Τ ι είναι όμως αυτό π ου π ροσδιορίζει τα γεγονότα εναρξης στην μονάδα του χρόνου

Transcript

1 Τ ι είναι όμως αυτό π ου π ροσδιορίζει τα γεγονότα εναρξης στην μονάδα του χρόνου Τ έσσερεις είναι οι κύριες π αράμετροι π ου επηρεάζουν ή προσδιορίζουν την ταχύτητα μιας σφαιρικής π ρωτεΐνης. Ποσότητα ή ριβοσωμάτων απ όδοση του mr NA,αφθονία, ενεργότητα της πρωτεινοσυνθετικής μηχανής, ταχύτητα επ ιμήκυνσης

2 Τ ο επ ίπ εδο του mr NA στο κυτταρόπλασμα προσδιορίζεται Την ταχύτητα της μεταγραφής Την αναλογία των πρωτογενών μεταγράφων τα οπ οία μεταφέρονται στο κυτταρόπ λασμα ως ώριμο mr NA Την ταχύτητα αποικοδόμησης των ωρίμων mr NA στο κυτταρόπ λασμα

3 Σ ε κύτταρα θηλαστικών που συνθέτουν έντονα πρωτεΐνες. Το mr NA συχνά βρίσκεται όλο στα πολυσώματα (όπως έχει δειχθεί π.χ. για την π ερίπ τωση της ακτίνης απ ό τους E ndo και Nadal) Σ την π ερίπ τωση αυτή η σύνθεση της συγκεκριμένης π ρωτεΐνης περιορίζεταιαπό το mr NA Σ υχνά όμως εμφανίζεται το ολικό mr NA στο κυτταρόπλασμα να βρίσκεται σε περίσσεια. Έ χει υπολογισθεί σε καλλιέργειες κυττάρων ότι περίπου το 30% του mr NA βρίσκεται υπ ό την μορφή mr NP σω ματιδίω ν.κατά συνέπ εια το επ ίπ εδο του mr NA δεν φαίνεται να είναι ο π εριοριστικός π αράγοντας για την δημιουργία γεγονότων έναρξης στο κύτταρο

4 Σ τα κύτταρα π ου δείχνουν χαμηλή μεταφραστική ικανότητα πολλά mr NA είναι καλυμμένα και προφανώς δεν μπορούν να χρησιμοποιηιθούν στην μεταφραστική μηχανή. Αυτό φαίνεται εντελώς ξεκάθαρα στα ωοκύτταρα στα μη γονιμοποιημένα αυγά αλλά και σε καλλιέργειες σ ωματικών κυττάρω ν Συχνά ένα μέρος του mr NA είναι πλήρως αδρανοποιημένο ενώ ένα μέρος μεταφράζεται ενεργά σε π ολυσώματα. Κλασσικά παραδείγματα εμφανίζονται στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες

5 Σε περίπτωση ειδικής ρύθμισης της πρωτεϊνοσύνθεσης η καταστολή του mrna και η διαθεσιμότητα στην μεταφραστική μηχανή έχουν κυρίαρχο ρόλο στην ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης

6 Πολλές φορές επίσης τα διάφορα ενεργοποιηµένα mrna διαφέρουν πάρα πολύ ως προς τις αποδόσεις τους στη µετάφραση ανάλογα µε το µέγεθος των πολυσωµάτων που συγκροτούν και ως εκ τούτου συνεισφέρουν διαφορετικά στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτές οι προκαθορισµένες αποδόσεις προσδιορίζονται κατά ένα µεγάλο µέρος από την πρωτοταγή αλλά και τις υψηλότερες δοµές του mrna.

7 Σ το κυτταρικό επ ίπ εδο τα ριβοσωμάτια μπ ορεί να είναι π εριοριστικός π αράγοντας υπ ό συγκεκριμένες συνθήκες Κύτταραενεργάστηνπρωτεινοσύνθεση όπωςγιαπαράδειγματακύτταρατουήπατος σε ποντίκια που είχαν πάρειπρόσφατα τροφή τα 90 95% του συνόλου των ριβοσωματίων συμμετέχουν στην πρωτεινοσύνθεση. Αυτό με άλλα λόγια εισηγείταιότιμπορείναεπιτευχθούν μεγαλύτερες ταχύτητες στην πρωτεινοσύνθεση εάν υπάρχει διαθέσιμος μεγαλύτερος αριθμός ριβοσωματίων

8 Αντίθετα σε μεταφραστικά κατασταλμένα κύτταρα όπως sτα κύτταρα στο συκώτι ποντικού που βρίσκονται σε ηρεμία ή σε κύτταρα κυτταροκαλλιέργειας που επίσης είναι σε ηρεμία λιγότερα από τα μισά ριβοσωμάτια συμμετέχουν στην μετάφραση του mrna Το επίπεδο των ριβοσωματίων βέβαια δεν είναι οπεριοριστικόςπαράγοντας σ αυτάτακύτταρα μια και ταχεία αύξηση στην ταχύτητα της πρωτεϊνοσύνθεσης μπορεί να επιτευχθεί εντός 20 λεπτών και πριν να κατορθωθεί η συγκρότηση περισσότερωννέωνριβοσωματίων

9 Σ τους π ερισσότερους ιστούς των θηλαστικών και σε μερικώς ταχέως διαφοροποιημένα κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια τα μη μεταφραζόμενα ριβοσωμάτια και οι ριβοσωμικές τους υπ ομονάδες συγκροτούν κλάσμα μεγαλύτερο από το 20% των συνολικών ριβοσωμάτων όπως μπορεί να διαπιστώσει κανείς με υπερφυγοκεντριση σε κλίση σακχαρόζης Τ α δεδομένα αυτά υπ οστηρίζουν ότι γενικά το επ ίπ εδο των ριβοσωμάτων δεν είναι ο π εριοριστικός π αράγοντας για την π ρωτεϊνοσύνθεση μια και στα κύτταρα μπ ορεί να ενεργοπ οιηθεί ιδιαίτερα γρήγορα η μετάφραση ως ανταπόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα

10 Η ποσότητα των ριβοσωµάτων σπάνια αποτελεί περιοριστικό παράγοντα. Αυτό υποστηρίζεται από µία σειρά δεδοµένα µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται: 1. Μπορεί να γίνει ταχεία επαγωγή της σύνθεσης εντός 20 λεπτών που χωρίς αµφιβολία δεν είναι αρκετός χρόνος για τη συγκρότηση των ριβοσωµάτων. 2. Σε µερικούς ιστούς των θηλαστικών και σε µερικά ταχέως διαφοροποιηµένα κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια έχει βρεθεί ότι τα ριβοσώµατα και οι υποµονάδες που δεν εµπλέκονται στη µετάφραση συνιστούν µεγαλύτερο από το 20% του ολικού πληθυσµού των ριβοσωµάτων.

11 Σε κύτταρα που το επίπεδο των ριβοσωμάτων δεν αποτελεί περιοριστικό παράγοντα. Ηταχύτητα της πρωτεϊνοσύνθεσης μπορεί να ελαττωθεί όταν διάφορα συστατικά της μετάφρασης περιορίζονται είτε ως προς την ποσότητα ή έχουν ελαττωμένες ενεργότητες Τέτοιες ρυθμίσεις συχνά εξασφαλίζονται μέσω φωσφορυλιώσεως των συστατικών της μετάφρασης όπως θα δειχθεί σε διάφορες περιπτώσεις Ως γενική αρχή υποστηρίζεται ότι η ρύθμιση της συνολικής ενεργότητας της μεταφραστικής συσκευής αναμένεται να επηρεάζει την μετάφραση του συνόλου των mrna

12 Έχουν σήµερα περιγραφεί κύτταρα τα οποία παρότι έχουν ριβοσωµάτια και mrna πολύ περισσότερα από αυτά που απαιτούνται για να γίνει η πρωτεϊνοσύνθεση εν τούτοις παρουσιάζουν µια ιδιαίτερα χαµηλή απόδοση στη σύνθεση πρωτεϊνών. Αυτό µπορεί να συµβαίνει είτε διότι ένα απλό στοιχείο µετάφρασης (π.χ. ένας διαλυτός παράγοντας) είναι σε περιορισµένη ποσότητα ή ότι ένα ή περισσότερα από τα συστατικά έχουν µειωµένες ειδικές ενεργότητες.

13 Αλλαγές στις ενεργότητες των συστατικών τα οποία αντεπιδρούν με το mr NA και επ ηρεάζουν την δέσμευση τους στα ριβοσωμάτια αναμένεται να δημιουργούν διαφορετικές επιδράσεις στην μετάφραση των διαφόρων mr NA Ο μηχανισμός με τον οποίο επηρεάζεται η δέσμευση των διαφόρων mr NA και οι επ ακόλουθες μεταβολές στην μεταφραστική απόδοση των διαφόρων mr NA θα μελετηθούν χωριστά στις διάφορες περιπτώσεις

14 Η ταχύτητα έναρξης ενός μηνύματος μπορεί να μειωθεί ή και να ανασταλεί εάν ένα ριβόσωμα που έχει ήδη ξεκινήσει την διαδικασία της έναρξης εγκαταλείπει για κάποιο λόγο πολύ αργά την περιοχή έναρξης Έναριβόσωμαπουδεσμεύεταιστονκώδωνα έναρξης AUG καταλαμβάνει νουκλεοτίδια ( 4 5 κώδωνες )downstreamσε σχέση με το AUG και γύρω στα 20 νουκλεοτίδια upstream

15 Ένα άλλο ριβόσωμα μπορεί να καταλάβει την θέση έναρξης μόνο μετά αφ ότου το πρώτο ριβόσωμα κινηθεί γύρω στους επτά κώδωνες κατά μήκος του mrna Εάν ο χρόνος που απαιτείται για να εγκαταλείψει την θέση έναρξης προσεγγίζει ή ξεπερνά τον χρόνο που απαιτείται για την έναρξη η ταχύτητα επιμήκυνσης περιορίζεται

16 Γενικά πιστεύεται ότι η ταχύτητα επιμήκυνσης είναι όμοια γιαταπερισσότεραmrna με 5 8 αμινοξέα να ενσωματώνονται ανά δευτερόλεπτο και ανά ριβόσωμα στα ευκαρυωτικά και ακόμη γρηγορότερα στα βακτήρια Βεβαίως η ταχύτητα επιμήκυνσης πολλές φορές μπορεί να είναι πολύ πιο αργή από ότι στα κανονικά όπως φαίνεται για το mrna που κωδικοποιεί για τον eif2b καθώς και για ορισμένους ιούς

17 Βεβαίως η ταχύτητα επιμήκυνσης μπορεί να μην παρουσιάζεται κατά μήκος της κωδικοποιούσας περιοχής του mrna Επιβράδυνση μπορεί να απαντά σε εξειδικευμένες περιοχές είτε λόγω της παρουσίας εξειδικευμένων κωδικονίων είτε διότι υπάρχουν ανώτερες δομές στο mrna

18 Σύμφωναμεταόσαέχουναναφερθείτρείςείναιοι τρόποι με τους οποίους μπορεί να περιορισθεί και να ρυθμισθεί η πρωτεινοσύνθεση σε σύντομο χρονικό διάστημα Παρεμβαίνοντας στην διαμόρφωση της ταχύτητας έναρξης Παρεμβαίνοντας στην διαμόρφωση της ταχύτητας επιμήκυνσης/λήξης Καταστέλλοντας /ενεργοποιώντας mrna/mrnp Πώς όμως μπορεί να προσδιορισθεί η ταχύτητα πρωτεινοσύνθεσης και πως το στάδιο ελέγχου

19 Η συνολική ταχύτητα της πρωτεϊνοσύνθεσης μπορεί να προσδιορισθεί ελέγχοντας το πόσο γρήγορα ενσωματώνονται στις αναπτυσσόμενες πρωτεΐνες ραδιενεργά σεσημασμένα αμινοξέα τα οποία προστίθενται στο μέσο επώασης Ο τρόπος προσδιορισμού παρουσιάζει προβλήματα τα οποία μπορούν να οφείλονται, στην μεταβλητή ποσότητα των μη ραδιενεργών αμινοξέων, στην de novo σύνθεση μη ραδιενεργών αμινοξέων καθώς και στην αποικοδόμηση των νεοσυντιθεμένων πρωτεϊνών

20 Μια άλλη προσέγγιση για να προσδιορίσουμε την ταχύτητα της πρωτεϊνοσύνθεσης στα κύτταρα είναι προσδιορίζοντας την ταχύτητα επιμήκυνσης/λήξης αλλά και τον αριθμό των ενεργών ριβοσωμάτων στο κύτταρο Η ταχύτητα επιμήκυνσης είναι ίση με το μέσο μέγεθος της πρωτεΐνης (αριθμός αμινοξέων ) διαιρούμενο με τον χρόνο transit

21 Το μέσο μέγεθος των πρωτεϊνών που συντίθεται μπορεί να προσδιορισθεί αναλύοντας τις ραδιενεργά σεσημασμένες πρωτεΐνες σε SDS πήκτωμα ακρυλαμίδης και προσδιορίζοντας την ποσότητα με φλουορογραφία την ποσότητα ραδιενέργειας που ενσωματώνεται σε πρωτεΐνη συγκεκριμένου Μοριακού βάρους

22 Οχρόνοςtransit του ριβοσωματίου αναφέρεται στον χρόνο που απαιτείται για να επιμηκυνθεί και να ολοκληρωθεί μια αρτιγενής πολυπεπτιδική αλυσίδα μετά την έναρξη Οχρόνοςtransit μετράται προσθέτοντας ραδιενεργά αμινοξέα σε μία κυτταροκαλλιέργεια και μετέπειτα ανάλυση των δειγμάτων που λαμβάνονται σε διάφορα χρονικά διαστήματα

23 Προσδιορισμός Χρόνος Transit του ριβοσωματίου Κύτταρα σημαίνονται με ραδιενεργό μεθειονίνη Κύτταρα επωάζονται και φυγοκεντρούνται για διάφορα χρονικά διαστήματα Ένα κλάσμα του ομογενοποιήματος υφίσταται καταβύθιση με τριχλωροξεικό οξύ προκειμένου να μετρηθεί η ενσωμάτωση της ραδιενεργού μεθειονίνης στις πρωτεΐνες (ολική ενσωμάτωση) Ένα δεύτερο κλάσμα φυγοκεντρείται προκειμένου να έλθουν στο ίζημα τα ριβοσωμάτια όπου περιέχονται οι αρτιγενείς πολυπεπτιδικές αλυσίδες ενώ στο υπερκείμενο ευρίσκονται οι ελεύθερες πρωτεΐνες που έχουν συντεθεί

24 O χρόνος που απαιτείται για την ενσωµάτωση ραδιενέργειας στο σύνολο των πρωτεϊνών είναι διαφορετικός από τον χρόνο που απαιτείται για την ενσωµατωση στις απελευθερονοµένες πρωτεΐνες η διαφορά αυτών των χρόνων ισούται µε τονµισό transit time

25 Ο απόλυτος αριθµός των ριβοσωµατίων ανά κύτταρο µπορεί να προσδιορισθεί ως εξής: Το οµογενοποίηµα υπερφυγοκεντρείται τα ριβοσωµάτια κααβυθίζονται και στο ίζηµα που περιέχονται τα ριβοσωµάτια µετραται η οπτική πυκνότητα Τα ριβοσωµάτια από τον συνολικό πληθυσµό που συµµετέχουν ενεργά στην πρωτεϊνοσύνθεση µπορούν να προσδιορισθούν µε υπερφυγοκέντριση του οµογενοποιήµατος των κυττάρων σε γραµµικά µεταβαλλόµενη κλίση σακχαρόζης

26 Ενεργά ριβοσώµατα είναι αυτά που βρίσκονται οργανωµένα σε πολυσώµατα συν µια µικρή ποσότητα από τα µονοσώµατα. Η 80S κορυφή είναι µείγµα ριβοσωµατίων που µεταφράζουν και ριβοσωµατίων που δεν µεταφράζουν Η οπτική πυκνότητα στην περιοχή των πολυσωµάτων διαιρουµένη µε την ολική πυκνότητα από την 40S υποµονάδα µέχρι τον βυθό της κλίσης αντιπροσωπεύει το ποσό των ριβοσωµατίων που συµµετέχουν ενεργά στην πρωτεϊνοσύνθεση

27