ιάλεξη 7 Μετάφραση Ο γενετικός κώδικας Το trna Μηχανισµός µετάφρασης σε προκαρυωτικά Aντιβιοτικά και πρωτεϊνοσύνθεση

Transcript

1 ιάλεξη 7 Μετάφραση Ο γενετικός κώδικας Το trna Μηχανισµός µετάφρασης σε προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα. Aντιβιοτικά και πρωτεϊνοσύνθεση

2 ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ DNA RNA protein Aντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση Kεντρικό δόγµα της µοριακής βιολογίας Οι κανόνες µε τους οποίους η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων ενος γονιδίου, µέσω του mrna, µεταφράζεται στην αλληλουχία των αµινοξέων µιας πρωτεϊνης ονοµάζεται γενετικός κώδικας.

3 Ο γενετικός κώδικας Ο γενετικός κώδικας αποτελείται από τριπλέτες νουκλεοτιδίων, που ονοµάζονται κωδικόνια. δηλ. 3 nt mrna καθορίζουν 1 αµινοξύ στην πρωτεϊνη Ο γενετικός κώδικας δεν αυτο-επικαλύπτεται, δηλ. διαδοχικές τριπλέτες διαβάζονται στην σειρά CAUGGAUUACGG CAUGGAUUACGG Ο γενετικός κώδικας διαβάζεται µε κατεύθυνση 5 3. Στον γενετικό κώδικα κάθε κωδικόνιο καθορίζει ένα και µόνο ένα αµινοξύ. ACG Thr και µόνοthr Ο γενετικός κώδικας είναι εκφυλισµένος δηλ. αµινοξέα δύνανται να καθοριστούν από περισσότερα από ένα κωδικόνια To aa Τhr καθορίζεται από ACG ACA ACC ACU εξηγεί την ικανότητα 4 3 = 64 κωδικ. να κωδικοποιούν για 20 αα Ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν οικουµενικός. Οι σπάνιες εξαιρέσεις περιλαµβάνουν µεταβολές του κανόνα στα µιτοχόνδρια και σε µερικά πρωτόζωα (π.χ AUA κωδικοποιεί για Ile αλλά στα µιτοχόνδρια θηλαστικών για Met [εναρκτήριο]).

4 Πρωτόζωα : Μονοκύτταροι ευκαρυωτικοί οργανισµοί Σηµασία στον άνθρωπο: Ελονοσία : ασθένεια που προκαλείται από τα P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. Vivax και µεταδίδεται από το κουνούπι Anopheles. Προκαλεί περισσότερους από 2 εκατ. θανάτους το χρόνο παγκοσµίως. Αµοιβαδική δυσεντερία : ασθένεια που προκαλείται από το πρωτόζωο της ιστολυτικής αµοιβάδας. Η µόλυνση γίνεται είτε από το νερό είτε από άπλυτα λαχανικά, όταν αυτά έχουν έλθει σε επαφή µε ανθρώπινα περιττώµατα. Η ασθένεια αυτή προκαλεί θανάτους το χρόνο παγκοσµίως.

5 Ο Γενετικός Κώδικας Ο γενετικός κώδικας έχει σήµατα για την έναρξη και λήξη της µετάφρασης (start codon / stop codon). Aνοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) 5 -UTR (Untranslated region) 3 -UTR

6 H µετάφραση του γενετικού κώδικα εµπεριέχει την χρήση της γενετικής πληροφορίας για την παραγωγή ενός πολυπεπτιδίου. Η µετάφραση είναι εποµένως συνωνυµη της πρωτεϊνοσύνθεσης. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ: 1) Ριβοσώµατα 2) trna 3) Εναρκτήριοι παράγοντες 4) ενέργεια 5) mrna

7 H µετάφραση του γενετικού κώδικα εµπεριέχει την χρήση της γενετικής πληροφορίας για την παραγωγή ενός πολυπεπτιδίου. Η µετάφραση είναι εποµένως συνωνυµη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η σύνθεση των πολυπεπτιδίων λαµβάνει χώρα στα ριβοσώµατα, συµπλέγµατα rrna και πρωτεϊνών (ριβοσωµικές πρωτεϊνες). Υπάρχουν 4 τύποι ριβοσωµάτων στα ευκαρυωτικά κύτταρα: 28S, 18S, 5.8S και 5S [S=Svedberg unit είναι συντελεστής καθίζησης ως αποτέλεσµα υπερφυγοκέντρησης S µετράει τα σχετικά µεγέθη µακροµορίων]. Μεγάλη υποµονάδα Μικρή υποµονάδα

8 Μεταφορικό RNA (trna) (Βραχίονας-αποδέκτης του αα) H προσθήκη του αα γίνεται µε την δράση της συνθετάσης του αµινοακυλο-trna και χρήση ΑΤΡ. Ζευγαρώνει µε το συµπληρωµατικό κωδικόνιο του mrna UAC ΑUG Ta trnas: Συνταιριάζουν τα αα στα κωδικόνια του mrna Σχεδόν ταυτόσηµες αλληλουχίες σε προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα nt 2 κύριες περιοχές: αντικωδικόνιο και βραχίονας-αποδέκτης του aa περίπου 31 trnas: τα στερεοχηµικά κριτήρια για το ζευγάρωµα µεταξύ των βάσεων στην 3η θέση του κωδικονίου και του αντικωδικονίου δεν είναι τόσο περιοριστικά όσο για τις δύο πρώτες- ταλάντευση ή αστάθειa (wobble). Ενα trna αναγνωρίζει περισσότερα από ένα κωδικόνια.

9 Προκαρυωτική µετάφραση H διαδικασία της µετάφρασης µπορεί να χωριστεί σε 3 στάδια: Έναρξη, επιµήκυνση και τερµατισµό. (initiation / elongation / termination) Στην έναρξη χρησιµοποιούνται: 1. mrna 2. Ριβοσώµατα 3. Εναρκτήριοι παράγοντες 4. Εναρκτήριο trna (φορµυλοµεθειονίνη) 5. GTP (ενέργεια) Κωδικόνια έναρξης στα βακτήρια: AUG (ATG) GUG (GTG) UUG (TTG)

10 Προκαρυωτική µετάφραση- Εναρξη Η µικρή ριβοσωµική µονάδα προσδένεται στον παράγοντα έναρξης-3 (IF3)

11 Προκαρυωτική µετάφραση- Εναρξη Η µικρή ριβοσωµική µονάδα προσδένεται στον παράγοντα έναρξης-3 (IF3) Το σύµπλεγµα 30S/IF3 δένεται στο mrna στην αλληλουχία AGGAGG (Shine- Delgarno sequence), που βρισκεται σε όλα τα προκαρυωτικά mrnas.

12 Προκαρυωτική µετάφραση - Εναρξη Η µικρή ριβοσωµική µονάδα προσδένεται στον παράγοντα έναρξης-3 (IF3) Το σύµπλεγµα 30S/IF3 δένεται στο mrna στην αλληλουχία AGGAGG (Shine- Delgarno sequence), που βρισκεται σε όλα τα προκαρυωτικά mrnas. Το fmet trna δενεται στον IF2 επιφέροντας πρόσδεση στο εναρκτήριο κωδικόνιο ΑUG. Το σύµπλεγµα 30S/IF3 ολισθαίνει στην αλυσίδα του mrna και επίσης προσδένεται στο εναρκτήριο κωδικόνιο. Το Σύµπλεγµα 30S, IF3, fmet trna, IF2 λέγεται eναρκτήριο σύµπλοκο (initiation complex).

13 Προκαρυωτική µετάφραση- Εναρξη Η µικρή ριβοσωµική µονάδα προσδένεται στον παράγοντα έναρξης-3 (IF3) Το σύµπλεγµα 30S/IF3 δένεται στο mrna στην αλληλουχία AGGAGG (Shine- Delgarno sequence), που βρισκεται σε όλα τα προκαρυωτικά mrnas. Το fmet trna δενεται στον IF2 επιφέροντας πρόσδεση στο εναρκτήριο κωδικόνιο ΑUG. Το σύµπλεγµα 30S/IF3 ολισθαίνει στην αλυσίδα του mrna και επίσης προσδένεται στο εναρκτήριο κωδικόνιο. Το Σύµπλεγµα 30S, IF3, fmet trna, IF2 λέγεται eναρκτήριο σύµπλοκο (initiation complex). CH 3 CH 2 R S CH 2 H - C NH- C C=O O H O

14 Προκαρυωτική µετάφραση- Επιµήκυνση Η µικρή ριβοσωµική µονάδα προσδένεται στον παράγοντα έναρξης-3 (IF3) Το σύµπλεγµα 30S/IF3 δένεται στο mrna στην αλληλουχία AGGAGG (Shine- Delgarno sequence), που βρισκεται σε όλα τα προκαρυωτικά mrnas. Το fmet trna δενεται στον IF2 επιφέροντας πρόσδεση στο εναρκτήριο κωδικόνιο ΑUG. Το σύµπλεγµα 30S/IF3 ολισθαίνει στην αλυσίδα του mrna και επίσης προσδένεται στο εναρκτήριο κωδικόνιο. Το Σύµπλεγµα 30S, IF3, fmet trna, IF2 λέγεται eναρκτήριο σύµπλοκο (initiation complex). H µεγαλη ριβοσωµική µονάδα προσδένεται στο σύµπλοκο. Με την υδρόλυση GTP οι παράγοντες έναρξης απελευθερώνονται. Το ριβοσωµικό σύµπλοκο είναι τώρα έτοιµο να αρχίσει την πρωτεϊνοσύνθεση.

15 Προκαρυωτική µετάφραση- Επιµήκυνση 3 θέσεις πρόσδεσης trna σχηµατίζoνται στο ριβόσωµα: Ρ: peptidyl A: aminoacyl E: ejection of trna (αποµάκρυνση) Το fmet είναι το µόνο αµινο-ακυλo trna που εισέρχεται στην θέση Ρ

16 Προκαρυωτική µετάφραση- Επιµήκυνση 3 θέσεις πρόσδεσης trna σχηµατίζoνται στο ριβόσωµα: Ρ: peptidyl A: aminoacyl E: ejection of trna (αποµάκρυνση) Αφού το δεύτερο trna καταλάβει την θέση Α, το ένζυµο πεπτιδυλοτρανσφεράση (α) σπάει τον δεσµό µεταξύ fmet και του trna του και (β) καταλύει την σύνθεση πεπτιδικού δεσµού µεταξύ των αα στις θέσεις Ρ και Α. Η διαδικασία αυτή υποβοηθείται από µια µικρή µετατόπιση της µικρής ριβοσωµικής υποµονάδας. πεπτιδυλοτρανσφεράση R1 H - C NH2 C=O O R1 H2N - C H C=O O

17 Προκαρυωτική µετάφραση- Επιµήκυνση 3 θέσεις πρόσδεσης trna σχηµατίζoνται στο ριβόσωµα: Ρ: peptidyl A: aminoacyl E: ejection of trna (αποµάκρυνση) Αφού το δεύτερο trna καταλάβει την θέση Α, το ένζυµο πεπτιδυλοτρανσφεράση (α) σπάει τον δεσµό µεταξύ fmet και του trna του και (β) καταλύει την σύνθεση πεπτιδικού δεσµού µεταξύ των αα στις θέσεις Ρ και Α. Η διαδικασία αυτή υποβοηθείται από µια µικρή µετατόπιση της µικρής ριβοσωµικής υποµονάδας. Σε αυτό το σηµείο το ριβόσωµα µετακινείται κατα 1 κωδικόνιο. Η µετακίνηση απαιτεί την δράση µιας σειράς παραγοντων επιµήκυνσης (elongation factors) και ενέργεια από την υδρόλυση του GTP. Ως αποτέλεσµα το trna που ήταν στην θέση P αποµακρύνεται, και το trna που ήταν στην θέση A µετακινείται στην Ρ. Η θέση A µπορεί να δεχθεί νεο µόριο trna µε αντικωδικόνιο συµπληρωµατικό του επόµενου κωδικονίου.

18 Προκαρυωτική µετάφραση- Επιµήκυνση...η διαδικασία επαναλαµβάνεται... Εποµένως, η σχηµατιζόµενη πεπτιδική αλυσίδα καταλαµβάνει την θέση Ρ, γι αυτό και ονοµάζεται peptidyl. H θέση Α δέχεται ένα trna που φέρει αµινοξύ και λέγεται aminoacyl. Η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνεται µε γρήγορους ρυθµούς (περίπου 15 αα/sec) και µε συχνότητα λάθους 1 στα 10,000 αα.

19 Προκαρυωτική µετάφραση- Επιµήκυνση...η διαδικασία επαναλαµβάνεται... Εποµένως, η σχηµατιζόµενη πεπτιδική αλυσίδα καταλαµβάνει την θέση Ρ, γι αυτό και ονοµάζεται peptidyl. H θέση Α δέχεται ένα trna που φέρει αµινοξύ και λέγεται aminoacyl. Η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνεται µε γρήγορους ρυθµούς (περίπου 15 αα/sec) και µε συχνότητα λάθους 1 στα 10,000 αα. Ποιο άκρο της πρωτεϊνης εξέρχεται του ριβοσώµατος? C ή Ν?

20 Προκαρυωτική µεταφραση- Τερµατισµός Οταν το κωδικόνιο τερµατισµού εισέλθει στην Α θέση, η επιµήκυνση της αλυσίδας σταµατάει γιατι δεν υπάρχει αντικωδικόνιο συµπληρωµατικό των κωδικονίων τερµατισµού.

21 Προκαρυωτική µετάφραση- Τερµατισµός Οταν το κωδικόνιο τερµατισµού εισέλθει στην Α θέση, η επιµήκυνση της αλυσίδας σταµατάει γιατι δεν υπάρχει αντικωδικόνιο συµπληρωµατικό των κωδικονίων τερµατισµού. Μια πρωτεϊνη απελευθέρωσης, Release Factor, (η οποία δεν αποτελεί συστατικό των ριβοσωµάτων) δένεται στην θέση Α και επιφέρει την διάσπαση του µεταφραστικού συµπλόκου. Το µόριο του mrna µπορεί να χρησιµοποιηθεί και πάλι για την µετάφραση.

22 Πολυσωµάτια Συνήθως, πολλα ριβοσώµατα µεταφράζουν ταυτόχρονα την ίδια αλυσίδα mrna µε µεσοδιαστήµατα τουλάχιστον 80 nt. Το σύµπλεγµα των ριβοσωµατίων µε µια αλυσίδα mrna ονοµάζεται πολυσωµάτιο (polysome).

23 Διαφορές µεταφρασης ανάµεσα στα προ- και ευκαρυωτικά Κύτταρα. Ta ευκαρυωτικά mrnas δεν φέρουν αλληλουχίες Shine- Delgarno. Αντ αυτού οι ριβοσωµικές υποµονάδες αναγνωρίζουν και δένονται στην καλύπτρα του 5 άκρου των ευκαρυωτικων mrnas. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιµοποιούν µόνο ΑUG ως εναρκτήριο κωδικόνιο. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα δεν χρησιµοποιούν φορµυλοµεθειονίνη αλλά µεθειονίνη. Εχουν όµως ένα ειδικό εναρκτήριο trna. Ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιµοποιούν µεγάλο αριθµό παραγόντων µετάφρασης. Για παράδειγµα υπάρχουν 10 παράγοντες έναρξης αντί των 3 στα προκαρυωτικά κύτταρα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα οι ριβοσωµατικές υποµονάδες είναι 60S και 40S (50S και 30S στους προκαρυώτες).

24 4E-BP1 1. eif4e G

25 4E-BP1 1. eif4e G p p 4E-BP1 Φωσφορυλίωση από µιτογόνα σήµατα 2. eif4e G

26 4E-BP1 1. eif4e G p p 4E-BP1 Φωσφορυλίωση από µιτογόνα σήµατα 2. eif4e G 3. eif4e G

27 4E-BP1 1. eif4e G p p 4E-BP1 Φωσφορυλίωση από µιτογόνα σήµατα 2. eif4e G 3. eif4e G eif2 40S

28 4E-BP1 eif4e G p p 4E-BP1 Φωσφορυλίωση από µιτογόνα σήµατα eif4e G eif4e G eif2 40S

29 4E-BP1 1. eif4e G p p 4E-BP1 Φωσφορυλίωση από µιτογόνα σήµατα 2. eif4e G 3,4. eif4e G 60S eif2 40S

30 Διαφορές µεταφρασης ανάµεσα στα προ- και ευκαρυωτικά Κύτταρα. Ta ευκαρυωτικά mrnas δεν φέρουν αλληλουχίες Shine- Delgarno. Αντ αυτού οι ριβοσωµικές υποµονάδες αναγνωρίζουν και δένονται στην καλύπτρα του 5 άκρου των ευκαρυωτικων mrnas. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιµοποιούν µόνο ΑUG ως εναρκτήριο κωδικόνιο. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα δεν χρησιµοποιούν φορµυλοµεθειονίνη αλλά µεθειονίνη. Εχουν όµως ένα ειδικό εναρκτήριο trna. Η µεταγραφή στα ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιµοποιεί µεγάλο αριθµό παραγόντων µεταγραφής. Για παράδειγµα υπάρχουν 10 παράγοντες έναρξης αντί των 3 στα προκαρυωτικά κύτταρα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα οι ριβοσωµατικές υποµονάδες είναι 60S και 40S (50S και 30S στους προκαρυώτες). Οι διαφορές αυτές επιτρέπουν την παρασκευή αντιβιοτικών που επιλεκτικά καταστρέφουν τα βακτηριακά κύτταρα µέσω της καταστολής της λειτουργίας των ριβοσωµάτων: Erythromycin: εµποδίζει την µετακίνηση του trna στα ριβοσώµατα Streptomycin: εµποδίζει την πρόσδεση του mrna µε µια συγκεκριµένη αλληλουχία στο 30S. Τetracyclins: εµποδίζουν την πρόσδεση του trna στο 30S Chloramphenicol: εµποδίζει τις αντιδράσεις της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης και εποµένως το στάδιο της επιµήκυνσης της µεταφρασης.

31 ΠΙΝΑΚΑΣ 2.4: ΠΙΝΑΚΑΣ 2.4: Η ιστότητα της µετάφρασης διασφαλίζεται α ό ολυάριθµα βήµατα ελέγχου σφαλµάτων.