ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΚΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΝΗΜΗΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΙΟΚΟΚΚΟΥ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ HIV-1 ΛΟΙΜΩΞΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ - ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Π.Γ.Ν.Θ. ΑΧΕΠΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Μ.ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ Αρ. Διατριβής:3596 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΚΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΝΗΜΗΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΙΟΚΟΚΚΟΥ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ HIV-1 ΛΟΙΜΩΞΗ ΟΛΓΑΣ ΤΣΑΧΟΥΡΙΔΟΥ ΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΖΕΜΠΕΚΑΚΗΣ ΠΑΝΤΕΛΗΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) ΜΕΤΑΛΛΙΔΗΣ ΣΥΜΕΩΝ, ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΚΟΥΡΑ ΛΕΜΟΝΙΑ, ΕΠ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΖΕΜΠΕΚΑΚΗΣ ΠΑΝΤΕΛΗΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) ΜΕΤΑΛΛΙΔΗΣ ΣΥΜΕΩΝ, ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΚΟΥΡΑ ΛΕΜΟΝΙΑ, ΕΠ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΥΡΙΑΖΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΙΟΥΜΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, ΑΝ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχής των γνωμών του συγγραφέως» (Nόμος 5343/32, αρθρ.202&2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50 &8

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ - ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Δ. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΜΕΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΣΤΕΡΙΟΣ ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ

4 Στην οικογένειά μου, για την αμέριστη στήριξη

5 Στους δασκάλους μου, για την αγάπη, την καθοδήγηση και την πίστη στην προσπάθεια αυτή

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος... 7 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Λοίμωξη από Streptococcus pneumoniae Α. Γενικός πληθυσμός Β. ΗΙV πληθυσμός Εμβόλιο έναντι του Streptococcus pneumoniae Α. Κατευθυντήριες οδηγίες για τον υγιή πληθυσμό Β. Κατευθυντήριες οδηγίες στον HIV πληθυσμό Γ. 23-δυναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο έναντι του Streptococcus pneumoniae Ανοσία στο 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο Α. Βασικές αρχές ανοσιακής απόκρισης επαγόμενες από τον Streptococcus pneumoniae Β. Δράση των αντισωμάτων Γ. Β κυτταρική μνήμη -Β λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι. ΣΚΟΠΟΣ II. ΑΣΘΕΝΕΙΣ-ΜΕΘΟΔΟΙ III. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ IV. ΣΥΖΗΤΗΣΗ V. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ VI. ΠΕΡΙΛΗΨΗ VII. SUMMARY VIII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

7 Πρόλογος Οι λοιμώξεις από τον Streptococcus pneumoniae είναι το συχνότερο αίτιο βακτηριακής πνευμονίας στους HIV ασθενείς και ευθύνονται για την υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα. Η εφαρμογή της υψηλής δραστικότητας αντιρετροϊκής αγωγής (HAART) οδήγησε σε μείωση της επίπτωσης της πνευμονίας από όλα τα αίτια, ωστόσο εξακολουθεί να επηρεάζει τους οροθετικούς ασθενείς συχνότερα από τον υγιή πληθυσμό, ακόμα και σε ασθενείς με υψηλά επίπεδα CD4 κυττάρων. Οι κατευθυντήριες οδηγίες εξακολουθούν να συστήνουν τον εμβολιασμό των HIV ασθενών με το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο, παρά τα νεότερα δεδομένα για αποτελεσματικότητά του, συγκριτικά με το πιο νέο συζευγμένο εμβόλιο. Τα Β λεμφοκύτταρα αποτελούν έναν από τους πιο δυσλειτουργικούς πληθυσμούς κυττάρων στους ασθενείς με HIV λοίμωξη. Η απώλεια των Β κυττάρων μνήμης είναι μια παράμετρος της δυσλειτουργίας στην HIV λοίμωξη. Επιπλέον, υπάρχουν στοιχεία για διαταραχή σε πληθυσμούς με δράση ενάντια σε θυμοανεξάρτητα αντιγόνα, όπως είναι οι πολυσακχαρίτες του πνευμονιόκοκκου. Ο φαινότυπος των Β λεμφοκυττάρων, που είναι απαραίτητα για την ανοσιακή απόκριση στο πολυσακχαριδικό εμβόλιο έναντι του πνευμονιοκόκκου, είναι αμφιλεγόμενος. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η καταγραφή και η αξιολόγηση των διαχρονικών μεταβολών των διαφόρων Β κυτταρικών υποπληθυσμών κατά τη διάρκεια 48 εβδομάδων, πριν και μετά τον ανοσολογική διέγερση με το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο σε HIV-1 ασθενείς. Μελετήσαμε δύο ομάδες ασθενών, μιας υπό επιτυχημένη αντιρετροϊκή αγωγή (CD4 cell count >500c/mm 3 ) και μιας δεύτερης ασθενών χωρίς θεραπεία, με φυσιολογικό ανοσιακό επίπεδο. Επιπλέον, μελετήσαμε προοπτικά την επίδραση της HAART, της ιαιμίας και του αντιγονικού ερεθισμού σε αυτούς τους πληθυσμούς, καθώς και την ανοσογονικότητα του εμβολίου μέσω της αντισωματικής διαμόρφωσης και της φαγοκυτταρικής ικανότητας

8 των ουδετερόφιλων κυττάρων του περιφερικού αίματος διαχρονικά και σε σχέση με τα επίπεδα των διαφόρων Β κυτταρικών πληθυσμών. Η μελέτη περιλαμβάνει δύο μέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό μέρος αναπτύσσεται η επιδημιολογία των λοιμώξεων από Streptococcus pneumonia στο γενικό και HIV πληθυσμό. Ακολουθούν οι κατευθυντήριες οδηγίες αναφορικά με τον εμβολιασμό, τα χαρακτηριστικά του 23-δύναμου πολυσακχαριδικού εμβολίου, καθώς και ο μηχανισμός δράσης αυτού. Τέλος, αναπτύσσεται η ολοκληρωμένη ανοσιακή απόκριση στον εμβολιασμό με επιμέρους ανάλυση της αντισωματικής διαμόρφωσης, της φαγοκυττάρωσης που διαμεσολαβείται από τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα, καθώς και του ρόλου των διαφόρων Β λεμφοκυτταρικών πληθυσμών μνήμης μετά από εμβολιασμό με το πολυσακχαριδικό εμβόλιο στους HIV ασθενείς. Στο ειδικό μέρος αρχικά περιγράφονται οι ασθενείς και η μεθοδολογία της μελέτης, ενώ στη συνέχεια παρατίθενται αναλύονται και συγκρίνονται τα αποτελέσματα. Ακολουθεί η συζήτηση των αποτελεσμάτων, ενώ στο τέλος αναφέρονται τα κύρια συμπεράσματα, η περίληψη στην ελληνική και αγγλική γλώσσα, καθώς και η βιβλιογραφία που χρησιμοποιήθηκε. Ολόκληρο το ερευνητικό μέρος της μελέτης εκπονήθηκε στο εργαστήριο του Κέντρου Αναφοράς AIDS Β. Ελλάδος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Οι ασθενείς προέρχονται από τη Μονάδα Ειδικών Λοιμώξεων της Α Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις θερμότερες ευχαριστίες μου στον επιβλέποντα της παρούσας διατριβής Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Παντελή Ζεμπεκάκη για την ανάθεση αυτής της διατριβής, καθώς και στη δασκάλα μου και μέλος της επταμελούς επιτροπής Επίκουρη Καθηγήτρια Βιοπαθολογίας κ. Λεμονιά Σκούρα για τη συνεχή επίβλεψη, καθοδήγηση και ηθική συμπαράσταση σε όλα τα στάδια εκπόνησης και συγγραφής της παρούσας εργασίας.

9 Ιδιαιτέρως ευχαριστώ το δάσκαλό μου και μέλος της συμβουλευτικής επιτροπής Επίκουρο Καθηγητής Παθολογίας - Λοιμωξιολογίας κ. Συμεών Μεταλλίδη για τις σημαντικές υποδείξεις και συμβουλές του. Ευχαριστώ θερμά τον Καθηγητή Παθολογίας - Ανοσολογίας Διευθυντή της Α Παθολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ κ. Μιχαήλ Δανιηλίδη, καθώς και τον Καθηγητή Μικροβιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κ. Νικόλαο Μαλισιόβα για τις πολύτιμες υποδείξεις τους αναφορικά με το εργαστηριακό και ανοσολογικό τμήμα της παρούσας εργασίας. Θεωρώ υποχρέωση μου να ευχαριστήσω και τον τ. Διευθυντή της Α Παθολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ κ. Παύλο Νικολαΐδη, υπό τη διεύθυνση του οποίου έγινε η ανάθεση αυτής της Διδακτορικής Διατριβής. Εκφράζω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες μου στη βιολόγο κ. Αποστολία Μαργαρίτη για την πολύτιμη βοήθειά της στη μεθοδολογία της κυτταρομετρίας ροής και της ανοσοενζυμικής μεθόδου ELISA και στην τεχνολόγο εργαστηρίου κ. Ελευθερία Πιθάρα για την αμέριστη βοήθειά στο τεχνικό μέρος της μελέτης. Επίσης, πρέπει να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Μπουγιουκλή Δημήτριο, για τις πολύτιμες συμβουλές στο σχεδιασμό της μελέτης. Τέλος ευχαριστώ τους ασθενείς, που συναίνεσαν πρόθυμα και συμμετείχαν στο ερευνητικό πρωτόκολλο της μελέτης.

10

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

12

13 1. Λοίμωξη από Streptococcus pneumoniae Α. Γενικός πληθυσμός Ο πνευμονιόκοκκος (Streptococcus pneumoniae) είναι Gram(+) βακτήριο που συνήθως καλύπτεται από πολυσακχαριδικό έλυτρο, που αποτελεί τη βάση της παθογονικότητάς του για τον άνθρωπο. Με βάση την αντιγονική δομή των πολυσακχαριτών του ελύτρου, έχουν απομονωθεί πάνω από 90 ορότυποι, αλλά υπολογίζεται ότι το 62% των διεισδυτικών πνευμονιοκοκκικών λοιμώξεων οφείλεται στους 10 συχνότερους από αυτούς [1]. Το βακτήριο αποικίζει το ανώτερο αναπνευστικό σύστημα και αποτελεί συχνό στοιχείο της φυσιολογικής χλωρίδας του ρινοφάρυγγα των παιδιών (μέχρι 65% σε παιδιά βρεφονηπιακών σταθμών) και σε μικρότερο βαθμό των ενηλίκων (15%) [2]. Η διάρκεια της φορείας ποικίλλει και είναι γενικά μεγαλύτερη στα παιδιά. Η μετάδοση γίνεται από άνθρωπο σε άνθρωπο μέσω των αναπνευστικών σταγονιδίων και με αυτοενοφθάλμιση από το αναπνευστικό. Ο πνευμονιόκοκκος προκαλεί τόσο διεισδυτικές λοιμώξεις (ΔΠΝ), όπως βακτηριαιμία, σηψαιμία, μηνιγγίτιδα, πνευμονία με βακτηριαιμία ή/και εμπύημα, όσο και μη διεισδυτικές λοιμώξεις,όπως οξεία μέση ωτίτιδα, παραρρινοκολπίτιδα, πνευμονία κ.α. Οι μη διεισδυτικές λοιμώξεις είναι βέβαια πιο ήπιες, αλλά είναι πολύ πιο διαδεδομένες και αποτελούν αιτία εκτεταμένης χρήσης αντιβιοτικών στην κοινότητα. Επιδημιολογικά στοιχεία από ολό τον κόσμο, δείχνουν ότι η επίπτωση της νόσου είναι μεγαλύτερη στα παιδιά κάτω των 5 ετών (κυρίως στα βρέφη και παιδιά, έως 2 ετών) και κατά δεύτερο λόγο στους ενήλικες, άνω των ετών [3,4] (Εικόνα 1).

14 Αδρή συχνότητα ανά πληθυσμού Άνδρες Γυναίκες Ομάδες ηλικίας Εικόνα1. Κατανομή διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής νόσου ανά ηλικιακή ομάδα στην Ευρώπη (Πηγή: ECDC 2014) Στα παιδιά, ως 2 ετών, η βακτηριαιμία χωρίς σαφή εστία λοίμωξης αποτελεί τη συχνότερη εκδήλωση διεισδυτικής νόσου (70%), ενώ η βακτηριαιμική πνευμονία αναλογεί σε ένα ποσοστό 12-16% [1]. Στους ενήλικες πιο συχνή κλινική εκδήλωση πνευμονιοκοκκικής λοίμωξης είναι η πνευμονία, καλύπτοντας το 36% των περιστατικών πνευμονίας της κοινότητας (CAP) και το 50% των νοσοκομειακών πνευμονιών [1]. Η οξεία μέση ωτίτιδα (ΟΜΩ) αποτελεί ιδιαίτερα συχνή λοίμωξη της παιδικής ηλικίας. Υπολογίζεται ότι μέσα στους πρώτους 12 μήνες ζωής, το 60% των βρεφών θα έχουν περάσει τουλάχιστον ένα επεισόδιο οξείας μέσης ωτίτιδας [1]. Ο πνευμονιόκοκκος ευθύνεται για την πλειονότητα των περιπτώσεων μικροβιακής ΟΜΩ στα παιδιά και κυρίως για το πρώτο επεισόδιο σε ηλικία κάτω του έτους, αλλά και στους ενήλικες [5]. Ο πνευμονιόκοκκος αποτελεί επίσης το κύριο αίτιο βακτηριακής μηνιγγίτιδας τόσο για τα παιδιά <5 ετών όσο και για τους ενήλικες, στους οποίους υπολείπεται μόνο σε περιπτώσεις επιδημικής έξαρσης του μηνιγγιτιδόκοκκου [6]. Η σημασία του είναι βαρύνουσα σε άτομα υψηλού κινδύνου

15 Επεισόδια ανά 1000 πληθυσμού για εμφάνιση σοβαρών πνευμονιοκοκκικών λοιμώξεων, όπως άτομα με ανοσοανεπάρκεια, ασπληνία ή μειονεκτική σπληνική λειτουργία, νεφρωσικό σύνδρομο, σακχαρώδη διαβήτη, χρόνια πνευμονοπάθεια, κοχλιακά εμφυτεύματα κλπ. Συνολικά κάθε χρόνο 1,6 εκατ. άνθρωποι σε όλο τον κόσμο πεθαίνουν από πνευμονιοκοκκική λοίμωξη, από τους οποίους περίπου είναι παιδιά, κάτω των 5 ετών [7]. Επιδημιολογικά δεδομένα της πνευμονίας στον υγιή πληθυσμό φαίνονται στην Εικόνα 2. Έτος Παγκόσμια Ορότυποι εμβολίου Άλλοι ορότυποι Εικόνα 2. Επίπτωση επεισοδίων πνευμονίας στο γενικό πληθυσμό από στελέχη που περιέχονται ή όχι στο 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο στην Ευρώπη (Πηγή: ECDC annual report of vaccine preventable diseases, 2014)

16 Β. ΗΙV πληθυσμός Οι βακτηριακές πνευμονικές λοιμώξεις συμβαίνουν συνήθως σε άτομα που έχουν μολυνθεί με τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) [8]. Η ετήσια επίπτωση της βακτηριακής πνευμονίας σε ασθενείς με HIV κυμαίνεται, από 5,5 έως 29 ανά 100, έναντι 0,7 έως 10 ανά 100 σε HIV-οροαρνητικούς ασθενείς [9-13]. Αν και η βακτηριακή πνευμονία μπορεί να συμβεί καθ 'όλη τη διάρκεια της HIV λοίμωξης, έχει την τάση να αναπτύσσεται πιο συχνά σε άτομα με προχωρημένη ανοσοκαταστολή [10,14]. Άμεση συσχέτιση του αριθμού των CD4 κυττάρων με τη συχνότητα της εμφάνισης της βακτηριακής πνευμονίας καταγράφηκε το 2006: 4.9, 8.7, 17.9 επεισόδια σημειώθηκαν ανά 100 ασθενείς-έτη με αντίστοιχες τιμές CD4> 500, 200 έως 500, και <200 κύτταρα/mm 3 [11]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) πρόσθεσαν την υποτροπιάζουσα βακτηριακή πνευμονία ως παθογνωμονική κατάσταση του AIDS, το Ανάμεσα σε ασθενείς με HIV λοίμωξη, οι χρήστες ενδοφλέβιων ναρκωτικών ουσιών (ΧΕΝ), οι κάτοικοι των πόλεων, οι καπνιστές και άτομα από τις αναπτυσσόμενες χώρες βρίσκονται σε υψηλότερο κίνδυνο για βακτηριακή πνευμονία [9, 10, 15, 16]. Η είσοδος της (HAART) στις Η.Π.Α. έχει αλλάξει τη συχνότητα της διεισδυτικής πνευμονίας [11,17-18]. Η χρήση ενδοφλέβιων ναρκωτικών, ο χαμηλός αριθμός CD4 κυττάρων, ο αριθμός των ναδίρ CD4 κυττάρων, η ηλικία, και η μη λήψη ΗΑART, αυξάνουν τον κίνδυνο πνευμονίας. Παρά το γεγονός ότι ο κίνδυνος νοσηλείας για πνευμονία σε άτομα με HIV λοίμωξη μειώθηκε δραματικά, η οροθετικότητα παραμένει ένας ισχυρός παράγοντας κινδύνου, ακόμα και σε άτομα με αριθμό CD4 κυττάρων 500 κύτταρα/mm 3 [19]. Η τρέχουσα καπνιστική συνήθεια, είναι επίσης ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για τους ασθενείς που λαμβάνουν ΗΑART [20]. Οι καπνιστές έχουν τριπλάσιο κίνδυνο πνευμονίας σε σύγκριση με τους μη καπνιστές [20].

17 Η αποτελεσματική ΗΑART ελαττώνει το ιικό φορτίο HIV RNA στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) με συνακόλουθη μείωση του απόλυτου αριθμού των CD8 + Τ- λεμφοκυττάρων, στον κυψελιδικό χώρο [21]. Υπάρχουν αντικρουόμενα στοιχεία ως προς το εάν η επίπτωση της διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής νόσου έχει μειωθεί κατά τη διάρκεια της μετα-haart εποχής [22-23]. Ο χαμηλός αριθμός CD4 <100 κύτταρα/mm 3 και το ιστορικό παλαιάς λοίμωξης από PPneumocystis Jiroveci παρέμειναν παράγοντες κινδύνου για νόσηση από διεισδυτική πνευμονιοκοκκική νόσο [18,24]. Ο κίνδυνος της διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής νόσου (ΔΠΝ) είναι μεγαλύτερoς σε ασθενείς με HIV λοίμωξη, από ότι στο γενικό πληθυσμό. Σε μελέτες του CDC για την πνευμονιοκοκκική νόσο, με χρήση δεδομένων της Active Βacteria Core (ABC)Αρχής Επιτήρησης και της National Health Interview Survey, ο κίνδυνος της διεισδυτικής νόσου μεταξύ των ομάδων υψηλού κινδύνου είναι υψηλότερος σε ενήλικες με αιματολογική κακοήθεια ή HIV/AIDS [25-27]. Ο αυξημένος κίνδυνος της διεισδυτικής νόσου σε ασθενείς με HIV λοίμωξη μπορεί να εξηγηθεί, εν μέρει, από μια προδιάθεση για ρινοφαρυγγικό αποικισμό από τον πνευμονιόκοκκο [28].

18 2. Εμβόλιο έναντι του Streptococcus pneumoniae Α. Κατευθυντήριες οδηγίες για τον υγιή πληθυσμό Η πνευμονιοκοκκική νόσος προλαμβάνεται με τον συστηματικό αντιπνευμονιοκοκκικό εμβολιασμό. Το 7δύναμο συζευγμένο πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο (PCV-7) χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 2000 στις ΗΠΑ, ενώ στη χώρα μας κυκλοφόρησε τον Οκτώβριο του 2004 και εντάχθηκε στο Εθνικό Πρόγραμμα Εμβολιασμού (ΕΠΕ) το 2006 [29]. Το εμβόλιο περιλαμβάνει τους ορότυπους 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F. Το όφελος του συστηματικού εμβολιασμού κυρίως στα παιδιά <5 ετών, αλλά και γενικότερα στο κοινωνικό σύνολο μέσω του φαινομένου της συλλογικής ανοσίας έχει καταδειχθεί σε πολυάριθμες διεθνείς μελέτες [30,31]. Αξίζει να αναφερθεί μια σημαντική μείωση των ΔΠΝ από τους ορότυπους του εμβολίου που καταγράφηκε σε πολλά ευρωπαϊκά κράτη, όπως μείωση κατά 39% στις πνευμονιοκοκκικές μηνιγγίτιδες και 29% στις βακτηριαιμίες σε παιδιά < 2 ετών στη Γαλλία [32], μείωση κατά 50% των ΔΠΝ σε παιδιά < 2 ετών στη Γερμανία [33], και κατά 40% στην Ισπανία [34] κατά 95% των ΔΠΝ από ορότυπους του PCV-7 σε παιδιά <5 ετών στην Νορβηγία [35], κατά 89% σε παιδιά <2 ετών στη Δανία [36], και κατά 98% στην ίδια ηλικιακή ομάδα στην Αγγλία και Ουαλία [37]. Στις ΗΠΑ η μείωση των ΔΠΝ από τους 7 ορότυπους του εμβολίου σε παιδιά > 5 ετών έφθασε το 100% το 2007, που αντιπροσώπευε μια συνολική μείωση κατά 76% των συνολικών περιστατικών ΔΠΝ [38]. Αντίστοιχα για τους ενήλικες >65 ετών, στα πλαίσια της συλλογικής ανοσίας, η μείωση των ΔΠΝ από τους ορότυπους του PCV-7 έφθασε το 92% και το 37% συνολικά για όλα τα περιστατικά ΔΠΝ [39]. Σημαντικά ήταν τα οφέλη και στις μη διεισδυτικές λοιμώξεις, αφού καταγράφηκε μείωση κατά 22% στο συνολικό αριθμό νοσηλειών παιδιών <1 έτους με CAP (Community Acquired Pneumonia) στις ΗΠΑ [40] μείωση κατά 70,5% των νοσηλειών πνευμονιοκοκκικής πνευμονίας στην Ιταλία [41] και 48% των περιστατικών ΟΜΩ με ωτόρροια στη χώρα μας [42]. Τέλος, σημαντική είναι και η μείωση που επέφερε η χρήση του εμβολίου

19 Ορότυπος στη ρινοφαρυγγική φορεία των ορότυπων του εμβολίου, η οποία σε πρόσφατη μελέτη από την Ολλανδία ανέρχεται σε 92% σε παιδιά 24 μηνών και 94% στους γονείς τους [43].H κατανομή των επιβεβαιωμένων επεισοδίων διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής νόσου ανά ορότυπο την τριετία φαίνεται στην Εικόνα 3. Συχνότητα % Εικόνα 3. Κατανομή επεισοδίων ΔΠΝ ανά ορότυπο στο γενικό πληθυσμό της Ευρώπης κατά τα έτη (Πηγή: ECDC 2014) Η ευρεία χρήση του PCV-7 οδήγησε σε σημαντική μείωση των περιπτώσεων ΔΠΝ από τους 7 ορότυπους, αλλά έφερε στο προσκήνιο κάποιους άλλους ορότυπους που δεν περιλαμβάνονται και χαρακτηρίζονται από σημαντική διεισδυτική ικανότητα, όπως οι 1,5,6A και κυρίως ο 19A [44]. Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκαν συζευγμένα πνευμονιοκοκκικά εμβόλια 2ης γενιάς, με σκοπό την αντιμετώπιση των αναδυόμενων αυτών οροτύπων. Το 2009, εντάχθηκε στο Εθνικό Πρόγραμμα Εμβολιασμών (ΕΠΕ) το 10δύναμο συζευγμένο πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο (PCV-10), που περιελάμβανε επιπλέον του 7δύναμου τους ορότυπους 1, 5 και 7F, ενώ τον

20 Ιούνιο του 2010 εντάχθηκε το 13δύναμο συζευγμένο πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο [45] (PCV-13), στο οποίο περιλαμβάνονται οι ορότυποι του 10δύναμου και επιπλέον οι ορότυποι 3, 6Α και 19Α, που έχουν αυξημένη παρουσία και στη χώρα μας τα τελευταία χρόνια [46]. Πολυκεντρική μελέτη που διεξήχθη στη χώρα μας, έδειξε ότι ο ορότυπος 19Α είναι το συχνότερο αίτιο ΔΠΝ και ΟΜΩ σε παιδιά <5 ετών, ενώ είναι συχνά πολυανθεκτικός σε θεραπείες πρώτης γραμμής [47]. Μέσα σε λίγα χρόνια από τη χρήση του PCV-13 τα στοιχεία για την αποτελεσματικότητά του είναι ιδιαίτερα θετικά. Στις ΗΠΑ αρχικά στοιχεία από 8 μεγάλα νοσοκομεία υποδεικνύουν μια μείωση κατά 36% των περιστατικών ΔΠΝ σε παιδιά, ένα χρόνο μετά την εισαγωγή του εμβολίου με αντίστοιχη μείωση κατά 45% των περιπτώσεων από τον ορότυπο 19Α [48]. Σημαντική μείωση των δηλούμενων περιπτώσεων ΔΠΝ από τους 6 επιπρόσθετους ορότυπους του εμβολίου καταγράφηκε επίσης από το HPA (Health Protection Agency) στα παιδιά <2 ετών και ιδίως από τους ορότυπους 19Α και 7F [49,50]. Στη Γερμανία, τρία χρόνια μετά την χρησιμοποίηση των συζευγμένων εμβολίων 2ης γενιάς καταγράφονται λιγότερα περιστατικά ΔΠΝ από τους ορότυπους 1, 3, 7F και 19A σε παιδιά <2 ετών [51]. Αξίζει να σημειωθεί ότι στη χώρα μας, σύμφωνα με στοιχεία του ΚΕΕΛΠΝΟ, μέσα στο πρώτο χρόνο κυκλοφορίας του PCV- 13 καταγράφηκε μείωση 23,3% των περιστατικών πνευμονιοκοκκικής μηνιγγίτιδας σε παιδιά <5 ετών [52]. Τα συζευγμένα πνευμονιοκοκκικά εμβόλια σύμφωνα με το ισχύον ΕΠΕ χορηγούνται σε 4 δόσεις στις ηλικίες 2, 4, 6 και μηνών [52]. To πολυσακχαριδικό εμβόλιο ήταν το πρώτο εμβόλιο προερχόμενο από πολυσακχαρίτη του ελύτρου του περιβλήματος του μικροοργανισμού, αποτελώντας ορόσημο στην ιστορία της Ιατρικής. Τα πολυσακχαριδικά αντιγόνα χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να επάγουν τα αντιγονοειδικά αντισώματα που ενισχύουν τον οψωνισμό, τη φαγοκυττάρωση και των κυτταρικό θάνατο από τα φαγοκύτταρα.

21 Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε 4δύναμο εμβόλιο, ωστόσο, λόγω της υψηλής επίπτωσης πολυανθεκτικών στελεχών και της σημαντικής νοσηρότητας και θνητότητας που σχετιζόταν με τη διηθητική πνευμονικοκκική λοίμωξη, έκανε το εμβόλιο πιο ελκυστικό ιδίως σε ασθενείς υψηλού κινδύνου. Το διαθέσιμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο περιλαμβάνει 23 κεκαθαρμένα πολυσακχαριδικά αντιγόνα του ελύτρου (ορότυποι 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, and 33F).Οι ορότυποι αυτοί επιλέχθηκαν ώστε να εκπροσωπούν το 85-90% των οροτύπων που προκαλούν διηθητική πνευμονιοκοκκική νόσο. Ο πρωτογενής εμβολιασμός με το 23-PPVεπάγει λειτουργικά αντισώματαπου διατηρούνται επί μακρόν στους ενήλικες [53, 54]. Πολλαπλές μελέτες κατέδειξαν την αποτελεσματικότητα του εμβολίου έναντι της ΔΠΝ, όπως η βακτηριαιμία και η μηνιγγίτιδα [55-62]. Ωστόσο, υπάρχουν αντιφατικά δεδομένα αναφορικά με την αποτελεσματικότητά του στην πρόληψη της πνευμονίας, με τις περισσότερες μελέτες να μη δείχνουν μείωση του κινδύνου για πνευμονία από οποιαδήποτε αιτία και από τον πνευμονιόκοκκο [57, 61, 63, 64], ωστόσο άλλες μελέτες δείχνουν σημαντική μείωση σε ηλικιωμένους ενήλικες [65]. Μια τυχαιοποιημένη μελέτη επίσης, προτείνει ότι το 23 PPV μειώνει την επίπτωση πνευμονίας από όλες τις αιτίες σε τροφίμους νοσηλευτικών ιδρυμάτων [66]. Η βιβλιογραφία υποστηρίζει ότι το μεγαλύτερο όφελος από το PPV-23 είναι η πρόληψη της ΔΠΝ. Βάσει αυτού, ο εμβολιασμός με το πολυσακχαριδικό εμβόλιο ακόμα συστήνεται στα άτομα υψηλού κινδύνου, συμπεριλαμβανομένων των ενηλίκων και ατόμων με συγκεκριμένες συννοσηρότητες, όπως η στεφανιαία νόσος, η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, ο σακχαρώδης διαβήτης, η νεφρική νόσος και η HIV λοίμωξη.

22 Επεισόδια % Επεισόδια % Β. Κατευθυντήριες οδηγίες στον HIV πληθυσμό Οι λοιμώξεις από πνευμονιόκοκκο, συμπεριλαμβανομένης της πνευμονίας και της διεισδυτικής νόσου, όπως η βακτηριαιμία και η μηνιγγίτιδα, ήταν μια σημαντική πηγή νοσηρότητας και θνησιμότητας από την αρχή της επιδημίας του HIV, που οδήγησε τους ειδικούς να υποστηρίξουν τη χρήση του πνευμονιοκοκκικού εμβολίου για την πρωτογενή πρόληψη σε ασθενείς με HIV λοίμωξη [67] (Εικόνα 4). Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα του πνευμονιοκοκκικού εμβολίου σε αυτό τον πληθυσμό ασθενών έχει συζητηθεί για πολλά χρόνια [68]. Επιπλέον, τα πνευμονιοκοκκικά εμβόλια είναι ειδικά για κάθε ορότυπο, έτσι η αποτελεσματικότητά τους ποικίλει ανάλογα με τους επικρατούντες οροτύπους εντός της κάθε κοινότητας. Ασθενείς με HIV λοίμωξη Ορότυποι Ασθενείς χωρίς HIV λοίμωξη Ορότυποι Περίοδος προ εμβολιασμού Περίοδος μετά εμβολιασμού

23 Εικόνα 4. Επίπτωση επεισοδίων ΔΠΝ σε υγιή και HIV-1 θετικά άτομα από τους πιο λοιμογόνους ορότυπους το 2014 στην Ευρώπη πριν και μετά την ανοσοποίηση (Πηγή: ECDC 2014)

24 Διαθέσιμα σκευάσματα του πολυσακχαριδικού εμβολίου Δύο τύποι πνευμονιοκοκκικού εμβολίου είναι διαθέσιμοι: το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό (PPV-23) και ένα 13-δύναμο συζευγμένο εμβόλιο (PCV13), το οποίο αντικατέστησε το συζευγμένο εμβόλιο 7-δύναμο (PCV7). Το εμβόλιο PCV13 επεκτείνει την κάλυψη του PCV7 συμπεριλαμβάνοντας επιπλέον έξι πρόσθετους ορότυπους έναντι του πνευμονιόκοκκου, συμπεριλαμβανομένου του ορότυπου 19Α, ο οποίος έχει αυξηθεί σε συχνότητα στις Ηνωμένες Πολιτείες μετά την εισαγωγή του εμβολιασμού με το PCV7 στα παιδιά [69,70]. Αποτελεσματικότητα και ανοσογονικότητα του εμβολιασμού έναντι του πνευμονιόκοκκου Η ανοσοποίηση έναντι του πνευμονιόκοκκου συνιστάται για ασθενείς με HIV λοίμωξη στις ανεπτυγμένες χώρες από τα μέσα της δεκαετίας του 1990, με βάση την υψηλή επίπτωση της διεισδυτικής νόσου σε αυτόν τον πληθυσμό ασθενών [71]. Οι μόνες κλινικές μελέτες αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας του εμβολίου κατά του πνευμονιόκοκκου σε HIV οροθετικούς ασθενείς έχουν διεξαχθεί σε χώρες με περιορισμένους πόρους. Η πρώτη κλινική μελέτη που εξέτασε την αποτελεσματικότητα του πολυσακχαριδικού εμβολίου διεξήχθη το 1995 σε 1312 ενήλικες ασθενείς με HIV για διάστημα τριών ετών παρακολούθησης [72, 73]. Οι συμμετέχοντες χωρίστηκαν τυχαία και έλαβαν μία δόση πολυσακχαριδικό εμβόλιο ή εμβολιασμό με εικονικό φάρμακο. Διεισδυτική πνευμονιοκοκκική νόσος με βακτηριαιμία παρατηρήθηκε μόνο σε 25 ασθενείς (HR 1.47; 95% CI 0,7-3,3). Οι τίτλοι αντισωμάτων μετά τον εμβολιασμό διπλασιάστηκαν μόνο στο 40 τοις εκατό όσων έλαβαν το εμβόλιο.οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι αν και η πνευμονιοκοκκική ανοσοποίηση με το πολυσακχαριδικό εμβόλιο ήταν καλά ανεκτή, το εμβόλιο δεν παρείχε προστασία. Πολλαπλές μελέτες παρατήρησης έχουν πραγματοποιηθεί στον ανεπτυγμένο κόσμο προκειμένου να

25 αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του πολυσακχαριδικου εμβολίου ενάντι της πνευμονίας από κάθε αιτία, της πνευμονιοκοκκικής πνευμονίας, καθώς και της διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής νόσου. Μια συστηματική ανασκόπηση των στοιχείων αυτών καταλήγει στο συμπέρασμα ότι υπάρχει όφελος από το πολυσακχαριδικό εμβόλιο [68]. Ωστόσο, μερικές μελέτες μόνο υποστηρίζουν την αποτελεσματικότητα του πολυσακχαριδικού πνευμονιοκοκκικού εμβολίου σε ενήλικες ασθενείς με HIV λοίμωξη[68]. Η αντισωματική απάντηση στο 23-δύναμο πολυσακχαριδικό πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο σε ασθενείς με HIV είναι χαμηλότερη από εκείνη που επιτυγχάνεται σε υγιή άτομα [74-75]. Τα ποσοστά ορομετατροπής είναι γενικά χαμηλότερα σε ασθενείς με αριθμό CD4 λεμφοκυττάρων <300 κύτταρα/mm 3 [76-78], αν και οι ασθενείς υπό HAART επιτυγχάνουν μια πιο σταθερή αντισωματική απόκριση, συγκριτικά με ασθενείς χωρίς θεραπεία, ανεξάρτητα από την αρχική τιμή του αριθμού των CD4 κυττάρων πριν από την ανοσοποίηση [79]. Τον Δεκέμβριο του 2011, η Aμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) ενέκρινε το συζευγμένο πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο (PCV13) για χρήση σε ενήλικες 50 ετών, που βασίστηκε σε δεδομένα ασφάλειας και ανοσογονικότητας σε περισσότερους από 6000 HIV-οροαρνητικούς ενήλικες. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν, ότι η επαγόμενη από PCV13 αντιωματική απόκριση ήταν, είτε συγκρίσιμη ή υψηλότερη από την απόκριση που επάγονταν από το πολυσακχαριδικό πνευμονιοκοκκικό εμβόλιο (PPV-23) [80-82]. Το PCV13 φαίνεται επίσης να έχει ένα παρόμοιο προφίλ ασφάλειας με το PPV-23. Ωστόσο, το 2012, η Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) άρχισε να συνιστά ταυτόχρονη χορήγηση του PPV-23 και PCV13 για τα άτομα ηλικίας 19 ετών και άνω και συνυπάρχουσα ανοσοκαταστολή (συμπεριλαμβανομένης της HIV λοίμωξης) ή άλλη κατάσταση που αυξάνει τον κίνδυνο διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής νόσου ή πνευμονιοκοκκικής πνευμονίας [83], αν και δεν

26 υπάρχουν δεδομένα που να προσδιορίζουν την αποτελεσματικότητα και την ανοσογονικότητα του PCV13 στους HIV ασθενείς. Χρόνος ανοσοποίησης Για τους ασθενείς με αριθμό CD4 κυττάρων <200 κύτταρα/mm 3, που δεν έχουν λάβει ακόμη PPV-23, η χορήγηση του PPV-23 είναι σκόπιμο να αναβάλλεται μέχρι ο ασθενής να έχει επιτύχει κάποιο βαθμό αποκατάστασης του ανοσοποιητικού συστήματος (δηλαδή, έναν ελάχιστο αριθμό CD4 κυττάρων ίσο ή μεγαλύτερο από 200 κύτταρα/mm 3 ) με την αντιρετροϊκή θεραπεία (HAART), δεδομένης της υποανοσογονικότητας του εμβολίου σε χαμηλότερο αριθμό CD4 κυττάρων και το σχετικό όφελος της HAART στην αντισωματική απάντηση. Αυτό είναι συμβατό με τις οδηγίες από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC), το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, και τις συστάσεις του HIV Medicine Association, που σημειώνουν ότι αν και το PPV-23 μπορεί να δοθεί τουλάχιστον οκτώ εβδομάδες μετά τη χορήγηση του PCV13, είναι προτιμότερο να αναβάλλεται η χορήγηση του PPV-23 μέχρις ότου ο αριθμός των κυττάρων CD4 να υπερβεί τα 200 κυττάρα/mm 3 [84]. Από την άλλη πλευρά, η Αμερικάνικη Εταιρεία Λοιμώξεων συνιστά χορήγηση του PPV-23 ακόμη και αν ο αριθμός των κυττάρων CD4 είναι κάτω από 200 κύτταρα/mm 3, αλλά και την επαναθεώρηση του επαναληπτικού εμβολιασμού για αυτούς τους ασθενείς όταν ο αριθμός των CD4 κυττάρων αυξηθεί ικανοποιητικά [85].

27 Γ. 23-δυναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο έναντι του Streptococcus pneumoniae Θεραπευτικές ενδείξεις Το PNEUMOVAX 23 ενδείκνυται για ενεργητική ανοσοποίηση έναντι νόσου από τους ορότυπους του πνευμονιόκοκκου που περιέχονται στο εμβόλιο [86]. Το εμβόλιο συνιστάται σε άτομα ηλικίας 2 ετών και άνω για τα οποία υπάρχει αυξημένος κίνδυνος νοσηρότητας και θνησιμότητας από πνευμονιοκοκκική λοίμωξη [87]. Οι ειδικές ομάδες κινδύνου που πρέπει να ανοσοποιηθούν καθορίζονται βάσει των επισήμων συστάσεων. Η ασφάλεια και αποτελεσματικότητα του εμβολίου δεν έχει τεκμηριωθεί σε παιδιά μικρότερα των 2 ετών, στα οποία η αντισωματική απάντηση μπορεί να είναι πτωχή. Το εμβόλιο δεν ενδείκνυται για την προφύλαξη από οξεία μέση ωτίτιδα, παραρινοκολπίτιδα και άλλες συνήθεις λοιμώξεις του ανωτέρου αναπνευστικού συστήματος. Δοσολογία & τρόπος χορήγησης Οι ενήλικες και παιδιά ηλικίας 2 ετών και άνω εμβολιάζονται με μία εφάπαξ δόση 0.5 ml ενδομυϊκά ή υποδόρια. Το εμβόλιο πνευμονιόκοκκου συνιστάται να χορηγείται κατά προτίμηση τουλάχιστον δύο εβδομάδες πριν από σπληνεκτομή ή την έναρξη χημειοθεραπείας ή άλλης ανοσοκατασταλτικής αγωγής. Ο εμβολιασμός πρέπει να αποφεύγεται κατά τη διάρκεια χημειοθεραπείας ή ακτινοβολίας. Μετά την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας και/ή ακτινοβολίας για νεοπλασία, η ανοσολογική απάντηση στον εμβολιασμό μπορεί να παραμείνει μειωμένη. Το εμβόλιο δεν πρέπει να χορηγείται νωρίτερα από τρεις μήνες μετά την ολοκλήρωση μιας τέτοιας θεραπείας. Μπορεί να απαιτηθεί περισσότερος χρόνος σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε εντατική ή παρατεταμένη θεραπεία [88].

28 Άτομα με ασυμπτωματική ή συμπτωματική λοίμωξη από HIV πρέπει να εμβολιάζονται αμέσως μετά την επιβεβαίωση της διάγνωσης [89-90]. Επανεμβολιασμός Οι υγιείς ενήλικες και παιδιά συνήθως δεν πρέπει να επανεμβολιάζονται. Ο κατάλληλος χρόνος και η ανάγκη για επανεμβολιασμό πρέπει να καθορίζονται βάσει των επισήμων συστάσεων [90]. Μία εφάπαξ δόση 0.5 ml ενδομυϊκά ή υποδόρια πρέπει να γίνεται επί ενδείξεων για επανεμβολιασμό. Δεν συνιστάται επανεμβολιασμός σε διάστημα μικρότερο των τριών ετών λόγω αυξημένου κινδύνου ανεπιθύμητων ενεργειών [88-90]. Υπάρχουν περιορισμένα κλινικά στοιχεία που αφορούν τη χορήγηση περισσοτέρων από δύο δόσεις PNEUMOVAX 23. Ενήλικες Συνιστάται επανεμβολιασμός σε άτομα με αυξημένο κίνδυνο βαριάς πνευμονιοκοκκικής λοίμωξης, οι οποίοι εμβολιάσθηκαν σε διάστημα μεγαλύτερο των πέντε ετών ή που είναι γνωστό ότι εμφανίζουν ταχεία μείωση των επιπέδων αντισωμάτων κατά του πνευμονιόκοκκου. Σε ορισμένους πληθυσμούς υψηλού κινδύνου για θανατηφόρα πνευμονιοκοκκική λοίμωξη (π.χ. ασπληνικοί ασθενείς), πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ο επανεμβολιασμός στα τρία χρόνια. Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες Το εμβόλιο παρασκευάζεται από κεκαθαρμένα πολυσακχαριδικά αντιγόνα του ελύτρου του πνευμονιόκοκκου, που προέρχονται από τους 23 ορότυπους, οι οποίοι ευθύνονται για το 90% περίπου των διεισδυτικών πνευμονιοκοκκικών λοιμώξεων. Η παρουσία χυμικών αντισωμάτων έναντι ειδικού τύπου, θεωρείται γενικά, ότι προφυλάσσει από πνευμονιοκοκκική λοίμωξη. Συγκρινόμενα τα επίπεδα

29 αντισωμάτων μετά τον εμβολιασμό με αυτά πριν από τον εμβολιασμό ή με αρνητικό ορό μάρτυρα δείχνουν ότι το εμβόλιο προκαλεί ανοσιακή απάντηση για κάθε έναν από τους 23 τύπους ελύτρου που περιέχονται στο εμβόλιο. Όπως μετράται με ραδιοανοσολογικές ή ενζυμικές ανοσολογικές μεθόδους, τα περισσότερα άτομα (85 έως 95%) απαντούν με παραγωγή αντισωμάτων έναντι των περισσότερων ή έναντι και των 23 αντιγόνων. Προστατευτικά επίπεδα αντισωμάτων έναντι ειδικού τύπου πολυσακχαρίτη του ελύτρου, εμφανίζονται συνήθως την τρίτη εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό. Παρόλο που η διάρκεια της προστατευτικής δράσης του εμβολίου δεν είναι γνωστή, προηγούμενες μελέτες με άλλα εμβόλια πνευμονιόκοκκου δείχνουν ότι τα αντισώματα μερικών ορότυπων μπορεί να μειωθούν σε 3 έως 5 χρόνια μετά τον εμβολιασμό, ανάλογα με τον ορότυπο και τον πληθυσμό. Σε μερικές ομάδες (π.χ. παιδιά) τα επίπεδα των αντισωμάτων μπορεί να μειωθούν πιο γρήγορα. Περιορισμένα δημοσιευμένα στοιχεία δείχνουν ότι τα επίπεδα των αντισωμάτων μπορεί να μειωθούν ακόμη πιο γρήγορα στους ηλικιωμένους. Επιδημιολογικές μελέτες [91] δείχνουν ότι ο εμβολιασμός μπορεί να προστατεύσει για τουλάχιστον 9 χρόνια μετά τη χορήγηση της πρώτης δόσης του εμβολίου. Έχει αναφερθεί μειωμένη αποτελεσματικότητα, όσο αυξάνεται ο χρόνος μετά τον εμβολιασμό, ιδιαίτερα σε υπερήλικες (άτομα ηλικίας 85 ετών). Τα προστατευτικά επίπεδα των αντισωμάτων του πολυσακχαρίτη του ελύτρου δεν έχουν προσδιοριστεί για πνευμονιοκοκκικές λοιμώξεις που οφείλονται σε οποιοδήποτε τύπο ελύτρου. Ωστόσο, σε κλινικές μελέτες με πολυδύναμα πολυσακχαριδικά εμβόλια πνευμονιόκοκκου, διπλάσια ή και μεγαλύτερη αύξηση των επιπέδων αντισωμάτων θεωρήθηκε αποτελεσματική. Η αποτελεσματικότητα του πολυδύναμου πολυσακχαριδικού εμβολίου πνευμονιόκοκκου, αποδείχθηκε σε πνευμονία από πνευμονιόκοκκο και βακτηριαιμία σε τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες μελέτες σε νέους εργαζόμενους ορυχείων [91]. Η προστατευτική αποτελεσματικότητα σε πνευμονία από πνευμονιόκοκκο, τον αρχικό

30 στόχο αυτών των μελετών, με ένα εξαδύναμο εμβόλιο ήταν 76.1% και με ένα δωδεκαδύναμο εμβόλιο 91.7% αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η αποτελεσματικότητα του εμβολίου στην πρόληψη διεισδυτικής πνευμονιοκοκκικής λοίμωξης σε πληθυσμό στόχο αξιολογήθηκε σε αρκετές μελέτες [92-93]. Αυτές οι μελέτες έδειξαν γενικά ότι το εμβόλιο ήταν αποτελεσματικό στο 50 έως 70% των ατόμων στα οποία ενδείκνυται ο εμβολιασμός. Η αποτελεσματικότητα έχει αποδειχθεί σε άτομα με σακχαρώδη διαβήτη, χρόνιο καρδιακό ή πνευμονικό νόσημα και ανατομική ασπληνία. Δεν έχει αποδειχθεί ότι ο εμβολιασμός είναι αποτελεσματικός σε άτομα άλλων ομάδων υψηλού κινδύνου, καθώς ο αριθμός των ασθενών σε αυτές τις μελέτες ήταν γενικά πολύ μικρός. Σε άλλη μελέτη βρέθηκε ότι ο εμβολιασμός προσφέρει σημαντική προστασία από διεισδυτική πνευμονιοκοκκική λοίμωξη που προκαλείται από αρκετούς μεμονωμένους ορότυπους (π.χ. 1, 3, 4, 8, 9V και 14). Για άλλους ορότυπους, ο αριθμός των περιπτώσεων ήταν πολύ μικρός και έτσι τα στοιχεία για την αποτελεσματικότητα ήταν αβάσιμα [94]. Υπάρχουν περιορισμένα κλινικά στοιχεία που αφορούν τη χορήγηση περισσοτέρων από δύο δόσεις PNEUMOVAX 23 [95]. Streptococcus pneumoniae και αντιβιοτική αντοχή Ο Streptococcus pneumoniae είναι ένα Gram (+) βακτήριο με έλυτρο. Το έλυτρό του συμβάλλει στη λοιμογονικότητα του παθογόνου και προστατεύει το βακτήριο από τη φαγοκυττάρωση (Εικόνα 5). Πνευμονιόκκοκοι χωρίς έλυτρο, όπως είναι το εργαστηριακό στέλεχος αναφοράς R6, θεωρούνται μη παθογόνοι. Ενενήντα ένας διαφορετικοί ορότυποι έχουν ως τώρα αναγνωριστεί. Αυξημένη αντοχή του πνευμονιόκοκκου παγκοσμίως οφείλεται κυρίως σε πολυανθεκτικούς κλώνους του παθογόνου [96]. Τρέχοντα δεδομένα δείχνουν ότι η αντοχή του πνευμονιόκοκκου πλέον απασχολεί και χώρες με παραδοσιακά χαμηλά επίπεδα αντοχής, όπως η Γερμανία [97]. Τα ανθεκτικά στις μακρολίδες στελέχη έχουν τριπλασιαστεί την τελευταία 7ετία (1997, 8.7%; 2004, 29%). Τα ανθεκτικά στις μακρολίδες στελέχη είναι

31 ιδιαίτερου ενδιαφέροντος καθώς σχετίζονται με αυξημένη κλινική θεραπευτική αποτυχία [98]. Αντιθέτως, η αντοχή στην πενικιλλίνη, μπορεί να σχετίζεται με τη θεραπεία της πνευμονίας σε πολύ υψηλές ανασταλτικές συγκεντρώσεις(mics) (>4 mg/l) [99]. Ωφέλεια από τον εμβολιασμό με το 23-PPV Ο εμβολιασμός των ενηλίκων με το 23δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο είναι κλινικά χρήσιμος παρά τη σχετικά χαμηλή και χρονικά πεπερασμένη του αποτελεσματικότητα. Αυτό γίνεται προφανές από μια ισπανική μελέτη [100], όπου καταδείχθηκε ότι, από 524 ασθενείς νοσηλευόμενους με διεγνωσμένη πνευμονιοκοκκική πνευμονία, η ομάδα των ασθενών (11%) που έλαβε το 23δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο εντός 5 ετών πριν τη νοσηλεία τους, όντως παρουσίασαν χαμηλότερα ποσοστά βακτηριαιμίας σε σχέση με τους ανεμβολίαστους (15% vs. 35%). Επίσης, οι ασθενείς αυτής της ομάδας απυρέτησαν γρηγορότερα (1.7 ημέρες vs. 2.9 ημέρες) και πήραν εξιτήριο νωρίτερα (9.4 ημέρες vs ημέρες). Η θνησιμότητα ήταν επίσης χαμηλότερα (1.6% vs. 6.1%) [101]. Το όφελος από τα πολυσακχαριδικά εμβόλια για τη δημόσια υγεία στηρίζεται επίσης και από μια από τις μεγαλύτερες μελέτες παρέμβασης, που πραγματοποιήθηκαν ποτέ [102]. Μεταξύ των ετών , από όλους τους κατοίκους της Στοκχόλμης >65 ετών (n = ), άτομα εμβολιάστηκαν έναντι του πνευμονιόκοκκου και της γρίπης. Η συνολική θνησιμότητα ήταν χαμηλότερη κατά 57% (95% CI 55 60%) στην ομάδα των εμβολιασμένων συγκριτικά με τους μη εμβολιασμένους (15.1 vs θάνατοι ανά 1000 κατοίκους; P < ) [102].

32 Πολυσακχαριδική κάψα Εικόνα 5. Πνευμονιόκοκκος με καψιδιακό περίβλημα (Εικόνα μικροσκοπίου/πηγή: Pneumococcal vaccines: mechanism of action, impact on epidemiology and adaption of the species. Int J Antimicrob Agents Sep;32 (3): )

33 3. Ανοσία στο 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο Εισαγωγή Στόχος του εμβολιασμού με το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο είναι η παραγωγή αντισωμάτων έναντι των 23 οροτύπων του ελύτρου του Streptococcus pneumoniae, που αποτελεί τον κατεξοχήν προστατευτικό μηχανισμό έναντι του παθογόνου[103]. Οι πολυσακχαρίτες του πνευμονιόκοκκου θεωρούνται Τ-κυτταρικά ανεξάρτητα αντιγόνα (θυμοανεξάρτητα αντιγόνα, Thymus independent, ΤI). Πρόσφατες in vitro μελέτες [104] έδειξαν ότι οι πολυσακχαρίτες του ελύτρου του ορότυπου 1-ακόμα και χωρίς συζευγμένη πρωτεΐνη- μπορούν να παρουσιαστούν από τα δενδριτικά κύτταρα στα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα χωρίς διαμεσολάβηση. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα διεγείρουν άμεσα τα Β λεμφοκύτταρα σε παραγωγή αντισωμάτων χωρίς την διαμεσολάβηση από τα Τ λεμφοκύτταρα [103]. Ειδικότερα, αυτά περιλαμβάνουν αντιγόνα με πολυμερή δομή και διακρίνονται σε δυο υποκατηγορίες, με βάση την ικανότητα τους να επάγουν πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων, δηλαδή πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση πολλών κλώνων Β λεμφοκυττάρων, ανεξάρτητα από την αντιγονική ειδικότητα τους. Τα ανεξάρτητα αντιγόνα τύπου 1 (TI-1), όπως οι βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες, είναι πολυκλωνικοί ενεργοποιητές ανεξάρτητα από τα Τ λεμφοκύτταρα. Αντίθετα, τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα τύπου 2 (TI-2) απαιτούν την παρουσία μικρού αριθμού Τ λεμφοκυττάρων και κάποιων κυτταροκινών και δεν έχουν την ικανότητα πολυκλωνικής ενεργοποίησης [103].

34 Α. Βασικές αρχές ανοσιακής απόκρισης επαγόμενες από τον Streptococcus pneumoniae Αντισωματικές απαντήσεις σε Τ-ανεξάρτητα αντιγόνα Οι πολυσακχαρίτες, όπως ήδη αναφέρθηκε, επάγουν αντισωματικές απαντήσεις χωρίς τη συμμετοχή των βοηθητικών Τ κυττάρων. Τα μη πρωτεϊνικά αυτά αντιγόνα δε μπορούν να προσδεθούν με τα μόρια Μείζονος Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας (MHC) και επομένως να αναγνωρισθούν από τα Τ κύτταρα. Πολλά βακτήρια φέρουν έλυτρο πλούσιο σε πολυσακχαρίτες και στην άμυνα κατά των μικροοργανισμών αυτών μεσολαβούν κυρίως αντισώματα που προσδένονται στους πολυσακχαρίτες του ελύτρου και σημαίνουν τα βακτήρια ώστε να φαγοκυτταρωθούν. Παρά τη σπουδαιότητα των αντισωματικών απαντήσεων κατά τέτοιων Τ-ανεξάρτητων αντιγόνων, δεν είναι απόλυτα ξεκάθαρο το πώς επάγονται. Είναι γνωστό, ότι οι αντισωματικές απαντήσεις σε Τ-ανεξάρτητα αντιγόνα διαφέρουν από πολλές απόψεις από τις απαντήσεις κατά πρωτεϊνών, και οι περισσότερες από τις διαφορές αυτές αποδίδονται στο ρόλο των Τ κυττάρων στις αντισωματικές απαντήσεις κατά πρωτεϊνών (Εικόνα 6). Επειδή τα πολυσακχαριδικά αντιγόνα φαίνεται να περιέχουν συχνά πολυσθενείς συστοιχίες του ίδιου επιτόπου, είναι ικανά να διασυνδέσουν πολλούς αντιγονικούς υποδοχείς πάνω σε ένα συγκεκριμένο Β κύτταρο. Η εκτεταμένη αυτή διασύνδεση μπορεί να ενεργοποιήσει τα Β κύτταρα με αρκετή ισχύ, ώστε να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση τους, χωρίς την προϋπόθεση για βοήθεια από τα Τ κύτταρα. Τα φυσικά πρωτεϊνικά αντιγόνα συνήθως δεν είναι πολυσθενή και ίσως αυτός να είναι ο λόγος που δεν επάγουν πλήρεις Β κυτταρικές απαντήσεις από μόνα τους, αλλά εξαρτώνται από τα βοηθητικά Τ κύτταρα για να ξεκινήσουν την παραγωγή αντισώματος. Τα αντισώματα που παράγονται σε απόκριση σε Τ-ανεξάρτητα αντιγόνα εμφανίζουν σχετικά μικρή μεταστροφή ισοτύπου κι ωρίμανση συγγένειας [103].

35 Εικόνα 6. Χαρακτηριστικά των αντισωματικών απαντήσεων σε ανεξάρτητα των Τ κυττάρων αντιγόνα. Τα εξαρτώμενα από τα Τ κύτταρα αντιγόνα και τα ανεξάρτητα από τα Τ κύτταρα αντιγόνα (μη πρωτεϊνικά) επάγουν αντισωματικές απαντήσεις με διαφορετικά χαρακτηριστικά, που αντανακλούν σε μεγάλο βαθμό τη συμμετοχή των βοηθητικών Τ κυττάρων στις απαντήσεις (Πηγή:Basic Immunology: Functions and disorders of the immune system. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman 2004, τροποποιημένη) [103]. Αναγνώριση των αντιγονικών επιτόπων του Str.pneumoniae από τα λεμφοκύτταρα Ο Β κυτταρικός υποδοχέας αναγνωρίζει και συνδέεται με επιτόπους που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια διαλυτών αντιγόνων (Εικόνα 7). Η χυμική ανοσοαπόκριση μέσω των αντισωμάτων ξεκινά όταν τα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίσουν το αντιγόνο και δεχθούν και το απαιτούμενο συνδιεγερτικό σήμα από ένα δραστικό Τ βοηθητικό λεμφοκύτταρο, είτε απευθείας από μικροβιακά συστατικά.

36 Αντιγόνα Αντιγόνα θυμοανεξάρτητα Κυτταροκίνες Β λεμφοκύτταρα Τ λεμφοκύτταρα Ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα Ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα Εικόνα 7. Ρόλος των κυτταροκινών στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων στην ανοσιακή απόκριση (Πηγή: Basic Immunology: Functions and disorders of the immune system. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman 2004, τροποποιημένη) [103]. Διέγερση των Β λεμφοκυττάρων από τον πνευμονιόκοκκο Τα Β λεμφοκύτταρα χρησιμοποιούν, όπως αναφέρθηκε, τους μεμβρανικούς υποδοχείς ανοσοσφαιρίνης (lg) για να αναγνωρίσουν το αντιγόνο στη φυσική του διαμόρφωση, δηλαδή χωρίς να είναι απαραίτητη η επεξεργασία του. Η αναγνώριση του αντιγόνου πυροδοτεί τις οδούς σηματοδότησης που έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του Β κυττάρου. Όπως στα Τ λεμφοκύτταρα, η ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων απαιτεί επίσης δεύτερα σήματα, πολλά από τα οποία παράγονται κατά τις αντιδράσεις της φυσικής ανοσίας κατά των μικροοργανισμών.

37 Έτσι, η αντιγονική διέγερση επάγει την πρώιμη φάση των χυμικών ανοσοαπαντήσεων. Η απάντηση αυτή είναι μεγαλύτερη όταν το αντιγόνο είναι πολυσθενές, διασύνδεει πολλούς αντιγονικούς υποδοχείς και ενεργοποιεί ισχυρά το συμπλήρωμα, γεγονότα που τα συναντάμε τυπικά στους πολυσακχαρίτες και σε άλλα Τ-ανεξάρτητα αντιγόνα. Τα περισσότερα διαλυτά αντιγόνα δεν περιέχουν πολλαπλούς πανομοιότυπους επιτόπους και δεν μπορούν να διασυνδέσουν πολλούς υποδοχείς στα Β κύτταρα, επομένως θα διεγείρουν μόνο ασθενείς ανοσοαπαντήσεις από μόνα τους. Η διέγερση από το αντιγόνο επάγει τουλάχιστον τρεις άλλες αλλαγές στα Β λεμφοκύτταρα που ενισχύουν την ικανότητα αυτών των Β κυττάρων να αλληλεπιδράσουν με τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα. Η ενεργοποίηση των Β κυττάρων οδηγεί στην αυξημένη έκφραση των συνδιεγερτών Β7, οι οποίοι προσφέρουν δεύτερα σήματα για την ενεργοποίηση των Β κυττάρων, και στην έκφραση υποδοχέων κυτταροκινών, οι οποίοι είναι εκκρινόμενοι μεσολαβητές των λειτουργιών των βοηθητικών Τ- λεμφοκυττάρων. Τα ενεργοποιημένα Β κύτταρα επίσης μειώνουν την έκφραση υποδοχέων χημειοκινών που παράγονται στα λεμφοζίδια και η λειτουργία των οποίων είναι να κρατήσουν τα Β κύτταρα στα λεμφοζίδια. Έτσι, τα ενεργοποιημένα Β κύτταρα μεταναστεύουν εκτός των λεμφοζιδίων και προς τα ανατομικά διαμερίσματα όπου συγκεντρώνοντα τα βοηθητικά Τ κύτταρα [ ]. Σηματοδότηση στα Β κύτταρα επαγόμενη από αντιγόνο Το αντιγόνο επάγει τη συνάθροιση των μεμβρανικών υποδοχέων lg, η οποία πυροδοτεί βιοχημικά σήματα που μεταφέρονται από μόρια σηματοδότησης συνδεδεμένα με τον υποδοχέα. Στα Β κύτταρα, η μεταβίβαση σήματος μέσω του υποδοχέα lg προϋποθέτει τη διασύνδεση δύο ή περισσοτέρων μορίων υποδοχέα. Η διασύνδεση του υποδοχέα συμβαίνει όταν δύο ή περισσότερα μόρια αντιγόνου από ένα ανοσοσύμπλεγμα, ή επαναλαμβανόμενοι επίτοποι σε ένα μόριο αντιγόνου, προσδεθούν σε γειτονικά μόρια lg στη μεμβράνη ενός Β κυττάρου. Οι

38 πολυσακχαρίτες συχνά περιέχουν πολλούς πανομοιότυπους επίτοπους σε κάθε μόριο και επομένως μπορούν να προσδένονται ταυτόχρονα με πολυάριθμούς υποδοχείς lg σε ένα Β κύτταρο [ ]. Τα αρχικά σήματα από τη διασύνδεση του αντιγονικού υποδοχέα μεταφέρονται από πρωτεΐνες που είναι συνδεδεμένες με τον υποδοχέα. Οι μεμβρανικές lgm και lgd, δηλαδή οι υποδοχείς των παρθένων Β κυττάρων, είναι εξαιρετικά ποικιλόμορφες πρωτεΐνες με βραχέα κυτταροπλασματικά τμήματα. Οι μεμβρανικοί αυτοί υποδοχείς αναγνωρίζουν το αντιγόνο αλλά δεν μπορούν να μεταβιβάσουν σήματα οι ίδιοι (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Δράση των Τ-εξαρτημένων και Τ-ανεξάρτητων αντιγόνων για την παραγωγή πλασματοκυττάρων μνήμης. Η διαφοροποίηση των ΜΖ Β κυττάρων και των Β1-b κυττάρων προϋποθέτει την ισχυρό σήμα από τον Β κυτταρικό υποδοχέα, που επάγεται από την παρουσία συνδιεγερτικών μορίων και φλεγμονωδών κυτταροκινών (Πηγή: Thierry Defrance, Morgan Taillardet and Laurent

39 Genestier. T cell-independent B cell memory. Curr Opin Immunol 2011, 23: ) [159]. Η ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων καταλήγει στον πολλαπλασιασμό των ειδικών για το αντιγόνο κυττάρων, που ονομάζεται κλωνική επέκταση, και στη διαφοροποίηση τους σε δραστικά κύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα. Τα εκκρινόμενα αντισώματα έχουν την ίδια ειδικότητα με τους μεμβρανικούς υποδοχείς των παρθένων Β κυττάρων, οι οποίοι αναγνωρίζουν το αντιγόνο ώστε να ξεκινήσει η απάντηση. Στη διάρκεια της διαφοροποίησης τους ορισμένα Β κύτταρα μπορεί να παράγουν αντισώματα με διαφορετικές τάξεις βαριών αλυσίδων (ή ισοτύπους), τα οποία μεσολαβούν σε διαφορετικές δραστικές λειτουργίες και είναι εξειδικευμένα, ώστε να καταπολεμούν λοιμώξεις από διαφορετικούς τύπους μικροοργανισμών. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται μεταστροφή ή μετάπτωση τάξης (ή ισοτύπου) της βαριάς αλυσίδας (heavy chain class isotype-switching). Η επανειλημμένη έκθεση σε ένα πρωτεϊνικό αντιγόνο έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή αντισωμάτων με αυξανόμενη συγγένεια για το αντιγόνο. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται ωρίμανση συγγένειας (affinity maturation), και οδηγεί στην παραγωγή αντισωμάτων με βελτιωμένη ικανότητα να προσδένονται και να εξουδετερώνουν μικρόβια και τοξίνες. Οι IgM που εκκρίνουν τα Β κύτταρα, τα βοηθά να παγιδεύσουν και να εσωτερικοποιούν διαλυτά αντιγόνα μέσω των ανοσοσφαιρινικών υποδοχέων, που με τη σειρά του προάγει την ικανότητά τους να δημιουργούν έντονες IgM αποκρίσεις (Εικόνα 9A). Επιπλέον, παρουσία συνδιεγερτικών μορίων, τα Β κύτταρα είναι ικανά να παρουσιάζουν επεξεργασμένα αντιγόνα συζευγμένα με μόρια MHC II στα Τ κύτταρα [103]. Τα Β κύτταρα που συνήθως διεγείρονται από τα Th2 κύτταρα και τις κυτταροκίνες (π.χ. ιντερλευκίνη (IL)-4, IL-5 και IL-6),διαφοροποιούνται σε IgG-εκκρίνοντα πλασματοκύτταρα (Εικόνα 9B). Η IgG παίζει σημαντικό ρόλο στην οψωνοφαγοκυττάρωση και την επαγόμενη από το συμπλήρωμα κυτταροτοξικότητα έναντι του πνευμονιόκοκκου από εξειδικευμένα φαγοκύτταρα. Κατάλληλα διεγερμένα

40 Β κύτταρα επίσης απελευθερώνουν IgA, που εναποτίθεται στις επιφάνειες των βλεννογόνων προκειμένου να προστατεύουν από τον αποικισμό από πνευμονιόκοκκο. Εικόνα 9. Μηχανισμός δράσης πολυσακχαριδικού (A) και συζευγμένου εμβολίου (B) έναντι του Streptococcus pneumoniae (Πηγή: Pneumococcal vaccines: mechanism of action, impact on epidemiology and adaption of the species. Int J Antimicrob Agents Sep;32(3): ).

41 Αντισωματική απάντηση στην HIV λοίμωξη Παρότι η αντισωματική διαμόρφωση έναντι των πολυσακχαριτών του πνευμονιόκοκκου, θεωρείται θυμοανεξάρτητη διαδικασία, έχει παρατηρηθεί ότι οι ασθενείς με HIV λοίμωξη και χαμηλά επίπεδα CD4 κυττάρων παράγουν λιγότερα αντισώματα έναντι διαφόρων πνευμονιοκοκκικών πολυσακχαριτών, συγκριτικά με ΗIV ασθενείς με φυσιολογικά CD4 κύτταρα ή υγιή άτομα [ ]. Μετά τον εμβολιασμό με το πολυσακχαριδικό εμβόλιο ο ρυθμός μείωσης των συγκεντρώσεων των αντισωμάτων ασθενών με HIV λοίμωξη είναι συγκρίσιμος με αυτόν του υγιούς πληθυσμού [ ]. Ωστόσο, ως συνέπεια των χαμηλών συγκεντρώσεων αντισωμάτων τρία χρόνια μετά τον εμβολιασμό με το 23δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο, οι περισσότεροι ασθενείς με HIV λοίμωξη θα έχουν αντισώματα σε πολύ χαμηλότερες συγκεντρώσεις από τις απαιτούμενες για προστασία[105]. Η πρώτη αξιολόγηση της αντισωματικής απάντησης στα αντιγόνα του πνευμονιόκοκκου σε ασθενείς με HIV λοίμωξη διενεργήθηκε πριν ακόμα γίνει διαθέσιμη η HAART [ ]. Οι ασθενείς με CD4<500 κύτταρα/mm 3 φάνηκε ότι έχουν ελαττωμένη IgG απάντηση στα αντιγόνα του πνευμονιόκοκκου [ ]. Αυτή η δυσλειτουργία της χυμικής ανοσιακής επάρκειας δεν φάνηκε να διορθώνεται με τον επανεμβολιασμό με διπλή δόση PPV-23 [16] ή με εμβολιασμό με το συζευγμένο εμβόλιο έναντι του πνευμονιόκοκκου [ ]. Η ανοσιακή απόκριση στα πολυσακχαριδικά αντιγόνα επηρεάζεται και ενισχύεται από τα Τ κύτταρα, παρόλο που το αντιγόνο ανήκει στα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα [118]. Η λήψη HAART, ίσως παίζει κάποιο ευεργετικό ρόλο στην αποκατάσταση ορισμένων δυσλειτουργιών των Β λεμφοκυττάρων που επάγονται από την HIV λοίμωξη [119]. Μετά την είσοδο της HAART και την ανοσιακή αποκατάσταση που επιτυγχάνει, οι αντισωματικές συγκεντρώσεις και η διάρκεια αυτών μπορεί να βελτιωθούν. Ωστόσο αυτό δεν επιβεβαιώνεται από όλους τους συγγραφείς [118], αφού η αντισωματική απάντηση ήταν μέτρια σε ασθενείς υπό HAART. Άλλοι

42 συγγραφείς υποστηρίζουν ότι η HAART επηρεάζει την ποιοτική, παρά την ποσοτική απάντηση στο πολυσακχαριδικό εμβόλιο[118]. Οι ανοσοαποκρίσεις για τα περισσότερα εμβόλια είναι γνωστό ότι είναι ελαττωμένες σε ασθενείς με HIV λοίμωξη [ ]. Ωστόσο, εκτός από την πρωτογενή απάντηση, μακροπρόθεσμη διατήρηση της προστασίας δεν έχει πλήρως τεκμηριωθεί. Είναι λοιπόν σημαντικό να εκτιμηθεί, πόσο και πως μειώνεται η οροπροστασία με την πάροδο του χρόνου στους ασθενείς που αρχικά ανταποκρίθηκαν στην ανοσοποίηση. Μια μετανάλυση 9 μελετών, με το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο σε HIV-1 ασθενείς, αξιολόγησε την αντισωματική απάντηση [ , ] στην πορεία του χρόνου. Ο χρόνος παρακολούθησης των ασθενών κυμάνθηκε από 8 έως 60 μήνες μετά την ανοσοποίηση (διάμεσος, 12 μήνες) και ο διάμεσος αριθμός των ασθενών ήταν 33. Ο ορισμός της αντισωματικής ανταπόκρισης φάνηκε να ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των μελετών: Παρατηρήθηκε, αύξηση 2 φορές του αρχικού τίτλου αντισωμάτων [130, 133] ή συγκεντρώσεις αντισωμάτων 0,35 μg/ml [ , 130], 0,5 μg/ml [123], ή 1 μg/ml [ , , 136] ή με βάση τους γεωμετρικούς μέσους τίτλους μόνο [ , ]. Μετά τον εμβολιασμό με το PPV-23 σε ενήλικες, τα ποσοστά μείωσης των αντισωματικών συγκεντρώσεων ήταν, είτε παρόμοια [128, 132, ], ή ταχύτερα [129, 134], σε σύγκριση με εκείνα που παρατηρήθηκαν σε υγιή άτομα. Για χρονικό διάστημα > 5 έτη [ ], οι συγκεντρώσεις των αντισωμάτων φθίνουν κάτω από τα προστατευτικά όρια για τους περισσότερους ορότυπους. Αυτό φαίνεται ότι είναι συχνότερο σε ασθενείς με χαμηλό αριθμό CD4 κυττάρων κατά τον εμβολιασμό ή σε εκείνους που απέτυχαν να επιτύχουν ιολογική καταστολή [130]. Β. Δράση των αντισωμάτων Tα αντισώματα επικαλύπτουν τα εξωκυττάρια παθογόνα και τα εξουδετερώνουν, όπως φαίνεται στην Εικόνα 8, αποκλείοντας θέσεις- κλειδιά πάνω στο παθογόνο, οι

43 οποίες ενισχύουν τη λοιμογονικότητά τους. Η εξουδετέρωση από τα αντισώματα μπορεί να αποτρέψει την είσοδο των παθογόνων και τη μόλυνση των κυττάρων του ξενιστή. Τα εξουδετερωμένα από τα αντισώματα παθογόνα (επικάλυψη αντιγόνου από το αντίσωμα) μπορεί ακολούθως να διηθηθούν στο σπλήνα και να απομακρυνθούν από το ουροποιητικό ή το πεπτικό σύστημα. Τα αντισώματα μπορούν επίσης να «σημαδέψουν» τα παθογόνα προκειμένου να καταστραφούν από τα φαγοκύτταρα, όπως είναι τα μακροφάγα ή τα ουδετερόφιλα, καθώς αυτά προσελκύονται ισχυρά από τα μακρομόρια που συμπλέκονται με τα αντισώματα. Η ενίσχυση της φαγοκυττάρωσης από τα αντισώματα ονομάζεται οψωνισμός. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος περιλαμβάνει την πρόσδεση των IgM και IgG του ορού στα αντιγόνα και την παροχή θέσεων μοριακής σύνδεσης, στις οποίες διαδοχικές πρωτεΐνες του συμπληρώματος μπορούν να συνδεθούν. Ο συνδυασμός αντισώματος-συμπληρώματος ενισχύει τον οψωνισμό ακόμα περισσότερο και προάγει την ταχεία κάθαρση των παθογόνων. Τα αντισώματα συμβάλουν στην ανοσία με τρεις τρόπους (Εικόνα 10): 1. Εξουδετέρωση των παθογόνων μικροοργανισμών. 2. Οψωνισμός, δηλαδή κάλυψη της επιφάνειας ενός παθογόνου μικροοργανισμού από αντισώματα με σκοπό την αύξηση της φαγοκυττάρωσής του. 3. Ενεργοποίηση του συμπληρώματος [103].

44 (α) Εξουδετέρωση. Τα αντισώματα αποτρέπουν στο παθογόνο να συνδεθεί με το στόχο του. (β) Οψωνινοποίηση. Το παθογόνο που μαρκάρεται από το αντίσωμα καταναλώνεται από το μακροφάγο ή το ουδετερόφιλο (γ) Ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Τα αντισώματα προσκολλώνται στην επιφάνεια του παθογόνου και ενεργοποιούν το σύστημα του συμπληρώματος. Εικόνα 10. Τα αντισώματα μπορούν να αποτρέψουν τη λοίμωξη από Str pneumoniae (α) αποτρέποντας από το παθογόνο να συνδεθεί με το στόχο του, (β) σημαδεύοντας το παθογόνο προκειμένου να καταστραφεί από τα μακροφάγα ή τα ουδετερόφιλα, ή (γ) ενεργοποιώντας την κλασική οδό του συμπληρώματος (Πηγή: Basic Immunology: Functions and disorders of the immune system. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman 2004, τροποποιημένη) [103]. Τα βοηθητικά Τ κύτταρα διεγείρουν τους προδρόμους των λεμφοκυττάρων που παράγουν lgm + lgd, ώστε να διαμορφώσουν διαφορετικές τάξεις βαριών αλυσίδων (ισοτύπους). Η διαδικασία της μεταστροφής ισοτύπου παρέχει τη δίνει τη δυνατότητα προσαρμογής στις χυμικές ανοσοαπαντήσεις κατά μικροοργανισμών, ώστε να αντιμετωπίζουν τους μικροοργανισμούς αυτούς με τον καλύτερο τρόπο. Όπως αναφέρθηκε, ένας από τους αμυντικούς μηχανισμούς κατά του πνευμονιόκοκκου

45 είναι η επικάλυψη των μικροοργανισμών με αντισώματα (οψωνισμός) με αποτέλεσμα τη φαγοκυττάρωση τους από ουδετερόφιλα και μακροφάγα. Η αντίδραση αυτή διαμεσολαβείται καλύτερα με τάξεις αντισωμάτων, όπως η lgg1 και lgg3 (στους ανθρώπους), οι οποίες συνδέονται στους υψηλής συγγένειας Fc υποδοχείς των μακροφάγων που είναι ειδικοί για τη γ βαριά αλυσίδα [103]. Με το ρόλο αυτό είναι επιφορτισμένες οι lge ανοσοσφαιρίνες, επειδή τα ηωσινόφιλα φέρουν υποδοχείς υψηλής συγγένειας για το τμήμα Fc της βαριάς αλυσίδας Ε. Έτσι, η αποτελεσματική άμυνα του ξενιστή προϋποθέτει ότι το ανοσοποιητικό σύστημα πρέπει να μπορεί να παράγει διαφορετικούς ισοτύπους σε απάντηση σε διάφορους μικροοργανισμούς, παρόλο που όλα τα παρθένα κύτταρα που είναι ειδικά για τους μικροοργανισμούς εκφράζουν τους ίδιους αντιγονικούς υποδοχείς, οι οποίοι ανήκουν στους ισοτύπους lgm και lgd. Η ευελιξία αυτή των χυμικών ανοσοαπαντήσεων προσφέρεται από την διαδικασία της μεταστροφής τάξης των βαριών αλυσίδων [103]. Οψωνισμός -Φαγοκυττάρωση Τα αντισώματα επικαλύπτουν τους μικροοργανισμούς και προάγουν την πρόσληψή τους από φαγοκύτταρα (Εικόνα 11). Η διαδικασία της επικάλυψης διαφόρων σωματιδίων για να φαγοκυτταρωθούν στη συνέχεια ονομάζεται οψωνισμός (opsonization), και τα μόρια που καλύπτουν τους μικροοργανισμούς και επάγου τη φαγοκυττάρωση τους λέγονται οψωνίνες. Όταν αρκετά μόρια αντισωμάτων προσδεθούν σε ένα μικροοργανισμό, σχηματίζεται μια διάταξη των περιοχών Fc που προβάλει μακριά από τον μικροοργανισμό. Αν τα αντισώματα ανήκουν σε ορισμένους ισοτύπους (lgg1 και lgg3 στον άνθρωπο), οι περιοχές Fc προσδένονται με ένα υψηλής συγγένειας υποδοχέα για τις περιοχές Fc των γ αλυσίδων, τον FcγRI (CD64), ο οποίος εκφράζεται στα ουδετερόφιλα και μακροφάγα. Σαν αποτέλεσμα το φαγοκύτταρο προεκτείνει την κυτταροπλασματική του μεμβράνη γύρω από τον οψωνινοποιημένο μικροοργανισμό και κλείνει σε ένα κυστίδιο, το φαγόσωμα, το οποίο συντήκεται με λυσσοσώματα. Η πρόσδεση των Fc άκρων των αντισωμάτων

46 στους FcγRI περιέχει μια σηματοδοτική αλυσίδα η οποία πυροδοτεί πολυάριθμες βιοχημικές οδούς μέσα στα φαγοκύτταρα [103]. Εικόνα 11. Οψωνισμός και φαγοκυττάρωση των μικροοργανισμών. Α. Τα αντισώματα των υποτάξεων IgG προσδένονται με μικροοργανισμούς και στη συνέχεια αναγνωρίζονται από τους Fc υποδοχείς των φαγοκυττάρων. Τα σήματα από τους Fc υποδοχείς προάγουν την φαγοκυττάρωση των οψωνινοποιημένων μικροοργανισμών και ενεργοποιούν τα φαγοκύτταρα ώστε να καταστρέψουν τους μικροοργανισμούς αυτούς (Πηγή: Basic Immunology: Functions and disorders of the immune system. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman 2004, τροποποιημένη) [103]. Τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα ή μακροφάγα παράγουν στα λυσοσώματά τους μεγάλες ποσότητες δραστικών μεταβολιτών του οξυγόνου, μονοξειδίου του αζώτου και πρωτεολυτικών ενζύμων, τα οποία συνδυάζονται για να καταστρέψουν φαγοκυτταρωμένο μικροοργανισμό. Η φαγοκυττάρωση μέσω αντισωμάτων είναι ο κύριος μηχανισμός άμυνας κατά βακτηρίων με έλυτρο, όπως ο Str. Pneumoniae. Οι πλούσιες σε πολυσακχαρίτες κάψες των βακτηρίων προστατεύουν τους μικροοργανισμούς από τη φαγοκυττάρωση όταν απουσιάζουν τα αντισώματα, αλλά ο οψωνισμός από τα αντισώματα προάγει την φαγοκυττάρωση και την καταστροφή των βακτηρίων. Ο σπλήνας περιέχει μεγάλο αριθμό φαγοκυττάρων και είναι μια

47 σημαντική θέση απομάκρυνσης των οψωνινοποιημένων βακτηρίων από τα μακροφάγα. Γι αυτό ασθενείς που έχουν υποστεί σπληνεκτομή, είναι ευπαθείς σε διάχυτες λοιμώξεις από βακτήρια με έλυτρο [103]. Τα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα (ΡΜΝ) και τα μονοκύτταρα αποτελούν τους κύριους τελεστές της έμφυτης ανοσίας. Μπορούν να αναγνωρίσουν και να φαγοκυτταρώσουν βακτήρια και άλλους μικροοργανισμούς, και επιπλέον να διαμεσολαβήσουν τις διάφορες ανοσοαποκρίσεις. Σε ασθενείς με HIV-1 λοίμωξη, οι λειτουργίες των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων, όπως η χημειοταξία, η δραστηριότητα αναπνευστικής έκρηξης και η διαμεσολαβούμενη από τα κύτταρα και εξαρτώμενη από τα αντισώματα κυτταροτοξικότητα είναι επηρεασμένη. Αυτό θεωρείται ως ένα βαθμό, το αίτιο για την αυξημένη συχνότητα και σοβαρότητα των βακτηριακών και άλλων ευκαιριακών λοιμώξεων σε αυτούς τους ασθενείς [140]. Μερικές από αυτές τις βλάβες προκύπτουν απ 'ευθείας από τη μόλυνση των μονοπύρηνων φαγοκυττάρων με τον HIV [141] είτε είναι δευτερεύουσες από άλλα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα. Παρόλο που υπάρχει γενική συμφωνία ότι η φαγοκυττάρωση είναι μειωμένη σε ασθενείς με λοίμωξη HIV, υπάρχουν αντιφατικές μελέτες σχετικά με επιμέρους δείκτες της φαγοκυτταρικής λειτουργίας. Για παράδειγμα, η παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου από ΡΜΝ αναφέρεται ως αυξημένη, μειωμένη ή κανονική σε διαφορετικές μελέτες [ ]. Είναι αμφίβολο κατά πόσον η λειτουργία των μονοκυττάρων και των ουδετερόφιλων για τη φαγοκυττάρωση και την οξειδωτική έκρηξη έχει βελτιωθεί με τη HAART ή επηρεάζεται όταν η HAART αποτυγχάνει. Οι λειτουργίες της φαγοκυτταρικής δραστικότητας και οξειδωτικής έκρηξης των ουδετεροφίλων και των μονοκυττάρων είναι σημαντικά ελαττωμένη στους HIV-1 ασθενείς. Υπάρχουν προηγούμενα δεδομένα που περιγράφουν την επίδραση του HIV στη φαγοκυττάρωση και την ενδοκυττάρια θανάτωση των μικροοργανισμών [146], καθώς και στη λειτουργία των ουδετερόφιλων [147] η οποία, ωστόσο, αναφέρεται στην ικανότητα για τη θανάτωση ενδοκυτταρικών μικροοργανισμών, όπως το μυκοβακτηρίδιο, η Salmonella, η Pneumocystis jirovecii, ο Cryptococcus

48 neoformans και η Candida albicans [ ]. Διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με τη φαγοκυττάρωση εξωκυττάριων βακτηρίων σε ασθενείς με HIV λοίμωξη οδηγούν σε αντιφατικά αποτελέσματα, καθώς ορισμένοι συγγραφείς αναφέρουν αυξημένη φαγοκυττάρωση και ενδοκυτταρική βακτηριοκτόνο δράση, ενώ άλλοι φυσιολογική ή μειωμένη λειτουργία [ , 152]. Αυτά τα αντιφατικά ευρήματα μπορούν να εξηγηθούν με βάση διάφορους παράγοντες, όπως η ηλικία του ασθενούς, το στάδιο της HIV λοίμωξης, η συνύπαρξη άλλων λοιμώξεων και η ταυτόχρονη φαρμακευτική αγωγή. Μεθοδολογικές διαφορές, όπως η επιλογή του μικροοργανισμού προς φαγοκυττάρωση και ενδοκυτταρικά κιτ θανάτωσης, θα μπορούσε επίσης να παίζουν κάποιο ρόλο. Τέλος, τα κιτ που χρησιμοποιούνται είναι συχνά δύσκολα να τυποποιηθούν. Ως εκ τούτου, η σύγκριση των αποτελεσμάτων μάλλον είναι δύσκολο να ερμηνευτεί. Παρότι η φαγοκυττάρωση είναι μειωμένη στους HIV-1 ασθενείς σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, όσο καλύτερη είναι η ανοσολογική κατάσταση των ασθενών και τόσο μεγαλύτερη η καταστολή του ιολογικού πολλαπλασιασμού, τόσο καλύτερες φαίνεται να είναι και οι λειτουργίες των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων. Αυτό το συμπέρασμα βασίζεται στο (α) ότι τα άτομα υπό επιτυχή HAART παρουσιάζουν καλύτερη οξειδωτική έκρηξη από ασθενείς χωρίς θεραπεία, στo ότι (β) oι λειτουργίες των μονοκυττάρων και των ουδετερόφιλων είναι καλύτερες στους naïve ασθενείς σε σχέση με όσους εμφανίζουν ιολογική αποτυχία μετά από λήψη HAART και (γ) στην αρνητική συσχέτιση μεταξύ της μείωσης του ιικού φορτίου και της λειτουργίας των μονοκυττάρων και των ουδετερόφιλων. Η επίπτωση της αποτελεσματικής διαχείρισης της HIV λοίμωξης αντανακλάται στον απόλυτο αριθμό των CD4 κυττάρων και το ιικό φορτίο και στη φαγοκυττάρωση [153], υποδηλώνοντας λειτουργική βελτίωση στα ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα έναντι της C. albicans, σε HIV-1ασθενείς που ελάμβαναν θεραπεία με HAART. Η χαμηλή φαγοκυττάρωση από ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα υποδηλώνει αρνητική επίπτωση στην αρχική φάση της φαγοκυττάρωσης, δηλαδή στον οψωνισμό του μικροοργανισμού, στη δέσμευση

49 των οψωνινοποιημένων και μη-οψωνινοποιημένων μικροοργανισμών στους υποδοχείς των φαγοκυττάρων και το σχηματισμό του φαγοσώματος μέσω της σχετιζόμενης με κυτταροσκελετικές αλλαγές, F-ακτίνης [154]. Ο HIV φαίνεται να προκαλεί ελαττωμένη φαγοκυττάρωση παρεμβαίνοντας με διακυτταρική σηματοδότηση των υποδοχέων Fc-γάμμα παρά διαμεσολαβώντας στην έκφραση των υποδοχέων των φαγοκυττάρων ή στη σύζευξη αυτών των υποδοχέων με τους συνδέτες τους [ ]. Δύο μελέτες προτείνουν επίσης ότι ο σχηματισμός του φαγοσώματος είναι ελαττωματικός στους οροθετικούς ασθενείς [ ]. Αυτό μπορεί να προκαλείται μέσω μειωμένης ανακύκλωσης των ενδοσωμικών συστατικών των μεμβρανών[157]. Συμπερασματικά, η ανοσιακή απόκριση φαίνεται ότι είναι επηρεασμένη στους HIV-1 ασθενείς αναφορικά με τη φαγοκυτταρική δραστικότητα και την οξειδωτική έκρηξη μονοκυττάρων και ουδετεροφίλων. Αυτές οι βλάβες επηρεάζονται σημαντικά από το επίπεδο της διαχείρισης των οροθετικών ασθενών με έμφαση στα επίπεδα των CD4 κυττάρων και του ιικού φορτίου. Γ. Β κυτταρική μνήμη -Β λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί Παρά το γεγονός ότι τα Τ ανεξάρτητα αντιγόνα, όπως το πολυσακχαριδικό έλυτρο του πνευμονιόκοκκου (PS) δεν μπορούν να διαμορφώσουν μια ικανοποιητική αντισωματική (Ab) απόκριση σε δευτερογενή ανοσοποίηση, ωστόσο μπορούν να δημιουργήσουν προστατευτική χυμική ανοσία στους ενήλικες. Η έννοια της θυμοανεξάρτητης Β κυτταρικής μνήμης μετά από αμφισβήτηση πολλών δεκαετιών, έχει πλέον λάβει υποστήριξη από διάφορα πειραματικά εργαστήρια [159]. Η θυμοανεξάρτητη Β κυτταρική μνήμη αποτελείται από συνιστώσες: i) τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης που διαφέρουν φαινοτυπικά και λειτουργικά από τα Τ- εξαρτώμενα ομόλογα κύτταρά τους, ii) πλασματοκύτταρα μνήμης του μυελού των οστών που παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανοσολογική προστασία που παρέχεται από τα Τ- ανεξάρτητα πολυσακχαριδικά εμβόλια. Τα Β-1b κύτταρα, αποτελούν την κύρια

50 πηγή αμφοτέρων των Τ-ανεξάρτητων λεμφοκυττάρων μνήμης και των πλασματοκυττάρων. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα κλασικά ορίζoνται ως μία κατηγορία ανοσογόνων είναι σε θέση να οδηγήσουν σε αντισωματική απόκριση, απουσία της περιορισμένης Τ κυτταρικής βοήθειας του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ [160]. Λίγα χρόνια νωρίτερα, θα ήταν αδύνατο να συνδεθεί ο όρος «μνήμη» με την Β κυτταρική ανταπόκριση που προκαλείται από θυμοανεξάρτητα αντιγόνα. Επικρατούσε η αντίληψη ότι τα Τ-ανεξάρτητα αντιγόνα δε δημιουργούν Β κυτταρική μνήμη, επειδή δεν μπορούν να προκαλέσουν μια τυπική ανάκληση της αντισωματικής απάντησης, η οποία είναι μια ενισχυμένη, επιταχυνόμενη και ώριμη συνάφειας παραγωγή αντισωμάτων κατά την δευτερογενή ανοσοποίηση. Αυτό το παράδειγμα ερχόταν, ωστόσο, σε αντίθεση με την πρακτική του πολυσακχαριδικού αντι-πνευμονιοκοκκικού εμβολίου, που αποτελείται από κεκαθαρμένους πολυσακχαρίτες του ελύτρου του βακτηρίου και εφαρμοζόταν από το 1983 και θεωρείτο ότι παρείχε χυμική ανοσία στους ενήλικες [161]. Αν και η ανοσιακή προστασία που παρέχεται από τα πολυσακχαριδικά εμβόλια γενικά θεωρείται ότι είναι βραχύβια, από επιδημιολογικές μελέτες [162] προκύπτει ότι το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο μπορεί να παρέχει προστασία για τουλάχιστον 9 έτη από την αρχική δόση στους ανοσοεπαρκείς και 5 έτη στους ανοσοκατασταλμένους ενήλικες. Έτσι, φαίνεται ότι η έννοια της θυμοανεξάρτητης Β κυτταρικής μνήμης έχει ήδη λάβει την επιβεβαίωση της ύπαρξής της στους ανθρώπους. Στην πραγματικότητα, η έννοια της θυμοανεξάρτητης Β κυτταρικής μνήμης δεν είναι πρόσφατη [ ]. Οι τότε μελέτες κατέδειξαν για πρώτη φορά ότι μακροχρόνια χυμική ανοσία μπορεί να παραχθεί με Τ-ανεξάρτητο μονοπάτι. Περαιτέρω μελέτες επιβεβαίωσαν αυτά τα ευρήματα[163,165].

51 Υποπληθυσμοί των Β-κυττάρων στην HIV λοίμωξη που συμμετέχουν στην ανοσιακή απόκριση έναντι του Str. pneumoniae H κατανόηση της επαγόμενης από τον HIV παθογένειας των Β-κυττάρων, έχει προαχθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια. Ενώ λίγοι ανοσοφαινοτυπικοί δείκτες ήταν διαθέσιμοι κατά τον χρόνο των πρώιμων μελετών επί των κυττάρων Β (Πίνακας 1), πιο πρόσφατες εξελίξεις στη μελέτη των επαγόμενων από τον HIV Β κυτταρικών διαταραχών έγιναν δυνατές λόγω της ικανότητας να προσδιοριστούν και να χαρακτηριστούν με μεγαλύτερη ακρίβεια οι υποπληθυσμοί των Β κυττάρων, τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και σε ιστούς (Πίνακας 2). Τέλος, η εξέλιξη στην κυτταρομετρία ροής και η ανάλυση μοναδικών κυττάρων, οδήγησαν σε μια βελτιωμένη μελέτη των HIV Β κυτταρικών ειδικών αποκρίσεων και στην απομόνωση ισχυρώς εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι του HIV από μολυσμένα άτομα[ ]. Πίνακας 1. Β κυτταρικοί δείκτες και ο βιολογικός τους ρόλος Δείκτης επιφανείας Ρόλος CD10 Μεταλλοπρωτεάση. Εκφράζεται στα πρόδρομα των Β κυττάρων, στα μεταβατικά και τα κύτταρα των βλαστικών κέντρων CD19 Τμήμα του BCR-Αυξάνει τη σηματοδότηση του BCR CD20 Εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των Β κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό τους CD21 ή υποδοχέας του συμπληρώματος (CR2) Υποδοχέας του C3b συμπληρώματος που σχηματίζει ομοιοπολικούς δεσμούς με τα ξένα αντιγόνα ή τα ανοσυμπλέγματα CD27 CD38 CD138 B κυτταρικό συνδιεγερτικό μόριο Γλυκοπρωτεϊνη που εμπλέκεται στην κυτταρική προσκόλληση, τη σήμανση του ασβεστίου και την μεταγωγή σήματος Δείκτης πλασματοκυττάρων- Εμπλέκεται στην διακυτταρική προσκόλληση και τη συγκόλληση κυττάρου-υποστρώματος

52 Είναι σαφές από την έρευνα που πραγματοποιήθηκε κατά κύριο λόγο σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) τις τρεις τελευταίες δεκαετίες, ότι οι ανωμαλίες των Β-κυττάρων στην HIV λοίμωξη, δεν προκύπτουν από την εμφάνιση νέων Β-κυτταρικών πληθυσμών (που δεν ανιχνεύονται σε υγιή άτομα), αλλά κυρίως από τις ανισορροπίες σε υποσύνολα Β-κυττάρων που υπάρχουν σε χαμηλότερο βαθμό σε υγιή άτομα όλων των ηλικιών [ ]. Πίνακας 2. Ορισμός των Β κυτταρικών υποσυνόλων βάσει των πιο συχνών δεικτών διαφοροποίησης και της κατανομής στους διάφορους ιστούς Β κυτταρικό σύνολο Φαινότυπος Τοποθεσία Μεταβατικά Β κύτταρα Β κύτταραδιαμορφωτές GC CD19+CD10+CD21 high CD27- Περιφερικό αίμα/μυελός των οστών CD19+CD10+CD27- Περιφερικό αίμα/λεμφικός ιστός CD19+CD10+CD27+CD24 high CD38 high IL10+ Περιφερικό αίμα Ρυθμιστικά Β κύτταρα Παρθένα Β κύτταρα CD19+CD10-CD21+CD27- Περιφερικό αίμα/λεμφικός ιστός Β κύτταρα των βλαστικών κέντρων Ενεργοποιημένα Β κύτταρα μνήμης Ηρεμούντα Β κύτταρα μνήμης Ιστικού τύπου Β κύτταρα μνήμης (Εξουθενωμένα) CD19+CD10+CD38+ CD19+CD10-CD27+CD21 low CD19+CD10-CD27 + CD21+ CD19+CD10+CD27-CD21- Λεμφικός ιστός Περιφερικό αίμα/λεμφικός ιστός Περιφερικό αίμα/λεμφικός ιστός Περιφερικό αίμα/λεμφικός ιστός Πλασματοκύτταρα CD19 low CD138 +/- CD38 ++ Mυελός των οστών Υπάρχουν πολλοί τρόποι προσδιορισμού των κυκλοφορούντων Β-κυτταρικών υποπληθυσμών, ωστόσο ο πιο βασικός τρόπος είναι η διαίρεση του υποσυνόλου που ήρθε σε επαφή με το αντιγόνο και σε κείνο που δεν έχει έρθει σε επαφή μαζί του. Ο πιο ακριβής ορισμός ενός Β-κυττάρου, που έχει «δει» και απάντησε μετά από επαφή με το αντιγόνο, είναι εκείνο, του οποίου ο Β-κυτταρικός υποδοχέας (BCR) έχει

53 υποστεί σωματικές μεταλλάξεις. Από τα Β κύτταρα που έχουν έρθει σε επαφή με το αντιγόνο διακρίνουμε εκείνα που δεν είναι πλήρως ώριμα, τα οποία χαρακτηρίζονται ως ανώριμα/μεταβατικά Β κύτταρα, και εκείνα που είναι ώριμα, αλλά παρθένα Β κύτταρα. Μεταξύ των Β κυττάρων που έχουν συναντήσει το αντιγόνο, υπάρχουν Β κύτταρα μνήμης, τα οποία μπορεί περαιτέρω να διαιρεθούν σε διάφορους υποπληθυσμούς των Β κυττάρων μνήμης και τερματικώς διαφοροποιημένα Β κύτταρα, περιλαμβάνουν πλασμαβλάστες (πολλαπλασιαζόμενους και κυκλοφορούντες) και πλασματοκύτταρα (εντελώς διαφοροποιημένα, άμισχα, και σπάνια παρόντα στο αίμα). Μια ξεχωριστή ή συμπληρωματική προσέγγιση για τη διαίρεση των Β κυττάρων σε υποπληθυσμούς σχετίζεται με τον ισότυπο της ανοσοσφαιρίνης (Ig) του BCR τους. Ενώ αμφότερες οι IgD και IgM ανοσοσφαιρίνες είναι παρούσες στην πλειονότητα των Β κυττάρων που δεν έχουν την εμπειρία του αντιγόνου και που κυκλοφορούν στο αίμα, συνδυασμοί των δύο αυτών ισοτύπων μπορούν επίσης να αποτελούν μέρος του μη μεταλλασσόμενου(unswitched) υποσυνόλου των Β-κυττάρων, που έχουν έρθει σε επαφή με το αντιγόνο [171]. Αυτό είναι σε αντίθεση με τα μεταλλαγμένα (switched) IgG, IgA και σπανίως IgE Β κύτταρα, που ήρθαν σε επαφή με αντιγόνο και τα οποία εκφράζουν μόνο ένα ισότυπο. Γίνεται σαφές ότι η κατηγοριοποίηση των Β κυττάρων, που βασίζεται στην ανοσοσφαιρίνη (Ig), ειδικά εκείνων που εκφράζουν μη μεταλλαγμένους ισότυπους, μπορεί να γίνει προβληματική χωρίς την πρόσθετη ανάλυση μεταλλάξεων των μεταβλητών Ig περιοχών, που είναι απαραίτητη για να διαχωρίσει με ακρίβεια αντιγονο-άπειρα από αντιγόνο-έμπειρα Β κύτταρα. Μεταβολές στους Β κυτταρικούς υποπληθυσμούς στην HIV λοίμωξη Οι διάφοροι υποπληθυσμοί των Β λεμφοκυττάρων που παρουσιάζουν μεταβολές στο αίμα των ΗIV ατόμων φαίνονται στην Εικόνα 12. Τα παρθένα Β κύτταρα δεν θα περιγραφούν, επειδή λίγες ανωμαλίες έχουν αναφερθεί για το υποσύνολο αυτό σε HIV-μολυσμένα άτομα [172], εκτός από μία σχετική μείωση στη συχνότητά τους σε HIV-ιαιμικούς ασθενείς [173]. Αυτές οι ανωμαλίες στα παρθένα Β κύτταρα τα οποία έχουν αναφερθεί σε ΗIV άτομα, είναι πιθανότατα το αποτέλεσμα της θεώρησης ότι μόνο δύο υποπληθυσμοί είναι παρόντες στο περιφερικό αίμα, τα παρθένα και τα Β κύτταρα μνήμης. Στην πραγματικότητα, υπάρχουν τουλάχιστον έξι υποπληθυσμοί Β-

54 κυττάρων που μπορούν να προσδιοριστούν στο περιφερικό αίμα υγιών και HIVθετικών ατόμων [ ]. Ανώριμο κύτταρο Μακρόβιος πλασμαβλάστης Μυελός των οστών Περιφερικό αίμα Ανώριμο μεταβατικό κύτταρο Μεταβατικό κύτταρο Διαμορφωτής βλαστικού κέντρου Ρυθμιστικό Παρθένο κύτταρο Λεμφικός Ιστός Ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμός των ώριμων Β κυττάρων από το αντιγόνο Βραχύβιος πλασμαβλάστης Ηρεμούν κύτταρο Ενεργοποιημένο μνήμης Ιστικό μνήμης Απόπτωση Πλασματοκύτταρο

55 Εικόνα 12. Τα Β λεμφοκύτταρα κατά τη διάρκεια της HIV λοίμωξης. Τα Β κύτταρα αναπτύσσονται στο μυελό των οστών και εξέρχονται από αυτόν ως ανώριμα Β κύτταρα (Βήμα 1). Μόνο ένα μικρό ποσοστό ανώριμων μεταβατικών Β κυττάρων, ανιχνεύεται στο περιφερικό αίμα υγιών ατόμων, αλλά η συχνότητά τους αυξάνεται κατά τη διάρκεια της HIV-1 λοίμωξης (Βήμα 2). Άλλο ένα υποσύνολο Β κυττάρων, που επίσης μοιράζεται το δείκτη επιφανείας CD10 με τα μεταβατικά Β κύτταρα, είναι Β κύτταρα των βλαστικών κυττάρων (Βήμα 3). Ωστόσο, η προέλευση του υποσυνόλου αυτού δεν είναι απόλυτα κατανοητή. Σε απάντηση εξωγενών αντιγόνων, τα παρθένα Β κύτταρα μεταναστεύουν σε περιοχές πλούσιες σε T κύτταρα του λεμφικού ιστού, ενεργοποιώντας τη διαμόρφωση των βλαστικών κέντρων. Στα διαμορφωμένα βλαστικά κέντρα, τα ώριμα Β κύτταρα, αυξάνονται και υποβάλλονται σε επιλογή ως απάντηση στο αντιγόνο (Βήμα 4). Τα ώριμα ενεργοποιημένα Β κύτταρα θα διαφοροποιηθούν σε Β κύτταρα μνήμης ή πλασματοκύτταρα (Βήμα 5), τα οποία θα αφήσουν το λεμφικό ιστό, προκειμένου να επιζήσουν στο μυελό των οστών. Ελάττωση της συχνότητας των ηρεμούντων Β κυττάρων παρατηρήθηκε στη χρόνια HIV-1 λοίμωξη. Η HIV-1 λοίμωξη σχετίζεται με αύξηση των ενεργοποιημένων Β κυττάρων μνήμης και των ιστικών Β κυττάρων μνήμης, καθώς και των βραχύβιων πλασμαβλαστών (Βήμα 6). Τα τελευταία θα παράγουν αντισώματα για μια σύντομη χρονική περίοδο και μετά θα υποστούν απόπτωση. Ένα πρόσθετο Β κυτταρικό υποσύνολο, μπορεί να εμφανιστεί κατά τη HIV-1 λοίμωξη: Τα Β ρυθμιστικά Β κύτταρα που παράγουν IL-10 (Βήμα 7). Αυτό το υποσύνολο μπορεί να διαμορφώνεται από τα μεταβατικά ή τα παρθένα Β κύτταρα. Τα βέλη δείχνουν τη μείωση ή αύξηση των Β κυτταρικών υποπληθυσμών κατά τη διάρκεια της HIV-1 λοίμωξης (Πηγή: Impairment of B-cell functions during HIV-1 infection. AIDS Sep 24;27(15): , τροποποιημένη) [229]. Στα τέλη της δεκαετίας του 1990, ο CD27 αναδείχθηκε ως ένας χρήσιμος δείκτης για την ταυτοποίηση των ανθρώπινων Β κυττάρων μνήμης, βασιζόμενος σε λειτουργικά

56 χαρακτηριστικά καθώς και στο προφίλ σωματικής μετάλλαξης των Ig [171, 176]. Όσον αφορά το τελευταίο, τα CD27 (+) Β κύτταρα χωρίστηκαν σε Β κύτταρα μνήμης, με και χωρίς μεταστροφή ισοτύπου, και οι αντίστοιχες μεταλλάξεις στα Ig γονιδιακά προφίλ των ελαφρών και βαριών μεταβλητών αλύσων τους, που φάνηκε να είναι διακριτές, συλλογικά παρέχει μια νέα προσέγγιση του συνδυασμού φαινοτυπικής μοριακής προσέγγισης προκειμένου να αξιολογηθούν τα ανθρώπινα Β κύτταρα μνήμης [171]. Αυτοί οι δείκτες έχουν έκτοτε χρησιμοποιηθεί για να δείξουν ότι υπάρχει σπανιότητα των Β κυττάρων μνήμης στο περιφερικό αίμα των HIV ατόμων, ειδικότερα των IgM + χωρίς μεταστροφή ισοτύπου [177] και τα Β κύτταρα κύτταρα μνήμης που έχουν συσχετιστεί με Τ-θυμοανεξάρτητες απαντήσεις [178]. Οι μεταβολές των πληθυσμών αυτών στην ΗΙV λοίμωξη φαίνονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Μεταβολές υποπληθυσμών Β λεμφοκυττάρων στην HIV λοίμωξη. Οι διάφοροι υποπληθυσμοί αυξάνονται στο αίμα των ατόμων με ΗΙV λοίμωξη, με εξαίρεση τον πληθυσμό των ηρεμούντων Β λεμφοκυττάρων μνήμης που παρουσιάζουν ελάττωση στην πορεία του χρόνου ( : αύξηση, : ελάττωση). Παρθένα Β κύτταρα HIV λοίμωξη Ηρεμούντα Β κύτταρα μνήμης Ενεργοποιημένα Β κύτταρα μνήμης Πλασματοκύτταρα Εξουθενωμένα Β κύτταρα μνήνης Ωστόσο, αυτό που έχει επίσης αναδειχθεί στα χρόνια που μεσολάβησαν ότι υπάρχει ένας αριθμός άλλων Β κυττάρων μνήμης σε υγιή άτομα, ορισμένα από τα οποία εκφράζουν τον CD27 και άλλα όχι [ ]. Μεταξύ των Β κυττάρων μνήμης που δεν εκφράζουν τον CD27, εκείνα που έχουν συναντήσει και απάντησαν σε κάποιο αντιγόνο, μπορεί να προσδιοριστούν εύκολα, από το εάν έχουν αλλάξει τον Ig

57 ισότυπό τους, συνηθέστερα σε IgG ή IgA [179]. Παραμένει ανοιχτό και μάλλον προκλητικό το ερώτημα ως προς το αν υπάρχουν ακόμη CD27-αρνητικά Β κύτταρα μνήμης και, αν ναι, πώς διαμορφώνονται από την ασθένεια. Έτσι, καθορίζοντας υποπληθυσμούς των Β κυττάρων μνήμης βάσει της Ig τάξης τους, αποτελεί μια νέα πρόκληση, δεδομένου ότι πλέον είναι γνωστό, ότι δεν εκφράζουν όλα τα Β κύτταρα μνήμης έναν μοναδικό δείκτη επιφάνειας, όπως είναι ο CD27. Το 2009, είχαν καταγραφεί δύο υποπληθυσμοί Β κυττάρων μνήμης, που εξέφραζαν χαμηλά επίπεδα CD21, τα επονομαζόμενα CD27+CD21 ενεργοποιημένα κύτταρα Β μνήμης (activated memory B cells) και CD27-CD21 όμοια με ιστικά Β κύτταρα μνήμης και φαινότυπο εξουθένωσης (tissue-like memory B cells/exhausted memory B cells) εκ των οποίων και τα δύο βρέθηκε να υπερεκφράζονται στην HIV λοίμωξη [181]. Το πρώτο υποσύνολο είχε ονομαστεί ενεργοποιημένο, βασιζόμενο στην έκφραση υψηλότερων επιπέδων δεικτών ενεργοποίησης όπως οι CD80 και CD95, μεταξύ όλων των υποομάδων Β κυττάρων που εξετάστηκαν. Το υποσύνολο αυτό περιελάμβανε κύτταρα CD27+CD21high, που αποτελούν την συντριπτική πλειοψηφία των Β κυττάρων μνήμης σε υγιή άτομα και ονομάζονται ηρεμούντα Β κύτταρα μνήμης (resting memory B cells) [182]. Το δεύτερο ανώμαλο υποσύνολο, τα όμοια με τα ιστικά Β κύτταρα μνήμης ή εξουθενωμένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, ονομάστηκαν από ένα υποσύνολο Β κυττάρων μνήμης που πρωτοπεριγράφηκε [183] σε ανθρώπινους ιστούς αμυγδαλών και που εξέφραζε το αρνητικό ανοσορρυθμιστικό μόριο FCRL4. Πρόσθετα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά αυτών των μοναδικών ιστικών Β κυττάρων μνήμης είναι η αυξημένη έκφραση του CD20 και η ελαττωμένη έκφραση του CD21. Από τότε, είχαν ήδη χαρακτηριστεί δύο διαφορετικά είδη CD21low Β κυττάρων στο αίμα των HIV ατόμων, τα ανώριμα/μεταβατικά Β-κύτταρα [184] και τα τερματικώς διαφοροποιημένα Β λεμφοκύτταρα [185]. Σημειωτέον, αυτοί οι υποπληθυσμοί εξέφραζαν επίπεδα του CD20 που ήταν, είτε κάπως (ανώριμα/μεταβατικά) ή εμφανώς (τερματικά διαφοροποιημένα) μειωμένα σε σύγκριση με τα παρθένα Β

58 κύτταρα. Ωστόσο, είχε καταστεί σαφές από το 2006, ότι ένα ακόμη τμήμα των CD21 low Β κυττάρων στο αίμα HIV-ιαιμικών ατόμων εξέφραζε υψηλά επίπεδα του CD20 [181], παρόμοιο με προφίλ που περιγράφηκαν για τα Β FCRL4 + κύτταρα στις αμυγδαλές [183]. Απουσία αντιρετροϊκής θεραπείας (ΗΑART), η πλειονότητα των HIV ατόμων θα διατηρήσει ένα ορισμένο επίπεδο ιαιμίας σε όλη την πορεία της νόσου τους. Η επιμονή της αντιγραφής του ιού κατά τη διάρκεια της κλινικά ασυμπτωματικής φάσης της HIV λοίμωξης έχει ένα ευρύ φάσμα επιπτώσεων στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των Β κυττάρων, και η πλειοψηφία αυτών των επιδράσεων συνδέονται με την HIV-επαγόμενη παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και συνεπώς υποαπαντητικότητα και στα εμβόλια και την ανοσιακή απόκριση. Οι επιδράσεις αυτές είναι συστηματικές, ενώ οι επιπτώσεις της ιαιμίας στα Β λεμφοκύτταρα διακρίνονται σε άμεσες και έμμεσες Ένα από τα μακροχρόνια και αναμφισβήτητα χαρακτηριστικά της HIV λοίμωξης είναι υπεργαμμασφαιριναιμία [168], με την IgG1 να είναι η πιο απορρυθμισμένη ανοσοσφαιρίνη [ ]. Οι ανοσοσφαιρίνες του ορού είναι, κατά κάποιο τρόπο, μοναδικοί διαλυτοί παράγοντες μιας και αντικατοπτρίζουν τις συστηματικές επιδράσεις ενεργοποίησης HIV ιαιμίας στα Β κύτταρα, χωρίς ωστόσο, όμως, οι ίδιοι να είναι ισχυροί ενεργοποιητές του ανοσοποιητικού συστήματος. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι η αυξημένη κυκλοφορία των Igs οδηγεί σε αυξημένο σχηματισμό ανοσοσυμπλεγμάτων που δεσμεύονται και ενεργοποιούν κύτταρα που εκφράζουν Fc υποδοχείς ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων της φυσικής ανοσίας που είναι γνωστό ότι εκκρίνουν φλεγμονώδεις παράγοντες, που σχετίζονται με την ιαιμία από HIV [ ]. Tα ίδια τα Β κύτταρα μπορούν να ενεργοποιηθούν μέσω προσκόλλησης των ανοσοσυμπλόκων. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα κύτταρα Β δεν εκφράζουν υποδοχείς ενεργοποίησης Fc, αυτό είναι πιο πιθανό να συμβεί μέσω της σύνδεσης των υποδοχέων του συμπληρώματος ή μέσω της σύνδεσης του

59 ανοσοσυμπλέγματος του αντιγόνου με τον BCR, αν και ο τελευταίος θα ήταν δύσκολο να εκτιμηθεί λόγω της πολυκλωνικής φύσης της υπεργαμμασφαιριναιμίας [191]. Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην έρευνα του HIV είναι η δυσκολία στον εντοπισμό και τη διερεύνηση των οροθετικών ατόμων κατά τη διάρκεια της οξείας φάσης της λοίμωξης. Η κριτική αυτή φάση (παράθυρο) είναι το χρονικό διάστημα, πριν από το οποίο δε μπορεί να ανιχνευθεί η επίκτητη ανοσία. Παρά την πρόκληση αυτή, μερικές σημαντικές μελέτες έχουν εντοπίσει με επιτυχία διαταραχές της έμφυτης ανοσίας που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια αυτής της οξείας φάσης και τον συνεχή ιικό πολλαπλασιασμό [192], εκ των οποίων μερικοί είναι παράγοντες που προκύπτουν γρήγορα, ακόμη και παροδικά, που έχει περιγραφεί ως η καταιγίδα φλεγμονωδών κυτταροκινών [ ]. Μεταξύ αυτών των πρώιμων παραγόντων είναι οι κυτταροκίνες που ενεργοποιούν έντονα τα Β κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της IL-15 που σχετίζεται με την πολυκλωνική ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Β-κυττάρων [ ], καθώς επίσης και της IL-6 που συνδέεται με την τερματική διαφοροποίηση των Β-κυττάρων και την επιβίωσή τους [198]. Η HIV-1 λοίμωξη έχει ως αποτέλεσμα την εμμένουσα (συνεχιζόμενη) αναπαραγωγή (αντιγραφή) του ιού, που οδηγεί σε ποικίλα επίπεδα ανιχνεύσιμης ιαιμίας στο πλάσμα στην πλειοψηφία των ασθενών που δεν λαμβάνουν αποτελεσματική θεραπεία. Οι άμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του HIV και των Β λεμφοκυττάρων αναφέρθηκαν πρώτη φορά πριν αρκετά χρόνια [175], παρόλο ότι υπήρχαν ελάχιστα στοιχεία, ότι ο HIV μπορεί να αναπαραχθεί στα Β κύτταρα in vivo. Ωστόσο, υπάρχουν ισχυρές αποδείξεις ότι ο HIV προσδένεται στα B κύτταρα In vivo, μέσω αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στον υποδοχέα του συμπληρώματος CD21 (γνωστού και ως CR2), o οποίος εκφράζεται στα περισσότερα ώριμα Β κύτταρα, ενώ οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος προσδένονται στα σωματίδια του ιού ΗΙV που κυκλοφορούν in vivo [ ].Τέτοιες αλληλεπιδράσεις που βασίζονται στα ανοσοσυμπλέγματα, μπορούν να παρέχουν διεγερτικά σήματα στα Β κύτταρα, παρόλο που η χαμηλή

60 συχνότητα των Β κυττάρων που αλληλεπιδρούν ευθέως με τα σωματίδια του HIV ίσως αποτελεί ένα μηδαμινό μονοπάτι ενεργοποίησης[200]. Είναι περισσότερο πιθανό ότι μέσω αυτής της αλληλεπίδρασης τα Β κύτταρα διευκολύνουν τη μετάδοση του HIV από κύτταρο σε κύτταρο (cell-to-cell) [201]. Ενας παρόμοιος μηχανισμός αλληλεπίδρασης του HIV έχει προταθεί για τα λεμφοζιδιακά δενδριτικά κύτταρα (FDCs) [202], τα οποία επίσης εκφράζουν το CD21 και μπορεί να δρουν ως μακρόβια (long-lived) εξωκυττάρια δεξαμενή για τον HIV ακόμα και υπό την παρουσία αποτελεσματικής HAART [203]. Παρόλο που τα στοιχεία από in vitro μοντέλα [ ] και από αναλύσεις των Β κυττάρων που εκφράζουν την οικογένεια των ανοσοσφαιρινών της V H 3 [204], προτείνουν ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις απευθείας διαμεσολαβούν τις επιπτώσεις του HIV στα Β κύτταρα, οι άμεσες in vivo αποδείξεις για αυτές λείπουν. Επιπλέον, η χαμηλή συχνότητα των Β κυττάρων που φέρουν HIV σωματίδια στην επιφάνειά τους σε σύγκριση με την ένταση της απορρύθμισης των B κυττάρων σε ΗΙV-1 ιαιμικούς ασθενείς, αποδεικνύει ότι υπάρχουν άλλοι έμμεσοι μηχανισμοί Β κυτταρικής ανοσοπαθολογίας. Με βάση την άποψη αυτή, παρόμοιες προτάσεις έχουν γίνει για τα CD4 Τ κύτταρα, καθώς η συχνότητα των μολυσμένων CD4 Τ κυττάρων δεν επαρκεί για να οδηγήσει στην προοδευτική τους απώλεια και δυσλειτουργία [169]. H επαγόμενη από τον HIV ενεργοποίηση των ανοσοκυττάρων, είναι ένα από τα πιο ευρέως αποδεκτά σημεία-κλειδιά (hallmarks) της παθογένεσης του HΙV και της προόδου της νόσου. Η υπερενεργοποίηση των Β κυττάρων από τον HIV χαρακτηρίζεται από πολλά στοιχεία: υπεργαμμασφαιριναιμία [166, ], αυξημένη πολυκλωνική Β κυτταρική ενεργοποίηση [166, ], αυξημένη κυτταρική μεταβολή [ ], αυξημένη έκφραση δεικτών ενεργοποίησης, αυξημένη διαφοροποίηση των Β κυττάρων σε πλασμαβλάστες όπως καταγράφονται από φαινοτυπικές, λειτουργικές και μορφολογικές μετρήσεις [205,208, 210,211], αυξημένη παραγωγή αυτοαντισωμάτων [176,207,212] και αύξηση της επίπτωσης Β-κυτταρικών κακοηθειών [213].

61 Οι επιπτώσεις της ιαιμίας στους υποπλοηθυσμούς των Β λεμφοκυττάρων φαίνεται στον Πίνακα 4. Πίνακας 4. Τύποι Β κυτταρικών υποπληθυσμών στην HIV λοίμωξη και Τύπος κυττάρων Θεραπευόμενοι Μη θεραπευόμενοι Ολικά Β κύτταρα Β κύτταρα μνήμης Εξουθενωμένα Β κύτταρα μνήμης Ηρεμούντα Β κύτταρα μνήμης IgM B λεμφοκύτταρα μνήμης Ενεργοποιημένα Β κύτταρα μνήμης μεταβολές αυτών με τη λήψη αντιρετροϊκής θεραπείας και τον έλεγχο της ιαιμίας. Με τα βέλη απεικονίζεται η αύξηση και η ελάττωση των υποπληθυσμών αυτών αναφορικά με τη λήψη HAART πορεία του χρόνου ( : αύξηση, : ελάττωση). Η αυξημένη έκφραση πολλαπλών ανασταλτικών υποδοχέων, που φαίνεται να έχει αθροιστική και ίσως συνεργική επίδραση στη ρύθμιση των αποκρίσεων και στον καθορισμό μιας λοίμωξης, περιγράφεται ως εξάντληση των Β-κυττάρων, η οποία σχετίζεται με τη χρόνια ιαιμία του HIV [181]. Επιπρόσθετα στον ανασταλτικό υποδοχέα FCRL4, αρκετοί ανασταλτικοί υποδοχείς σχετιζόμενοι με τα Β-κύτταρα βρέθηκε να υπερεκφράζονται στα όμοια με τα ιστικού τύπου Β κύτταρα μνήμης, το υποσύνολο εκείνο που είναι υπεύθυνο για την εξάντληση των Β-κυττάρων στην HIV λοίμωξη. Συνολικά, η έννοια της Β και Τ-κυτταρικής εξάντλησης ή εξασθένησης ή ανεργίας που συμβαίνει στα πλαίσια της χρόνιας ανοσολογικής ενεργοποίησης

62 πιθανώς αντιπροσωπεύει ένα μηχανισμό άμυνας έναντι των επιβλαβών επιδράσεων ενός επίμονα υπερενεργοποιημένου περιβάλλοντος. Στα χρόνια που ακολούθησαν τη διαθεσιμότητα αποτελεσματικών σχημάτων ΗΑΑRT για τη μείωση και τη διατήρηση του HIV ιικού φορτίου σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα, κατέστη σαφές ότι η ανώμαλη κυτταρική υπερδραστηριότητα στους ΗΙV ασθενείς, οφειλόταν σε μεγάλο βαθμό στη συνεχιζόμενη αντιγραφή του ιού. Η αποτελεσματική ΗΑART, με έναρξη, είτε στην πρώιμη, είτε στη χρόνια λοίμωξη, οδήγησε σε μία ταχεία μείωση των επαγόμενων πολυκλωνικών αποκρίσεων των Β-κυττάρων, όπως αντικατοπτρίζεται από την παρουσία Β κυττάρων που εκκρίνουν αντισώματα (ASC) στο περιφερικό αίμα [88]. Αρκετές μελέτες έκτοτε, επιβεβαίωσαν τα ευρήματα αυτά, είτε μετρώντας τις συχνότητες των ASCs με τη μέθοδο της ενζυμικά-συνδεδεμένης ανοσοκηλίδας (ELISPOT), είτε με ανοσοφαινοτυπικές αναλύσεις των κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την αυθόρμητη έκκριση αντισώματος, δηλαδή των πλασμαβλαστών [185, ]. Σε πιο πρόσφατες μελέτες, φάνηκε ότι υψηλότερες συχνότητες των κυκλοφορούντων πλασμαβλαστών παρατηρήθηκαν στην αρχική φάση της HIV λοίμωξης και ότι εντός 1 έτους από την έναρξη της ΗΑART, αυτές οι συχνότητες είχαν εντελώς εξομαλυνθεί σε άτομα, των οποίων η ΗΑART ξεκίνησε, είτε κατά τη διάρκεια της πρώιμης, είτε της χρόνιας HIV λοίμωξης [174]. Επίσης, φάνηκε ότι ενώ η ΗΑART είχε μια εξομαλυντική επίδραση σε ορισμένες υποομάδες των Β-κυττάρων που κυκλοφορούν στο περιφερικό αίμα, η επίδραση σε άλλες υποομάδες Β- κυττάρων, ήταν αργή και ατελής, με αποτέλεσμα διαταραχή στην ανοσιακή απόκριση. Ούτε η συχνότητα των ενεργοποιημένων Β κυττάρων μνήμης, ούτε τα όμοια με τα ιστικά Β κύτταρα μνήμης (εξουθενωμένα) είχαν αποκατασταθεί μετά από 1 χρόνο επιτυχούς HAART [111], γεγονός που υποδηλώνει ότι ορισμένες επιδράσεις παραμένουν και μετά την καταστολή του ιικού πολλαπλασιασμού που επιτυγχάνεται με την HAART. Η επίδραση της ιαιμίας και η επαγόμενη από την HAART καταστολή του ιικού πολλαπλασιασμού στα Β κύτταρα απεικονίζονται καλύτερα με την υπεργαμμασφαιριναιμία, η οποία προκύπτει νωρίς

63 αμέσως μετά τη μόλυνση και διατηρείται σε υψηλά επίπεδα καθ 'όλη τη διάρκεια της χρόνιας ιαιμίας [ ], αλλά δεν ομαλοποιείται πλήρως μετά από επιτυχή ΗΑART [214, 219]. Η αντιρετροϊκή θεραπεία δεν φαίνεται να αποκαθιστά πλήρως τον υποπληθυσμό των ηρεμούντων Β-κυττάρων μνήμης, σε άτομα που ξεκίνησαν θεραπεία κατά τη χρόνια φάση της HIV λοίμωξης [220]. Ωστόσο, συγκρίνοντας τα αποτελέσματα της πρώιμης έναρξης HAART έναντι της καθυστερημένης έναρξης, βρέθηκε ότι η μνήμη ηρεμίας των Β-κυττάρων είχε καλύτερη αποκατάσταση στους ασθενείς με έναρξη κατά την πρώιμη φάση της λοίμωξης και η αποκατάσταση παρατηρήθηκε τόσο στο φαινότυπο όσο και στην λειτουργικότητα, όπως μετρήθηκε από τη Β κυτταρική μνημονική απόκριση σε ένα αντιγόνο ανάκλησης [174]. Παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν γίνει και σε άλλες μελέτες σε ενήλικες με πρώιμη HIV λοίμωξη [221] και σε παιδιά που μολύνθηκαν με τον ιό HIV με κάθετη μετάδοση [222]. Ενώ αυτές και παρόμοιες παρατηρήσεις που έγιναν σε άλλα κύτταρα της επίκτητης ανοσίας [223], παρέχουν ένα ισχυρό επιχείρημα ότι η πρώιμη έναρξη της ΗΑART μπορεί να αποτρέψει ανεπανόρθωτες βλάβες στο ανοσοποιητικό σύστημα, υπάρχουν μελέτες που αμφισβητούν ή μετριάζουν αυτές τις παρατηρήσεις. Μια πρόσφατη μελέτη απέτυχε να καταδείξει παρατεταμένη ομαλοποίηση των Β-κυττάρων μνήμης σε πρώιμη έναρξη της HAART [223]. Υπάρχουν αρκετοί διαφορετικοί τρόποι ορισμού και ανάλυσης των λειτουργικών ιδιοτήτων των Β κυττάρων μνήμης και των υποσυνόλων των Β κυττάρων μνήμης που μπορεί να οδηγήσουν σε σύγχυση και αντιφατικά αποτελέσματα. Επιπλέον, ακόμη και σε υγιή άτομα, υπάρχει ένα ευρύ φάσμα συχνοτήτων των κυκλοφορούντων Β-κυττάρων μνήμης [106], και ως εκ τούτου, είναι σημαντικό ότι οι μελέτες περιλαμβάνουν ένα μεγάλο αριθμό συμμετεχόντων, αλλά συνήθως είναι μελέτες επιπολασμού (cross-sectional) αντί για μελέτες κοορτής (cohort studies). Συνοψίζοντας, οι λοιμώξεις από Streptococcus pneumoniae είναι η πιο κοινή αιτία της βακτηριακής πνευμονίας στους ασθενείς με HIV λοίμωξη και ευθύνονται για

64 υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα [103]. Η εισαγωγή της HAART έχει οδηγήσει σε μείωση της συχνότητας εμφάνισης διεισδυτικής πνευμονίας, αν και εξακολουθεί να επηρεάζει τα HIV άτομα πιο συχνά από ό, τι τον υγιή πληθυσμό, ακόμα και σε ασθενείς με διατηρημένο αριθμό των CD4 κυττάρων. Τα Β κύτταρα αποτελούν έναν από τους πλέον δυσλειτουργικούς πληθυσμούς λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με HIV λοίμωξη. Κατά τη διάρκεια του χρόνιου ιϊκού πολλαπλασιασμού, εμφανίζονται λειτουργικές διαταραχές των Β-κυττάρων καθώς και μεταβολή στις αναλογίες και απόλυτους αριθμούς των κυκλοφορούντων Β κυττάρων με αποτέλεσμα μειωμένη ανοσοαπόκριση στον εμβολιασμό. Σημαντική ετερογένεια είναι επίσης έκδηλη στους πληθυσμούς των Β κυττάρων μνήμης. Η απώλεια των Β κυττάρων μνήμης είναι μια διαπιστωμένη επιπλοκή στην HIV λοίμωξη. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις για μεταβολές σε πληθυσμούς Β κυττάρων έναντι θυμοανεξάρτητων αντιγόνων, όπως είναι οι πολυσακχαρίτες του πνευμονιόκοκκου. Ακόμα, έχει ακόμα διαπιστωθεί μειωμένη συχνότητα IgM + Β κυττάρων μνήμης, τα οποία διαμεσολαβούν αποκρίσεις έναντι της πνευμονιοκοκκικής λοίμωξης. Τα περισσότερα ενεργοποιημένα Β κύτταρα υφίστανται απόπτωση μετά το πέρας της λοίμωξης, εκτός από μερικά κύτταρα που αποτελούν τον πληθυσμό των ηρεμούντων Β κυττάρων μνήμης, που είναι απαραίτητα για την ταχεία δευτερογενή απάντηση. Κατά τη φυσική πορεία της HIV-1 λοίμωξης οι υποπληθυσμοί των Β κυττάρων μεταβάλλονται, συμπεριλαμβανομένων των ηρεμούντων Β κυττάρων μνήμης που υφίστανται κυτταρική εξουθένωση. Επιπλέον, ελαττωματικοί πληθυσμοί Β-κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενεργοποιημένων Β κυττάρων μνήμης και των όμοιων με τα ιστικού τύπου Β κύτταρα (εξουθενωμένα), αυξάνονται στα HIV άτομα, ενώ κυκλοφορούν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε υγιή άτομα [146]. Αυτά τα ανώμαλα κύτταρα παρουσιάζουν χαρακτηριστικά υπερ-ενεργοποίησης του ανοσοποιητικού συστήματος και κυτταρική εξάντληση.

65 Η είσοδος της HAART μειώνει την ενεργοποίηση των πολυκλωνικών Β-κυττάρων και ομαλοποιεί ορισμένους υποπληθυσμούς. Ωστόσο ούτε το ποσοστό των των Β κυττάρων μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου, ούτε η λειτουργική τους δραστικότητα αποκαθίσταται με την HAART, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη ανοσία ακόμα και σε θεραπευόμενους ασθενείς. Η απώλεια της μνήμης αντικατοπτρίζεται στην έκπτωση των ειδικών Β κυττάρων μνήμης μετά τον εμβολιασμό, που δεν αποκαθίστανται από τη HAART. Η ΗΑΑRT έχει περιορισμένη επίδραση στην ομαλοποίηση των Β λεμφοκυττάρων. Το είδος των Β κυτταρικών λειτουργιών που αποκαθίστανται με την HAART παραμένει αδιευκρίνιστο. Παρόλο που τα επίπεδα των αντισωμάτων αποτελούν έναν χρήσιμο δείκτη προστασίας και έχουν χρησιμοποιηθεί για δεκαετίες ως πρώτης εκλογής μέθοδος προσδιορισμού αποτελεσματικής ανοσοποίησης, έχουν περιορισμούς και δεν μπορούν πλήρως να περιγράψουν την ανοσιακή απόκριση στον εμβολιασμό. Συνεπώς, άλλοι δείκτες αξιολόγησης της ανοσογονικότητας και της αποτελεσματικότητας των εμβολίων έχουν αναπτυχθεί. Η μελέτη της φαγοκυττάρωσης έχει εξελιχθεί σε ένα χρήσιμο εργαλείο αξιολόγησης της ανοσογονικότητας του πνευμονιοκοκκικού εμβολίου σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, καθώς αυτή είναι ελαττωματική στην HIV-1 λοίμωξη και ενοχοποιείται για τη νόσηση από διεισδυτική πνευμονιοκοκκική νόσο, ακόμα και σε ασθενείς υπό θεραπεία.

66 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

67

68 Ι. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της ανοσογονικότητας του 23- δύναμου πολυσακχαριδικού εμβολίου έναντι του Streptococcus pneumoniae σε ασθενείς με HIV-1 λοίμωξη, καθώς και η επίδραση της αντιρετροϊκής αγωγής στην ανοσιακή απόκριση. Ειδικότερα, μελετήσαμε δύο ομάδες ασθενών, ασθενείς που ελάμβαναν και ασθενείς που δεν ελάμβαναν αντιρετροϊκή θεραπεία, προκειμένου να ανιχνεύσουμε την επίδραση της HAART στις μεταβολές τις αντισωματικής απάντησης και της διαχρονικής εξέλιξης των διαφόρων Β λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών. Προσπαθήσαμε να καταγράψουμε και να αξιολογήσουμε τις συχνότητες των κυκλοφορούντων Β λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στο περιφερικό αίμα και της αντισωματικής απάντησης κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 48 εβδομάδων (πριν τον εμβολιασμό, 4 και 48 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με το 23-PPV) και την επίδραση αυτών, στην αντισωματική απάντηση. Ταυτόχρονα, έγινε εκτίμηση της φαγοκυτταρικής λειτουργίας που συμβαίνει πριν από τον εμβολιασμό και στο τέλος της περιόδου παρατήρησης, ως έμμεσο δείκτη και προγνωστικό παράγοντα της ανοσιακής ικανότητας μετά τον εμβολιασμό στις δύο διαφορετικές ομάδες οροθετικών ατόμων. Τέλος, δευτερεύων στόχος ήταν η διερεύνηση άλλων παραγόντων που επηρεάζουν την ανοσιακή απόκριση στο εμβόλιο, όπως π.χ. HIV RNA ιικό φορτίο, ναδίρ CD4 κύτταρα.

69 II. ΑΣΘΕΝΕΙΣ-ΜΕΘΟΔΟΙ Ασθενείς Η παρούσα μελέτη αποτελεί μια προοπτική παρεμβατική μελέτη με 66 HIV-1 ασθενείς, 31 μη θεραπευόμενους (naive) με CD4 κύτταρα >500c/mm 3 και 35 υπό επιτυχημένη αντιρετροϊκή θεραπεία, με ικανοποιητικό έλεγχο του ιικού φορτίου (HIV RNA ιικό φορτίο <50 copies/ml). Όλα τα κλινικά, επιδημιολογικά και εργαστηριακά δεδομένα (ηλικία, φύλο, τρόπος μετάδοσης, συννοσηρότητα, HIV RNA ιικό φορτίο, CD4 κύτταρα, ναδίρ CD4 κύτταρα) μετρήθηκαν και καταγράφηκαν. Εξαιρέθηκαν οι ασθενείς που είχαν επανεμβολιαστεί με το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο την τελευταία πενταετία, εκείνοι που ήταν υπό HAART για χρονικό διάστημα <6 μήνες, ασθενείς υπό HAART με πλημμελή ιολογική καταστολή (HIV RNA VL >50 copies/ml), ασθενείς με αριθμό CD4 T κυττάρων < 200 cells/ml, ή που έχασαν την πρώτη επίσκεψη μετά τον εμβολιασμό (4 η εβδομάδα). Οι ασθενείς και των δύο ομάδων ήταν σε αντιστοιχία ως προς την ηλικία τους και την ανοσολογική τους κατάσταση (αριθμός CD4 κυττάρων, διάρκεια HIV-1 λοίμωξης). Όλοι οι ασθενείς παρακολουθούνταν τακτικά στη Μονάδα Ειδικών Λοιμώξεων του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ της Θεσσαλονίκης. Η Επιτροπή Βιοηθικής και Δεοντολογίας του Ιατρικού Τμήματος, ενέκρινε το ερευνητικό πρωτόκολλο και όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν έγγραφη συγκατάθεση. Ανοσοποίηση και συλλογή δειγμάτων αίματος Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε αιμοληψία (15ml φρέσκου ολικού αίματος) και εν συνεχεία έλαβαν ενδομυϊκά 0.5 ml του 23-δύναμου πολυσακχαριδικού αντιπνευμονιοκοκκικού εμβολίου Pneumovax 23, το οποίο περιέχει 25 μg καθενός από τους ακόλουθους καψιδιακούς πολυσακχαριδικούς τύπους: 1, 2, 3, 4, 5, 6Β, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F και 33F (Pneumovax 23, Merck & Co., Inc.).

70 Δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες ενέργειες από τον εμβολιασμό, με μοναδική εξαίρεση την εμφάνιση έντονης τοπικής δερματικής αντίδρασης σε μία ασθενή, η οποία υποχώρησε με συμπτωματική θεραπεία εντός 3 ημερών. Οι ασθενείς επέστρεψαν 4 και 48 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό για περαιτέρω δειγματοληψίες. 15 ml φρέσκου ολικού αίματος ελήφθη από τον κάθε ασθενής σε i)φιαλίδια χωρίς αντιπηκτικό, ii)φιαλίδια με ηπαρίνη και iii)φιαλίδια με EDTA, ενώ η επεξεργασία πραγματοποιήθηκε εντός 2 ωρών από τη συλλογή. Προσδιορισμός των ΙgG αντισωμάτων με τη μέθοδο ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Στην περίπτωση της συγκεκριμένης μελέτης χρησιμοποιήθηκε το kit της Binding Site VaccZyme Anti-PCP IgG (ELISA Manufacturers Manual. userfiles /Docuemtnos% 20Anexos/Binding%20Site/ MK012. pdf/ The Binding Site Ltd, Birmingham, U.K.), που προορίζεται για την εργαστηριακή μέτρηση in vitro των ειδικών IgG αντισωμάτων έναντι του πολυσακχαριδικού ελύτρου του πνευμονιόκοκκου σε δείγματα ορού. Συνοπτικά η τεχνική είχε ως εξής: Χρησιμοποιήθηκαν βοθρία που είναι επιστρωµένα µε αντιγόνο PCP (1-5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, 33F). Οι βαθμονομητές και οι οροί ελέγχου είχαν προσροφηθεί έναντι του πολυσακχαρίτη του ελύτρου και τα δείγματα αραιώθηκαν σε διαλύτη που περιέχει CPS (αραίωση 1/100). Οι βαθμονομητές, οι οροί ελέγχου και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών (προσθήκη 100 μl αραιωμένου ορού) κατανεμήθηκαν στα βοθρία και τα αντισώµατα που αναγνωρίζουν το αντιγόνο PCP προσδέθηκαν κατά την πρώτη επώαση. Μετά το πλύσιµο για την απομάκρυνση όλων των μη µη προσδεµένων πρωτεϊνών, προστέθηκε ως αντιδραστήριο σύζευξης αντι-ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη IgG κονίκλου (γ ειδικής αλύσου) σηµασµένη µε υπεροξειδάση. Το αντιδραστήριο σύζευξης προσδέθηκε στο δεσμευμένο ανθρώπινο αντίσωµα και η περίσσεια του µη

71 προσδεμένου αντιδραστηρίου σύζευξης απομακρύνθηκε µε νέο πλύσιµο. Το προσδεμένο αντιδραστήριο σύζευξης γίνεται ορατό µε υπόστρωµα 3.3, 5.5 τετραµέθυλο-βενζόλιου (ΤΜΒ) το οποίο δίνει προϊόν αντίδρασης κυανού ωχρότητος, του οποίου η ένταση είναι ανάλογη προς την συγκέντρωση του αντισώματος στο δείγµα. Τέλος προστέθηκε φωσφορικό οξύ σε κάθε βοθρίο για να σταματήσει η αντίδραση. Αυτό παρήγαγε το τελικό κίτρινο χρώµα που διαβάζεται στα 450nm σε φωτόμετρο. Ως επιτυχημένη αντισωματική απάντηση στο εμβόλιο, θεωρήθηκε ο διπλασιασμός του αρχικού τίτλου των αντισωμάτων [ ]. Προσδιορισμός ανοσοφαινότυπου Β λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής 100μl αίματος από κάθε ασθενή μετά από προσθήκη 10μl από το κάθε μονοκλωνικό αντίσωμα (με τους συνδυασμούς που ακολουθούν) υποβλήθηκαν σε δεκάλεπτη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου και σκοτάδι. Ακολούθησε λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων με προσθήκη 2ml από το Lysis Buffer (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA) και επώαση για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η επεξεργασία των δειγμάτων και η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε σε κυτταρόμετρο XL Epics της εταιρίας Beckman Coulter. Για την προετοιμασία των δειγμάτων (oλικό αίμα με EDTA, επεξεργασία εντός 2 ωρών από τη δειγματοληψία) χρησιμοποιήθηκαν τα εξής μονοκλωνικά αντισώματα της εταιρίας Immunostep: CD19-PerCP, CD27-PE, IgM-FITC, IgD-FITC, CD21-FITC, CD3-PE/CD4-FITC, CD45RO-PerCP. Ως ολικά Β κύτταρα μνήμης θεωρήθηκαν τα κύτταρα με δείκτες επιφανείας CD19+CD27 +. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστά υποπληθυσμών επί του συνολικού κλάσματος των Β κυττάρων. Τα Β κύτταρα (CD19+) και Β κύτταρα μνήμης (CD19+CD27+) σημάνθηκαν με τη χρήση των παρακάτω μονοκλωνικών αντισωμάτων συζευγμένων με fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), και Peridinin chlorophyll protein (PerCP) κατάλληλα για κυτταρομετρίας ροής

72 τριών φθοριοχρωμάτων. Ο συνδυασμός των τριών φθοριοχρωμάτων χαρακτηρίζει τους υποπληθυσμούς που μελετήθηκαν στην παρούσα μελέτη: CD19-PerCP/ CD27- PE/ IgM-FITC- CD19-PerCP/ CD27-PE/ IgD-FITC- CD19-PerCP/ CD27-PE/ CD21- FITC - CD3-PE/CD4-FITC/ CD45RO-PerCP. Ειδικότερα οι παρακάτω δείκτες επιφανείας χαρακτήριζαν του διαφόρους υποπληθυσμούς Β λεμφοκυττάρων μνήμης ως εξής: Εξουθενωμένα Β κύτταρα μνήμης ή κύτταρα μνήμης όμοια με τα ιστικά (exhausted memory B cells/tissue like memory B cells): CD19+CD21lowCD27-, ηρεμούντα Β λεμφοκύτταρα μνήμης (resting memory B cells): CD19+CD21high+CD27+, IgM Β λεμφοκύτταρα μνήμης (IgM memory B cells) :CD19+CD27+IgMhigh, ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης (activated memory B cells): CD19+CD21low+CD27+ και Β λεμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου (isotype-switched memory B cells): CD19+CD27 + IgM. Μέτρηση φαγοκυττάρωσης 10 ml ολικού αίματος ελήφθησαν μετά από φλεβοκέντηση περιφερικής φλέβας υπό άσηπτες συνθήκες σε σωληνάρια ηπαρίνης πριν τον εμβολιασμό και μετά από 48 εβδομάδες παρακολούθησης των ασθενών. Έγινε άμεση μεταφορά και επεξεργασία των δειγμάτων στο εργαστήριο. Οι φαγοκυτταρικές παράμεροι μετρήθηκαν με τη χρήση του Phagotest κιτ (Orpegen Pharma, Heidelberg, Germany), βάσει των οδηγιών του κατασκευαστή (Operator smanual PHAGOTEST. Available at: ac.be/mexp/phagotst.pdf /Orpegen Pharma GmBH, Heidelberg, Germany) Αναλυτικά, φρέσκο ηπαρινισμένο αίμα βαπτίστηκε σε υδατόλουτρο για 15 λεπτά σε θερμοκρασία 0 C. Σε αυτό το τεστ, 2 Χ 10 7 σημασμένα με FITC φθοριόχρωμα βακτήρια Escherichia coli, τα οποία τοποθετήθηκαν σε ψύξη στους 0 C, προστέθηκαν σε 100 ml ολικού αίματος. Ακολούθησε τότε επώασε όλων των δειγμάτων για 10 λεπτά στους 37 C. Η διακοπή της φαγοκυττάρωσης τότε έγινε τοποθετώντας τα δείγματα σε πάγο και έγινε προσθήκη 100 μl διαλύματος που

73 επιτρέπει να διακρίνουμε τα βακτήρια που απλά προσκολληθήκαν από αυτά που συγχωνεύτηκαν από τα φαγοκύτταρα, απενεργοποιώντας τα μόρια της χρωστικής των βακτηρίων που βρίσκονταν έξω από τα φαγοκύτταρα. Ακολούθως έγινε πλύση των δειγμάτων και λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, ενώ λίγο πριν την επεξεργασία των δειγμάτων στο κυτταρόμετρο έγινε η προσθήκη διαλύματος που βάφει το DNA των βακτηρίων και καθιστά ευκολότερη την ανάλυση, αφού διαχωρίζονται τα τεχνητά ανοσοσυμπλέγματα που μπορεί να δημιουργηθούν μεταξύ κυττάρων ή βακτηρίων. Ένα αρνητικό δείγμα ελέγχου κρατήθηκε σε πάγο. Στη συνέχεια, έγινε πλύση των δειγμάτων και λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ λίγο πριν την επεξεργασία των δειγμάτων στο κυτταρόμετρο έγινε η προσθήκη 200 ml διαλύματος (propidium iodide) που βάφει το DNA των βακτηρίων και τα λευκοκύτταρα, καθιστώντας ευκολότερη την ανάλυση, αφού διαχωρίζονται τα τεχνητά συσσωματώματα που μπορεί να δημιουργηθούν μεταξύ κυττάρων ή βακτηρίων. Έπειτα, ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και η φαγοκυτταρική ικανότητα ποσοτικοποιήθηκε ως η ξεχωριστή φαγοκυτταρική δραστηριότητα εκφρασμένη από το βαθμό φθορισμού ανά κύτταρο (μέση ένταση φθορισμού-mean fluorescent intensity MFI) μετά από ανάλυση σε κυτταρομετρητή ροής. Τα φυσιολογικά όρια φαγοκυττάρωσης κυμαίνονται από 95-99% για τα ουδετερόφιλα, ενώ για τα μονοκύτταρα η ικανοποιητική φαγοκυτταρική ικανότητα, ορίζεται αντίστοιχα από τα όρια 65-95%. Προσδιορισμός του ιϊκού φορτίου HIV RNA στο πλάσμα, των υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων To ιϊκό φορτίο HIV RNA στο πλάσμα υπολογίστηκε ως εξέταση ρουτίνας σε όλους τους HIV-1 ασθενείς με την τεχνική real-time PCR και κατώτερο εύρος ανίχνευσης τα 50 copies/ml. Η ποσοτικοποίηση των υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων (CD4+ και CD8+), συμπεριλαμβανομένων των παρθένων CD45RA+ (naive) και μνημονικών

74 CD45RO+ (memory) CD4 T κυττάρων πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής σε κυτταρόμετρο XL Epics της εταιρίας Beckman Coulter. Στατιστική Ανάλυση Ο έλεγχος της κανονικότητας της κατανομής των αποτελεσμάτων των μετρήσεων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Kolmogorov-Smirnov test και το Νormal Probability Plot.Για τον έλεγχο της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στον εμβολιασμό και τον παράγοντα χρόνο χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο της Ανάλυσης Διακύμανσης κατά 2 παράγοντες (Two-way ANOVA). Οι συγκρίσεις των απόλυτων τιμών των μεταβλητών ανάμεσα στις 2 ομάδες πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το τ-τεστ για ανεξάρτητα δείγματα (Independent samples t-test). Για την διαχρονική σύγκριση των μεταβλητών ανά ομάδα (baseline vs 1 η μέτρηση vs 2 η μέτρηση) χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο της ανάλυσης διακύμανσης κατά ένα παράγοντα με επαναληπτικές μετρήσεις (Οne factor Repeated Measures ANOVA). Οι συγκρίσεις των ποσοστιαίων αυτών μεταβολών των μεταβλητών ανάμεσα στις ομάδες πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο της ανάλυσης διακύμανσης κατά ένα παράγοντα χωρίς επαναληπτικές μετρήσεις (Οne way ANOVA). Οι συγκρίσεις κατά ζεύγη πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Bonferroni test. Σε περίπτωση που δεν ικανοποιήθηκαν οι προϋποθέσεις της κανονικής κατανομής των δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν τα μη παραμετρικά test Kruskal-Wallis και Mann- Whitney test.το μοντέλο ανάλυσης συνδιακύμανσης (Αnalysis of Covariance)χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των απόλυτων μεταβολών των μεταβλητών σε κάθε χρονική αξιολόγηση από τη χρονική στιγμή πριν τον εμβολιασμό, ανάμεσα στις δύο ομάδες, προσαρμόζοντας παράλληλα και την τιμή των μεταβλητών πριν τον εμβολιασμό, ώστε να υπάρχει έλεγχος της επίδρασης τυχόν διαφορών αρχικά στις 2 ομάδες.

75 Οι αντισωματικές απαντήσεις μετρήθηκαν ως η σχετική ειδική από το εμβόλιο IgG αύξηση σε σχέση με τα επίπεδα πριν τον εμβολιασμό στην 4η και 48 η εβδομάδα, παρέχοντας έτσι μια συσχέτιση της ολικής απάντησης στο εμβόλιο προσαρμοσμένη ως προς τη συγκέντρωση των IgG των ασθενών για τους 23 ορότυπους του εμβολίου τη στιγμή της ένταξής του στη μελέτη. Παρόμοια, η φαγοκυτταρική δραστηριότητα μετρήθηκε ως η μέση τιμή των ουδετερόφιλων και των μονοκυττάρων, πριν τον εμβολιασμό και στο τέλος της μελέτης. Ο αριθμός των Β λεμφοκυττάρων και των Β υποπληθυσμών μνήμης, συγκρίθηκαν ανάμεσα στις δύο ομάδες ασθενών με τη χρήση του Student's T-test ή το Mann-Whitney test στην περίπτωση μη κανονικής κατανομής των δεδομένων. Οι συσχετίσεις μεταξύ της σχετικής αύξησης των συγκεντρώσεων των IgG ή της φαγοκυττάρωσης και των μεταβλητών των Β λεμφοκυττάρων πριν τον εμβολιασμό εκτιμήθηκαν με την μονοπαραγοντική γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης. Αυτή ενισχύθηκε με την πολυπαραγοντική ανάλυση με προσαρμογή ως προς την ομάδα ασθενών (με θεραπευόμενοι και θεραπευόμενοι ασθενείς) και την τρέχουσα καπνιστική συνήθεια (ναι/όχι). Λογαριθμική μετατροπή χρησιμοποιήθηκε, όταν απαιτούνταν, για την κανονικότητα των δεδομένων. Oλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό πακέτο SPSS, version (SPSS Inc, Chicago, IL). Όλα τα τεστ ήταν διπλής κατεύθυνσης (twosided). Η τιμή p-value <0.05 καθορίσθηκε σαν επίπεδο στατιστικά σημαντικής διαφοράς, επίσης καταγράφηκαν και οι οριακές στατιστικά σημαντικές διαφορές (0.05<P<0.1)

76 III. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δημογραφικά και κλινικοεργαστηριακά δεδομένα Τα δημογραφικά, κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα των 66 ασθενών της μελέτης, συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες ως προς την καπνιστική συνήθεια (p=0.0013), τον αριθμό των nadir CD4 λεμφοκυττάρων (p<0.0005). Παρατηρούμε, αναφορικά με τα κλινικά στοιχεία των ασθενών, ότι υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις ομάδες ως προς την ύπαρξη κλινικής εκδήλωσης παθογνωμονικής του AIDS (p=0.0005), αναιμίας(p=0.027), νεφρικής βλάβης (p=0.055), λιποδυστροφίας (p=0.005) και υπερλιπιδαιμίας (p=0.0005). Τα επίπεδα των CD4 κυττάρων ήταν υψηλότερα στην ομάδα των θεραπευόμενων ασθενών και ακολούθησαν, διαχρονικά, διαφορετική εξέλιξη από των μη θεραπευόμενων ασθενών ασθενών (p =0,024) [Διάγραμμα 1]. Η διαφορά στη μεταβολή των CD4 κυττάρων ήταν έκδηλη, συγκρίνοντας και κάθε χρονική στιγμή ξεχωριστά, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 2, ιδίως μετά τον εμβολιασμό στην πορεία του χρόνου.

77 Πίνακας 1. Βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών της μελέτης, στην ένταξή τους. Μη θεραπευόμενοι ασθενείς Θεραπευόμενοι ασθενείς p value (Ν=31) (Ν=35) Ηλικία(έτη) ± ± Φύλο [άνδρας/γυναίκα (n, %)] 31 (100.0%)/0 (0.0%) 31 (85.7%)/4 (14.3%) Διάρκεια HIV λοίμωξης (έτη) 3.84± ± CD4 πριν τον εμβολιασμό 637.9± ± Nadir CD ± ± VL πριν τον εμβολιασμό * 36503(165080) 47(0) HAART (διάρκεια σε μήνες) NA 35.6±14.35 NA Βάρος Σώματος (kg) 76.1 ± ± HCV λοίμωξη [n (%)] 1(3.2%) 3(8.6%) HBV λοίμωξη [n (%)] 6(19.4%) 3(8.6%) Λιποδυστροφία 0 8(22.9%) Υπερλιπιδαιμία 6(19.4%) 22(62.9%) Εκδήλωση AIDS 1(3.2%) 14(40.1%) Αναιμία 0 6(17.1%) Νεφρική βλάβη 0 5(14.3%) Κάπνισμα [n (%)] 21(67.7%) 12(34.3%) Όλα τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως mean± SD, *median (IQR) VL: HIV RNA ιικό φορτίο, HAART: Highly Active Antiretroviral Therapy, NA = not applicable, HCV: Ηπατίτιδα C, HBV: Ηπατίτιδα Β

78 Mέση τιμή CD4 λεμφοκυττάρων 1200 μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι ,34 698,71 701, ,39 546,74 498, Χρόνος ( εβδομάδες) Διάγραμμα 1. Διαχρονική μεταβολή των CD4 λεμφοκυττάρων σε διάστημα παρακολούθησης ενός έτους. Ο αριθμός των CD4 λεμφοκυττάρων μεταβλήθηκε διαχρονικά με διαφορετικό τρόπο στις δυο ομάδες ασθενών (overall significance, p=0.024).

79 Πίνακας 2. Σύγκριση των CD4 λεμφοκυττάρων σε κάθε χρονική στιγμή, πριν και μετά τον εμβολιασμό με το 23-PPV. Tα επίπεδα των CD4 λεμφοκυττάρων διέφεραν σημαντικά ανάμεσα στις δυο ομάδες ασθενών, ιδίως μετά τον εμβολιασμό. Mέση τιμή Τυπική Απόκλιση p-value Στιγμιότυπο πριν τον εμβολιασμό Μη θεραπευόμενοι 618,39 275,18 θεραπευόμενοι 719,34 290,56 0,154 4 εβδομάδες μετά Μη θεραπευόμενοι 546,74 262,40 θεραπευόμενοι 698,71 287,11 0, εβδομάδες μετά Μη θεραπευόμενοι 498,16 195,92 θεραπευόμενοι 701,34 274,98 0,001 Αντισωματική απάντηση στο 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο Μετρήθηκε ο απόλυτος αριθμός των αντισωμάτων σε τρία στιγμιότυπα: πριν τον εμβολιασμό, 4 και 48 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Αναλυτικότερα, τα αποτελέσματα ανά ασθενή παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 του παραρτήματος. Η διαχρονική εξέλιξη των επιπέδων των αντισωμάτων στις δύο ομάδες ασθενών διέφερε, τόσο πριν, όσο και μετά τον εμβολιασμό (p=0.009), όπως φαίνεται και στο Διάγραμμα 2. Ο απόλυτος αριθμός των αντισωμάτων και ο εκθετικός λογάριθμος των επιπέδων των αντισωμάτων ήταν μεγαλύτερος στην ομάδα των θεραπευμένων ασθενών και στα τρία στιγμιότυπα, πριν τον εμβολιασμό (p=0,0005), την 4 η εβδομάδα (p=0,006) και την 48 η εβδομάδα (p=0,001).

80 Οι δυο ομάδες ασθενών διέφεραν ακόμα ως προς την ανταπόκριση στον εμβολιασμό (p=0.047) [Πίνακας 3], η οποία ορίστηκε, σύμφωνα με την βιβλιογραφία, ως ο διπλασιασμός του αρχικού τίτλου των αντισωμάτων την 4 η εβδομάδα, μετά τον εμβολιασμό ,77 p= ,70 222,09 234,41 Μη θεραπευόμενοι ασθενείς ,82 Θεραπευόμενοι ασθενείς ,99 Στιγμιότυπο προ εμβολιασμού Εβδομάδα 4 Εβδομάδα 48 Διάγραμμα 2. Διαχρονική εξέλιξη των επιπέδων των αντισωμάτων στις δύο ομάδες ασθενών. Τα επίπεδα των αντισωμάτων παρουσίαζαν στατιστικά σημαντικές μεταβολές στην πορεία του χρόνου ανάμεσα στις δύο ομάδες ασθενών (N ασθενών=66,overall significance, p=0.009). Από το σύνολο των ασθενών της μελέτης, 48 ασθενείς (72,7%) διπλασίασαν τον αρχικό τίτλο των αντισωμάτων 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό (responders/απαντητές), ενώ 18 ασθενείς (27,2%) δεν ανταποκρίθηκαν (nonresponders/μη απαντητές) [Διάγραμμα 3]. Η πλειοψηφία των non-responders ελάμβαναν HAART (13 vs 5 ασθενείς) [Πίνακας 4]. Δεν υπήρξε συσχέτιση της ανταπόκρισης με τον αριθμό των CD4 (NS) ή τον αριθμό των nadir CD4 (NS).

81 Πίνακας 3. Αντισωματική απάντηση ασθενών στο 23-PPV. Παρά τη λήψη αντιρετροϊκής θεραπείας σημαντικό ποσοστό ασθενών δεν ανταποκρίθηκε ικανοποιητικά στον εμβολιασμό με το 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο. Μη θεραπευόμενοι ασθενείς Θεραπευόμενοι ασθενείς p value (Ν=31) (Ν=35) Αbs (log) πριν τον εμβολιασμό 3.16± ± Αbs(log) 4 η εβδομάδα 4.62± ± Αbs (log)48 η εβδομάδα 0.29± ± Απάντηση στο εμβόλιο 26 (83.8%) 22(62.8%) Μη απάντηση στο εμβόλιο 5(16.1%) 13(37.1%) Επί τοις % διπλασιασμός του τίτλου 6.72± ±13.41 NS Abs (log): Εκθετικός λογάριθμος των επιπέδων αντισωμάτων Απαντητές: αρχικός τίτλος αντισωμάτων x2

82 Διάγραμμα 3. Αντισωματική απάντηση στο 23-δύναμο πολυσακχαριδικό εμβόλιο σε ασθενείς που δε λαμβάνουν και σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία. Στο διάγραμμα απεικονίζεται η μέση τιμή της αντισωματικής απάντησης την 4 η εβδομάδα.

83 Μέτρηση Β λεμφοκυττάρων Μελετήθηκαν τα ποσοστά των ολικών Β κυττάρων (CD19+), των B λεμφοκυττάρων μνήμης (CD19+CD27+), των IgM Β κυττάρων μνήμης (CD19+CD27+IgM+) των ηρεμούντων μνημονικών (CD19+CD21high+CD27+), των ενεργοποιημένων μνημονικών (CD19+CD21low+CD27+), των Β κυττάρων μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου (CD19+CD27+IgD ) και των κυττάρων μνήμης που μοιάζουν με τα Β κυττάρων μνήμης που παρουσιάζουν εξουθένωση (CD19+CD21lowCD27-) πριν και μετά τον εμβολιασμό. Καμιά στατιστική διαφορά στα επίπεδα των ολικών Β και των άλλων υποπληθυσμών μνήμης δε βρέθηκε ανάμεσα στους θεραπευόμενους και μη θεραπευόμενους ασθενείς πριν τον εμβολιασμό. Η HAART δεν είχε καμιά επίδραση στην διακύμανση των αρχικών συγκεντρώσεων των Β λεμφοκυττάρων στους HIV ασθενείς (Διάγραμμα 4). α. Συχνότητα των ολικών Β λεμφοκυττάρων στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.06

84 β. Συχνότητα των Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.854 γ. Συχνότητα των ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.758

85 δ. Συχνότητα των IgM Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.132 ε. Συχνότητα των Β λεμφοκυττάρων μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.951

86 στ. Συχνότητα των εξουθενωμένων Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.1 ζ. Συχνότητα των ημερούντων Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών πριν τον εμβολιασμό. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι p=0.850

87 Διάγραμμα 4. Συχνότητες των ολικών Β λεμφοκυττάρων και άλλων υποπληθυσμών Β λεμφοκυττάρων μνήμης στο περιφερικό αίμα μη θεραπευόμενων και θεραπευόμενων ασθενών πριν τον εμβολιασμό με το PPV- 23 πολυσαχκαριδικό έμβολιο έναντι του Streptococcus pneumoniae. Στα επιμέρους διαγράμματα απεικονίζεται η κατανομή των συχνοτήτων των Β λεμφοκυτταρικών πληθυσμών πριν τον εμβολιασμό:α. Ολικά Β λεμφοκύτταρα, β. Β λεμφοκύτταρα μνήμης, γ. Ενεργοποιημένα Β λεφοκύτταρα, δ. ΙgM B λεμφοκύτταρα μνήμης, ε. Β λεμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου, στ. Εξουθενωμένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, ζ. Ηρεμούντα Β λεμφοκύτταρα μνήμης. Η διακύμανση συχνοτήτων των ολικών Β λεμφοκυττάρων και των διαφόρων υποσυνόλων των Β λεμφοκυττάρων μνήμης απεικονίζονται στο Διάγραμμα 5 συγκεντρωτικά, πριν και μετά τον εμβολιασμό. α. Διαχρονική εξέλιξη των ολικών Β λεμφοκυττάρων. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι

88 β. Διαχρονική εξέλιξη των Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι γ. Διαχρονική εξέλιξη των Β λεμφοκυττάρων μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι

89 δ. Διαχρονική εξέλιξη των ΙgM Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι ε. Διαχρονική εξέλιξη των ηρεμούντων Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι

90 στ. Διαχρονική εξέλιξη των εξουθενωμένων Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι ζ. Διαχρονική εξέλιξη των ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Μη θεραπευόμενοι Θεραπευόμενοι

91 Ολικά Β λεμφοκύτταρα Διάγραμμα 5. Διαχρονική εξέλιξη της μέσης τιμής των συχνοτήτων των Β κυτταρικών υποπληθυσμών στην πορεία του χρόνου, πριν, 4 και 48 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με το 23-PPV. α. Ολικά Β λεμφοκύτταρα, β. Β λεμφοκύτταρα μνήμης, γ. Β λεμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου, δ. IgM Β λεμφοκυττάρων μνήμης, ε. Ηρεμούντα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, στ. Εξουθενωμένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, ζ. Ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης. Ειδικότερα, τα ποσοστά των συνολικών Β λεμφοκυττάρων ήταν υψηλότερο στους θεραπευόμενους ασθενείς, ωστόσο δε διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές πριν και μετά τον εμβολιασμό, ανάμεσα στις δυο ομάδες (p=0.85,ns). Υπήρξε μια πτωτική τάση των ολικών Β κυττάρων με την πρόοδο της HIV λοίμωξης, ανεξάρτητα από τον εμβολιασμό ή τη λήψη HAART (Διάγραμμα 6) p=0.85 μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι ,25 8,49 8 7,64 6 6,62 6,36 5, Χρόνος (εβδομάδες) Διάγραμμα 6. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των ολικών Β λεμφοκυττάρων στις δύο ομάδες ασθενών.

92 Β λεμφοκύτταρα μνήμης Όσον αφορά τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης (CD19+CD27+), τα επίπεδά τους ήταν υψηλότερα σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία πριν και μετά τον εμβολιασμό (p=0.987, NS). Ο εμβολιασμός οριακά αύξησε τα κυκλοφορούντα κλάσματα των Β λεμφοκυττάρων μνήμης (εβδομάδα 4), αν και σταδιακή ελάττωσή τους παρατηρήθηκε και στις δύο ομάδες ασθενών (Διάγραμμα 7). 5 4,5 4 p=0.987 μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι 3,5 3 2,5 2 1,5 2,16 2,28 1,98 2,07 1,91 1,76 1 0, Χρόνος ( εβδομάδες) Διάγραμμα 7. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών. Τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου (CD19+CD27+IgM-) ήταν οριακά αυξημένα στους naïve ασθενείς σε σύγκριση με τους θεραπευόμενους ασθενείς (Διάγραμμα 8). Ο υποπληθυσμός αυτός αυξήθηκε σημαντικά μετά τον

93 Β λρμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου εμβολιασμό και στις δύο ομάδες παρατήρησης της μελέτης (overall significance, p=0.0005) p= , , , ,29 25,03 μη θεραπευόμενοι 20 22,42 θεραπευόμενοι Χρόνος ( εβδομάδες ) Διάγραμμα 8. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των Β λεμφοκυττάρων μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου στις δύο ομάδες ασθενών. Τα IgM B λεμφοκύτταρα μνήμης (CD19+CD27+IgMhigh) ήταν περισσότερα στην ομάδα των ασθενών χωρίς θεραπεία πριν τον εμβολιασμό. Η ποσοστιαία μεταβολή των επιπέδων τους πριν τον εμβολιασμό στις 4 και 48 εβδομάδες διέφερε σημαντικά ανάμεσα στις δύο ομάδες (p=0.046 and p=0.042, αντίστοιχα), συνεπώς ο εμβολιασμός είχε παρόμοια επίδραση και στις δύο ομάδες ασθενών (Διάγραμμα 9).

94 IgM Β λεμφοκύτταρα μνήμης p= , ,99 24,44 28,24 24, , μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι Χρόνος ( εβδομάδες ) Διάγραμμα 9. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των IgM Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών. Οι ασθενείς που ελάμβαναν θεραπεία, από την άλλη πλευρά, είχαν υψηλότερα ποσοστά ηρεμούντων Β λεμφοκυττάρων (CD19+CD21high+CD27+). Αυτοί διέφεραν σημαντικά μετά τον εμβολιασμό την 4 η εβδομάδα (p=0,017) και την 48η (p=0.03). Η διαχρονική τάση ωστόσο ήταν παρόμοια και στις δύο ομάδες ασθενών (total significance,p=0,201), με τον εμβολιασμό να πυροδοτεί την αρχική αύξησή των συγκεντρώσεων του υποπληθυσμού αυτού (οι οποίοι διέφεραν σημαντικά στους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία, p=0.003) και τα επίπεδά τους να μειώνονται σταδιακά (Διάγραμμα 10).

95 Ηρεμούντα Β λεμφοκύτταρα μνημης p= μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι 70 60, , ,89 40,66 44,62 46, Χρόνος ( εβδομάδες ) Διάγραμμα 10. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των ηρεμούντων Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών. Οι ασθενείς υπό θεραπεία είχαν υψηλότερα επίπεδα των Β λεμφοκυττάρων μνήμης όμοιων με τα ιστικά και φαινότυπο εξουθένωσης (CD19+CD21lowCD27-) συγκριτικά με τους naïve ασθενείς, με πτωτική τάση με την πρόοδο του χρόνου, ανεξάρτητα από τη λήψη HAART. Αυτές οι αλλαγές δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων (total significance, p=0,876). Μια δραματική ελάττωση των κυττάρων αυτών παρατηρήθηκε, 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό τόσο στους naïve ασθενείς (p = 0,023) όσο και σε εκείνους που ελάμβαναν θεραπεία (p=0,024) [Διάγραμμα 11].

96 Εξουθενωμένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης p= μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι 60 55, , ,49 45,28 39, , Χρόνος ( εβδομάδες) Διάγραμμα 11. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των Β λεμφοκυττάρων μνήμης όμοιων με τα ιστικά και φαινότυπο εξουθένωσης στις δύο ομάδες ασθενών. Οι naïve ασθενείς διατηρούσαν υψηλότερα επίπεδα ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων μνήμης (CD19+CD27+CD21low+) πριν και μετά τον εμβολιασμό (εβδομάδα 4: p=0,018, την εβδομάδα 48: p=0,035). Μετά τον εμβολιασμό παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του πληθυσμού και στις δύο ομάδες ασθενών της μελέτης (Διάγραμμα 12).

97 Ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης p= μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι ,62 54, ,87 52, , , Χρόνος ( εβδομάδες ) Διάγραμμα 12. Διαχρονική εξέλιξη του ποσοστού των ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων μνήμης στις δύο ομάδες ασθενών. Συμβολή της ιαιμίας και των ναδίρ CD4 κυττάρων στις μεταβολές των Β λεμφοκυττάρων Προκειμένου να διερευνήσουμε τον ρόλο των διαφόρων παραγόντων που συσχετίζονται με τις μεταβολές των Β κυττάρων, εκτιμήθηκαν δημογραφικοί, ιολογικοί και ανοσολογικοί παράγοντες σε πολυπαραγοντική ανάλυση πριν τον εμβολιασμό. Η ηλικία συσχετίστηκε με το ενεργοποιημένα και τα ηρεμούντα Β κύτταρα μνήμης, ενώ το φύλο δε φάνηκε να επιδρά σε αυτούς τους πληθυσμούς. Το ιικό φορτίο πριν τον εμβολιασμό δε συσχετίστηκε με τα ενεργοποιημένα, τα ηρεμούντα ή τα IgM Β κύτταρα μνήμης την ίδια χρονική στιγμή (Πίνακας 4). Προκειμένου να εκτιμηθούν πιο διεξοδικά τα αθροιστικά αποτελέσματα της παραπάνω ανάλυσης, διερευνήσαμε περαιτέρω την πιθανότητα γραμμικής

98 συσχέτισης των συχνοτήτων των Β κυτταρικών υποπληθυσμών με το HIV RNA ιικό φορτίο και τα CD4 κύτταρα σε όλα τα χρονικά στιγμιότυπα ξεχωριστά (πριν, 4 η και 48 η εβδομάδα). Τα ενεργοποιημένα κύτταρα πριν τον εμβολιασμό είχαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το αρχικό ιικό φορτίο (r=0.54, p=0.01) και τα ηρεμούντα μέτρια αρνητική συσχέτιση με το αρχικό ιικό φορτίο (r=-0.45, p=0.026) [Διάγραμμα 13]. Τα ναδίρ CD4 συσχετίστηκαν με χαμηλά επίπεδα των ηρεμούντων (r=0.538, p=0.01) και ενεργοποιημένων(r=0.595, p=0.004) Β κυττάρων μνήμης.καμία συσχέτιση δεν διαπιστώθηκε μεταξύ των CD4 κυττάρων και τον ενεργοποιημένων ή ηρεμούντων κυττάρων σε κανένα χρονικό στιγμιότυπο. Πίνακας 4. Πολυπαραγοντική ανάλυση δημογραφικών και ιολογικών παραγόντων επίδρασης στους υποπληθυσμούς των Β λεμφοκυττάρων μνήμης Ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης Ηρεμούντα λεμφοκύτταρα μνήμης Β ΙgM Β λεμφοκύτταρα μνήμης Estimate±SE p- value Estimate±SE p-value Estimate±S E p-value Ηλικία -1.00± ± ± Φύλο Άνδρες Ref. --- Ref. --- Ref. --- Γυναίκες ± ± ± HIV-RNA <47 Ref. --- Ref. --- Ref. --- > ± ± ± Ναδίρ CD4-2.34± ± ±

99 Διάγραμμα 13. Συσχέτιση του αρχικού ιικού φορτίου (HIV RNA Viral Load) με τα επίπεδα των Β λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών μνήμης πριν τον εμβολιασμό. Συσχέτιση των Β λεμφοκυττάρων με τα επίπεδα των αντισωμάτων Τα ολικά Β κύτταρα, τα B κύτταρα μνήμης και τα Β κύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου πριν τον εμβολιασμό συσχετίζονταν με τα επίπεδα των αντισωμάτων πριν τον εμβολιασμό (p=0.059, p=0.058 και p=0.012 αντίστοιχα) ανεξάρτητα από τη λήψη αντιρετροϊκής αγωγής (Διάγραμμα 14).

100 Log (αντισωμάτων πριν τον εμβολιασμό) Log (αντισωμάτων πριν τον εμβολιασμό) α Log (ολικών B λεμφοκυττάρων πριν τον εμβολιασμό) β Log (B λεμφοκυττάρων μνήμης πριν τον εμβολιασμό)

101 Log (αντισωμάτων πριν τον εμβολιασμό) γ Log (B λεμφοκυττάρων με μεταστροφή ισοτύπου πριν τον εμβολιασμό) Διάγραμμα 14. Συσχέτιση των επιπέδων των αρχικών ολικών Β λεμφοκυττάρων και των Β κυτταρικών υποπληθυσμών μνήμης με τα επίπεδα των αντισωμάτων πριν τον εμβολιασμό. α. Ολικά Β λεμφοκύτταρα μνήμης, β. Β λεμφοκύτταρα μνήμης, γ. Β λεμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτύπου. Τα επίπεδα των Β λεμφοκυττάρων μνήμης και τα IgM Β κύτταρα μνήμης φάνηκε ότι δεν μπορούν να προβλέψουν την αντισωματική απόκριση στο εμβόλιο σε κανένα χρονικό στιγμιότυπο. Η συγκέντρωση των IgG αντισωμάτων την 4 η εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό συσχετίζονταν θετικά με τα αρχικά ολικά Β λεμφοκύτταρα (p=0.02) και με τα αρχικά όμοια με τα ιστικά Β λεμφοκύτταρα μνήμης και φαινότυπο εξουθένωσης (p=0.07) τόσο στη μη προσαρμοσμένη όσο και στην προσαρμοσμένη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης (Διάγραμμα 15). Κανένας άλλος αρχικός υποπληθυσμός Β λεμφοκυττάρων δεν φάνηκε να σχετίζεται με την αντισωματική απόκριση και διατήρηση των αντισωματικών συγκεντρώσεων μετά τον εμβολιασμό για το διάστημα των 48 εβδομάδων παρατήρησης της μελέτης.

102 α p = 0.07

103 β p = 0.13 p = 0.78 γ p = 0.79

104 δ p=0.28 ε p = 0.02 Εξουθενωμένα Β κύτταρα μνήμης

105 στ p = 0.97 ζ p = 0.86

106 Mέση τιμή φαγοκυτταρικής δραστηριότητας ουδετερόφιλων Διάγραμμα 15. Συσχέτιση των αρχικών ολικών Β λεμφοκυττάρων και των διαφόρων Β κυτταρικών υποπληθυσμών μνήμης με την αντισωματική απάντηση (4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό) στο 23-PPV. α. Ολικά Β λεμφοκύτταρα, β. Β λεμφοκυτταρα μνήμης, γ. Β λεμφοκύτταρα μνήμης με μεταστροφή ισοτυπου, δ. IgM Β λεμφοκύτταρα μνήμης, ε. Εξουθενωμένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, στ. Ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, ζ. Ηρεμούντα Β λεμφοκύτταρα μνήμης. Φαγοκυτταρική ικανότητα ουδετερόφιλων Τα ουδετερόφιλα των ασθενών που ήταν υπό HAART παρουσίαζαν συνολικά αποτελεσματικότερη φαγοκυτταρική ικανότητα πριν και μετά τον εμβολιασμό, ωστόσο αυτή δεν διέφερε σημαντικά (p=0.82, NS) από τους naïve ασθενείς. Διαχρονικά παρατηρήθηκε μείωση της φαγοκυτταρικής ικανότητας και στις δύο ομάδες των ασθενών (Διάγραμμα 16) μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι ,79 94,27 94,06 93, p= Χρόνος ( εβδομάδες) 48 Διάγραμμα 16. Φαγοκυτταρική ικανότητα ουδετερόφιλων κυττάρων στους naïve ασθενείς και τους ασθενείς υπό θεραπεία, πριν και 48 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με το 23-PPV.

107 Mέση τιμή φαγοκυτταρικής δραστηριότητας μονοκυττάρων Ανάλογα αποτελέσματα προέκυψαν και από την μελέτη της φαγοκυτταρικής ικανότητας των μονοκυττάρων των ασθενών και των δύο ομάδων(p=0.697, NS) [Διάγραμμα 17]. Η συνολική φαγοκυτταρική ικανότητα (ουδετερόφιλα-μονοκύτταρα) των ασθενών που ελάμβαναν ή όχι θεραπεία απεικονίζεται στο Διάγραμμα ,37 75,29 μη θεραπευόμενοι θεραπευόμενοι 71,86 67, p= Χρόνος ( εδβομάδες ) 48 Διάγραμμα 17. Φαγοκυτταρική ικανότητα μονοκυττάρων στους naïve ασθενείς και τους ασθενείς υπό θεραπεία, πριν και 48 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με το 23-PPV.

108 Ομάδες ασθενών Διάγραμμα 18. Συνολική φαγοκυτταρική ικανότητα των ασθενών που συμμετείχαν στη μελέτη. Υψηλά ποσοστά ασθενών, τόσο υπό θεραπεία όσο και χωρίς θεραπεία παρουσίασαν ελαττωμένη συνολική φαγοκυτταρική ικανότητα. Η φαγοκυτταρική δραστηριότητα των ουδετερόφιλων και των μονοκυττάρων δε συσχετίστηκε με κανέναν από τους Β λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς. Η αντισωματική απάντηση στο πολυσακχαριδικό εμβόλιο δε σχετίστηκε σημαντικά με τη φαγοκυττάρωση τους ασθενείς συνολικά (p=0.193). Αναφορικά με τους ασθενείς που απάντησαν στο εμβόλιο (Πίνακας 5), παρά την ικανοποιητική αντισωματική