ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ΝΕΟΥ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BCL2L12 ΚΑΙ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ΝΕΟΥ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BCL2L12 ΚΑΙ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ"

Ἀκελδαμά Μεσσηνέζης
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ΝΕΟΥ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BCL2L12 ΚΑΙ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ (Περίληψη) ΧΡΗΣΤΟΣ ΚΟΝΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΘΗΝΑ 2009

2 H έρευνα συγχρηματοδοτήθηκε: 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ένωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο, 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας, και από τον Ιδιωτικό Τομέα - ELPEN A.E., στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης. Έργο Π.ΕΝ.Ε.Δ με κωδικό Γ.Γ.Ε.Τ.: 03ΕΔ 178

3 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Σκορίλας Ανδρέας, Αναπλ. Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. (Επιβλέπων) Φραγκούλης Γ. Εμμανουήλ, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Βασιλακοπούλου Διδώ, Επίκ. Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Φραγκούλης Γ. Εμμανουήλ, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Βοργιάς Κωνσταντίνος, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Σκορίλας Ανδρέας, Αναπλ. Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Σίδερης Διαμάντης, Αναπλ. Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Γουργιώτης Δημήτριος, Αναπλ. Καθηγητής Ιατρικής Σχολής, Ε.Κ.Π.Α. Βασιλακοπούλου Διδώ, Επίκ. Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Παναγιώτου Γεώργιος, Διευθυντής Ερευνών, Ινστιτούτο Μοριακής Ογκολογίας, Ε.ΚΕ.Β.Ε «Αλέξανδρος Φλέμιγκ»

4 Μελέτη και κλινική αξιολόγηση τος νέος αποπτωτικού γονιδίος BCL2L12 και της L-DOPA αποκαρβοξςλάσης στον καρκίνο τος παχέος εντέρος Χρήστος Κοντός Διδακτορική Διατριβή Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ O καρκίνος του παχέος εντέρου και του ορθού συνιστά μια κύρια αιτία νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως, καθότι είναι η τρίτη συνηθέστερη κακοήθης νεοπλασία στους άνδρες και τις γυναίκες στις αναπτυγμένες χώρες. H πιο σημαντική παράμετρος που επηρεάζει τη μακρόχρονη επιβίωση των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο είναι το στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση, ενώ εξίσου σημαντικές μεταβλητές για την πρόγνωση των ασθενών αυτών αποτελούν ο βαθμός αποδιαφοροποίησης του ιστού και η διήθηση (ή όχι) των λεμφαδένων ή απομακρυσμένων οργάνων. Μολονότι στο παρελθόν έχουν αξιολογηθεί πολλοί προγνωστικοί δείκτες για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, οι περισσότεροι από αυτούς δεν έχουν κριθεί ικανοποιητικοί. Τα μέλη της οικογένειας ΒCL2 διαδραματίζουν κυρίαρχο ρόλο στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, προάγοντας ή αναστέλλοντας αυτή τη φυσιολογική διαδικασία, και συνεπώς εμπλέκονται στην παθοβιολογία και την εξέλιξη του καρκίνου. Το γονίδίο BCL2L12 είναι ένα νέο μέλος της αποπτωτικής οικογένειας BCL2. H έκφραση mrna του γονιδίου BCL2L12 βρέθηκε ιδιαίτερα υψηλή σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές και τύπους καρκίνου, καθώς επίσης σημαντικές μεταβολές της παρατηρήθηκαν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κατόπιν επίδρασης αντικαρκινικών φαρμάκων. H L-DOPA αποκαρβοξυλάση (L-DOPA decarboxylase, DDC) είναι το ένζυμο που καταλύει την αποκαρβοξυλίωση της 3,4-διϋδροξυ-L-φαινυλαλανίνης (L-DOPA) και της 5- υδροξυ-l-τρυπτοφάνης προς ντοπαμίνη και σεροτονίνη (5-υδροξυτρυπταμίνη), αντίστοιχα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η πρόταση ότι η DDC μπορεί να αποτελέσει, σε επίπεδο mrna, ένα γενικό βιοδείκτη νευροενδοκρινών όγκων, συμπεριλαμβανομένων του νευροβλαστώματος και του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, καθώς και ένα νέο, πιθανό μοριακό δείκτη της διασποράς του γαστρικού καρκίνου στην περιτοναϊκή κοιλότητα. 5

5 Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη και η κλινική αξιολόγηση της έκφρασης των γονιδίων BCL2L12 και DDC στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Πιο συγκεκριμένα, το ερώτημα που είχε τεθεί ήταν εάν η έκφραση των εν λόγω γονιδίων, είτε σε επίπεδο mrna είτε σε επίπεδο πρωτεΐνης, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα νέο δείκτη πρόγνωσης του ορθοκολικού καρκίνου και/ή ένα βιοδείκτη για την πρόβλεψη κατάλληλης θεραπευτικής αγωγής και την παρακολούθηση της ανταπόκρισης των ασθενών στη θεραπεία. Η έκφραση mrna του BCL2L12 σε καρκινώματα παχέος εντέρου κυμάνθηκε από 0,022 έως 82,6 c/kc (αντίγραφα mrna του BCL2L12 / 1000 αντίγραφα mrna του GAPDH) με μέση τιμή 10,0±1,43, ενώ η έκφραση mrna της DDC κυμάνθηκε από 0,04 έως 91,95 c/kc (αντίγραφα mrna της DDC / 1000 αντίγραφα mrna του GAPDH) με μέση τιμή 9,02±1,51. Η αυξημένη έκφραση mrna τόσο του γονιδίου BCL2L12 όσο και του γονιδίου DDC στο παχύ έντερο βρέθηκε ότι σχετίζεται με ορθοκολικούς όγκους χαμηλού βαθμού αποδιαφοροποίησης και αρχικού σταδίου. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, η ανάλυση επιβίωσης κατά Kaplan-Meier έδειξε ότι ασθενείς με νεοπλασίες στο παχύ έντερο όπου τα γονίδια BCL2L12 και DDC εκφράζονται ισχυρά, έχουν μεγαλύτερα διαστήματα ελεύθερης νόσου και ολικής επιβίωσης, συγκριτικά με ασθενείς που φέρουν κακοήθεις όγκους που δεν εκφράζουν τα συγκεκριμένα γονίδια. Επίσης, η μονομεταβλητή ανάλυση έδειξε ότι η υπερέκφραση mrna του BCL2L12 στο παχύ έντερο σχετίζεται θετικά με την ελεύθερη νόσου επιβίωση (HR=0,12 και p=0,042) των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο, ενώ η αυξημένη έκφραση mrna του γονιδίου DDC φαίνεται να σχετίζεται θετικά με την DFS (HR=0,18 και p=0,021) αλλά με και την OS (HR=0,23 και p=0,047). Συμπερασματικά, φαίνεται ότι τα γονίδια BCL2L12 και DDC μπορούν να χρησιμοποιηθούν, πιθανότατα, ως ευμενείς προγνωστικοί δείκτες για τον ορθοκολικό καρκίνο. Πειράματα στύπωσης Western και ανοσοεντοπισμού της πλήρους μήκους ισομορφής της DDC αποκάλυψαν ότι το ένζυμο αυτό εκφράζεται σε κυμαινόμενα επίπεδα στο παχύ έντερο, τόσο σε καρκινικούς όσο και σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά δεν φαίνεται να διαθέτει ενζυμική ενεργότητα ως προς την αποκαρβοξυλίωση της L-DOPA σε ντοπαμίνη. Επιπλέον, η DDC δεν μπόρεσε να ταυτοποιηθεί με ανάλυση πεπτιδίων σε φασματογράφο μάζας, καθότι λαμβάνει χώρα φαινόμενο masking από άλλες πρωτεΐνες που εκφράζονται πολύ άφθονα στα κύτταρα Caco-2, όπως οι τσαπερονίνες HSP60 και CCT5, οι οποίες διαθέτουν ίδιο μοριακό βάρος και ισοηλεκτρικό σημείο με αυτό της DDC στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Οι πρωτεΐνες αυτές, όμως, δεν εμφανίζουν σημαντική ομοιότητα με την πλήρους μήκους ισομορφή της DDC, ούτε και με το ανοσογονικό 6

6 πεπτίδιο που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του ειδικού πολυκλωνικού αντισώματος. Επίσης, η ύπαρξη της DDC πιστοποιήθηκε και με τη χρήση ενός ακόμα ειδικού πολυκλωνικού αντισώματος, κατόπιν ανοσοστύπωσης σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Για τη διερεύνηση της ικανότητας πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυτταρικών σειρών παχέος εντέρου DLD-1 και Caco-2, κατασκευάστηκαν καμπύλες αύξησης αυτών. Κατόπιν δοκιμής μιας σειράς διαφορετικών συγκεντρώσεων εμφύτευσης κυττάρων και μελετώντας την κυτταρική αύξηση ανά 24 ώρες για ένα διάστημα 96 ωρών αφότου τα κύτταρα είχαν κολλήσει στο ταπήτιο, βρέθηκε ότι η βέλτιστη συγκέντρωση εμφύτευσης κυττάρων DLD-1 και Caco-2 έτσι ώστε τα κύτταρα να παραμένουν σε εκθετική φάση ανάπτυξης μετά από 72 ώρες, ήταν 0,5x10 5 κύτταρα/ml θρεπτικού υλικού (δηλαδή 10 6 κύτταρα / 20 ml θρεπτικού υλικού ή, ισοδύναμα, 10 6 κύτταρα / 75 cm 2 επιφάνεια). Με βάση τις καμπύλες βιωσιμότητας των καρκινικών αυτών κυττάρων κατόπιν επίδρασης με μια πληθώρα χημειοθεραπευτικών φαρμάκων που χρησιμοποιήθηκαν σε ένα μέγαλος έυρος συγκεντρώσεων, βρέθηκε η τοξική για το 50% των κυττάρων συγκέντρωση (IC 50 ) κάθε αντικαρκινικού φαρμάκου. Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση IC50 δοξορουβικίνης (αδριαμυκίνης), φθοροουρακίλης, συνδυασμού φθοροουρακίλης-λευκοβορίνης (σε αναλογία 2:1), ιρινοτεκάνης, μεθοτρεξάτης, και οξαλιπλατίνης, για τα κύτταρα DLD-1 ήταν 0,5, 50, 50:25, 10, 0,5, και 10 μμ, αντίστοιχα, και για τα κύτταρα Cacο-2 ήταν 0,01, 10, 10:5, 10, 1, και 1 μμ, αντίστοιχα. Αξιοσημείωτες μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης mrna του γονιδίου DDC παρατηρήθηκαν στα κύτταρα DLD-1, παρουσία κάθε χημειοθεραπευτικού παράγοντα που χρησιμοποιήθηκε, ενώ μικρές ήταν οι μεταβολές στην έκφραση mrna της DDC στα κύτταρα Caco-2, πάντοτε σε σχέση με τα αντίστοιχα κύτταρα όπου δεν είχε προηγηθεί επίδραση με κάποιο αντικαρκινικό φάρμακο. Αντίθετα, για το γονίδιο BCL2L12 σημειώθηκαν μικρότερου εύρους μεταβολές της έκφρασης mrna τόσο στην καρκινική κυτταρική σειρά DLD-1 όσο και στην Caco-2. Αρκετά σημαντικές μεταβολές σημειώθηκαν και για τα άλλα σχετιζόμενα με την απόπτωση γονίδια που μελετήθηκαν (BCL2, BAX, BCLX, και FAS). Συμπερασματικά, οι μεταβολές των επιπέδων έκφρασης mrna της DDC και του BCL2L12 παρουσία χημειοθεραπευτικών παραγόντων δείχνουν ότι τα δύο αυτά γονίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί δείκτες πρόβλεψης μιας αποτελεσματικής χημειοθεραπευτικής αγωγής του καρκίνου του παχέος εντέρου και παρακολούθησης της απόκρισης των ασθενών σε αυτή, ή ακόμα και ως μελλοντικοί θεραπευτικοί στόχοι. 7

Σχετικά έγγραφα

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ