακά µυοκύτταρα επωάστηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις BMY 7378 (από 1 pm µέχρι 1 mm) παρουσία 1µΜ αδρεναλίνης και µετρήθηκαν οι παραγόµενες φωσφορικές ινοσιτόλες (InsP). Η µη γραµµική ανάλυση παλινδρόµησης της αναστολής του σχηµατισµού InsP από το BMY 7378, έδειξε σηµαντικά καλύτερη προσαρµογή στο πρότυπο ενός µόνο τύπου υποδοχέων (Eικόνα 1.3.). Η σταθερά συγγένειας για τον α 1D -ανταγωνιστή BMY 7378 βρέθηκε ίση µε 0.12 µμ (pk b : 6.92 ± 0.28). Η τιµή αυτή ήταν παρόµοια µε αυτήν που παρατηρήθηκε για τις θέσεις χαµηλής συγγένειας στα πειράµατα σύνδεσης µε ραδιενεργά επισηµασµένο συνδέτη (Πίνακας 1.1.). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι οι α 1D -αδρενεργικοί υποδοχείς των καρδιακών µυοκυττάρων ενήλικου αρουραίου δε συνδέονται µε τη φωσφολιπάση C και δεν επάγουν την παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης.

66 % [3H] InsP [BMY], log M Εικόνα 1.3. Ανασταλτική επίδραση του ειδικού αναστολέα των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων ΒΜΥ 7378 στην παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης ([ 3 Η]InsP) που επάγεται ύστερα από διέγερση των καρδιακών µυοκυττάρων αρουραίου µε αδρεναλίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις BMY 7378 παρουσία αδρεναλίνης 1µΜ για 30 λεπτά. Η παραγωγή [ 3 Η]InsP, που παρατηρείται σε κάθε µία συγκέντρωση ΒΜΥ 7378 εκφράζεται ως % της παραγωγής, που προκαλείται από τη διέγερση µε αδρεναλίνη απουσία ΒΜΥ Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6 διαφορετικά πειράµατα. Στα σηµεία που φαίνονται ως µονές µετρήσεις, οι µπάρες σφάλµατος καλύπτονται από το αντίστοιχο σύµβολο. Η προσαρµογή των δεδοµένων σε καµπύλη δύο θέσεων (διφασική καµπύλη) δεν ήταν σηµαντικά καλύτερη από την προσαρµογή σε καµπύλη µίας θέσης (µονοφασική καµπύλη). Figure 1.3. Inhibition by BMY 7378 of the adrenaline-stimulated inositol phosphate formation [ 3 Η]InsP in adult rat cardiac myocytes. Cells were incubated with various concentrations of BMY 7378 in the presence of 1µΜ adrenaline for 30 min. The rates of [ 3 H]InsP formation are expressed as a percentage of the rate of [ 3 H]InsP formation in the presence of adrenaline and in the absence of BMY Data are the mean ± SEM of six separate experiments. Where no error bars are shown, their size is smaller than the size of the symbol. A two-site curve fit was not significantly better than one-site curve.

67 61 Ανάλογα πειράµατα έγιναν παρουσία του ανταγωνιστή των β-αδρενεργικών υποδοχέων προπρανολόλη, µε παρόµοια αποτελέσµατα (pk b : 7.02±0.12). Επιπλέον, η ανασταλτική δράση του BMY 7378 ήταν ουσιαστικά στα ίδια επίπεδα (pk b : 6.60±0.19), παρουσία του α 1Α -ανταγωνιστή 5 -µεθυλουραπιδίλη. Σε µια δεύτερη σειρά πειραµάτων, κατασκευάστηκαν καµπύλες συγκέντρωσηςαπόκρισης µε αυξανόµενες συγκεντρώσεις αδρεναλίνης και διερευνήθηκε η ανασταλτική επίδραση του BMY 7378 στην απόκριση των καρδιακών µυοκυττάρων, η οποία µετράται ως παραγωγή [ 3 H]InsP. οκιµάστηκαν οι ακόλουθες συγκεντρώσεις BMY 7378: 100 nm, 1 µm, και 10µΜ. Πειράµατα που έγιναν απουσία BMY 7378 χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρας. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται συγκριτικά στην εικόνα 1.4.Α. Οι καµπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης που προέκυψαν αντίστοιχα για κάθε µία από τις συγκεντρώσεις του BMY 7378, όπως και για το µάρτυρα, προσαρµόζονται στο µονοφασικό πρότυπο. Στον Πίνακα 1.2. παρουσιάζονται οι τιµές της µέγιστης απόκρισης των κυττάρων (ως % υδρόλυση των PtdIns), καθώς επίσης και οι αντίστοιχες τιµές του αρνητικού δεκαδικού λογάριθµου της συγκέντρωσης αδρεναλίνης, στην οποία παρατηρείται το 50% της µέγιστης απόκρισης των καρδιακών µυοκυττάρων (pec 50 ). Το BMY 7378 ελαττώνει σηµαντικά (Ρ<0.001) την τιµή pec 50 για την αδρεναλίνη στις συγκεντρώσεις 1 µm και 10µΜ (5.85±0.08 και 5.07±0.05, αντίστοιχα, έναντι 6.14±0.13 στους µάρτυρες). Αντίθετα, το BMY 7378 στη µικρότερη συγκέντρωση που δοκιµάστηκε, 100 nm (συγκέντρωση η οποία κυµαίνεται στα επίπεδα της K d που προσδιορίστηκε στα πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης µε [ 3 Η]πραζοσίνη) δε µετέβαλε σηµαντικά την pec 50 της αδρεναλίνης (5.96±0.12). Η µέγιστη απόκριση των µυοκυττάρων στην αδρεναλίνη µειώθηκε επίσης, σηµαντικά, παρουσία 1 µm και 10µΜ BMY 7378, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Στις συγκεντρώσεις αυτές, παρατηρήθηκε αναστολή της µέγιστης παραγωγής [ 3 H]InsP κατά 22% και 30% αντίστοιχα (η αναστολή εκφράζεται ως εκατοστιαία αναλογία της παραγωγής [ 3 H]InsP που παρατηρήθηκε στους µάρτυρες). Από τα αποτελέσµατα αυτά προκύπτει ότι το BMY 7378 αναστέλλει την απόκριση των καρδιοµυοκυττάρων στην αδρεναλίνη, σε συγκεντρώσεις όµως σχετικά µεγαλύτερες από την K d που έχει προσδιοριστεί για τους α 1D -αδρενεργικούς υποδοχείς. Αυτό φαίνεται άλλωστε και από την ανάλυση των δεδοµένων σύµφωνα µε τη µέθοδο Schild. Στην εικόνα 1.4.Β. παρουσιάζεται το

68 62 A [ 3 H] InsP (DPM) [Adrenaline], log M B 1.0 log (DR-1) [BMY], log M

69 63 ΠΙΝΑΚΑΣ 1.2. Απόκριση στην αδρεναλίνη, µε βάση την παραγωγή της τριφωσφορικής ινοσιτόλης, σε διάφορες συγκεντρώσεις του αναστολέα BMY 7378, στα καρδιακά µυοκύτταρα αρουραίου. Adrenaline response, as determined from [ 3 H]InsP formation, in the presence of various concentrations of the α 1D - specific antagonist BMY 7378, in adult rat cardiac myocytes. ΒΜΥ 7378 pec 50, log M Μέγιστη απόκριση % βασικού ρυθµού - 6,17±0, nM 6,05±0, µΜ 5,82±0, µΜ 5,07±0, Οι τιµές είναι ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα από 3 διαφορετικά πειράµατα. EC 50 είναι η συγκέντρωση της αδρεναλίνης όπου παρατηρείται απόκριση 50% της µέγιστης. Values are expressed as mean ± SEM from 3 separate experiments. EC 50 is the half maximal effective concentartion. γράφηµα Schild της ανταγωνιστικής δράσης του BMY 7378 ενάντια στην επίδραση της αδρεναλίνης. Η κλίση της ευθείας αυτής ήταν 0.85±0.11, όταν αναλύθηκε στο διάστηµα από 100 nm έως 1 µm BMY 7378, και δεν ήταν σηµαντικά διαφορετική από τη µονάδα. Η τιµή pα 2 που βρέθηκε ίση µε 6.31±0.28, ήταν πολύ κοντά στην τιµή της pk b που προέκυψε από την καµπύλη αναστολής (Εικόνα 1.3). Και οι δύo Εικόνα 1.4. Α. Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του ΒΜΥ 7378 στην καµπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης για την παραγωγή [ 3 Η]InsP που επάγεται από την αδρεναλίνη στα καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 4 διαφορετικά πειράµατα. Στα σηµεία που φαίνονται ως µονές µετρήσεις οι µπάρες σφάλµατος καλύπτονται από το αντίστοιχο σύµβολο. Επεξήγηση συµβόλων: ( ) απουσία ΒΜΥ 7378 (µάρτυρες), ( ) παρουσία 100 nm, ( ) 1µΜ, και ( ) 10 µμ ΒΜΥ Β. Σχήµα Schild του ανταγωνιστικού αποτελέσµατος του ΒΜΥ 7378 έναντι της επίδρασης που ασκεί η αδρεναλίνη στα καρδιακά µυοκύτταρα. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τον µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα και προέρχονται από τα δεδοµένα που παρουσιάζονται στο (Α). Η ευθεία παλινδρόµησης υπολογίστηκε µε βάση τη µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Figure 1.4. A. Effects of BMY 7378 on the concentration-response curves for the adrenaline- induced PI hydrolysis in adult rat cardiac myocytes. Control ( ) and in the presence of 100 nm ( ), 1µΜ ( ) and 10µΜ ( ) BMY Values are means ± SEM from 4 different experiments. Where no error bars are shown, their size is smaller than the size of the symbol. B. Schild plot of BMY 7378-induced antagonism against the effect of adrenaline. Values presented are means ± SEM. The data used were taken from (A) and the slope of the regression line was calculated by the leastsquare method.

70 64 αυτές τιµές είχαν µικρή συσχέτιση µε τις pk i τιµές σύνδεσης του BMY 7378 για κλωνοποιηµένους α 1D -αδρενεργικούς υποδοχείς. Η ικανότητα του BMY 7378 για αναστολή της επαγόµενης από την αδρεναλίνη παραγωγής [ 3 H]InsP στα καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου, έδειξε υψηλή συσχέτιση µε τις pk i τιµές σύνδεσης για κλωνοποιηµένους α 1Α - και α 1Β - αδρενεργικούς υποδοχείς. 2. Συµµετοχή των ιόντων Ca 2+ στη λειτουργία των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων Τα ιόντα Ca 2+ παίζουν σηµαντικό ρόλο σε πάρα πολλές φυσιολογικές λειτουργίες των κυττάρων. Ειδικότερα στα καρδιακά µυοκύτταρα, η συγκέντρωση του Ca 2+ µπορεί να τροποποιήσει τόσο τη συσταλτικότητά τους, όσο και πολλά από τα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων τους. Παλαιότερες µελέτες υποστήριζαν ότι η διέγερση των α 1Α αδρενεργικών υποδοχέων συνδέεται περισσότερο µε την εισροή Ca 2+ παρά την παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης (Han και συν. 1987, Minneman 1988). Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν ενδείξεις για τη συµµετοχή και των α 1Α - και των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων στην παραγωγή της τριφωσφορικής ινοσιτόλης (Lazou και συν. 1994, Deng και συν. 1996), δεν µπορεί να αποκλεισθεί η πιθανότητα ότι ένας από τους δύο υποτύπους έχει µεγαλύτερη εξάρτηση από τη συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+. Έτσι, διερευνήθηκε η σχέση µεταξύ της εξωκυτταρικής ή ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης Ca 2+ ή της εισροής Ca 2+ και της παραγωγής τριφωσφορικής ινοσιτόλης µετά από διέγερση των α 1 αδρενεργικών υποδοχέων. Επιπλέον, µε τη χρήση κατάλληλων ανταγωνιστικών ενώσεων διερευνήθηκε η πιθανότητα κάποιος από τους δύο υποτύπους να έχει µεγαλύτερη ευαισθησία στη συγκέντρωση των ιόντων Ca Επίδραση της συγκέντρωσης του εξωκυτταρικού Ca 2+ στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή φωσφορικών ινοσιτολών ([ 3 H]InsP) Μελετήθηκε, κατ αρχάς, η επίδραση των ιόντων Ca 2+ στην παραγωγή ραδιενεργά σηµασµένης φωσφορικής ινοσιτόλης ([ 3 H]InsP), που επάγεται µε τη διέγερση των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων, στα καρδιακά µυοκύτταρα. Τα πειράµατα αυτά έγιναν µε επώαση αποµονωµένων κυττάρων σε διάφορες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+ (0, 0.1 µμ,1 µμ, 10 µμ, 100 µμ, 1mM, και 2 mm) παρουσία του αγωνιστή των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων αδρεναλίνη, σε συγκέντρωση 100 µμ για 30 λεπτά. Οι

71 65 [ 3 H]InsP (DPM) * * # ** ** Εξωκυτταρικό [Ca 2+ ], M Εικόνα 2.1. Μεταβολές στην παραγωγή [ 3 Η]InsP που επάγεται από τη διέγερση µε αδρεναλίνη καρδιακών µυοκυττάρων ενήλικου αρουραίου, σε σχέση µε διάφορες τιµές εξωκυτταρικής συγκέντρωσης ασβεστίου. Καρδιακά κύτταρα επισηµάνθηκαν µε µυο-[ 3 Η] ινοσιτόλη και στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 min µε αδρεναλίνη 100 µμ παρουσία LiCl 10 mm. Η ρύθµιση της συγκέντρωσης ασβεστίου στις δεδοµένες τιµές έγινε µε ΒΑΡΤΑ. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 8 διαφορετικά πειράµατα. Στα σηµεία που φαίνονται ως µονές µετρήσεις, οι µπάρες σφάλµατος καλύπτονται από το αντίστοιχο σύµβολο. Οι ανοικτοί κύκλοι αντιστοιχούν σε επωάσεις κυττάρων χωρίς αδρεναλίνη (βασικός ρυθµός παραγωγής [ 3 Η]InsP). Τα ανοικτά τρίγωνα σε επωάσεις κυττάρων παρουσία αδρεναλίνης 100 µμ. * Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την αµέσως προηγούµενη συγκέντρωση, # Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την τιµή που σηµειώθηκε στα 10-6 Μ, ** Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την τιµή που σηµειώθηκε στα 10-5 Μ Ca 2+. Figure 2.1. Calcium dependence of the adrenaline-induced [ 3 Η]InsP generation in cardiac myocytes. myo- [ 3 Η] inositol prelabeled cardiac myocytes were incubated for 30 min with adrenaline in the presence of LiCl 10 mm. Calcium was buffered to the indicated concentrations with BAPTA. Results are the mean ± SEM of eight determinations from different experiments. Where no error bar is shown, the error bar is within the size of the symbol. Open circles represent incubations in the absence of adrenaline (basal rate of [ 3 Η]InsP generation). Open triangles represent incubations in the presence of adrenaline 100 µm. * P< 0.01 compared with the previous value, # P< 0.01 compared with the value at 10-6 Μ, ** P<0.01 compared with the value at 10-5 Μ Ca 2+.

72 66 συγκεντρώσεις του ελεύθερου Ca 2+ ρυθµίστηκαν χρησιµοποιώντας τη χηλική ένωση ΒΑΡΤΑ που δείχνει υψηλή επιλεκτικότητα για το ασβέστιο, σε συγκέντρωση 1mM. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η παραγωγή [ 3 H]InsP, µετά από τη διέγερση των καρδιακών µυοκυττάρων µε αδρεναλίνη, εξαρτάται από τη συγκέντρωση του Ca 2+ στο εξωκυτταρικό µέσον (Εικόνα 2.1.). Η αποµάκρυνση των ιόντων Ca 2+ από το εξωκυτταρικό µέσον ανέστειλε τη δράση της αδρεναλίνης. Μια µικρή αύξηση στην παραγωγή [ 3 H]InsP παρατηρήθηκε σε συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca µΜ (2.206±0.34 φορές σε σύγκριση µε τον αντίστοιχο µάρτυρα, στην ίδια συγκέντρωση ιόντων Ca 2+, απουσία αδρεναλίνης). Ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP έγινε σηµαντικός (5.08±0.27 φορές σε σχέση µε τον αντίστοιχο µάρτυρα), όταν η συγκέντρωση του Ca 2+ αυξήθηκε σε 1µΜ. Περαιτέρω αύξηση στην παραγωγή [ 3 H]InsP παρατηρήθηκε, καθώς η εξωκυτταρική συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+ αυξήθηκε βαθµιαία από 1µΜ σε 2 mm (Εικόνα 2.1). Η συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+ δεν είχε καµία επίδραση στο βασικό ρυθµό παραγωγής [ 3 H]InsP, χωρίς τη διέγερση της αδρεναλίνης στα καρδιακά µυοκύτταρα. Η µεταβολή της µέγιστης παραγωγής [ 3 H]InsP που επάγεται από την αδρεναλίνη, στις διάφορες συγκεντρώσεις Ca 2+, δεν οφείλεται σε απώλεια της βιωσιµότητας των µυοκυττάρων, αφού τόσο τα αποθέµατα του ATP που µετρήθηκαν, όσο και η µορφολογία των µυοκυττάρων διατηρήθηκαν σε όλες τις συνθήκες επώασης. Προκειµένου να αποκλειστεί το ενδεχόµενο η επίδραση των ιόντων Ca 2+ στην παραγωγή [ 3 H]InsP να συνδέεται µε µεταβολές της αποτελεσµατικότητας της αδρεναλίνης, έγιναν οι καµπύλες απόκρισης των καρδιακών µυοκυττάρων σε αυξανόµενες συγκεντρώσεις αδρεναλίνης, στις ίδιες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+ που χρησιµοποιήθηκαν στα προηγούµενα πειράµατα (Εικόνα 2.2.). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.1 η διαφοροποίηση στις τιµές EC 50 (συγκέντρωση που προκαλεί το 50% της απόκρισης), που υπολογίστηκαν για την αδρεναλίνη στις διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+, ήταν πολύ µικρή, καθώς αυτές κυµάνθηκαν από 0.81 έως 1.17 µμ. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι τα ιόντα Ca 2+ επηρεάζουν τη µέγιστη παραγωγή [ 3 H]InsP, χωρίς να µεταβάλλουν την αποτελεσµατικότητα της αδρεναλίνης.

73 67 [ 3 H]InsP (DPM) Αδρεναλίνη, log [M] Εικόνα 2.2. Καµπύλες διέγερσης-απόκρισης για την παραγωγής [ 3 Η]InsP από την αδρεναλίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού ασβεστίου Καρδιακά κύτταρα επωάστηκαν µε αδρεναλίνη (αυξανόµενες συγκεντρώσεις από 10-9 έως 10-3,5 Μ) στις ακόλουθες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού ασβεστίου: 10-7 Μ (ανοικτά τετράγωνα), 10-6 Μ (ανοικτά τρίγωνα), 10-5 (ανοικτοί ρόµβοι), 10-4 Μ (ανοικτά αντεστραµµένα τρίγωνα) και 10-3 Μ (ανοικτοί κύκλοι). Η παραγωγή [ 3 Η]InsP εκφράζεται σε διασπάσεις ανά λεπτό (DPM). Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-9 διαφορετικά πειράµατα. Figure 2.2. Dose-response curves for the generation of [ 3 Η]InsP by adrenaline at various concentrations of external Ca 2+. Cardiac myocytes were stimulated with increasing concentrations of adrenaline ( ,5 M) at the following concentrations of extracellular Ca 2+ : 10-7 Μ (open squares), 10-6 Μ (open triangles), 10-5 (open diamonds), 10-4 Μ (open reversed triangles) και 10-3 Μ (open circles). Data are given as disintegrations per minute (DPM). Each point represents the mean ± SEM from 6-9 separate preparations of cardiomyocytes.

74 68 ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1. Επίδραση της συγκέντρωσης του εξωκυτταρικού Ca 2+ στη σταθερά EC 50 για την παραγωγή [ 3 H]InsP, που επάγεται από την αδρεναλίνη στα µυοκύτταρα της καρδιάς. Effects of extracellular Ca 2+ concentration on EC 50 for adrenaline stimulated [ 3 H]InsP formation in cardiac myocytes. Ca 2+, M pec 50 n H ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.08 Τα µυοκύτταρα διεγέρθηκαν µε αυξανόµενες συγκεντρώσεις αδρεναλίνης σε συγκεκριµένες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+. Οι τιµές pec 50 (αρνητικός λογάριθµός της συγκέντρωσης που παρατηρείται 50% απόκριση) και n H (συντελεστής Hill) υπολογίστηκαν από τις αντίστοιχες καµπύλες, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους και δίνονται ως µέσοι όροι ± τυπικό σφάλµα από 6-9 διαφορετικά παρασκευάσµατα µυοκυττάρων. Myocytes were stimulated with increasing concentrations of adrenaline in specific extracellular Ca 2+ concentrations. pec 50 values (negative logarithm of half maximal effective concentration) and n H (Hill coefficient) were calculated from the corresponding curves as described under Methods. These values are given as mean ± SEM from 6-9 myocyte preparations Ρύθµιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων Ca 2+ Προκειµένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος των ιόντων Ca 2+ στη παραγωγή των InsPs, µελετήθηκε η επίδραση του εξωκυτταρικού Ca 2+ σε καρδιακά κύτταρα, στα οποία η ενδοκυτταρική συγκέντρωση ιόντων Ca 2+ διατηρήθηκε σταθερή και ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του εξωκυτταρικού Ca 2+. Στα πειράµατα που έγιναν, η ενδοκυτταρική συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+ ρυθµίστηκε µε BAPTA-AM. Ο παράγοντας αυτός είναι µια εστεροποιηµένη µορφή του BAPTA που µπορεί να διαπερνά την κυτταρική µεµβράνη. Στη συνέχεια, χάνει την εστερική οµάδα στο κυτταρόπλασµα, όπου δρα ως χηλικός παράγοντας. Με τον τρόπο, αυτό η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του Ca 2+ ρυθµίζεται στα επίπεδα της σταθεράς διάστασης του µε το ΒΑΡΤΑ, δηλαδή περίπου στα nm. Η διέγερση των κυττάρων έγινε µε 100 µμ αδρεναλίνης, σε διάφορες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+ (0, 0.1 µμ,1 µμ, 10 µμ, 100 µμ, 1mM, και 2 mm).

75 69 Σε κύτταρα που είχαν προηγούµενα επωαστεί µε 10 µμ BAPTA-AM, το πρότυπο της επίδρασης του εξωκυτταρικού Ca 2+ στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP ήταν διαφορετικό σε σύγκριση µε τα κύτταρα στα οποία δεν είχε γίνει ρύθµιση της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού Ca 2+ µε το BAPTA-AM (Εικόνα 2.3). Ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP αυξήθηκε, καθώς η συγκέντρωση του εξωκυτταρικού Ca 2+ µεταβλήθηκε από 0 σε 1µΜ (5.08±0.27 φορές σε σύγκριση µε τον µάρτυρα βασικός ρυθµός παραγωγής [ 3 H]InsP, στην ίδια συγκέντρωση ιόντων Ca 2+, απουσία αδρεναλίνης). Όµως, καµία επιπλέον αύξηση δεν παρατηρήθηκε, όταν η συγκέντρωση του εξωκυτταρικού Ca 2+ αυξήθηκε περισσότερο. Σε συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca 2+ 1 mm και 2 mm, ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP, σε καρδιακά µυοκύτταρα που είχαν προηγούµενα επωαστεί µε BAPTA-AM, αντιστοιχούσε περίπου στο 65-70% εκείνου που παρατηρήθηκε σε κύτταρα στα οποία έγινε µεν διέγερση µε αδρεναλίνη, χωρίς όµως να υπάρχουν συνθήκες ρύθµισης του ενδοκυτταρικού Ca 2+. Πιο συγκεκριµένα, σε 1 mm Ca 2+ ήταν 545±47% (εκφραζόµενο ως % του αντίστοιχου βασικού ρυθµού παραγωγής [ 3 H]InsP απουσία αδρεναλίνης), έναντι 781±53% και σε 2 mm Ca 2+ ήταν 568±59%, έναντι 887±94% (Εικόνα 2.3). Είναι φανερό ότι σε αυτές τις συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+, ένα ποσοστό περίπου 30-35% της παραγωγής [ 3 H]InsP, που επάγει η διέγερση µε αδρεναλίνη, εξαρτάται από την εισροή Ca Επίδραση της ιονοµυκίνης στην παραγωγή [ 3 H]InsP απουσία αδρεναλίνης και µετά από διέγερση µε αδρεναλίνη Η επίδραση της εισροής των ιόντων Ca 2+ στην παραγωγή [ 3 H]InsP διερευνήθηκε περαιτέρω µε πειράµατα, όπου χρησιµoποιήθηκε η ιονοφόρος ουσία ιονοµυκίνη. Η ιονοµυκίνη χρησιµοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις 10 nm µέχρι 10 µμ τόσο σε κύτταρα που δε διεγέρθηκαν µε αδρεναλίνη, όσο και µετά από διέγερση µε 1µΜ αδρεναλίνης. ιαπιστώθηκε ότι η ιονοµυκίνη προκάλεσε το σχηµατισµό [ 3 H]InsP σε κύτταρα που δεν επωάστηκαν µε αδρεναλίνη. Η αύξηση της συγκέντρωσης της ιονοµυκίνης προκάλεσε αύξηση του ρυθµού παραγωγής της [ 3 H]InsP, µε τιµή EC 50 περίπου 3.3 µμ (Εικόνα 2.4.). Η µέγιστη διέγερση ήταν περίπου 1.7 φορές µεγαλύτερη σε σχέση µε το µάρτυρα (απουσία ιονοµυκίνης) και περίπου το 25% της µέγιστης διέγερσης που προκαλείται από α 1 -αδρενεργική διέγερση µε τη µέγιστη συγκέντρωση αδρεναλίνης. Σε προκαταρκτικά πειράµατα που έγιναν, διαπιστώθηκε ότι το DMSO

76 70 % αύξηση της παραγωγής [ 3 H]InsP ** * x10-3 Εξωκυτταρικό [Ca 2+ ], M Εικόνα 2.3. Επίδραση της ενδοκυτταρικής φόρτισης µε BAPTA στη µεταβολή της παραγωγής [ 3 Η]InsP που προκαλεί η σταδιακή αύξηση της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης Ca 2+. Καρδιακά µυοκύτταρα επωάστηκαν για 30 min µε αδρεναλίνη 100 µμ στις συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+, που αναγράφονται στην εικόνα. Οι ανοικτές στήλες αντιστοιχούν στους µάρτυρες που επωάστηκαν µε αδρεναλίνη, οι κλειστές στήλες σε κύτταρα που επωάστηκαν για 15 min µε ΒΑΡΤΑ-ΑΜ πριν διεγερθούν µε αδρεναλίνη. Τα δεδοµένα σε κάθε οµάδα εκφράζονται ως επί % του αντίστοιχου βασικού ρυθµού παραγωγής [ 3 Η]InsP, απουσία αδρεναλίνης, στη συγκεκριµένη συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca 2+. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 8-10 διαφορετικά πειράµατα. * Ρ<0.05 και ** Ρ<0.01 σε σύγκριση µε τις αντίστοιχες τιµές στα κύτταρα- µάρτυρες. Figure 2.3. Effect of BAPTA preloading on the external Ca 2+ of [ 3 Η]InsP formation. Cardiac myocytes were incubated for 30 min with 100 µμ adrenaline at extracellular Ca 2+ buffered to the indicated concentrations. Open bars represent control cells incubated with adrenaline, filled bars represent cells incubated with 10 µμ BAPTA-AM for 15 min at 37 o C before adrenaline stimulation. Data in each group are expressed as percentage of the respective basal rate, in the absence of adrenaline stimulation, at the particular Ca 2+ concentration. Values are the mean ± SEM from 8-10 different experiments. * Ρ<0.05 και ** Ρ<0.01 compared with the respective value in control cells.

77 71 [3H]InsPs (% µάρτυρα) 1000 * * * * Ιονοµυκίνη, log[m] Εικόνα 2.4. ιέγερση της παραγωγής [ 3 Η]InsP απότην ιονοµυκίνη. Καρδιακά µυοκύτταρα επωάστηκαν για 30 min στις συγκεκριµένες συγκεντρώσεις ιονοµυκίνης απουσία (τετράγωνα) και παρουσία αδρεναλίνης 1 µμ (τρίγωνα) σε συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca 2+ 1mΜ. Τα δεδοµένα εκφράζονται ως % του βασικού ρυθµού παραγωγής [ 3 Η]InsP, απουσία οποιουδήποτε παράγοντα Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 3 διαφορετικά πειράµατα. Στα σηµεία που φαίνονται ως µονές µετρήσεις οι µπάρες σφάλµατος καλύπτονται από το αντίστοιχο σύµβολο. * Ρ<0.05 σε σύγκριση µε τις επωάσεις κυττάρων απουσία ιονοµυκίνης. Figure 2.4. Stimulation of [ 3 Η]InsP formation by ionomycin. Cardiac myocytes were incubated for 30 min with the indicated concentrations of ionomycin in the absence (squares) or the presence (triangles) of 1µΜ adrenaline at 1mM extracellular Ca 2+. Data are expressed as percentage of the basal rate in the absence of any drug. Results are the mean ± SEM from three different experiments. Where no error bar is shown, the error bar is within the size of the symbol. * P<0.05 compared with control incubations in the absence of ionomycin.

78 72 το οποίο χρησιµοποιήθηκε ως φορέας της ιονοµυκίνης, από µόνο του δεν είχε καµία επίδραση στην παραγωγή [ 3 H]InsP. Σε κύτταρα που έγινε διέγερση µε 1µΜ αδρεναλίνη, η ιονοµυκίνη προκάλεσε, επίσης, αύξηση στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP (Εικόνα 2.4.). Η αύξηση στο σχηµατισµό των [ 3 H]InsP εξαρτώταν από τη συγκέντρωση της ιονοµυκίνης, µε τιµή EC 50 περίπου 1.5 µμ. Η µέγιστη απόκριση των καρδιακών µυοκυττάρων ήταν 8.5-φορές υψηλότερη από το βασικό ρυθµό σχηµατισµού [ 3 H]InsP και 1.7-φορές υψηλότερη σε σύγκριση µε τη µέγιστη απόκριση κυττάρων στα οποία έγινε διέγερση µε αδρεναλίνη, απουσία ιονοµυκίνης. Από τα αποτελέσµατα αυτά συµπεραίνεται ότι η α 1 - αδρενεργική διέγερση και η εισροή ιόντων Ca 2+, που προκάλεσε η ιονοµυκίνη, είχαν προσθετική δράση όσον αφορά στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP Επίδραση των ανταγωνιστών των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (α 1Α - και α 1Β -) στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή InsP Για να διαπιστωθεί εάν η εξαρτώµενη από τη συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+ παραγωγή των [ 3 H]InsPs, που επάγει η αδρεναλίνη, σχετίζεται µε ένα συγκεκριµένο υποτύπο α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, έγιναν πειράµατα ανάλογα µε τα προηγούµενα, στα οποία όµως χρησιµοποιήθηκαν ειδικοί ανταγωνιστές των α 1Α - ή των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων. Συγκεκριµένα, χρησιµοποιήθηκαν το CEC, που είναι µη αναστρεπτός αναστολέας των α 1Β - και η 5 -µεθυλουραπιδίλη, που είναι ειδικός ανταγωνιστής των α 1Α -αδρενεργικών υποδοχέων. Είναι γεγονός ότι προεπώαση των κυττάρων µε CEC ή 5 -µεθυλουραπιδίλη έχει ως αποτέλεσµα µια µείωση στο σχηµατισµό των [ 3 H]InsPs που προκαλεί η διέγερση µε αδρεναλίνη, µια και οι ανταγωνιστές αυτοί απενεργοποιούν ένα ποσοστό των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων. Με σκοπό να διευκολυνθεί η σύγκριση µεταξύ των διαφορετικών οµάδων (επώαση µε CEC ή επίδραση µε 5 -µεθυλουραπιδίλη), ο ρυθµός σχηµατισµού [ 3 H]InsP σε κάθε οµάδα εκφράστηκε ως ποσοστό του ρυθµού σχηµατισµού [ 3 H]InsP απουσία εξωκυτταρικού Ca 2+. Σε κύτταρα που είχαν προηγούµενα επωαστεί µε 100 µμ CEC, ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP, ύστερα από διέγερση των καρδιακών µυοκυττάρων µε 100 µμ αδρεναλίνη, απαιτούσε µια ελάχιστη συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca 2+ µεταξύ 0.1 και 1 µμ, όπως συµβαίνει στους µάρτυρες (κύτταρα στα οποία έγινε διέγερση µε 100 µμ αδρεναλίνη, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Ca 2+, χωρίς άλλη επέµβαση) (Εικόνα

79 73 A % αύξηση [ 3 H]InsP Μάρτυρες CEC BAPTA + CEC * # # * # # Εξωκυτταρικό [Ca 2+ ], M B % αύξηση [ 3 H]InsP Μάρτυρες 5' MU BAPTA+ 5'MU * ** * * * Εξωκυτταρικό [Ca 2+ ], M

80 Α.). Εντούτοις, όταν η συγκέντρωση του εξωκυτταρικού Ca 2+ έγινε µεγαλύτερη από 10 µμ, δεν παρατηρήθηκε καµία επιπλέον επίδραση στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP. Όπως φαίνεται στην εικόνα 2.5.Α., παρόµοιο πρότυπο απόκρισης στην αδρενεργική διέγερση, σε αυξανόµενες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+, παρατηρήθηκε σε κύτταρα στα οποία ρυθµίστηκε η ενδοκυτταρική συγκέντρωση Ca 2+ µε BAPTA-ΑΜ και στη συνέχεια επωάστηκαν µε CEC. Επίσης, ελέγχθηκε ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP που επάγεται από την αδρεναλίνη, σε συνάρτηση µε το Ca 2+, παρουσία του ανταγωνιστή των α 1Α -αδρενεργικών υποδοχέων 5 -µεθυλουραπιδίλη. Η 5 -µεθυλουραπιδίλη χρησιµοποιήθηκε, στα πειράµατα που έγιναν, σε συγκέντρωση 10 nm, η οποία είναι πολύ κοντά στην τιµή EC 50 της αναστολής του σχηµατισµού [ 3 H]InsP ύστερα από α 1 -αδρενεργική διέγερση, σε καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου (Lazou και συν. 1994). Όταν σε καρδιακά Εικόνα 2.5. Επίδραση των α 1Β - και α 1Α - ειδικών ανταγωνιστών στην εξάρτηση της παραγωγής [ 3 Η]InsP από την εξωκυτταρική συγκέντρωση Ca 2+. Α: Κύτταρα που δεν εκτέθηκαν σε καµία ουσία (µάρτυρες- ανοικτά τετράγωνα), κύτταρα που επωάστηκαν για 15 min µε CEC 100µΜ στους 37 o C (µαύρα τρίγωνα) και κύτταρα που επωάστηκαν πρώτα µε ΒΑΡΤΑ-ΑΜ και στη συνέχεια µε CEC (ανοικτοί κύκλοι) διεγέρθηκαν µε αδρεναλίνη 100 µμ στις αναγραφόµενες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού Ca 2+. B: Κύτταρα µάρτυρες (ανοικτοί κύκλοι), κύτταρα που εκτέθηκαν σε 5 -µεθυλουραπιδίλη (5 MU) (µαύρα τετράγωνα) και κύτταρα που επωάστηκαν πρώτα µε ΒΑΡΤΑ-ΑΜ και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 5 -µεθυλουραπιδίλη (5 MU) (ανοικτά τρίγωνα) διεγέρθηκαν µε αδρεναλίνη 1µΜ. Σε κάθε οµάδα, ο ρυθµός παραγωγής [ 3 Η]InsP εκφράζεται ως επί τοις εκατό αναλογία του ρυθµού που παρατηρείται σε µηδενική συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca 2+. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 3-6 διαφορετικά πειράµατα. * Ρ<0.05 και ** Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την τιµή που σηµειώνεται στα 10-6 Μ Ca 2+, # Ρ<0.05 σε σύγκριση µε την αντίστοιχη τιµή στα κύτταρα µάρτυρες (στην ίδια συγκέντρωση εξωκυτταρικού Ca 2+ ), Ρ<0.05 σε σύγκριση µε την αντίστοιχη τιµή που σηµειώνεται στην ίδια συγκέντρωση Ca 2+ στους µάρτυρες και στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε 5 MU, Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την αντίστοιχη τιµή στους µάρτυρες και στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε 5 MU. Figure 2.5. Effects of α 1 -adrenergic subtype inhibitors on the Ca 2+ dependence of the adrenaline stimulated [ 3 Η]InsP formation in cardiac myocytes. A: Control myocytes, in the absence of any treatment (open squares), myocytes treated with 100 µμ CEC for 15 min at 37 ο C (closed triangles) or treated with CEC and preloaded with BAPTA-AM (open circles) were stimulated with 100 µμ adrenaline at the indicated external Ca 2+ concentrations. Β: Control, non-treated myocytes (open circles), myocytes treated with 5 -methylurapidil (5 MU) (closed squares) or myocytes preloaded with BAPTA-AM and treated with 5 -methylurapidil (open triangles) were stimulated with 1µΜ adrenaline. For each group, the rate of [ 3 Η]InsP formation is presented as percentage of the rate at zero concentration of external Ca 2+. Values are the mean ± SEM from 3-6 experiments on separate batches of cells. * P<0.05 and ** P<0.01compared with the value at 10-6 Μ Ca 2+, # P<0.05 compared with the value at the same Ca 2+ concentration in the control group, Ρ<0.05 compared with the value at the same Ca 2+ concentration in the control and 5 -methylurapidil- treated groups, Ρ<0.01 compared with the value at the same Ca 2+ concentration in the control and 5 -methylurapidil- treated groups.

81 75 µυοκύτταρα έγινε διέγερση µε 1 µμ αδρεναλίνη, παρουσία 5 -µεθυλουραπιδίλη, ο σχηµατισµός των [ 3 H]InsPs έδειξε να εξαρτάται από τη συγκέντρωση του εξωτερικού Ca 2+ (Εικόνα 2.5.Β.). Η σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης του εξωκυτταρικού Ca 2+, από 0.1 µμ σε 1 mm, είχε ως αποτέλεσµα ανάλογη αύξηση στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP, από 116±30 σε 280±40%. Αυτό το πρότυπο απόκρισης των κυττάρων ήταν παρόµοιο µε εκείνο που παρατηρήθηκε σε κύτταρα στα οποία έγινε διέγερση µε αδρεναλίνη 1 µμ, απουσία 5 -µεθυλουραπιδίλης. Αντίθετα, σε κύτταρα που έγινε διέγερση µε 1 µμ αδρεναλίνη, παρουσία 5 -µεθυλουραπιδίλης, ενώ είχε προηγηθεί επώαση µε BAPTA-ΑΜ, ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP δεν έδειξε καµία εξάρτηση από την εξωκυτταρική συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+ (Εικόνα 2.5.Β.). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η παραγωγή των [ 3 H]InsPs που προκαλεί η διέγερση των α 1Α - αδρενεργικών υποδοχέων, δεν εξαρτάται από την εισροή ιόντων Ca 2+. Αντίθετα, η παραγωγή των [ 3 H]InsP που προκαλεί η διέγερση των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων, φαίνεται να εξαρτάται από την εισροή ιόντων Ca 2+ στα καρδιακά µυοκύτταρα Επίδραση ανταγωνιστών των καναλιών Ca 2+ (νιφεδιπίνη, Ni 2+, Co 2+ ) στην παραγωγή [ 3 H]InsP που επάγει η αδρενεργική διέγερση Προκειµένου να µελετηθεί περαιτέρω ο ρόλος της εισόδου ιόντων Ca 2+ στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP που επάγει η αδρεναλίνη, καρδιακά µυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ αδρεναλίνη, σε συγκέντρωση 1 mm εξωκυτταρικού Ca 2+, παρουσία είτε νιφεδιπίνης, που είναι ανταγωνιστής των L-τύπου καναλιών Ca 2+, είτε των δισθενών κατιόντων Ni 2+ και Co 2+. Η επίδραση µε διαφορετικές συγκεντρώσεις νιφεδιπίνης έδειξε σηµαντική αναστολή στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP, στη συγκέντρωση 50 µμ (Πίνακας 2.2.). Η επίδραση της νιφεδιπίνης δεν φαίνεται να σχετίζεται µε κάποιον από τους δύο υποτύπους των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (α 1Β - ή α 1Α -), αφού σε κύτταρα που είχαν προηγούµενα επωαστεί µε τον ανταγωνιστή των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων, CEC, ή µε 5 -µεθυλουραπιδίλη, που είναι ειδικός ανταγωνιστής των α 1Α - αδρενεργικών υποδοχέων, το αποτέλεσµα της δράσης της ήταν παρόµοιο. Όσον αφορά στην επίδραση των κατιόντων Ni 2+ και Co 2+, διαπιστώθηκε ότι τα ιόντα Ni 2+ σε συγκέντρωση 1 mm και τα ιόντα Co 2+ σε συγκεντρώσεις 0.5 και 1 mm, δε µειώνουν σηµαντικά το σχηµατισµό [ 3 H]InsP. Όπως φαίνεται όµως στον πίνακα 2.3., και τα δύο αυτά ιόντα έχουν σηµαντική επίδραση µόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Επιπλέον, παρουσία ιόντων Ni 2+, η απόκριση των κυττάρων στη

82 76 διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων δε διέφερε σηµαντικά στα κύτταρα που είχαν επωαστεί παρουσία ή απουσία του α 1Β - ανταγωνιστή, CEC. ΠΙΝΑΚΑΣ 2.2 Επίδραση της νιφεδιπίνης στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή [ 3 H]InsP σε κύτταρα που δεν είχαν υποστεί καµία επίδραση και σε κύτταρα που είχαν προεπωαστεί µε τους αναστολείς των α 1Α - και α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων 5 - µεθυλουραπιδίλη και CEC. Effects of nifedipine on adrenaline induced [ 3 H]InsP formation in non treated cells and in cells preincubated with the α 1Α - or α 1Β -adrenergic subtype specific antagonists methylurapidil and CEC. Νιφεδιπίνη µμ Χωρίς α 1 - αναστολείς Παρουσία CEC Παρουσία 5 - µεθυλουραπιδίλης ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 4.37 a ± 5.44 b ± 3.18 a ± 5.37 a ± 5.83 b ± 5.08 a Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως % του µάρτυρα δηλαδή απουσία νιφεδιπίνης. Οι τιµές είναι ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα από 5-9 διαφορετικά παρασκευάσµατα. a P<0.05 και b P<0.01 σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Results are expressed as % of control (i.e. in the absence of nifedipine). Values are the mean ± SEM from 5-9 separate preparations.. a P<0.05 and b P<0.01 vs. control.

83 77 ΠΙΝΑΚΑΣ 2.3 Επίδραση των ανόργανων αναστολέων των καναλιών Ca 2+ στην επαγόµενη από την αδρεναλίνη παραγωγή [ 3 H]InsP σε κύτταρα που δεν είχαν υποστεί καµία επίδραση και σε κύτταρα που είχαν προεπωαστεί µε τον αναστολέα των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων CEC. Effects of inorganic Ca 2+ channel blocker on adrenaline induced [ 3 H]InsP formation in non treated cells and in cells preincubated with α 1Β -adrenergic subtype specific antagonist CEC. Χωρίς CEC Παρουσία CEC Μάρτυρας 100± ±6.3 Ni 2+ 1mM ± ± mm ± 3.04 a ± 7.80 Co mm ± mm ± mm ± 7.08 a - Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως % του µάρτυρα απουσία αναστολέων των καναλιών Ca 2+. Σε κάθε οµάδα, οι τιµές αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 3 διαφορετικά πειράµατα. a P< 0.01 σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Results are expressed as % of control (i.e. in the absence of Ca 2+ channel blockers). In each group values are the mean ± SEM from 3 separate preparations. a P<0.01 vs. control.

84 78 3. Η διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην ισχαιµική προετοιµασία Είναι δεδοµένο ότι κατά την ισχαιµία της καρδιάς υπάρχει έκλυση κατεχολαµινών και επακόλουθη διέγερση των αδρενεργικών υποδοχέων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη διέγερση µονοπατιών µεταγωγής µηνυµάτων και µεταβολές στις φυσιολογικές διαδικασίες των µυοκυττάρων. Έτσι, διερευνήθηκε κατά πόσο οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς συµµετέχουν στην προσαρµοστική αντίδραση της καρδιάς στην ισχαιµία και παρέχουν κάποιο προστατευτικό αποτέλεσµα. Επίσης, διερευνήθηκε η διαφορική συµµετοχή των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στη διαδικασία αυτή. Χρησιµοποιήθηκαν αποµονωµένες και εµποτισµένες καρδιές αρουραίου, οι οποίες υποβλήθηκαν σε ισχαιµία και επανεµποτισµό και στις οποίες προσδιορίστηκε η επίδραση της ισχαιµίας. Τα κριτήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν η λειτουργική ανάκτηση της καρδιάς και το ποσοστό νεκρωµένου µυοκαρδίου µετά την ισχαιµία. Για τον προσδιορισµό της λειτουργικής ανάκτησης της καρδιάς χρησιµοποιήθηκαν οι εξής παράµετροι: 1. Η αναπτυσσόµενη πίεση στην αριστερή κοιλία (LVDP) 2. Η ροή της στεφανιαίας κυκλοφορίας (CF) 3. Ο καρδιακός ρυθµός (HR) 4. Το γινόµενο HR x LVDP, το οποίο θεωρείται δείκτης της συσταλτικότητας της καρδιάς 5. Η τελοδιαστολική πίεση της αριστερής κοιλίας (LVEDP) 3.1. Επίδραση του εµποτισµού µε φαινυλεφρίνη στην ανάκτηση της καρδιάςµετά την ισχαιµία Για να διαπιστωθεί αν η διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων µπορεί να έχει κάποιο προστατευτικό αποτέλεσµα ενάντια στην ισχαιµία, οι καρδιές εµποτίστηκαν µε φαινυλεφρίνη 50µΜ (ΡΕ) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε 45 λεπτά ισχαιµία και 60 λεπτά επανεµποτισµό. Η λειτουργία της καρδιάς καταγραφόταν κατά τη διάρκεια του πειράµατος, ενώ στο τέλος του επανεµποτισµού προσδιορίστηκε το ποσοστό νέκρωσης των κυττάρων.

85 79 ΠΙΝΑΚΑΣ 3.1. Λειτουργικές παράµετροι των εµποτιζόµενων καρδιών στη φάση της σταθεροποίησης και στο τέλος του 60λεπτου επανεµποτισµού µετά από 45 λεπτά ισχαιµίας. Functional parameters of perfused hearts during stabilization and at the end of the 60 minutes reperfusion period that follows 45 minutes of sustained ischaemia. Σταθεροποίηση 60 λεπτά επανεµποτισµού Οµάδα LVDP (mm Hg) Στεφανιαία ροή (ml/min) HR (χτύποι/min) LVDP (mm Hg) LVEDP (mm Hg) HR x LVDP (χτύποι/min x mm Hg) Στεφανιαία ροή (ml/min) NP ± ± ± ± ± ± ± 0.5 PE ± ± ± ±4.67* 24 ± 4* ± 1124* 7.9 ± 0.4* PRA ± ± ± ± ± ± ± 0.5 PE+PRA ± ± ± ±3.49 # 37 ± ± 1167 # 5.9 ± 0.4 # Οι τιµές εκφράζονται ως µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα από 6-9 διαφορετικά πειράµατα. LVDP, αναπτυσσόµενη πίεση στην αριστερή κοιλία, HR, καρδιακός ρυθµός. ΝΡ µάρτυρες χωρίς προετοιµασία, ΡΕ φαινυλεφρίνη, PRA πραζοσίνη. * Ρ<0.05 σε σύγκριση µε ΝΡ, # Ρ<0.05 σε σύγκριση µε ΡΕ. Values represent the mean ± SEM from 6-9 separate experiments. LVDP, Left Ventricular Developed Pressure, HR, Heart Rate, NP, Non Preconditioned control hearts, PE, Phenylephrine, PRA, Prazosin. * Ρ<0.05 vs. ΝΡ group, # Ρ<0.05 vs. ΡΕ group.

86 80 Στον Πίνακα 3.1 παρουσιάζονται τα λειτουργικά χαρακτηριστικά κατά την περίοδο σταθεροποίησης της εµποτιζόµενης καρδιάς και στο τέλος του 60λεπτου επανεµποτισµού, ενώ στην Εικόνα 3.1 φαίνεται η αναπτυσσόµενη πίεση κατά τη διάρκεια του πειράµατος. Η «προετοιµασία» της καρδιάς µε εµποτισµό µε φαινυλεφρίνη 50 µμ (PE), η οποία ως γνωστόν είναι αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, είχε ως αποτέλεσµα την ανάκτηση της αναπτυσσόµενης πίεσης αριστερής κοιλίας (LVDP), µετά από 45 λεπτά ισχαιµίας και 60 λεπτά επανεµποτισµού, σε ποσοστό που πλησίαζε το 60% σε σχέση µε τη φάση σταθεροποίησης. Το αντίστοιχο ποσοστό στους µάρτυρες (δηλαδή στις καρδιές που δεν είχαν υποστεί την επίδραση της φαινυλεφρίνης) προσέγγιζε το 30% (Εικόνα 3.1). Η τιµή του γινοµένου καρδιακός ρυθµός x αναπτυσσόµενη πίεση (HR x LVDP) ήταν ±1124 χτύποι / min x mmhg στις καρδιές που προετοιµάστηκαν µε φαινυλεφρίνη και 5623±743 χτύποι / min x mmhg στους µάρτυρες (P< 0.01, Πίνακας 3.1). Στις καρδιές της ΡΕ οµάδας, η LVEDP (τελοδιαστολική πίεση αριστερής κοιλίας) ήταν σηµαντικά χαµηλότερη (24±4 mmhg έναντι 55±5 mmhg, Ρ<0.01) και η ροή της στεφανιαίας κυκλοφορίας σηµαντικά καλύτερη (7.9±0.4 ml/min έναντι 5.8±0.5 ml/min, Ρ<0.05) σε σύγκριση µε τις NP καρδιές που χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες. Ο καρδιακός ρυθµός δεν επηρεάστηκε από την προετοιµασία µε φαινυλεφρίνη, ενώ η µεγαλύτερη τιµή του γινοµένου HR x LVDP στις καρδιές της ΡΕ οµάδας οφείλεται αποκλειστικά στη µεγαλύτερη ανάκτηση της LVDP κατά τον επανεµποτισµό. Στην Εικόνα 3.2 παρουσιάζεται το µέγεθος της νεκρωτικής βλάβης (εκφραζόµενο ως ποσοστό του συνολικού καρδιακού όγκου), που προκαλείται από την 45λεπτη ισχαιµία, στις καρδιές µάρτυρες και στις καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε ΡΕ. Η ευεργετική επίδραση της «προετοιµασίας» µε τον αγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων είναι εµφανής καθώς στις καρδιές- µάρτυρες το ποσοστό του νεκρωµένου µυοκαρδίου ήταν 43.16±3.26%, ενώ στις καρδιές της οµάδας ΡΕ το αντίστοιχο ποσοστό ήταν 11.55±3.21% (Ρ<0.001). Για να διευκρινιστεί αν η δράση της φαινυλεφρίνης ήταν ειδική, επαναλήφθηκαν τα προηγούµενα πειράµατα παρουσία πραζοσίνης, η οποία είναι ανταγωνιστής των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων. Η πραζοσίνη χορηγήθηκε σε συγκέντρωση 1µΜ, πέντε λεπτά πριν και κατά τη διάρκεια του εµποτισµού µε φαινυλεφρίνη, έτσι ώστε να αναστείλει τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς. Η πραζοσίνη από µόνη της δεν είχε καµιά

87 81 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κολίας (% της τιµής σταθεροποίησης) PE Ισχαιµία * # # # # # * * NP-Μάρτυρες PE Χρόνος (min) Εικόνα 3.1. Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε καρδιές µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία (ΝΡ-Μάρτυρες) και σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη 50 µμ (ΡΕ). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-9 καρδιές. * Ρ<0.05, # Ρ<0.01, Ρ< Figure 3.1. Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in non-preconditioned control hearts (NP-Control) and in hearts preconditioned with phenylephrine 50 µμ (PE). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-9 hearts. * Ρ<0.05, # Ρ<0.01, Ρ<0.001.

88 82 Ποσοστό νέκρωσης (% συν. όγκου της καρδιάς) # NP PE PRA PE+PRA Εικόνα 3.2. Ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου εκφραζόµενο ως % του συνολικού όγκου της καρδιάς. ΝΡ, καρδιές µάρτυρες χωρίς προετοιµασία. ΡΕ, καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη 50 µμ. ΡΕ+ΡRΑ, καρδιές που προετοιµάστηκαν µε φαινυλεφρίνη παρουσία του αναστολέα των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων πραζοσίνης. PRA, καρδιές που εµποτίστηκαν µόνον µε πραζοσίνη. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το ποσοστό νέκρωσης από µία καρδιά. ίπλα σε κάθε οµάδα παρατίθεται ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα. # Ρ<0.001 σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Figure 3.2. Infarct size, expressed as percentage of heart volume. NP, non-preconditioned control hearts. PE, hearts preconditioned with phenylephrine 50 µμ. PE+PRA, hearts preconditioned with phenylephrine in the presence of α 1 -adrenergic receptor antagonist prazosin. PRA, hearts perfused with prazosin alone. Open circles represent the individual heart infarct size. The corresponding mean ± SEM is depicted together with the group data. # Ρ<0.001 vs. NP-Control.

89 83 επίδραση στην καρδιακή λειτουργία. Σε καρδιές που χορηγήθηκε µόνον πραζοσίνη πριν τη 45λεπτη ισχαιµία, οι τιµές των αιµοδυναµικών χαρακτηριστικών µετά από 60 λεπτά επανεµποτισµού, όπως και ο βαθµός νέκρωσης του µυοκαρδίου, κυµαίνονταν σε επίπεδα αντίστοιχα µε εκείνα των καρδιών που δεν είχαν υποστεί προετοιµασία (Πίνακας 3.1, Εικόνες 3.2 και 3.3). Επίσης, σε προκαταρκτικά πειράµατα που έγιναν διαπιστώθηκε ότι τόσο το DMSO που χρησιµοποιήθηκε για τη διάλυση της πραζοσίνης, όσο και το ασκορβικό όξύ που χρησιµοποιήθηκε στο διάλυµα της φαινυλεφρίνης δεν είχαν καµία επίδραση στη λειτουργία της καρδιάς. Η παρουσία της πραζοσίνης στο διάλυµα εµποτισµού µε τη φαινυλεφρίνη (οµάδα PE+PRA) είχε ως αποτέλεσµα την παρεµπόδιση της προστατευτικής δράσης της προετοιµασίας µε φαινυλεφρίνη, τόσο στην ανάκτηση της καρδιάς (Πίνακας 3.1 και Εικόνα 3.4), όσο και στο βαθµό νέκρωσης του µυοκαρδίου (Εικόνα 3.2). Στο τέλος του 60λεπτου εµποτισµού, το ποσοστό ανάκτησης της LVDP σε σχέση µε την περίοδο σταθεροποίησης ήταν 39.43±4.62% στις καρδιές της οµάδας PE+PRA. H τιµή αυτή δε διαφέρει σηµαντικά από την αντίστοιχη που σηµειώθηκε στις καρδιές που δεν υποβλήθηκαν σε προετοιµασία µε φαινυλεφρίνη (οµάδα NP-Μάρτυρες). Ειδικότερα στην PE+PRA οµάδα, το ποσοστό ανάκτησης της LVDP ήταν σηµαντικά µικρότερο σε σύγκριση µε τις PE καρδιές (P<0.01). Επιπλέον, οι καρδιές της οµάδας PE+PRA παρουσίασαν σηµαντικά χαµηλότερη ανάκτηση της συσταλτικότητας της καρδιάς (8624±1167 χτύποι / min x mmhg ) από τις PE καρδιές (14044±1124 χτύποι / min x mmhg) (P<0.01) και επίσης, σηµαντικά µικρότερη ροή της στεφανιαίας κυκλοφορίας (PE+PRA: 5.9±0.4, έναντι NΕ: 7.9±0.4, P<0.05) (Πίνακας 3.1). Ο βαθµός νέκρωσης του µυοκαρδίου στην οµάδα αυτή ήταν αρκετά µεγάλος 32.67±4.48% και διέφερε σηµαντικά από τον αντίστοιχο που παρατηρήθηκε στις καρδιές της οµάδας ΡΕ (Ρ<0.01). Από τα αποτελέσµατα αυτά, και δεδοµένου ότι η χορήγηση του ανταγωνιστή των β-αδρενεργικών υποδοχέων προπρανολόλη δεν παρεµπόδισε την προστατευτική δράση του φαινοµένου της προετοιµασίας µε φαινυλεφρίνη στη λειτουργική ανάκτηση της καρδιάς, αλλά, και στο βαθµό νέκρωσης του µυοκαρδίου, φαίνεται ότι η προστατευτική δράση της φαινυλεφρίνης στις καρδιές αρουραίων που υποβλήθηκαν σε παρατεταµένη ισχαιµία (45 λεπτά) σχετίζεται µε τη διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων.

90 84 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (% της τιµής σταθεροποίησης ) PRA Ισχαιµία NP-Μάρτυρες Pra Χρόνος (min) Εικόνα 3.3. Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε εµποτισµένες καρδιές µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία (ΝΡ- Μάρτυρες) και σε καρδιές που εµποτίστηκαν µε τον ανταγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων πραζοσίνη (PRA). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-9 καρδιές. Figure 3.3. Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in nonpreconditioned control hearts (NP-Control) and in hearts perfused with the α 1 adrenergic receptor antagonist prazosin (PRA). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-9 hearts.

91 85 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (% της τιµής σταθεροποίησης) PRA PE Ισχαιµία NP-Μάρτυρες * # * * ** Χρόνος (min) # # PE & # PE+PRA & & # # & # Εικόνα 3.4. Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε εµποτισµένες καρδιές µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία (ΝΡ- Μάρτυρες), σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη 50 µμ (ΡΕ) και σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη παρουσία του ανταγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων πραζοσίνη (PE+PRA). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-9 καρδιές. * Ρ<0.05, # Ρ<0.01, σε σύγκριση µε ΝΡ-Μάρτυρες, & Ρ<0.05 σε σύγκριση µε PE+PRA. Figure 3.4. Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in non-preconditioned control hearts (NP-Control), hearts preconditioned with phenylephrine 50 µμ (PE) and hearts preconditioned with phenylephrine in the presence of the α 1 -adrenergic receptor antagonist prazosin (PE+PRA). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-9 hearts. * Ρ<0.05, # Ρ<0.01, vs. NP-Control, & Ρ<0.05 vs. PE+PRA.

92 Επίδραση των ανταγωνιστών των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην προστατευτική δράση της φαινυλεφρίνης στην καρδιά Για να διευκρινιστεί αν στο µηχανισµό της φαρµακολογικής «προετοιµασίας» µε φαινυλεφρίνη εµπλέκεται ένας συγκεκριµένος υποτύπος, α 1Α - ή α 1Β - των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων, χρησιµοποιήθηκαν κατάλληλοι ανταγωνιστές των υποδοχέων αυτών. Συγκεκριµένα, πριν και κατά τη διάρκεια του εµποτισµού µε φαινλεφρίνη, χορηγήθηκε ο α 1Α -ειδικός ανταγωνιστής 5 -µεθυλουραπιδίλη (MU, 100nM) ή ο α 1Β -ειδικός ανταγωνιστής CEC (100 µμ). Οπως και στην περίπτωση της πραζοσίνης, οι λειτουργικές παράµετροι και ο βαθµός νέκρωσης του µυοκαρδίου δεν επηρεάστηκαν από τον εµποτισµό µόνο µε τους ανταγωνιστές και κυµάνθηκαν στα επίπεδα των µαρτύρων (Πίνακας 3.2, Εικόνες 3.5 και 3.6). Οπως φαίνεται στην Εικόνα 3.7., το CEC ανέστειλε την προστατευτική δράση της φαινυλεφρίνης. Στην οµάδα ΡΕ+CEC, το ποσοστό ανάκτησης της LVDP, ύστερα από 60 λεπτά επανεµποτισµού, διέφερε σηµαντικά από την ανάκτηση που παρατηρείται στην οµάδα ΡΕ (Ρ<0.01) και µάλιστα ήταν ακόµη πιο χαµηλό από αυτό της οµάδας PE+PRA, 23.54±5.05 %. Επίσης και οι υπόλοιπες αιµοδυναµικές παράµετροι της οµάδας αυτής ήταν σηµαντικά διαφορετικές από τις αντίστοιχες της ΡΕ οµάδας. Συγκεκριµένα, η συσταλτικότητα της καρδιάς στο τέλος της φάσης επανεµποτισµού ήταν σηµαντικά χαµηλότερη, 4694±1619 χτύποι / min x mmhg (Ρ<0.01 σε σχέση µε την οµάδα PE), όπως και η στεφανιαία ροή, 4.0±0,4 ml/min. Αντίθετα, σηµαντικά υψηλότερη είναι η LVEDP, 57±8 mmhg (Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την οµάδα PE). (Πίνακας 3.2). Eπιπλέον, η ανασταλτική δράση του ειδικού ανταγωνιστή των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων στο ευεργετικό αποτέλεσµα της «προετοιµασίας» µε φαινυλεφρίνη, γίνεται ιδιαίτερα εµφανής από τις εκτεταµένες περιοχές νέκρωσης που παρατηρούνται στις καρδιές της οµάδας αυτής (Εικόνα 3.8.). Το ποσοστό νέκρωσης ήταν 38.50±4.25 %, µε το αντίστοιχο ποσοστό στις καρδιές ΡΕ να είναι 11.55±3.21% (Ρ<0.01). Αντίθετα µε την επίδραση του CEC, ο α 1Α -ειδικός ανταγωνιστής 5 -µεθυλουραπιδίλη (οµάδα PE+MU) δεν παρεµπόδισε την προστατευτική δράση της φαινυλεφρίνης. Το ποσοστό ανάκτησης της LVDP (Εικόνα 3.7), οι αιµοδυναµικές παράµετροι (Πίνακας 3.2), καθώς και το ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου (Εικόνα 3.8) δε διέφεραν σηµαντικά από τα αντίστοιχα των καρδιών της οµάδας ΡΕ.

93 87 ΠΙΝΑΚΑΣ 3.2. Λειτουργικές παράµετροι των εµποτιζόµενων καρδιών στη φάση της σταθεροποίησης και στο τέλος του 60λεπτου επανεµποτισµού, µετά από 45 λεπτά ισχαιµίας. Functional parameters of perfused hearts during stabilization and at the end of the 60 min reperfusion period that follows 45 minutes of sustained ischemia. Σταθεροποίηση 60 λεπτά επανεµποτισµού Οµάδα LVDP (mm Hg) Στεφανιαία ροή (ml/min) HR (χτύποι/min) LVDP (mm Hg) LVEDP (mm Hg) HR x LVDP (χτύποι/min x mm Hg) Στεφανιαία ροή (ml/min) NP ± ± ± ± ± ± ± 0.5 PE ± ± ± ±4.67* 24 ± 4* ± 1124* 7.9 ± 0.4* MU ± ± ± ± ± ± ± 0.5 CEC ± ± ± ± ± ± ± 0.3 PE+MU ± ± ± ±10.64* 28 ± 6* ± 1318* 7.3 ± 0.4 PE+CEC ± ± ± ±6.45# 57 ± 8# 4694 ± 1619# 4.0 ± 0.4# Οι τιµές εκφράζονται ως µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα από 6-9 διαφορετικά πειράµατα. LVDP, αναπτυσσόµενη πίεση στην αριστερή κοιλία, HR, καρδιακός ρυθµός, LVEDP τελοδιαστολική πίεση αριστερής κοιλίας. ΝΡ µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία, ΡΕ φαινυλεφρίνη, PRA πραζοσίνη, MU 5 -µεθυλουραπιδίλη, CEC χλωροαιθυλκλονιδίνη. * Ρ<0.05 σε σύγκριση µε ΝΡ, # Ρ<0.05 σε σύγκριση µε ΡΕ. Values represent the mean ± SEM from 6-9 separate experiments. LVDP, Left Ventricular Developed Pressure, HR, Heart Rate, LVEDP, Left Ventricular End Diastolic Pressure, NP, Non-Preconditioned control hearts, PE, Phenylephrine, PRA, Prazosin, MU, MethylUrapidil, CEC, CloroEthylClonidine. * Ρ<0.05 vs. ΝΡ group, # Ρ<0.05 vs. ΡΕ group.

94 88 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (% της τιµής σταθεροποίησης) CEC/MU Ισχαιµία ΝΡ-Μάρτυρες CEC MU Χρόνος (min) Εικόνα 3.5. Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε εµποτισµένες καρδιές µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία (ΝΡ- Μάρτυρες), σε καρδιές που εµποτίστηκαν µε τον ειδικό ανταγωνιστή των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων CEC (CEC) και σε καρδιές που εµποτίστηκαν µε τον α 1Α - ειδικό ανταγωνιστή 5 - µεθυλουραπιδίλη (MU). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-9 καρδιές. Figure 3.5. Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in non-preconditioned control hearts (NP-Control), hearts perfused with α 1Β - irreversible inhibitor CEC (CEC) and hearts perfused with specific antagonist of α 1Α -adrenergic subtype 5 - methylurapidil (MU). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-9 hearts.

95 89 70 Ποσοστό νέκρωσης (% συν. όγκου της καρδιάς) NP MU CEC Εικόνα 3.6. Ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου εκφραζόµενο ως % του συνολικού όγκου της καρδιάς. ΝΡ, καρδιές µάρτυρες χωρίς προετοιµασία. CEC, καρδιές που εµποτίστηκαν µε τον, µη αντιστρεπτό, αναστολέα των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων CEC. MU, καρδιές που εµποτίστηκαν µε 5 -µεθυλουραπιδίλη, ειδικό ανταγωνιστή του α 1Α - υποτύπου των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το ποσοστό νέκρωσης από µία καρδιά. ίπλα σε κάθε οµάδα παρατίθεται ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα. Figure 3.6. Infarct size, expressed as percentage of heart volume. NP, non-preconditioned control hearts. CEC, hearts perfused with α 1Β - irreversible inhibitor CEC. MU, hearts perfused with the specific antagonist of α 1Α -adrenergic subtype 5 - methylurapidil. Open circles represent the individual heart infarct size. The corresponding mean ± SEM is depicted together with the group data.

96 90 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (% της τιµής σταθεροποίησης) MU Ισχαιµία CEC PE PE+MU PE+CEC PE # # # # # # # # # * * * * * * * * * * Χρόνος (min) Εικόνα 3.7. Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη 50 µμ (ΡΕ), σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή των α 1Α -αδρενεργικών υποδοχέων, 5 -µεθυλουραπιδίλη (PE+MU) και σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή των α 1Β - υποδοχέων, CEC (PE+CEC). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας). Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-7 καρδιές. * P<0.05 και # P<0.01 σε σύγκριση µε την οµάδα PE+CEC Figure 3.7. Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in hearts precontitioned with phenylephrine 50 µμ (ΡΕ), in hearts precontitioned with phenylephrine in the presence of α 1Α -adrenergic subtype specific antagonist 5 - methylurapidil (PE+MU) and in hearts precontitioned with phenylephrine in the presence of the specific antagonist of α 1Β - adrenergic subtype CEC (PE+CEC). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-7 hearts. * P<0.05 and # P<0.01 vs. PE+CEC group.

97 91 Ποσοστό νέκρωσης (% συν. όγκου της καρδιάς) #,& #,& 0 NP PE PE+CEC PE+MU Εικόνα 3.8. Ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου εκφραζόµενο ως % του συνολικού όγκου της καρδιάς. ΝΡ, καρδιές µάρτυρες χωρίς προετοιµασία. PE, καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε φαινυλεφρίνη 50 µμ. PE+CEC, καρδιές που προετοιµάστηκαν µε φαινυλεφρίνη παρουσία του µη αντιστρεπτού αναστολέα των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων CEC. PE+MU, καρδιές που προετοιµάστηκαν µε φαινυλεφρίνη παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή των α 1Α - αδρενεργικών υποδοχέων 5 -µεθυλουραπιδίλη. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το ποσοστό νέκρωσης από µία καρδιά. ίπλα σε κάθε οµάδα παρατίθεται ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα SEM. # Ρ<0.01 σε σύγκριση µε τους µάρτυρες, & Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την οµάδα PE+CEC. Figure 3.8. Infarct size, expressed as percentage of heart volume. NP, non-preconditioned control hearts. PE, hearts precontitioned with phenylephrine 50 µμ. PE+CEC, hearts precontitioned with phenylephrine in the presence of irreversible inhibitor of α 1Β -adrenergic receptors CEC. PE+MU, hearts precontitioned with phenylephrine in the presence of α 1Α - specific antagonist 5 -methylurapidil. Open circles represent the individual heart infarct size. The corresponding mean ± SEM is depicted together with the group data. # P<0.01 vs. NP and & P<0.01 vs. PE+CEC.

98 92 Τα παραπάνω αποτελέσµατα αποτελούν µια σειρά ενδείξεων για τη συµµετοχή των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων στον προστατευτικό µηχανισµό της προετοιµασίας µε φαινυλεφρίνη Επίδραση του εµποτισµού µε µεθοξαµίνη στην ανάκτηση της καρδιάς µετά την ισχαιµία Με σκοπό να επιβεβαιωθούν τα προηγούµενα αποτελέσµατα, σύµφωνα µε τα οποία η διέγερση των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων προστατεύει την καρδιά από τις επιπτώσεις της ισχαιµίας, έγιναν ανάλογα πειράµατα χρησιµοποιώντας ως αγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων τη µεθοξαµίνη. Η µεθοξαµίνη σε χαµηλές συγκεντρώσεις είναι ειδικός αγωνιστής των α 1Α -αδρενεργικών υποδοχέων (Τsujimoto και συν. 1989). Έτσι, προκειµένου να επιβεβαιωθεί ότι η προστατευτική δράση της προετοιµασίας της καρδιάς µε φαινυλεφρίνη πραγµατοποιείται µέσω της διέγερσης των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων, επιλέχτηκαν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις µεθοξαµίνης (0.1, 0.5 ή 1 µμ) για την προετοιµασία τριών οµάδων καρδιών αντίστοιχα. Η προετοιµασία µε 0.1 ή 0.5 µμ µεθοξαµίνη (οµάδες ΜΕΤΗ 0.1 και ΜΕΤΗ 0.5) δεν προστάτευσε τις καρδιές από τις επιπτώσεις της 45λεπτης ισχαιµίας (Πίνακας 3.3, Εικόνα 3.9). Πιο συγκεκριµένα, οι καρδιές της οµάδας ΜΕΤΗ 0.1 και ΜΕΤΗ 0.5 ανέκτησαν, στο τέλος του 60λεπτου επανεµποτισµού, την αναπτυσσόµενη πίεση στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε ποσοστό 31.21±4.50% και 36.58±3.67% αντίστοιχα, ενώ οι καρδιές ΜΕΤΗ 1, που προετοιµάστηκαν µε τη µεγαλύτερη συγκέντρωση µεθοξαµίνης (1 µμ), σε ποσοστό 51.10±4.96% (Εικόνα 3.9.). Επίσης, στην οµάδα ΜΕΤΗ 1, το ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου ήταν χαµηλό (25.65±2.35%) και µάλιστα σηµαντικά χαµηλότερο από αυτό που παρατηρήθηκε στους µάρτυρες (P<0.01). Από την άλλη πλευρά το ποσοστό του νεκρωµένου µυοκαρδίου τόσο στην οµάδα ΜΕΤΗ 0.1 (34.58±5.24), όσο και στην οµάδα ΜΕΤΗ 0.5 (37.63±3.50) κυµαίνονταν στα ίδια επίπεδα µε αυτό των µαρτύρων (Εικόνα 3.10). Φαίνεται ότι η προετοιµασία της εµποτισµένης καρδιάς µε χαµηλότερες συγκεντρώσεις µεθοξαµίνης (0.1 και 0.5 µμ) δεν επιφέρει κανένα προστατευτικό αποτέλεσµα έναντι της παρατεταµένης ισχαιµίας. Αντίθετα, ο 5λεπτος εµποτισµός

99 93 ΠΙΝΑΚΑΣ 3.3. Λειτουργικές παράµετροι των εµποτιζόµενων καρδιών στη φάση της σταθεροποίησης και στο τέλος του 60λεπτου επανεµποτισµού, µετά από 45 λεπτά ισχαιµίας. Functional parameters of perfused hearts during stabilization and at the end of the 60 min reperfusion period that follows 45 minutes of sustained ischemia. Σταθεροποίηση 60 λεπτά επανεµποτισµού Οµάδα LVDP (mm Hg) Στεφανιαία ροή (ml/min) HR (χτύποι/min) LVDP (mm Hg) LVEDP (mm Hg) HR x LVDP (χτύποι/min x mm Hg) Στεφανιαία ροή (ml/min) NP ± ± ± ± ± ± ± 0.5 METH ± ± ± ± ± ± ± 0.4 METH ± ± ± ± ± ± ± 0.6 METH ± ± ± ±5.38* 33 ± 3* ± 1898* 6.4 ± 0.4 METH 1+CEC ± ± ± ±3.93# 47 ± ± 1148# 5.3 ± 0.4 METH 1+MU ± ± ± ±5.89* 31 ± 4* ± 2155* 7.1 ± 1.2 Οι τιµές εκφράζονται ως µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα από 6-9 διαφορετικά πειράµατα. LVDP, αναπτυσσόµενη πίεση στην αριστερή κοιλία, HR, καρδιακός ρυθµός, LVEDP τελοδιαστολική πίεση αριστερής κοιλίας. ΝΡ µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία, ΜΕΤΗ µεθοξαµίνη, MU 5 - µεθυλουραπιδίλη, CEC χλωροαιθυλκλονιδίνη. * Ρ<0.05 σε σύγκριση µε ΝΡ, # Ρ<0.01 σε σύγκριση µε ΜΕΤΗ 1. Values represent the mean ± standard error of mean from 6-9 separate experiments. LVDP, Left Ventricular Developed Pressure, HR, HeartRate, LVEDP, Left Ventricular End Diastolic Pressure, NP, Non Preconditioned control hearts, METH, Methoxamine, MU, 5 -methylurapidil, CEC, CloroEthylClonidine. * Ρ<0.05 vs. ΝΡ group, # Ρ<0.05 vs. ΜΕΤΗ 1 group.

100 94 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (% της τιµής σταθεροποίησης) METH Ισχαιµία & * NP-Μάρτυρες METH 0.1 METH 0.5 METH 1 & * * * * # # * * Χρόνος (min) Εικόνα 3.9. Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε εµποτισµένες καρδιές µάρτυρες, χωρίς προετοιµασία (ΝΡ- Μάρτυρες) και σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε τον α 1 -αδρενεργικό αγωνιστή µεθοξαµίνη σε συγκεντρώσεις 0.1 µμ (ΜΕΤΗ 0.1), 0.5 µμ (ΜΕΤΗ 0.5) και 1µΜ (ΜΕΤΗ 1). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-9 καρδιές. * P<0.05 και # P<0.01 σε σύγκριση µε τους µάρτυρες, & Ρ<0.05 σε σύγκριση µε την οµάδα ΜΕΤΗ 0.5. Figure 3.9. Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in non-preconditioned contol hearts and in hearts precontitioned with the α 1 -adrenergic receptor agonist methoxamine in the following concentrations, 0.1 µμ (ΜΕΤΗ 0.1), 0.5 µμ (ΜΕΤΗ 0.5) and 1µΜ (ΜΕΤΗ 1). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-7 hearts. * P<0.05 and # P<0.01 vs. control, & P<0.05 vs. ΜΕΤΗ 0.5 group.

101 95 Ποσοστό νέκρωσης (% συν. όγκου της καρδιάς) NP METH 0.1 METH 0.5 METH 1 # Εικόνα Ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου εκφραζόµενο ως % του συνολικού όγκου της καρδιάς. ΝΡ, καρδιές µάρτυρες χωρίς προετοιµασία. METH 0.1, METH 0.5 και METH 1 καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε τον α 1 -αδρενεργικό αγωνιστή µεθοξαµίνη σε συγκεντρώσεις 0.1 µμ, 0.5 µμ και 1µΜ αντίστοιχα. ίπλα σε κάθε οµάδα παρατίθεται ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα. # Ρ<0.01 σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Figure Infarct size, expressed as percentage of heart volume. NP, non-preconditioned control hearts. METH 0.1, METH 0.5 and METH 1 PE, hearts precontitioned with α 1 - adrenergic agonist methoxamine in concentrations 0.1 µμ, 0.5 µμ and 1µΜ respectively. Open circles represent the individual heart infarct size. The corresponding mean ± SEM is depicted together with the group data. # P<0.01 vs. NP.

102 96 της καρδιάς µε µεθοξαµίνη 1 µμ αποδεικνύεται αποτελεσµατικός, αφού βελτιώνει τον βαθµό λειτουργικής ανάκτησης κατά τον επανεµποτισµό, µειώνοντας ταυτόχρονα το βαθµό νέκρωσης του µυοκαρδίου. Τα αποτελέσµατα αυτά σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι στις χαµηλότερες συγκεντρώσεις µεθοξαµίνης που δοκιµάστηκαν η ένωση αυτή δρα ως ειδικός αγωνιστής των α 1Α - αδρενεργικών υποδοχέων, αποκλείουν ακόµη περισσότερο το ενδεχόµενο της συµµετοχής των α 1Α - αδρενεργικών υποδοχέων στην προστατευτική δράση της προετοιµασίας του µυοκαρδίου. Για να επιβεβαιωθούν τα παραπάνω αποτελέσµατα, χρησιµοποιήθηκαν πάλι οι ειδικοί ανταγωνιστές των υποτύπων των α 1 αδρενεργικών υποδοχέων. Ετσι, όταν µαζί µε τη µεθοξαµίνη 1µΜ προστέθηκε ο ειδικός α 1Β -ανταγωνιστής CEC (οµάδα MΕΤΗ 1+CEC), παρατηρήθηκε απώλεια της προστατευτικής επίδρασης, ενώ αντίθετα, ο ειδικός ανταγωνιστής των α 1Α -αδρενεργικών υποδοχέων 5 -methylurapidyl (οµάδα MΕΤΗ 1 + CEC) δεν εµπόδισε την αποτελεσµατική προετοιµασία της καρδιάς µε 1 µmol/l µεθοξαµίνη (Πίνκας 3.3, Εικόνες 3.11 και 3.12). Όσον αφορά στη λειτουργική ανάκτηση, είναι χαρακτηριστικό ότι οι καρδιές ΜΕΤΗ 1+CEC ανέκτησαν την αναπτυσσόµενη πίεση στην αριστερή κοιλία (LVDP) στο τέλος του 60λεπτου επανεµποτισµού σε ποσοστό µόνο 29.16±3.91%, ενώ οι καρδιές ΜΕΤΗ 1+MU σε ποσοστό 60.49±5.27% (Εικόνα 3.11). Η παρεµπόδιση της αποτελεσµατικής προετοιµασίας της καρδιάς µε 1 µμ µεθοξαµίνη από τον ειδικό ανταγωνιστή των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων φαίνεται επίσης και από το υψηλό ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου που παρατηρήθηκε στις ΜΕΤΗ 1+CEC καρδιές (43.17±3.40%), σε αντίθεση µε το χαµηλό ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου στις καρδιές της οµάδας ΜΕΤΗ 1+MU (23.37±2.12% ) (Εικόνα 3.12). Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώνουν ότι στο µηχανισµό της προετοιµασίας της καρδιάς µε διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων συµµετέχουν οι α 1Β -αδρενεργικοί υποδοχείς, ενώ αντίθετα ο ρόλος των α 1Α υποδοχέων στο φαινόµενο αυτό δείχνει να είναι αµελητέος.

103 97 Αναπτυσσόµενη πίεση αριστερής κοιλίας (% της τιµής σταθεροποίησης) MU CEC Ισχαιµία # METH 1 METH 1 + CEC METH 1 + MU # # # # # # # # # # * * * * * * * # METH Χρόνος (min) Εικόνα Μεταβολή της αναπτυσσόµενης πίεσης στην αριστερή κοιλία (LVDP) σε συνάρτηση µε το χρόνο σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε τον α 1 -αδρενεργικό αγωνιστή µεθοξαµίνη 1µΜ (ΜΕΤΗ 1), σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε µεθοξαµίνη παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή των α 1Α -αδρενεργικών υποδοχέων 5 -µεθυλουραπιδίλη (ΜΕΤΗ 1+ MU) και σε καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε µεθοξαµίνη παρουσία του µη αντιστρεπτού αναστολέα των α 1Β -αδρενεργικών υποδοχέων CEC (ΜΕΤΗ 1+CEC). Οι τιµές της αναπτυσσόµενης πίεσης εκφράζονται ως % των αντίστοιχων τιµών στο τέλος της φάσης σταθεροποίησης (-25 λεπτά). Το 0 αντιστοιχεί στην έναρξη της 45λεπτης ισχαιµίας. Κάθε σηµείο αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα από 6-7 καρδιές. * P<0.05 και # P<0.01 σε σύγκριση µε την οµάδα ΜΕΤΗ 1+ CEC. Figure Time course of left ventricular developed pressure (LVDP) in hearts precontitioned with the α 1 -adrenergic receptor agonist methoxamine 1µΜ (ΜΕΤΗ 1), in hearts preconditioned with methoxamine 1µΜ in the presence of α 1Α -adrenergic subtype specific antagonist 5 -methylurapidil (ΜΕΤΗ 1+MU) and in hearts preconditioned with methoxamine 1µΜ in the presence of α 1Β - specific antagonist CEC (ΜΕΤΗ 1+CEC). LVDP is expressed as % of the respective pre-ischemic values. 0 represents the onset of 45min ischemia. Each point represents mean ± SEM from 6-7 hearts. * P<0.05 and # P<0.01 vs. ΜΕΤΗ 1+ CEC group.

104 98 Ποσοστό νέκρωσης (% συν.όγκου της καρδιάς) # # 0 METH 1 METH 1+CEC METH 1+MU Εικόνα Ποσοστό νέκρωσης του µυοκαρδίου εκφραζόµενο ως % του συνολικού όγκου της καρδιάς. METH 1, καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε µεθοξαµίνη 1µΜ. METH 1+ΜU, καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε µεθοξαµίνη παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή των α 1Α - αδρενεργικών υποδοχέων, 5 -µεθυλουραπιδίλη. METH 1+CEC, καρδιές που «προετοιµάστηκαν» µε µεθοξαµίνη παρουσία του µη αντιστρεπτού αναστολέα των α 1Β - αδρενεργικών υποδοχέων, CEC (ΜΕΤΗ 1+CEC). ίπλα σε κάθε οµάδα παρατίθεται ο µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα. # Ρ<0.01 σε σύγκριση µε την οµάδα METH 1+CEC. Figure Infarct size, expressed as percentage of heart volume. (ΜΕΤΗ 1), hearts precontitioned with the α 1 -adrenergic receptor agonist methoxamine 1µΜ. ΜΕΤΗ 1+MU, hearts preconditioned with methoxamine 1µΜ in the presence of α 1Α -adrenergic subtype specific antagonist 5 -methylurapidil. ΜΕΤΗ 1+CEC, hearts preconditioned with methoxamine 1µΜ in the presence of α 1Β - specific antagonist CEC. Open circles represent the individual heart infarct size. The corresponding mean ± SEM is depicted together with the group data. # P<0.01 vs ΜΕΤΗ 1 + CEC group.

105 99 V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 1. Προσδιορισµός των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά αρουραίου Είναι γενικώς αποδεκτό ότι οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς εκφράζονται στην καρδιά του αρουραίου (Minneman και Esbenshade 1994, Graham και συν. 1996, Zhong και Minneman 1999, Michelotti και συν. 2000, Rockman και συν. 2002). Στο συµπέρασµα αυτό συγκλίνουν τα δεδοµένα µελετών µε ειδικούς ανταγωνιστές ή αγωνιστές (Hanft και Gross 1989, Han και Minneman 1991, Lazou και συν. 1994) και πειραµάτων µοριακής βιολογίας (Lomasney και συν. 1991, Perez και συν. 1994, Rokosh και συν. 1994). Παρόλα αυτά θεωρήσαµε σκόπιµο να ανιχνεύσουµε τους υποδοχείς αυτούς στα καρδιακά κύτταρα µε πειράµατα σύνδεσης [ 3 Η]πραζοσίνης σε κλάσµατα κυτταρικών µεµβρανών, πριν προχωρήσουµε στη µελέτη της ύπαρξης του υποτύπου α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων στον ιστό αυτό (Εικόνα 1.1, Πίνακας 1.1). Η δέσµευση της ραδιενεργά σηµασµένης πραζοσίνης, η οποία όπως έχουµε αναφέρει είναι ειδικός ανταγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, σε παρασκευάσµατα κυτταρικών µεµβρανών από καρδιά αρουραίου, όπως εκτιµήθηκε από τα αντίστοιχα γραφήµατα, επιβεβαιώνει ουσιαστικά ήδη γνωστά δεδοµένα σχετικά µε την ύπαρξη και τη σχετική αφθονία (πυκνότητα) των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στον ιστό αυτό (Lazou και συν. 1994). Από την γραµµικότητα της καµπύλης Scatchard προκύπτει ότι η [ 3 Η]πραζοσίνη συνδέεται στις αντίστοιχες θέσεις των κυτταρικών µεµβρανών, χωρίς να υπάρχει κάποια επιλεκτικότητα ως προς τους διαφορετικούς υποτύπους των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων. Η οµοιόµορφη σύνδεση της ένωσης αυτής επιβεβαιώνει ουσιαστικά το γεγονός ότι οι υποτύποι των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων έχουν παραπλήσια συγγένεια για την [ 3 Η]πραζοσίνη. Η τιµή του αρνητικού δεκαδικού λογάριθµου της σταθεράς διάστασης που υπολογίστηκε (pk d : 9.71±0.095) είναι συγκρίσιµη µε τις αντίστοιχες τιµές που αναφέρονται από άλλους ερευνητές (10.13±0.08, Lazou και συν. 1994). Ο µέγιστος αριθµός των θέσεων δέσµευσης που βρέθηκε µε βάση το γράφηµα Scatchard (Βmax: 23.4±11.2 fmol/mg πρωτεΐνης) αποτελεί µία εκτίµηση της σχετικής αφθονίας των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου αλλά δεν µπορεί να συγκριθεί άµεσα µε αυτή που αναφέρεται από τους Lazou και συν. (1994) γιατί εκφράζονται σε διαφορετικές µονάδες.

106 100 Γενικά, όσον αφορά στη σχετική αφθονία (πυκνότητα) των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, υπάρχει η εκτίµηση ότι ποικίλει στα διάφορα είδη. Το µυοκάρδιο του αρουραίου και του κουνελιού εµφανίζουν τις υψηλότερες πυκνότητες σε σχέση µε άλλα γνωστά είδη (Terzic και συν. 1993). Σε µία σχετική εργασία, οι Mukherjee και συν. (1983) προσδιόρισαν την πυκνότητα των θέσεων δέσµευσης σε µεµβρανικά κλάσµατα από καρδιές αρουραίου, κουνελιού, σκύλου και γάτας βρίσκοντας τις τιµές 167, 191, 55 και 15 fmol/mg πρωτεΐνης, αντίστοιχα. ε γνωρίζουµε τις ακριβείς αιτίες της µεγάλης απόκλισης που υπάρχει µεταξύ της Βmax που αναφέρεται στην προηγούµενη εργασία και των αντίστοιχων τιµών της δικής µας, όσο και των άλλων εργασιών που αναφέρονται παραπάνω. Πιθανόν να σχετίζεται µε µεταβολές της πυκνότητας των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια του οργανισµού, φαινόµενο που έχει παρατηρηθεί στο µυοκάρδιο του αρουραίου, του κουνελιού και του σκύλου (Buchtal και συν. 1987, Han και συν. 1989, Nakanishi και συν. 1989, Del Balzo και συν. 1990). Συγκεκριµένα, έχει παρατηρηθεί ότι πληθυσµός των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά των ενήλικων ζώων είναι σηµαντικά µειωµένος σε σχέση µε την καρδιά των νεογέννητων ατόµων και συνεχίζει να µειώνεται µε την πάροδο της ηλικίας (Kimball και συν. 1991). Η µείωση αυτή δε συνοδεύεται από µεταβολές της συγγένειας των υποδοχέων. Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζει η εργασία των Buxton και Brunton (1986), οι οποίοι χρησιµοποιώντας [ 3 Η]πραζοσίνη υπολόγισαν ότι ένα καρδιακό µυοκύτταρο ενήλικου αρουραίου διαθέτει α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς ή 13 α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς/µm 2. Τέλος, ο πληθυσµός των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων φαίνεται ότι κατανέµεται οµοιόµορφα µεταξύ της αριστερής και της δεξιάς κοιλίας στην καρδιά του αρουραίου (Muntz και συν. 1985), αν και σε άλλα είδη φαίνεται ότι οι κοιλίες κατέχουν µεγαλύτερη πυκνότητα α 1 -υποδοχέων από τους κόλπους (Steinfath και συν. 1992) Έκφραση του υποτύπου α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά αρουραίου Για αρκετά µεγάλο χρονικό διάστηµα υπήρχε ασυµφωνία όσον αφορά στην ετερογένεια των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων και στον αριθµό των διαφορετικών υποτύπων. Με βάση τους µέχρι πρότινος διαθέσιµους ειδικούς αγωνιστές και ανταγωνιστές, οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς διακρίνονταν σε δύο υποτύπους, τον α 1Α - και τον α 1Β -. Έτσι, το WB 4101 αρχικά (Morrow και Creese 1986) και στη συνέχεια

107 101 άλλοι ειδικοί ανταγωνιστές, όπως το CEC (Han και συν. 1987), η 5 - µεθυλουραπιδίλη (Gross και συν. 1988) και η (+)-νιγουλδιπίνη (Boer και συν. 1989) απέβησαν χρήσιµες για το διαχωρισµό και την ταυτοποίηση των δύο υποτύπων. Από την άλλη πλευρά, η κλωνοποίηση των cdna ή των γονιδίων που κωδικοποιούν τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς στον άνθρωπο και σε άλλα είδη αποκάλυψε την ύπαρξη µεγαλύτερης ετερογένειας, η οποία δεν µπορούσε να καλυφθεί από την υπάρχουσα ταξινόµηση (Cotecchia και συν. 1988, Schwinn και συν. 1990, Lomasney και συν. 1991, Perez και συν. 1991, Ramarao και συν. 1992, Hirasawa και συν. 1993, Forray και συν. 1994, Esbenshade και συν. 1995, Schwinn και συν. 1995, Tseng-Crang και συν. 1995). Φάνηκε, λοιπόν, ότι η ετερογένεια των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων δεν εξαντλείται στην ύπαρξη δύο µόνο υποτύπων. Η ανεύρεση και χρησιµοποίηση µίας ειδικής επιλεκτικής ένωσης, του ΒΜΥ 7378 (Saussy και συν. 1994, Goetz και συν. 1995, Piascik και συν. 1995) ξεδιάλυνε την υπάρχουσα σύγχυση, συµβάλλοντας έτσι στη διαµόρφωση ενός συστήµατος ταξινόµησης βασιζόµενου στον συγκερασµό των µελετών σε πρωτεϊνικό επίπεδο από τη µία µε τα ευρήµατα των τεχνικών κλωνοποίησης από την άλλη. ιαπιστώθηκε ότι το ΒΜΥ 7378 ανέστειλε τη δέσµευση του [ 125 Ι] ΗΕΑΤ στον υποτύπο α 1d - των αδρενεργικών υποδοχέων αρουραίου µε pk i : 8.2±0.06, ενώ για τον κλωνοποιηµένο υποτύπο α 1b - του χάµστερ η αντίστοιχη τιµή pk i ήταν 6.2±0.03 και για τον κλωνοποιηµένο α 1a - του βοδιού 6.1±0.02 (Goetz και συν. 1995). Επιπλέον, σε πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης µε [ 3 Η]πραζοσίνη, το ΒΜΥ 7378 επέδειξε υψηλή συγγένεια για τον κλωνοποιηµένο υποτύπο α 1d του ανθρώπου µε pk i : 8.2±0.10 σε σχέση µε τους κλωνοποιηµένους υποτύπους α 1a - (pk i : 6.2±0.10), και α 1b - (pk i : 6.7±0.11) (Kenny και συν. 1995) (Πίνακας 1). Το BMY 7378 χρησιµοποιήθηκε σε πειράµατα ανταγωνιστικής δέσµευσης για να εξακριβωθεί αν και σε ποιο βαθµό εκφράζεται ο υποτύπος α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του ενήλικου αρουραίου. Οι καµπύλες αναστολής σύνδεσης της [ 3 Η]πραζοσίνης από το BMY 7378 έδειξαν καλύτερη προσαρµογή στο µοντέλο δύο ειδικών θέσεων σύνδεσης, µε τις θέσεις υψηλής συγγένειας, που αντιστοιχούν στους α 1D -αδρενεργικούς υποδοχείς, να αποτελούν το 28% περίπου των συνολικών θέσεων ειδικής σύνδεσης (Εικόνα 1.2, Πίνακας 1.1). Για τις θέσεις υψηλής συγγένειας ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της σταθεράς αναστολής (pk i :

108 ±0.26) δείχνει να συµφωνεί µε την αντίστοιχη τιµή που είναι γνωστή για τον κλωνοποιηµένο α 1d - υποτύπο 8.94±0.05 (Πίνακας 1). ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Σταθερές συγγένειας των κλωνοποιηµένων υπoτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων για την αδρεναλίνη, τον ειδικό ανταγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων πραζοσίνη και τους α 1Α - και α 1D - ειδικούς ανταγωνιστές, 5 - µεθυλουραπιδίλη και BMY 7378 αντίστοιχα. Βinding affinities for the cloned α 1 -adrenergic receptor subtypes of adrenaline, prazosin and α 1Α - and α 1D - specific antagonists 5 -methylurapidil and BMY 7378 respectively. Κλωνοποιηµένοι α 1 - αδρενεργικοί υποδοχείς Συνδέτης α 1Α α 1b α 1d Αδρεναλίνη 6,06 ± 0,07 b 6,03 ± 0,04 b 7,45 ± 0,03 b 5 ΜU 8,63 ± 0,32 c 6,97 ± 0,50 c 7,31 ± 0,66 c BMY ,57 ± 0,02 b 6,77 ± 0,03 b 8,94 ± 0,05 b Πραζοσίνη 9,52 ± 0,38 c 9,79 ± 0,38 c 9,63 ± 0,40 c pk i pk i είναι ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της σταθεράς αναστολής Κ i. 5 MU, 5 - µεθυλουραπιδίλη. Οι σταθερές συγγένειας των κλωνοπoιηµένων α 1 -αδρενεργικών υποτύπων που παρατίθενται προέρχονται από τις ακόλουθες εργασίες: b Yang και συν. 1997, c Michel και συν pk i represents the negative logarithm of inhibition constant (Κ i ). 5 MU, 5 methylurapidil. Affinity constants for the cloned mammalian α 1 -adrenoreceptors were obtained from the following reports: b Yang et al. 1997, c Michel et al Από τα αποτελέσµατα αυτά φαίνεται ότι ο υποτύπος α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων εκφράζεται στα καρδιακά κύτταρα του ενήλικου αρουραίου και µάλιστα σε ποσοστό σχετικά υψηλό. Γενικά, η κατανοµή των τριών υποτύπων των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων στους ιστούς του αρουραίου έχει αποσαφηνιστεί σε επίπεδο mrna (Alonso-Llamazares και συν. 1993, Faure και συν. 1994, Rokosh και συν. 1994, Perez και συν. 1994, Price και συν. 1994b, Stewart και συν. 1994, Wenham και συν. 1997, Wolff και Scofield 1998). Πέρα από τις όποιες διαφορές στα αναφερόµενα επίπεδα έκφρασης του καθενός υποτύπου των αδρενεργικών υποδοχέων, έχει αποδειχθεί ότι στον αρουραίο το mrna του υποτύπου α 1Α - ανιχνεύεται στην καρδιά, τους πνεύµονες, τους σπερµατικούς αγωγούς και τους σιελογόνους αδένες, ενώ απουσιάζει από τον σπλήνα και το ήπαρ. Ακόµη ο υποτύπος α 1Β - των αδρενεργικών

109 103 υποδοχέων φαίνεται ότι αφθονεί στο ήπαρ και στην καρδιά, ενώ δεν ανιχνεύεται στον ιππόκαµπο, στους σιελογόνους αδένες και στην αορτή. Τέλος, ο α 1D -υποτύπος εντοπίζεται στην αορτή, στην καρδιά και στους πνεύµονες, όχι όµως και στο ήπαρ ή το νεφρό του αρουραίου. Η κατανοµή των α 1Α - και α 1Β - υποτύπων έχει επίσης µελετηθεί και σε επίπεδο πρωτεΐνης, µε πειράµατα σύνδεσης µε ραδιενεργά σηµασµένο συνδέτη (Hanft και Gross 1989, Han και Minneman 1991, Michel και συν. 1993, Lazou και συν. 1994, Michel και συν. 1994a). Όσον αφορά στην έκφραση των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου, είχε διαµορφωθεί η άποψη ότι στο συγκεκριµένο ιστό είναι ανιχνεύσιµοι τόσο ο α 1Α -, σε σχετικά µικρότερο ποσοστό (περίπου 25%), όσο και ο α 1Β -, ο οποίος και αποτελεί το µεγαλύτερο ποσοστό του πληθυσµού των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στο µυοκάρδιο (περίπου 75%). Θα πρέπει, ωστόσο, να ληφθεί υπ όψιν ότι η απουσία ενδείξεων για την ύπαρξη του υποτύπου α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων θα µπορούσε να οφείλεται στη µακροχρόνια έλλειψη των κατάλληλων ανταγωνιστών για το συγκεκριµένο υποτύπο υποδοχέων. Έτσι, σύµφωνα µε τα δεδοµένα των πειραµάτων της µελέτης αυτής που βασίστηκαν στη χρήση του ΒΜΥ 7378, θα πρέπει να αναθεωρήσουµε την παραπάνω αναφερόµενη κατανοµή των υποτύπων των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων, σύµφωνα µε την οποία στην καρδιά του αρουραίου εκφράζονται δύο υποτύποι, ο α 1Α - και ο α 1Β -, σε αναλογία 25% και 75% αντίστοιχα. Φαίνεται ότι στις κοιλίες της καρδιάς του ενήλικου αρουραίου εκφράζονται και οι τρεις υποτύποι των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, α 1Α -, α 1Β - και α 1D - σε αναλογία περίπου 20, 50, και 30% αντίστοιχα. Τα παραπάνω αποτελέσµατα συµφωνούν µε τη εργασία των Zhang και συν. (1999), οι οποίοι µελέτησαν την κατανοµή των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου µε πειράµατα σύνδεσης 125 ΙΒΕ και παράλληλα ανίχνευσαν τα αντίστοιχα επίπεδα mrna των α 1 - αδρενεργικών υποτύπων µε δοκιµασίες προστασίας από RNAαση. Στα πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης παρουσία BMY 7378, ανιχνεύθηκαν θέσεις υψηλής συγγένειας (pk i : 8.8±0.1 στις κοιλίες, 8.7±0.3 στους κόλπους) σε ποσοστό που αναλογούσε στο 30 % περίπου του συνολικού πληθυσµού των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων. Επίσης, σχετικά µε τους άλλους δύο υποτύπους, ο α 1Α - φαίνεται να κατέχει ίδιο ποσοστό µε τους α 1D -, 30%, µε το υπόλοιπο 40% να καταλαµβάνεται από τον υποτύπο α 1Β - των αδρενεργικών υποδοχέων. Τα αντίστοιχα mrnas των τριών υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων ανιχνεύτηκαν σε ποσοστά

110 104 παραπλήσια µε αυτά που προσδιορίστηκαν από τα πειράµατα ανταγωνιστικής σύνδεσης. Παρ όλα αυτά, άλλοι ερευνητές αµφισβητούν την ύπαρξη των α 1D - αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου (Deng και συν. 1996a, Wolff και Scofield 1998). Συγκεκριµένα, ο Deng και συν. (1996a) ανέφεραν ότι το BMY 7378 ανέστειλε τη σύνδεση της [ 3 Η]πραζοσίνης σε κυτταρικές µεµβράνες της δεξιάς κοιλίας µε µονοφασικό τρόπο, εµφανίζοντας µέτρια ανασταλτική ισχύ (pk i : 7.47±0.1). Eπίσης, το BMY 7378 ανέστειλε µε µονοφασικό τρόπο την ινοτροπική δράση της φαινυλεφρίνης σε λωρίδες µυϊκού ιστού από τη δεξιά κοιλία καρδιάς αρουραίου (pα 2 : 7.0±0.11). Η συγκεκριµένη τιµή της pk i, περίπου 100 φορές µικρότερη από αυτήν που προσδιορίσαµε στα δικά µας πειράµατα, δε θα µπορούσε ασφαλώς να αποτελεί πειστική ένδειξη της έκφρασης των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων. Οι ερευνητές αυτοί θεωρούν ότι η συµµετοχή των υποτύπων αυτών στην καρδιά του αρουραίου είναι αµελητέα και δε σχετίζεται µε την ινοτροπική δράση των αδρενεργικών αγωνιστών. Αφήνεται, όµως, να εννοηθεί ότι οι α 1D -αδρενεργικοί υποδοχείς θα πρέπει να εκφράζονται στο συγκεκριµένο ιστό, κυρίως λόγω του γεγονότος ότι το αντίστοιχο mrna ανιχνεύεται στο µυοκάρδιο του αρουραίου (Perez και συν. 1994, Price και συν. 1994a, Rokosh και συν. 1994, Stewart και συν. 1994) Συµµετοχή των α 1D -αδρενεργικών υποδοχέων στην υδρόλυση των PtdIns Αφού διαπιστώθηκε η ύπαρξη των α 1D -αδρενεργικών υποδοχεών στην καρδιά του αρουραίου σε σχετικά υψηλά ποσοστά, εξετάστηκε στη συνέχεια αν αυτοί συµβάλλουν στην υδρόλυση των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης (PtdIns), που επάγεται ύστερα από α 1 -αδρενεργική διέγερση. Όσον αφορά στους α 1Α - και α 1Β -αδρενεργικούς υποδοχείς, έχει διαπιστωθεί από προηγούµενες µελέτες ότι και οι δύο συµµετέχουν στη διέγερση της υδρόλυσης των µεµβρανικών PtdIns, που επάγεται από την α 1 -αδρενεργική διέγερση σε καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου (Lazou και συν. 1994, Deng και συν. 1996b). Το BMY 7378 ανέστειλε την υδρόλυση των PtdIns που προκαλεί η αδρεναλίνη, µε χαµηλή σταθερά συγγένειας, ενδεικτική της συµµετοχής των υποτύπων α 1Α - ή α 1Β - των αδρενεργικών υποδοχέων στη συγκεκριµένη απόκριση. εν υπήρξε καµία ένδειξη για κάποια υψηλή σταθερά συγγένειας, που να υποδηλώνει τη συµµετοχή του υποτύπου α 1D - (Εικόνα 1.3). Επιπρόσθετα, η καµπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης της παραγωγής InsP, που επάγεται από την αδρεναλίνη, δε µεταβλήθηκε από την

111 105 παρουσία του ΒΜΥ 7378 στη συγκέντρωση 100 nμ. Η συγκέντρωση αυτή κυµαίνεται στα επίπεδα της K d της [ 3 Η]πραζοσίνης που προσδιορίστηκε από τα αντίστοιχα πειράµατα. Σηµαντική µείωση της µέγιστης απόκρισης και της τιµής EC 50 παρατηρήθηκε σε σχετικά µεγάλες συγκεντρώσεις του ΒΜΥ 7378 ( 1µΜ), στις οποίες αναµένεται ότι αναστέλλονται, µη ειδικά, οι υποτύποι α 1Α - και α 1Β - των αδρενεργικών υποδοχέων. Όσον αφορά στην τιµή pa 2 που υπολογίστηκε από το γράφηµα Schild, αυτή δεν συσχετίζονταν µε την υψηλής συγγένειας pk i που εµφανίζει το BMY 7378 για τις µεµβράνες των καρδιακών µυοκυττάρων (Εικόνα 1.4, Πίνακας 1.2). Από τα δεδοµένα αυτά φαίνεται ότι οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς, που είναι ευαίσθητοι σε χαµηλές συγκεντρώσεις του BMY 7378, δε συνδέονται µε τη διέγερση της υδρόλυσης των PtdIns η οποία θα πρέπει να πραγµατοποιείται µέσω της ενεργοποίησης των υποτύπων που έχουν χαµηλή συγγένεια για το ΒΜΥ 7378 δηλαδή των α 1Α - ή/και α 1Β -. Σε παρόµοια συµπεράσµατα κατέληξαν οι Yang και Endoh (1997) για τα καρδιακά κύτταρα κουνελιού. Μελετώντας τη συµµετοχή των α 1D - αδρενεργικών υποδοχέων στη ρύθµιση της καρδιακής σύσπασης και στην υδρόλυση των PtdIns, παρατήρησαν ότι το ΒΜΥ 7378 ανέστειλε τη θετική ινότροπο δράση της φαινυλεφρίνης σύµφωνα µε το διφασικό πρότυπο που αντιστοιχεί σε δύο θέσεις δέσµευσης. Όµως, η υδρόλυση των µεµβρανικών φωσφολιπιδίων δεν επηρεάστηκε από το ΒΜΥ 7378 σε συγκεντρώσεις που έφταναν µέχρι τα 10 nm. Σηµαντική µείωση στα επίπεδα των παραγόµενων [ 3 Η]InsPs παρατηρήθηκε σε σχετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις (100 nm-1µμ), οι οποίες δε θεωρούνται ενδεικτικές της ειδικής δράσης του στους α 1D -αδρενεργικούς υποδοχείς (Yang και συν. 1997). Επίσης, πειράµατα σε τοµές από το θάλαµο εγκεφάλου του αρουραίου έδειξαν ότι οι α 1D -αδρενεργικοί υποδοχείς δε σχετίζονται µε την παραγωγή των InsPs (Trejo και συν. 1996). Το ΒΜΥ 7378 εµφάνισε χαµηλή αποτελεσµατικότητα προκαλώντας 49% αναστολή των [ 3 Η]InsPs, που παράγονται ύστερα από επίδραση µε νοραδρεναλίνη, σε σχετικά µεγάλες συγκεντρώσεις. Η τιµή pk i που υπολογίστηκε για το ΒΜΥ 7378 από τα πειράµατα αυτά ήταν 6.9. Η παραγωγή [ 3 Η]InsPs ύστερα από α 1 -αδρενεργική διέγερση µε νοραδρεναλίνη οφειλόταν στην ενεργοποίηση των υποτύπων α 1Α- και α 1Β-. Είναι ενδιαφέρον ότι τα αποτελέσµατα άλλων µελετών που έγιναν σε µετασχηµατισµένα κύτταρα, που εξέφραζαν κλωνοποιηµένους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς (ετερόλογη έκφραση), οδηγούν σε αντίθετα συµπεράσµατα όσον αφορά

112 106 στη συµµετοχή του υποτύπου α 1D - στην υδρόλυση των PtdIns. Ειδικότερα παρατηρήθηκε ότι η ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C και η επακόλουθη αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων Ca 2+, µέσω της παραγωγής InsPs, επάγεται όχι µόνο από τους υποτύπους α 1Α - ή α 1Β - αλλά και από τον υποτύπο α 1D - (Schwinn και συν. 1991, 1995, Tseng-Crank και συν. 1995, Theroux και συν. 1996, Vasquez-Prado και Garcia-Sainz 1996, Taguchi και συν. 1998). Οι Schwinn και συν. (1991) ανέφεραν µάλιστα ότι ο α 1Α - υποτύπος φάνηκε περισσότερο αποτελεσµατικός από τον α 1Β - στην ενεργοποίηση της παραγωγής InsPs. Μία πιο συστηµατική µελέτη και σύγκριση των κλωνοποιηµένων α 1 -αδρενεργικών υποτύπων ανθρώπου, που εκφράστηκαν σε παρόµοιες πυκνότητες σε ανθρώπινα εµβρυϊκά κύτταρα νεφρού της σειράς 293, έγινε από τον Theroux και συν. (1996). Οι ερευνητές αυτοί παρατήρησαν σηµαντικές διαφορές στην ικανότητα των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων να προκαλέσουν συσσώρευση των προϊόντων υδρόλυσης της ΡtdInsΡ 2 και αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων Ca 2+. Συγκεκριµένα, παρατηρήθηκε ότι ο υποτύπος α 1Α - είναι περισσότερο αποτελεσµατικός από τον υποτύπο α 1Β -, και ο υποτύπος α 1D - είναι ο λιγότερο αποτελεσµατικός από τους τρεις. Παρόµοια αποτελέσµατα προέκυψαν από πειράµατα σε ανθρώπινα κύτταρα του νευρικού επιθηλίου (SKNMC), όπου η ενεργοποίηση του καθενός από τους τρεις υποτύπους είχε ανόµοια αποτελέσµατα όσον αφορά στη µέγιστη απόκριση της παραγωγής InsPs (α 1Α - > α 1Β - α 1D -) και της αύξησης του ενδοκυτταρικού Ca 2+ (α 1Α - > α 1Β - > α 1D -) (Theroux και συν. 1996). Η ίδια σειρά στην αποτελεσµατικότητα των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων παρατηρήθηκε σε ανάλογα πειράµατα µε κλωνοποιηµένους υποτύπους α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων ανθρώπου σε ινοβλάστες αρουραίου τύπου 1 (Taguchi και συν. 1998). Από τις µελέτες αυτές φαίνεται λοιπόν ότι το µονοπάτι υδρόλυσης των µεµβρανικών PtdIns µπορεί να ενεργοποιείται και από τους τρεις υποτύπους. Ωστόσο, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη η διαπιστωµένη διαφοροποίησή τους όσον αφορά στην αποτελεσµατικότητα µε την οποία φαίνεται να επάγουν το σχηµατισµό InsPs. Το δεδοµένο αυτό σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι καθένας από τους κλωνοποιηµένους υποτύπους εκφραζόταν σε πυκνότητα πολύ µεγαλύτερη από αυτή που προσδιορίσαµε για τους α 1 -υποδοχείς συνολικά στην καρδιά του αρουραίου, για παράδειγµα στην εργασία των Taguchi και συν. (1998) η πυκνότητα των α 1D - ήταν 150±14 fmol/mg πρωτεΐνης και των α 1Β ±703 fmol/mg πρωτεΐνης), αποτελούν στοιχεία στα οποία µπορεί να αποδοθεί εν µέρει η διάσταση

113 107 των απόψεών µας όσον αφορά τη συµµετοχή των α 1D - στην υδρόλυση των µεµβρανικών φωσφολιπιδίων. Γενικά, η συνύπαρξη και των τριών υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου δυσχεραίνει τις προσπάθειες που γίνονται για την εξακρίβωση του ρόλου που έχει ο καθένας από αυτούς στη λειτουργία του µυοκαρδίου. Αν και υπάρχουν ορισµένες ενδείξεις σχετικά µε τη φυσιολογική σηµασία των υποτύπων των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά του αρουραίου, η κατάσταση δεν έχει ξεκαθαριστεί ακόµη. Έτσι, η υπερτροφία των καρδιακών κυττάρων νεογέννητων αρουραίων που προκαλείται από κατεχολαµίνες φαίνεται ότι πραγµατοποιείται µέσω των α 1Α - (Knowlton και συν. 1993). Επίσης, σύµφωνα µε µια άλλη µελέτη, ο υποτύπος α 1Α - συνδέεται κατά προτίµηση µε το µονοπάτι της υδρόλυσης των PtdIns, ενώ ο υποτύπος α 1Β - συνδέεται κατά προτίµηση µε το µονοπάτι των ενεργοποιούµενων από µιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (Wenham και συν. 1997). Όσον αφορά στη θετική ινότροπη δράση των κατεχολαµινών στην καρδιά του αρουραίου, υπάρχουν δεδοµένα που δείχνουν ότι εκδηλώνεται µέσω της ενεργοποίησης των υποτύπων α 1Α - και α 1Β - (Michel και συν. 1994b, Williamson και συν. 1994, Deng και συν. 1996a), αν και φαίνεται ότι ο υποτύπος α 1Β - έχει τον κύριο ρόλο σε αυτήν τη διαδικασία (Takanasi και συν. 1991, Endoh και συν. 1992, Michel και συν. 1994b, Yu και Han 1994). Αντίθετα, ο ρόλος του υποτύπου α 1D - στη λειτουργία αυτή φαίνεται ότι είναι ελάσσονος σηµασίας στην καρδιά του ενήλικου αρουραίου (Deng και συν. 1996a, Zang και συν. 1999), αλλά και στο µυοκάρδιο νεογέννητου αρουραίου (Deng και Varma 1997). Oι α 1D -υποδοχείς φαίνεται ότι παίζουν σηµαντικό ρόλο στη σύσπαση της αορτής αρουραίου (Goetz και συν. 1995, Kenny και συν. 1995, Piascik και συν. 1995, Testa και συν. 1995), της λαγόνιας αρτηρίας, της καρωτίδας, της µεσεντερικής, µηριαίας και νεφρικής αρτηρίας (Villalobos-Molina και Ibarra 1996, Ibarra και συν. 1997, Piascik και συν. 1997, Villalobos-Molina και συν. 1997). Η συµµετοχή, κυρίως, του υποτύπου α 1D - στη σύσπαση των αποµονωµένων αρτηριών αρουραίου υποδηλώνει ότι ο υποδοχέας αυτός µπορεί να είναι βασικός ρυθµιστής του περιφερειακού αγγειακού τόνου. Η υπόθεση αυτή επιβεβαιώθηκε σε φυσιολογικούς, µη υπερτασικούς αρουραίους, όπου οι τονικές αποκρίσεις σε α 1 -αδρενεργική ή νευρική διέγερση αναστέλλονταν πλήρως από ειδικούς ανταγωνιστές των α 1D -υποδοχέων ( Zhou και συν. 1996, Ibarra και συν. 1997, Castillio και συν. 1998). Φαίνεται όµως ότι οι α 1D - δε σχετίζονται µόνο µε την αγγειακή σύσπαση, αλλά, επίσης, συνδέονται µε την αγγειακή υπερτροφία. Σύµφωνα

114 108 µε µία µελέτη, ο υποτύπος α 1D - των αδρενεργικών υποδοχέων µεσολαβεί στην υπερτροφική απόκριση του λείου µυός της αορτής αρουραίου στην νοραδρεναλίνη (Xin και συν. 1997). Φαίνεται ότι στην περίπτωση αυτή η δράση τους εκδηλώνεται µε την ενεργοποίηση του µονοπατιού των ΜΑΡΚs. 2. Ο ρόλος του Ca 2+ στην υδρόλυση των φωσφολιπιδίων που επάγει η α 1 -αδρενεργική διέγερση. Όπως έχει αναφερθεί και στην εισαγωγή, η ενεργοποίηση του µονοπατιού της υδρόλυσης των µεµβρανικών φωφσφολιπιδίων από τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς προάγει την κινητοποίηση των εσωτερικών αποθεµάτων Ca 2+ και την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (Berridge 1984, 1987, Minneman 1988, Berridge και Irvine 1989, Terzic και συν. 1993, Minneman και Esbenshade 1994). Οι µεταβολές της συγκέντρωσης των ελευθέρων ιόντων ασβεστίου στο κυτταρόπλασµα αποτελούν ένα σηµαντικό παράγοντα του µηχανισµού µεταγωγής µηνύµατος στα κύτταρα, µέσω του οποίου το εξωκυτταρικό µήνυµα µεταγάγεται προς διάφορους τελικούς αποδέκτες (Putney και συν. 1993, Berridge 1995, Clapham 1995, Barritt 1999). Η α 1 -αδρενεργική διέγερση επάγει το σχηµατισµό τριφωσφορικής ινοσιτόλης η οποία συνδεόµενη µε ειδικούς υποδοχείς του ενδοπλασµατικού δικτύου προκαλεί την απελευθέρωση ιόντων Ca 2+ (Berridge και Irvine 1989, Ferris και Snyder 1992, Henzi και MacDermott 1992). Έτσι, φαίνεται ότι η µεταβολή της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου, που προκαλεί η ενεργοποίηση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, δε σχετίζεται µε την εισροή ιόντων Ca 2+ από τον εξωκυττάριο χώρο. Ωστόσο, σχετικές µελέτες που έγιναν σε διάφορους ιστούς, έδειξαν ότι οι αποκρίσεις στην α 1 -αδρενεργική διέγερση εξαρτώνται από την εισροή ιόντων Ca 2+ στο κυτταρόπλασµα µέσω των τασεοελεγχόµενων και µη καναλιών Ca 2+ (Han και συν. 1987, Eberhard και Holz 1988, Minneman 1988, Baird και Nahorski 1990, Summers και McMartin 1993, Minneman και Esbenshade 1994). Αρχικά, σε µια προσπάθεια να εξηγηθεί το φαινόµενο αυτό, διατυπώθηκε η υπόθεση ότι ο υποτύπος α 1Α - προάγει την εισροή ιόντων Ca 2+ µέσω της αλληλεπίδρασης µε συγκεκριµένα κανάλια Ca 2+, ενώ ο α 1Β - είναι αυτός που συνδέεται µε το κλασικό µονοπάτι της υδρόλυσης των µεµβρανικών φωσφολιπιδίων (Han και συν. 1987, Tsujimoto και συν. 1989, Han και συν. 1990, Suzuki και συν. 1990, Han και Minneman 1991). Ωστόσο, η υπόθεση αυτή έχει ουσιαστικά εγκαταλειφθεί, καθώς είναι πλέον εµφανές ότι η υδρόλυση των

115 109 Ptdlns δεν προκαλείται αποκλειστικά από τη διέγερση ενός µόνο υποτύπου των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων (Graham και συν. 1996, Zhong και Minnerman 1999, Deng και Varma 2000, Michellotti και συν. 2000). Στην καρδιά του ενήλικου αρουραίου για παράδειγµα, η παραγωγή φωσφορικής ινοσιτόλης (InsP) που επάγεται από αδρενεργική διέγερση συνδέεται µε την ενεργοποίηση τόσο του υποτύπου α 1Α - όσο και του υποτύπου α 1Β - (Lazou και συν. 1994, Michel και συν. 1994a, Deng και συν.1996b). Θεωρείται πιθανότερο οι α 1Α - και α 1Β - αδρενεργικοί υποδοχείς να ενεργοποιούν το µονοπάτι της υδρόλυσης των PtdIns, προκαλώντας την παραγωγή InsPs, µε διαφορετικό τρόπο (Wilson και Minneman 1990, Wigginton και Minneman 1991). Συγκεκριµένα, θεωρείται πιθανό ότι η δέσµευση του αγωνιστή στον α 1Β - αδρενεργικό υποδοχέα προκαλεί ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C µέσω µιας G q/11 πρωτεΐνης, ενώ η ενεργοποίηση του α 1Α - επάγει την είσοδο ιόντων Ca 2+ και την επακόλουθη ενεργοποίηση µιας ισοµορφής της φωσφολιπάσης C, που εξαρτάται από το ασβέστιο. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις που υποστηρίζουν το ενδεχόµενο αυτό (Kendal και Nahorski 1984, 1985, Pearce και συν. 1986, Rooney και Nahorski 1986, Κnepper και Rutledge 1987, Maier και Rutledge 1987, Brammer και συν. 1988). Ωστόσο, οι ενδείξεις αυτές προέρχονται κυρίως από µελέτες στο λείο µυ και στον εγκέφαλο του αρουραίου. Στην καρδιά του αρουραίου, οι έρευνες που ασχολήθηκαν µε το ζήτηµα της συµµετοχής του εξωκυτταρικού Ca 2+ στο σηµατοδοτικό µηχανισµό των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων είναι, εξ όσων γνωρίζουµε, σχετικά περιορισµένες. Πρόκειται κυρίως για ηλεκτροφυσιολογικές µελέτες, στις οποίες εξετάζεται η επίδραση της α 1 -αδρενεργικής διέγερσης στη λειτουργία διαφόρων καναλιών ιόντων Ca 2+ της σαρκοπλασµατικής µεµβράνης των µυοκυττάρων της καρδιάς (Fedida και συν. 1989, 1990, Terzic και συν. 1992, 1993). Το συγκεκριµένο ζήτηµα διερευνήθηκε στην παρούσα µελέτη µε σκοπό να διαπιστωθεί κατ αρχάς αν η υδρόλυση των ΡtdIns, που προκαλείται ως απόκριση των µυοκυττάρων της καρδιάς, εξαρτάται από το εξωκυτταρικό ασβέστιο. Έτσι, εξετάστηκαν οι πιθανές επιδράσεις που έχει η ρύθµιση της εξω- και ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων Ca 2+ στο σχηµατισµό των [ 3 H]InsPs, που επάγει η α 1 - αδρενεργική διέγερση µε αδρεναλίνη. ιαπιστώθηκε ότι στα καρδιακά µυοκύτταρα, ο σχηµατισµός [ 3 H]InsPs µετά από διέγερση µε αδρεναλίνη φάνηκε να εξαρτάται από τη συγκέντρωση των ιόντων του εξωκυτταρικού Ca 2+ και αναστέλλεται πλήρως µε την αποµάκρυνση των ιόντων του εξωκυτταρικού Ca 2+ (Εικόνα 2.1, 2.2, Πίνακας 2.1). Μια ελάχιστη ποσότητα εξωκυτταρικού Ca 2+ (0.1µΜ) ήταν απαραίτητη για

116 110 απόκριση των κυττάρων στη διέγερση µε αδρεναλίνη. Μεγαλύτερη αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων Ca 2+ (έως 2 mm) είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση στο ρυθµό του σχηµατισµού [ 3 H]InsPs. Παρόµοια σχέση µεταξύ της παραγωγής [ 3 H]InsP που επάγεται από τη νοραδρεναλίνη και της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+ παρατηρήθηκε σε κύτταρα γλοίας από νεογέννητο αρουραίο (Wigginton και Minneman 1991) καθώς και σε τοµές εγκεφαλικού ιστού αρουραίου (Knepper και Rutledge 1987). Βρέθηκε ότι η απόκριση των κυττάρων αυτών στην α 1 -αδρενεργική διέγερση µε νοραδρεναλίνη ανεστάλη πλήρως σε εξωκυτταρικές συγκεντρώσεις ιόντων Ca 2+ µικρότερες από 0.1 µμ. Ανιχνεύσιµες ποσότητες [ 3 H]InsP παρήχθησαν, όταν τα κύτταρα επωάστηκαν σε συγκέντρωση ιόντων Ca 2+ 1µΜ. Επίσης, σε τοµές θαλάµου από εγκέφαλο αρουραίου παρατηρήθηκε εξάρτηση των σχηµατιζόµενων [ 3 H]InsP από το ασβέστιο, ύστερα από διέγερση µε νοραδρεναλίνη (Trejo και συν. 1996). Στην περίπτωση αυτή επώαση των τοµών σε συνθήκες έλλειψης ασβεστίου προκάλεσε µείωση των παραγόµενων [ 3 H]InsPs στο 36% περίπου του ποσού που µετρήθηκε στους µάρτυρες, οι οποίοι επωάστηκαν σε συγκέντρωση εξωκυτταρικού ασβεστίου 2 mm. Ωστόσο, οι αποκρίσεις των µυοκυττάρων που επωάστηκαν µε BAPTA-ΑΜ στην αδρενεργική διέγερση, δεν επηρεάστηκαν, όταν η συγκέντρωση του εξωκυτταρικού Ca 2+ έγινε µεγαλύτερη από 1 µμ (Εικόνα 2.3). Το ΒΑΡΤΑ-ΑΜ, δρώντας ως χηλική ένωση στο εσωτερικό των µυοκυττάρων, ρυθµίζει την ενδοκυτταρική συγκέντρωση των ιόντων Ca 2+ περίπου στα nm. Έτσι, µε βάση τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι ο σχηµατισµός [ 3 H]InsP στα καρδιακά µυοκύτταρα, ως απόκριση στη διέγερση µε αδρεναλίνη, γίνεται εν µέρει µε τη µεσολάβηση της εισροής ιόντων Ca 2+ στα κύτταρα. Άλλωστε, και το γεγονός ότι η ιονοµυκίνη βρέθηκε να διεγείρει το σχηµατισµό [ 3 H]InsP συµφωνεί µε το συµπέρασµα αυτό (Εικόνα 2.4). Επίσης, σε άλλες µελέτες που έγιναν σε κύτταρα γλοίας νεογέννητου αρουραίου (Wigginton και Minneman 1991), καθώς και σε τοµές θαλάµου αρουραίου (Trejo και συν. 1996) παρατηρήθηκε ότι η ιονοφόρος ουσία Α23187 προκαλεί το σχηµατισµό InsPs και ακόµη ότι η δράση της συσχετίζεται άµεσα µε την εξωκυτταρική συγκέντρωση του ασβεστίου. Πιστεύεται ότι ο µηχανισµός µέσω του οποίου η εισροή ιόντων Ca 2+ ρυθµίζει την παραγωγή [ 3 H]InsP πιθανόν να εµπλέκει µια ισοµορφή της φωσφολιπάση C ευαίσθητης στα ιόντα Ca 2+. Επιπλέον, σε καρδιακά κύτταρα κοτόπουλου βρέθηκε ότι η άνοδος των επιπέδων του ενδοκυτταρικού ασβεστίου προκαλεί αύξηση της δραστικότητας µίας ισοµορφής της φωσφολιπάσης C και

117 111 επακόλουθη αύξηση των παραγόµενων InsPs (McDonough και συν. 1988). Φαίνεται ότι η συγκεκριµένη ισοµορφή εξαρτάται από GTP και εποµένως σχετίζεται µε G πρωτεΐνες εν αποκλείεται, όµως, η ρύθµιση της παραγωγής InsP από το ασβέστιο να εκδηλώνεται µε διαφορετικό τρόπο. Είναι χαρακτηριστικό ότι, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατά µας, η αδρεναλίνη και η ιονοµυκίνη είχαν προσθετική δράση όσον αφορά στο σχηµατισµό [ 3 H]InsP, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διέγερση των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων και η επίδραση της ιονοµυκίνης διεγείρουν το σχηµατισµό InsP µέσω διαφορετικών µηχανισµών. Γενικά, η ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C που προκαλείται µέσω G πρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσµα την υδρόλυση της 4,5-διφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης, PtdIns(4,5)P 2 και το σχηµατισµό 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης, InsP(1,4,5)P 3. Η InsP(1,4,5)P 3, στη συνέχεια, αποφωσφορυλιώνεται σε 1,4-διφωσφορική ινοσιτόλη, InsP(1,4)P 2, η οποία µε τη σειρά της χάνει την 4 φωσφορική οµάδα µετατρεπόµενη σε 1-µονοφωσφορική ινοσιτόλη, (InsP(1)P) (Berridge και Irvine 1989). Εναλλακτικά, η InsP(1,4,5)P 3 είναι δυνατό να φωσφορυλιωθεί σχηµατίζοντας την 1,3,4,5-τετράκις φωσφορική ινοσιτόλη, InsP(1, 3, 4,5)P 4. Υπάρχουν, όµως, ενδείξεις ότι η φωσφολιπάση C που ενεργοποιείται µε τη µεσολάβηση των ιόντων Ca 2+ παρουσιάζει διαφορετική εξειδίκευση ως προς τα µεµβρανικά φωσφολιπίδια που υδρολύει, προκαλώντας το σχηµατισµό διαφορετικών προϊόντων (Brammer και συν. 1988, Brammer και Weaver 1989, Putney και συν. 1989, Wilson και συν. 1990). Πρόσφατα, οι Matkovisch και συν. (2000) αναφέρουν ότι στα καρδιακά κύτταρα νεογέννητου αρουραίου η α 1 -αδρενεργική διέγερση πιθανόν να προκαλεί την υδρόλυση άλλου φωσφολιπιδίου και όχι της διφωσφορικής φωσφατίδυλο ινοσιτόλης, PtdIns(4,5)P 2. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό δεύτερων µηνυµάτων που δε σχετίζονται µε την Ins(1,4,5)P 3. Αντίθετα, τα ιόντα Ca 2+ ενεργοποιούν την παραγωγή InsP κυρίως µέσω της υδρόλυσης της PtdIns(4,5)P 2, της οποίας βασικό προϊόν είναι η InsP(1,4,5)P 3. Είναι χαρακτηριστικό µάλιστα το γεγονός ότι το κύριο προϊόν που ανιχνεύθηκε από την υδρόλυση µέσω G πρωτεΐνης ήταν η 4-µονοφωσφορική ινοσιτόλη, InsP(4)P και όχι η InsP(1)P, η οποία προκύπτει από τις διαδοχικές αποφωσφορυλιώσεις της InsP(1,4,5)P 3. Αυτό σηµαίνει ότι είναι πολύ πιθανό η α 1 - αδρενεργική διέγερση να προκαλεί, µέσω µίας G πρωτεΐνης, την υδρόλυση της 4- µονοφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης, PtdIns(4)P και όχι την υδρόλυση της PtdIns(4,5)P 2. Υπάρχουν στοιχεία, σύµφωνα µε τα οποία φαίνεται ότι το ίδιο µονοπάτι παραγωγής InsPs ενεργοποιείται από την α 1 -αδρενεργική διέγερση και στα

118 112 καρδιακά κύτταρα του ενήλικου αρουραίου (Woodcock και συν. 1995). Στο µονοπάτι αυτό, το µεµβρανικό φωσφολιπίδιο, που υδρολύεται από µία ισοµορφή της φωσφολιπάσης C, είναι η PtdIns(4)P. Το προϊόν της υδρόλυσης είναι η 1,4- διφωσφορική ινοσιτόλη, Ins(1,4)P 2, η οποία αποφωσφορυλιώνεται σε Ins(4)P (Εικόνα 1). Όσον αφορά λοιπόν στο συγκεκριµένο ζήτηµα, υπάρχουν πολλά δεδοµένα τα οποία υποδεικνύουν ότι τα ιόντα Ca 2+ και η α 1 -αδρενεργική διέγερση µπορεί να λειτουργήσουν ως ξεχωριστά ερεθίσµατα που προκαλούν την ενεργοποίηση του µονοπατιού της υδρόλυσης ειδικών φωσφολιπιδίων της µεµβράνης. Κάτι τέτοιο θα ήταν πολύ πιθανό, αν στη µεταγωγή των σηµάτων αυτών µεσολαβούσαν διαφορετικές ισοµορφές της φωσφολιπάσης C, που δρουν σε διαφορετικά αποθέµατα φωσφατίδυλο-ινοσιτόλης των µεµβρανών στα καρδιακά κύτταρα. Βέβαια, στην παρούσα µελέτη δεν έγινε διάκριση µεταξύ των διαφορετικών µορίων φωσφορικής ινοσιτόλης που σχηµατίζονται. Ωστόσο, η εξάρτηση της παραγωγής InsP από το εξωκυτταρικό ασβέστιο και κυρίως η απόκριση των µυοκυττάρων που είχαν σταθερή ενδοκυτταρική συγκέντρωση Ca 2+ σε συνδυασµό µε την προσθετική δράση του ιονοφόρου και της α 1 -αδρενεργικής διέγερσης που παρατηρήθηκε υποστηρίζουν το ενδεχόµενο να ενεργοποιούνται αντίστοιχα διαφορετικές ισοµορφές της φωσφολιπάσης C. Εικόνα 1. ιαγραµµατική απεικόνιση των διαφόρων µονοπατιών υδρόλυσης των PtdIns.