ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΩΝ ΜΕ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ΤΥΠΟΥ Ι ΚΑΙ ΙΙ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΩΝ ΜΕ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ΤΥΠΟΥ Ι ΚΑΙ ΙΙ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ» ΚΑΜΗΛΑΡΗ ΕΛΕΝΗ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ, ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ 2014

2 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF NATURAL SCIENCES INVESTIGATION OF INTERACTIONS OF GLYCOSAMINOGLYCANS WITH COLLAGEN TYPE I AND II MEDICINAL CHEMISTRY: DRUG DISCOVERY AND DESIGN KAMILARI ELENI CHEMIST PATRAS, JANUARY 2014

3 Τριμελής Επιτροπή Χρίστος Γ. Κοντογιάννης Καθηγητής του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών (Επιβλέπων καθηγητής) Μαλβίνα Γ. Όρκουλα Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών Φωτεινή Ν. Λάμαρη Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών i

4 Evaluation Committee Christos G. Kontoyannis Professor and Director, Laboratory of Instrumental Pharmaceutical Analysis, Department of Pharmacy, University of Patras (Supervisor Professor) Malvina G. Orkoula Assistant Professor, Laboratory of Instrumental Pharmaceutical Analysis, Department of Pharmacy, University of Patras Fotini N. Lamari Assistant Professor, Laboratory of Pharmacognosy and Chemistry of Natural Products, Department of Pharmacy, University of Patras ii

5 Περίληψη Δύο από τα σημαντικότερα δομικά και λειτουργικά βιομόρια του εξωκυττάριου χώρου είναι το κολλαγόνο και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs), ανιοντικοί πολυσακχαρίτες που αποτελούν το βασικό δομικό συστατικό των πρωτεογλυκανών. Οι κύριοι τύποι γλυκοζαμινογλυκανών είναι η θειική χονδροϊτίνη, η θειική δερματάνη, η ηπαρίνη, η θειική ηπαράνη, η θειική κερατάνη και το υαλουρονικό οξύ. Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στους ιστούς των θηλαστικών. Το κολλαγόνο τύπου ΙΙ αποτελεί το κύριο συστατικό του εξωκυττάριου χώρου του αρθρικού χόνδρου και άλλων ιστών. Τα παραπάνω μακρομόρια είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση διαφόρων διεργασιών των κυττάρων τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως παθήσεις των αρθρώσεων και νεοπλασματικές ασθένειες. Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και των δύο τύπων κολλαγόνου, η οποία θα συνεισφέρει στη βαθύτερη κατανόηση της βιολογικής τους λειτουργίας. Μερικές από τις τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για το συγκεκριμένο σκοπό είναι η χρωματογραφία συγγένειας, η ηλεκτροφόρηση και η φασματοσκοπία φθορισμού. Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), η περίθλαση ακτίνων-χ και ο κυκλικός διχρωισμός (Circular Dichroism, CD) προσφέρουν δομικές πληροφορίες για τις αλλαγές στη διαμόρφωση και τα σημεία πρόσδεσης μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεϊνών. Θερμοδυναμικές πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνώνγλυκοζαμινογλυκανών αντλούνται από τη θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (Isothermal Titration Calorimetry, ITC), ενώ με την τεχνική της διέγερσης επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR) μελετώνται η σταθερά σύνδεσης και η σταθερά διάστασης της αλληλεπίδρασης σε πραγματικό χρόνο. Το κυριότερο μειονέκτημα των παραπάνω τεχνικών είναι το ότι δεν προσφέρουν πληροφορίες για χημικούς δεσμούς, ενώ ο χρόνος ανάλυσης είναι μεγάλος και απαιτούνται μεγάλες ποσότητες δειγμάτων. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε ήταν εκείνη της φασματοσκοπίας micro-raman, μια μη καταστρεπτική τεχνική, η οποία προσφέρει πληροφορίες για τη χημική δομή του εξεταζόμενου δείγματος, ενώ παράλληλα είναι γρήγορη και ακριβής. Παρασκευάστηκαν δύο είδη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών με κολλαγόνο. Στην πρώτη περίπτωση, κολλαγόνο τύπου Ι ή τύπου ΙΙ iii

6 εμβαπτίστηκε σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης, ηπαρίνης ή μίγμα τους που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 1:1. Στη δεύτερη περίπτωση, μίγματα των δύο ουσιών προέκυψαν με ανάμιξη ίσων ποσοτήτων των δύο ουσιών. Τα παραπάνω μίγματα μελετήθηκαν με φασματοσκοπία Raman και με την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) και συγκρίθηκαν με τα φάσματα των προτύπων ουσιών. Κάθε ουσία έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα Raman, η ερμηνεία του οποίου οδήγησε στην ταυτοποίηση χαρακτηριστικών ομάδων των μορίων, όπως οι δεσμοί C-OH, οι θειικές ομάδες (O-SO - 3, N-SO - 3 ), η Ν-ακετυλομάδα, οι δεσμοί C=O και οι δεσμοί C-Ν. Οι φασματικές περιοχές που παρουσιάζουν τα πιο έντονα χαρακτηριστικά στα φάσματα Raman των μιγμάτων GAG-κολλαγόνου είναι οι εξής: cm -1, cm -1 και cm -1. Όσον αφορά στην τελευταία φασματική περιοχή, παρατηρήθηκε σημαντική μετατόπιση της χαρακτηριστικής κορυφής της δόνησης έκτασης των θειομάδων προς χαμηλότερους κυματάριθμους (από τους 1070 cm -1 περίπου στους cm -1 ) και η εμφάνιση μιας κορυφής στους 1072 cm -1, σε σχέση με τα αντίστοιχα φάσματα των προτύπων ουσιών, στα φάσματα όλων των μιγμάτων που μελετήθηκαν. Η μετατόπιση της συγκεκριμένης κορυφής αποτελεί ένδειξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών και καταδεικνύει το σημαντικό ρόλο των θειομάδων των γλυκοζαμινογλυκανών στις αλληλεπιδράσεις τους με τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας Raman βρίσκονται σε συμφωνία με εκείνα που προκύπτουν από την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC), καθώς τα θερμογραφήματα DSC των μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι είναι διαφορετικά από εκείνο του μίγματος που προέκυψε από την ανάμιξη των δύο συστατικών, υποδεικνύοντας την ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών. Με την τεχνική της φασματοσκοπίας Raman διαπιστώθηκε ότι το κολλαγόνο τύπου Ι έδειξε μεγαλύτερη «χημική προτίμηση» προς την ηπαρίνη σε σχέση με τη θειική χονδροϊτίνη, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙ προτίμησε να αλληλεπιδράσει με τη θειική χονδροϊτίνη. iv

7 Λέξεις-κλειδιά: γλυκοζαμινογλυκάνες, κολλαγόνο, θειική χονδροϊτίνη, ηπαρίνη, αλληλεπιδράσεις, φασματοσκοπία Raman, Θερμιδομετρία Διαφορικής Σάρωσης (DSC). v

8 vi

9 Abstract Collagen and glycosaminoglycans (GAGs) co-exist as major constituents of the extracellular matrix (ECM) in a variety of tissues. Collagen type I is the most abundant protein in the human body, whereas another important type of collagen is type II, which forms the extracellular matrix of cartilage and other tissues. Glycosaminoglycans are negatively charged polysaccharides that occur as a structural component of proteoglycans and can be divided in four major groups: i) chondroitin sulfate and dermatan sulfate, ii) heparin and heparin sulfate, iii) keratan sulfate, and iv) hyaluronic acid. Both GAGs and collagen not only regulate a variety of cellular functions but they also seem to be involved in many pathological conditions, including cancer and joint diseases. Therefore, a more detailed investigation of the interactions between them will result in a deeper understanding of their biological function. Most common methods for identifying GAG-collagen interactions include affinity chromatography, affinity electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray diffraction and Circular Dichroism (CD) provide structural data characterizing conformational changes and contact points between the interacting species. Using Isothermal Titration Calorimetry (ITC), information on the thermodynamics of glycosaminoglycan-protein interactions can be obtained. Surface Plasmon Resonance (SPR) allows the measurement of association and dissociation constants of glycosaminoglycanprotein interactions in real time. The major disadvantage of the techniques described above is the inability to identify specific chemical bonds. Other disadvantages are the long analysis time and that large amounts of the interacting substances are required. In the present work, Raman spectroscopy, a non-destructive, vibrational technique which yields information on the chemical composition of the specimen, was employed for the exploration of the interactions between collagen type I and type II and two glycosaminoglycans, chondroitin sulfate and heparin. Two sets of mixtures composed of glycosaminoglycans and each type of collagen were prepared: i) collagen type I or type II was immersed in aqueous solutions of chondroitin sulfate, heparin and a 1:1 mixture of both GAGs, and ii) GAG-collagen mixtures were obtained by blending suitable amounts of the two substances. Differential Scanning Calorimetry (DSC) was also applied on the latter mixtures. vii

10 From the Raman spectra identification of vibrational frequencies of the functional groups of the above molecules, such as C-OH linkages, sulfate groups (O-SO - 3, N-SO - 3 ), N-acetyl group, carboxyl group and C-Ν linkages is possible. The prominent features arising from the Raman spectra of GAG-collagen interactions are found in the regions cm -1, cm -1 and cm -1. Processing of the spectra of all GAG-collagen mixtures has revealed that a shift of the most characteristic vibration of chondroitin sulfate s and heparin s spectrum from 1070 cm -1 to cm -1, while a vibration at approximately 1072 cm -1 emerges. The sulfate band shift is indicative of an interaction between collagen and glycosaminoglycans and depicts the important role of the sulfate group of glycosaminoglycans in the interactions with the protein. This observation was in accordance with the results from Differential Scanning Calorimetry (DSC), which demonstrated an interaction between collagen and chondroitin sulfate. A stronger preference of collagen type I to interact with heparin rather than chondroitin sulfate and of collagen type II to interact with chondroitin sulfate was also observed. Key words: glycosaminoglycans, collagen, chondroitin sulfate, heparin, interactions, Raman spectroscopy, Differential Scanning Calorimetry (DSC). viii

11 Περιεχόμενα Περίληψη... iii Abstract... vii Ευχαριστίες... xii 1 Τα συστατικά του εξωκυττάριου χώρου Ο εξωκυττάριος χώρος Ο ρόλος του εξωκυττάριου χώρου Κολλαγόνο Βιοσύνθεση του κολλαγόνου Ρόλος του κολλαγόνου Κολλαγόνο τύπου Ι Κολλαγόνο τύπου ΙΙ Πρωτεογλυκάνες Γλυκοζαμινογλυκάνες Θειική χονδροϊτίνη: Δομή και βιολογικός ρόλος Θειική δερματάνη: Δομή και βιολογικός ρόλος Ηπαρίνη-Θειική ηπαράνη: Δομή και βιολογικός ρόλος Υαλουρονικό οξύ: Δομή και βιολογικός ρόλος Θειική κερατάνη Αλληλεπιδράσεις γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου Σημασία των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου Μέθοδοι μελέτης των αλληλεπιδράσεων γλυκοζαμινογλυκανών-πρωτεϊνών Είδη αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ix

12 3 Χρησιμοποιούμενες Tεχνικές Xαρακτηρισμού Εισαγωγή στις Φασματοσκοπικές Τεχνικές Ανάλυσης Είδη μοριακών δονήσεων στις Φασματοσκοπικές Τεχνικές Ανάλυσης Φασματοσκοπία Raman Οργανολογία Εφαρμογές Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC) Θερμοσταθμική ανάλυση (TG) ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χρησιμοποιούμενα υλικά Χημικές ουσίες Ιστοί/Βιογενή υλικά Εμβαπτίσεις κολλαγόνου τύπου Ι ή τύπου ΙΙ σε διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών Μίγματα γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι Λυοφιλιοποιημένα μίγματα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Οπτική Παρατήρηση των δειγμάτων στο στερεοσκόπιο Συλλογή φασμάτων Raman Επεξεργασία των φασμάτων Raman Θερμοσταθμικές μέθοδοι Επεξεργασία των θερμογραφημάτων DSC και TG ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Φάσματα Raman προτύπων ουσιών Φάσματα Raman γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs) Φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ x

13 5.2 Μελέτη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου με φασματοσκοπία Raman Μελέτη των εμβαπτίσεων κολλαγόνου τύπου Ι σε διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών με φασματοσκοπία Raman Μελέτη των εμβαπτίσεων κολλαγόνου τύπου ΙΙ σε διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών με φασματοσκοπία Raman Μελέτη των εμβαπτίσεων κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ σε διάλυμα που περιέχει και τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες με φασματοσκοπία Raman Μελέτη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι με φασματοσκοπία Raman Μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Μίγμα ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Μίγμα υαλουρονικού οξέος-κολλαγόνου τύπου Ι Μελέτη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι (70 ο C) με φασματοσκοπία Raman Μελέτη λυοφιλιοποιημένων μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι με φασματοσκοπία Raman Σύνοψη αποτελεσμάτων Συσχετισμός μεταξύ των αποτελεσμάτων από τις δύο κατηγορίες πειραμάτων και των δύο ειδών μιγμάτων Φάσμα Raman θειικού αμμωνίου (NH 4 ) 2 SO Μελέτη των μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου με Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC) και Θερμοσταθμική Ανάλυση (TG) ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ CURRICULUM VITAE xi

14 Ευχαριστίες Η παρούσα ερευνητική εργασία για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης εκπονήθηκε στο εργαστήριο Ενόργανης Φαρμακευτικής Ανάλυσης του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του διατμηματικού προγράμματος «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ. Χρίστου Κοντογιάννη. Πρώτα απ όλους, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή της ερευνητικής μου εργασίας, τον κ. Χρίστο Κοντογιάννη, Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Η καθοδήγησή του στα μονοπάτια της έρευνας και οι εύστοχες υποδείξεις του, τόσο κατά τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων όσο και κατά το στάδιο συγγραφής της παρούσας εργασίας, ήταν πολύτιμες για εμένα. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμότερες ευχαριστίες μου στην κ. Μαλβίνα Όρκουλα, Επίκουρη καθηγήτρια του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για τη σημαντική βοήθεια που μου παρείχε καθ όλη τη διάρκεια και το σχεδιασμό των πειραμάτων, την επεξεργασία των αποτελεσμάτων και κατά τη συγγραφή του κειμένου. Όλο αυτό το διάστημα ήταν δίπλα μου στο εργαστήριο, προσφέροντάς μου με γενναιοδωρία από τις γνώσεις και την εμπειρία της. Η συμβολή της στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας ήταν καθοριστική. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την αμεσότητά της και το συμβουλευτικό της ρόλο, όχι μόνο στα θέματα που αφορούσαν άμεσα τη συγκεκριμένη εργασία. Ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να εκφράσω και στην κ. Φωτεινή Λάμαρη, επίκουρο καθηγήτρια του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών που αποτελεί το τρίτο μέλος της τριμελούς επιτροπής. Η κ. Λάμαρη ήταν πάντα δίπλα μου και πάντα πρόθυμη να με βοηθήσει σε οποιονδήποτε προβληματισμό μου. Πέραν όμως της βοήθειας της στο πλαίσιο της ερευνητικής εργασίας, ήταν σημαντική για εμένα η εμπιστοσύνη που μου έδειξε και η αμέριστη στήριξή της. xii

15 Χαίρομαι που γνώρισα επιστήμονες-ανθρώπους που με εμπιστεύτηκαν, με ενθάρρυναν και με βοήθησαν. Θα ήταν παράλειψη να μην αναφερθεί ότι μερικές από τις γλυκοζαμινογλυκάνες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, ήταν ευγενική χορηγία των κ. Νίκου Καραμάνου και κ. Αχιλλέα Θεοχάρη του Εργαστηρίου Βιοχημείας του τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, τους οποίους ευχαριστώ θερμά. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον καθηγητή και υπεύθυνο του Εργαστηρίου Υλικών και Μεταλλουργίας, Κεραμικών και Σύνθετων Υλικών του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Γεώργιο Αγγελόπουλο. Στο συγκεκριμένο εργαστήριο πραγματοποιήθηκαν οι μετρήσεις Διαφορικής Θεμιδομετρίας Σάρωσης (DSC) και Θερμοσταθμικής Ανάλυσης (TGA). Δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω ιδιαιτέρως την Δρ. Αγγελική Χριστογέρου και την υποψήφια διδάκτωρ Δήμητρα Κουμπούρη για τη βοήθειά τους με τις ανωτέρω μετρήσεις. Πρέπει να ευχαριστήσω το Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας του Πανεπιστημίου Πατρών Κ. Καραθεοδωρή (κωδικός έργου: C.914) για την οικονομική ενίσχυση που μου παρείχε. Δε θα μπορούσα να μην αναφερθώ επίσης στο Ινστιτούτο Ερευνας Χημικής Μηχανικής (ΙΕΧΜΗ) για την πρόσβαση στα όργανα και την οικονομική του συμβολή. Στο σημείο αυτό, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ. Ιωάννη Καραμπά για τη βοήθειά του με την εξοικείωση στο εργαστήριο και την προθυμία του να βοηθήσει σε θέματα εργαστηριακά και θεωρητικά, καθώς και τις συνεργάτες και φίλες μου, Σοφία Κουβαριτάκη, Μάρθα Βαρδάκη, Γιούλη Παπασπυριδάκου και Γεωργία Μανίκα. Τους ευχαριστώ όχι μόνο για την άψογη συνεργασία και την καθημερινή και ποικιλόμορφη βοήθεια τους στο εργαστήριο, αλλά και για όσα έμαθα από τον καθένα τους ξεχωριστά. Τέλος, δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω τους υπόλοιπους συναδέλφους-φίλους με τους οποίους βρεθήκαμε στον ίδιο εργαστηριακό χώρο και τους φίλους μου για την ψυχολογική τους συμπαράσταση. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στους γονείς μου Θεμιστοκλή και Σταυρούλα, για την κατανόηση και υπομονή που έχουν δείξει όλα αυτά τα χρόνια των σπουδών μου και για την υλική και ηθική υποστήριξή τους, η οποία είναι ανεκτίμητη. xiii

16 Σας ευχαριστώ και πάλι όλους θερμά Πάτρα, Ιανουάριος 2014 Ελένη Καμηλάρη xiv

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο 1 Τα συστατικά του εξωκυττάριου χώρου 1.1 Ο εξωκυττάριος χώρος Η πλειονότητα των κυττάρων των διαφόρων ιστών και των οργάνων στους πολυκύτταρους οργανισμούς περιβάλλονται από ένα πολύπλοκο οργανωμένο δίκτυο μακρομορίων, το οποίο είναι γνωστό ως εξωκυττάριος χώρος ή δίκτυο ή μήτρα (extracellular matrix, ECM). Το εξωκυττάριο δίκτυο δεν είναι μόνο σημαντικό για την αρχιτεκτονική των ιστών, αλλά είναι υπεύθυνο και για τη ρύθμιση αρκετών κυτταρικών δραστηριοτήτων και φυσιολογικών λειτουργιών. Τα κύρια τμήματα του εξωκυττάριου χώρου είναι η βασική μεμβράνη, ένα πυκνό στρώμα ύλης που διαχωρίζει την επιφάνεια του επιθηλιακού κυττάρου από το υποκείμενο μεσέγχυμα, και το ενδιάμεσο στρώμα, μια δομή που καθορίζει τα κύρια συστατικά του ιστού. Η βασική μεμβράνη είναι μια εξειδικευμένη μορφή του εξωκυττάριου χώρου και αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη, νιδογόνο (nidogen), περλεκάνη (perlecan) και πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης. Ο ρόλος της βασικής μεμβράνης δεν είναι μόνο η στήριξη των κυττάρων, αλλά λειτουργεί και ως φραγμός κατά των ξένων αντικειμένων ή καρκινικών κυττάρων, εμποδίζοντας την είσοδό τους στον υποκείμενο συνδετικό ιστό [1]. Ινώδη συστατικά και πρωτεογλυκάνες, γλυκοζαμινογλυκάνες και ορισμένες γλυκοπρωτεΐνες συνιστούν το ενδιάμεσο στρώμα. Τα ινώδη συστατικά είναι το κολλαγόνο τύπου Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και η ελαστίνη. Περιέχει επίσης αιμοφόρα αγγεία και νεύρα για τον έλεγχο των κυττάρων των ιστών [2]. Η σύσταση του εξωκυττάριου χώρου κάθε ιστού είναι μοναδική, γεγονός που αντικατοπτρίζεται από τις διαφορετικές φυσικές ιδιότητες και λειτουργίες των διαφόρων συνδετικών ιστών, αλλά δύο είναι οι κύριες κατηγορίες βιομορίων που συνθέτουν τον εξωκυττάριο χώρο: 1

18 Ινώδεις πρωτεΐνες Πρωτεογλυκάνες Εικόνα 1.1. Τα κυριότερα συστατικά του εξωκυττάριου χώρου. Αρκετοί τύποι πρωτεογλυκανών με διαφορετικό μέγεθος και διαφορετικό πρωτεϊνικό σκελετό απαντώνται στο εξωκυττάριο δίκτυο. Πληρώνουν τον ενδιάμεσο χώρο της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μέσα στον ιστό με τη μορφή ένυδρου πηκτώματος και λειτουργούν ως δομικά και λιπαντικά συστατικά στον συνδετικό ιστό [3]. 2

19 Οι πρωτεΐνες του εξωκυττάριου χώρου περιλαμβάνουν το κολλαγόνο και την ελαστίνη που έχουν δομικό ρόλο, καθώς και τις μη-κολλαγονούχες γλυκοπρωτεΐνες ινονεκτίνη και λαμινίνη, οι οποίες εμπλέκονται σε διεργασίες προσκόλλησης. Το πιο άφθονο δομικό συστατικό του εξωκυττάριου δικτύου είναι το κολλαγόνο, χαρακτηριστική ιδιότητα του οποίου είναι να σχηματίζει καλά οργανωμένα πολυμερή. Αποτελεί μέχρι και το 30% της ολικής πρωτεϊνικής μάζας σε έναν πολυκύτταρο οργανισμό. Κολλαγόνο εκκρίνεται από τα κύτταρα ενός συνδετικού ιστού, όπως ινοβλάστες, οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα και άλλα κύτταρα. Σε αντίθεση με τις πρωτεογλυκάνες, το κολλαγόνο προσδίδει την αντίσταση στο μηχανικό τέντωμα ενός ιστού, ενώ οι πρωτεογλυκάνες αποτρέπουν τη συμπίεσή του. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των ιστών [4]. Ένα μόριο ελαστίνης αποτελείται από ελαστικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες και έχει την ικανότητα του αναστρέψιμου ξετυλίγματος υπό την επήρεια μηχανικών δυνάμεων τεντώματος. Αυτή η ιδιότητα τεντώματος των μορίων της ελαστίνης προσδίδει στους ιστούς την ικανότητα επαναφοράς στο αρχικό σχήμα μετά από μηχανικές επιδράσεις. Τα μόρια ελαστίνης εκκρίνονται μέσα στον εξωκυττάριο χώρο και συνδέονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν ίνες. Η ινονεκτίνη απαντάται κατά κύριο λόγο στη βασική μεμβράνη και είναι μία από τις γλυκοπρωτεΐνες που είναι υπεύθυνη για την προσκόλληση των κυττάρων στον εξωκυττάριο χώρο. Κάθε μόριο τους φέρει τμήματα στα οποία προσκολλώνται ειδικώς, εκτός από τα κύτταρα, και άλλα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως κολλαγόνο, ηπαρίνη. Ανάμεσα στα είδη κυττάρων που εκκρίνουν ινονεκτίνες περιλαμβάνονται οι ινοβλάστες και τα επιθηλιακά κύτταρα. Οι λαμινίνες διαθέτουν επίσης διάφορες περιοχές πρόσδεσης για τα κύτταρα, το κολλαγόνο τύπου IV, το νιδογόνο και μερικές γλυκοζαμινογλυκάνες. Ως κύριο συστατικό των βασικών μεμβρανών, ρυθμίζουν την πρόσδεση των παρεγχυματικών κυττάρων στο κολλαγόνο τύπου IV και κατά συνέπεια την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων και των μεμβρανών [2]. 3

20 Η αλληλεπίδραση ανάμεσα στα κύτταρα και την εξωκυττάρια μήτρα πραγματοποιείται μέσω κυτταρικών υποδοχέων, από τους οποίους πιο σημαντικές είναι οι ιντεγκρίνες. Πρόκειται για διμερή μόρια που αποτελούνται από δύο πρωτεϊνικές υπομονάδες (α και β). 1.2 Ο ρόλος του εξωκυττάριου χώρου Το συγκεκριμένο δίκτυο μακρομορίων συμμετέχει στην οικοδόμηση υποστρώματος για την ανάπτυξη των κυττάρων, συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας πολλών ιστών, ενώ παράλληλα λειτουργεί ως βιολογικός ηθμός και ρυθμίζει την εκλεκτική διαπερατότητα διαμέσου αυτού μακρομορίων. Επιπλέον, ο εξωκυττάριος χώρος, μέσω της αλληλεπίδρασης των συστατικών του με τους κατάλληλους υποδοχείς που υπάρχουν στην επιφάνεια των κυττάρων, προάγει και ρυθμίζει διάφορες λειτουργίες ζωτικής σημασίας για τα κύτταρα, όπως η μετανάστευση, η προσκόλληση, η διαφοροποίηση και ο πολλαπλασιασμός τους. Στους κατάλληλους υποδοχείς του εξωκυττάριου χώρου προσδένονται αυξητικοί παράγοντες (GFs) με αποτέλεσμα την έναρξη της μεταγωγής σήματος και τη ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής, κατευθύνοντας έτσι την απαραίτητη μορφολογική οργάνωση και τη φυσιολογική λειτουργία του ιστού [4]. Η δομή του εξωκυττάριου χώρου δεν είναι στατική, αλλά αναδιαμορφώνεται συνεχώς, ενζυματικά ή μη ενζυματικά, και τα μοριακά συστατικά του υπόκεινται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, όχι μόνο σε φυσιολογικές συνθήκες, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις. 1.3 Κολλαγόνο Οι πιο άφθονες ινώδεις πρωτεΐνες που είναι διαδεδομένες στον εξωκυττάριο χώρο όλων των ιστών σπονδυλωτών και άλλων οργανισμών είναι μέλη της οικογένειας του κολλαγόνου. Οι πρωτεΐνες αυτές παρέχουν την απαραίτητη δομική ακεραιότητα στους ιστούς, ενώ παράλληλα ρυθμίζουν και πληθώρα φυσιολογικών λειτουργιών. Έχουν ταυτοποιηθεί έως σήμερα στα σπονδυλωτά περίπου 28 γενετικά διαφορετικοί τύποι κολλαγόνου με ποικίλα δομικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά [5]. Με βάση τη λειτουργία και την ομολογία της αλληλουχίας τους, μπορούν να διακριθούν διάφορες κατηγορίες κολλαγόνου: 4

21 ινιδικά (τύποι Ι, ΙΙ, ΙΙΙ, V, XI, XXIV και XXVII) εκείνα που σχηματίζουν δίκτυα (τύποι IV, VIII και X) εκείνα που σχηματίζουν μικροϊνίδια προσκόλλησης (τύπος VI) εκείνα που συνδέονται σε ινίδια με διακεκομμένη τριπλή έλικα, γνωστά ως FACIT (τύποι IX, XII, XIV, XVI και XIX) εκείνα που χαρακτηρίζονται από πολλαπλά ελικοειδή τμήματα και διακοπές και ονομάζονται multiplexins (XV και XVIII) [6]. 5

22 Πίνακας 1.1. Διάφοροι τύποι κολλαγόνου, η δομή τους και οι ιστοί στους οποίους εντοπίζονται [7, 8]. Τύπος Κατηγορία α αλυσίδες Κατανομή στους ιστούς Ι ινιδικό α 1 (Ι) 2, α 2 (Ι) δέρμα, σύνδεσμοι, οστά, κερατοειδής χιτώνας τένοντες ΙΙ ινιδικό α 1 (ΙΙ) χόνδρος, υαλώδες υγρό ΙΙΙ ινιδικό α 1 (ΙΙΙ) δέρμα, αιμοφόρα αγγεία, έντερο IV σχηματίζει δίκτυο α 1 (IV), α 2 (IV), α 3 (IV) α 4 (IV), α 5 (IV), α 5 (IV) βασική μεμβράνη V ινιδικό α 1 (V), α 2 (V), α 3 (V) οστό, κερατοειδής χιτώνας VI μικροϊνιδικό α 1 (VI), α 2 (VI), α 3 (VI) οστό, κερατοειδής χιτώνας, χόνδρος, δέρμα VII anchoring α 1 (VII) δέρμα, έντερο VIII σχηματίζει δίκτυο α 1 (VIII), α 2 (VIII) δέρμα, εγκέφαλος, νεφρά, καρδιά IX FACIT α 1 (IX), α 2 (IX), α 3 (IX) χόνδρος, υαλώδες υγρό, κερατοειδής χιτώνας X σχηματίζει δίκτυο α 1 (X) χόνδρος XI ινιδικό α 1 (XI), α 2 (XI), α 3 (XI) χόνδρος, μεσοσπονδύλιοι δίσκοι XII FACIT α 1 (XII) δέρμα, τένοντες XIII MACIT α 1 (XIII) καρδιά, οφθαλμός, δέρμα, ενδοθήλια XIV FACIT α 1 (XIV) οστό, χόνδρος, δέρμα XV multiplexins α 1 (XV) τριχοειδή αγγεία, καρδιά, νεφρά XVI FACIT α 1 (XVI) νεφρά, δέρμα XVII MACIT α 1 (XVII) επιθηλιακά κύτταρα XVIII multiplexins α 1 (XVIII) βασική μεμβράνη, συκώτι XIX FACIT α 1 (XIX) βασική μεμβράνη 6

23 Οι πρώτοι τύπου κολλαγόνου που απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά ήταν οι ινιδικοί τύποι κολλαγόνου, λόγω της αφθονίας τους σε αρκετούς συνδετικούς ιστούς στα σπονδυλωτά. Ο ρόλος των FACIT κολλαγόνων είναι η τροποποίηση της δομής και της λειτουργίας των ινιδίων κολλαγόνου, καθώς επίσης και η σύνδεση των ινιδικών τύπων κολλαγόνου σε άλλα συστατικά της εξωκυττάριας μήτρας. Για παράδειγμα, το κολλαγόνο τύπου IX, ένα κολλαγόνο τύπου FACIT, υπάρχει στην επιφάνεια των ινιδίων του κολλαγόνου στο χόνδρο, όπου προσδένεται ομοιοπολικά στα μόρια του κολλαγόνου τύπου ΙΙ. Το κολλαγόνο τύπου XII και XIV, που ανήκουν στην ομάδα των FACIT κολλαγόνων, εμφανίζονται στον κερατοειδή χιτώνα. Τα multiplexins κολλαγόνα εντοπίζονται στη βασική μεμβράνη και χαρακτηρίζονται από ένα μεγάλο και διακεκομμένο κολλαγονούχο τμήμα που πλαισιώνεται από σχετικά μεγάλα αμινο και καρβοξυ τμήματα. Το κύριο χαρακτηριστικό όλων των μελών αυτής της οικογένειας είναι μια δεξιόστροφη τριπλή έλικα που συντίθεται από τρεις πολυπεπτιδικές α αλυσίδες και παρουσιάζει την ελικοειδή διαμόρφωση εκτεταμένης πολυπρολίνης-ιι [9]. Η τριπλή έλικα μπορεί να σχηματιστεί: είτε από τρεις παρόμοιες α-αλυσίδες (ομοτριμερή), όπως παρατηρείται στο κολλαγόνο τύπου ΙΙ, ΙΙΙ, VII, VIII και X είτε από δύο ή περισσότερες διαφορετικές α-αλυσίδες (ετεροτριμερή), όπως παρατηρείται στους εξής τύπους κολλαγόνου: I, IV, V, VI, IX και XI. Κάθε πολυπεπτιδική α αλυσίδα αποτελείται από την επαναλαμβανόμενη τριπλέτα πεπτιδίων (Gly-X-Y) n, όπου στην πρώτη θέση εμφανίζεται πάντα το κατάλοιπο γλυκίνης και απαντάται μετά από τρία αμινοξέα, ενώ οι θέσεις X και Y καταλαμβάνονται συνήθως από τα αμινοξέα προλίνη και υδροξυπρολίνη αντίστοιχα. Οι δακτύλιοι της προλίνης και της υδροξυπρολίνης σταθεροποιούν την ελικοειδή διαμόρφωση πολυπρολίνης ΙΙ των πολυπετιδικών αλυσίδων [10]. 7

24 Εικόνα 1.2. Η α- έλικα του κολλαγόνου. Κάθε μία από τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες σχηματίζει μια εκτεταμένη αριστερόστροφη έλικα. Οι τρεις αλυσίδες αναδιπλώνονται γύρω από έναν κεντρικό άξονα με δεξιόστροφο τρόπο ώστε να προκύψει τελικά η χαρακτηριστική ελικοειδής διαμόρφωση, η οποία στους ινιδικούς τύπους κολλαγόνου έχει μήκος 300 nm και διαμέτρο 1.5 nm. Σε κάθε περιστροφή της έλικας απαντώνται περίπου 3.6 αμινοξέα. Στο κέντρο της τριπλής έλικας βρίσκονται όλα τα κατάλοιπα γλυκίνης, ενώ οι πιο ογκώδεις πλευρικές αλυσίδες των υπόλοιπων αμινοξέων καταλαμβάνουν τις εξωτερικές θέσεις [11]. 8

25 Εικόνα 1.3. Η τριπλή έλικα του κολλαγόνου. Οι δεσμοί υδρογόνου αποτελούν κρίσιμο παράγοντα σταθεροποίησης της τριπλής έλικας. Η αμιδική ομάδα Ν-Η του κατάλοιπου της γλυκίνης σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με το καρβονύλιο C=O του αμινοξέος που βρίσκεται στη θέση Χ του τριπεπτιδίου στη γειτονική αλυσίδα της τριπλής έλικας, (Gly)NH C=O(X). Τα καρβονύλια, όμως, της γλυκίνης και των αμινοξέων στις θέσεις Χ και Υ της τριπλέτας, καθώς και αμιδικές ομάδες που υπάρχουν όταν τα αμινοξέα στις θέσεις αυτές δεν είναι προλίνη ή υδροξυπρολίνη, δεν μπορούν να σχηματίσουν εύκολα δεσμούς λόγω στερεοχημικών παρεμποδίσεων. Το ίδιο ισχύει και για την υδροξυπρολίνη, της οποίας το υδροξύλιο βρίσκεται σε απομακρυσμένη θέση σε σχέση με τον σκελετό της τριπλής έλικας. Το νερό που είναι ισχυρά προσδεδεμένο στην έλικα του κολλαγόνου σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με τις διαθέσιμες ομάδες των κατάλοιπων των 9

26 αμινοξέων του σκελετού και στη συνέχεια τα μόρια του νερού συνδέονται μεταξύ τους [12]. Με αυτόν τον τρόπο, δύο καρβονύλια των αμινοξέων που βρίσκονται στην ίδια αλυσίδα ή σε διαφορετικές αλυσίδες μπορούν να ενωθούν. Είναι δυνατό, επίσης, να σχηματιστεί δεσμός μεταξύ μιας αμιδικής ομάδας και ενός καρβονυλίου μεταξύ αμινοξέων που βρίσκονται σε διαφορετικές αλυσίδες. Ο ρόλος της υδροξυπρολίνης στη σταθεροποίηση της τριπλής έλικας συσχετίζεται επίσης με τις ενδομοριακές γέφυρες νερού. Τα καρβοξύλια του κατάλοιπου της υδροξυπρολίνης παρουσιάζουν δύο περιοχές όπου μπορεί να προσδεθεί το νερό και συνεπώς τα μόρια νερού μπορούν να συνδέσουν το καρβονύλιο ή το υδροξύλιο της υδροξυπρολίνης με το καρβονύλιο της γλυκίνης που βρίσκεται στην ίδια ή σε γειτονική αλυσίδα, καθώς επίσης και το υδροξύλιο της υδροξυπρολίνης με το καρβονύλιο του αντίστοιχου κατάλοιπου αμινοξέος που βρίσκεται σε γειτονική αλυσίδα [7, 10]. Εικόνα 1.4. Οι δεσμοί υδρογόνου που σταθεροποιούν την τριπλή έλικα. Δεσμοί υδρογόνου μπορούν να σχηματιστούν είτε άμεσα μεταξύ των γειτονικών αλυσίδων, (α) είτε μέσω των μορίων νερού μεταξύ δύο ομάδων εντός της ίδιας αλυσίδας, αλλά και μεταξύ δύο ομάδων σε διαφορετικές αλυσίδες, (β) και (γ) [10]. 10

27 Ένας ακόμα παράγοντας που συνεισφέρει στη σταθερότητα της τριπλής έλικας είναι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων, οι οποίες ευνοούνται στερεοχημικά, διότι οι ομάδες αυτές βρίσκονται στο εξωτερικό τμήμα της τριπλής έλικας. Η δομή της τριπλής έλικας σταθεροποιείται περαιτέρω με τη δημιουργία ενδομοριακών και διαμοριακών ομοιοπολικών δεσμών Βιοσύνθεση του κολλαγόνου Η βιοσύνθεση του κολλαγόνου πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο από κύτταρα, όπως οι ινοβλάστες, οι οστεοβλάστες, τα χονδροκύτταρα και οι οδοντοβλάστες [1]. Οι προ-α αλυσίδες του κολλαγόνου συντίθενται από ένα mrna στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στη συνέχεια τροποποιούνται με μετα-μεταφραστικές διεργασίες. Τα ένζυμα προλυλ 3-υδροξυλάση, προπυλ 4-υδροξυλάση και λυσυλ υδροξυλάση καταλύουν την υδροξυλίωση των κατάλοιπων της προλίνης και της λυσίνης που υπάρχουν στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Το ποσοστό της υδροξυλίωσης της προλίνης και της γλυκίνης εξαρτάται από τον τύπο του κολλαγόνου και τον ιστό στον οποίο λαμβάνει χώρα η βιοσύνθεση. Η 4-υδροξυπρολίνη είναι απαραίτητη για την ακεραιότητα της ίνας κολλαγόνου εξαιτίας των ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου που σχηματίζει, ενώ τα κατάλοιπα υδροξυγλυκίνης συνεισφέρουν στη σταθερότητα των σταυροδεσμών, δεσμών που θα δημιουργηθούν αργότερα, και παράλληλα προσφέρουν τις περιοχές όπου μπορούν να προσδεθούν κατάλοιπα υδατανθράκων [13]. Ο αριθμός των υδατανθράκων που συνδέονται ομοιοπολικά με τη βοήθεια ειδικών ενζύμων στο κολλαγόνο εξαρτάται επίσης από τον εκάστοτε ιστό. Μόλις ολοκληρωθούν οι τροποποιήσεις των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, ακολουθεί ο σχηματισμός της τριπλής έλικας του προκολλαγόνου, του πρόδρομου μορίου του κολλαγόνου. Η ελικοειδής περιοχή του μορίου πλαισιώνεται από μικρά μη ελικοειδή τμήματα που περιέχουν 20 κατάλοιπα αμινοξέων και ονομάζονται τελοπεπτίδια. Περιέχει επίσης δύο μεγάλα τμήματα στο Ν-αμινικό και C-καρβοξυλικό τερματικό άκρο, γνωστά ως Ν-προπεπτίδιο και C-προπεπτίδιο αντίστοιχα. 11

28 Εικόνα 1.5. Το μόριο του προκολλαγόνου. Τα τριμερή του προκολλαγόνου πακετάρονται σε κυστίδια στο σύμπλεγμα Golgi και στη συνέχεια εκκρίνονται στον εξωκυττάριο χώρο, όπου υπόκεινται σε περαιτέρω επεξεργασία. Τα δύο μη ελικοειδή άκρα του προκολλαγόνου αποκόπτονται από δύο ειδικές μεταλλοπρωτεάσες και ακολουθεί ο σχηματισμός των ινιδίων κολλαγόνου. Στην αρχή, τα μόρια του τροποκολλαγόνου οργανώνονται και σχηματίζονται τα ινίδια, λεπτές δομές διαμέτρου nm με εκατοντάδες μm μήκος. Στη συνέχεια, τα ινίδια αυτά συνενώνονται σε δεμάτια και προκύπτουν έτσι οι ίνες κολλαγόνου με διάμετρο από 0,5 έως 3 μm. Στη διαδικασία συγκρότησης των μονομερών του κολλαγόνου σε οργανωμένες διατάξεις εμπλέκονται υδροφοβικές και ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις [14]. Ο προσανατολισμός και η διάμετρος των σχηματιζόμενων ινιδίων ποικίλλει στους διάφορους τύπους κολλαγόνου και επηρεάζει τις μηχανικές ιδιότητες των ινών κολλαγόνου και κατ επέκταση τις διαφορετικές ιδιότητες των ιστών. 12

29 Εικόνα 1.6. Η βιοσύνθεση του κολλαγόνου τύπου Ι. Η διαδικασία της αυτο-οργάνωσης που προκαλεί τα μόρια του κολλαγόνου να οργανωθούν σε ίνες απεικονίζεται στην παρακάτω εικόνα. 13

30 Εικόνα 1.7. Ο σχηματισμός της ίνας κολλαγόνου. Τέλος, σχεδόν αμέσως μετά την έναρξη της ινιδιογένεσης, σχηματίζονται οι ενδομοριακοί και διαμοριακοί σταυροδεσμοί (cross-links) μεταξύ των μη ελικοειδών και των ελικοειδών περιοχών ανάμεσα σε γειτονικές αλυσίδες του κολλαγόνου, οι οποίοι σταθεροποιούν τη μηχανική αντοχή των ινών κολλαγόνου [15]. Αρχικά, ειδικά κατάλοιπα λυσίνης και υδροξυλυσίνης υφίστανται οξειδωτική απαμίνωση που καταλύεται από τα ένζυμα λυσυλοξειδάση και υδροξυλυσυλ-οξειδάση και προκύπτουν οι αντίστοιχες αλδεΰδες. Μια αυθόρμητη αντίδραση τύπου βάσης Schiff μεταξύ της αλδεΰδης που προέρχεται από τη λυσίνη ή την υδροξυλυσίνη και μιας μη τροποποιημένης ε-αμινομάδας άλλων κατάλοιπων λυσίνης ή υδροξυλυσίνης οδηγεί στο σχηματισμό των ενδομοριακών σταυροδεσμών [16]. Οι διαμοριακοί σταυροδεσμοί είναι το προϊόν μιας αλδολικής συμπύκνωσης μεταξύ δύο 14

31 αλδεϋδικών παραγώγων λυσίνης ή υδροξυλυσίνης που βρίσκονται στη μη-ελικοειδή τερματική περιοχή δύο αλυσίδων εντός του ίδιου μορίου [17, 18]. Εικόνα 1.8. Σχηματισμός των χιαστών δεσμών ανάμεσα στα μονομερή κολλαγόνου Ρόλος του κολλαγόνου Ο ρόλος του κολλαγόνου δεν περιορίζεται μόνο στη συντήρηση της δομικής ακεραιότητας των ιστών και των οργάνων. Ως συστατικό των βασικών μεμβρανών λειτουργεί ως μοριακός ηθμός ουσιών. Η αλληλεπίδραση του κολλαγόνου με παράγοντες, όπως οι ιντεγκρίνες, γλυκοπρωτεΐνες ή εξειδικευμένοι υποδοχείς πρωτεογλυκανών, καθορίζει τη διαφοροποίηση, την ανάπτυξη, την προσκόλληση, καθώς και την επιβίωση των κυττάρων. Προσδένει αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες, με αποτέλεσμα να διαδραματίζει ρόλο στην ανάπτυξη των οργάνων, την επούλωση πληγών και την επισκευή ιστών. Αξιοσημείωτη είναι η εφαρμογή του κολλαγόνου ως βιοϋλικό στην Μηχανική των ιστών, που αποσκοπεί στην αναγέννηση, επανόρθωση και αντικατάσταση των ανθρώπινων ιστών για τη θεραπεία ασθενειών. Το κολλαγόνο χρησιμοποιείται στην κατασκευή πορώδων ικριωμάτων, μια τρισδιάστατη κατασκευή που παρέχει την απαραίτητη στήριξη για τα κύτταρα, ώστε αυτά να προσκολληθούν, να πολλαπλασιαστούν και να διατηρήσουν τη λειτουργία τους. 15

32 Τα φυσικά χαρακτηριστικά του κολλαγόνου, σε συνδυασμό με τη βιοσυμβατότητά του και τη χαμηλή ανοσογονικότητα, καθιστούν το κολλαγόνο ένα εξαιρετικό βιοϋλικό. Ο πολυπεπτιδικός σκελετός του περιέχει πολλές λειτουργικές ομάδες, διευκολύνοντας την πρόσβαση γονιδίων, αυξητικών παραγόντων και άλλων βιολογικών μορίων. Μπορεί να διαμορφωθεί και να αποκτήσει διάφορες μορφές, όπως φιλμ, σπογγώδες υλικό, gel, σκόνη, πάνω στις οποίες φέρονται διάφορα φάρμακα. Ένα παράδειγμα εφαρμογής του κολλαγόνου ως φορέα φαρμάκου είναι στον τομέα της οφθαλμολογίας. Σπογγώδεις μορφές κολλαγόνου χρησιμοποιούνται ως υλικά επούλωσης πληγών και εγκαυμάτων, καθώς συμβάλλουν στη διατήρηση της υγρασίας του τραυματισμένου ιστού, παρέχουν προστασία από τραυματισμούς και βακτηριακές λοιμώξεις, ενώ παράλληλα επιταχύνουν την επούλωση της πληγής. Δεδομένου ότι σημαντικά ποσοστά κολλαγόνου περιέχονται στα οστά και στα δόντια, γίνονται προσπάθειες αξιοποίησης του στα τεχνητά εμφυτεύματα αυτών των ιστών [19, 20]. Ο τύπος του κολλαγόνου που χρησιμοποιείται περισσότερο στη μηχανική των ιστών είναι εκείνος που βρίσκεται σε μεγαλύτερη αφθονία στον ανθρώπινο οργανισμό και έχει μελετηθεί περισσότερο. Πρόκειται για το κολλαγόνο τύπου Ι, που μπορεί να απομονωθεί από ζώα (π.χ. βοοειδές ή χοίρο) ή να συντεθεί με τεχνικές γενετικής μηχανικής [21] Κολλαγόνο τύπου Ι Είναι ο πιο άφθονος τύπος κολλαγόνου που απαντάται στα θηλαστικά και τον ανθρώπινο οργανισμό. Αποτελεί το % της οργανικής μάζας του οστού και του τένοντα και είναι ο κύριος τύπος κολλαγόνου ιστών, όπως το δέρμα, ο κερατοειδής χιτώνας, οι αρθρώσεις, η οδοντίνη και οι αρτηρίες. Οι περισσότεροι συνδετικοί ιστοί περιέχουν επίσης τον συγκεκριμένο τύπο κολλαγόνου, εκτός από τον υαλώδη χόνδρο, τον εγκέφαλο και το υαλώδες υγρό του οφθαλμού. Η τριπλή έλικα του προκολλαγόνου τύπου Ι στον ανθρώπινο οργανισμό έχει μήκος 300 nm και διάμετρο 1.5 nm και αποτελείται από δύο proα1 αλυσίδες που περιέχουν 1464 κατάλοιπα αμινοξέων και μία κάπως μικρότερη α2 αλυσίδα 1366 αμινοξέων [5]. Κολλαγόνο τύπου Ι συνθέτουν κυρίως σε μεγάλο ποσοστό ινοβλάστες, οστεοβλάστες και οδοντοβλάστες και σε μικρότερο ποσοστό ορισμένα άλλα είδη κυττάρων που υπάρχουν στους ιστούς. Η διαδικασία 16

33 της σύνθεσης του κολλαγόνου τύπου Ι περιγράφηκε αναλυτικά στην προηγούμενη ενότητα (βλ. εικόνα 1.6). Ο σχηματισμός των ινιδίων του κολλαγόνου τύπου Ι είναι μια αυθόρμητη διεργασία in vitro, ενώ η διαδικασία αυτή in vivo εξαρτάται από την παρουσία ινονεκτίνης, ιντεγκρινών που προσδένουν το κολλαγόνο και το κολλαγόνο τύπου V [14]. Τα επιμέρους μονομερή του κολλαγόνου τύπου Ι οργανώνονται σε μια χαρακτηριστική κλιμακωτή τρισδιάστατη διάταξη που παρουσιάζει μια περιοδικότητα (D-περιοδική διάταξη) περίπου 67 nm, σχηματίζοντας αρχικά τα μικροϊνίδια και στη συνέχεια τα ινίδια. Τα ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι έχουν μερικά χιλιοστά μήκος και η διάμετρος τους ποικίλλει από μερικά nm έως 500 nm περίπου (εξαρτάται από τον ιστό και το στάδιο ανάπτυξής του) [22]. Υπεύθυνοι για τη σταθεροποίηση των ινιδίων είναι οι ομοιοπολικοί ενδομοριακοί σταυροδεσμοί (cross-links) που προσδένουν τα μόρια του κολλαγόνου μεταξύ τους. Στη συνέχεια, τα ινίδια αυτά ενώνονται σε δέσμες, οι οποίες αποτελούν τις ίνες κολλαγόνου. Ο τρόπος με τον οποίο διατάσσονται τα ινίδια κολλαγόνου, καθώς επίσης και η διάμετρος τους, ποικίλλουν στους διάφορους ιστούς, επηρεάζοντας τις μηχανικές ιδιότητες των ινών του κολλαγόνου και κατ επέκταση τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του ινώδους ιστού [23]. Η οπτική διαφάνεια του κερατοειδούς χιτώνα και η αντίσταση στην ενδοφθάλμια πίεση σχετίζεται άμεσα με την εξειδικευμένη διάταξη των ινιδίων του κολλαγόνου σε ορθογώνιο πλέγμα [24, 25]. Στους συνδέσμους και στους τένοντες, τα ινίδια, τα οποία έχουν μεγαλύτερη διάμετρο σε σχέση με εκείνα του κερατοειδούς χιτώνα, απαντώνται ευθυγραμμισμένα και σε παράλληλη διάταξη διαμήκως, εγκαρσίως και οριζοντίως [26], ενώ στα οστά εμφανίζουν τη μορφή ομόκεντρης ύφανσης, ώστε να προσδώσουν στους ιστούς αυτούς την απαραίτητη μηχανική αντοχή [27]. 17

34 Εικόνα 1.9. Η διαδικασία σχηματισμού μιας ίνας κολλαγόνου τύπου Ι. Τα ινίδια του κολλαγόνου in vivo χαρακτηρίζονται ως ετεροτυπικά, επειδή περιέχουν περισσότερο από έναν τύπο κολλαγόνου, έστω και σε μικρό ποσοστό. Για παράδειγμα, οι ινώδεις δομές του δέρματος συνίστανται από κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ [28], ενώ εκείνες που απαντώνται στον κερατοειδή χιτώνα περιέχουν, εκτός από κολλαγόνο τύπου Ι, κολλαγόνο τύπου V [29]. Τα ινίδια του κολλαγόνου στο οστό συντίθενται κυρίως από κολλαγόνο τύπου Ι αλλά περιέχουν και ένα μικρότερο ποσοστό κολλαγόνο τύπου V [30]. Στους τένοντες, τα ινίδια κολλαγόνου είναι μίγμα από μόρια κολλαγόνου τύπου Ι, ΙΙΙ και V [31]. Ο κύριος ρόλος του κολλαγόνου τύπου Ι είναι δομικός, ενώ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη σωστή ανάπτυξη των ιστών και των οργάνων. Οι ίνες του κολλαγόνου τύπου Ι καθορίζουν το σχήμα και τις μηχανικές ιδιότητες των ιστών, προσδίδοντάς τους την απαραίτητη δυσκαμψία και τη δυνατότητα εφελκυσμού. Συνεισφέρει στην απαραίτητη σκληρότητα και αντοχή του οστού [32]. Η χαρακτηριστική δομή των ινών του κολλαγόνου τύπου Ι είναι σημαντική επίσης για τους τένοντες που συνδέουν τους μύες με τα οστά, καθώς τους προσφέρει τη δυνατότητα πιο πολύπλοκων κινήσεων [33]. Εμπλέκεται στη διαδικασία επούλωσης των πληγών και των καταγμάτων και οι διαδικασίες που αναστέλλουν τη σύνθεση του κολλαγόνου καθυστερούν την επούλωσή τους. 18

35 Μεταλλάξεις στα γονίδια που κωδικοποιούν τις αλυσίδες της τριπλής έλικας του κολλαγόνου τύπου Ι ή τις πρωτεΐνες που συμμετέχουν στις τροποποιήσεις του κολλαγόνου κατά τη βιοσύνθεσή του μπορούν να οδηγήσουν σε διάφορες ασθένειες. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η ατελής οστεογένεση, στην οποία παρατηρείται ευθραυστότητα των οστών. Άλλα παραδείγματα είναι το σύνδρομο Ehres-Danlos, το οποίο χαρακτηρίζεται από υπερκινητικές αρθρώσεις και ανωμαλίες του δέρματος, και το σύνδρομο Marfan όπου παρατηρούνται ανωμαλίες στις αρτηρίες [34]. Προϊόντα καταβολισμού του θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες της μεταβολής οργάνων και ιστών και κατά συνέπεια ως διαγνωστικό εργαλείο σε παθολογικές καταστάσεις (οστεοπόρωση, οστεοαρθρίτιδα, καρκίνος, αθηροματικές πλάκες) Κολλαγόνο τύπου ΙΙ Το κολλαγόνο τύπου ΙΙ αποτελεί το κυρίαρχο συστατικό του αρθρικού χόνδρου, αντιπροσωπεύοντας το 85-90% του ολικού ποσοστού του κολλαγόνου που περιέχεται στον ιστό αυτό. Άλλοι ιστοί στους οποίους εντοπίζεται κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε μεγάλο ποσοστό είναι το υαλοειδές υγρό του οφθαλμού, ο κερατοειδής χιτώνας, οι ενδοαρθρικοί μηνίσκοι, η νωτιαία χορδή και ο πηκτοειδής πυρήνας των μεσοσπονδύλιων δίσκων [35]. Η τριπλή έλικα του κολλαγόνου τύπου ΙΙ απαρτίζεται από τρεις όμοιες πολυπετιδικές αλυσίδες α1(ιι). Το μήκος των αλυσίδων αυτών είναι το ίδιο και κάθε μια περιέχει 1060 αμινοξέα [36]. Είναι, δηλαδή, ένα ομοτριμερές μόριο με μέγεθος και βιοχημικά χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα του κολλαγόνου τύπου Ι. Η σύνθεση του κολλαγόνου τύπου ΙΙ ως προκολλαγόνο πραγματοποιείται σχεδόν αποκλειστικά από τα χονδροκύτταρα. Το εναλλακτικό μάτισμα του στο πρώιμο mrna του κολλαγόνου μπορεί να οδηγήσει σε δύο μορφές κολλαγόνου τύπου ΙΙ (ΙΙΑ και ΙΙΒ), οι οποίες εντοπίζονται σε διαφορετικούς ιστούς και επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες. Αφού τροποποιηθεί με υδροξυλίωση και γλυκοζυλίωση, εκκρίνεται στον εξωκυττάριο χώρο, όπου υφίσταται πρωτεολυτική διάσπαση των δύο άκρων. Η διαδικασία ολοκληρώνεται με το σχηματισμό των χαρακτηριστικών ινιδίων του κολλαγόνου [8]. Μια διαφορά μεταξύ του κολλαγόνου τύπου ΙΙ και τύπου Ι εντοπίζεται στο ποσοστό των μετα-μεταφραστικών 19

36 τροποποιήσεων και σχετίζεται με το υψηλότερο ποσοστό ενζύμων που περιέχει ο χόνδρος. Πιο συγκεκριμένα, στις αλυσίδες του κολλαγόνου τύπου ΙΙ περιέχονται περισσότερα κατάλοιπα υδροξυλυσίνης, καθώς και κατάλοιπα γαλακτόζης και γλυκόζης που ρυθμίζουν τις αλληλεπιδράσεις με τις πρωτεογλυκάνες (άλλο ένα χαρακτηριστικό συστατικό του εξωκυττάριου χώρου) [37]. Το κολλαγόνο τύπου ΙΙ σχηματίζει D-περιοδικά ετεροτυπικά μικροϊνίδια στο χόνδρο, τα οποία διακρίνονται στα λεπτά ινίδια διαμέτρου 16 nm και στα χοντρά ινίδια με διάμετρο 40 nm. Η παρουσία του κολλαγόνου τύπου XI είναι απαραίτητη για το σχηματισμό των λεπτών ινιδίων στο χόνδρο και καθορίζει τη διάμετρο τους [14]. Οι πρωτεογλυκάνες του εξωκυττάριου χώρου σταθεροποιούν την οργάνωση των ινιδίων σε μεγαλύτερες δέσμες. Ο σωστός σχηματισμός σταυροδεσμών μεταξύ των κατάλοιπων της λυσίνης και της υδροξυλυσίνης εξασφαλίζει τη σταθερότητα των ινιδίων και της δομής του ιστού [36]. Εικόνα Η δομή ενός λεπτού ινιδίου κολλαγόνου στο χόνδρο. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη είναι υπεύθυνη για τη συνοχή και την ελαστικότητα των χόνδρων των αρθρώσεων. Κολλαγόνο τύπου ΙΙ και πρωτεογλυκάνες συμπλέκονται ώστε να σχηματιστεί 20

37 ο εξωκυττάριος χώρος του χόνδρου, προσδίνοντας του τη δυνατότητα αντίστασης σε συμπιεστικές δυνάμεις και τη δυνατότητα εφελκυσμού, ώστε να αντέχει τα φορτία της άρθρωσης, να υφίσταται μεγάλες σχηματικές παραμορφώσεις και να απορροφά κραδασμούς. Μεταλλάξεις στους τύπους ΙΙ και XI κολλαγόνου είναι υπεύθυνες για σκελετικές δυσπλασίες και οστεοάρθρωση [38]. 1.4 Πρωτεογλυκάνες Οι πρωτεογλυκάνες αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια μακρομορίων που απαντώνται σε όλους τους ιστούς. Πιο συγκεκριμένα, εντοπίζονται σε μεγάλα ποσοστά στην εξωκυττάρια ύλη και στην επιφάνεια των κυττάρων, ενώ μικρότερα ποσοστά πρωτεογλυκανών εντοπίζονται σε ενδοκυττάρια οργανίδια [39]. Οι πρωτεογλυκάνες συντίθενται από έναν πρωτεϊνικό κορμό στον οποίο συνδέονται ομοιοπολικά μακριές γραμμικές αλυσίδες πολυσακχαριτών που ονομάζονται γλυκοζαμινογλυκάνες. Η σύνδεση του πρωτεϊνικού κορμού με τις γλυκοζαμινογλυκάνες γίνεται μέσω ενός Ο-γλυκοζιτικού δεσμού που ενώνει ένα κατάλοιπο σερίνης της πρωτεΐνης με την υπόλοιπη αλυσίδα των γλυκοζαμινογλυκάνης μέσω μιας ξυλόζης και δύο σακχάρων γαλακτόζης [40]. Επομένως, η εξαιρετική ετερογένεια που παρατηρείται εξαρτάται από το μέγεθος και τη θέση του πρωτεϊνικού κορμού, καθώς και από τον αριθμό και τον τύπο των προσδεδεμένων γλυκοζαμινογλυκανών. 21

38 Εικόνα Η δομή μιας πρωτεογλυκάνης. 22

39 Εικόνα Η σύνδεση της γλυκοζαμινογλυκάνης στον πρωτεϊνικό κορμό της πρωτεογλυκάνης. Οι λειτουργίες που επιτελούν οι πρωτεογλυκάνες σε έναν οργανισμό είναι πολυάριθμες. Μπορούν να σχηματίσουν πηκτώματα με ποικίλη πυκνότητα φορτίων και μέγεθος πόρων, τα οποία στηρίζουν τα κύτταρα και δρουν ως ηθμοί, επιτρέποντας την εκλεκτική διέλευση διαλυτών μακρομορίων διαμέσου του εξωκυττάριου χώρου. Σε συνδυασμό με τις ίνες κολλαγόνου προσδίδουν ισχύ και ανθεκτικότητα σε διάφορες δομές. Το αρνητικό φορτίο των πρωτεογλυκανών επηρεάζει την ενυδάτωση του ινώδους δικτύου. Οι πρωτεογλυκάνες, λόγω της κατανομής τους στον εξωκυττάριο χώρο και στην κυτταρική επιφάνεια, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες που σχετίζονται με αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων, αλλά και των κυττάρων με τον εξωκυττάριο χώρο. Ελέγχουν την προσκόλληση κυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία, ρυθμίζοντας με αυτόν τον τρόπο την κυτταρική μετανάστευση. Επηρεάζουν, επίσης, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση των κυττάρων [41]. Η αλληλεπίδρασή τους με αυξητικούς παράγοντες, χυμοκίνες και κυτοκίνες, έχει ως αποτέλεσμα τη μεταγωγή σημάτων στο εσωτερικό του κυττάρου [42]. 23

40 Πολλές γενετικές ασθένειες έχουν συνδεθεί με μεταλλάξεις στα γονίδια των πρωτεογλυκανών. Οι πρωτεογλυκάνες είναι υπεύθυνες επίσης για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης των κυττάρων και των μονοπατιών σηματοδότησης σε περιπτώσεις νεοπλασίας [3]. 1.5 Γλυκοζαμινογλυκάνες Αυτή η μεγάλη κατηγορία αρνητικά φορτισμένων γραμμικών ετεροπολυσακχαριτών αποτελεί τη δομική μονάδα των πρωτεογλυκανών. Απαντώνται ως τα κύρια συστατικά της επιφάνειας όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων και του εξωκυττάριου περιβάλλοντος σε όλους σχεδόν τους ιστούς. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες διακρίνονται σε δύο κύριους τύπους: α) τις θειωμένες, από τις οποίες εκείνες που απαντώνται περισσότερο είναι η θειική χονδροϊτίνη (CS), η θειική δερματάνη (DS), η θειική ηπαράνη (HS), η θειική κερατάνη (KS) και η ηπαρίνη (HEP) και β) τις μη θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες, στις οποίες περιλαμβάνεται το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) συνίστανται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριτικές μονάδες που περιέχουν ένα κατάλοιπο ενός ουρονικού οξέος (D-γλυκουρονικό οξύ ή L- ιδουρονικό οξύ) ή μιας εξόζης (D-γαλακτόζη) και μίας ακετυλιωμένης εξοζαμίνης (Ν-ακετυλο- D-γλυκοζαμίνη ή Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη). Εξαίρεση στο παραπάνω μοτίβο αποτελεί η θειική κερατάνη (KS), η δισακχαριτική μονάδα της οποίας αποτελείται από Ν-ακετυλο-Dγλυκοζαμίνη και D-γαλακτόζη. Σχηματίζεται ένας γλυκοζιτικός δεσμός μεταξύ της γλυκοζαμίνης και του ουρονικού οξέος [43]. Οι περισσότερες γλυκοζαμινογλυκάνες, εκτός από το υαλουρονικό οξύ το οποίο απαντάται ελεύθερο, βιοσυντίθενται προσκολλημένες στον πρωτεϊνικό κορμό από όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Υαλουρονικό οξύ, θειική χονδροϊτίνη και θειική ηπαράνη μπορούν να συντεθούν και στα προκαρυωτικά κύτταρα. Οι διάφορες γλυκοζαμινογλυκάνες ποικίλουν ανάλογα με τον ιστό προέλευσης και οι διαφορές τους εντοπίζονται στον τύπο της εξοζαμίνης, εξόζης ή ουρονικού οξέος, τη γεωμετρία του γλυκοζιτικού δεσμού που τα συνδέει μεταξύ τους, καθώς και ως προς το βαθμό και το σχέδιο θείωσης που περιέχουν. Αυτή η ετερογένεια που παρατηρείται στις 24

41 γλυκοζαμινογλυκάνες διευκολύνει την εξειδικευμένη πρόσδεσή τους σε διάφορες πρωτεΐνες, όπως αυξητικούς παράγοντες, ένζυμα, μορφογόνα, επηρεάζοντας κατά συνέπεια τις βιολογικές τους λειτουργίες. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες, εκτός από την οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου, συμμετέχουν στη ρύθμιση πολυάριθμων φυσιολογικών και παθολογικών κυτταρικών διεργασιών, όπως η ανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση και η αγγειογένεση [44]. Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες εμπλέκονται και στη ρύθμιση διεργασιών που λαμβάνουν χώρα και σε παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Στην τελευταία περίπτωση έχει παρατηρηθεί η ποσοτική και ποιοτική μεταβολή των γλυκοζαμινογλυκανών, οι οποίες επηρεάζουν το φαινότυπο του καρκίνου και πιο συγκεκριμένα επηρεάζουν την κινητική της ανάπτυξης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων, καθώς και την ικανότητα μετάστασης του καρκίνου [45] Θειική χονδροϊτίνη: Δομή και βιολογικός ρόλος Η θειική χονδροϊτίνη (CS) είναι μια αντιπροσωπευτική θειωμένη γαλακτοζαμινογλυκάνη, η οποία είναι διαδεδομένη στη μορφή της πρωτεογλυκάνης σε ενδοκύτταρια κοκκία κυττάρων, όπως στα μαστοκύτταρα, στην κυτταρική μεμβράνη και στον εξωκυττάριο χώρο ασπόνδυλων και σπονδυλωτών οργανισμών. Αποτελεί το κύριο συστατικό του χόνδρου, ενώ ποσότητές της εντοπίζονται σε οστά, τένοντες και αορτές. Η βασική δομική μονάδα της θειικής χονδροϊτίνης είναι ένας δισακχαρίτης αποτελούμενος από D-γλυκουρονικό οξύ και Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη που ενώνονται με β(1,3) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Οι δισακχαρίτες ενώνονται με β(1,4) γλυκοζιτικούς δεσμούς προς σχηματισμό της αλυσίδας. Εστέρες των θειικών ομάδων παρατηρούνται συνήθως είτε στη θέση C (6) της Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης (6-θειική χονδροϊτίνη, CS C) είτε στη θέση C (4) της Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης (4-θειική χονδροϊτίνη, CS A). Σε μερικές περιπτώσεις, η θείωση παρατηρείται και στις δύο θέσεις της θειική χονδροϊτίνης, ενώ έχει αναφερθεί και η ύπαρξη θειικής χονδροϊτίνης που δεν περιέχει θειικές ομάδες [43]. Το μοριακό βάρος των αλυσίδων της κυμαίνεται από 5-50 kda. 25

42 Εικόνα Δομή της επαναλαμβανόμενης δισακχαριτικής μονάδας της 4-θειικής χονδροϊτίνης (C-4S). 26

43 Εικόνα Δομή της επαναλαμβανόμενης δισακχαριτικής μονάδας της 6-θειικής χονδροϊτίνης (C- 6S). Την έναρξη της βιοσύνθεσης των γαλακτοζαμινογλυκανών πυροδοτεί η σύνθεση μιας περιοχής σύνδεσης που αποτελείται από τέσσερις μονοσακχαρίτες: μια ξυλόζη, δύο γαλακτόζες και ένα γλυκουρονικό οξύ. Η περιοχή αυτή (GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xyl3Galβ1-O- Ser) προσδένεται ομοιοπολικά σε ειδικά κατάλοιπα σερίνης που ενσωματώνονται σε διαφορετικούς πρωτεϊνικούς πυρήνες. Ο σκελετός της θειικής χονδροϊτίνης σχηματίζεται όταν η πρώτη Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη μεταφέρεται από γαλακτοζαμινοσυλοτρανσφεράση (GalNAcT I) στο μη-αναγωγικό άκρο του γλυκουρονικού οξέος. Ακολουθεί η εναλλασσόμενη προσθήκη γλυκουρονικού οξέος και Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης, η οποία καταλύεται από την τρανσφεράση του γλυκουρονικού οξέος (GlcAT IΙ) και τη γαλακτοζαμινοσυλοτρανσφεράση ΙΙ (GalNAcT ΙI) αντίστοιχα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό του χαρακτηριστικού δισακχαριτικού μοτίβου της θειικής χονδροϊτίνης. Η θείωση του σκελετού της συγκεκριμένης γαλακτοζαμινογλυκάνης ρυθμίζεται από διάφορες σουλφοτρανσφεράσες και θειομάδες εισάγονται στις θέσεις C (6) και C (4) των κατάλοιπων της Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης [46]. 27

44 Οι πρωτεογλυκάνες της θειικής χονδροϊτίνης που απαντώνται in vivo ποικίλουν σημαντικά ως προς το μέγεθος και τον αριθμό των αλυσίδων, στο είδος της πρωτεΐνης που είναι προσδεδεμένες, καθώς και στη θέση και το βαθμό της περιεχόμενης θείωσης. Αυτή η δομική ετερογένεια των αλυσίδων της θειικής χονδροϊτίνης διευκολύνει την αλληλεπίδραση της με μια ποικιλία βιομορίων και καθορίζει τις πολύπλευρες βιολογικές λειτουργίες της συγκεκριμένης γλυκοζαμινογλυκάνης. Η δομή της θειικής χονδροϊτίνης εξαρτάται από το είδος του ζώου και του ιστού από τον οποίο απομονώνεται και τη φυσιολογική του κατάσταση. Οι κυριότερες υποκατηγορίες αυτής της οικογένειας γλυκοζαμινογλυκανών που απαντώνται στους ιστούς των θηλαστικών συντίθενται από μονοθειωμένες υπομονάδες. Η θειική χονδροϊτίνη που υπάρχει στην επιφάνεια των κυττάρων αλληλεπιδρά με μόρια όπως αυξητικοί παράγοντες, κυτοκίνες, χυμοκίνες, λιποπρωτεΐνες και μορφογόνα, συμβάλλοντας έτσι στη ρύθμιση πληθώρας διεργασιών (παρουσιάζοντας τα στους αντίστοιχους υποδοχείς ή απομακρύνοντας τα από αυτούς). Αρκετά παθογόνα, βακτήρια, ιοί και παράσιτα προσκολλώνται στις αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης που υπάρχουν στην κυτταρική επιφάνεια με αποτέλεσμα να μολύνουν τα κύτταρα-ξενιστές. Οι αλυσίδες της θειικής χονδροϊτίνης προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων και δρουν ως μόρια σηματοδότησης του εξωκυττάριου χώρου που ενεργοποιούν μονοπάτια σηματοδότησης στον ενδοκυττάριο χώρο [47]. Ορισμένες ασθένειες και νοσογόνες καταστάσεις συνδέονται με αλλαγές στη βιοσύνθεση των πρωτεογλυκανών θειικής χονδροϊτίνης (CSPGs). Το επίπεδο των CSPGs είναι αρκετά αυξημένο στα πρώιμα στάδια αθηροσκλήρωσης και επηρεάζει την κατακράτηση, τη μετατροπή και τη συσσώρευση των λιπιδίων. Η θειική χονδροϊτίνη, ως βασικό συστατικό του χόνδρου, έχει δομικό ρόλο, δεσμεύοντας το κολλαγόνο και συγκρατώντας τις ίνες του κολλαγόνου σε πυκνό δίκτυο, με αποτέλεσμα να προσδίδει στο χόνδρο την αντίσταση σε δυνάμεις συμπίεσης και την αντοχή στο φορτίο της άρθρωσης. Επιπλέον, συνεισφέρει στην ενυδάτωση του ιστού, λόγω του υψηλού αρνητικού φορτίου που περιέχει και της ικανότητας να συγκρατεί σημαντικά ποσοστά νερού. Τα τελευταία 22 χρόνια έχουν γίνει αρκετές κλινικές δοκιμές όπου μελετάται η χορήγηση θειικής χονδροϊτίνης για την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων της οστεοαρθρίτιδας. Θεωρείται 28

45 ότι η λήψη συμπληρωμάτων θειικής χονδροϊτίνης (ειδικά σε συνδυασμό με τη θειική γλυκοζαμίνη), όχι μόνο μπορεί να ανακουφίσει από τον πόνο, αλλά και να αποτρέψει ή να επιβραδύνει τη φθορά του χόνδρου κατά την εξέλιξη της νόσου [48, 49]. Έχει επίσης αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση [50]. Διαλύματα θειικής χονδροϊτίνης χρησιμοποιούνται σε ορισμένες οφθαλμολογικές ασθένειες, όπως η κερατοεπιπεφυκίτιδα, και για τη συντήρηση του κερατοειδούς και της ενδοφθάλμιας πίεσης [51] Θειική δερματάνη: Δομή και βιολογικός ρόλος Ο πολυσακχαρίτης αυτός, ο οποίος είναι γνωστός και με την ονομασία θειική χονδροϊτίνη Β, αποτελείται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριτικές μονάδες Ν-ακετυλο-D γαλακτοζαμίνης και L-ιδουρονικού οξέος που ενώνονται με β(1,4) γλυκοζιτικούς δεσμούς και β(1,3) γλυκοζιτικούς δεσμούς αντίστοιχα. Η ύπαρξη του ιδουρονικού οξέος είναι αυτό που τη διαφοροποιεί από τη θειική χονδροϊτίνη και προσδίδει τη διαμορφωτική ευελιξία στη θειική δερματάνη [52]. Η μοριακή της μάζα κυμαίνεται μεταξύ kda. Εικόνα Δομή της επαναλαμβανόμενης δισακχαριτικής μονάδας της θειικής δερματάνης. 29

46 Η θειική δερματάνη απαντάται στον εξωκυττάριο χώρο μαλακών ιστών, όπως το δέρμα και τα αιμοφόρα αγγεία. Αποτελεί την κύρια γλυκοζαμινογλυκάνη του δέρματος και απελευθερώνεται σε υψηλές συγκεντρώσεις κατά την επούλωση πληγών [53]. Η θειική δερματάνη, όπως και οι υπόλοιπες γλυκοζαμινογλυκάνες, διαδραματίζει ρόλο κλειδί σε διαδικασίες βιολογικής απόκρισης, εξαιτίας της δράσης της ως: σταθεροποιητής αυξητικών παραγόντων, χυμοκινών και κυτοκινών ρυθμιστής της ενζυμικής δραστηριότητας μόριο σηματοδότησης σε περιπτώσεις κυτταρικής βλάβης (π.χ. τραυματισμός, μόλυνση, καρκινογένεση) στόχος ιογενών, βακτηριακών και παρασιτικών λοιμογόνων παραγόντων Η συγκεκριμένη γλυκοζαμινογλυκάνη προσδένεται μέσω μιας ξυλόζης στα κατάλοιπα σερίνης του πρωτεϊνικού σκελετού ώστε να σχηματιστεί η πρωτεογλυκάνη. Στη βιοσύνθεσή της εμπλέκονται πολλά βιοσυνθετικά ένζυμα. Συμμετέχει σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές αποκρίσεις, όπως στην πήξη του αίματος, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σε μολύνσεις και στην καρκινογένεση [54]. Η θειική δερματάνη ενισχύει το ρυθμό αναστολής της θρομβίνης από τον συμπαράγοντα ηπαρίνης ΙΙ (HC II), προσφέροντας ένα καταλυτικό υπόστρωμα στο οποίο μπορούν να προσδεθούν τόσο ο αναστολέας όσο και η πρωτεάση. Υπεύθυνος για την αλληλεπίδραση αυτή είναι ένας ειδικός εξασακχαρίτης αποτελούμενος από τρεις δισακχαριτικές μονάδες που περιέχουν ιδουρονικό οξύ και Ν-ακετυλο-D γαλακτοζαμίνη [IdoA(2S)-GalNAc(4S)] [55] Ηπαρίνη-Θειική ηπαράνη: Δομή και βιολογικός ρόλος Οι δύο αυτές γλυκοζαμινογλυκάνες βρίσκονται προσκολλημένες σε διαφορετικούς πρωτεϊνικούς πυρήνες και εντοπίζονται σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα. Η ηπαρίνη (HEP) απομονώνεται συνήθως από κυστίδια αποθήκευσης των μαστοκυττάρων που υπάρχουν στους ιστούς ή τη βλέννα ορισμένων ζώων, ενώ η θειική ηπαράνη (HS) απαντάται στην κυτταρική επιφάνεια και στον εξωκυττάριο χώρο σπονδυλωτών και ασπόνδυλων ειδών [56]. 30

47 Η χημική δομή των δύο αυτών γραμμικών πολυμερών είναι παρόμοια. Εναλλασσόμενες μονάδες Ν-ακετυλο-D γλυκοζαμίνης ενώνονται με κατάλοιπα D-γλυκουρονικού οξέος μέσω β(1,4) γλυκοζιτικών δεσμών προς σχηματισμό της πολυμερικής αλυσίδας της γλυκοζαμινογλυκάνης. Η αμινομάδα της D γλυκοζαμίνης στη θειική ηπαράνη είναι - υποκατεστημένη είτε με μια ακετυλομάδα είτε με μια θειική ομάδα (NHCOCH 3 ή N-SO 3 αντίστοιχα), ενώ στην ηπαρίνη κυριαρχούν τα κατάλοιπα των Ν-θειωμένων-D γλυκοζαμινών. Εστεροποιημένες Ο-θειικές ομάδες μπορεί να υπάρχουν στις θέσεις C (3) και C (6) της γλυκοζαμίνης, ενώ παρατηρείται Ο-θείωση και στη θέση C (2) του ουρονικού οξέος, το οποίο μπορεί να είναι είτε D-γλυκουρονικό οξύ ή L-ιδουρονικό οξύ [57, 58]. Εικόνα Οι διαφορές στις επαναλαμβανόμενες δισακχαριτικές μονάδες της ηπαρίνης (HEP) και της θειικής ηπαράνης (HS). 31

48 Οι αλυσίδες της θειικής ηπαράνης παρουσιάζουν μεγαλύτερη δομική ποικιλία και είναι μεγαλύτερες σε σχέση με την ηπαρίνη, καθώς το μοριακό τους βάρος κυμαίνεται από 5 έως 50 kda, με ένα μέσο μοριακό βάρος στα 30 kda. Η μοριακή μάζα της ηπαρίνης κυμαίνεται μεταξύ 5-40 kda, με μια μέση τιμή στα 15 kda. Η ηπαρίνη περιέχει μεγαλύτερα ποσοστά ιδουρονικού οξέος και χαρακτηρίζεται από υψηλότερο βαθμό θείωσης σε σχέση με τη θειική ηπαράνη, γεγονός που την καθιστά περισσότερο αρνητικά φορτισμένη [58]. Η βιοσύνθεση των συγκεκριμένων γλυκοζαμινογλυκανών, η οποία λαμβάνει χώρα στο σύμπλεγμα Golgi, ξεκινά με την προσκόλληση μιας περιοχής σύνδεσης αποτελούμενη από τέσσερις μονοσακχαρίτες στον πρωτεϊνικό κορμό. Ακολουθεί η επέκταση της αλυσίδας με την πρόσθεση των δισακχαριτών Ν-ακετυλο-D γλυκοζαμίνης και D γλυκουρονικού οξέος από δύο γλυκοσυλοτρανσφεράσες (EXT1 και EXT2). Στη συνέχεια, η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα τροποποιείται από ειδικά ένζυμα. Οι τροποποιήσεις αυτές περιλαμβάνουν την αποκετυλίωση και την επακόλουθη θείωση της Ν-ακετυλο-D γλυκοζαμίνης, η οποία μετατρέπεται σε Ν- σουλφο-d γλυκοζαμίνη, ενώ ποσότητα D γλυκουρονικού οξέος επιμερίζεται σε L-ιδουρονικό οξύ. Στη συνέχεια, σουλφομάδες ενσωματώνονται στη θέση C (2) του L-ιδουρονικού ή του D- γλυκουρονικού οξέος, καθώς και στις θέσεις C (3) και C (6) της γλυκοζαμίνης [59]. Η ηπαρίνη που απομονώνεται από την εντερική βλέννα χοίρων χρησιμοποιείται ευρέως ως αντιπηκτικό φάρμακο, εμποδίζοντας την εμφάνιση θρόμβων και την επέκταση των θρόμβων που ήδη υπάρχουν. Η αντιπηκτική δράση της ηπαρίνης οφείλεται στην αλληλεπίδρασή της με τη σερίνη της πρωτεάσης του αναστολέα της αντιθρομβίνης ΙΙΙ (ΑΤ), η οποία προκαλεί την αλλαγή της διαμόρφωσης του αναστολέα και κατά συνέπεια ενισχύει την ικανότητά του να αδρανοποιεί τη δράση της θρομβίνης και άλλες πρωτεάσες που εμπλέκονται στο μηχανισμό της πήξης του αίματος [60]. Η ηπαρίνη και η θειική ηπαράνη επηρεάζουν τη δράση μεμβρανικών πρωτεϊνών, ενζύμων, μορφογόνων, κυτοκινών και ιντεγκρινών [61]. Αλληλεπιδρούν με αυξητικούς παράγοντες και ρυθμίζουν ποικίλες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της πήξης του αίματος, της εμβρυογένεσης, της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης των κυττάρων [62]. Οι συγκεκριμένες γλυκοζαμινογλυκάνες διαδραματίζουν ρόλο και σε καταστάσεις όπως 32

49 ιογενείς μολύνσεις και άμυνα κατά των ξενιστών, σε φλεγμονές και στη μετάσταση νεοπλασματικών ασθενειών. Επηρεάζουν άμεσα το φαινότυπο του καρκινικού κυττάρου, τον πολλαπλασιαμό των κυττάρων, την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο, καθώς και τις μεταστατικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων. Η ηπαρίνη και η θειική ηπαράνη μπορεί να έχουν διεγερτική ή ανασταλτική επίδραση στην αγγειογένεση που παρατηρείται σε νεοπλασματικές ασθένειες [63, 64] Υαλουρονικό οξύ: Δομή και βιολογικός ρόλος Το υαλουρονικό οξύ, που αποτελεί τον κύριο τύπο γλυκοζαμινογλυκάνης στον εξωκυττάριο χώρο, είναι ένας υψηλού μοριακού βάρους ( kda) πολυσακχαρίτης που αποτελείται από κατάλοιπα D-γλυκουρονικού οξέος και N-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με β(1,4) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Οι δισακχαρίτες ενώνονται μέσω β(1,3) γλυκοζιτικούς δεσμούς για να σχηματιστεί η αλυσίδα του υαλουρονικού οξέος [65]. Η β διαμόρφωση επιτρέπει σε όλες τις ογκώδεις χαρακτηριστικές ομάδες, όπως τα υδροξύλια, η καρβοξυλομάδα, να βρίσκονται σε ευνοϊκά από στερεοχημική άποψη ισημερινή θέση, ενώ όλα τα μικρά άτομα Η απασχολούν τις λιγότερο ευνοημένες στερεοχημικά αξονικές θέσεις, όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Η δομή του δισακχαρίτη είναι ενεργειακά πολύ σταθερή [66]. 33

50 Εικόνα Δομή της επαναλαμβανόμενης δισακχαριτικής μονάδας του υαλουρονικού οξέος. Το υαλουρονικό οξύ απαντάται στο σώμα με τη μορφή του άλατος (υαλουρονικό άλας, hyaluronate) και εντοπίζεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στον εξωκυττάριο χώρο αρκετών μαλακών συνδετικών ιστών, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος, του ομφάλιου λώρου, του αρθρικού υγρού και του υαλώδους χόνδρου. Όσον αφορά στον οφθαλμό, υαλουρονικό οξύ μπορεί να εντοπιστεί στο υαλοειδές υγρό, στο δακρυϊκό αδένα, στον κερατοειδή, στον επιπεφυκότα, καθώς επίσης και στα ανθρώπινα δάκρυα. Μερικά από τα όργανα που περιέχουν σημαντικά ποσοστά υαλουρονικού οξέος είναι ο πνεύμονας, οι νεφροί και ο εγκέφαλος. Είναι ο μόνος τύπος γλυκοζαμινογλυκάνης που δε φέρει θειικές ομάδες και δε συνδέεται ομοιοπολικά με τον πρωτεϊνικό κορμό. Η βιοσύνθεση του υαλουρονικού οξέος λαμβάνει χώρα στο σύμπλεγμα Golgi των κυττάρων και καταλύεται από μία κατηγορία μεμβρανικών πρωτεϊνών που ονομάζεται υαλουρονική συνθάση (HAS1, HAS2 και HAS3). Τα ένζυμα της υαλουρονικής συνθάσης συνθέτουν μακριές, γραμμικές αλυσίδες πολυμερών από την επαναλαμβανόμενη δομή του δισακχαρίτη του υαλουρονικού οξέος, προσθέτοντας 34

51 εναλλακτικά D-γλυκουρονικό οξύ και Ν-ακετυλο D-γλυκοζαμίνη στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα και χρησιμοποιώντας τα ενεργοποιημένα νουκλεοτίδια ως υποστρώματα [67]. Οι λειτουργίες του υαλουρονικού οξέος είναι ποικίλες. Λόγω του ιξώδους και της ικανότητάς του να προσδένει μεγάλα ποσά νερού, ρυθμίζει σημαντικά την ενυδάτωση των ιστών και την ωσμωτική πίεση και συνεπώς επηρεάζει τις φυσικές ιδιότητες του εξωκυττάριου χώρου. Η ικανότητά του να αλληλεπιδρά ειδικώς και μη ειδικώς με αρκετούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων και άλλων συστατικών όχι μόνο συντελεί στη δομική ακεραιότητα, αλλά οδηγεί και στην ενεργοποίηση σημάτων, επηρεάζοντας με αυτόν τον τρόπο τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την έκφραση γονιδίων. Συνεπώς, διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο κατά την εμβρυϊκή και ιστική ανάπτυξη, σε διαδικασίες υπεύθυνες για την επούλωση πληγών, σε φλεγμονώδεις καταστάσεις και σε κακοήθειες [68]. Οι υγροσκοπικές ιδιότητες, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι αποτελεί φυσικό συστατικό του υαλώδους υγρού, καθιστούν το υαλουρονικό οξύ κατάλληλο για οφθαλμολογικές εφαρμογές. Πολλά σκευάσματα και τεχνητά δάκρυα περιέχουν υαλουρονικό οξύ για την αντιμετώπιση της ξηρότητας του οφθαλμού, ενώ χρησιμοποιείται ευρέως και σε οφθαλμολογικές επεμβάσεις [69]. Ο συγκεκριμένος πολυσακχαρίτης είναι υπεύθυνος για την ελαστικότητα του αρθρικού υγρού και κατά συνέπεια επηρεάζει τη λίπανση των αρθρώσεων. Συντελεί επίσης σε κάποιο βαθμό στην απορρόφηση των φορτίων της άρθρωσης και των κραδασμών. Γι αυτό το λόγο, χρησιμοποιείται η έγχυση υαλουρονικού οξέος για την τοπική ανακούφιση των συμπτωμάτων της οστεοαρθρίτιδας, ενισχύοντας τις λιπαντικές ιδιότητες του ασθενούς αρθρικού υγρού [70]. Τέλος, άλλος ένας τομέας στον οποίο βρίσκει εφαρμογή το υαλουρονικό οξύ είναι η κοσμετολογία. Υαλουρονικό οξύ εμπεριέχεται σε καλλυντικές και φαρμακευτικές κρέμες που χρησιμοποιούνται για την ενυδάτωση του δέρματος και την εξάλειψη των ρυτίδων, καθώς και για την ανάπλαση των μαλακών ιστών κατά τη θεραπεία επούλωσης πληγών και του δέρματος [70]. Επιπλέον, προστατεύει τα κύτταρα από το οξειδωτικό στρες, καθώς παρεμποδίζει την εμφάνιση ελευθέρων ριζών. 35

52 1.5.5 Θειική κερατάνη Η θειική κερατάνη αποτελείται από δισακχαριτικές μονάδες μιας γαλακτόζης και μιας Ν- ακετυλο-d-γλυκοζαμίνης ενωμένες με γλυκοζιτικούς δεσμούς που είναι ανεστραμμένοι σε σχέση με εκείνους που υπάρχουν στο υαλουρονικό οξύ, στη θειική χονδροϊτίνη και στη θειική δερματάνη [71]. Η θείωση είναι δυνατή στον C (6) τόσο της γαλακτόζης όσο και της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης. Εικόνα Δομή της επαναλαμβανόμενης δισακχαριτικής μονάδας της θειικής κερατάνης. Η συγκεκριμένη γλυκοζαμινογλυκάνη, σε αντίθεση με τις υπόλοιπες γλυκοζαμινογλυκάνες, μπορεί να βιοσυντεθεί τόσο ως Ο-γλυκοζιτικά συνδεδεμένη σε κατάλοιπο σερίνης ή θρεονίνης του πρωτεϊνικού κορμού όσο και ως Ν-γλυκοζιτικά συνδεδεμένη σε κατάλοιπο ασπαραγίνης. Η επιμήκυνση των αλυσίδων της θειικής κερατάνης πραγματοποιείται από γλυκοσυλοτρανσφεράσες και σουλφοτρανσφεράσες και ρυθμίζεται από τα σιαλικά οξέα που είναι Ο-γλυκοζιτικά συνδεδεμένα στον ολιγοσακχαρίτη. 36

53 Θειική κερατάνη στη Ν-γλυκοζιτικά συνδεδεμένη μορφή της (KS I) εντοπίζεται σε γλυκοπρωτεΐνες συνδεδεμένες στα κύτταρα στον κερατοειδή χιτώνα, ενώ η Ο-γλυκοζιτικά συνδεδεμενη μορφή της (KS II) απαντάται κυρίως στο χόνδρο. Ο T. Krusius και η ομάδα του ταυτοποίησαν και ένα τρίτο είδος θειικής κερατάνης (KS ΙΙI) σε εγκεφαλικούς ιστούς, η οποία περιέχει Ο-γλυκοζιτικό δεσμό ανάμεσα σε μαννόζη και σερίνη [72]. Το μοριακό βάρος της είναι μικρό (4-19 kda) και αυξάνεται με τη γήρανση. Η παρουσία της συγκεκριμένης γλυκοζαμινογλυκάνης στον κερατοειδή χιτώνα σχετίζεται με τη διατήρηση της ενυδάτωσης του ιστού, η οποία είναι απαραίτητη διαφάνειά του, ενώ στους υπόλοιπους ιστούς δρα ως μόριο σηματοδότησης. για την οπτική 37

54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 2 Αλληλεπιδράσεις γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου 2.1 Σημασία των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου Ο τρόπος που αλληλεπιδρούν τα διάφορα μόρια μεταξύ τους στον εξωκυττάριο χώρο επηρεάζουν τη δομική οργάνωση του ιστού και κατ επέκταση και τη βιολογική του λειτουργία. Όπως αναφέρθηκε ήδη, δύο κύρια συστατικά του εξωκυττάριου χώρου πολλών ιστών και οργάνων είναι το κολλαγόνο και οι γλυκοζαμινογλυκάνες που βρίσκονται προσδεδεμένες σε κάποιον πρωτεϊνικό πυρήνα, με εξαίρεση το υαλουρονικό οξύ που απαντάται σε ελεύθερη μορφή. Εκτός από το δομικό τους ρόλο, οι δύο αυτές κατηγορίες μακρομορίων επηρεάζουν βασικές κυτταρικές διεργασίες μέσω των αλληλεπιδράσεων τους με κύτταρα, με μόρια προσκόλλησης, αυξητικούς παράγοντες και άλλα είδη παραγόντων και την ενεργοποίηση ποικίλων μονοπατιών μεταγωγής σήματος. Συνεπώς, η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου σε μοριακό επίπεδο είναι θεμελιώδους σημασίας στη βιολογία και ειδικά στο σχεδιασμό θεραπευτικών παραγόντων. Η βιολογική σημασία αυτών των μακρομορίων επισημαίνεται και από την εμπλοκή τους σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Τα οργανικά πολυμερή αποτελούν ίσως τα πιο σημαντικά υλικά κατασκευής των ικριωμάτων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη μηχανική των ιστών, επειδή περιέχουν βιολειτουργικά μόρια, κατάλληλα για να αλληλεπιδράσουν τα κύτταρα με το ικρίωμα, και δεν εγείρουν κάποια ανοσολογική αντίδραση του οργανισμού. Μπορούν να αποικοδομηθούν ενζυματικά και τα προϊόντα τους δεν είναι τοξικά. Συνεπώς, το κολλαγόνο (και ειδικά το κολλαγόνο τύπου Ι), που είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στον ανθρώπινο οργανισμό, αποτελεί ένα φυσικό υπόστρωμα για τα περισσότερα είδη ιστών, πληρώντας παράλληλα τις παραπάνω προϋποθέσεις, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ευρέως ως βιοϋλικό στη μηχανική των ιστών, αλλά και ως υλικό επίστρωσης των εμφυτευμάτων. Το κύριο μειονέκτημα του συγκεκριμένου βιοϋλικού, που περιορίζει και τη χρήση του σε αυτόν τον 38

55 τομέα, είναι η δυσκολία διαφοροποίησης των μηχανικών ιδιοτήτων του. Κατά συνέπεια, το ερευνητικό ενδιαφέρον στράφηκε προς την τροποποίηση της κολλαγονούχας μήτρας με άλλα βιοσυμβατά υλικά με σκοπό τη βελτίωση των βιομηχανικών χαρακτηριστικών της. Μια άλλη κατηγορία βιοργανικών πολυμερών που θα ήταν κατάλληλη να χρησιμοποιηθεί στον συγκεκριμένο τομέα, καθώς δεν προκαλούν ανοσολογική απόκριση και απαντώνται ως φυσικό συστατικό του εξωκυττάριου χώρου σε όλους τους ζώντες οργανισμούς, είναι οι γλυκοζαμινογλυκάνες. Η δημιουργία χημικών δεσμών ή η ανάμειξη με κάποια γλυκοζαμινογλυκάνη βελτιώνει τα χαρακτηριστικά του υποστρώματος του κολλαγόνου και έτσι τα ικριώματα που παρασκευάζονται από κολλαγόνο και γλυκοζαμινογλυκάνη χαρακτηρίζονται από εξαιρετική βιοσυμβατότητα και βιοδιασπασιμότητα και χαμηλή ή μηδενική ανοσογονικότητα, μεγαλύτερη δυσκαμψία και σκληρότητα, ενώ μειώνεται ο ρυθμός διάσπασης του κολλαγόνου. Επιπλέον, το ικρίωμα αυτό που μοιάζει περισσότερο με τον μητρικό εξωκυττάριο χώρο, διευκολύνει την προσκόλληση των κυττάρων πάνω του και ενισχύονται οι διάφορες κυτταρικές διεργασίες (μετανάστευση, πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση κ.α.) [73, 74]. Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι η βαθύτερη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κολλαγόνου και γλυκοζαμινογλυκανών, θα βοηθούσε στο σχεδιασμό ενός ικριώματος με βέλτιστα χαρακτηριστικά. Είναι γνωστό ότι η παρουσία των πολυσακχαριτών μπορεί να τροποποιήσει τη διαδικασία της αυτο-οργάνωσης των ινιδίων στο κολλαγόνο. Πιο συγκεκριμένα, οι γλυκοζαμινογλυκάνες επηρεάζουν το ρυθμό σχηματισμού των ινιδίων και καθορίζουν τη διάμετρο και την απόσταση μεταξύ των ινιδίων στο υπόστρωμα του κολλαγόνου, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα τη μεταβολή των ιδιοτήτων του κολλαγόνου [75-77]. 2.2 Μέθοδοι μελέτης των αλληλεπιδράσεων γλυκοζαμινογλυκανώνπρωτεϊνών Αρκετές τεχνικές έχουν εφαρμοστεί για το χαρακτηρισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεϊνών, από τις οποίες οι πιο χαρακτηριστικές είναι οι εξής: χρωματογραφία συγγένειας, ηλεκτροφόρηση, ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, 39

56 φασματομετρία φθορισμού, διέγερση επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR), φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance, NMR), περίθλαση ακτίνων Χ και θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) [78-81]. Τα σύμπλοκα που έχουν μελετηθεί περισσότερο με βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία είναι εκείνα που παράγονται από τη θειική χονδροϊτίνη ή την ηπαρίνη και κάποια πρωτεΐνη. Η πιο διαδεδομένη τεχνική προσδιορισμού είναι εκείνη της χρωματογραφίας συγγένειας, στην οποία το ποσό του ρυθμιστικού διαλύματος που απαιτείται για την έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη είναι ένα ποσοτικό μέτρο της πρόσδεσης της από τη γλυκοζαμινογλυκάνη που βρίσκεται ακινητοποιημένη πάνω σε ένα στερεό υπόστρωμα [82, 83]. Η μέθοδος αυτή είναι κατάλληλη μόνο όταν η φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών είναι ηλεκτροστατική και δεν μπορεί να προσδιορίσει άλλα είδη αλληλεπιδράσεων, όπως ο σχηματισμός δεσμών υδρογόνου ή οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Στα μειονεκτήματα της περιλαμβάνονται το ότι είναι καταστροφική και απαιτείται κατεργασία του δείγματος πριν την ανάλυση, της οποίας η διάρκεια είναι μεγάλη. Η θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) είναι ιδιαίτερα χρήσιμη μέθοδος, καθώς, εκτός από την πρόσδεση, προσδιορίζει και τις θερμοδυναμικές παραμέτρους της πρόσδεσης μεταξύ μορίων [84]. Σε αυτήν την τεχνική, καταγράφεται η θερμότητα που εκλύεται μετά από κάθε προσθήκη μικρής ποσότητας του ενός συστατικού στο διάλυμα που περιέχει την άλλη ουσία και βρίσκεται μέσα σε μια θερμοστατούμενη κυψελίδα για να διατηρείται σταθερή η θερμοκρασία. Χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική, οι R.E. Hileman et al [85] παρατήρησαν τη δημιουργία δεσμού υδρογόνου μεταξύ της ηπαρίνης και ενός πεπτιδίου και τόνισαν τη συνεισφορά των πολικών πλευρικών ομάδων των κατάλοιπων αμινοξέων μέσω της δημιουργίας δεσμού υδρογόνου και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών και των γλυκοζαμινογλυκανών. Απαιτεί, όμως, αρκετή ποσότητα από κάθε είδος, ενώ είναι χρήσιμη μόνο όταν οι σταθερές σύνδεσης είναι της τάξεως του 10 4 έως Η φασματοσκοπία NMR είναι μία αρκετά διαδεδομένη τεχνική που προσφέρει πολύτιμες δομικές πληροφορίες. Χαρακτηρίζει τις αλλαγές στη διαμόρφωση που συμβαίνουν κατά την 40

57 αλληλεπίδραση, καθώς και τα σημεία όπου παρατηρείται η αλληλεπίδραση μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πεπτιδίων, προσφέροντας έτσι μια λεπτομερή εικόνα του τρόπου αλληλεπίδρασης των δύο μορίων. Η φασματοσκοπία NMR αποτελεί μια αρκετά ευαίσθητη μέθοδο για τη μελέτη δεσμών υδρογόνου και χρησιμοποιήθηκε από τον J.H. Bae και τους συνεργάτες του [86] για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης της ηπαρίνης με ένα συνθετικό πεπτίδιο, ανάλογο της αντιθρομβίνης ΙΙΙ. Τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν το σχηματισμό δεσμού υδρογόνου μεταξύ της τυροσίνης και των Ν-ακετυλο ομάδων της γλυκοζαμινογλυκάνης [86]. Η μικρή ευαισθησία της μεθόδου, καθώς απαιτεί μεγάλες ποσότητες από τα είδη που μελετώνται και σε υψηλές συγκεντρώσεις, δημιουργεί προβλήματα διαλυτότητας και δυσκολεύει την ακριβή μέτρηση της σταθεράς σύνδεσης. Μία ακόμη ευαίσθητη μέθοδος με την οποία μπορούν να προσδιοριστούν αλλαγές που συμβαίνουν στη διαμόρφωση της πρωτεΐνης όταν αλληλεπιδράσει με κάποια γλυκοζαμινογλυκάνη είναι η φασματοσκοπία φθορισμού [86]. Με τη συγκεκριμένη τεχνική οι αλλαγές γίνονται αντιληπτές μέσω της αλλαγής του φθορισμού χαρακτηριστικών ενδογενών φθορίζουσων χρωμοφόρων ομάδων, όπως αυτές που περιέχουν τα αρωματικά αμινοξέα τυροσίνη και τρυπτοφάνη. Παράλληλα, μπορεί να μετρηθεί η σταθερά σύνδεσης με παρακολούθηση της αλλαγής του φθορισμού κατά την τιτλοδότηση του ενός είδους που αλληλεπιδρά με διάλυμα του άλλου είδους. Η εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου περιορίζεται μόνο σε περιπτώσεις όπου η πρόσδεση της γλυκοζαμινογλυκάνης με την πρωτεΐνη προκαλεί αλλαγή στον φθορισμό, ενώ η παραγωγοποίηση της γλυκοζαμινογλυκάνης με μια εξωγενή φθορίζουσα χρωμοφόρο ομάδα ίσως διαταράξει τη διαμόρφωσή της και την αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη. Οι M.K. Lee και A.D. Lander [87] ανέπτυξαν μια ηλεκτροφορητική τεχνική για τη μέτρηση της σταθεράς που χαρακτηρίζει την πρόσδεση πρωτεΐνης-γλυκοζαμινογλυκάνης, αλλά και για την αποσαφήνιση δομικής εκλεκτικότητας κατά την πρόσδεση της πρωτεΐνης στη γλυκοζαμινογλυκάνη. Η μέθοδος αυτή απαιτεί μικρές ποσότητες δείγματος και είναι ικανή να προσδιορίσει τη σταθερά συγγένειας ακόμα και όταν η διάσταση συμβαίνει γρήγορα, δηλαδή σε περιπτώσεις όπου η σταθερά έχει χαμηλές τιμές. 41

58 Δύο ακόμα τεχνικές που παρέχουν δομικές πληροφορίες είναι η περίθλαση ακτίνων Χ και η φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού (Circular Dichroism, CD). Η τελευταία στηρίζεται στην ικανότητα των ασύμμετρων ουσιών να απορροφούν σε διαφορετικό βαθμό το αριστερόστροφο και το δεξιόστροφο κυκλικά πολωμένο φως και αποτελεί εξαιρετικό εργαλείο όχι μόνο για την ανάλυση της δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών, αλλά και των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών με διάφορα μόρια [88]. Η περίθλαση ακτίνων Χ, παρ όλο που είναι μη καταστρεπτική για το δείγμα, απαιτεί μεγάλες ποσότητες των ουσιών, οι οποίες πρέπει να είναι κρυσταλλικές. Με την τεχνική της διέγερσης επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR) είναι δυνατή η μελέτη της κινητικής των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών και γλυκοζαμινογλυκανών σε πραγματικό χρόνο [89]. Η αλληλεπίδραση αλλάζει τον δείκτη διάθλασης του μεταλλικού υμενίου πάνω στο οποίο βρίσκεται προσροφημένη η μία ουσία και το μέγεθος της αλλαγής αυτής είναι ανάλογο προς τη μάζα του συστατικού που προσδένεται. Μέσω της μέτρησης των ρυθμών πρόσδεσης και διάστασης μπορεί να υπολογιστεί η σταθερά διάστασης. 2.3 Είδη αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου Έχουν εφαρμοστεί διάφορες μέθοδοι για τον προσδιορισμό του είδους της αλληλεπίδρασης μεταξύ των συγκεκριμένων ουσιών. Ο M.B. Matthews το 1965 [90] χρησιμοποιώντας την τεχνική της ηλεκτροφόρησης διαπίστωσε τη δημιουργία ενός αναστρέψιμου συμπλόκου μεταξύ του κολλαγόνου και υαλουρονικού οξέος ή ηπαρίνης ή θειικής χονδροϊτίνης, η σταθερότητα του οποίου εξαρτάται κυρίως από τις ιονικές αλληλεπιδράσεις και το μέγεθος του μορίου του πολυσακχαρίτη. Μερικά χρόνια αργότερα, οι R.A. Gelman και J. Blackwell [91], προσπαθώντας να εξερευνήσουν τη φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κολλαγόνου και πολυσακχαριτών, μελέτησαν με τη φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού (CD) μίγματα πολυ(l-λυσίνης) με 4- και 6- θειική χονδροϊτίνη σε υδατικό διάλυμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το πολυπεπτίδιο στο μίγμα αποκτά τη διαμόρφωση α-έλικας, αντί για τη διαμόρφωση τυχαίας σπείρας (random coil) που παρατηρείται απουσία της γλυκοζαμινογλυκάνης, γεγονός που μαρτυρά την 42

59 ύπαρξη ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ανιονικού πολυσακχαρίτη και των θετικά φορτισμένων ε-αμινομάδων της πολυ(l-λυσίνης). Επειδή στο μίγμα με την 4-θειική χονδροϊτίνη, μόνο το 20% του πολυπεπτιδίου παίρνει τη διαμόρφωση α-έλικας, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η αλληλεπίδραση με την 4-θειική χονδροϊτίνη είναι ασθενέστερη απ ότι με την 6-θειική χονδροϊτίνη [92]. Κάτι αντίστοιχο παρατήρησαν και στην εργασία τους για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ηπαρίνης και των κατιονικών πολυπεπτιδίων πολυ(l-λυσίνη), πολύ(l-αργινίνη) και πολυ(l-ορνιθίνη), τα οποία αποκτούν τη διαμόρφωση α- έλικας παρουσία ηπαρίνης, ενώ το πολυπεπτίδιο μόνο του κάτω από τις ίδιες συνθήκες εμφανίζει τη διαμόρφωση charged coil [93]. Επίσης, έρευνα σε μη-θειωμένους πολυσακχαρίτες έδειξε ότι η σουλφομάδα, μαζί με την καρβοξυλομάδα, είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση, το οποίο βρίσκεται σε συμφωνία με το ότι η σουλφομάδα είναι απαραίτητη για την πρόσδεση κατιόντων σε διάφορους πολυσακχαρίτες. Το συγκεκριμένο είδος της αλληλεπίδρασης μεταξύ της 4-θειικής χονδροϊτίνης και μιας πρωτεογλυκάνης θειικής χονδροϊτίνης με το κολλαγόνο παρατηρήθηκε με χρωματογραφία της γλυκοζαμινογλυκάνης και της πρωτεογλυκάνης πάνω σε στήλη από gel κολλαγόνου από τους B. Obrink και A. Wasteson [94]. Η πρόσδεση μεταξύ των δύο μακρομορίων ήταν σημαντική σε φυσιολογικές συνθήκες, ενώ αυξήθηκε με αύξηση του ph και της ιονικής ισχύος. Ο B. Obrink το 1972 [95] χρησιμοποίησε μια τεχνική σκέδασης του φωτός για τη συλλογή πληροφοριών σχετικά με τη φύση της αλληλεπίδρασης που λαμβάνει χώρα μεταξύ του κολλαγόνου και γλυκοζαμινογλυκανών σε συνθήκες ιονικής ισχύος παρόμοιες με αυτές που υπάρχουν in vivo. Στο κολλαγόνο προσδέθηκαν 4-θειική χονδροϊτίνη, θειική δερματάνη, θειική ηπαράνη και ηπαρίνη, καθώς και πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης και θειικής δερματάνης. Το σύμπλεγμα που δημιουργήθηκε ήταν ιονικής φύσεως. Θειική κερατάνη δεν προσδέθηκε στο κολλαγόνο, υποδεικνύοντας είτε ότι το ουρονικό οξύ είναι απαραίτητο για την αλληλεπίδραση είτε ότι απαιτείται πυκνότητα φορτίου μεγαλύτερη από ένα αρνητικό φορτίο ανά δισακχαρίτη. Πολυσακχαρίτες που περιείχαν L-ιδουρονικό οξύ παρουσίασαν πιο ισχυρή ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση από εκείνους που περιείχαν μόνο D-γλυκουρονικό 43

60 οξύ. Το υαλουρονικό οξύ δεν προσδέθηκε σε σημαντικό βαθμό στο κολλαγόνο, λόγω αμοιβαίων στερεοχημικών παρεμποδίσεων μεταξύ τους. Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκαν αναλυτικές μέθοδοι για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πεπτιδίων που βασίζονται σε φασματοσκοπικές τεχνικές ανάλυσης και πιο συγκεκριμένα στη φασματοσκοπία Raman και στη φασματοσκοπία υπερύθρου. Ο A.R. Ishwar και η ομάδα του [96] εφάρμοσαν τη φασματοσκοπία Raman και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (CE) για να αναγνωρίσουν τα χημικά είδη που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ ενός συνθετικού πεπτιδίου και της ηπαρίνης ή της 6-θειικής χονδροϊτίνης, καθώς και τις αλλαγές στη διαμόρφωση που υπόκεινται για να λάβει χώρα η πρόσδεση μεταξύ τους. Τα αποτελέσματά τους έδειξαν ότι η τυροσίνη σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου μέσω των υδροξυλίων της, ενώ οι μετατοπίσεις στους κυματάριθμους όπου αναμένονται οι δονήσεις του αμιδίου Ι του πεπτιδίου και των σουλφομάδων της αντίστοιχης γλυκοζαμινογλυκάνης δείχνουν ότι έλαβαν χώρα αλλαγές στη διαμόρφωση των ομάδων αυτών [96]. Ο H.L. Tian και οι συνεργάτες του [97] επέλεξαν τη φασματοσκοπία υπερύθρου για τη μελέτη ομογενοποιημένων μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου με διάφορες αναλογίες και για τον προσδιορισμό τόσο των ειδικών αλληλεπιδράσεων που λαμβάνουν χώρα μεταξύ του κολλαγόνου και της θειικής χονδροϊτίνης όσο και των αλλαγών στη διαμόρφωση του κολλαγόνου. Διαπίστωσαν ότι η αναλογία μεταξύ των δύο ουσιών στο μίγμα επηρεάζει τα είδη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δύο ουσιών. Όταν το ποσοστό της θειικής χονδροϊτίνης στο μίγμα είναι λιγότερο από 50% w/w, τα υδροξύλια της θειικής χονδροϊτίνης σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τα καρβοξύλια του κολλαγόνου, ενώ όταν υπερβεί αυτό το ποσοστό, τα καρβοξύλια ή οι θειικές ομάδες αλληλεπιδρούν ηλεκτροστατικά με την ε-αμινομάδα της λυσίνης ή της αργινίνης που περιέχονται στο μόριο του κολλαγόνου. 44

61 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου αποκτά συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον, εφόσον τα δύο αυτά βιομόρια είναι ιδιαίτερης σημασίας σε βασικές βιολογικές διεργασίες, ενώ ο ρόλος τους και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις είναι εξίσου σημαντικός. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των γλυκοζαμινογλυκανών περιλαμβάνουν την απομόνωσή τους από ιστούς, κύτταρα ή βιολογικά υγρά, την ενζυμική κατεργασία ώστε να απελευθερωθούν από τις πρωτεογλυκάνες στις οποίες είναι προσδεδεμένες και στη συνέχεια το διαχωρισμό τους με βιοχημικές μεθόδους, όπως υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) και τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (Capillary Electrophoresis, CE) [65, ]. Τα προηγούμενα χρόνια έχουν γίνει σημαντικές προσπάθειες μελέτης της φύσης των αλληλεπιδράσεων γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεϊνών/πεπτιδίων, συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου, με πληθώρα τεχνικών, όπως χρωματογραφία συγγένειας, ηλεκτροφόρηση, φασματομετρία φθορισμού, διέγερση επιφανειακών πλασμονίων (SPR), φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), περίθλαση ακτίνων Χ και θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (ITC) [78, 79]. Οι περισσότερες από τις τεχνικές αυτές προσφέρουν πληροφορίες για ένα είδος αλληλεπίδρασης και παρά τα πλεονεκτήματά τους, κύριο μειονέκτημά τους αποτελεί το γεγονός ότι δεν μπορούν να αναγνωρίσουν ειδικούς χημικούς δεσμούς. Στα μειονεκτήματα των παραπάνω τεχνικών προστίθενται ο μεγάλος χρόνος ανάλυσης και η καταστροφή του δείγματος. Η παρούσα εργασία αναφέρεται στη χρήση της φασματοσκοπίας Raman για το δομικό χαρακτηρισμό των γλυκοζαμινογλυκανών και των αλληλεπιδράσεων τους με το κολλαγόνο. Η συγκεκριμένη τεχνική, που χρησιμοποιείται ευρέως στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση, προσφέρει τη δυνατότητα διερεύνησης της μοριακής δομής και των χημικών δεσμών στο εξεταζόμενο δείγμα. Επιπλέον, η φασματοσκοπία Raman είναι μια τεχνική με σημαντικά πλεονεκτήματα. Δίνει γρήγορα αποτελέσματα, είναι μη-καταστροφική και απαιτεί ελάχιστη 45

62 ποσότητα και προετοιμασία του δείγματος. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μελέτη στερεών, υγρών και βιολογικών δειγμάτων. 46

63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο 3 Χρησιμοποιούμενες Τεχνικές Χαρακτηρισμού 3.1 Εισαγωγή στις Φασματοσκοπικές Τεχνικές Ανάλυσης Οι φασματοσκοπικές τεχνικές ανάλυσης αποτελούν μια κατηγορία των οπτικών τεχνικών ανάλυσης που ασχολούνται με την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που πηγάζει από μια ουσία ή αλληλεπιδρά με αυτή και παρέχει πληροφορίες για τα συστατικά του δείγματος. Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει τις τεχνικές που βασίζονται στην ικανότητα αλληλεπίδρασης της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με τα μόρια του δείγματος και μέτρησης της έντασης της ακτινοβολίας. Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία είναι μια μορφή ενέργειας που διαθέτει σωματιδιακές και κυματικές ιδιότητες. Με άλλα λόγια, μια δέσμη φωτός αποτελείται από διακριτά σωματίδια (φωτόνια) που φέρουν ενέργεια και ορμή και η ενέργεια είναι ανάλογη προς τη συχνότητα της ακτινοβολίας. Η ενέργεια του κάθε φωτονίου δίνεται από τη σχέση του Planck: E-hv=hc/λ=hcv όπου h: η σταθερά του Planck, c: η ταχύτητα διάδοσης του φωτός, λ: το μήκος κύματος, v: ο κυματάριθμος (το αντίστροφο του μήκους κύματος στο κενό). Όταν η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία αλληλεπιδράσει με ένα άτομο ή μόριο, τέσσερις διεργασίες είναι δυνατό να λάβουν χώρα: σκέδαση, απορρόφηση, εκπομπή και φωταύγεια (φθορισμός ή φωσφορισμός). Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα περιλαμβάνει μια ευρεία περιοχή συχνοτήτων ή μηκών κύματος που καλύπτουν τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα και απεικονίζεται στην εικόνα 3.1. Στην περιοχή αυτή που κυμαίνεται από 10 m έως 1 pm, συναντώνται τα ραδιοκύματα, τα μικροκύματα, το υπεριώδες, το ορατό και το υπέρυθρο φως, οι ακτίνες Χ και οι ακτίνες γ. Παρ όλο που η φύση της ακτινοβολίας είναι ίδια σε όλη την έκταση του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος, παρατηρούνται διαφορές στα μήκη κύματος και στην ενέργεια των παραγόμενων ακτινοβολιών, καθώς και στα φαινόμενα που προκαλούν στην ύλη στην οποία προσπίπτουν. 47

64 Εικόνα 3.1. Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Τη βάση των διαφόρων φασματοσκοπικών τεχνικών αποτέλεσαν οι πυρηνικές, ατομικές ή μοριακές μεταβολές που χαρακτηρίζουν κάθε περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος και οδηγούν σε μεταβολές στις κβαντισμένες ενεργειακές καταστάσεις των ατόμων και των μορίων. Συγκεκριμένα, στην περιοχή των ραδιοκυμάτων, μετριέται η ενεργειακή μεταβολή του spin των πυρήνων και των ηλεκτρονίων που βρίσκονται σε μαγνητικό πεδίο, ενώ στην περιοχή των μικροκυμάτων, η περιστροφή των μορίων είναι εκείνη που προκαλεί την απορρόφηση ή εκπομπή ακτινοβολίας. Στην ορατή και υπεριώδη περιοχή του φάσματος, τα ηλεκτρόνια σθένους διεγείρονται σε ανώτερες ενεργειακές στάθμες, ενώ στην υπέρυθρη περιοχή προκαλούνται περιστροφικές και δονητικές μεταπτώσεις των ατόμων και των μορίων. Στην περιοχή των ακτίνων Χ, οι ενεργειακές μεταβολές αφορούν τα εσωτερικά ηλεκτρόνια, ενώ στην περιοχή των ακτίνων γ παρατηρούνται ανακατατάξεις των πυρηνικών σωματιδίων. 3.2 Είδη μοριακών δονήσεων στις Φασματοσκοπικές Τεχνικές Ανάλυσης Οι σχετικές θέσεις των ατόμων σε ένα μόριο δεν είναι απόλυτα καθορισμένες, αλλά αλλάζουν συνεχώς λόγω των διαφορετικών ειδών δονήσεων και περιστροφών του μορίου. Ο 48

65 θεωρητικός αριθμός των βασικών δονήσεων που εκτελεί ένα μόριο είναι συνάρτηση τόσο του αριθμού των ατόμων όσο και της γεωμετρίας του και υπολογίζεται από τις εξισώσεις: Αριθμός βασικών δονήσεων= 3Ν-6, όταν πρόκειται για μη γραμμικό μόριο Αριθμός βασικών δονήσεων= 3Ν-5, όταν το μόριο είναι γραμμικό όπου το Ν αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ατόμων που περιέχονται στο μόριο. Δύο είναι οι βασικές μορφές δονήσεων που εκτελεί ένα μόριο: δονήσεις έκτασης (stretching) δονήσεις κάμψης (bending) Στις δονήσεις έκτασης η δόνηση γίνεται κατά μήκος του δεσμού που συνδέει τα δονούμενα άτομα και μεταβάλλεται συνεχώς η μεταξύ τους απόσταση. Η δόνηση έκτασης μπορεί να είναι συμμετρική ή ασύμμετρη. Στη συμμετρική δόνηση έκτασης συμπίπτουν τα κέντρα θετικού και αρνητικού φορτίου σε κάθε δονητική θέση και δεν είναι ενεργή στο υπέρυθρο, αφού δεν υπάρχει μεταβολή στη διπολική ροπή. Οι δονήσεις έκτασης απαιτούν γενικά μεγαλύτερες ενέργειες σε σχέση με τις δονήσεις κάμψεως. Εικόνα 3.2. Οι δονήσεις έκτασης. 49

66 Οι δονήσεις κάμψης χαρακτηρίζονται από συνεχή μεταβολή της γωνίας που σχηματίζουν δύο δεσμοί και μπορούν να διακριθούν σε τέσσερα είδη: i. ψαλιδοειδής (scissoring), η οποία λαμβάνει χώρα όταν δύο μη συνδεόμενα άτομα κινούνται μπρος και πίσω από τη μεταξύ τους διεύθυνση ii. iii. iv. λικνιζόμενη (rocking), η οποία συμβαίνει όταν η μη γραμμική μονάδα τριών ατόμων πάλλεται εντός του επιπέδου ισορροπίας παλλόμενη (wagging), η οποία παρατηρείται όταν μια μη γραμμική δομική μονάδα πάλλεται εντός του επιπέδου ισορροπίας που δημιουργείται από τα άτομα και τους δυο δεσμούς συστρεφόμενη (twisting), η οποία παράγεται όταν η δομική μονάδα περιστρέφεται γύρω από το δεσμό που τη συνδέει με το υπόλοιπο τμήμα του μορίου Εικόνα 3.3. Οι δονήσεις κάμψης. Το (+) δείχνει κίνηση μπροστά από το επίπεδο και το (-) πίσω από το επίπεδο. 3.3 Φασματοσκοπία Raman Πρόκειται για μια ειδική φασματοσκοπική τεχνική που στηρίζεται στο φαινόμενο σκέδασης μιας δέσμης φωτός προς όλες τις κατευθύνσεις, καθώς διέρχεται από ένα διαπερατό υλικό. Το 50

67 φαινόμενο αυτό είχε αρχικά προβλεφθεί θεωρητικά από τον A.G. Smecal το 1923 και τους Kramers και Heisenberg το Όμως, ο Sir C.V. Raman ήταν εκείνος που ανακάλυψε ότι ένα μικρό κλάσμα της ακτινοβολίας σκεδάζεται από ορισμένα μόρια σε διαφορετικό μήκος κύματος από εκείνο της προσπίπτουσας ακτινοβολίας και απέδειξε ότι οι μεταβολές του μήκους κύματος εξαρτώνται από τη χημική δομή των μορίων που προκαλούν τη σκέδαση. Όταν μια μονοχρωματική δέσμη ακτινοβολίας προσπίπτει πάνω σε ένα δείγμα, η προσπίπτουσα ακτινοβολία σκεδάζεται προς τυχαίες κατευθύνσεις. Κατά το μεγαλύτερο ποσοστό, η σκέδαση είναι ελαστική, δηλαδή η ακτινοβολία σκεδάζεται στο ίδιο μήκος κύματος με εκείνο της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Ένα μικρό ποσοστό, όμως, της ακτινοβολίας (περίπου το 0,001%) σκεδάζεται σε διαφορετικό μήκος κύματος (ανελαστική σκέδαση). Αυτή η μεταβολή στο μήκος κύματος παρέχει τις πληροφορίες για τη χημική δομή των μορίων και αποτελεί τη βάση της φασματοσκοπίας Raman. Παρατηρώντας ένα φάσμα Raman, μπορούν να διακριθούν τρία είδη εκπεμπόμενης ακτινοβολίας: η σκέδαση Stokes, η σκέδαση anti-stokes και η σκέδαση Rayleigh, από τις οποίες πιο ισχυρή είναι η τελευταία, επειδή το μήκος κύματος είναι ακριβώς το ίδιο με εκείνο της πηγής. Σε γενικές γραμμές, οι κορυφές Stokes έχουν μεγαλύτερη ένταση από τις αντίστοιχες κορυφές anti-stokes και γι αυτό το λόγο χρησιμοποιείται συνήθως το τμήμα με τις κορυφές Stokes για τη μελέτη ενός φάσματος Raman. Οι κορυφές anti-stokes είναι περισσότερο χρήσιμες σε περιπτώσεις όπου το δείγμα φθορίζει, καθώς δεν προκαλούνται παρεμποδίσεις στην παρατήρηση των μετατοπίσεων των κορυφών αυτών. Το μέγεθος των κορυφών Raman είναι ανεξάρτητο από το μήκος κύματος του laser που χρησιμοποιείται για τη διέγερση. Η αλληλεπίδραση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με ένα μόριο μπορεί να οδηγήσει σε δύο τύπους σκέδασης Raman, την ελαστική και την ανελαστική σκέδαση Raman. Στον πρώτο τύπο σκέδασης, δεν παρατηρείται μεταβολή στο μήκος κύματος ή στην ενέργεια του φωτονίου, ενώ αντίθετα, η ανελαστική σκέδαση Raman συνοδεύεται από μετατόπιση του μήκους κύματος ή μεταβολή της ενέργειας του φωτονίου. Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται ο μηχανισμός σκέδασης όταν ένα μόριο ακτινοβολείται με μονοχρωματική ακτινοβολία. 51

68 Εικόνα 3.4. Ενεργειακές μεταβολές ενός μορίου που παρατηρούνται κατά το φαινόμενο Raman. Μόλις αλληλεπιδράσει το μόριο με ένα φωτόνιο από την πηγή, η ενέργειά του μεταβάλλεται και η μεταβολή αυτή είναι ίση με την ενέργεια του φωτονίου, η οποία δίνεται από τον τύπο E=hv, όπου h είναι η σταθερά του Planck και v η συχνότητα. Το μόριο μπορεί να διεγερθεί από τη θεμελιώδη στάθμη σε μία εικονική ηλεκτρονιακή κατάσταση και να επανέλθει μετά στην ίδια ενεργειακή στάθμη με ταυτόχρονη σκέδαση ενός φωτονίου ίσης ενέργειας με του προσπίπτοντος. Αυτή η σκέδαση είναι η σκέδαση Rayleigh, στην οποία δεν παρατηρείται απώλεια ενέργειας και οι συγκρούσεις μεταξύ του μορίου και του φωτονίου χαρακτηρίζονται ως ελαστικές. Είναι δυνατό, επίσης, το μόριο, μετά τη μετάπτωση προς τη θεμελιώδη κατάσταση, να βρεθεί σε κάποιο δονητικό επίπεδο υψηλότερης ενέργειας και η μετάπτωση αυτή να συνοδεύεται από τη σκέδαση ενός φωτονίου μικρότερης ενέργειας από εκείνη του προσπίπτοντος. Αυτή η μεταβολή ενέργειας είναι ίση με 52

69 την ενεργειακή διαφορά των επιπέδων της αρχικής και της τελικής κατάστασης του μορίου. Αυτός ο τύπος ανελαστικής σκέδασης ονομάζεται εκπομπή Stokes. Η τελευταία και πιο σπάνια περίπτωση σκέδασης περιλαμβάνει τη μετάπτωση σε δονητικό επίπεδο χαμηλότερης ενέργειας από αυτό που βρισκόταν αρχικά, προκαλώντας τη σκέδαση ενός φωτονίου με μεγαλύτερη ενέργεια από το προσπίπτον. Ομοίως, η ενεργειακή μεταβολή αντιστοιχεί στην ενεργειακή διαφορά μεταξύ των δονητικών επιπέδων. Αυτή η περίπτωση σκέδασης είναι η εκπομπή anti-stokes [101]. Σε γενικές γραμμές, η εκπομπή Stokes είναι πιθανότερη από την anti-stokes, ενώ η σκέδαση Rayleigh έχει μεγαλύτερη πιθανότητα να συμβεί σε σχέση με τη σκέδαση Raman. Κύρια προϋπόθεση για να είναι μία δόνηση ενεργή κατά Raman αποτελεί η μεταβολή της πολωσιμότητας του μορίου, δηλαδή μια στιγμιαία παραμόρφωση της κατανομής των ηλεκτρονίων γύρω από ένα δεσμό, που ακολουθείται από επανεκπομπή της ακτινοβολίας, καθώς ο δεσμός επιστρέφει στην κανονική κατάσταση Οργανολογία Δύο είναι οι κύριοι τύποι οργάνων που χρησιμοποιούνται στη συλλογή φασμάτων Raman: τα όργανα διασποράς και το φασματοφωτόμετρο Raman με μετασχηματισμό Fourier, τα οποία διαφέρουν ως προς τη χρησιμοποιούμενη πηγή laser και στον τρόπο με τον οποίο η ακτινοβολία σκεδάζεται και ανιχνεύεται. Ένα φασματόμετρο Raman αποτελείται από τέσσερα κυρίως μέρη: 1. από την πηγή laser 2. σύστημα οπτικών που κατευθύνουν την ακτινοβολία στο δείγμα και συλλέγουν τη σκεδαζόμενη ακτινοβολία 3. έναν μονοχρωμάτορα ή ένα ιντερφερόμετρο 4. έναν ανιχνευτή 53

70 Εικόνα 3.5. Γενικό διάγραμμα των συστατικών ενός φασματόμετρου Raman. Επειδή η ένταση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας είναι ασθενής και η ποιότητα των κορυφών επηρεάζεται από τη σταθερότητα της πηγής διέγερσης, απαιτείται για τη διέγερση μια πηγή laser συνεχούς λειτουργίας με αρκετά μεγάλη ένταση ακτινοβολίας και με σταθερό μήκος κύματος. Μερικά από τις συνηθισμένα laser που χρησιμοποιούνται στη φασματοσκοπία Raman είναι τα laser ιόντων αργού και κρυπτού, τα οποία εκπέμπουν στα 514,5 nm και 647,1 nm αντίστοιχα. Τα τελευταία χρόνια, όμως, χρησιμοποιούνται συχνότερα πηγές laser που εκπέμπουν στην ορατή και στην περιοχή εγγύς υπερύθρου του φάσματος, όπως η πηγή laser διόδου στα 785 nm και η πηγή Nd/YAG στα 1064 nm. Οι πηγές αυτές μπορούν να λειτουργήσουν σε μεγάλη ισχύ χωρίς να φωτοδιασπαστεί το δείγμα και προκαλούν ελάχιστο ή καθόλου φθορισμό του δείγματος. Με τον τρόπο αυτό περιορίζεται αρκετά και η διάχυση Rayleigh. Κατάλληλοι φακοί εστιάζουν την ακτινοβολία που προέρχεται από την πηγή στο δείγμα και κατευθύνουν την ακτινοβολία που σκεδάζεται από αυτό στο φασματόμετρο. Ο μονοχρωμάτορας αποτελείται από ένα πρίσμα χαλαζία ή φράγμα περίθλασης. Στη συνέχεια, διέρχεται διαμέσου ειδικών φίλτρων πριν την είσοδό της στο φασματογράφο, τα οποία έχουν 54

71 επιλεχθεί με βάση το μήκος κύματος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Τα φίλτρα αυτά απομακρύνουν τη σκεδαζόμενη ακτινοβολία Rayleigh και επιτρέπουν τη διέλευση και ανίχνευση μόνο του ποσοστού εκείνου της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας με μήκος κύματος μεγαλύτερο από εκείνο της πηγής, δηλαδή εκείνου του ποσοστού που υπέστη σκέδαση Stokes. Ο ανιχνευτής παράγει ηλεκτρικό σήμα ανάλογα με την ένταση της ακτινοβολίας και αυτό το σήμα καταγράφεται, μετά από ενίσχυση, στον υπολογιστή με τη μορφή φάσματος που δείχνει την ένταση του ανελαστικά σκεδαζόμενου φωτός συναρτήσει της μετατόπισης του κυματάριθμου. Τα φάσματα μπορούν στη συνέχεια να υποστούν επεξεργασία στον υπολογιστή και να ερμηνευθούν σύμφωνα με τη βάση δεδομένων. Ο ανιχνευτής σύζευξης φορτίου (CCD) είναι ένας από τους ανιχνευτές που χρησιμοποιείται ευρέως για τις μετρήσεις της σκέδασης Raman στα όργανα διασποράς λόγω της υψηλής ευαισθησίας σε ασθενή σήματα και των χαμηλών ορίων ανίχνευσης που προσφέρει. Επιπλέον, η υψηλή κβαντική απόδοση της διάταξης αυτής έχει ως αποτέλεσμα ο χρόνος που απαιτείται για την καταγραφή των δεδομένων να είναι μειωμένος, καλύπτοντας ταυτόχρονα μια εκτεταμένη φασματική περιοχή. Ο ανιχνευτής CCD είναι ευαίσθητος στην ακτινοβολία μήκους κύματος 785 nm που παράγεται από laser διόδου, όχι όμως και στην ακτινοβολία των 1064 nm. Το φασματόμετρο Raman με μετασχηματισμό Fourier περιέχει ένα συμβολόμετρο παρόμοιο με εκείνο που χρησιμοποιείται στα όργανα υπερύθρου και θα περιγραφεί σε επόμενη ενότητα. Ως πηγή διέγερσης σε αυτού του τύπου τα όργανα χρησιμοποιείται το laser Nd:YAG που εκπέμπει στα 1064 nm. Το όργανο FT-Raman είναι εξοπλισμένο με έναν φωτοαγώγιμο ανιχνευτή γερμανίου ψυχόμενο με υγρό άζωτο. Τα ειδικά ολογραφικά φίλτρα συμβολής, που ονομάζονται φίλτρα εγκοπής, ή ένας μονοχρωμάτορας επιτρέπουν να φτάσει στον ανιχνευτή ακτινοβολία με μήκη κύματος μεγαλύτερα από εκείνο της πηγής, δηλαδή απορρίπτουν τη σκεδαζόμενη ακτινοβολία Rayleigh [102]. 55

72 Εικόνα 3.6. Σχηματική παράσταση ενός φασματομέτρου Raman με μετασχηματισμό Fourier. Εικόνα 3.7. Σχηματική παράσταση ενός φασματομέτρου Raman διασποράς. 56

73 Φασματόμετρο micro-raman Τα φασματόμετρα Raman διασποράς μπορούν να συζευχθούν με ένα μικροσκόπιο ή με έναν καθετήρα οπτικών ινών. Ο αντικειμενικός φακός του οπτικού μικροσκοπίου βοηθά σε μια περισσότερο λεπτομερή παρατήρηση του δείγματος και προσφέρει τη δυνατότητα εστίασης του laser και τη συλλογή των χημικών πληροφοριών σε συγκεκριμένες περιοχές του δείγματος. Εικόνα 3.8. Φασματόμετρο Raman συζευγμένο με οπτικό μικροσκόπιο. Με τη χρήση καθετήρα οπτικών ινών η ορατή ή εγγύς υπέρυθρη ακτινοβολία μπορεί να διαδοθεί σε βάθος στο δείγμα. Το laser διέγερσης εστιάζεται μέσω του φακού ενός οπτικού μικροσκοπίου στην είσοδο της δεσμίδας των οπτικών ινών (ίνες εισόδου) και η ακτινοβολία μεταφέρεται στο άλλο άκρο τους, το οποίο είναι βυθισμένο στο δείγμα. Οι ίνες συλλογής μεταφέρουν την ακτινοβολία που σκεδάστηκε στον μονοχρωμάτορα [102]. Το συγκεκριμένο σύστημα δειγματοληψίας χρησιμοποιείται για την άμεση συλλογή φασμάτων όταν οι συνθήκες δειγματοληψίας είναι δύσκολες. Επιπλέον, η σύζευξη του φασματόμετρου Raman με 57

74 καθετήρα οπτικών ινών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την άντληση βιοχημικών πληροφοριών από ένα δείγμα in vivo [103] Εφαρμογές Τα ποικίλα πλεονεκτήματα της φασματοσκοπίας Raman ευθύνονται και για το πλήθος εφαρμογών της σε πολλούς κλάδους της επιστήμης. Πρόκειται για μια μη-καταστροφική τεχνική που παρέχει ποιοτικές και ποσοτικές πληροφορίες για τη σύσταση των μορίων ενός δείγματος με μεγάλη ακρίβεια. Μπορεί να εφαρμοστεί τόσο σε στερεά όσο και σε υγρά δείγματα, καθώς το ύδωρ δεν προκαλεί παρεμπόδιση στη μέτρηση, ενώ είναι δυνατή η συλλογή φάσματος από πολύ μικρό δείγμα. Ο χειρισμός του δείγματος είναι πολύ απλός και δεν απαιτείται ιδιαίτερη προκατεργασία του δείγματος. Με βάση τα χαρακτηριστικά αυτά, η φασματοσκοπία Raman είναι κατάλληλη και για τη μελέτη βιολογικών συστημάτων. Η φασματοσκοπία Raman εφαρμόζεται και για ποσοτικές αναλύσεις, δεδομένου ότι οι κορυφές των φασμάτων Raman είναι οξείες και η ένταση μιας κορυφής Raman είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της δραστικής ουσίας. ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Οι μέθοδοι της θερμικής ανάλυσης προσδιορίζουν μια φυσική ιδιότητα ή τα προϊόντα αντίδρασης μιας ένωσης ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, η οποία μεταβάλλεται με συγκεκριμένο τρόπο. Με τις συγκεκριμένες μεθόδους, μπορούν να μελετηθούν εκτός από ιδιότητες των ουσιών, όπως ενθαλπία, χωρητικότητα, και μεταβολές φάσεων, όπως τήξη, κρυστάλλωση, αλλοτροπικές μορφές. 3.4 Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC) Είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη θερμική τεχνική. Στη διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC), το υπό μελέτη δείγμα και το δείγμα 58

75 αναφοράς υποβάλλονται σε ελεγχόμενο πρόγραμμα αύξησης της θερμοκρασίας και καταγράφεται η διαφορά ροής της θερμότητας προς τις δύο ουσίες ως συνάρτηση της θερμοκρασίας του δείγματος. Όταν το υλικό υφίσταται κάποια αλλαγή φάσης (τήξη, κρυστάλλωση, υαλώδης μετάπτωση κ.α.) ή αντιδρά, εκλύεται ή απορροφάται θερμότητα. Τα θερμικά φαινόμενα που έλαβαν χώρα παρουσιάζονται στο θερμογράφημα που προκύπτει με τη μορφή μιας καμπύλης, της οποίας τα κοίλα είναι στραμμένα προς τα πάνω ή προς τα κάτω, ανάλογα με το αν το φαινόμενο είναι εξώθερμο ή ενδόθερμο. Τα όργανα με τα οποία μετράται η διαφορά στη ροή θερμότητας, διακρίνονται σε δύο είδη: τα θερμιδόμετρα DSC αντιστάθμισης ισχύος και τα θερμιδόμετρα DSC με ροή θερμότητας. Στα πρώτα, χρησιμοποιούνται δύο ανεξάρτητοι φούρνοι για τη θέρμανση του δείγματος και του υλικού αναφοράς, οι οποίοι είναι τοποθετημένοι σε έναν μεγάλο θερμοπρογραμματιζόμενο υποδοχέα θερμότητας. Πάνω από τους αυτούς βρίσκονται οι κυψελίδες των δύο υλικών και οι θερμοκρασίες τους ελέγχονται συνεχώς με ενσωματωμένα θερμόμετρα αντίστασης λευκοχρύσου. Στον δεύτερο τύπο θερμιδόμετρου, ένας ηλεκτρικώς θερμαινόμενος θερμοηλεκτρικός δίσκος κατασκευασμένος από θερμοηλεκτρικό υλικό βοηθά τη ροή θερμότητας προς το δείγμα και το υλικό αναφοράς, τα οποία είναι τοποθετημένα στους υποδοχείς σε υπερηψωμένες πλατφόρμες πάνω στο δίσκο. Το θερμοζεύγος κάτω από το δισκίο του δείγματος προσδιορίζει τη θερμοκρασία του δείγματος. Η κύρια εφαρμογή της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης στη βιομηχανία είναι ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου για τον προσδιορισμό της καθαρότητας ουσιών, κυρίως φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. 3.5 Θερμοσταθμική ανάλυση (TG) Η διαφορά μεταξύ των δύο αυτών θερμικών τεχνικών είναι ότι στη θερμοσταθμική ανάλυση (Thermogravimetric Analysis, TG) καταγράφονται διαφορές στη θερμοκρασία, ενώ η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης βασίζεται στη μέτρηση διαφορών στην ενέργεια. 59

76 Στη θερμοσταθμική ανάλυση, καταγράφεται συνεχώς η μάζα του δείγματος ως συνάρτηση της θερμοκρασίας ή του χρόνου, σε μια ελεγχόμενη ατμόσφαιρα, καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται (συνήθως γραμμικά με το χρόνο). Οι μεταβολές στη μάζα παρέχουν ποιοτικές και ποσοτικές πληροφορίες για τη σύσταση της εξεταζόμενης ουσίας. Το όργανο που χρησιμοποιείται για θερμοσταθμικές αναλύσεις αποτελείται από ένα φούρνο, έναν αναλυτικό ζυγό υψηλής ακρίβειας, ένα θερμοζεύγος για τον υπολογισμό της θερμοκρασίας, ένα διαβιβαστή αερίου για την εξασφάλιση της αδρανούς ατμόσφαιρας και έναν υπολογιστή, ο οποίος συλλέγει και καταγράφει τα δεδομένα της μέτρησης. Ο υποδοχέας του δείγματος τοποθετείται μέσα στον ηλεκτρικά θερμαινόμενο φούρνο και η θερμοκρασία του δείγματος μετράται με ακρίβεια. Η απώλεια μάζας καταγράφεται από το σύστημα συλλογής των δεδομένων και παρουσιάζεται με τη μορφή του θερμογραφήματος ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται στη μελέτη ιδιοτήτων υλικών, κυρίως πολυμερών, παρέχοντας πληροφορίες για τον τρόπο αποσύνθεσής τους. 60

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο 4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4.1 Χρησιμοποιούμενα υλικά Χημικές ουσίες Θειική χονδροϊτίνη σε μορφή σκόνης, μίγμα 4- και 6- θειικής χονδροϊτίνης Ηπαρίνη σε μορφή σκόνης, η οποία απομονώθηκε από βλέννα του εντέρου χοίρου (Sigma Αldrich) Θειική ηπαράνη σε μορφή σκόνης, η οποία απομονώθηκε από βλέννα χοίρου (Amsbio) Θειική δερματάνη σε μορφή σκόνης, η οποία απομονώθηκε από βλέννα χοίρου (Amsbio) Υαλουρονικό οξύ σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 1 mg/ml Από τις παραπάνω ουσίες, η θειική χονδροϊτίνη, η ηπαρίνη και το υαλουρονικό οξύ, ήταν ευγενική χορηγία του Εργαστηρίου Βιοχημείας του τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης 5% w/v με διάλυση της κατάλληλης ποσότητας της στερεάς ουσίας σε υπερκάθαρο νερό (Milli-Q, Millipore, 18 ΜΩ cm). Οι ουσίες, όπως και τα υδατικά διαλύματά τους, φυλάσσονται στην κατάψυξη στους -20 ο C Ιστοί/Βιογενή υλικά Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε κολλαγόνο τύπου Ι σε μορφή σκόνης, το οποίο απομονώθηκε από κνημιαίο βόειο οστό. Το οστό είχε υποστεί χημική επεξεργασία με διάλυμα χλωροφορμίου-μεθανόλης για απομάκρυνση των λιπιδίων, καθώς και με EDTA για την 61

78 απομάκρυνση του βιοαπατίτη, του ανόργανου τμήματος του οστού. Στη συνέχεια, το οστό κονιοποιήθηκε σε σφυρόμυλο ψυχόμενο με υγρό Ν 2 [104]. Κατάλληλη ποσότητα (50 mg) από το παραπάνω δείγμα εναιωρήθηκε σε υπερκάθαρο νερό, ώστε να προκύψει εναιώρημα κολλαγόνου τύπου Ι περιεκτικότητας 5% w/v. Ως κολλαγόνο τύπου ΙΙ χρησιμοποιήθηκε αρθρικός χόνδρος, ο οποίος απομονώθηκε από κεφαλή μηριαίου οστού ανθρώπου που είχε αφαιρεθεί χειρουργικά κατά τη διάρκεια αρθροπλαστικής στην ορθοπεδική κλινική του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Τα δύο κύρια συστατικά του αρθρικού χόνδρου είναι το κολλαγόνο τύπου ΙΙ και οι πρωτεογλυκάνες [105]. Δείγματα αρθρικού χόνδρου κόπηκαν με τη βοήθεια νυστεριού από την περίμετρο της κεφαλής στην περιοχή όπου ενώνεται με το μηριαίο οστό και στη συνέχεια εκπλύθηκαν αρκετές φορές με υπερκάθαρο νερό. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν τυλιγμένα σε γάζα εμποτισμένη με υπερκάθαρο νερό σε αεροστεγή συσκευασία στους -20 ο C. Πριν υποστούν κάποια επεξεργασία, ελήφθησαν φωτογραφίες των δειγμάτων στο στερεοσκόπιο και συλλέχθηκαν φάσματα Raman για το δομικό χαρακτηρισμό τους, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως πρότυπες ουσίες σε περαιτέρω έρευνα. Εικόνα 4.1. Φωτογραφίες από το στερεοσκόπιο αρθρικού χόνδρου. Δεδομένου ότι η κύρια δομική μονάδα των πρωτεογλυκανών που απαρτίζουν τον αρθρικό χόνδρο είναι η θειική χονδροϊτίνη [106], έγιναν προσπάθειες απομάκρυνσης της με διαδοχικές 62

79 εκπλύσεις του χόνδρου με ακετόνη ή απόλυτη αιθανόλη. Πρόκειται για δύο διαλύτες που χρησιμοποιούνται συχνά για την κατακρήμνιση των γλυκοζαμινογλυκανών [ ]. Ξεκινώντας τη διαδικασία, δείγμα αρθρικού χόνδρου βάρους 9 mg ψύχθηκε με υγρό Ν 2 και τοποθετήθηκε σε κατάλληλη συσκευή (Labconco, Freezone1) για να εξαχνωθεί η υγρασία που περιέχει (freeze-drying). Στη συνέχεια, ο λυοφιλιοποιημένος χόνδρος εμβαπτίστηκε σε 2 ml ακετόνης. Το διάλυμα ανανεωνόταν κάθε 2 ώρες και η διαδικασία επαναλήφθηκε για 4 μέρες. Συλλέχθηκαν φάσματα Raman και παρατηρώντας χαρακτηριστικές κορυφές της θειικής χονδροϊτίνης στο φάσμα του χόνδρου, διαπιστώθηκε ότι δεν είχε απομακρυνθεί από το χόνδρο. Οι εκπλύσεις του λυοφιλιοποιημένου χόνδρου συνεχίστηκαν με τοποθέτηση του χόνδρου σε 2 ml διαλύματος απόλυτης αιθανόλης (θερμοκρασίας 4 ο C). Πραγματοποιήθηκε ανανέωση των διαλυμάτων κάθε 24 ώρες και η συνολική διάρκεια της διαδικασίας ήταν 5 εβδομάδες. Από τα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν, τα οποία θα παρουσιαστούν στο κεφάλαιο των αποτελεσμάτων (σχήμα 5.21), διαπιστώθηκε ότι δεν ήταν δυνατή η απομάκρυνση της θειικής χονδροϊτίνης από το χόνδρο. Τα μίγματα των γλυκοζαμινογλυκανών με το κολλαγόνο τύπου Ι παρασκευάστηκαν με τους εξής τρόπους: Εμβάπτιση κολλαγόνου τύπου Ι σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης ή ηπαρίνης Ανάμιξη ίσων όγκων του εναιωρήματος του κολλαγόνου τύπου Ι και του διαλύματος θειικής χονδροϊτίνης ή ηπαρίνης ίδιας περιεκτικότητας (5% w/v) Ανάμιξη ίσων ποσοτήτων κολλαγόνου τύπου Ι και θειικής χονδροϊτίνης (σε σκόνη) και διάλυση σε υπερκάθαρο νερό Ανάμιξη ίσων ποσοτήτων διαλυμάτων κολλαγόνου τύπου Ι και θειικής χονδροϊτίνης, διάλυση σε υπερκάθαρο νερό και στη συνέχεια λυοφιλιοποίησή τους 63

80 4.1.3 Εμβαπτίσεις κολλαγόνου τύπου Ι ή τύπου ΙΙ σε διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών Για την παρασκευή των συγκεκριμένων μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών με το κολλαγόνο τύπου Ι, μια ποσότητα περίπου 8 mg κολλαγόνου τύπου Ι σε μορφή σκόνης εμβαπτίστηκε σε διάλυμα γλυκοζαμινογλυκάνης 5% w/v. Πιο συγκεκριμένα: 8.4 mg κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτίστηκαν σε 75 μl διαλύματος θειικής χονδροϊτίνης 7.8 mg κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτίστηκαν σε 50 μl διαλύματος ηπαρίνης 9.7 mg κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτίστηκαν σε 50 μl μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 Ομοίως, τα μίγματα του κολλαγόνου τύπου ΙΙ με τις γλυκοζαμινογλυκάνες προέκυψαν ως εξής: 9 mg χόνδρου εμβαπτίστηκαν σε 25 μl διαλύματος θειικής χονδροϊτίνης (5% w/v) 7.9 mg χόνδρου εμβαπτίστηκαν σε 25 μl διαλύματος ηπαρίνης (5% w/v) 8.7 mg χόνδρου εμβαπτίστηκαν σε 25 μl μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (5% w/v) Μίγματα γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι Τα συγκεκριμένα μίγματα παρασκευάστηκαν με ανάμιξη ίσων όγκων των διαλυμάτων κάθε συστατικού και ακολούθησε έντονη ανάδευση σε συσκευή vortex (MS2 Minishaker, IKA ) για να εξασφαλιστεί η καλή ανάμιξη των συστατικών μεταξύ τους. Με αυτόν τον τρόπο προέκυψαν τα παρακάτω μίγματα: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι με αναλογία όγκων 1:1 μίγμα ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι με αναλογία όγκων 1:1 μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι με αναλογία όγκων 1:1:1 64

81 Μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι παρασκευάστηκε και με άλλον τρόπο. Αναμίχθηκαν πρώτα ίσες ποσότητες των δύο ουσιών σε μορφή σκόνης και μετά ακολούθησε η διάλυση της κατάλληλης ποσότητας του μίγματος σε υπερκάθαρο νερό. Μετά την προσθήκη των ζυγισμένων ποσοτήτων, η ανάμιξη των δύο συστατικών στο ιγδίο πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια σπάτουλας, καθώς και με ήπια λειοτρίβηση με ύπερο. Επίσης, υδατικό διάλυμα μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι με αναλογία όγκων 1:1 τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο στους 70 ο C, όπου παρέμεινε για 4 ώρες περίπου. Καθ όλη τη διάρκεια της θέρμανσης, το eppendorf που περιείχε το διάλυμα ήταν πωματισμένο ώστε να αποφευχθεί εξάτμιση του διαλύτη Λυοφιλιοποιημένα μίγματα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Υδατικό διάλυμα μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 1:1, καθώς και το αντίστοιχο μίγμα θειικής χονδροϊτίνηςκολλαγόνου τύπου Ι που τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο στους 70 ο C, λυοφιλιοποιήθηκαν ώστε να απομακρυνθεί η περιεχόμενη υγρασία. Κατά τη διαδικασία αυτή, το υλικό καταψύχεται και στη συνέχεια εισέρχεται σε περιβάλλον υψηλού κενού, επιτρέποντας έτσι την απευθείας μετατροπή του νερού που περιέχει το υλικό από τη στερεή στην αέρια φάση (εξάχνωση). Εν συντομία, η λυοφιλιοποίηση περιλαμβάνει τα εξής στάδια: ψύξη του υλικού με υγρό Ν 2 ελάττωση της πίεσης κάτω από το τριπλό σημείο του νερού προσεκτική θέρμανση του υλικού (παροχή λανθάνουσας θερμότητας για εξάχνωση του πάγου) συνεχή απομάκρυνση των παραγόμενων υδρατμών Η λυοφιλιοποίηση (freeze-drying) των παραπάνω μιγμάτων της θειικής χονδροϊτίνης με το κολλαγόνο τύπου Ι πραγματοποιήθηκε σε λυοφιλιοποιητή (Labconco, Freezone1). 65

82 Πίνακας 4.1. Περιέχει όλα τα μίγματα κολλαγόνου και γλυκοζαμινογλυκανών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, τη μεταξύ τους αναλογία και την επεξεργασία που υπέστησαν (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Τρόπος ανάμιξης Αναλογία συστατικών Περαιτέρω επεξεργασία COL I+CS εμβάπτιση 8.4 mg COL I σε 75 μl δ/τος CS 5% w/v - COL I+HEP εμβάπτιση 7.8 mg COL I σε 50 μl δ/τος CS 5% w/v - COL I-CS-HEP εμβάπτιση 9.7 mg COL I σε 50 μl δ/τος CS 5% w/v - COL II+CS εμβάπτιση 9 mg COL II σε 25 μl δ/τος CS 5% w/v - COL II+HEP εμβάπτιση 7.9 mg COL II σε 25 μl δ/τος CS 5% w/v - COL II-CS-HEP εμβάπτιση 8.7 mg COL II σε 25 μl δ/τος CS 5% w/v - COL I-CS ανάμιξη όγκων 1:1 αφυδάτωση σταγόνας διάλυση σε νερό και i) COL I-CS ανάμιξη μαζών 1:1 COL I-CS (70 o C) ανάμιξη όγκων 1:1 αφυδάτωση σταγόνας ii) λυοφιλιοποίηση i) αφυδάτωση σταγόνας ii) λυοφιλιοποίηση COL I-HEP ανάμιξη όγκων 1:1 αφυδάτωση σταγόνας COL I-CS-HEP ανάμιξη όγκων 1:1:1 αφυδάτωση σταγόνας 66

83 4.2 Οπτική Παρατήρηση των δειγμάτων στο στερεοσκόπιο Το στερεοσκόπιο είναι ένα οπτικό όργανο που χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη των στερεών δειγμάτων. Στην παρούσα εργασία, η μορφολογία της επιφάνειας των διαφόρων δειγμάτων μελετήθηκε με στερεοσκόπιο (DFC295, Leica). Μία σταγόνα όγκου περίπου 40 μl από κάθε υγρό δείγμα εναποτέθηκε με τη βοήθεια μικροσύριγγας του 1 ml σε πλακίδιο υψηλής ανακλαστικότητας με επικάλυψη χρυσού (Gold Coated Test Slides, Evaporated Metal Films Corporation, Ithaca, New York). Η σταγόνα αφέθηκε στους 4 ο C για περίπου 8h έως ότου εξατμιστεί ο διαλύτης. Φωτογραφίες στο στερεοσκόπιο από το στερεό υπόλειμμα των σταγόνων των δειγμάτων ελήφθησαν μετά τη στερεοποίηση τους πάνω στο πλακίδιο χρυσού. Τα βιογενή υλικά, όπως και τα λυοφιλιοποιημένα δείγματα, τοποθετήθηκαν σε τριβλίο Petri για να παρατηρηθούν οπτικά κάτω από το φακό του στερεοσκοπίου. Χαρακτηριστικές στερεοφωτογραφίες αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι, HEP-COL (παρασκευασμένου με αναλογία όγκων 1:1) και λυοφιλιοποιημένου μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι, CSA-COL (παρασκευασμένου με αναλογία όγκων 1:1) παρουσιάζονται στην παρακάτω εικόνα. Εικόνα 4.2. Φωτογραφία στο στερεοσκόπιο αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος HEP-COL (Α) και λυοφιλιοποιημένου μίγματος CSA-COL (Β). 67

84 4.3 Συλλογή φασμάτων Raman Για τη συλλογή των φασμάτων Raman, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε πλακίδιο υψηλής ανακλαστικότητας με επικάλυψη χρυσού για ενίσχυση του σήματος. Στην περίπτωση των υδατικών διαλυμάτων, μία σταγόνα από κάθε διάλυμα εναποτέθηκε στην επιφάνεια του χρυσού πλακιδίου με τη βοήθεια μικροσύριγγας και αφέθηκε να αφυδατωθεί στους 4 ο C για περίπου 8h. Τα φάσματα Raman των δειγμάτων καταγράφηκαν σε φασματοφωτόμετρο Raman, το οποίο ήταν συζευγμένο με οπτικό μικροσκόπιο (InVia Raman microscope, Renishaw, UK). Για τη διέγερση χρησιμοποιήθηκε λέιζερ διόδου που εκπέμπει ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού και συγκεκριμένα στα 785 nm. Ο έλεγχος της καλής λειτουργίας του laser γινόταν με παρακολούθηση της κορυφής του πυριτίου (Si) στα 785 nm, η οποία εντοπίζεται στους 520 cm - 1. Καταγραφή της κορυφής στο πυρίτιο πραγματοποιούταν κάθε φορά πριν από τις μετρήσεις των δειγμάτων και ελεγχόταν τόσο ο κυματάριθμος όπου εμφανίζεται η κορυφή όσο και η ένταση της συγκεκριμένης κορυφής. Το συγκεκριμένο όργανο χαρακτηρίζεται από διακριτική ικανότητα (resolution) 2 cm -1 και διαθέτει φράγμα περίθλασης (grating) με 1200 χαραγές (lines) ανά mm. Ο ανιχνευτής του συστήματος είναι ανιχνευτής σύζευξης φορτίου (Charge-Coupled Device, CCD) (574x384 pixels), ψυχόμενος με αέρα. Η επιλογή του εκάστοτε σημείου συλλογής φάσματος Raman έγινε μετά από οπτική παρατήρηση μέσω του μικροσκοπίου του δείγματος. Ακολουθούσε η εστίαση του ίχνους της προσπίπτουσας ακτινοβολίας στην επιφάνεια του δείγματος και λήψη της εικόνας του δείγματος πριν την καταγραφή του φάσματος. Η επιλογή του επόμενου σημείου από το οποίο συλλέχθηκε φάσμα Raman, γινόταν με μετακίνηση της τράπεζας που διαθέτει το όργανο ως προς το ίχνος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Η συλλογή των φασμάτων Raman από τα δείγματα που ήταν σε μορφή σκόνης πραγματοποιήθηκε με τον αντικειμενικό φακό 50x του οπτικού μικροσκοπίου (μέγεθος του ίχνους της προσπίπτουσας ακτινοβολίας: 29 μm x 8 μm όταν η εστίαση γινόταν στο πρότυπο δείγμα πυριτίου με ένταση ρυθμισμένη στο 5*10-8 % της ισχύος του laser). Ο χρόνος κάθε 68

85 σάρωσης είχε οριστεί στα 10 s, η ισχύς του laser στο 50% της ονομαστικής ισχύος του (250 mw) και το κάθε φάσμα είναι ο μέσος όρος 10 σαρώσεων (accumulations). Για τη συλλογή των φασμάτων Raman από τα υδατικά διαλύματα (στη μορφή της αφυδατωμένης σταγόνας) χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες συνθήκες. Η επιλογή των σημείων λήψης φασμάτων Raman σε αυτήν την περίπτωση πραγματοποιήθηκε ξεκινώντας από το άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας και προχωρώντας προς το κέντρο της, μετακινώντας την τράπεζα του οργάνου. Τα φάσματα Raman που καταγράφηκαν από τα μίγματα που παρασκευάστηκαν με εμβάπτιση κολλαγόνου τύπου Ι ή τύπου ΙΙ σε διάλυμα γλυκοζαμινογλυκάνης ήταν το αποτέλεσμα 5 σαρώσεων (accumulations), κάθε μία από τις οποίες είχε διάρκεια 20 s, ενώ η ένταση της ακτινοβολίας του laser είχε ρυθμιστεί στο 90% της αρχικής τιμής. Η εστίαση του laser πραγματοποιήθηκε μέσω του αντικειμενικού φακού 20x του οπτικού μικροσκοπίου του οργάνου. Με τις ίδιες ακριβώς συνθήκες καταγράφηκαν και τα φάσματα Raman από τον αρθρικό χόνδρο. Εικόνα 4.3. Φασματοφωτόμετρο Raman. 69

86 Εικόνα 4.4. Συλλογή φάσματος Raman από αφυδατωμένη σταγόνα Επεξεργασία των φασμάτων Raman Η επεξεργασία των φασμάτων Raman που καταγράφηκαν πραγματοποιήθηκε αρχικά με το πρόγραμμα Origin Pro 8.0. Μελετώντας τα φάσματα, διαπιστώθηκε ότι ήταν απαραίτητος ο διαχωρισμός των κορυφών (deconvolution) κάτω από ευρείες μπάντες σε διάφορες φασματικές περιοχές. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κατάλληλο λογισμικό ανάλυσης (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Ακολουθεί η περιγραφή της διαδικασίας με την οποία έγινε η επεξεργασία των φασμάτων. Αρχικά, τα δεδομένα εισάγονται στο πρόγραμμα από ένα αρχείο τύπου ASCII. Επιλέγονται τα όρια της εκάστοτε φασματικής περιοχής που θέλουμε να επεξεργαστούμε (π.χ cm - 1 ) και την απομονώνουμε από το υπόλοιπο φάσμα. 70

87 Εικόνα 4.5. Επιλογή φασματικής περιοχής (στη συγκεκριμένη περίπτωση: περιοχή cm -1 ). Η περιοχή που απομονώνεται συμβολίζεται με κίτρινα τετράγωνα, ενώ η υπόλοιπη περιοχή έχει απενεργοποιηθεί (γκρίζα τετράγωνα). Φέρουμε τη γραμμή βάσης μεταξύ των δύο άκρων, τα οποία κυμαίνονταν σε πολύ στενό εύρος κυματάριθμων (π.χ cm -1 ) για διασφάλιση της επαναληψιμότητας. 71

88 Εικόνα 4.6. Φέρουμε γραμμή βάσης ανάμεσα στα δύο άκρα της φασματικής περιοχής. Στη συνέχεια, εντοπίζεται η θέση του μεγίστου κάθε κορυφής, καθώς και ο ακριβής αριθμός των κορυφών που υπάρχουν, με βάση βιβλιογραφικά δεδομένα, προηγούμενη ανάλυση προτύπων ουσιών και χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της δεύτερης παραγώγου. Για την προσομοίωση των κορυφών επιλέχθηκε το μικτό μοντέλο Gauss-Lorentzian. 72

89 Εικόνα 4.8. Η προσαρμογή των κορυφών με τη μέθοδο της δεύτερης παραγώγου. Ακολουθεί μια διαδικασία σύγκλισης μέσω συνεχών επαναλήψεων του συστήματος των κορυφών με το πραγματικό φάσμα και προσδιορισμού των παραμέτρων των επιμέρους κορυφών. Η απόκλιση του προσομοιωμένου φάσματος από το πραγματικό εκτιμάται με την τιμή του r 2 και το τυπικό σφάλμα που υπάρχει. Η καλύτερη σύγκλιση χαρακτηρίζεται από τιμή του r 2 περίπου ίση με τη μονάδα και μέγεθος σφάλματος πολύ μικρό (πλησιάζει το μηδέν). Επίσης, για κάθε κορυφή υπολογίζονται δεδομένα, όπως το πλάτος, η θέση του μεγίστου και το εμβαδόν κάθε κορυφής, τα οποία εμφανίζονται αυτόματα από το πρόγραμμα. 73

90 Εικόνα 4.8. Η διαδικασία της σύγκλισης των κορυφών. 4.4 Θερμοσταθμικές μέθοδοι Οι μετρήσεις διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC), καθώς και οι θερμοσταθμικές μετρήσεις (Thermogravimetric Analysis, TG) πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα σε θερμιδόμετρο (STA 449 F 3 Jupiter, Netzsch), υπό αδρανή ατμόσφαιρα Ν 2. Το όργανο ήταν εξοπλισμένο και με σύστημα ελεγχόμενης ψύξης. Τα δείγματα μάζας 2-16 mg τοποθετήθηκαν σε ειδικά καψίδια αλουμινίου (aluminum pans). Το εύρος της θερμοκρασιακής περιοχής είχε οριστεί από τους 30 ο C έως τους 450 ο C, ενώ ο ρυθμός θέρμανσης ήταν 10 ο C/min. Η θερμοκρασιακή βαθμονόμηση του οργάνου είχε πραγματοποιηθεί στην αρχή χρησιμοποιώντας Ίνδιο (In) ως πρότυπο, το οποίο έχει σημείο τήξης 156,6 ο C. Για μεγαλύτερη ακρίβεια στις μετρήσεις, προσδιορίστηκε η γραμμή βάσης (baseline) σαρώνοντας την καθορισμένη περιοχή θερμοκρασιών με τους υποδοχείς κενούς. 74

91 4.4.1 Επεξεργασία των θερμογραφημάτων DSC και TG Η επεξεργασία των θερμογραφημάτων DSC και TG πραγματοποιήθηκε μέσω ενός λογισμικού που είναι κατάλληλο για θερμικές αναλύσεις (Proteus, Netzsch). Με το συγκεκριμένο λογισμικό, προσδιορίστηκαν τα εμβαδά των χαρακτηριστικών κορυφών στα θερμογραφήματα DSC, καθώς και το μέγεθος της απώλειας μάζας στο θερμογράφημα TG. Στη συνέχεια, με το πρόγραμμα Origin Pro 8.0 κατασκευάστηκαν τα διαγράμματα που θα παρουσιαστούν στο επόμενο κεφάλαιο. 75

92 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο 5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1 Φάσματα Raman προτύπων ουσιών Αρχικά, μελετήθηκαν τα φάσματα Raman των ουσιών: θειικής χονδροϊτίνης, ηπαρίνης, υαλουρονικού οξέος, θειικής δερματάνης, καθώς και κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια ως πρότυπα στη μελέτη των μιγμάτων τους Φάσματα Raman γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs) Τα φάσματα Raman των διαφόρων γλυκοζαμινογλυκανών καταγράφηκαν: α) από τις ουσίες σε μορφή σκόνης και β) από αφυδατωμένες σταγόνες υδατικών διαλυμάτων τους. Δεν παρατηρήθηκαν ιδιαίτερες διαφορές ανάμεσα στα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν από τα δείγματα που ήταν σε μορφή σκόνης και τα αντίστοιχα σε υδατικό διάλυμα. Στο σχήμα που ακολουθεί παρουσιάζονται τα φάσματα Raman γλυκοζαμινογλυκανών που καταγράφηκαν υπό μορφή σκόνης, εκτός από το υαλουρονικό οξύ που ήταν σε υδατικό διάλυμα, και βρίσκονται σε αρκετά καλή συμφωνία με τα αντίστοιχα φάσματα γλυκοζαμινογλυκανών που υπάρχουν στη βιβλιογραφία, όπως αυτά που παρουσιάζει ο R. Bansil και η ομάδα του [111]. 76

93 Ένταση Raman C-4S CS DS HEP HS Μετατόπιση Raman (cm -1 ) HA Σχήμα 5.1. Φάσματα Raman των διαφόρων GAGs (C-4S: 4-θειική χονδροϊτίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη, DS: θειική δερματάνη, HEP: ηπαρίνη, HS: θειική ηπαράνη, HA: υαλουρονικό οξύ). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες είναι γραμμικά πολυμερή αρνητικού φορτίου και συντίθενται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριτικές μονάδες που περιέχουν συνήθως μια εξοζαμίνη (Νακετυλο-D-γλυκοζαμίνη ή Ν- ακετυλο-d-γαλακτοζαμίνη) και ένα ουρονικό οξύ (Dγλυκουρονικό οξύ ή L-ιδουρονικό οξύ) (βλ. κεφάλαιο 1). Οι δομές των γλυκοζαμινογλυκανών που μελετήθηκαν στη συγκεκριμένη εργασία παρουσιάζονται στην εικόνα

94 Εικόνα 5.1. Σύσταση των γλυκοζαμινογλυκανών (HA: υαλουρονικό οξύ, C-4S: 4-θειική χονδροϊτίνη, C- 6S: 6-θειική χονδροϊτίνη, DS: θειική δερματάνη, HEP: ηπαρίνη, HS: θειική ηπαράνη). Μελετώντας τα φάσματα Raman των διαφορετικών ειδών γλυκοζαμινογλυκανών μπορούν να ταυτοποιηθούν οι δονήσεις των δεσμών που αντιπροσωπεύουν τις χαρακτηριστικές λειτουργικές ομάδες που περιέχουν αυτά τα μόρια. Διαπιστώθηκε επίσης ότι υπάρχουν κάποιες διαφοροποιήσεις μεταξύ των φασμάτων τους, γεγονός που καθιστά εύκολη την ταυτοποίηση και τη διάκριση μεταξύ τους. Οι πιο έντονες διαφορές όσον αφορά στα φάσματα Raman παρατηρούνται μεταξύ θειωμένων (CS, DS, HEP και HS) και μη θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών (ΗΑ). Όπως φαίνεται στην εικόνα 5.1, το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), που αποτελεί τη μοναδική μη θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη, παρουσιάζει διαφορετική φασματοσκοπική εικόνα σε σχέση με τις υπόλοιπες θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες (CS, DS, HEP και HS). Ιδιαίτερη σημασία έχει η φασματική περιοχή cm -1, η οποία περιλαμβάνει τις δονήσεις της πιο 78

95 χαρακτηριστικής λειτουργικής ομάδας των γλυκοζαμινογλυκανών, της θειομάδας (OSO - 3 ) [111]. Στο φάσμα Raman του υαλουρονικού οξέος απουσιάζει η χαρακτηριστική ευρεία κορυφή στους 1069 cm -1, ενδεικτική της παρουσίας θειομάδας, και βλέπουμε κυρίως τις δονήσεις παραμόρφωσης του δεσμού C-OH που εμφανίζονται στην περιοχή cm -1 του φάσματος [112]. Στην περίπτωση των θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών οι δονήσεις αυτές επικαλύπτονται φασματοσκοπικά από τις δονήσεις της θειομάδας. Διαφορές στα φάσματα μεταξύ των θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών συνδέονται είτε με τις διαφορές στη χημική δομή κάθε μορίου είτε με τον διαφορετικό προσανατολισμό των διαφόρων υποκαταστατών στα μόρια [111]. Οι θειωμένοι πολυσακχαρίτες διαφέρουν επίσης - και ως προς το είδος της θειομάδας που περιέχουν. Η O-SO 3 ομάδα απαντάται στις περισσότερες θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες και εντοπίζεται σε διάφορες θέσεις των - κατάλοιπων των σακχάρων, ενώ η N-SO 3 ομάδα απαντάται μόνο στα κατάλοιπα των αμινοδεοξυεξοζών στην ηπαρίνη και στην θειική ηπαράνη [113]. Λόγω της αλληλεπικάλυψης κορυφών κρίθηκε απαραίτητη η επεξεργασία των φασμάτων Raman με τη χρήση του κατάλληλου λογισμικού για το διαχωρισμό των κορυφών (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Η επεξεργασία και μελέτη των φασμάτων των πρότυπων γλυκοζαμινογλυκανών επικεντρώνεται στις εξής φασματικές περιοχές: cm cm cm cm -1- Τα επεξεργασμένα φάσματα για καθεμία από τις παραπάνω φασματικές περιοχές παρουσιάζονται στα σχήματα που ακολουθούν. 79

96 Περιοχή cm -1 Σχήμα 5.2. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της 4-θειικής χονδροϊτίνης (C-4S), θειικής χονδροϊτίνης (CS) και θειικής δερματάνης (DS). 80

97 Η θειική χονδροϊτίνη (CS) παρουσιάζει δύο κύριες κορυφές στους 859 cm -1 και 883 cm -1, με την πρώτη να είναι η ισχυρότερη σε ένταση Raman. Η συγκεκριμένη κορυφή πηγάζει από την ασύμμετρη δόνηση έκτασης του δεσμού C-O-S [114]. Στο συγκεκριμένο φάσμα παρατηρούνται, επίσης, και δύο χαμηλότερης έντασης κορυφές στους 846 cm -1 και 894 cm -1. Ο R. Bansil και η ομάδα του το 1978, ύστερα από μελέτη με φασματοσκοπία Raman α και β γλυκόζης σε κρυσταλλική μορφή, πρότειναν ότι δονήσεις παραμόρφωσης του δεσμού CH 2 και πιο συγκεκριμένα του δεσμού C (1) -H εμφανίζονται στους κυματάριθμους 847 cm -1 για τα α ανωμερή και στους 880 cm -1 (4- θειική χονδροϊτίνη) και 890 cm -1 (6- θειική χονδροϊτίνη) για τα β ανωμερή [111]. Τα παραπάνω συνάδουν με τη γενικότερη άποψη ότι οι γλυκοσιδικοί δεσμοί στη θειική χονδροϊτίνη, θειική δερματάνη και υαλουρονικό οξύ είναι β τύπου. Βλέπουμε τις αντίστοιχες κορυφές και στο φάσμα της 4-θειικής χονδροϊτίνης, οι οποίες εμφανίζονται στους ίδιους περίπου κυματάριθμους σε σχέση με το φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης (CS). Η θειική χονδροϊτίνη που χρησιμοποιήθηκε στη συγκεκριμένη μελέτη είναι μίγμα 4- και 6-θειικής χονδροϊτίνης. Παρ όλο που η δομή της 4-θειικής χονδροϊτίνης μοιάζει αρκετά με εκείνη της θειικής δερματάνης (ισομερείς ενώσεις), η φασματική αυτή περιοχή είναι διαφορετική στα δύο μόρια. Η θειική δερματάνη (DS) χαρακτηρίζεται από τρεις κύριες κορυφές στους 809 cm -1, 866 cm -1 και 889 cm -1, ενώ διακρίνονται και δύο κορυφές που εμφανίζονται ως ώμοι (shoulders) στους 831 cm -1 και 912 cm -1 αντίστοιχα. Σύμφωνα με την εργασία των F. Cabassi et al [113], οι οποίοι μελέτησαν φάσματα Raman από στερεά δείγματα θειικής δερματάνης, η ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή του φάσματος που εντοπίζεται στους 867 cm -1 αντιπροσωπεύει την ασύμμετρη δόνηση του δεσμού C-O-S [113]. Οι M.O. Longas et al [53] χρησιμοποίησαν τη φασματοσκοπία υπερύθρου (IR) για το χαρακτηρισμό θειικής δερματάνης που απομονώθηκε από δέρμα και αναφέρουν ότι η απορρόφηση στους 860 cm -1 είναι χαρακτηριστική των δονήσεων που πηγάζουν από τους δεσμούς C-O-S των αξονικών θειομάδων στον C (4) της Ν- ακετυλογαλακτοζαμίνης στην 4-θειική χονδροϊτίνη και θειική δερματάνη [91]. 81

98 Σχήμα 5.3. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της ηπαρίνης (HEP) και της θειικής ηπαράνης (HS). Μελετώντας την περιοχή αυτή στα φάσματα Raman της ηπαρίνης (HEP) και της θειικής ηπαράνης (HS), διακρίνουμε τις κύριες κορυφές στους κυματάριθμους 825 cm -1, 856 cm -1, 881 cm -1 και 897 cm -1, από τις οποίες η μεγαλύτερη σε ένταση Raman είναι η πρώτη. Οι κορυφές αυτές έχουν σχετιστεί με δονήσεις του δεσμού C-O-S [113]. Οι D. Grant et al [115], μελετώντας φάσματα IR που καταγράφηκαν από ηπαρίνη και σύμπλοκα ηπαρίνης-μεταλλικού ιόντος, 82

99 κατάφεραν να αποδώσουν την κορυφή στους 825 cm -1 στις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-O- S των κατάλοιπων της 6-θειωμένης γλυκοζαμίνης. Η δεύτερη κύρια κορυφή της ηπαρίνης και της θειικής ηπαράνης, εκείνη στους 897 cm -1, σύμφωνα με την ίδια ομάδα ερευνητών, είναι αποτέλεσμα σύζευξης δονήσεων έκτασης των δεσμών C-O-C του δακτυλίου του σακχάρου και των δεσμών C-O-S [115]. 83

100 Περιοχή cm -1 Σχήμα 5.4. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της 4-θειικής χονδροϊτίνης (C-4S), θειικής χονδροϊτίνης (CS) και θειικής δερματάνης (DS). 84

101 Στο φάσμα Raman της θειικής χονδροϊτίνης (CS), η ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή εντοπίζεται στους 939 cm -1 και αποδίδεται στη σκελετική δόνηση του δεσμού C-O-C [116], ενώ διακρίνεται και μια χαμηλής έντασης κορυφή στους 950 cm -1. Οι υπόλοιπες δύο χαμηλότερης έντασης κορυφές στους 977 cm -1 και 998 cm -1 είναι αποτέλεσμα δονήσεων του δεσμού C-O-S [111, 116]. Παρατηρούμε ότι για τη 4-θειική χονδροϊτίνη, η ισχυρότερη σε ένταση κορυφή εντοπίζεται στους 928 cm -1, συνοδευόμενη από έναν ώμο στους 940 cm -1. Υπάρχουν, επίσης, δύο χαμηλότερης έντασης κορυφές στους 982 cm -1 και 995 cm -1, οι οποίες μπορούν να αποδοθούν σε δονήσεις των δεσμών C-O-S, με βάση την εργασία των R. Bansil et al [111]. Τέσσερις κορυφές παρουσιάζονται σε αυτήν την περιοχή του φάσματος της θειικής δερματάνης (DS), με την ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή να βρίσκεται στους 977 cm -1. Ακολουθεί η κορυφή στους 939 cm -1, ενώ διακρίνονται επίσης μια κορυφή στους 959 cm -1 και μια πολύ χαμηλής έντασης κορυφή στους 970 cm -1. Με βάση τη μελέτη των V. Renugopalakrishnan et al το 1989 [107], οι οποίοι πραγματοποίησαν λήψη φάσματος Raman από θειική πρωτεοδερματάνη (proteodermatan sulfate, PDS) που απομονώθηκε από δέρμα χοίρου, η κορυφή στους 977 cm -1 πηγάζει από τις δονήσεις του δεσμού C-O-S, ενώ η κορυφή στους 939 cm -1 οφείλεται στη σκελετική δόνηση του δεσμού C-O-C [107]. 85

102 Σχήμα 5.5. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της ηπαρίνης (HEP) και της θειικής ηπαράνης (HS). Όσον αφορά στη συγκεκριμένη φασματική περιοχή, η ηπαρίνη (HEP) και η θειική ηπαράνη (HS) χαρακτηρίζονται από μια κύρια κορυφή στους 956 cm -1, η οποία συνοδεύεται από δύο χαμηλότερης έντασης κορυφές (shoulders) στους 946 cm -1 και 964 cm -1. Δεν υπάρχει κάποια αναφορά στη βιβλιογραφία σχετικά με τους δεσμούς που προκαλούν την εμφάνιση των συγκεκριμένων κορυφών. 86

103 Το φάσμα Raman του υαλουρονικού οξέος (HA) εμφανίζει μια οξεία κορυφή στους 911 cm - 1, η οποία έχει αποδοθεί στη δόνηση του δεσμού C (6) -OH του γλυκουρονικού οξέος, σύμφωνα με τις μελέτες των φασμάτων Raman N-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης και D-γλυκουρονικού οξέος (δομικές μονάδες του υαλουρονικού οξέος) που πραγματοποίησαν οι C.Y. She et al [117]. 87

104 Περιοχή cm -1 Σχήμα 5.6. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της 4-θειικής χονδροϊτίνης (C-4S), θειικής χονδροϊτίνης (CS) και θειικής δερματάνης (DS). 88

105 Ύστερα από την επεξεργασία των φασμάτων στη συγκεκριμένη φασματική περιοχή, διαπιστώσαμε την ύπαρξη αρκετών επιμέρους κορυφών κάτω από την ευρεία μπάντα των θειομάδων. Συγκεκριμένα, στο φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης παρατηρούνται κορυφές στους κυματάριθμους: 998 cm -1, 1005 cm -1, 1022 cm -1, 1037 cm -1, 1052 cm -1, 1070 cm -1, 1089 cm -1, 1103 cm -1, 1120 cm -1, 1139 cm -1 και 1162 cm -1. Οι κύριες κορυφές είναι εκείνες που εντοπίζονται στους 1052 cm -1 και 1070 cm -1, με τη δεύτερη να αποτελεί την ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή και είναι αποτέλεσμα της συμμετρικής δόνησης έκτασης των θειομάδων (O-SO - 3 ) [111, 116]. Η κορυφή στους 1052 cm -1 αντιστοιχεί μερικώς σε δονήσεις του δεσμού C-OH [111]. Στο φάσμα της 4-θειικής χονδροϊτίνης (C-4S) διακρίνονται κορυφές στους: 989 cm -1, 1022 cm -1, 1040 cm -1, 1054 cm -1, 1072 cm -1, 1094 cm -1, 1101 cm -1, 1120 cm -1, 1139 cm -1 και 1157 cm -1. Η απόδοση των κορυφών είναι αντίστοιχη με την περίπτωση της θειικής χονδροϊτίνης (CS). Η απόδοση των παραπάνω κορυφών βασίστηκε στις βιβλιογραφικές αναφορές των R. Bansil et al, οι οποίοι κατέγραψαν φάσματα Raman δύο θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών (4-θειική χονδροϊτίνη, C-4S και 6-θειική χονδροϊτίνη, C-6S) και μίας μη θειωμένης γλυκοζαμινογλυκάνης (υαλουρονικό οξύ, HA) σε μορφή σκόνης και ως υδατικό διάλυμα [111]. Στο φάσμα Raman της θειικής δερματάνης (DS) στην ίδια περιοχή, διαπιστώθηκε η ύπαρξη κορυφών στους εξής κυματάριθμους: 997 cm -1, 1018 cm -1, 1038 cm -1, 1052 cm -1, 1067 cm -1, 1083 cm -1, 1107 cm -1, 1125 cm -1, 1139 cm -1 και 1158 cm -1. Οι V. Renugopalakrishnan et al [107] στη μελέτη φάσματος Raman από θειική πρωτεοδερματάνη (proteodermatan sulfate, PDS) που απομονώθηκε από δέρμα χοίρου αναφέρουν μία κορυφή στους 1056 cm -1 που έχει αναγνωριστεί ως η συμμετρική δόνηση της σουλφομάδας, με μερική συνεισφορά από τη δόνηση έκτασης του δεσμού C-OH [107]. Στο φάσμα της θειικής δερματάνης (DS) που καταγράφηκε παρατηρείται η ύπαρξη τριών χαρακτηριστικών κορυφών στους 1053 cm -1, 1067 cm -1 και 1082 cm

106 Σχήμα 5.7. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της ηπαρίνης (HEP) και της θειικής ηπαράνης (HS). Οι πιο έντονες κορυφές στην αντίστοιχη περιοχή στο φάσμα Raman της ηπαρίνης και της θειικής ηπαράνης, στους 1047 cm -1 και 1070 cm -1, σχετίζονται με τη συμμετρική δόνηση έκτασης του δεσμού S=O των θειομάδων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εργασίας των D.H. Atha et al [118] και δεδομένου ότι οι Ν-θειομάδες εμφανίζουν κορυφές σε χαμηλότερες συχνότητες σε σχέση με τις Ο-θειομάδες, η κορυφή στους 1046 cm -1 αποδίδεται στη 90

107 - συμμετρική δόνηση έκτασης των N-SO 3 ομάδων [118], ενώ εκείνη στους 1070 cm -1 στην - αντίστοιχη δόνηση των O-SO 3 ομάδων που εντοπίζονται στον C (6) της γλυκοζαμίνης [118, 119]. Η κορυφή με την ασθενέστερη ένταση Raman στους 1055 cm -1, που συνοδεύει τις δύο κύριες κορυφές των θειομάδων της ηπαρίνης και της θειικής ηπαράνης, πηγάζει από τη δόνηση της - O-SO 3 ομάδας στον C (2) του ιδουρονικού οξέος [118]. Οι υπόλοιπες κορυφές στο φάσμα της ηπαρίνης εντοπίζονται στους εξής κυματάριθμους: 990 cm -1, 1005 cm -1, 1027 cm -1, 1092 cm -1, 1101 cm -1, 1116 cm -1, 1134 cm -1 και 1152 cm -1 και αντίστοιχα για τη θειική ηπαράνη στους: 989 cm -1, 1006 cm -1, 1030 cm -1, 1092 cm -1, 1115 cm -1, 1137 cm -1 και 1156 cm -1. Παρατηρείται μια τριπλή κορυφή στο φάσμα του υαλουρονικού οξέος (HA) στους 1029 cm - 1, 1047 cm -1 και 1056 cm -1, με τη δεύτερη να είναι η υψηλότερη σε ένταση Raman κορυφή και αποδίδεται μερικώς σε δονήσεις του δεσμού C-OH [117]. Η κορυφή στους 1056 cm -1 έχει ταυτοποιηθεί ως η δόνηση έκτασης των δεσμών C-O και C-C [120]. Περιοχή cm -1 Σε αυτήν την περιοχή τα φάσματα Raman των γλυκοζαμινογλυκανών επιδεικνύουν τις χαρακτηριστικές κορυφές που αντιπροσωπεύουν τις δονήσεις των καρβονυλο- και καρβοξυλοομάδων, τις δονήσεις παραμόρφωσης των μεθυλομάδων, καθώς και τις δονήσεις του αμιδίου ΙΙΙ. 91

108 Σχήμα 5.8. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της 4-θειικής χονδροϊτίνης (C-4S), θειικής χονδροϊτίνης (CS) και θειικής δερματάνης (DS). 92

109 Μελετώντας τα φάσματα καθεμίας από τις γλυκοζαμινογλυκάνες ξεχωριστά, διαπιστώνουμε ότι η θειική χονδροϊτίνη εμφανίζει κορυφές στους: 1204 cm -1, 1233 cm -1, 1271 cm -1, 1314 cm -1, 1344 cm -1, 1376 cm -1, 1416 cm -1 και 1458 cm -1, ενώ οι κορυφές της 4-θειικής χονδροϊτίνης παρουσιάζονται στους: 1202cm -1, 1242 cm -1, 1278 cm -1, 1315 cm -1, 1351 cm -1, 1381 cm -1, 1417 cm -1 και 1454 cm -1. Η θειική δερματάνη εμφανίζει κορυφές στους: 1234 cm -1, 1275 cm -1, 1318 cm -1, 1344 cm -1, 1376 cm -1, 1414 cm -1 και 1460 cm

110 Σχήμα 5.9. Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman της ηπαρίνης (HEP) και της θειικής ηπαράνης (HS). Στο φάσμα Raman της ηπαρίνης και της θειικής ηπαράνης παρατηρούμε κορυφές στους: 1207 cm -1, 1234 cm -1, 1268 cm -1, 1297 cm -1, 1325 cm -1, 1347 cm -1, 1368 cm -1, 1381 cm -1, 1420 cm -1 και 1464 cm -1 για την πρώτη και στους: 1206 cm -1, 1232 cm -1, 1266 cm -1, 1298 cm -1, 1324 cm -1, 1347 cm -1, 1379 cm -1, 1417 cm -1 και 1463 cm -1 για τη δεύτερη. 94

111 Με βάση φασματοσκοπικές μελέτες υπερύθρου σε δείγματα γλυκοζαμινογλυκανών που πραγματοποιήθηκαν από τον J.J. Cael και την ομάδα του [121], η κορυφή μικρής έντασης που εμφανίζεται στους cm -1 μπορεί να αποδοθεί σε δονήσεις παραμόρφωσης των δεσμών C-H και O-H των μονοϋποκατεστημένων αμιδίων, όπως αυτά που περιέχουν τα μόρια των γλυκοζαμινογλυκανών. Οι δονήσεις παραμόρφωσης των μεθυλομάδων (CH 3 ) είναι υπεύθυνες για τις κορυφές στους cm -1 στα φάσματα όλων των γλυκοζαμινογλυκανών [111], ενώ δονήσεις παραμόρφωσης των CH 2 εμφανίζονται ως μια ασθενούς έντασης κορυφή στους cm -1 [111]. Η κορυφή στους περίπου 1416 cm -1 οφείλεται σε συμμετρική δόνηση της καρβοξυλομάδας (COO - ) του ουρονικού οξέος [111, 116, 122]. Στο φάσμα Raman του υαλουρονικού οξέος, η ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή στους 1465 cm -1 έχει αποδοθεί από τους T.W. Barrett και W.L. Peticolas, οι οποίοι πραγματοποίησαν λήψη φασμάτων Raman σε διαλύματα υαλουρονικού οξέος διαφόρων ph, σε δονήσεις κάμψης CH 2 [120]. Η κορυφή στους 1406 cm -1 πηγάζει από τη συμμετρική δόνηση έκτασης της καρβοξυλομάδας του D-γλυκουρονικού οξέος (COO - ) [116]. Οι κορυφές που εμφανίζονται σε κυματάριθμους μεταξύ 200 cm -1 και 800 cm -1 στα φάσματα Raman των γλυκοζαμινογλυκανών έχουν αποδοθεί κυρίως στις σκελετικές δονήσεις των δακτυλίων των δισακχαριτικών μονάδων, ενώ σε αυτήν τη φασματική περιοχή εμφανίζονται και δονήσεις παραμόρφωσης της θειομάδας [111]. Στον πίνακα 5.1, παρουσιάζονται συνοπτικά οι κυματάριθμοι όπου εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές κορυφές, καθώς και οι δονήσεις στις οποίες αποδίδονται, στα φάσματα Raman των γλυκοζαμινογλυκανών που μελετήθηκαν. 95

112 Πίνακας 5.1. Κυματάριθμοι Raman (cm -1 ) στους οποίους εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις των διαφόρων γλυκοζαμινογλυκανών (CS: θειική χονδροϊτίνη, DS: θειική δερματάνη, HEP: ηπαρίνη, HS: θειική ηπαράνη, HA: υαλουρονικό οξύ). Κυματάριθμος (cm -1 ) CS C-4S DS HEP HS HA Απόδοση Βιβλιογραφική αναφορά 809 vw μ 803 sh 803 sh 800 m 826 vw 825 vw s 825 s - C-O-S [111, 115] sh C-O-S? 846 sh 845 sh - δ(c (1) -H) (α ανωμερή) [111] 859 s 857 s 867 s 856 m 856 m ν αsym (C-O-S) [111, 113] 879 m m 879 m δ(c (1) -H) (ισημερινή, β ανωμερή) [111, 123] 890 sh m 897 s 895 sh δ(c (1) -H) (αξονική, β ανωμερή) [111, 123] sh s C (1) -H [117] 928 s 939 s 941 sh 939 m - - C-O-C [111, 116] sh 946 sh sh sh 956 w 956 w sh 964 sh w 989 w 977 s C-O-S 998 vw 993 sh ν sym (C-O-S) [116] 1006 sh 1022 sh 1022 w w 1039 vw 1030 sh 1046 s 1046 s ν sym (Ν-SO - 3 ) [118] 1052 s 1054 s 1053 s 1047 s C-OH w 1056 w ν sym (O-SO - 3 ) [118] 1056 s ν(c-o), ν(c-c) [120] 1071 s 1072 m 1067 s 1071 s 1069 s - ν sym (O-SO - 3 ) [118, 119] 1089 sh 1094 m 1082 s 1092 vw 1092 w 1103 m 1101 w 1120 w 1120 w 1116 w 1115 w 1139 m 1139 w 1134 w 1137 w 1162 sh 1157 m 1156 br 1152 sh 1156 sh C-O & C-C 1204 vw 1202 vw 1207 sh 1206 sh 1185 s 1233 sh 1242 sh 1234 w 1234 w 1232 w 1257 s 1271 m 1278 m 1275 m 1267 m 1266 w 1297 m 1299 w 1296 s 1314 sh sh 1327 s 1324 sh C-H & O-H 1344 s 1351 s 1344 s 1350 s 1347 s αμίδιο III 1368 vw 1376 s 1381 sh 1376 s 1381 m 1379 m δ(ch 3 ) 96

113 1416 s 1417 s 1414 m 1418s 1416 m 1406 w ν sym (COO - ) [111, 116, 122] 1458 w 1454 sh 1460 w 1464 w 1463 w 1465 s δ(ch 2 ) s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), br: ευρεία (broad), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) Φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ Με χρήση της φασματοσκοπίας micro-raman καταγράφηκαν φάσματα κολλαγόνου τύπου Ι υπό μορφή σκόνης, το οποίο απομονώθηκε από οστό βοοειδούς αφότου είχε υποστεί επεξεργασία με EDTA για την απομάκρυνση του βιοαπατίτη, καθώς και φάσματα κολλαγόνου τύπου ΙΙ, απομονωμένου από αρθρικό χόνδρο. 97

114 Ένταση Raman COL II COL I Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα Φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι (COL Ι) και τύπου ΙΙ (COL ΙΙ). Με παρόμοιο τρόπο έγινε η επεξεργασία των φασμάτων Raman και για τους δύο τύπους κολλαγόνου στις αντίστοιχες περιοχές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στα σχήματα που ακολουθούν. 98

115 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι (COL I) και κολλαγόνου τύπου ΙΙ (COL II). Όπως φαίνεται στο σχήμα 5.11, η επεξεργασία των φασμάτων στη συγκεκριμένη περιοχή αποκάλυψε την ύπαρξη πέντε επιμέρους κορυφών για το κολλαγόνο τύπου Ι, οι οποίες εντοπίζονται στους εξής κυματάριθμους: 815 cm -1, 840 cm -1, 855 cm -1, 873 cm -1 και 884 cm -1. Στο φάσμα του κολλαγόνου τύπου ΙΙ, βλέπουμε τις αντίστοιχες κορυφές στους 815 cm -1,

116 cm -1, 857 cm -1, 877 cm -1 και 891 cm -1 αλλά διαπιστώνουμε και την ύπαρξη δύο επιπλέον κορυφών στους 826 cm -1 και 846 cm -1, οι οποίες οφείλονται στη θειική χονδροϊτίνη που περιέχει ο χόνδρος. Η ύπαρξη των κορυφών στους συγκεκριμένους κυματάριθμους έχει αναφερθεί από τους G.S. Mandair et al [124], οι οποίοι χρησιμοποίησαν τη φασματοσκοπία Raman για να εξετάσουν αλλαγές της φυσικοχημικής σύστασης μηριαίων οστών κεφαλών ποντικών που προκαλούνται σε συνθήκες διαστημικών πτήσεων. Οι κορυφές στους 855 cm -1 και 873 cm -1 έχουν σχετιστεί με τις δονήσεις κάμψης των δεσμών C-C-H και/ή δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C των αμινοξέων προλίνης και υδροξυπρολίνης της έλικας του κολλαγόνου [124]. Σύμφωνα με τη μελέτη των φασμάτων Raman από στερεά δείγματα κολλαγόνου τύπου Ι από ουρά βοοειδούς που πραγματοποιήθηκε από τους J.J. Carcamo et al [125], η κορυφή στους 815 cm -1 είναι αποτέλεσμα δονήσεων έκτασης των δεσμών C-C και C-O-C του πεπτιδικού δεσμού [125]. Ο M. Wisniewski και η ομάδα του [126] κατέγραψαν επίσης φάσματα Raman από φιλμ κολλαγόνου τύπου Ι που απομονώθηκε από τένοντες ουράς αρουραίων και απέδωσαν τις κορυφές στους 856 cm -1 και 876 cm -1 στις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C της προλίνης και της υδροξυπρολίνης αντίστοιχα [126]. Στις ίδιες δονήσεις των αμινοξέων προλίνης και υδροξυπρολίνης απέδωσαν οι N.S.J. Lim et al [127] τις κορυφές στους 855 cm -1 και 877 cm -1 που παρατηρήθηκαν στα φάσματα Raman που καταγράφηκαν από εμφυτεύματα χόνδρου που απομονώθηκαν από οπίσθια πόδια χοίρου [127]. 100

117 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι (COL I) και κολλαγόνο τύπου ΙΙ (COL II). Σε αυτήν την περιοχή, το φάσμα Raman του κολλαγόνου τύπου Ι εμφανίζει κορυφές στους 919 cm -1, 937 cm -1 και 963 cm -1, με τη δεύτερη να αποτελεί την ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή, ενώ όσον αφορά στο φάσμα του κολλαγόνου τύπου ΙΙ, οι κορυφές εντοπίζονται στους κυματάριθμους: 921 cm -1, 939 cm -1, 951 cm -1 και 964 cm

118 Οι K.A. Esmonde-White et al [128] χρησιμοποίησαν τη φασματοσκοπία micro-raman για να συλλέξουν φάσματα από χόνδρο, υποχόνδρινο οστό και σπογγώδες οστό από την εγγύς κερκίδα ανθρώπινου αντιβραχίου και αναφέρουν την ύπαρξη κορυφής στους 920 cm -1 τόσο στο φάσμα του αρθρικού χόνδρου (κολλαγόνο τύπου ΙΙ) όσο και στο φάσμα του υποχόνδρινου οστού (κολλαγόνο τύπου Ι), η οποία αντικατοπτρίζει τη δόνηση έκτασης του δεσμού C-C του δακτυλίου της προλίνης [128]. Στην ίδια δόνηση του δεσμού C-C της προλίνης απέδωσε και η ομάδα των M. Wisniewski et al [126] την κορυφή στους 921 cm -1 που παρατηρήθηκε σε φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι [126]. Η κορυφή στους cm -1, η οποία αποτελεί και την ισχυρότερη σε ένταση κορυφή Raman και για τους δύο τύπους κολλαγόνου, αποδίδεται σε δόνηση έκτασης του μη αρωματικού δεσμού C-C των αμινοξέων λυσίνης, βαλίνης και λευκίνης που περιέχει το κολλαγόνο [129]. Η κορυφή μικρής έντασης που εμφανίζεται στους 950 cm -1 οφείλεται στη θειική χονδροϊτίνη που περιέχει ο χόνδρος. Η κορυφή στους 964 cm -1 στο κολλαγόνο τύπου ΙΙ πηγάζει από τη δόνηση έκτασης του δεσμού C-C της προλίνης [125]. 102

119 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι (COL I) και κολλαγόνο τύπου ΙΙ (COL II). Στο κολλαγόνο τύπου Ι βλέπουμε την ύπαρξη επιμέρους κορυφών στους: 1003 cm -1, 1011 cm -1, 1033 cm -1, 1047 cm -1, 1062 cm -1, 1085 cm -1, 1096 cm -1, 1101 cm -1, 1106 cm -1 και 1127 cm

120 Αντίστοιχα, στο φάσμα Raman του κολλαγόνου τύπου ΙΙ παρατηρούνται κορυφές στους εξής κυματάριθμους: 997 cm -1, 1004 cm -1, 1010 cm -1, 1033 cm -1, 1045 cm -1, 1064 cm -1, 1082 cm -1, 1097 cm -1, 1101 cm -1, 1106 cm -1 και 1128 cm -1. Πρέπει να τονιστεί ότι η μικρής έντασης κορυφή που εμφανίζεται στους 998 cm -1 στο φάσμα του κολλαγόνου τύπου ΙΙ οφείλεται στη θειική χονδροϊτίνη. Μία από τις χαρακτηριστικές κορυφές και για τους δύο τύπους κολλαγόνου είναι η οξεία κορυφή στους 1003 cm -1 και προέρχεται από τη δόνηση αναπνοής (breathing) του βενζοϊκού δακτυλίου της φαινυλαλανίνης της έλικας του κολλαγόνου [126]. Η ίδια δόνηση του δακτυλίου της φαινυλαλανίνης είναι υπεύθυνη και για την κορυφή στους 1033 cm -1 στα φάσματα του κολλαγόνου [126]. Η ερευνητική ομάδα των K.A. Esmonde-White et al [128] αποδίδουν την κορυφή στους 1063 cm -1 στη συμμετρική δόνηση έκτασης της θειομάδας στα φάσματα Raman του αρθρικού χόνδρου που κατέγραψαν [128]. Οι G. Penel et al [129], κατά τη λήψη φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι, αναφέρουν ότι οι δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C των φωσφολιπιδίων είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση της κορυφής στους 1097 cm -1 στα φάσματα και των δύο τύπων κολλαγόνου [129], ενώ η χαμηλής έντασης κορυφή στους 1103 cm -1 στο φάσμα του κολλαγόνου τύπου Ι αποδόθηκε στις δονήσεις των ανθρακικών υποκαταστατών (CO 2-3 ) Α τύπου [129]. Ο J.J. Carcamo και η ομάδα του [130] παρατήρησαν την ύπαρξη μιας κορυφής στους 1101 cm -1 στα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι από ουρά βοοειδούς που κατέγραψαν, την οποία απέδωσαν σε δόνηση παραμόρφωσης του δεσμού C-N-H της προλίνης [130]. Η ίδια ερευνητική ομάδα αναφέρει ότι δονήσεις έκτασης του δεσμού C-N της προλίνης προκαλούν την εμφάνιση μιας ασθενούς έντασης κορυφής στους 1064 cm -1 [130]. Η κορυφή στους cm -1 στα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι και κολλαγόνου τύπου ΙΙ προέρχεται από τις δονήσεις έκτασης των trans δεσμών C-C φωσφολιπιδίων και πρωτεϊνών [129]. Οι θέσεις των κορυφών που παρατηρήθηκαν στα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι και κολλαγόνου τύπου ΙΙ, καθώς και η απόδοσή τους παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στον παρακάτω πίνακα. 104

121 Πίνακας 5.2. Κυματάριθμοι Raman (cm -1 ) στους οποίους εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις των δύο τύπων κολλαγόνου (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, COL II: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη). COL I COL ΙI Απόδοση Ομάδες Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 815 w 815 w ν(c-c), ν(c-o-c) Πεπτιδικός δεσμός (protein backbone) [125] sh 840 sh 840 sh sh Θειική χονδροϊτίνη (CS) 855 m 857 m ν(c-c) Προλίνη (Pro) [124, 126] 873 m 877 m ν(c-c) Υδροξυπρολίνη (Hyp) [124, 126] 884 sh 891 sh 919 m 921 m ν(c-c) Δακτύλιος της προλίνης (Pro ring) [128] 937 m 939 m ν(c-c) Λυσίνη, Βαλίνη, Λευκίνη (Lys, Val,Leu) [129] sh 963 sh 964 sh ν(c-c) Προλίνη (Pro) [125] sh Θειική χονδροϊτίνη (CS) 1003 s 1004 s ν(c-c) Φαινυλαλανίνη (Phe) [126] 1012 sh 1011 sh 1033 m 1033 m ν(c-c) Φαινυλαλανίνη (Phe) [126] 1048 m 1045 m 1062 m 1064 m ν(c-n) v sym (OSO 3 - ) Προλίνη (Pro), COL I CS, COL IΙ 1085 w 1083 w ν(c-n) Προλίνη (Pro) [125] 1097 w 1097 w ν(c-c) Φωσφολιπίδια [129] 1102 vw 1101 vw δ(n-c-h) Προλίνη (Pro)/Ανθρακικά (CO 3 2- ) A τύπου [129] 1106 w 1106 w 1129 w 1128 w ν(c-c)trans Φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες [129] [130] [128] s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) 105

122 5.2 Μελέτη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου με φασματοσκοπία Raman Για τη φασματοσκοπική μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου, παρασκευάστηκαν μίγματα των δύο ουσιών με δύο τρόπους: κολλαγόνο (τύπου Ι ή τύπου ΙΙ) εμβαπτίστηκε σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης ή ηπαρίνης παρασκευάστηκαν μίγματα γλυκοζαμινογλυκάνης (θειικής χονδροϊτίνης ή ηπαρίνης)-κολλαγόνου τύπου Ι με ανάμιξη των δύο συστατικών με διάφορους τρόπους Μελέτη των εμβαπτίσεων κολλαγόνου τύπου Ι σε διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών με φασματοσκοπία Raman Στο σχήμα 5.14 παρουσιάζονται τα φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτισμένου σε διάλυμα ηπαρίνης, καθώς και κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτισμένου σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης και συγκρίνονται με τα φάσματα κολλαγόνου τύπου Ι, ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης. 106

123 Ένταση Raman COL I COL I-HEP COL I-CS CS HEP Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα Φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτισμένου σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL I-CS), κολλαγόνου τύπου Ι εμβαπτισμένου σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP), καθώς και των αντίστοιχων προτύπων ουσιών (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Τα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν από τα υπό μελέτη μίγματα παρουσιάζουν τα κύρια χαρακτηριστικά τους στη φασματική περιοχή cm -1, όπως φαίνεται στο παραπάνω σχήμα. 107

124 Λόγω της αλληλεπικάλυψης κορυφών, κρίθηκε απαραίτητος ο διαχωρισμός των κορυφών χρησιμοποιώντας το ίδιο λογισμικό (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Τα επεξεργασμένα φάσματα από κάθε μίγμα γλυκοζαμινογλυκάνης-κολλαγόνου που μελετήθηκε στην εκάστοτε περιοχή ενδιαφέροντος παρουσιάζονται στα σχήματα που ακολουθούν και γίνεται σύγκριση με τα φάσματα των αντίστοιχων προτύπων ουσιών. 108

125 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL I-CS: κολλαγόνο τύπου Ι σε θειική χονδροϊτίνη, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη). 109

126 Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται και αποδίδονται καταγράφηκαν στο φάσμα του μίγματος κολλαγόνου τύπου Ι-θειικής χονδροϊτίνης. οι κορυφές που Πίνακας 5.3. Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου Ι που εμβαπτίστηκε σε θειική χονδροϊτίνη (COL I-CS) και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-CS COL I CS Κυματάριθμος (cm -1 ) Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά 816 w - ν(c-c), ν(c-o-c), COL I [125] 839 sh sh m 874 m ν(c-c), COL I ν(c-o-s), CS ν(c-c), COL I δ(c (1) -H), CS [126] [111] [126] [111] 885 sh δ(c (1) -H), CS [111] w: μικρής έντασης (weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) Στο φάσμα του μίγματος COL I-CS μπορούμε να δούμε τις κύριες κορυφές του κολλαγόνου στους 856 cm -1 και 874 cm -1 που έχουν σχετιστεί με τις δονήσεις έκτασης του δεσμού C-C της προλίνης και της υδροξυπρολίνης αντίστοιχα [126] και αποτελούν και τις υψηλότερες σε ένταση Raman κορυφές του φάσματος. Άλλη μία χαρακτηριστική κορυφή που κολλαγόνου παρατηρείται στους 885 cm -1. Όμως, στους 859 cm -1 εμφανίζονται οι δονήσεις των δεσμών C- O-S των θειομάδων της θειικής χονδροϊτίνης, ενώ οι κορυφές στους 883 cm -1 και 894 cm -1 που υπάρχουν στο φάσμα της, σχετίζονται με τη δόνηση παραμόρφωσης του δεσμού C (1) -H [111]. 110

127 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε ηπαρίνη, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη). 111

128 Ο παρακάτω πίνακας περιέχει συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα της επεξεργασίας της συγκεκριμένης περιοχής του παραπάνω φάσματος. Πίνακας 5.4. Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου Ι που εμβαπτίστηκε σε ηπαρίνη (COL I-HEP) και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-HEP COL I HEP Κυματάριθμος (cm -1 ) Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά 816 w - ν(c-c), ν(c-o-c) [125] 826 w - ν(c-o-s), HEP [115] 840 sh m ν(c-c), COL I ν(c-o-s), HEP [126] [113] 879 m ν(c-c), COL I [126] 894 sh ν(c-o-s & C-O-C), HEP [115] w: μικρής έντασης (weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching) Η μορφολογία του φάσματος του μίγματος COL I-HEP μαρτυρά επίσης την συνύπαρξη των δύο συστατικών του. Οι κορυφές στους 856 cm -1 και 879 cm -1 παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη ένταση Raman και προέρχονται και από τα δύο συστατικά του μίγματος. Το ίδιο ισχύει και για τη δόνηση που εντοπίζεται στους 894 cm -1, καθώς το φάσμα του κολλαγόνου τύπου Ι εμφανίζει μια κορυφή στους 884 cm -1, ενώ το φάσμα της ηπαρίνης στους 897 cm -1. Η τελευταία είναι αποτέλεσμα της σύζευξης δονήσεων έκτασης των δεσμών C-O-S και των δεσμών C-O-C του δακτυλίου του σακχάρου [115]. Συνοψίζοντας, η μορφολογία της περιοχής cm -1 στα φάσματα των μιγμάτων GAGsκολλαγόνο τύπου I μοιάζει περισσότερο με εκείνη του φάσματος του κολλαγόνου, ενώ η παρουσία γλυκοζαμινογλυκάνης φαίνεται πιο έντονα στο φάσμα του μίγματος με την ηπαρίνη. Μικρές τροποποιήσεις στα φάσματα των μιγμάτων παρατηρήθηκαν, οι οποίες αφορούν 112

129 κυρίως στη μετατόπιση των μεγίστων των κορυφών του κολλαγόνου από τους 855 cm -1 και 873 cm -1 σε υψηλότερους κυματάριθμους και οφείλονται κυρίως στη συνύπαρξη των ουσιών στα δυαδικά μίγματα. 113

130 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL I-CS: κολλαγόνο τύπου Ι σε θειική χονδροϊτίνη, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη). 114

131 Τα αποτελέσματα της επεξεργασίας σε αυτήν την περιοχή του φάσματος που καταγράφηκε για το μίγμα κολλαγόνου Ι- θειικής χονδροϊτίνης παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 5.5. Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου Ι που εμβαπτίστηκε σε θειική χονδροϊτίνη (COL I-CS) και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-CS COL I CS Κυματάριθμος (cm -1 ) Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά 921 m - ν(c-o-c), COL I [128] 938 m 950 sh - ν(c-c), COL I ν(c-c), CS [129] [116] 961 sh - ν(c-c), COL I [125] 981 w - (977) ν asym (C-O-S), CS [111] w: μικρής έντασης (weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) Η επεξεργασία του φάσματος του μίγματος COL I-CS στη φασματική αυτή περιοχή αποκάλυψε την ύπαρξη κορυφών που πηγάζουν από χαρακτηριστικές δονήσεις των δεσμών που περιέχει τόσο το κολλαγόνο όσο και η θειική χονδροϊτίνη. Η μεγαλύτερη σε ένταση Raman κορυφή στο συγκεκριμένο φάσμα εμφανίζεται στους 921 cm -1 και προκύπτει από τις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-O-C του δακτυλίου της προλίνης του κολλαγόνου [128]. Δονήσεις έκτασης των σκελετικών δεσμών C-C που υπάρχουν στο μόριο της θειικής χονδροϊτίνης [116], καθώς και δονήσεις έκτασης του μη αρωματικού δεσμού C-C διαφόρων αμινοξέων που περιέχει το κολλαγόνο [129] είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση της κορυφής στους 938 cm

132 Παρατηρείται η κορυφή χαμηλής έντασης στους 981 cm -1. Δεδομένου ότι στο φάσμα του κολλαγόνου δεν εμφανίζεται κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο, η πιο κοντινή δόνηση στην οποία θα μπορούσε να αποδοθεί είναι εκείνη των δεσμών C-O-S των θειομάδων που περιέχει η θειική χονδροϊτίνη. Η δόνηση αυτή, όμως, στο φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης εμφανίζεται στους 977 cm -1 ως μία χαμηλής έντασης κορυφή, σε σύγκριση με μια άλλη χαρακτηριστική κορυφή του φάσματος στους 939 cm -1. Στο φάσμα όμως του μίγματος, η ένταση της κορυφής αυτής φαίνεται να είναι μεγαλύτερη, αν τη συγκρίνουμε με την κορυφή στους 938 cm

133 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε ηπαρίνη, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη). 117

134 Ο πίνακας που ακολουθεί συγκεντρώνει τις θέσεις των κορυφών που παρατηρήθηκαν στο φάσμα του μίγματος κολλαγόνου Ι-ηπαρίνης. Πίνακας 5.6. Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου Ι που εμβαπτίστηκε σε ηπαρίνη (COL I-HEP) και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-HEP COL I HEP Κυματάριθμος (cm -1 ) Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά 922 m - ν(c-o-c), COL I [128] 938 m - ν(c -C), COL I [129] 946 vw sh vw sh ν(c-c), COL I [125] 981 w - - w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) Οι μεγαλύτερες σε ένταση Raman κορυφές του φάσματος του μίγματος COL I-HEP προέρχονται από τις δονήσεις της προλίνης του κολλαγόνου και εντοπίζονται στους 922 cm -1 και 938 cm -1 [128, 129]. Η κορυφή στους 964 cm -1 οφείλεται τόσο σε δονήσεις των δεσμών C-C της προλίνης του κολλαγόνου [125] όσο και σε δονήσεις που προέρχονται από δονήσεις των ομάδων της ηπαρίνης. Αξιοσημείωτη είναι η εμφάνιση της κορυφής στους 981 cm -1 στο φάσμα του μίγματος COL I- HEP, η οποία δεν μπορεί να αποδοθεί στην ηπαρίνη ή στο κολλαγόνο, λόγω απουσίας κορυφής σε αυτόν τον κυματάριθμο στα αντίστοιχα φάσματα των προτύπων ουσιών. Με βάση τις βιβλιογραφικές αναφορές των R. Bansil et al, κορυφές στους 977 cm -1 έχουν σχετιστεί με τις δονήσεις των δεσμών C-O-S των θειομάδων που περιέχονται στις θειωμένες 118

135 γλυκοζαμινογλυκάνες. Η D.C.W. Siew και η ομάδα της [131], πραγματοποιώντας φασματοσκοπικές μελέτες σε θειική δεξτράνη, κατέγραψαν μια κορυφή στους 985 cm -1 στα φάσματα Raman και την απέδωσαν σε ασύμμετρη δόνηση έκτασης του δεσμού C-O-S, συζευγμένη με δονήσεις έκτασης των δεσμών C-O, C-C, C-C-H του σκελετού του υδατάνθρακα (carbohydrate backbone). Συνεπώς, η δόνηση που παρατηρείται στους 981 cm -1 στο φάσμα Raman του παραπάνω μίγματος προέρχεται από το δεσμό C-O-S. 119

136 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL I-CS: κολλαγόνο τύπου Ι σε θειική χονδροϊτίνη, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη). 120

137 Ο πίνακας που ακολουθεί περιέχει τις θέσεις των κορυφών στις οποίες εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις στη συγκεκριμένη περιοχή του φάσματος του μίγματος κολλαγόνου τύπου Ι και θειικής χονδροϊτίνης. Πίνακας 5.7. Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου Ι που εμβαπτίστηκε σε θειική χονδροϊτίνη (COL I-CS) και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-CS COL I CS Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 998 sh - v sym (C-O-S), CS [116] 1004 s - ν(c -C), COL I [126] 1024 sh m - ν(c -C), COL I [126] 1037 vw m w - C-OΗ, CS [111] 1063 m (1070) ν(c N), COL I 1073 w - - ν sym (O-SO 3 - ), CS [130] [116] 1084 w ν(c N), COL I [125] 1096 w - ν(c -C), COL I [129] 1102 vw w 1120 vw w - ν(c -C) trans, COL I [129] 1139 sh - s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) 121

138 Στο φάσμα του μίγματος του κολλαγόνου Ι με τη θειική χονδροϊτίνη, είναι εμφανείς οι κορυφές που απορρέουν και από τα δύο συστατικά του μίγματος. Ειδικότερα, μερικές από τις δονήσεις των ομάδων που περιέχονται στο μόριο της θειικής χονδροϊτίνης εμφανίζονται στους 998 cm -1, 1024 cm -1, 1037 cm -1 και 1053 cm -1. Σε γενικές γραμμές, το φάσμα Raman του μίγματος στην περιοχή αυτή, παρουσιάζει τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου, με την κορυφή που προέρχεται από τη δόνηση αναπνοής (breathing) της φαινυλαλανίνης του κολλαγόνου στους 1004 cm -1 να αποτελεί την κορυφή με την ισχυρότερη ένταση Raman. Στο φάσμα Raman του μίγματος COL I-CS, παρατηρείται μια κορυφή στους 1063 cm -1, η οποία με μια πρώτη ματιά θα μπορούσε να αποδοθεί στη δόνηση έκτασης του δεσμού C N της προλίνης του κολλαγόνου [130], καθώς δεν εμφανίζεται κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο στο φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης. Η κορυφή αυτή, όμως, στο φάσμα του κολλαγόνου έχει μικρότερη ένταση Raman σε σύγκριση με τη γειτονική χαρακτηριστική κορυφή των δονήσεων του δακτυλίου της φαινυλαλανίνης του κολλαγόνου στους 1033 cm -1. Στο φάσμα του μίγματος, η ένταση της κορυφής στους 1063 cm -1 αυξάνεται και έχει σχεδόν την ίδια ένταση Raman με εκείνη στους 1033 cm -1. Η πιο κοντινή δόνηση στην οποία θα μπορούσε να αποδοθεί είναι εκείνη των θειομάδων της θειικής χονδροϊτίνης, η οποία στο φάσμα της ουσίας εμφανίζεται στους 1070 cm -1. Παρατηρείται επίσης και η εμφάνιση μιας κορυφής στους 1073 cm -1, η οποία δεν υπάρχει στα φάσματα των προτύπων ουσιών. 122

139 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε ηπαρίνη, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη). 123

140 Πίνακας 5.8. Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου Ι που εμβαπτίστηκε σε ηπαρίνη (COL I-HEP) και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-HEP COL I HEP Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμοι (cm -1 ) 1004 m - ν(c-c), COL I [126] 1026 sh w - ν(c-c), COL I [126] 1045 m ν sym (N-SO 3 - ), HEP [118] 1053 w - ν sym (O-SO 3 - ), HEP [118] 1062 s (1071) ν(c N), COL I 1072 w - - ν sym (O-SO 3 - ), HEP [130] [118] 1082 w - ν(c N), COL I [125] 1095 w ν(c-c), COL I [129] 1101 vw 1105 w sh vw - ν(c-c) trans, COL I [129] s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) Όπως φαίνεται στο σχήμα 5.20, στη συγκεκριμένη περιοχή του φάσματος του μίγματος COL I-HEP, παρατηρούνται κορυφές που μπορούν να αποδοθούν σε δονήσεις των δεσμών των μορίων είτε του κολλαγόνου ή της ηπαρίνης. Η γενική μορφολογία του φάσματος του μίγματος θυμίζει περισσότερο τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου τύπου Ι παρά της ηπαρίνης, αλλά υπάρχουν κάποιες σημαντικές διαφοροποιήσεις. 124

141 Η ένταση Raman της κορυφής στους 1045 cm -1 έχει αυξηθεί στο φάσμα του δυαδικού μίγματος αν τη συγκρίνουμε με τη γειτονική κορυφή στους 1004 cm -1, ενώ στο φάσμα του κολλαγόνου έχει μικρότερη ένταση Raman από την κορυφή της φαινυλαλανίνης στους 1003 cm -1. Αυτό συμβαίνει γιατί σε αυτόν τον κυματάριθμο, εκτός από τις δονήσεις έκτασης του δεσμού C-C του βενζολικού δακτυλίου της φαινυλαλανίνης που περιέχει το κολλαγόνο [126], - εμφανίζονται και οι δονήσεις των N-SO 3 ομάδων που περιέχονται στο μόριο της ηπαρίνης [118]. Οι τελευταίες είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση της δεύτερης πιο ισχυρής σε ένταση Raman κορυφής που εμφανίζεται στους 1046 cm -1 στο φάσμα της ηπαρίνης. Η ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή που παρατηρείται στο φάσμα του μίγματος COL I- HEP είναι η κορυφή στους 1062 cm -1. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι οι δονήσεις έκτασης του δεσμού C N της προλίνης του κολλαγόνου προκαλούν την εμφάνιση μιας ασθενούς έντασης κορυφή στους 1063 cm -1 [130]. Η συγκεκριμένη κορυφή στους 1062 cm -1 στο φάσμα του κολλαγόνου τύπου Ι έχει χαμηλότερη ένταση Raman σε σχέση με τη γειτονική κορυφή στους 1033 cm -1, η οποία αντιπροσωπεύει τη δόνηση του δεσμού C-C του δακτυλίου της φαινυλαλανίνης του κολλαγόνου [126]. Συνεπώς, συγκρίνοντας την κορυφή στους 1062 cm -1 που παρατηρείται στο φάσμα Raman του μίγματος με την κορυφή του κολλαγόνου στους 1033 cm -1 διαπιστώνεται ότι η κορυφή στους 1062 cm -1 στο φάσμα του μίγματος δεν αντιστοιχεί στη δόνηση της προλίνης του κολλαγόνου. Λαμβάνοντας υπ όψιν τα παραπάνω και το φάσμα της ηπαρίνης, η ισχυρή σε ένταση Raman κορυφή που παρατηρείται στους 1062 cm -1 πηγάζει από τη συμμετρική δόνηση έκτασης των θειομάδων που περιέχονται στην ηπαρίνη, η οποία εμφανίζεται στους 1071 cm -1 στο φάσμα της ηπαρίνης [118]. Στο φάσμα του μίγματος διακρίνεται και μία μικρότερης έντασης κορυφή στους 1072 cm -1 που δεν μπορεί να αποδοθεί στην ηπαρίνη ή στο κολλαγόνο, καθώς καμία από τις δύο ουσίες δεν εμφανίζει κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο. 125

142 5.2.2 Μελέτη των εμβαπτίσεων κολλαγόνου τύπου ΙΙ σε διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών με φασματοσκοπία Raman Δύο από τα κύρια συστατικά του αρθρικού χόνδρου είναι το κολλαγόνο τύπου ΙΙ [132] και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (κυρίως 4-θειική χονδροϊτίνη και 6-θειική χονδροϊτίνη) που απαντώνται με τη μορφή πρωτεογλυκανών στο χόνδρο [106]. Εφαρμόστηκε μια διαδικασία που είχε ως σκοπό την απομάκρυνση της θειικής χονδροϊτίνης από το χόνδρο, κατά την οποία πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές εκπλύσεις του λυοφιλιοποιημένου χόνδρου με απόλυτη αιθανόλη ή ακετόνη που κατακρημνίζουν τις γλυκοζαμινογλυκάνες. Από τα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν μετά τις εκπλύσεις (σχήμα 5.21), διαπιστώθηκε ότι η θειική χονδροϊτίνη δεν είχε απομακρυνθεί. 126

143 Σχήμα Φάσματα Raman λυοφιλιοποιημένου χόνδρου πριν (Α) και μετά από εκπλύσεις με αιθανόλη (Β) και ακετόνη (Γ). Προχωρήσαμε στη συνέχεια στη συλλογή φασμάτων Raman από τα μίγματα που προέκυψαν από την εμβάπτιση του χόνδρου σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης ή ηπαρίνης, τα οποία παρουσιάζονται στο σχήμα που ακολουθεί. 127

144 Ένταση Raman COL II COL II-HEP COL II-CS Μετατόπιση Raman (cm -1 ) CS HEP Σχήμα Φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ εμβαπτισμένου σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL IΙ-CS), κολλαγόνου τύπου ΙΙ εμβαπτισμένου σε διάλυμα ηπαρίνης (COL IΙ-HEP), καθώς και των αντίστοιχων προτύπων ουσιών (COL IΙ κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). Για την επεξεργασία των φασμάτων των διαφόρων μιγμάτων των γλυκοζαμινογλυκανών με το κολλαγόνο τύπου ΙΙ, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία σε κάθε φασματική περιοχή. 128

145 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL IΙ-CS: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε θειική χονδροϊτίνη, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη). 129

146 Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επεξεργασία του φάσματος της θειικής χονδροϊτίνης με το κολλαγόνο τύπου ΙΙ στη συγκεκριμένη φασματική περιοχή παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 5.9. Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου ΙΙ που εμβαπτίστηκε σε θειική χονδροϊτίνη (COL IΙ-CS) και η απόδοσή τους (COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μίγμα Συστατικό COL IΙ-CS COL IΙ CS Κυματάριθμος (cm -1 ) Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά 815 w - ν(c-c), ν(c-o-c) [125] 828 sh sh sh m ν(c-c), COL IΙ ν(c-o-s), CS 865 sh 876 m ν(c-c), COL IΙ δ(c (1) -H), CS [126] [111] [126] [111] 892 sh δ(c (1) -H), CS [111] w: μικρής έντασης (weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) Μελετώντας την περιοχή αυτή στο μίγμα COL IΙ-CS, διαπιστώθηκε ότι το φάσμα Raman του μίγματος χαρακτηρίζεται κυρίως από τις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C διαφόρων αμινοξέων του κολλαγόνου που εμφανίζονται στους 856 cm -1 και 876 cm -1 [125, 126], ενώ σε αυτούς τους κυματάριθμους εμφανίζονται και οι δονήσεις έκτασης των δεσμών C-O-S και οι 130

147 δονήσεις παραμόρφωσης των δεσμών C (1) -H της θειικής χονδροϊτίνης [111]. Η κορυφή επίσης στους 892 cm -1 μπορεί να αποδοθεί τόσο στο κολλαγόνο όσο και στη θειική χονδροϊτίνη. 131

148 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα ηπαρίνης (COL IΙ-HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε ηπαρίνη, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη). 132

149 Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται οι κορυφές που καταγράφηκαν στο φάσμα του κολλαγόνου ΙΙ μετά την εμβάπτισή του σε διάλυμα ηπαρίνης. Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου ΙΙ που εμβαπτίστηκε σε ηπαρίνη (COL ΙI-HEP) και η απόδοσή τους (COL ΙI: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL IΙ-HEP COL IΙ HEP Κυματάριθμος (cm -1 ) Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά 816 w - ν(c-c), ν(c-o-c) [125] 827 w - ν(c-o-s), HEP [115] 840 sh m ν(c-c), COL IΙ ν(c-o-s), HEP [126] [115] 880 m ν(c-c), COL ΙI [126] 893 sh ν(c-o-s & C-O-C), HEP [115] w: μικρής έντασης (weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) Ομοίως, το φάσμα του μίγματος COL IΙ-HEP στην περιοχή που μελετάται, παρουσιάζει τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου τύπου ΙΙ με τις κορυφές στους 856 cm -1 και 880 cm -1 να χαρακτηρίζονται από τη μεγαλύτερη ένταση Raman. Οι κορυφές αυτές πηγάζουν από τις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C των αμινοξέων προλίνης και υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου αντίστοιχα [126], ενώ και η δόνηση των δεσμών C-O-S της ηπαρίνης προκαλούν την εμφάνιση κορυφής στους 856 cm -1 [115]. Η κορυφή στους 893 cm -1 προέρχεται τόσο από τη σύζευξη των δονήσεων έκτασης των δεσμών C-O-S και C-O-C της ηπαρίνης [115], όσο και από δονήσεις των δεσμών ομάδων που περιέχονται στο κολλαγόνο. Όμως, στο φάσμα Raman αυτού του μίγματος, η παρουσία της γλυκοζαμινογλυκάνης είναι πιο έντονη. Αυτό φαίνεται 133

150 κυρίως από την κορυφή στους 827 cm -1 που αντιπροσωπεύει τη δόνηση έκτασης των δεσμών C-O-S της εξοζαμίνης της ηπαρίνης [115]. 134

151 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL IΙ-CS: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε θειική χονδροϊτίνη, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη). 135

152 Οι θέσεις των μεγίστων των κορυφών του φάσματος παρουσιάζονται συνοπτικά στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας Οι κορυφές που παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου ΙI που εμβαπτίστηκε σε θειική χονδροϊτίνη (COL II-CS) και η απόδοσή τους (COL II: κολλαγόνο τύπου ΙI, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μίγμα Συστατικό COL II-CS COL II CS Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 922 m - ν(c-c), COL IΙ [128] 939 m ν(c-c), COL IΙ 949 sh - ν(c-c), CS [129] [116] 962 sh ν(c-c), COL IΙ [125] 977 sh - C-O-S, CS [111] m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) H περιοχή αυτή του φάσματος του μίγματος COL ΙI-CS περιλαμβάνει τις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C της προλίνης του κολλαγόνου που εμφανίζονται στους 922 cm -1 και 962 cm -1 [125], καθώς και τις κορυφές στους 949 cm -1 και 977 cm -1 που προέρχονται από τη θειική χονδροϊτίνη. Η κορυφή στους 939 cm -1 πηγάζει από τη σκελετική δόνηση του δεσμού C-C της θειικής χονδροϊτίνης [116] και τη δόνηση έκτασης του μη αρωματικού δεσμού C-C των αμινοξέων λυσίνης, βαλίνης και ισολευκίνης που περιέχει το κολλαγόνο [129]. 136

153 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή σε διάλυμα ηπαρίνης (COL IΙ-HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε ηπαρίνη, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη). 137

154 Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου ΙΙ που εμβαπτίστηκε σε ηπαρίνη (COL ΙI-HEP) και η απόδοσή τους (COL ΙI: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL II-HEP COL II HEP Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 922 w - ν(c-c), COL IΙ [128] 940 m - ν(c-c), COL IΙ [129] 946 vw sh vw sh ν(c-c), COL IΙ [125] 978 sh - - C-O-S, CS [111] w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) Στο φάσμα του μίγματος COL ΙI-HEP, μπορούν να αναγνωριστούν οι δονήσεις που προέρχονται και από τις δύο ουσίες του μίγματος. Η κορυφή στους 964 cm -1 αποδίδεται στη δόνηση έκτασης του δεσμού της προλίνης του κολλαγόνου [125], αλλά και η ηπαρίνη παρουσιάζει έναν ώμο (shoulder) στους 964 cm -1. Πρέπει να τονιστεί επίσης ότι διακρίνονται και δύο κορυφές στους 952 cm -1 και 978 cm -1 που προέρχονται από τις δονήσεις των δεσμών των ομάδων της θειικής χονδροϊτίνης, η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του χόνδρου. Η ένταση της κορυφής του κολλαγόνου τύπου ΙΙ στους 940 cm -1, σε σύγκριση με τη διπλανή κορυφή του κολλαγόνου στους 922 cm -1, ενισχύεται στο φάσμα του μίγματος με την ηπαρίνη, παρ όλο που το φάσμα της ηπαρίνης δεν εμφανίζει κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο. 138

155 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης (COL IΙ-CS: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε θειική χονδροϊτίνη, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη). 139

156 Η επεξεργασία του φάσματος του δείγματος COL IΙ-CS αποκάλυψε την ύπαρξη αρκετών επιμέρους κορυφών στη συγκεκριμένη φασματική περιοχή που παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου ΙΙ που εμβαπτίστηκε σε θειική χονδροϊτίνη (COL IΙ-CS) και η απόδοσή τους (COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μίγμα Συστατικό COL II-CS COL II CS Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 999 sh - v sym (C-O-S), CS [116] 1005 s - v(c-c), COL IΙ [126] 1011 sh m - v(c-c), COL ΙI [126] 1036 w w w - C-OH [111] 1064 s v sym (O-SO 3 - ), CS [116] 1072 w w v(c-n), COL IΙ [125] 1098 w - v(c-c), COL IΙ [129] 1102 vw 1105 w sh w - v(c-c) trans, COL IΙ [129] 1137 sh - s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) 140

157 Η επεξεργασία της περιοχής αυτής στο φάσμα του μίγματος COL IΙ-CS αποκάλυψε ότι η μορφολογία της περιοχής αυτής είναι παρόμοια με εκείνη του φάσματος του κολλαγόνου τύπου ΙΙ. Το φάσμα του μίγματος χαρακτηρίζεται από τις κορυφές του κολλαγόνου τύπου ΙΙ και τις κορυφές της θειικής χονδροϊτίνης. Δεν παρατηρείται κάποια ιδιαίτερη τροποποίηση του φάσματος του μίγματος, αλλά εμφανίζεται η κορυφή στους 1072 cm -1, η οποία δεν απαντάται στα αντίστοιχα φάσματα των προτύπων ουσιών. 141

158 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα ηπαρίνης (COL IΙ-HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε ηπαρίνη, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη). 142

159 Ομοίως, τα αποτελέσματα της επεξεργασίας της περιοχής αυτής του φάσματος του μίγματος κολλαγόνου ΙΙ-ηπαρίνης συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 του φάσματος Raman του κολλαγόνου τύπου ΙΙ που εμβαπτίστηκε σε ηπαρίνη (COL ΙI-HEP) και η απόδοσή τους (COL ΙI: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL II-HEP COL II HEP Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 996 sh 1005 s - v(c-c), COL IΙ [126] 1011 sh m - v(c-c), COL IΙ [126] 1036 w CS 1045 w v sym (N-SO - 3 ), HEP [118] 1053 w - v sym (O-SO 3 - ), HEP [118] 1064 m v sym (O-SO 3 - ), HEP [118] 1072 w w v(c-n), COL IΙ [125] 1098 w v(c-c), COL IΙ [129] 1102 vw 1105 w sh w sh - v(c-c) trans, COL IΙ [129] s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching) 143

160 Και στο φάσμα του μίγματος COL IΙ-HEP κυριαρχούν οι κορυφές που πηγάζουν από το κολλαγόνο τύπου ΙΙ, αλλά παρατηρούνται και κορυφές που είναι αποτέλεσμα δονήσεων των χαρακτηριστικών ομάδων της ηπαρίνης, όπως για παράδειγμα οι δονήσεις των θειομάδων που περιέχει και εμφανίζονται στη συγκεκριμένη φασματική περιοχή [118]. Διακρίνονται, επίσης, και κάποιες κορυφές, όπως εκείνη στους 996 cm -1, που πηγάζουν από δονήσεις της θειικής χονδροϊτίνης που περιέχει ο χόνδρος. Συνοψίζοντας, στα φάσματα Raman των μιγμάτων του κολλαγόνου τύπου Ι που μελετήθηκαν, παρατηρήθηκε μια ελαφριά μετατόπιση των μεγίστων των κορυφών του κολλαγόνου, κυρίως στην περιοχή cm -1, λόγω της συνύπαρξης των συστατικών στα δυαδικά μίγματα, ενώ η παρουσία της ηπαρίνης προκαλεί πιο έντονη τροποποίηση της μορφολογίας του φάσματος σε σχέση με τη θειική χονδροϊτίνη. Πρέπει να επισημανθεί ότι σε κανένα από τα φάσματα των μιγμάτων των γλυκοζαμινογλυκανών με κολλαγόνο τύπου ΙΙ δεν παρατηρήθηκε η ύπαρξη κορυφής στους 981 cm -1, όπως συνέβη στην περίπτωση των μιγμάτων τους με το κολλαγόνο τύπου Ι. Παρατηρείται μόνο μια ασθενούς έντασης κορυφή στους 977 cm -1 που πηγάζει από την ασύμμετρη δόνηση έκτασης τους δεσμούς C-O-S της θειικής χονδροϊτίνης. Είναι σημαντική η εμφάνιση της κορυφής που αντιπροσωπεύει τους δεσμούς C-O-S των γλυκοζαμινογλυκανών στα φάσματα των μιγμάτων των γλυκοζαμινογλυκανών με κολλαγόνο τύπου Ι, αφ ενός γιατί το φάσμα Raman της ηπαρίνης δεν εμφανίζει κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο, και αφ ετέρου η ένταση της κορυφής αυτής είναι αυξημένη στο φάσμα του μίγματος σε σχέση με την αντίστοιχη κορυφή στο φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης. Σημαντική, επίσης, είναι και η μετατόπιση της κορυφής που προέρχεται από τη δόνηση των θειομάδων (O-SO - 3 ) που περιέχουν οι γλυκοζαμινογλυκάνες σε χαμηλότερους κυματάριθμους (από τους 1070 cm -1 στους 1062 cm -1 περίπου), η οποία παρατηρήθηκε κυρίως στα μίγματα με το κολλαγόνο τύπου Ι. Στην περίπτωση των μιγμάτων με το κολλαγόνο τύπου ΙΙ, παρατηρείται κορυφή στους 1064 cm -1, η οποία έχει αποδοθεί στη δόνηση των θειομάδων της θειικής χονδροϊτίνης που περιέχει ο χόνδρος [128]. Σε όλα τα φάσματα επίσης καταγράφηκε η κορυφή στους 1072 cm -1 που δεν προέρχεται από κανένα συστατικό των μιγμάτων. 144

161 5.2.3 Μελέτη των εμβαπτίσεων κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ σε διάλυμα που περιέχει και τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες με φασματοσκοπία Raman Ακολουθεί η μελέτη με χρήση της φασματοσκοπίας Raman του κολλαγόνου (τύπου Ι ή τύπου ΙΙ) εμβαπτισμένου σε διάλυμα που περιέχει και τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες (θειική χονδροϊτίνη και ηπαρίνη) σε ίση αναλογία όγκων μεταξύ τους, η οποία αποσκοπεί στη διερεύνηση της συμπεριφοράς του κάθε τύπου κολλαγόνου ως προς συγκεκριμένο είδος GAG και ο προσδιορισμός, αν υπάρχει, χημικής προτίμησης ως προς συγκεκριμένο τύπο GAG. Κολλαγόνο τύπου Ι και κολλαγόνο τύπου ΙΙ εμβαπτίστηκαν σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνηςηπαρίνης που παρασκευάστηκε με ανάμιξη ίσων όγκων διαλυμάτων της κάθε γλυκοζαμινογλυκάνης. Τα υδατικά διαλύματα των γλυκοζαμινογλυκανών ήταν ίδιας περιεκτικότητας. Τα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα. 145

162 Ένταση Raman COL I COL II COL II-CS-HEP COL I-CS-HEP CS HEP Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα Φάσματα Raman κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ εμβαπτισμένου σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1, καθώς και τα φάσματα των προτύπων ουσιών (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, COL I-CS-HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης, COL ΙI-CS-HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Στα επόμενα σχήματα θα παρουσιαστεί η επεξεργασία των συλλεχθέντων φασμάτων Raman σε κάθε φασματική περιοχή. 146

163 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS- HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης 1:1, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). 147

164 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL ΙI-CS- HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης 1:1, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). Οι θέσεις των μεγίστων των κορυφών των φασμάτων Raman και των δύο τύπων κολλαγόνου που συλλέχθηκαν μετά την εμβάπτισή τους σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνηςηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 θα παρουσιαστούν συνοπτικά στον πίνακα που ακολουθεί. 148

165 Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 των φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ που συλλέχθηκαν μετά από εμβάπτισή τους σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS-HEP και COL IΙ-CS-HEP αντίστοιχα), καθώς και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, COL ΙI: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-CS-HEP COL II-CS-HEP COL CS HEP Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 815 w 816 w - - ν(c-c), ν(c-o-c) [125] 827 sh 829 w - ν(c-o-s), HEP [115] 840 sh 839 sh sh m 859 m ν(c-c), COL ν(c-o-s), CS, HEP 878 m 880 m ν(c-c), COL δ(c (1) -H), CS 892 sh 893 sh δ(c (1) -H), CS ν(c-o-s & C-O-C), HEP [128] [111, 115] [128] [111] [111] [115] w: μικρής έντασης (weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) Τα φάσματα Raman και των δύο μιγμάτων αποτυπώνουν τις χαρακτηριστικές δονήσεις και των τριών συστατικών του κάθε μίγματος. Έτσι, η κορυφή στους cm -1 πηγάζει από τις δονήσεις έκτασης του δεσμού C-C της προλίνης που περιέχει το κολλαγόνο [128] και τις δονήσεις έκτασης του δεσμού C-O-S των γλυκοζαμινογλυκανών [111], ενώ δονήσεις έκτασης του δεσμού C-C της υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου [128], δονήσεις παραμόρφωσης του δεσμού C (1) -H στη θειική χονδροϊτίνη και δονήσεις που οφείλονται σε δεσμούς που υπάρχουν στο μόριο της ηπαρίνης προκαλούν την εμφάνιση της κορυφής στους 878 cm -1. Η κορυφή στους 893 cm -1 στα φάσματα των μιγμάτων είναι αποτέλεσμα της σύζευξης των δονήσεων 149

166 έκτασης των δεσμών C-O-S & C-O-C στην ηπαρίνη [115] και των δονήσεων παραμόρφωσης του δεσμού C (1) -H στη θειική χονδροϊτίνη [111], ενώ και δονήσεις των συστατικών του κολλαγόνου προκαλούν την εμφάνιση κορυφής σε γειτονικό κυματάριθμο. Στην περίπτωση του μίγματος του COL I-CS-HEP, παρατηρείται μια ελαφριά μετατόπιση των μεγίστων των κορυφών που προέρχονται από το κολλαγόνο τύπου Ι στο φάσμα Raman του μίγματος προς υψηλότερους κυματάριθμους λόγω της συνύπαρξης των τριών ουσιών στο μίγμα. 150

167 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS- HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). 151

168 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL ΙI-CS- HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). 152

169 Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 των φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ που συλλέχθηκαν μετά από εμβάπτισή τους σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS-HEP και COL IΙ-CS-HEP αντίστοιχα), καθώς και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, COL ΙI: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-CS-HEP COL II-CS-HEP COL CS HEP Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 922 m 922 m - - ν(c-c), COL [128] 939 m 940 m vw 946 vw sh 951 sh vw 956 vw - - ν(c -C), COL ν(c -C), CS [129] [116] 962 sh 963 sh - ν(c-c), COL I [125] 981 w 977 sh - (977) - C-O-S, CS [111] w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) Όσον αφορά στο φάσμα του μίγματος COL I-CS-HEP, η δόνηση των δεσμών C-C στο δακτύλιο της προλίνης του κολλαγόνου που εμφανίζεται στους 922 cm -1 αποτελεί και την ισχυρότερη σε ένταση Raman κορυφή [128]. Ακολουθεί η κορυφή στους 938 cm -1, η οποία προσδιορίζει τις δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C των αμινοξέων του κολλαγόνου [129], αλλά και τις δονήσεις έκτασης των σκελετικών δεσμών C-C της θειικής χονδροϊτίνης [116]. Κορυφή στους 964 cm -1 περίπου απαντάται στα φάσματα Raman της ηπαρίνης και του κολλαγόνου, η οποία στην περίπτωση του τελευταίου αποδίδεται σε δόνηση έκτασης του δεσμού C-C της προλίνης του κολλαγόνου [125]. 153

170 Παρατηρώντας το φάσμα Raman του μίγματος COL ΙI-CS-HEP, διακρίνουμε τις κορυφές και των τριών ουσιών, ενώ τη μεγαλύτερη ένταση Raman έχει η κορυφή στους 940 cm -1 που πηγάζει από τις δονήσεις του κολλαγόνου και της θειικής χονδροϊτίνης που αναφέρονται και παραπάνω. Στο φάσμα του μίγματος COL I-CS-HEP παρατηρείται η εμφάνιση μιας κορυφής στους 981 cm -1, ενώ στο φάσμα του αντίστοιχου μίγματος με το κολλαγόνο τύπου ΙΙ (COL ΙI-CS-HEP), παρατηρείται μια κορυφή πολύ χαμηλής έντασης στους 978 cm -1. Τα φάσματα της ηπαρίνης και του κολλαγόνου δεν εμφανίζουν κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο και η πιο κοντινή δόνηση είναι η χαμηλής έντασης Raman κορυφή που παρατηρείται στους 977 cm -1 στο φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης, η οποία έχει σχετιστεί με τη δόνηση των δεσμών C-O-S [111]. 154

171 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου Ι μετά από εμβάπτισή του σε μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS- HEP: κολλαγόνο τύπου Ι σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης, COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). 155

172 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 στο φάσμα Raman κολλαγόνου τύπου ΙΙ μετά από εμβάπτισή του σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL IΙ- CS-HEP: κολλαγόνο τύπου ΙΙ σε μίγμα ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης, COL IΙ: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, HEP: ηπαρίνη, CS: θειική χονδροϊτίνη). 156

173 Πίνακας Οι παρατηρούμενες κορυφές στην περιοχή cm -1 των φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου ΙΙ που συλλέχθηκαν μετά από εμβάπτισή τους σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS-HEP και COL IΙ-CS- HEP αντίστοιχα), καθώς και η απόδοσή τους (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, COL ΙI: κολλαγόνο τύπου ΙΙ, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Μίγμα Συστατικό COL I-CS-HEP COL II-CS-HEP COL CS HEP Δόνηση Βιβλιογραφική αναφορά Κυματάριθμος (cm -1 ) 998 sh v sym (C-O-S), CS [116] 1004 s v(c-c), COL [126] 1009 sh sh 1024 sh m 1033 m - - v(c-c), COL [126] 1037 w 1039 w s 1046 w - v sym (Ν-SO 3 - ), HEP [118] 1055 w 1055 w - v sym (O-SO 3 - ), HEP C-OH, CS 1062 s 1064 s v(c-n), COL 1071 w 1074 w v sym (O-SO 3 - ), CS, HEP [118] [111] [130] [116, 118] 1085 w 1085 w - - v(c-n), COL [125] 1099 w 1095 w - - v(c-c), COL [129] 1101 vw 1101 vw w 1105 w w 1122 w w 1128 w - - v(c-c) trans, COL [129] 1138 sh 1134 sh - - s: ισχυρής έντασης (strong), w: μικρής έντασης (weak), vw: πολύ μικρής έντασης (very weak), m: μέτριας έντασης (medium), sh: ώμος (shoulder) ν: δόνηση έκτασης (stretching), ν sym : συμμετρική δόνηση έκτασης (symmetric stretching), ν asym : ασύμμετρη δόνηση έκτασης (asymmetric stretching), δ: δόνηση παραμόρφωσης (deformation) 157

174 Η ανάλυση των φασμάτων Raman των μιγμάτων COL I-CS-HEP και COL IΙ-CS-HEP αποκάλυψε τις κορυφές κάτω από την ευρεία μπάντα στην περιοχή αυτή που πηγάζουν από τις δονήσεις δεσμών που περιέχονται και στα τρία συστατικά του μίγματος. Η μορφολογία της περιοχής αυτής στο φάσμα του μίγματος COL I-CS-HEP θυμίζει αρκετά τη μορφολογία του φάσματος του μίγματος του κολλαγόνου τύπου Ι με την ηπαρίνη (COL I-HEP). Όπως έχουμε εξηγήσει σε προηγούμενη ενότητα, η ισχυρή κορυφή που παρατηρείται στους 1062 cm -1 πηγάζει από τη συμμετρική δόνηση έκτασης των θειομάδων (O-SO - 3 ) που περιέχουν η θειική χονδροϊτίνη και η ηπαρίνη [116, 118], η οποία έχει μετατοπιστεί από τους 1070 cm -1 περίπου, όπου εμφανίζεται στα φάσματα των προτύπων ουσιών, στους 1062 cm -1. Επίσης, η κορυφή στους 1045 cm -1, έχει αυξημένη ένταση Raman, σε σχέση με τη γειτονική κορυφή στους 1033 cm -1 του κολλαγόνου, κάτι που είναι αναμενόμενο επειδή, εκτός από τις δονήσεις του κολλαγόνου, σε αυτόν τον κυματάριθμο εμφανίζεται και η συμμετρική δόνηση έκτασης - των Ν-SO 3 ομάδων που περιέχει η ηπαρίνη [118]. Διακρίνεται επίσης και μια κορυφή στους 1071 cm -1, η οποία δεν απαντάται στα φάσματα των προτύπων ουσιών. Στο φάσμα του μίγματος του κολλαγόνου τύπου ΙΙ με τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες (COL IΙ- CS-HEP), η επίδραση των γλυκοζαμινογλυκανών στη μορφολογία του φάσματος δεν είναι τόσο έντονη, καθώς μοιάζει περισσότερο με τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου τύπου ΙΙ. Η χαρακτηριστική δόνηση έκτασης των θειομάδων (O-SO - 3 ) των γλυκοζαμινογλυκανών εντοπίζεται στους 1064 cm -1, κορυφή που υπάρχει εξαρχής στο φάσμα του χόνδρου, αλλά η ένταση Raman φαίνεται να έχει αυξηθεί λίγο σε σύγκριση με την κορυφή του κολλαγόνου στους 1033 cm -1. Επίσης, στο φάσμα του συγκεκριμένου μίγματος διακρίνεται μια κορυφή πολύ χαμηλής έντασης στους 1074 cm

175 Σχήμα Η περιοχή cm -1 φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙ που εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS-HEP, COL II-CS-HEP) και σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP, COL II-HEP). 159

176 Σχήμα Η περιοχή cm -1 φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙ που εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS-HEP, COL II-CS-HEP) και σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP, COL II-HEP). 160

177 Σχήμα Η περιοχή cm -1 φασμάτων Raman κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙ που εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης με αναλογία όγκων 1:1 (COL I-CS-HEP, COL II-CS-HEP) και σε διάλυμα ηπαρίνης (COL I-HEP, COL II-HEP). Συνοψίζοντας, όσον αφορά στο μίγμα του κολλαγόνου τύπου Ι με τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες, η μορφολογία του φάσματος σε κάθε φασματική περιοχή που εξετάστηκε μοιάζει περισσότερο με εκείνη του φάσματος του μίγματος κολλαγόνου-ηπαρίνης παρά με του μίγματος του κολλαγόνου με τη θειική χονδροϊτίνη (βλ. σχήματα ), γεγονός που υποδηλώνει τη «χημική προτίμηση» του κολλαγόνου τύπου Ι ως προς την 161

178 ηπαρίνη. Κάτι αντίστοιχο φαίνεται ότι ισχύει και στην περίπτωση του αντίστοιχου μίγματος του κολλαγόνου τύπου ΙΙ (COL IΙ-CS-HEP), καθώς η μορφολογία του φάσματος του μίγματος θυμίζει τη μορφολογία του φάσματος του μίγματος του κολλαγόνου τύπου ΙΙ με την ηπαρίνη, ενώ η θειική χονδροϊτίνη δεν έχει έντονη επίδραση στη μορφολογία του φάσματος. 5.3 Μελέτη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι με φασματοσκοπία Raman Αρχικά, έπρεπε να επιλεχθεί το πλακίδιο που θα χρησιμοποιήσουμε για την εναπόθεση των σταγόνων από τα υγρά δείγματα και τη συλλογή φασμάτων. Μια σταγόνα του ίδιου δείγματος εναποτέθηκε σε πλακίδιο με επικάλυψη χρυσού υψηλής ανακλαστικότητας, σε πλακίδιο πυριτίου και σε απλή αντικειμενοφόρο πλάκα και αφέθηκε να αφυδατωθεί στις ίδιες συνθήκες (8 h στους 4 o C). Τα φάσματα Raman που καταγράφηκαν από ένα ενδεικτικό σημείο στο εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας σε κάθε περίπτωση παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα. 162

179 Ένταση Raman Γ Β Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Α Σχήμα Φάσματα Raman μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι σε πλακίδιο χρυσού (Α), πλακίδιο πυριτίου (Β) και απλή αντικειμενοφόρο πλάκα (Γ). Όπως φαίνεται από τα παραπάνω φάσματα, όταν χρησιμοποιήθηκε το πλακίδιο χρυσού (Α) παρατηρήθηκε ενίσχυση του σήματος Raman, γεγονός που οφείλεται στην υψηλή ανακλαστικότητά του. Στο φάσμα που καταγράφηκε στο πλακίδιο πυριτίου (Β) φαίνεται κυρίως η κορυφή στους 520 cm -1 που οφείλεται στο πυρίτιο, ενώ δεν παρατηρούνται κορυφές από τα συστατικά του δείγματος ούτε όταν το δείγμα εναποτέθηκε σε απλή αντικειμενοφόρο πλάκα (Γ). 163

180 Ακολουθεί η μελέτη και επεξεργασία φασμάτων Raman μιγμάτων που παρασκευάστηκαν με ανάμιξη διαλυμάτων γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου τύπου Ι, όπως περιγράφεται στο πειραματικό μέρος. Προσδιορισμός της βέλτιστης αναλογίας GAG-COL για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων Αρχικά, μελετήθηκαν με τη φασματοσκοπία Raman μίγματα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, καθώς και μίγματα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, σε διάφορες αναλογίες όγκων, προκειμένου να καθοριστεί η βέλτιστη αναλογία GAG-COL για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ουσιών αυτών. Μίγματα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι και ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι παρασκευάστηκαν με ανάμιξη διαλυμάτων ίδιας περιεκτικότητας (5% w/v) των δύο ουσιών. Στα παρακάτω σχήματα παρουσιάζονται τα φάσματα Raman μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι με αναλογίες όγκων GAG-κολλαγόνου 20:80, 50:50 και 80:20, τα οποία καταγράφηκαν στο άκρο, στο εσωτερικό και στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας. 164

181 Ένταση Raman COL I CS-COL I 20:80 CS-COL I 50:50 CS-COL I 80:20 CS Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα Φάσματα Raman των μιγμάτων της θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι σε διάφορες αναλογίες και των προτύπων ουσιών που καταγράφηκαν στο άκρο της σταγόνας (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL I 20:80: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 20:80, CS-COL I 50:50: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 50:50, CS-COL I 80:20: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 80:20, CS: θειική χονδροϊτίνη). Μελετώντας τα φάσματα των διαφόρων μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνο τύπου Ι που καταγράφηκαν στο άκρο της σταγόνας και συγκρίνοντας τα με εκείνα των προτύπων 165

182 Ένταση Raman ουσιών, διαπιστώνουμε ότι η μορφολογία των φασμάτων μοιάζει με εκείνη του φάσματος του κολλαγόνου. COL I CS-COL I 20:80 CS-COL I 50:50 CS-COL I 80:20 CS Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα Φάσματα Raman των μιγμάτων της θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι σε διάφορες αναλογίες και των προτύπων ουσιών που καταγράφηκαν από ένα σημείο στο εσωτερικό της σταγόνας (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL I 20:80: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 20:80, CS-COL I 50:50: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 50:50, CS-COL I 80:20: μίγμα θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 80:20, CS: θειική χονδροϊτίνη). 166

183 Στο εσωτερικό της σταγόνας, η μορφολογία του φάσματος του μίγματος CS-COL I 20:80 μοιάζει αρκετά με εκείνη του φάσματος του κολλαγόνου τύπου Ι, αλλά διακρίνονται κάποιες κορυφές που αντιστοιχούν στη θειική χονδροϊτίνη. Η μορφολογία του φάσματος του μίγματος CS-COL I 80:20 είναι παρόμοια με εκείνη του φάσματος της θειικής χονδροϊτίνης. Εστιάζοντας στο φάσμα του μίγματος που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 50:50 μεταξύ των δύο ουσιών (CS-COL I 50:50), είναι περισσότερο ευδιάκριτες οι διαφορές στα φάσματα που θα μας οδηγήσουν στη καλύτερη μελέτη των μιγμάτων τόσο όσον αφορά στον προσδιορισμό κάθε συστατικού στο μίγμα, αλλά και για τον προσδιορισμό των πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου. Με τον ίδιο τρόπο, μελετήθηκαν και φάσματα Raman που καταγράφηκαν από μίγματα ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι με αναλογία όγκων GAG-κολλαγόνου 20:80, 50:50 και 80:

184 Ένταση Raman COL I HEP-COL I 20:80 HEP-COL I 50:50 HEP-COL I 80: Μετατόπιση Raman (cm -1 ) HEP Σχήμα Φάσματα Raman των μιγμάτων της ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι σε διάφορες αναλογίες και των προτύπων ουσιών που καταγράφηκαν στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I 20:80: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 20:80, HEP-COL I 50:50: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 50:50, HEP-COL I 80:20: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 80:20, HEP: ηπαρίνη). 168

185 Ένταση Raman COL I HEP-COL I 20:80 HEP-COL I 50:50 HEP-COL I 80:20 HEP Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα Φάσματα Raman των μιγμάτων της ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι σε διάφορες αναλογίες και των προτύπων ουσιών που καταγράφηκαν σε ένα σημείο στο εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I 20:80: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 20:80, HEP-COL I 50:50: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 50:50, HEP-COL I 80:20: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 80:20, HEP: ηπαρίνη). 169

186 Ένταση Raman COL I HEP-COL I 20:80 HEP-COL I 50:50 HEP-COL I 80: Μετατόπιση Raman (cm -1 ) HEP Σχήμα Φάσματα Raman των μιγμάτων της ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι σε διάφορες αναλογίες και των ουσιών που καταγράφηκαν στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I 20:80: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 20:80, HEP-COL I 50:50: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 50:50, HEP-COL I 80:20: μίγμα ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 80:20, HEP: ηπαρίνη). Η μορφολογία των φασμάτων Raman του μίγματος HEP-COL I 20:80, ανεξαρτήτως σημείου από το οποίο συλλέχθηκε, μοιάζει με τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου. Αντίστοιχα, τα φάσματα μίγματος στο οποίο η ηπαρίνη βρίσκεται σε μεγαλύτερη αναλογία (HEP-COL I 80:20) που συλλέχθηκαν στο εσωτερικό και στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας παρουσιάζουν τη μορφολογία του φάσματος της ηπαρίνης, ενώ διακρίνονται 170

187 κορυφές και από το συστατικό που βρίσκεται σε μικρότερο ποσοστό στο μίγμα. Η συνύπαρξη των δύο συστατικών αντικατοπτρίζεται καλύτερα στο φάσμα του μίγματος HEP-COL I 50: Μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Αφού διαπιστώθηκε η βέλτιστη αναλογία ανάμιξης των δύο ουσιών για την παρασκευή μίγματος τους, συλλέχθηκαν φάσματα Raman σε διάφορα χαρακτηριστικά σημεία εντός της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 1:1. Πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές λήψεις φασμάτων ξεκινώντας από το άκρο της σταγόνας και προχωρώντας προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας, όπως φαίνεται στην εικόνα 5.2. Τα φάσματα που καταγράφηκαν παρουσιάζονται στο σχήμα Εικόνα 5.2. Στερεοφωτογραφία αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι (αναλογία όγκων 1:1). 171

188 Σχήμα Φάσματα Raman μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι (παρασκευασμένου με αναλογία όγκων 1:1) και των προτύπων ουσιών (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL I Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, CS-COL I Β-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας, CS: θειική χονδροϊτίνη). Παρατηρώντας τα παραπάνω φάσματα Raman, διαφοροποιήσεις ως προς τη μορφολογία εντοπίζονται στην περιοχή cm -1, όπου εμφανίζεται μια νέα κορυφή στους 980 cm -1 καθώς προχωράμε προς το κέντρο της σταγόνας, καθώς επίσης και στην περιοχή cm -1. Στην τελευταία, οι κορυφές της θειικής χονδροϊτίνης γίνονται πιο έντονες και ευδιάκριτες στο φάσμα που λήφθηκε από το κέντρο της σταγόνας σε σύγκριση με εκείνο του οποίου η λήψη πραγματοποιήθηκε από το άκρο της σταγόνας. Οι πιο έντονες διαφοροποιήσεις όμως, 172

189 τόσο ως προς τη μορφολογία όσο και ως προς την ένταση των κορυφών, παρατηρούνται στη φασματική περιοχή cm -1, η οποία περιλαμβάνει τις δονήσεις έκτασης των σουλφομάδων (OSO - 3 ) της θειικής χονδροϊτίνης [111]. Τα παραπάνω φάσματα Raman δείχνουν ότι το κολλαγόνο κρυσταλλώνει προς το άκρο της σταγόνας, ενώ οι γλυκοζαμινογλυκάνες δείχνουν προτίμηση κρυστάλλωσης στο κέντρο της σταγόνας, γεγονός που συνεπάγεται ότι η αναλογία GAG-κολλαγόνου είναι διαφορετική στη σταγόνα. Συνεπώς, η αναλογία GAG-κολλαγόνου 1:1 υπάρχει στο εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας. Στα σχήματα που ακολουθούν παρουσιάζεται η επεξεργασία και η ανάλυση των παραπάνω φασμάτων Raman σε καθεμία περιοχή ξεχωριστά. 173

190 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL Ι, με αναλογία όγκων 1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας). 174

191 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). 175

192 Το φάσμα Raman του μίγματος που καταγράφηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας έχει τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου σε αυτήν τη φασματική περιοχή και παρατηρούνται οι κορυφές στους 826 cm -1 και 846 cm -1 που προέρχονται από τη θειική χονδροϊτίνη. Προχωρώντας προς το εσωτερικό της σταγόνας εμφανίζεται πιο έντονα η κορυφή στους 826 cm -1, ενώ τα μέγιστα των κορυφών στους 855 cm -1, 875 cm -1 και 888 cm -1 μετατοπίζονται ελαφρώς σε υψηλότερους κυματάριθμους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρουσία της γλυκοζαμινογλυκάνης είναι πιο έντονη στο εσωτερικό και στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας. Στα φάσματα του μίγματος διακρίνονται οι κορυφές του κολλαγόνου στους 815 cm -1 και 840 cm -1, από τις οποίες η πρώτη συμβολίζει τη δόνηση έκτασης των δεσμών C-C του πεπτιδικού δεσμού (protein backbone) του κολλαγόνου [126]. Βλέπουμε επίσης κορυφές που οφείλονται στη θειική χονδροϊτίνη και εμφανίζονται στους 826 cm -1 και 846 cm -1. Οι υπόλοιπες τρεις κορυφές στους 858 cm -1, 880 cm -1 και 892 cm -1 πηγάζουν από δονήσεις και των δύο συστατικών του μίγματος. Οι δονήσεις των δεσμών C-O-S στη θειική χονδροϊτίνη [111] και οι δονήσεις έκτασης των δεσμών C-C της προλίνης του κολλαγόνου προκαλούν την εμφάνιση της κορυφής στους 858 cm -1 [126], ενώ η κορυφή στους 880 cm -1 είναι αποτέλεσμα των δονήσεων έκτασης των δεσμών C-C της υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου [126] και των δονήσεων παραμόρφωσης των δεσμών C (1) -H της θειικής χονδροϊτίνης [111]. Η κορυφή στους 892 cm -1 πηγάζει επίσης από τις δονήσεις παραμόρφωσης των δεσμών C (1) -H που υπάρχουν στη θειική χονδροϊτίνη [111] και δονήσεις που προέρχονται από τους δεσμούς του κολλαγόνου. 176

193 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL Ι, με αναλογία όγκων 1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας). 177

194 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). 178

195 Η μεγαλύτερη σε ένταση Raman κορυφή του φάσματος του μίγματος της θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι στην περιοχή αυτή είναι εκείνη που πηγάζει από τη σκελετική δόνηση του δεσμού C-C της θειικής χονδροϊτίνης [116] και τη δόνηση έκτασης του μη αρωματικού δεσμού C-C των αμινοξέων λυσίνης, βαλίνης και ισολευκίνης του κολλαγόνου [129] και εμφανίζεται στους 939 cm -1. Βλέπουμε επίσης και άλλες δύο χαρακτηριστικές δονήσεις του κολλαγόνου στους 920 cm -1 και cm -1 που σχετίζονται με τις δονήσεις έκτασης του δεσμού C-C της προλίνης του κολλαγόνου [130]. Η μικρής έντασης κορυφή που διακρίνεται στους cm -1 είναι χαρακτηριστική της θειικής χονδροϊτίνης, όπως φαίνεται από το φάσμα της θειικής χονδροϊτίνης. Η ένταση Raman της κορυφής στους 939 cm -1, σε σύγκριση με την κορυφή του κολλαγόνου στους 920 cm -1, είναι αυξημένη στο φάσμα που καταγράφηκε στο εσωτερικό και στο κέντρο της σταγόνας σε σχέση με εκείνο στο άκρο της σταγόνας, ενώ οι εντάσεις Raman των κορυφών στους 920 cm -1 και 963 cm -1 που προέρχονται από το κολλαγόνο μειώνονται αρκετά στο εσωτερικό και ειδικά στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας. Ιδιαίτερη σημασία πρέπει να δοθεί στη δόνηση στους 978 cm -1, η οποία έχει σχετιστεί με τη δόνηση του δεσμού C-O-S [111, 123] και αποτελεί πιθανώς μια ένδειξη αλληλεπίδρασης, όπως αναλύθηκε στην προηγούμενη ενότητα. Παρατηρώντας την κορυφή αυτή στα φάσματα Raman των διαφόρων σημείων εντός της αφυδατωμένης σταγόνας, διαπιστώθηκε ότι η ένταση Raman της κορυφής αυτής αυξάνεται προς το κέντρο της σταγόνας. Στα φάσματα που συλλέχθηκαν προς το άκρο της σταγόνας μπορεί να διακριθεί, όμως, η ύπαρξη μιας ασθενούς έντασης Raman κορυφής τους 975 cm

196 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, CS-COL Ι, με αναλογία όγκων 1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας). 180

197 Όσον αφορά στην περιοχή αυτή, η μορφολογία του φάσματος Raman του μίγματος της θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι στο άκρο της σταγόνας μοιάζει αρκετά με εκείνη του φάσματος του κολλαγόνου τύπου Ι και η κορυφή στους 1003 cm -1 που πηγάζει από δονήσεις της φαινυλαλανίνης του κολλαγόνου αποτελεί την κορυφή με τη μεγαλύτερη ένταση Raman. Συγκεκριμένα, η επεξεργασία του φάσματος Raman στο άκρο της σταγόνας (CS-COL I Α) αποκάλυψε ότι χαρακτηρίζεται από τις κορυφές του κολλαγόνου στους: 1003 cm -1, 1032 cm - 1, 1045 cm -1, 1063 cm -1, 1086 cm -1, 1095 cm -1, 1101 cm -1, 1106 cm -1 και 1126 cm -1. Οι κορυφές που πηγάζουν από τη θειική χονδροϊτίνη εντοπίζονται στους: 998 cm -1, 1021 cm -1, 1038 cm -1, 1053 cm -1, 1117 cm -1 και 1138 cm -1. Προχωρώντας προς το εσωτερικό της σταγόνας, παρατηρούμε ότι η παρουσία των σουλφομάδων γίνεται πιο έντονη φασματοσκοπικά, καθώς αυξάνεται η ένταση μερικών κορυφών της θειικής χονδροϊτίνης, όπως εκείνες στους 1106 cm -1, 1140 cm -1 που καταγράφηκαν στο φάσμα του μίγματος CS-COL I Γ και εμφανίζεται η κορυφή στους 1162 cm -1 που απαντάται στα φάσματα της θειικής χονδροϊτίνης. 181

198 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 1:1 (CS-COL I Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). Η μορφολογία στην περιοχή αυτή των φασμάτων του μίγματος θειικής χονδροϊτίνηςκολλαγόνου τύπου Ι που συλλέχθηκαν στο εσωτερικό (CS-COL I Δ) και στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας (CS-COL I Ε) μοιάζει περισσότερο με εκείνη του φάσματος της 182

199 θειικής χονδροϊτίνης, γεγονός που δείχνει ότι η θειική χονδροϊτίνη είναι πιο έντονη στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας. Συγκεκριμένα, αυξάνεται η ένταση Raman των κορυφών που απορρέουν από τη θειική χονδροϊτίνη, όπως αυτές που βρίσκονται στους 1118 cm -1, 1140 cm -1 και 1161 cm -1 στο φάσμα CS-COL I Δ και στους 1120 cm -1, 1141 cm -1 και 1159 cm -1 στο φάσμα CS-COL I Ε. Παράλληλα, στα φάσματα αυτά διακρίνονται και κάποιες χαρακτηριστικές κορυφές του κολλαγόνου τύπου Ι, η ένταση Raman των οποίων, όμως, έχει μειωθεί. Στο φάσμα CS-COL I Δ βλέπουμε τις κορυφές του κολλαγόνου στους: 1003 cm -1, 1033 cm -1, 1044 cm -1, 1086 cm -1, 1096 cm -1, 1102 cm -1, 1106 cm -1, 1128 cm -1 και αντίστοιχα στο φάσμα CS-COL I Ε οι κορυφές αυτές εντοπίζονται στους: 1003 cm -1, 1034 cm -1, 1045 cm -1, 1089 cm -1, 1097 cm -1, 1102 cm -1, 1107 cm -1 και 1130 cm -1. Στο φάσμα Raman του μίγματος που καταγράφηκε στο άκρο της σταγόνας (CS-COL I Α), παρατηρείται μια κορυφή στους 1062 cm -1, η οποία έχει σχεδόν την ίδια ένταση Raman με τη γειτονική κορυφή στους 1033 cm -1 που προέρχεται από μια χαρακτηριστική δόνηση του κολλαγόνου, τη δόνηση του δακτυλίου της φαινυλαλανίνης που περιέχεται στην έλικα του κολλαγόνου [126]. Στο φάσμα του κολλαγόνου τύπου Ι που καταγράφηκε, όμως, η κορυφή στους 1063 cm -1, η οποία αποδίδεται σε δονήσεις έκτασης του δεσμού C-N της προλίνης του κολλαγόνου [130], έχει χαμηλότερη ένταση Raman από τη δόνηση στους 1033 cm -1. Συνεπώς, στο φάσμα του μίγματος θειικής χονδροϊτίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, η κορυφή στους 1063 cm - 1 αντιστοιχεί στη συμμετρική δόνηση έκτασης των σουλφομάδων (O-SO 3 - ), της πιο χαρακτηριστικής λειτουργικής ομάδας της θειικής χονδροϊτίνης, η οποία έχει μετατοπιστεί προς χαμηλότερους κυματάριθμους. Παρατηρώντας την κορυφή στους 1063 cm -1 στα φάσματα που καταγράφηκαν προχωρώντας προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας (φάσματα CS-COL I Β και CS- COL I Γ), διαπιστώνουμε ότι η ένταση Raman της κορυφής που αντιπροσωπεύει τη δόνηση των σουλφομάδων αυξάνεται, σε σύγκριση πάντα με την κορυφή στους 1033 cm -1, ενώ στο φάσμα του μίγματος CS-COL I Γ, έχει μεγαλύτερη ένταση Raman από την κορυφή στους 1033 cm -1. Πλησιάζοντας στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας (φάσματα CS-COL I Δ και CS-COL I Ε), η δόνηση των σουλφομάδων της θειικής χονδροϊτίνης αποτελεί την κορυφή με τη μεγαλύτερη ένταση Raman και η ένταση Raman της κορυφής στους 1003 cm -1 έχει μειωθεί αρκετά. 183

200 Θα ήταν παράλειψη να μην αναφερθεί η εμφάνιση της κορυφής στους cm -1, η οποία καταγράφηκε σε όλα τα φάσματα Raman του μίγματος θειικής χονδροϊτίνηςκολλαγόνου τύπου Ι και κανένα από τα φάσματα Raman των συστατικών του μίγματος δεν εμφανίζει κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο Μίγμα ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Στη συνέχεια, προχωρήσαμε στη συλλογή φασμάτων Raman σε διάφορα σημεία εντός της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι που παρασκευάστηκε με ανάμιξη ίσων όγκων διαλυμάτων των δύο ουσιών (βλ. εικόνα 5.3). Τα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν με τον ίδιο τρόπο παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα. Εικόνα 5.3. Στερεοφωτογραφία αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι (αναλογία όγκων 1:1). 184

201 Σχήμα Φάσματα Raman μίγματος ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι (παρασκευασμένου με αναλογία όγκων 1:1) και των προτύπων ουσιών (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, HEP-COL I Β-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας, HEP: ηπαρίνη). Με μια πρώτη ματιά στα φάσματα Raman του μίγματος της ηπαρίνης με το κολλαγόνο τύπου Ι, διακρίνονται κάποιες διαφοροποιήσεις ως προς τη μορφολογία τους προχωρώντας προς το κέντρο της σταγόνας και οι πιο έντονες αφορούν στις φασματικές περιοχές cm -1 και cm -1. Ελάχιστες διαφοροποιήσεις παρατηρούνται στην περιοχή cm -1 των φασμάτων του μίγματος. 185

202 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας). 186

203 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). 187

204 Οι διαφοροποιήσεις στη μορφολογία της περιοχής αυτής είναι έντονες μεταξύ του φάσματος στο άκρο της σταγόνας και των αντίστοιχων φασμάτων στο εσωτερικό και στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας. Στο φάσμα του μίγματος HEP-COL I Α κυριαρχούν οι κορυφές του κολλαγόνου στους: 814 cm -1, 840 cm -1, 855 cm -1, 876 cm -1 και 889 cm -1. Πρέπει να τονιστεί όμως ότι δονήσεις των δεσμών C-O-S, αλλά και συζευγμένες δονήσεις των δεσμών C- O-C του δακτυλίου και των δεσμών C-O-S που περιέχει η ηπαρίνη, εμφανίζονται στους 856 cm - 1 και 897 cm -1 αντίστοιχα στο φάσμα της ηπαρίνης [115]. Μια κορυφή μικρής έντασης που διακρίνεται στο φάσμα του μίγματος στους 824 cm -1 αποδίδεται στη δόνηση των δεσμών C-O- S της ηπαρίνης [115]. Η παρουσία της γλυκοζαμινογλυκάνης είναι πιο έντονη στο εσωτερικό και στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας (σημεία Γ-Ε), όπως φανερώνει η αύξηση της έντασης Raman της κορυφής στους 826 cm -1 και η μετατόπιση των μεγίστων των κορυφών του φάσματος που καταγράφηκε στο άκρο της σταγόνας από τους 875 cm -1 και 889 cm -1 στους 881 cm -1 και 896 cm -1 αντίστοιχα. 188

205 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος της ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας). Το φάσμα Raman του μίγματος ηπαρίνης-κολλαγόνου Ι που λήφθηκε στο άκρο της σταγόνας στην περιοχή αυτή χαρακτηρίζεται από τις κορυφές του κολλαγόνου στους 920 cm -1 και 938 cm -1, με την πρώτη να αποτελεί τη μεγαλύτερη σε ένταση Raman κορυφή. Διακρίνονται επίσης οι κορυφές της ηπαρίνης στους 946 cm -1 και 957 cm -1, ενώ παρατηρείται μια κορυφή στους 952 cm -1, η οποία δεν απαντάται ούτε στο φάσμα της ηπαρίνης ούτε στο αντίστοιχο του κολλαγόνου. Κορυφή σε αυτόν τον κυματάριθμο καταγράφηκε μόνο στα φάσματα της θειικής χονδροϊτίνης, αλλά και στα φάσματα των μιγμάτων της με κολλαγόνο. Κάτι αντίστοιχο ισχύει και για την κορυφή στους 976 cm -1, η οποία αποδίδεται στη δόνηση των δεσμών C-O-S των γλυκοζαμινογλυκανών [111]. Η κορυφή στους 963 cm -1 είναι αποτέλεσμα της δόνησης έκτασης δεσμών C-C της προλίνης του κολλαγόνου [125] και της δόνησης που προέρχεται από την ηπαρίνη. 189

206 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας). 190

207 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-COL I, με αναλογία όγκων 1:1 (Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). 191

208 Η επεξεργασία του φάσματος του μίγματος ηπαρίνης-κολλαγόνου που συλλέχθηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας αποκάλυψε την ύπαρξη των επιμέρους κορυφών στους: 1003 cm -1, 1015 cm -1, 1026 cm -1, 1033 cm -1, 1045 cm -1, 1056 cm -1, 1062 cm -1, 1074 cm -1, 1086 cm -1, 1096 cm -1, 1101 cm -1, 1107 cm -1, 1120 cm -1 και 1127 cm -1, από τις οποίες οι περισσότερες πηγάζουν από τις δονήσεις του κολλαγόνου. Σε δονήσεις της ηπαρίνης αποδίδονται οι κορυφές στους 1026 cm -1 και 1055 cm -1. Η κορυφή στους 1045 cm -1 οφείλεται σε δόνηση που - πηγάζει από το κολλαγόνο και σε δονήσεις των Ν-SO 3 ομάδων της ηπαρίνης [118]. Παρατηρείται, επίσης, η έντονη μετατόπιση της δόνησης των θειομάδων (O-SO - 3 ) της ηπαρίνης από τους 1069 cm -1 στους 1064 cm -1 και μία κορυφή στους 1074 cm -1. Στο αμέσως επόμενο σημείο συλλογής φάσματος (HEP-COL I Β), η μορφολογία της συγκεκριμένης φασματικής περιοχής μοιάζει αρκετά με την αντίστοιχη περιοχή του φάσματος του κολλαγόνου, αλλά η κορυφή στους 1043 cm -1 που προέρχεται από τις θειομάδες της ηπαρίνης έχει μεγαλύτερη ένταση Raman, σε σύγκριση με την χαρακτηριστική κορυφή του κολλαγόνου στους 1032 cm -1, απ ότι στο σημείο Α. Αναλύοντας την περιοχή cm -1 στα φάσματα Raman στα σημεία Γ-Δ της αφυδατωμένης σταγόνας, παρατηρήθηκε ότι οι δονήσεις των N-SO και O-SO 3 ομάδων της ηπαρίνης, που εμφανίζονται στους 1046 cm -1 και 1071 cm -1 αντίστοιχα στο φάσμα της ηπαρίνης, έχουν τη μεγαλύτερη ένταση Raman. Οι κορυφές του κολλαγόνου διακρίνονται στους ίδιους περίπου κυματάριθμους όπως στο φάσμα του μίγματος στο άκρο της σταγόνας. - Η δόνηση της O-SO 3 ομάδας της ηπαρίνης έχει μετατοπιστεί προς μικρότερο κυματάριθμο και εντοπίζεται στους cm -1. Η ένταση Raman της κορυφής στους 1075 cm -1 είναι αυξημένη, σε σύγκριση με την κορυφή των θειομάδων στους 1063 cm -1, στο φάσμα Raman που συλλέχθηκε στο σημείο Δ της σταγόνας. Η μελέτη της αντίστοιχης περιοχής του φάσματος που καταγράφηκε στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας αποκάλυψε ότι η μορφολογία της περιοχής αυτής στο κέντρο της σταγόνας (HEP-COL I Ε) μοιάζει περισσότερο με την αντίστοιχη περιοχή στο φάσμα της ηπαρίνης παρά με του κολλαγόνου. Από τις κορυφές του κολλαγόνου διακρίνονται μόνο εκείνες που βρίσκονται στους κυματάριθμους: 1003 cm -1, 1035 cm -1, 1094 cm -1, 1100 cm -1 και 1106 cm -1. Οι υπόλοιπες κορυφές προέρχονται από δονήσεις των δεσμών των ομάδων της 192

209 ηπαρίνης. Σε αυτό το φάσμα η συμμετρική δόνηση έκτασης της θειομάδας (O-SO 3 - ) της ηπαρίνης βρίσκεται στους 1068 cm -1, ενώ είναι εμφανής μία κορυφή στους 1080 cm Μίγμα θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι Με τον ίδιο τρόπο συλλέχθηκαν φάσματα Raman ενός μίγματος που περιέχει κολλαγόνο τύπου Ι, θειική χονδροϊτίνη και ηπαρίνη, το οποίο παρασκευάστηκε με ανάμιξη ίσων περίπου όγκων διαλυμάτων των τριών ουσιών. Εικόνα 5.4. Στερεοφωτογραφία αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνηςκολλαγόνου τύπου Ι (αναλογία όγκων 1:1:1). 193

210 Σχήμα Φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι με αναλογία όγκων 1:1:1 και των προτύπων ουσιών (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-CS-COL I Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας του μίγματος, HEP-CS-COL I Β-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας, CS: θειική χονδροϊτίνη, HEP: ηπαρίνη). Ακολουθεί η επεξεργασία των παραπάνω φασμάτων σε κάθε φασματική περιοχή. 194

211 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης 195

212 σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό σταγόνας). της αφυδατωμένης Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1:1 (Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). 196

213 Το φάσμα του μίγματος και των τριών ουσιών που λήφθηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας (HEP-CS-COL I Α) παρουσιάζει κορυφές στους: 814 cm -1, 826 cm -1, 840 cm -1, 846 cm -1, 855 cm -1, 875 cm -1 και 889 cm -1, από τις οποίες οι κορυφές στους 855 cm -1 και 875 cm -1 έχουν τη μεγαλύτερη ένταση Raman και προέρχονται από τις δονήσεις των αμινοξέων της προλίνης και της υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου αντίστοιχα [126]. Σε αυτούς τους κυματάριθμους περίπου εμφανίζονται και οι δονήσεις των δεσμών C-O-S που απαντώνται στις γλυκοζαμινογλυκάνες και οι δονήσεις παραμόρφωσης των δεσμών C (1) -H της θειικής χονδροϊτίνης [111]. Μπορούν να διακριθούν κορυφές που οφείλονται στις δονήσεις της ηπαρίνης και της θειικής χονδροϊτίνης και πρόκειται για τις κορυφές στους 825cm -1 και 846 cm -1 αντίστοιχα. Προχωρώντας προς το εσωτερικό της σταγόνας, η μορφολογία της περιοχής αυτής αλλάζει αρκετά και μοιάζει με τη μορφολογία της αντίστοιχης περιοχής του φάσματος του μίγματος του κολλαγόνου τύπου Ι με την ηπαρίνη. Η παρουσία των γλυκοζαμινογλυκανών είναι πιο έντονη, γεγονός που φαίνεται μέσω των κορυφών των γλυκοζαμινογλυκανών στους 828 cm -1 και 846 cm -1, η ένταση Raman των οποίων στα φάσματα που συλλέχθηκαν στα υπόλοιπα σημεία της αφυδατωμένης σταγόνας (Β-Ε) του τριαδικού μίγματος αυξάνεται σε σχέση με τις χαρακτηριστικές κορυφές του κολλαγόνου στους 815 cm -1 και 840 cm -1 αντίστοιχα. Επίσης, παρατηρείται μετατόπιση των μεγίστων των κορυφών από τους 875 cm -1 και 889 cm -1 προς υψηλότερους κυματάριθμους και συγκεκριμένα στους 881 cm -1 και 895 cm -1, λόγω της συνύπαρξης των συστατικών στο μίγμα, δεδομένου ότι δονήσεις των δεσμών των ομάδων που περιέχουν και οι τρεις ουσίες εμφανίζουν κορυφές σε αυτήν τη φασματική περιοχή. Η ένταση Raman της κορυφής στους 896 cm -1 στα φάσματα που συλλέχθηκαν από τα σημεία Γ-Ε της αφυδατωμένης σταγόνας είναι μεγαλύτερη σε σύγκριση με την κορυφή στους 881 cm -1. Στα ίδια φάσματα αξιοσημείωτη είναι η μετατόπιση του μεγίστου μιας άλλης κορυφής που είναι αποτέλεσμα δονήσεων που πηγάζουν και από τις τρεις ουσίες του μίγματος, από τους 855 cm - 1 στους 851 cm -1, δηλαδή προς χαμηλότερο κυματάριθμο, ενώ παρατηρείται η εμφάνιση μιας κορυφής χαμηλής έντασης Raman στους cm

214 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, HEP-CS-COL I Β: λήψη φάσματος προχωρώντας προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας). Η μορφολογία του φάσματος που συλλέχθηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας στη συγκεκριμένη περιοχή μοιάζει περισσότερο με την αντίστοιχη του φάσματος του κολλαγόνου τύπου Ι, όπου η κορυφή με τη μεγαλύτερη ένταση Raman είναι η δόνηση έκτασης των δεσμών C-C της προλίνης του κολλαγόνου στους 921 cm -1, ενώ στο εσωτερικό της σταγόνας η κορυφή 198

215 που χαρακτηρίζεται από τη μεγαλύτερη ένταση Raman είναι εκείνη στους 939 cm -1. Η τελευταία πηγάζει από δονήσεις δεσμών που υπάρχουν στη θειική χονδροϊτίνη και στο κολλαγόνο. Η κορυφή στους 980 cm -1 στο φάσμα του μίγματος που συλλέχθηκε στο εσωτερικό της σταγόνας, η οποία πηγάζει από τους δεσμούς C-O-S, έχει μεγαλύτερη ένταση Raman σε σχέση με την αντίστοιχη που παρατηρείται στους 978 cm -1 στο φάσμα που συλλέχθηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, συγκρινόμενη πάντα με την κορυφή στους 952 cm -1, χαρακτηριστική της θειικής χονδροϊτίνης. Η μορφολογία της περιοχής αυτής είναι παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε στα φάσματα των δυαδικών μιγμάτων GAG-κολλαγόνου (θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι και ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι) που συλλέχθηκαν από αντίστοιχα σημεία εντός της αφυδατωμένης σταγόνας. 199

216 Περιοχή cm -1 Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1:1 (Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης 200

217 σταγόνας, Β-Γ: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το εσωτερικό σταγόνας). της αφυδατωμένης Σχήμα Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1 σε φάσματα Raman των διαφόρων σημείων της αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος θειικής χονδροϊτίνης και ηπαρίνης με κολλαγόνο τύπου Ι, HEP-CS-COL I, με αναλογία όγκων 1:1:1 (Δ-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το εσωτερικό προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας). 201

218 Στο φάσμα του μίγματος που λήφθηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας (HEP-CS-COL I A) παρατηρούνται οι χαρακτηριστικές κορυφές του κολλαγόνου στην περιοχή αυτή που βρίσκονται στους εξής κυματάριθμους: 1003 cm -1, 1033 cm -1, 1046 cm -1, 1087 cm -1, 1097 cm -1, 1101 cm -1 και 1107 cm -1. Διακρίνονται οι κορυφές της θειικής χονδροϊτίνης στους 994 cm -1, 1021 cm -1, 1040 cm -1, 1121 cm -1 και 1135 cm -1, ενώ κορυφές στους 1025 cm -1 και 1055 cm -1 αποδίδονται στην ηπαρίνη. Όπως δείχνουν τα παραπάνω σχήματα, στην περιοχή αυτή των φασμάτων που συλλέχθηκαν στα σημεία Γ-Ε της αφυδατωμένης σταγόνας του μίγματος, παρουσιάζονται οι χαρακτηριστικές κορυφές των δονήσεων των θειομάδων (OSO - 3 ) που περιέχουν η ηπαρίνη και η θειική χονδροϊτίνη στους 1047 cm -1, 1056 cm -1 και 1070 cm -1. Άλλες κορυφές που αποδίδονται στις γλυκοζαμινογλυκάνες του μίγματος βρίσκονται στους 997 cm -1, 1037 cm -1 και 1139 cm -1 και πηγάζουν από τη θειική χονδροϊτίνη, καθώς και εκείνες που διακρίνονται στους 1025 cm -1, 1120 cm -1 και 1160 cm -1, οι οποίες είναι αποτέλεσμα δονήσεων των λειτουργικών ομάδων της ηπαρίνης. Κορυφές που απορρέουν από δονήσεις των μορίων του κολλαγόνου εντοπίζονται στους: 1004 cm -1, 1033 cm -1, 1087 cm -1, 1096 cm -1, 1101 cm -1, 1107 cm -1 και 1129 cm -1. Στο φάσμα Raman του μίγματος θειικής χονδροϊτίνης-ηπαρίνης-κολλαγόνου τύπου Ι παρατηρείται η μετατόπιση της δόνησης έκτασης των σουλφομάδων της θειικής χονδροϊτίνης και της ηπαρίνης στους 1064 cm -1 κατά τη λήψη φάσματος στο άκρο της σταγόνας (HEP-CS- COL I A). Στα φάσματα που συλλέχθηκαν στα σημεία Β και Γ της σταγόνας, η εν λόγω δόνηση εντοπίζεται στους 1066 cm -1 και 1067 cm -1 αντίστοιχα, ενώ στα φάσματα στα σημεία Δ και Ε στους 1070 cm -1, δηλαδή στον κυματάριθμο όπου αναμένεται. Επιπλέον, στο φάσμα HEP-CS- COL I A, παρατηρείται μία κορυφή στους 1075 cm -1, η οποία εμφανίζεται στους 1080 cm -1 και 1078 cm -1 στα αμέσως επόμενα διαδοχικά σημεία συλλογής φάσματος (HEP-CS-COL I Β και HEP-CS-COL I Γ αντίστοιχα). Η κορυφή αυτή δεν υπάρχει στα φάσματα HEP-CS-COL I Δ και HEP- CS-COL I Ε. Η μορφολογία του φάσματος του μίγματος του κολλαγόνου τύπου Ι με τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες, είναι παρόμοια με τη μορφολογία του φάσματος του μίγματος του 202

219 κολλαγόνου Ι μόνο με την ηπαρίνη, ενισχύοντας την υπόθεση μας ότι το κολλαγόνο τύπου Ι δείχνει την τάση να αλληλεπιδράσει περισσότερο με την ηπαρίνη σε σύγκριση με τη θειική χονδροϊτίνη. Συνοψίζοντας, φάσματα Raman που καταγράφηκαν από διάφορα μίγματα GAGsκολλαγόνου τύπου Ι μελετήθηκαν. Παρατηρήσαμε ότι η μορφολογία των φασμάτων των μιγμάτων αλλάζει προχωρώντας από το άκρο προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας και πιο συγκεκριμένα, κατά τη λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας κυριαρχούν οι κορυφές του κολλαγόνου, ενώ όσο προχωράμε προς το εσωτερικό της αφυδατωμένης σταγόνας αυξάνεται η ένταση Raman των κορυφών που προέρχονται από τη γλυκοζαμινογλυκάνη και μειώνεται εκείνη των κορυφών του κολλαγόνου. Στο κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας, η μορφολογία των φασμάτων των μιγμάτων θυμίζει αρκετά τη μορφολογία του φάσματος της αντίστοιχης γλυκοζαμινογλυκάνης. Σε όλα τα φάσματα που καταγράφηκαν, η πιο έντονη τροποποίηση της περιοχής cm -1 παρατηρείται σε εκείνα που καταγράφηκαν στο εσωτερικό και στο κέντρο της σταγόνας και ακόμα πιο έντονη στην περίπτωση του μίγματος του κολλαγόνου με την ηπαρίνη (HEP-COL I), καθώς και του μίγματος με τις δύο γλυκοζαμινογλυκάνες (HEP-CS-COL I). Αυτή η τροποποίηση παρατηρείται, επειδή δονήσεις δεσμών και από τις τρεις ουσίες προκαλούν την εμφάνιση κορυφών σε αυτή τη φασματική περιοχή. Στα φάσματα του μίγματος κολλαγόνου τύπου Ι-θειικής χονδροϊτίνης, παρατηρήθηκε η αύξηση της έντασης Raman των κορυφών στους 939 cm -1 και 978 cm -1, που προέρχεται από τη δόνηση των δεσμών C-C και των δεσμών των θειομάδων της θειικής χονδροϊτίνης [111]. Οι πιο σημαντικές παρατηρήσεις αφορούν στην περιοχή cm -1, η οποία περιλαμβάνει τη συμμετρική δόνηση έκτασης των θειομάδων (O-SO - 3 ), της πιο χαρακτηριστικής ομάδας των γλυκοζαμινογλυκανών. Στα φάσματα Raman των μιγμάτων παρατηρήθηκε η μετατόπιση της δόνησης αυτής προς χαμηλότερους κυματάριθμους και πιο συγκεκριμένα στους cm -1, η οποία συνοδεύεται από την εμφάνιση μιας κορυφής στους cm

220 5.3.4 Μίγμα υαλουρονικού οξέος-κολλαγόνου τύπου Ι Ο B. Obrink [95] μελέτησε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου με μια τεχνική σκέδασης φωτός και παρατήρησε ότι πολυσακχαρίτες χαμηλού μοριακού βάρους και υψηλού αρνητικού φορτίου αλληλεπιδρούν ισχυρά με το κολλαγόνο. Το υαλουρονικό οξύ, το οποίο είναι ένας υψηλού μοριακού βάρους πολυσακχαρίτης που δεν περιέχει θειομάδες και φέρει μόνο ένα αρνητικό φορτίο ανά δισακχαρίτη, δεν αλληλεπίδρασε με το κολλαγόνο, σε αντίθεση με την ηπαρίνη, έναν πολυσακχαρίτη χαμηλού μοριακού βάρους, υψηλά θειωμένο και φέρει 3-4 αρνητικά φορτία ανά δισακχαρίτη, η οποία αλληλεπίδρασε πιο ισχυρά από οποιονδήποτε άλλο πολυσακχαρίτη που μελετήθηκε. Στόχο της συγκεκριμένης ενότητας αποτελεί η εξέταση της ύπαρξης αλληλεπίδρασης ή όχι μεταξύ του υαλουρονικού οξέος και του κολλαγόνου τύπου Ι. Μίγμα των δύο αυτών ουσιών παρασκευάστηκε με ανάμιξη τους με αναλογία όγκων 1:1 και μελετήθηκε με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας Raman. Tα φάσματα Raman που συλλέχθηκαν από μια αφυδατωμένη σταγόνα του συγκεκριμένου μίγματος παρουσιάζονται στο σχήμα που ακολουθεί. Εικόνα 5.5. Στερεοφωτογραφία αφυδατωμένης σταγόνας μίγματος υαλουρονικού οξέος-κολλαγόνου τύπου Ι (αναλογία όγκων 1:1). 204

221 Σχήμα Φάσματα Raman μίγματος υαλουρονικού οξέος με κολλαγόνο τύπου Ι (παρασκευασμένου με αναλογία όγκων 1:1) και των προτύπων ουσιών (COL I: κολλαγόνο τύπου Ι, ΗΑ-COL I Α: λήψη φάσματος στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας, ΗΑ-COL I Β-Ε: λήψη φάσματος διαδοχικά από το άκρο προς το κέντρο της αφυδατωμένης σταγόνας, ΗΑ: υαλουρονικό οξύ). Η μορφολογία του φάσματος που συλλέχθηκε στο άκρο της αφυδατωμένης σταγόνας του μίγματος (ΗΑ-COL I Α) θυμίζει αρκετά τη μορφολογία του φάσματος του κολλαγόνου τύπου Ι, ενώ εκείνη του φάσματος που συλλέχθηκε στο κέντρο της σταγόνας μοιάζει αρκετά με τη μορφολογία του φάσματος του υαλουρονικού οξέος (ΗΑ-COL I Ε), κάτι που παρατηρήθηκε και στα υπόλοιπα μίγματα γλυκοζαμινογλυκανών-κολλαγόνου τύπου Ι που μελετήθηκαν με τον ίδιο τρόπο. 205