Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG

Transcript

1 Νοέμβριος 2013 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG Έκδοση 1 25 Ποιοτική in vitro διάγνωση Για χρήση με όργανα Rotor-Gene Q PathoFinder B.V., Randwycksingel 45, 6229 EG Maastricht, ΟΛΛΑΝΔΙΑ Διανέμεται από την QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, ΓΕΡΜΑΝΙΑ R EL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies Η QIAGEN ηγείται στο χώρο πρωτοποριακών τεχνολογιών δειγμάτων και προσδιορισμών, παρέχοντας τη δυνατότητα απομόνωσης και ανίχνευσης των περιεχομένων οποιουδήποτε βιολογικού δείγματος. Τα προηγμένα, υψηλής ποιότητας προϊόντα και οι υπηρεσίες μας αποτελούν εγγύηση επιτυχίας - από το δείγμα έως το αποτέλεσμα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στους προσδιορισμούς νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών δειγμάτων και προσδιορισμών Αποστολή μας είναι η διασφάλιση των δικών σας επιτυχιών και επιτευγμάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε μας στη διεύθυνση

3 Περιεχόμενα Προβλεπόμενη χρήση 4 Περίληψη και επεξήγηση 4 Αρχές της διαδικασίας 5 Γονίδια-στόχοι 7 Υλικά που παρέχονται 10 Περιεχόμενα του κιτ 10 Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται 10 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 11 Γενικές προφυλάξεις 12 Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων 13 Χειρισμός και φύλαξη δειγμάτων 13 Διαδικασία 14 Εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων και προετοιμασία 14 Χρήση αρνητικού μάρτυρα 15 Χρήση εσωτερικού μάρτυρα και φορέα RNA 15 Πρωτόκολλο: Ενίσχυση PCR και ανάλυση τήξης 17 Ερμηνεία των αποτελεσμάτων 34 Κανονικοποίηση 34 Ανάλυση 34 Κατώφλι 34 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 36 Ποιοτικός έλεγχος 39 Περιορισμοί 40 Χαρακτηριστικά απόδοσης 40 Βιβλιογραφία 40 Σύμβολα 40 Πληροφορίες επικοινωνίας 41 Πληροφορίες παραγγελίας 42 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013 3

4 Προβλεπόμενη χρήση Το πάνελ RespiFinder RG είναι μια ποιοτική δοκιμασία multiplex PCR για την ανίχνευση και διαφοροποίηση 16 RNA ιών,* 2 DNA ιών, και 3 βακτηρίων, όλα από τα οποία μπορούν να προκαλέσουν λοιμώξεις του αναπνευστικού στους ανθρώπους: αδενοϊός, μποκαϊός, κορόνα NL63, κορόνα OC43, κορόνα 229E, κορόνα HKU1, hmpv, γρίπη A, γρίπη B, γρίπη A H1N1v, παραγρίπη 1, παραγρίπη 2, παραγρίπη 3, παραγρίπη 4, ρινοϊός/εντεροϊός, RSV-A, RSV-B, Bordetella pertussis, Legionella pneumophila, και Mycoplasma pneumoniae. Το πάνελ RespiFinder RG βοηθά στη διάγνωση λοίμωξης του αναπνευστικού όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. Αρνητικά αποτελέσματα δεν υποδεικνύουν απαραίτητα την απουσία ιογενούς ή βακτηριακής λοίμωξης του αναπνευστικού αρνητικά αποτελέσματα δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως η μοναδική βάση για τη διάγνωση, τη θεραπεία ή άλλες θεραπευτικές αποφάσεις. Θετικά αποτελέσματα δεν αποκλείουν συνυπάρχουσα λοίμωξη με άλλα παθογόνα. Το(α) ανιχνευόμενο(α) παθογόνο(α) ενδέχεται να μην αποτελεί(ούν) την οριστική αιτία της νόσου. Στην τελική διάγνωση, πρέπει να περιλαμβάνονται άλλες εργαστηριακές εξετάσεις και αξιολόγηση της κλινικής παρουσίασης. Το προϊόν προορίζεται για χρήση μόνο από επαγγελματίες εργαστηρίων. Περίληψη και επεξήγηση Οξεία λοίμωξη του αναπνευστικού αποτελεί τον πιο διαδεδομένο τύπο οξείας λοίμωξης σε ενήλικες και παιδιά και είναι σημαντική αιτία νόσου σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Οι λοιμώξεις του αναπνευστικού (RTI) χωρίζονται συνήθως σε λοιμώξεις του ανώτερου αναπνευστικού (URTI) και λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού (LRTI). Οι URTI περιλαμβάνουν ρινόρροια, επιπεφυκίτιδα, φαρυγγίτιδα, μέση ωτίτιδα και παραρρινοκολπίτιδα. Οι LRTI περιλαμβάνουν πνευμονία, βρογχιολίτιδα και βρογχίτιδα. Τόσο οι ιοί όσο και τα βακτήρια μπορούν να προκαλέσουν οξείες RTI, και ο αριθμός των αιτιολογικών παραγόντων είναι μεγάλος, καθώς και ποικίλος, αποτελώντας μια μεγάλη πρόκληση για τη διάγνωση. Οι δοκιμασίες ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων έχει αποδειχθεί ότι αποτελούν γρήγορες, ευαίσθητες και ειδικές εναλλακτικές λύσεις είτε σε singleplex είτε σε multiplex μορφή. Οι προσδιορισμοί multiplex επιτρέπουν την ταυτόχρονη ενίσχυση περισσότερων του ενός στόχων, παρέχοντας στοιχεία για τη σημασία των μικτών λοιμώξεων και την πρόγνωση και υποτροπή των αναπνευστικών παθήσεων. * Το πάνελ RespiFinder RG ανιχνεύει 16 RNA ιούς, αλλά δεν διαφοροποιεί τον ρινοϊό από τον εντεροϊό. 4 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

5 Αρχές της διαδικασίας Το πάνελ RespiFinder RG βασίζεται στην τεχνολογία SmartFinder, μια τεχνολογία η οποία επιτρέπει μια εξαιρετικά σύνθετη ανάλυση έως και 13 στόχων σε μία μόνο αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου. Το πάνελ RespiFinder RG περιέχει διαφορετικά σύνολα ιχνηθετών MultiFinder συνδυασμένα με 12 φθορίζοντες ανιχνευτές σήμανσης SMART (ενίσχυση multiplex ενός μόνο σωληναρίου σε πραγματικό χρόνο), οι οποίοι επιτρέπουν την ανίχνευση 21 διαφορετικών παθογόνων συν έναν εσωτερικό μάρτυρα. Η αντίδραση ξεκινά με μια προενίσχυση, η οποία συνδυάζει ένα βήμα αντίστροφης μεταγραφής με ένα βήμα PCR για την ενίσχυση του (c)dnaστόχου. Ακολούθως, ένα μέρος της αντίδρασης προενίσχυσης μεταφέρεται σε 2 σωληνάρια PCR. Πραγματοποιούνται δύο ξεχωριστές αντιδράσεις SmartFinder, οι οποίες περιλαμβάνουν ένα βήμα υβριδισμού με ανιχνευτή και ένα βήμα σύνδεσης (ligation) ανιχνευτή και ενίσχυσης. Η ανίχνευση πραγματοποιείται με χρήση ανάλυσης καμπύλης τήξης. Μια σχηματική αναπαράσταση της συνολικής ροής εργασίας παρουσιάζεται στην εικόνα 1. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013 5

6 Εικόνα 1. Επισκόπηση της ροής εργασίας με το πάνελ RespiFinder RG. Το πάνελ RespiFinder RG χρησιμοποιεί το όργανο Rotor-Gene Q MDx ή Rotor-Gene Q για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων του(ων) παθογόνου(ων). Ένας εσωτερικός μάρτυρας (IC) περιλαμβάνεται στον προσδιορισμό για τη διάκριση μεταξύ πραγματικών αρνητικών δειγμάτων και ψευδών αρνητικών δειγμάτων λόγω αποδόμησης των νουκλεϊκών οξέων, αναστολής της PCR, ή αστοχίας της δοκιμασίας. Το δείγμα εισόδου είναι ολικά νουκλεϊκά οξέα εγχυλισμένα και καθαρισμένα από ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα. Η προετοιμασία των δειγμάτων αποτελεί ξεχωριστή διαδικασία από το πεδίο εφαρμογής του πάνελ. Χρησιμοποιήστε κατάλληλες μεθόδους ή προϊόντα για το χειρισμό των δειγμάτων και εκχυλίστε 6 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

7 και καθαρίστε τα νουκλεϊκά οξέα (βλ. «Χειρισμός και φύλαξη δειγμάτων», σελ. 13, και «Εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων και προετοιμασία», σελ. 14). Γονίδια-στόχοι Τα γονίδια-στόχοι που χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό των ανιχνευτών και των εκκινητών παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Γονίδια-στόχοι του πάνελ RespiFinder RG Στόχος Μάρτυρας Εσωτερικός μάρτυρας (IC) Γονίδιο Γονίδιο πρωτεΐνης λύσης φάγων MS2 Κωδικός παθογόνου IC Ιοί Αδενοϊός Γονίδιο εξονίου (H) Adeno Μποκαϊός Γονίδιο μη καψιδίου (NP1) Boca Κορόνα 229E Κορόνα HKU1 Κορόνα NL63 Κορόνα OC43 hmpv Γρίπη A Γρίπη B Γονίδιο πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (NP) Γονίδιο φωσφοπρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (N) Γονίδιο πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (NP) Γονίδιο πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (NP) Γονίδιο πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (NP) Γονίδιο πρωτεΐνης μεσοκυττάριας ουσίας (M1) Γονίδιο πρωτεΐνης μεσοκυττάριας ουσίας (M1) 229E HKU1 NL63 OC43 hmpv InfA InfB Γρίπη A H1N1v Γονίδιο νευραμινιδάσης H1N1 Παραγρίπη 1 Γονίδιο αιμοσυγκολλητίνηςνευραμινιδάσης (HN) PIV1 Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013 7

8 Πίνακας 1. Συνέχεια Στόχος Ιοί (συνέχεια) Παραγρίπη 2 Παραγρίπη 3 Παραγρίπη 4 Ρινοϊός/εντεροϊός RSV-A RSV-B Βακτήρια Bordetella pertussis Chlamydophila pneumoniae* Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Γονίδιο Γονίδιο αιμοσυγκολλητίνηςνευραμινιδάσης (HN) Γονίδιο αιμοσυγκολλητίνηςνευραμινιδάσης (HN) Γονίδιο μείζονος πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (N) Γονίδιο πολυπρωτεΐνης 5' μη μεταφρασμένης περιοχής (PP) Γονίδιο μείζονος πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (N) Γονίδιο μείζονος πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου (N) Αλληλουχία περεμβολής 481 (IS481) Γονίδιο μείζονος πρωτεΐνης εξωτερικής μεμβράνης (OmpA) Γονίδιο ενισχυτή αναστολέα μακροφάγων (Mip) Γονίδιο πρωτεΐνης κυταδεσίνης (P1) Κωδικός παθογόνου PIV2 PIV3 PIV4 Rhino/ Entero RSVA RSVB B. pert C. pneu L. pneu M. pneu * Σημείωση: Η ανίχνευση του Chlamydophila pneumoniae με το πάνελ RespiFinder RG προορίζεται μόνο για έρευνα. Δεν προορίζεται για διαγνωστικές διαδικασίες. Καμία αξίωση ή δήλωση δεν προορίζεται για να παρέχει πληροφορίες για τη διάγνωση, την πρόληψη ή τη θεραπεία νόσου. Για κάθε δείγμα, διενεργείται μία προενίσχυση και 2 αντιδράσεις SmartFinder. Τα παθογόνα, οι επισημάνσεις και το T m των αντίστοιχων ανιχνευτών υβριδισμού SMART στις δύο αντιδράσεις 2 SmartFinder παρουσιάζονται στον πίνακα 2. 8 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

9 Πίνακας 2. Οι στόχοι και οι αντίστοιχες τιμές T m των ανιχνευτών SMART Επισήμ ανση Cy 5 ROX BHQ 1 Ανιχνευτής SMART Cy5 ανιχνευτής 1 Cy5 ανιχνευτής 2 Cy5 ανιχνευτής 3 Cy5 ανιχνευτής 4 Cy5 ανιχνευτής 5 Cy5 ανιχνευτής 6 ROX ανιχνευτής 1 ROX ανιχνευτής 2 ROX ανιχνευτής 3 ROX ανιχνευτής 4 ROX ανιχνευτής 5 ROX ανιχνευτής 6 BHQ1 ανιχνευτής 1 Αποδεκτό εύρος T m ( C) Κωδικός παθογόνου (μείγμα 1) 50,5 53,5 L. pneu OC43 54,5 57,5 B. pert NL63 60,0 63,0 Rhino/Entero 229E 66,0 69,0 C. pneu* HKU1 70,5 73,5 M. pneu 76,5 79,5 H1N1 52,5 55,5 RSVA PIV1 57,5 60,5 Adeno PIV2 62,5 65,5 hmpv PIV3 66,5 69,5 RSVB PIV4 72,5 75,5 InfA Boca 76,5 79,5 InfB 70,5 73,5 IC IC Κωδικός παθογόνου (μείγμα 2) * Σημείωση: Η ανίχνευση του Chlamydophila pneumoniae με το πάνελ RespiFinder RG προορίζεται μόνο για έρευνα. Δεν προορίζεται για διαγνωστικές διαδικασίες. Καμία αξίωση ή δήλωση δεν προορίζεται για να παρέχει πληροφορίες για τη διάγνωση, την πρόληψη ή τη θεραπεία νόσου. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013 9

10 Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ RespiFinder RG Panel (25) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων 25 Περιεχόμενα Pre-amplification Master Mix (Κύριο μείγμα προενίσχυσης) Internal Control (Εσωτερικός μάρτυρας) (IC) Pre-amplification Primermix (Μείγμα εκκινητών προενίσχυσης) Hybridization Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού) Χρώμα πώματος Όγκος Μοβ 180 µl Μαύρο 300 µl Λευκό 65 µl Κίτρινο 80 µl Probemix 1 (Μείγμα ανιχνευτών 1) Κόκκινο 40 µl Probemix 2 (Μείγμα ανιχνευτών 2) Μπλε 40 µl TwoStep Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα δύο βημάτων) Πράσινο (σε κεχριμπαρί σωληνάριο) µl Ligase Enzyme (Ένζυμο λιγκάσης) Καφέ 50 µl Taq Polymerase (Πολυμεράση Taq) Πορτοκαλί 20 µl Dilution Buffer (Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης) RespiFinder RG Panel Handbook (εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG) (αγγλικά) Διαφανές µl 1 Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS), τα οποία και είναι διαθέσιμα από τον προμηθευτή του προϊόντος. 10 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

11 Αντιδραστήρια Κιτ εκχύλισης RNA/DNA (βλ. «Εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων και προετοιμασία», σελ. 14) Νερό απαλλαγμένο από RNάση/DNάση Αναλώσιμα Αναλώσιμα ρύγχη που περιέχουν υδρόφοβα φίλτρα Αναλώσιμα ρύγχη χαμηλής κατακράτησης που περιέχουν υδρόφοβα φίλτρα Σωληνάρια των 1,5 ml απαλλαγμένα από RNάση/DNάση Σωληνάρια PCR των 0,2 ml απαλλαγμένα από RNάση/DNάση (μεμονωμένα σωληνάρια με πώματα ή σωληνάρια ταινιών με ατομικά πώματα) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (σωληνάρια ταινιών και πώματα) (αρ. καταλ ή ) για χρήση με όργανα Rotor-Gene Q Εξοπλισμός Ρυθμιζόμενες πιπέτες:* 0,1 2 µl, 2 20 µl, µl Πολυκάναλη ρυθμιζόμενη πιπέτα:* 1 10 µl (προαιρετικό) Αναδευτήρας τύπου vortex* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με στροφέα για σωληνάρια των 2 ml Φυγόκεντρος* για σωληνάρια αντίδρασης των 0,2 ml Τεμάχιο ψύξης ή πάγος Θερμικός κυκλοποιητής* για σωληνάρια PCR των 0,2 ml με θερμαινόμενο καπάκι και ρυθμούς διάκλισης 1 5 C/δευτερόλεπτο (για προ-ενίσχυση και υβριδισμό, π.χ. βασισμένος σε μπλοκ θερμικός κυκλοποιητής GeneAmp PCR System 9700) Όργανο και παρελκόμενα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM* ή Rotor-Gene Q 5plex HRM* Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για διαγνωστική χρήση in vitro Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες παρακαλείστε να ανατρέξετε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS). Αυτά τα δελτία είναι διαθέσιμα online σε εύχρηστη μορφή * Βεβαιωθείτε πως τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

12 PDF στη διεύθυνση όπου και μπορείτε να βρείτε, να προβάλλετε και να εκτυπώσετε τα δελτία SDS για κάθε κιτ και συστατικό των κιτ της QIAGEN. Για πληροφορίες ασφαλείας σχετικά με το χρησιμοποιούμενο κιτ καθαρισμού, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο του σχετικού κιτ. Για πληροφορίες ασφαλείας σχετικά με όργανα, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του εκάστοτε οργάνου. Απορρίψτε τα απόβλητα δειγμάτων και προσδιορισμών σύμφωνα με τις εκάστοτε τοπικές διατάξεις ασφαλείας. Πληροφορίες επείγουσας ανάγκης, 24ωρης διαθεσιμότητας Βοήθεια σε περίπτωση χημικής έκτακτης ανάγκης ή ατυχήματος είναι διαθέσιμη 24 ώρες την ημέρα από την: CHEMTREC Εκτός Η.Π.Α. & Καναδά Τηλ.: (κλήσεις με χρέωση του καλουμένου αποδεκτές) Γενικές προφυλάξεις Λαμβάνετε πάντοτε υπόψη τα ακόλουθα: Αυτός ο μοριακός προσδιορισμός πρέπει να εκτελείται μόνο από εξειδικευμένο εργαστηριακό προσωπικό. Φυλάσσετε και λαμβάνετε θετικά υλικά (δείγματα και θετικούς μάρτυρες) χωριστά από όλα τα υπόλοιπα αντιδραστήρια και προσθέτετέ τα στο μείγμα αντίδρασης σε χωρικά διαχωρισμένη εγκατάσταση. Φοράτε αναλώσιμα γάντια όταν εκτελείτε τον προσδιορισμό. Χρησιμοποιείτε αναλώσιμα ρύγχη που περιέχουν υδρόφοβα φίλτρα προκειμένου να αποφύγετε τη διασταυρούμενη μόλυνση. Χρησιμοποιείτε αναλώσιμα ρύγχη χαμηλής κατακράτησης που περιέχουν υδρόφοβα φίλτρα κατά το χειρισμό του μείγματος ενζύμων RT-PCR, του ενζύμου λιγκάσης και της Taq πολυμεράσης. Χρησιμοποιείτε φιαλίδια PCR απαλλαγμένα από RNάση/DNάση. Πάντα να αποψύχετε τα δείγματα RNA/DNA σε πάγο και να τα διατηρείτε σε πάγο ή σε τεμάχιο ψύξης. Πάντα να διατηρείτε τα ένζυμα σε πάγο ή σε τεμάχιο ψύξης όταν τα βγάζετε από τον καταψύκτη. Χειρίζεστε τα ένζυμα με προσοχή και αναμειγνύετε πολύ απαλά. Όταν αποψυχθούν, φυγοκεντρίστε τα αντιδραστήρια για 5 δευτερόλεπτα σε φυγόκεντρο και αναμείξτε με απαλό πιπετάρισμα πάνω-κάτω. Η είσοδος σε όλα τα προγράμματα κυκλοποίησης στο λογισμικό Rotor- Gene Q πρέπει να γίνεται πριν την εκτέλεση του προσδιορισμού. 12 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

13 Πάντα να φυγοκεντρίζετε τα φιαλίδια και τα πλακίδια PCR για σύντομο χρονικό διάστημα και να ανοίγετε με προσοχή προκειμένου να αποφύγετε τα αερολύματα. Σημείωση: Για να αποφευχθεί η μόλυνση, συνιστούμε ιδιαίτερα να εκτελείτε τις πειραματικές δραστηριότητες σε σταθμούς εργασίας PCR, στις ακόλουθες 3 ξεχωριστές περιοχές: Περιοχή 1: Προετοιμάστε τα κύρια μείγματα για προενίσχυση, υβριδισμό και ανάλυση σύνδεσης/αποδιάταξης. Περιοχή 2: Προσθέστε δείγμα RNA/DNA στο μείγμα. Περιοχή 3: Εκτελέστε την προενίσχυση, τον υβριδισμό και την ανάλυση καμπύλης τήξης σε 3 βήματα: Εκτελέστε την προενίσχυση. Προσθέστε προϊόντα προενίσχυσης στο μείγμα υβριδισμού (κατά προτίμηση μέσα σε σταθμό εργασίας PCR) και εκτελέστε υβριδισμό. Προσθέστε προϊόντα υβριδισμού στο μείγμα δύο βημάτων (κατά προτίμηση μέσα σε σταθμό εργασίας PCR) και εκτελέστε τη σύνδεση, την ενίσχυση και την ανάλυση καμπύλης τήξης. Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων Τα συστατικά του πάνελ RespiFinder RG Panel πρέπει να φυλάσσονται σε σκοτεινό χώρο στους 15 έως 30 C και είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Θα πρέπει να αποφεύγεται η επαναλαμβανόμενη απόψυξη και κατάψυξη (>5 φορές) διότι μπορεί να επιφέρει έκπτωση της απόδοσης του προσδιορισμού. Χειρισμός και φύλαξη δειγμάτων Η ανίχνευση των παθογόνων του αναπνευστικού εξαρτάται από τη συλλογή δειγμάτων υψηλής ποιότητας, τη γρήγορη μεταφορά τους στο εργαστήριο, καθώς και την κατάλληλη φύλαξή τους πριν από τις εργαστηριακές εξετάσεις. Τα ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα είναι κατάλληλα για την ανίχνευση ιογενών και/ή βακτηριακών λοιμώξεων του αναπνευστικού. Τα κλινικά δείγματα πρέπει να μεταφέρονται στο εργαστήριο το συντομότερο δυνατόν, σε υποπολλαπλάσια, και να υποβάλλονται σε επεξεργασία. Τα δείγματα πρέπει να φυλάσσονται στους 4 C. Εάν τα δείγματα δεν μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία εντός 48 ωρών, πρέπει να φυλαχθούν κατεψυγμένα σε θερμοκρασία ίση με ή χαμηλότερη από 20 C, κατά προτίμηση 70 C. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

14 Διαδικασία Εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων και προετοιμασία Το κιτ QIAamp MinElute Virus Spin της QIAGEN, που φαίνεται στον πίνακα 3, είναι επικυρωμένο για καθαρισμό DNA και RNA από τον ενδεικνυόμενο τύπο ανθρώπινων δειγμάτων για χρήση με το πάνελ RespiFind RG. Εκτελέστε τον καθαρισμό των νουκλεϊκών οξέων σύμφωνα με τις οδηγίες στο εγχειρίδιο του κιτ. Πίνακας 3. Κιτ καθαρισμού επικυρωμένο για χρήση με το πάνελ RespiFinder RG Τύπος δείγματος Ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα Κιτ απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Αριθμός καταλόγου (QIAGEN) Χρησιμοποιήστε 200 µl υλικού δείγματος και εκλούστε σε 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης. Συνιστούμε ιδιαίτερα να μην επιχειρήσετε να συμπνυκνώσετε τα νουκλεϊκά οξέα, καθώς αυτό μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο αναστολής των ενζύμων RT-PCR. Ένας εσωτερικός μάρτυρας προστίθεται στο λυμένο δείγμα (βλ. «Χρήση εσωτερικού μάρτυρα και φορέα RNA», σελ. 15). Κατά τη χρήση του κιτ QIAamp MinElute Virus Spin, συνιστούμε την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης στο δείγμα σε θάλαμο νηματικής ροής. Η διαδικασία εκχύλισης μπορεί να συνεχιστεί σε πάγκο μετά τη λύση του δείγματος. Μετά τη χρήση, συνιστάται να απολυμαίνετε το θάλαμο νηματικής ροής με διάλυμα απολύμανσης (π.χ. λευκαντικό ppm)* και λειτουργώντας τη λυχνία UV για 30 λεπτά. Αποφεύγετε κύκλους κατάψυξης/απόψυξης του εκχυλισμένου DNA/RNA όσο είναι δυνατόν, και φυλάσσετε τα εκχυλίσματα νουκλεϊκών οξέων στους 4 C όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία εντός μίας ημέρας. Για μεγαλύτερες χρονικές περιόδους, φυλάσσετε το εκχυλισμένο RNA/DNA στους 20 C ή 70 C. * Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS), τα οποία και είναι διαθέσιμα από τον προμηθευτή του προϊόντος. 14 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

15 Χρήση αρνητικού μάρτυρα Κάθε εκτέλεση πρέπει να συμπεριλαμβάνει έναν αρνητικό μάρτυρα. Ένας αρνητικός μάρτυρας αποτελείται από 200 µl νερού ποιότητας εφαρμογών PCR συν εσωτερικό μάρτυρα (IC). Αυτός ο αρνητικός μάρτυρας υποβάλλεται σε επεξεργασία ως κανονικό δείγμα, συμπεριλαμβανομένης της διαδικασίας εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων. Στην τελική ανάλυση, το σήμα αρνητικού μάρτυρα χρησιμεύει ως αναφορά για το σήμα υποβάθρου στα κανάλια FAM/ROX και FAM/Cy5 και για το σήμα θετικού IC στο κανάλι Green (IC). Χρήση εσωτερικού μάρτυρα και φορέα RNA Η χρήση του κιτ QIAamp MinElute Virus Spin σε συνδυασμό με το πάνελ RespiFinder RG απαιτεί την εισαγωγή του εσωτερικού μάρτυρα (IC) στη διαδικασία καθαρισμού, για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της προετοιμασίας των δειγμάτων και του καθοδικού προσδιορισμού. Επιπλέον, το κιτ QIAamp MinElute Virus Spin απαιτεί την προετοιμασία του φορέα RNA. Ο IC είναι ένας φάγος MS2 και παρέχεται ως μάρτυρας για τη λύση, την εκχύλιση RNA/DNA, την απόδοση προσδιορισμού του πάνελ RespiFinder RG, καθώς και για τον έλεγχο για πιθανή αναστολή της PCR. Ο IC προστίθεται μαζί με το φορέα RNA στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πριν από την προσθήκη στο δείγμα. Η ποσότητα του εμβολιασμένου IC είναι ανεξάρτητη από τον αρχικό όγκο του δείγματος. Η ποσότητα του εμβολιασμένου IC εξαρτάται από τον όγκο έκλουσης. Χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp MinElute Virus Spin, το εκχυλισμένο RNA/DNA θα εκλουστεί σε 60 µl. Ο όγκος του IC που θα προστεθεί στο ρυθμιστικό διάλυμα AL είναι 5,5 µl ανά δείγμα (βλ. πίνακα 4). Σε περίπτωση ισχυρής λοίμωξης και/ή πολλαπλών λοιμώξεων, η κορυφή τήξης του IC ενδέχεται να μην είναι ορατή στην τελική ανάλυση. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι υψηλές ποσότητες παθογόνων νουκλεϊκών οξέων καταναλώνουν το μεγαλύτερο μέρος των αντιδραστηρίων στον προσδιορισμό. Κατά συνέπεια, όταν το σήμα IC είναι απόν υπό την παρουσία ενός ή περισσότερων ειδικών κορυφών τήξης υποδεικνύοντας λοίμωξη, ο προσδιορισμός εξακολουθεί να είναι έγκυρος. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

16 Πίνακας 4. Απαιτούμενοι όγκοι ρυθμιστικού διαλύματος AL, μείγματος φορέα RNA ρυθμιστικού διαλύματος AVE, και IC Αριθμός δειγμάτων Όγκος ρυθμ. διαλύματος AL (ml) Όγκος φορέα RNA AVE (µl) Όγκος εσωτερικού μάρτυρα (µl) 1 0,22 6,2 5,5 2 0,44 12, ,66 18,5 16,5 4 0,88 24, ,1 30,8 27,5 6 1,32 36, ,54 43,1 38,5 8 1,76 49, ,98 55,4 49,5 10 2,2 61, ,42 67,7 60,5 12 2,64 73, Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

17 Πρωτόκολλο: Ενίσχυση PCR και ανάλυση τήξης Απαραίτητες ενέργειες πριν από την έναρξη Αποψύξτε τη μήτρα RNA/DNA (εάν έχει καταψυχθεί) και όλα τα αντιδραστήρια, και διατηρήστε τα σωληνάρια στον πάγο. Προετοιμάστε ελαφρώς μεγαλύτερες από τις απαιτούμενες ποσότητες των διαφόρων μειγμάτων, έτσι ώστε να αντισταθμιστούν οι απώλειες από τη διανομή με πιπέτα. Διαδικασία Προενίσχυση 1. Αναστρέψτε το κύριο μείγμα προενίσχυσης αρκετές φορές για να διασφαλίσετε την πλήρη απόψυξη και ομογενοποίηση του κύριου μείγματος. Φυγοκεντρίστε το σωληνάριο για σύντομο χρονικό διάστημα. Προετοιμάστε το μείγμα αντίδρασης προενίσχυσης σύμφωνα με τον πίνακα 5 και διατηρήστε το στον πάγο. Το μείγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που απαιτούνται για την PCR, εκτός από το δείγμα. Σημείωση: Τα μείγματα υβριδισμού (βήμα 6) και το μείγμα δύο βημάτων (βήμα 12) μπορούν να προετοιμαστούν ταυτόχρονα με το μείγμα προενίσχυσης και πρέπει να φυλαχθούν σε σκοτεινό μέρος στους 4 C μέχρι τη χρήση. Η ταυτόχρονη προετοιμασία και των 3 μειγμάτων μπορεί να γίνει μόνο όταν ακολουθηθεί το πλήρες πρωτόκολλο χωρίς καθυστέρηση. Η σταθερότητα των μειγμάτων δεν είναι εγγυημένη μετά από παρατεταμένη φύλαξη (όπως κατά τη διάρκεια της νύχτας). Πίνακας 5. Προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης προενίσχυσης Αριθμός δειγμάτων (χρώμα πώματος του σωληναρίου αντιδραστηρίου) 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (διαφανές) 6,25 µl 75 µl Κύριο μείγμα προενίσχυσης (μοβ) 6,25 µl 75 µl Μείγμα εκκινητών προενίσχυσης (λευκό) 2,5 µl 30 µl Συνολικός όγκος 15 µl 180 µl Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

18 2. Αναμείξτε το μείγμα αντίδρασης προενίσχυσης απαλά αλλά πλήρως, και διανείμετε με πιπέτα 15 µl του μείγματος μέσα σε κάθε σωληνάριο PCR των 0,2 ml. Στη συνέχεια, προσθέστε 10 µl του εκλουσμένου DNA/RNA δείγματος ή του αρνητικού μάρτυρα (βλ. πίνακα 6). 3. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Αναμείξτε καλά. Φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια για σύντομο χρονικό διάστημα και τοποθετήστε τα σωληνάρια πίσω στον πάγο ή σε ένα τεμάχιο ψύξης. Πίνακας 6. Προετοιμασία των αντιδράσεων προενίσχυσης Αριθμός δειγμάτων 1 12 Μείγμα αντίδρασης προενίσχυσης 15 µl 15 μl καθένα Δείγμα ή αρνητικός μάρτυρας 10 µl 10 μl καθένα Συνολικός όγκος 25 µl 25 μl καθένα 4. Προγραμματίστε το βασισμένο σε μπλοκ θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με τον πίνακα 7. Πίνακας 7. Πρόγραμμα θερμικού κυκλοποιητή για προενίσχυση Αντίστροφη μεταγραφή: 20 λεπτά 50 C Αρχικό βήμα ενεργοποίησης: Κυκλοποίηση 3 βημάτων: 2 λεπτά 95 C Αποδιάταξη 25 δευτερόλεπτα 94 C Ανασύνδεση 25 δευτερόλεπτα 55 C Επέκταση 40 δευτερόλεπτα 72 C Αριθμός κύκλων 40 Διατήρηση 20 C 5. Εκκινήστε το πρόγραμμα προενίσχυσης ενώ τα σωληνάρια PCR βρίσκονται ακόμα στον πάγο. Περιμένετε μέχρι ο θερμικός κυκλοποιητής να φθάσει τους 50 C. Στη συνέχεια, τοποθετήστε τα σωληνάρια στο μπλοκ του θερμικού κυκλοποιητή και κλείστε το θερμαινόμενο καπάκι. 18 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

19 Υβριδισμός 6. Προετοιμάστε το μείγμα υβριδισμού 1 σύμφωνα με τον πίνακα 8 και το μείγμα υβριδισμού 2 σύμφωνα με τον πίνακα 9, και αναμείξτε απαλά αλλά πλήρως. Εάν τα μείγματα υβριδισμού ήταν ήδη προετοιμασμένα στο βήμα 1, περιμένετε μέχρι να ολοκληρωθεί το πρόγραμμα προενίσχυσης, και στη συνέχεια προχωρήστε στο βήμα 7. Πίνακας 8. Προετοιμασία του μείγματος υβριδισμού 1 Αριθμός δειγμάτων (χρώμα πώματος του σωληναρίου αντιδραστηρίου) 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού (κίτρινο) 1,5 µl 18 µl Μείγμα ανιχνευτών 1 (κόκκινο) 1,5 µl 18 µl Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (διαφανές) Συνολικός όγκος του μείγματος υβριδισμού 1 3,0 µl 36 µl 6,0 µl 72 µl Πίνακας 9. Προετοιμασία του μείγματος υβριδισμού 2 Αριθμός δειγμάτων (χρώμα πώματος του σωληναρίου αντιδραστηρίου) 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού (κίτρινο) 1,5 µl 18 µl Μείγμα ανιχνευτών 2 (μπλε) 1,5 µl 18 µl Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (διαφανές) Συνολικός όγκος του μείγματος υβριδισμού 2 3,0 µl 36 µl 6,0 µl 72 µl 7. Για κάθε δείγμα, διανείμετε με πιπέτα 6 µl του μείγματος υβριδισμού 1 σε ένα νέο σωληνάριο PCR, και διανείμετε με πιπέτα 6 µl του μείγματος υβριδισμού 2 σε ένα νέο σωληνάριο PCR. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

20 8. Αφού ολοκληρωθεί το πρόγραμμα προενίσχυσης (βήμα 5), αφαιρέστε τα σωληνάρια PCR από το θερμικό κυκλοποιητή και φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα. Διανείμετε με πιπέτα 2 µl κάθε αντίδρασης προ-ενίσχυσης σε καθένα από τα 2 σωληνάρια ένα με μείγμα υβριδισμού 1 και ένα με μείγμα υβριδισμού 2 (βλ. πίνακα 10). Πίνακας 10. Προετοιμασία των αντιδράσεων υβριδισμού Αριθμός δειγμάτων 1 12 Μείγμα υβριδισμού 1 (βήμα 7) 6,0 µl 6,0 μl καθένα Αντίδραση προενίσχυσης (βήμα 8) 2,0 µl 2,0 μl καθένα Συνολικός όγκος 8,0 µl 8,0 μl καθένα Μείγμα υβριδισμού 2 (βήμα 7) 6,0 µl 6,0 μl καθένα Αντίδραση προενίσχυσης (βήμα 8) 2,0 µl 2,0 μl καθένα Συνολικός όγκος 8,0 µl 8,0 μl καθένα 9. Κλείστε τα σωληνάρια PCR και φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα. 10. Προγραμματίστε το βασισμένο σε μπλοκ θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με τον πίνακα 11. Πίνακας 11. Πρόγραμμα θερμικού κυκλοποιητή για υβριδισμό Αποδιάταξη: 10 λεπτά 98 C Υβριδισμός των ανιχνευτών: 30 λεπτά 60 C Διατήρηση 60 C 11. Τοποθετήστε τα σωληνάρια που περιέχουν τα μείγματα της αντίδρασης προενίσχυσης και τα μείγματα υβριδισμού μέσα στο μπλοκ του θερμικού κυκλοποιητή και κλείστε το θερμαινόμενο καπάκι. Εκκινήστε το πρόγραμμα υβριδισμού. Σύνδεση και PCR 12. Προετοιμάστε το μείγμα δύο βημάτων σύμφωνα με τον πίνακα 12. Αναμείξτε απαλά αλλά πλήρως και διατηρήστε στον πάγο μέχρι τη χρήση. 20 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

21 Σημείωση: Δεδομένου ότι τα δείγματα χωρίστηκαν σε 2 μέρη (μείγμα υβριδισμού 1 και μείγμα υβριδισμού 2), το μείγμα δύο βημάτων πρέπει να προετοιμαστεί εις διπλούν. Και τα δύο μείγματα υβριδισμού απαιτούν 32,0 µl μείγματος δύο βημάτων των καθένα. Εάν το μείγμα δύο βημάτων είχε ήδη προετοιμαστεί στο βήμα 1, τότε συνεχίστε με το βήμα 13. Πίνακας 12. Προετοιμασία του μείγματος δύο βημάτων Αριθμός δειγμάτων (χρώμα πώματος του σωληναρίου αντιδραστηρίου) 1* 2 x 1 2 x 12 Ρυθμιστικό διάλυμα δύο βημάτων (πράσινο) 30,6 µl 61,2 µl 734,4 µl Ένζυμο λιγκάσης (καφέ) 1,0 µl 2,0 µl 24,0 µl Taq πολυμεράση (πορτοκαλί) 0,4 µl 0,8 µl 9,6 µl Συνολικός όγκος 32,0 µl 64,0 µl 768,0 µl * Σημείωση: Η προετοιμασία 1 μείγματος δύο βημάτων δεν είναι ποτέ απαραίτητη διότι πρέπει να προετοιμάζονται 2 x 1 όγκοι μείγματος δύο βημάτων για κάθε δείγμα. 13. Δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας για το όργανο Rotor-Gene Q σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα. Μια επισκόπηση του προγράμματος θερμικού κυκλοποιητή παρουσιάζεται στον πίνακα 13, σελ. 22. Ρύθμιση των γενικών παραμέτρων του προσδιορισμού Εικόνες 2, 3 Δημιουργία νέων καναλιών Εικόνες 4 7 Επεξεργασία της απολαβής Εικόνες 8, 9 Προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας Εικόνα Προγραμματισμός του προγράμματος τήξης Εικόνες 17, 18 Περίληψη και αποθήκευση της μήτρας Εικόνες 19, 20 Έναρξη της εκτέλεσης Σχήμα 21 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

22 Όλες οι προδιαγραφές αναφέρονται στο λογισμικό Rotor-Gene Q, έκδοση Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον προγραμματισμό των οργάνων Rotor-Gene Q, παρακαλείστε να ανατρέξετε στο εγχειρίδιο χρήσης του οργάνου. Στις απεικονίσεις, οι ρυθμίσεις αυτές πλαισιώνονται με έντονο μαύρο χρώμα. Περιλαμβάνονται απεικονίσεις για τα όργανα Rotor-Gene Q. Πίνακας 13. Επισκόπηση του προγράμματος θερμικού κυκλοποιητή για κυκλοποίηση δύο βημάτων Σύνδεση των ανιχνευτών: Αρχικό βήμα αποδιάταξης: PCR 1: Κυκλοποίηση 3 βημάτων: 15 λεπτά 54 C 2 λεπτά 95 C Αποδιάταξη 15 δευτερόλεπτα 94 C Ανασύνδεση 15 δευτερόλεπτα 60 C Επέκταση 15 δευτερόλεπτα 72 C Αριθμός κύκλων 10 PCR 2: Κυκλοποίηση 3 βημάτων: Αποδιάταξη 15 δευτερόλεπτα 94 C Σχόλια PCR υψηλής ειδικότητας Ανασύνδεση 15 δευτερόλεπτα 50 C Λήψη* Αποδιάταξη 15 δευτερόλεπτα 72 C Αριθμός κύκλων 23 Αποδιάταξη: 2 λεπτά 95 C Πρόγραμμα τήξης: C Λήψη * Κανάλια λήψης: Green, απολαβή 4 Red, απολαβή 1 FAM /ROX, απολαβή 8 και FAM/Cy5, απολαβή 10. Κανάλια λήψης: Green, Red, FAM/ROX, και FAM/Cy5. Χρησιμοποιήστε «Optimize gain before melt on all tubes» (βελτιστοποίηση της απολαβής πριν την τήξη σε όλα τα σωληνάρια). «The gain giving the highest fluorescence less than 95 will be selected» (θα επιλεγεί η απολαβή που δίνει τον υψηλότερο φθορισμό κάτω από 95). 22 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

23 14. Ανοίξτε καταρχήν το πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (οδηγός νέας εκτέλεσης) (εικόνα 2). Επιλέξτε το πλαίσιο «Locking Ring Attached» (προσαρτημένος δακτύλιος ασφάλισης) και κάντε κλικ στο «Next» (επόμενο). 1 2 Εικόνα 2. Το πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard». 15. Επιλέξτε 40 για τον όγκο αντίδρασης και κάντε κλικ στο «Next» (εικόνα 3). 1 2 Εικόνα 3. Ρύθμιση των γενικών παραμέτρων του προσδιορισμού. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

24 16. Κάντε κλικ στο κουμπί «Create New» (δημιουργία νέου) στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (εικόνα 4), και προγραμματίστε 2 πρόσθετα κανάλια, όπως φαίνεται στις εικόνες Εικόνα 4. Δημιουργία νέων καναλιών. 1 2 Εικόνα 5. Δημιουργία νέου καναλιού «FAM/ROX». 24 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

25 1 2 Εικόνα 6. Δημιουργία νέου καναλιού «FAM/Cy5». 1 2 Εικόνα 7. Συμπερίληψη νέων καναλιών. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

26 17. Επεξεργαστείτε την απολαβή για κάθε κανάλι όπως φαίνεται στην εικόνα 8. Οι τελικές ρυθμίσεις απολαβής για κάθε κανάλι υποδεικνύονται στην εικόνα 9. Οι ρυθμίσεις απολαβής για το όργανο Rotor-Gene Q επιλέγονται προκειμένου να αποφευχθεί ο κορεσμός στα κανάλια ανίχνευσης. Ωστόσο, εάν παρατηρηθεί κορεσμός σε οποιοδήποτε από τα κανάλια ανίχνευσης, οι ρυθμίσεις απολαβής για το συγκεκριμένο κορεσμένο κανάλι θα πρέπει να προσαρμοστούν και θα πρέπει να διενεργηθεί μια νέα ανάλυση καμπύλης τήξης. 1 2 Εικόνα 8. Επεξεργασία της απολαβής. Ως παράδειγμα, η εικόνα δείχνει τη ρύθμιση της απολαβής στο 4 για το κανάλι Cycling Green. 26 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

27 1 Εικόνα 9. Τελικές ρυθμίσεις απολαβής για όλα τα κανάλια. Τα κανάλια που απαιτούνται είναι: Green, απολαβή 4 Red, απολαβή 1 FAM/ROX, απολαβή 8 και FAM/Cy5, απολαβή Κάντε κλικ στο κουμπί «Edit Profile» (επεξεργασία προφίλ) στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου «New Run Wizard» (εικόνα 10) και προγραμματίστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως φαίνεται στις εικόνες 11 13). 1 Εικόνα 10. Επεξεργασία του προφίλ. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

28 1 2 Εικόνα 11. Σύνδεση των ανιχνευτών Εικόνα 12. Αρχικό βήμα αποδιάταξης Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

29 1 2 5a Εικόνα 13. Ενίσχυση των συνδεδεμένων ανιχνευτών a Εικόνα 14. Ενίσχυση των συνδεδεμένων ανιχνευτών συμπεριλαμβανομένης της λήψης σήματος στους 50 C. Τα κανάλια που απαιτούνται για τη λήψη φαίνονται στην εικόνα Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

30 1 2 Εικόνα 15. Απαιτείται επιλογή όλων των καναλιών για τη λήψη. 1 2 Εικόνα 16. Αποδιάταξη των προϊόντων PCR και ανιχνευτών Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

31 1 2 Εικόνα 17. Πρόγραμμα τήξης Εικόνα 18. Λήψη κατά τη διάρκεια του προγράμματος τήξης. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

32 Εικόνα 19. Περίληψη του προφίλ θερμοκρασίας. 19. Αποθηκεύστε τη μήτρα για χρήση σε μεταγενέστερο χρόνο (εικόνα 20). 1 1 Εικόνα 20. Φυλάξτε τη μήτρα για χρήση σε μεταγενέστερο χρόνο. 20. Αφήστε το μείγμα δύο βημάτων (από το βήμα 12) να εξισορροπήσει σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 C), και διανείμετε με πιπέτα 32,0 µl του μείγματος δύο βημάτων μέσα σε κάθε σωληνάριο ταινιών για το όργανο Rotor-Gene Q. 32 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

33 Σημείωση: Για κάθε δείγμα, διανείμετε με πιπέτα 32,0 µl μείγματος δύο βημάτων μέσα σε καθένα από 2 νέα σωληνάρια. 21. Διανείμετε με πιπέτα κάθε αντίδραση υβριδισμού (8 µl) στα σωληνάρια ταινιών που περιέχουν το μείγμα δύο βημάτων. Ο τελικός όγκος είναι 40 µl ανά δείγμα. Σημείωση: Διατηρήστε τις αντιδράσεις υβριδισμού στους 60 C μέχρι να προστεθούν στο μείγμα δύο βημάτων. 22. Κλείστε τα σωληνάρια ταινιών με τα κατάλληλα πώματα και τοποθετήστε τα αμέσως στο στροφέα του οργάνου Rotor-Gene Q. 23. Τοποθετήστε το στροφέα μέσα στο όργανο Rotor-Gene Q. Βεβαιωθείτε πως ο δακτύλιος ασφάλισης (προαιρετικό εξάρτημα του oργάνου Rotor-Gene Q) έχει τοποθετηθεί επάνω από το στροφέα για την αποτροπή του ακούσιου ανοίγματος των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης. 24. Εκκινήστε την εκτέλεση (εικόνα 21) χρησιμοποιώντας την αποθηκευμένη μήτρα (βήμα 19). 1 Εικόνα 21. Έναρξη της εκτέλεσης. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

34 Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Κανονικοποίηση Στα όργανα Rotor-Gene Q, τα ακατέργαστα δεδομένα για το κανάλι FAM/Cy5 πρέπει πρώτα να κανονικοποιηθούν για να αντισταθμιστεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των διαφορετικών καναλιών. Για την κανονικοποίηση των σημάτων Cy5, ανοίξτε το ακατέργαστο κανάλι Melt FAM/Cy5 (ρυθμίσεις φίλτρου nm). Κάντε κλικ στο κουμπί «Option» (επιλογή), και επιλέξτε «Normalise to Melt FAM/ROX» (κανονικοποίηση σε Melt FAM/ROX). Το νεοδημιουργηθέν αρχείο ακατέργαστων δεδομένων Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX πρέπει να κανονικοποιηθεί επιπροσθέτως για το κανάλι Red (ρυθμίσεις φίλτρου 625/660 nm). Αυτό γίνεται ανοίγοντας το νέο αρχείο ακατέργαστων δεδομένων Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX, κάνοντας κλικ στο κουμπί «Option» και επιλέγοντας «Normalise to Melt Red» (κανονικοποίηση σε Melt Red). Με αυτήν την κανονικοποίηση, διορθώνεται ο εξαρτώμενος από τη θερμοκρασία φθορισμός του Cy5, με αποτέλεσμα μια πιο συμμετρική κορυφή τήξης. Ανάλυση Για την ανάλυση του αρχείου ακατέργαστων δεδομένων, ανοίξτε το παράθυρο «Analysis» (ανάλυση) και επιλέξτε το κατάλληλο κανονικοποιημένο αρχείο ακατέργαστων δεδομένων για FAM/Cy5 στην καρτέλα «Melt» (τήξη). Τα σήματα στο κανάλι Green (IC) (ρυθμίσεις φίλτρου nm) και στο κανάλι FAM/ROX (ρυθμίσεις φίλτρου nm) δεν χρειάζεται να κανονικοποιηθούν τα αντίστοιχα αρχεία ακατέργαστων δεδομένων για τα κανάλια FAM/ROX και Green επιλέγονται επίσης. Οι διαφορετικές θερμοκρασίες τήξης των ανιχνευτών SMART υποδεικνύονται στον πίνακα 14, σελ. 35. Κατώφλι Χρησιμοποιώντας τη βελτιστοποίηση απολαβής στο λογισμικό Rotor-Gene Q στο πρόγραμμα τήξης της αντίδρασης δύο βημάτων όπως περιγράφεται στον πίνακα 13 (σελ. 22) και στην εικόνα 17 (σελ. 31), πρέπει να ρυθμιστούν οι ακόλουθες τιμές κατωφλίου στα διαγράμματα ανάλυσης καμπύλης τήξης για την ανάλυση των αποτελεσμάτων των δειγμάτων. Κανάλι FAM/ROX: Κατώφλι = 1 Κανάλι FAM/Cy5 (κανονικοποιημένο): Κατώφλι = 0 Κανάλι Green (IC): Αναστρέψτε το πρόσημο του df/dt, και επιλέξτε όλα τα δείγματα που δεν αποκάλυψαν θετική κορυφή τήξης στα κανάλια FAM/ROX και FAM/Cy5 και με τα δύο μείγματα. Ρυθμίστε το κατώφλι χειροκίνητα στο υψηλότερο επίπεδο φθορισμού στους 50 C που λαμβάνεται με αυτά τα αρνητικά δείγματα. Τα δείγματα τα οποία 34 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

35 αποκαλύπτουν κορυφές τήξης και με τα δύο μείγματα εντός του εύρους αποδοχής T m του εσωτερικού μάρτυρα (70,5 73,5 C) μπορούν τώρα να θεωρηθούν ως πραγματικά αρνητικά δείγματα. Τα δείγματα που αποκαλύπτουν μόνο ένα ή κανένα θετικό αποτέλεσμα εσωτερικού μάρτυρα πρέπει να θεωρηθούν ως μη έγκυρα. Τα μη έγκυρα δείγματα πρέπει να επανληφθούν. Πίνακας 14. Οι στόχοι και οι αντίστοιχες τιμές T m των ανιχνευτών SMART Επισήμανση Ανιχνευτής SMART Αποδεκτό εύρος T m ( C) Κωδικός παθογόνου (μείγμα 1) Cy5 ανιχνευτής 1 50,5 53,5 L. pneu OC43 Κωδικός παθογόνου (μείγμα 2) Cy5 ανιχνευτής 2 54,5 57,5 B. pert NL63 Cy5 Cy5 ανιχνευτής 3 60,0 63,0 Rhino/Entero 229E Cy5 ανιχνευτής 4 66,0 69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 ανιχνευτής 5 70,5 73,5 M. pneu Cy5 ανιχνευτής 6 76,5 79,5 H1N1 ROX BHQ1 ROX ανιχνευτής 1 ROX ανιχνευτής 2 ROX ανιχνευτής 3 ROX ανιχνευτής 4 ROX ανιχνευτής 5 ROX ανιχνευτής 6 BHQ1 ανιχνευτής 1 52,5 55,5 RSVA PIV1 57,5 60,5 Adeno PIV2 62,5 65,5 hmpv PIV3 66,5 69,5 RSVB PIV4 72,5 75,5 InfA Boca 76,5 79,5 InfB 70,5 73,5 IC IC * Σημείωση: Η ανίχνευση του Chlamydophila pneumoniae με το πάνελ RespiFinder RG προορίζεται μόνο για έρευνα. Δεν προορίζεται για διαγνωστικές διαδικασίες. Καμία αξίωση ή δήλωση δεν προορίζεται για να παρέχει πληροφορίες για τη διάγνωση, την πρόληψη ή τη θεραπεία νόσου. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

36 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αυτός ο οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων μπορεί να σας βοηθήσει στην επίλυση οποιωνδήποτε προβλημάτων που ενδεχομένως προκύψουν. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στη σελίδα Frequently Asked Questions (Συχνές ερωτήσεις) του Κέντρου τεχνικής υποστήριξης της εταιρείας μας: Οι επιστήμονες των Τεχνικών Υπηρεσιών QIAGEN είναι πάντοτε πρόθυμοι(-ες) να απαντήσουν σε οποιεσδήποτε απορίες σας σχετικά με τις πληροφορίες και τα πρωτόκολλα αυτού του εγχειριδίου ή τεχνολογίες δειγμάτων και προσδιορισμών (για πληροφορίες επικοινωνίας, βλ. οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε μας στη διεύθυνση 36 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

37 Σχόλια και προτάσεις Δεν υπάρχουν ορατές ειδικές κορυφές τήξης και η κορυφή τήξης IC δεν είναι ορατή α) Σφάλμα(τα) προγραμματισμού στο πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης β) Σφάλμα διανομής με πιπέτα ή ανύπαρκτο αντιδραστήριο γ) Δεν προστέθηκε IC ή ο IC προστέθηκε πριν προστεθεί το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης στο δείγμα δ) Αναστολείς της PCR είναι παρόντες στο δείγμα Προγραμματίστε το θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με την ενότητα «Πρωτόκολλο: Ενίσχυση PCR και ανάλυση τήξης», σελ. 17, και επαναλάβετε τον προσδιορισμό. Επαναλάβετε τον προσδιορισμό RespiFinder, σύμφωνα με την ενότητα «Πρωτόκολλο: Ενίσχυση PCR και ανάλυση τήξης», σελ. 17. Είναι σημαντικό να προστεθεί ο IC και ο φορέας RNA στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, κατά προτίμηση αφού προστεθεί στο δείγμα, ανεξάρτητα από το χρησιμοποιούμενο πρωτόκολλο εκχύλισης (βλ. «Χρήση εσωτερικού μάρτυρα και φορέα RNA», σελ. 15). Σε αντίθετη περίπτωση, ο IC θα μπορούσε να υποβαθμιστεί, λόγω νουκλεασών στο δείγμα. Επαναλάβετε την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων και τον προσδιορισμό RespiFinder. Επαναλάβετε τον προσδιορισμό χρησιμοποιώντας πενταπλάσια αραίωση του απομονωμένου RNA/DNA. Δεν υπάρχει ορατή κορυφή τήξης IC υπό την παρουσία ειδικών για το παθογόνο κορυφών τήξης Ισχυρή λοίμωξη και/ή πολλαπλή λοίμωξη Ο IC είχε ισχυρότερο ανταγωνισμό στον προσδιορισμό. Το αποτέλεσμα εξακολουθεί να είναι έγκυρο. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

38 Είναι ορατές ψευδείς κορυφές τήξης Διασταυρούμενη μόλυνση Σχόλια και προτάσεις Βεβαιωθείτε ότι τα βήμα της αντίδρασης εκτελούνται σε ξεχωριστούς χώρους προκειμένου να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση. Επαναλάβετε τον προσδιορισμο RespiFinder. Ελέγξτε το πρόγραμμα κυκλοποίησης και βεβαιωθείτε ότι όλα τα βήματα χειρισμού εκτελούνται όπως περιγράφεται στην ενότητα «Πρωτόκολλο: Ενίσχυση PCR και ανάλυση τήξης», σελ. 17. Διασφαλίστε ότι εργάζεστε σε πάγο όπου υποδεικνύεται στο πρωτόκολλο. Επαναλάβετε τον προσδιορισμο RespiFinder. Μπορούν να παρατηρηθούν αυξημένα σήματα φθορισμού υποβάθρου ενώ δεν έλαβε χώρα ειδική ενίσχυση στην αντίδραση δείγματος a) Ανασταλτικοί παράγοντες είναι παρόντες στο εγχύλισμα νουκλεϊκών οξέων δείγματος εμποδίζοντας την αποτελεσματική, ειδική ενίσχυση b) Απουσία εσωτερικού μάρτυρα στα αρνητικά δείγματα Αυξημένα σήματα υποβάθρου μπορεί να βρίσκονται πάνω από τις τιμές κατωφλίου του πάνελ RespiFinder RG, αλλά αναγνωρίζονται εύκολα ως μη ειδικές κορυφές τήξης. Ένα παράδειγμα αυξημένου υποβάθρου δίνεται στην εικόνα 22, σελ. 39. Αυξημένα σήματα υποβάθρου μπορεί να βρίσκονται πάνω από τις τιμές κατωφλίου του πάνελ RespiFinder RG, αλλά αναγνωρίζονται εύκολα ως μη ειδικές κορυφές τήξης. Επαναλάβετε τον προσδιορισμο RespiFinder. Ένα παράδειγμα αυξημένου υποβάθρου δίνεται στην εικόνα 22, σελ Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

39 Κανάλι FAM/ROX Μείγμα 1 Μείγμα 2 Πραγματικό θετικό Αρνητικός μάρτυρας Απουσία IC Απουσία IC Αρνητικός μάρτυρας Κανάλι FAM/Cy5 Μείγμα 1 Μείγμα 2 Απουσία IC Αρνητικός μάρτυρας Πραγματικό θετικό Αρνητικός μάρτυρας Απουσία IC Κανάλι Green (IC) Μείγμα 1 Μείγμα 2 Αρνητικός μάρτυρας Απουσία IC Απουσία IC Αρνητικός μάρτυρας Εικόνα 22. Παράδειγμα αυξημένου υποβάθρου. Αρνητικός μάρτυρας: Οι γραμμές αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα υποδεικνύοντας απουσία σημάτων τόσο στο κανάλι FAM/ROX όσο και στο FAM/Cy5, αλλά ειδική κορυφή εσωτερικού μάρτυρα στο κανάλι Green (IC). Πραγματικό θετικό: Οι υποδεικνυόμενες γραμμές για FAM/ROX μείγμα 1 και FAM/Cy5 μείγμα 2 αντιστοιχούν σε δείγματα που εμφανίζουν πραγματικές θετικές κορυφές τήξης. Απουσία IC: Οι γραμμές αντιστοιχούν σε ένα δείγμα στο οποίο δεν προστέθηκε εσωτερικός μάρτυρας. Για το δείγμα αυτό, δεν έλαβε χώρα ειδική ενίσχυση, με αποτέλεσμα αυξημένο φθορισμό υποβάθρου στο κανάλι FAM/ROX, το οποίο δείχνει ασαφείς κορυφές τήξης, αλλά επίπεδα φθορισμού πάνω από την τιμή κατωφλίου. Ποιοτικός έλεγχος Το πάνελ RespiFinder RG παράγεται από την PathoFinder BV στο Μάαστριχτ, Ολλανδία, στα πλαίσια συστημάτων ποιότητας πιστοποιημένα κατά ISO13485:2003 και EN ISO 13485:2012. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

40 Περιορισμοί Το πάνελ RespiFinder RG βοηθά στη διάγνωση λοιμώξεων του αναπνευστικού, όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. Αρνητικά αποτελέσματα δεν υποδεικνύουν απαραιτήτως απουσία ιογενούς ή βακτηριακής λοίμωξης του αναπνευστικού. Τα αρνητικά αποτελέσματα δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ως η μόνη βάση για τη διάγνωση, τη θεραπεία ή άλλες θεραπευτικές επιλογές. Θετικά αποτελέσματα δεν αποκλείουν συνυπάρχουσα λοίμωξη με άλλα παθογόνα. Το(α) ανιχνευόμενο(α) παθογόνο(α) ενδέχεται να μην αποτελεί(ούν) την οριστική αιτία της νόσου. Στην τελική διάγνωση, πρέπει να περιλαμβάνονται άλλες εργαστηριακές εξετάσεις και αξιολόγηση της κλινικής παρουσίασης. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης τεκμηριώθηκαν με επικυρωμένα πάνελ EQA από τον QCMD. Το προϊόν προορίζεται για χρήση μόνο από επαγγελματίες εργαστηρίων. Η ανίχνευση του Chlamydophila pneumoniae με το πάνελ RespiFinder RG προορίζεται μόνο για έρευνα. Δεν προορίζεται για χρήση σε διαγνωστικές διαδικασίες. Καμία αξίωση ή δήλωση δεν προορίζεται για να παρέχει πληροφορίες για τη διάγνωση, την πρόληψη ή τη θεραπεία νόσου. Χαρακτηριστικά απόδοσης Ανατρέξτε στη διεύθυνση για τα χαρακτηριστικά απόδοσης του πάνελ RepliFinder RG. Βιβλιογραφία Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη, ενημερωμένη online βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιεύσεων στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν προϊόντα της QIAGEN. Με τις εύχρηστες δυνατότητες αναζήτησης μπορείτε να βρείτε τα άρθρα που αναζητάτε είτε με απλή αναζήτηση λέξης-κλειδιού ή ορίζοντας την εφαρμογή, τον ερευνητικό τομέα, τον τίτλο κτλ. Για έναν κατάλογο της βιβλιογραφίας, επισκεφθείτε την online βιβλιογραφική βάση δεδομένων της QIAGEN (Reference Database) στη διεύθυνση ή επικοινωνήστε με τις τεχνικές υπηρεσίες της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. Σύμβολα Τα ακόλουθα σύμβολα μπορεί να εμφανίζονται στη συσκευασία και στην επισήμανση: <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <Ν> αντιδράσεις 40 Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

41 Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολoγικό προϊόν Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Περιορισμός θερμοκρασίας Κατασκευαστής Συμβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης Προσοχή Πληροφορίες επικοινωνίας Για θέματα τεχνικής υποστήριξης και περαιτέρω πληροφορίες, επισκεφθείτε το Κέντρο Τεχνικής Υποστήριξης στη διεύθυνση καλέστε ή επικοινωνήστε με κάποιο από το τμήματα τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN ή με τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλ. οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε τη διεύθυνση Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

42 Πληροφορίες παραγγελίας Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. καταλ. RespiFinder RG Panel (25) CE Για 25 αντιδράσεις: Κύριο μείγμα προενίσχυσης, εσωτερικός μάρτυρας, μείγμα εκκινητών προενίσχυσης, μείγματα ανιχνευτών, ένζυμο λιγκάσης, Taq πολυμεράση, και ρυθμιστικά διαλύματα QIAamp MinElute Virus Spin Kit για ταυτόχρονο καθαρισμό ιικού DNA και RNA από ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα για χρήση με το πάνελ RespiFinder RG QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Για 50 μίνι προετοιμασίες: 50 στήλες QIAamp MinElute, πρωτεάση QIAGEN, φορέας RNA, ρυθμιστικά διαλύματα, σωληνάρια συλλογής (2 ml) Rotor-Gene Q MDx για επικυρωμένη για IVD ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου σε κλινικές εφαρμογές Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής τήξης (Melt) υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, μπορντώ) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και την εργασία, δεν περιλαμβάνει εγκατάσταση και κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής τήξης υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, μπορντώ) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα, περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και την εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/2013

43 Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. καταλ. Rotor-Gene Q για κορυφαία απόδοση στην PCR πραγματικού χρόνου Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Παρελκόμενα του Rotor-Gene Q Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2.500) Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής τήξης υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, μπορντώ) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και την εργασία, δεν περιλαμβάνει εγκατάσταση και κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής τήξης υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, μπορντώ) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα, περιλαμβάνει εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και την εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση 250 ταινίες των 4 σωληναρίων και πωμάτων για αντιδράσεις των µl 10 x 250 ταινίες των 4 σωληναρίων και πωμάτων για αντιδράσεις των µl Για τις τρέχουσες πληροφορίες άδειας και αποποιήσεις σχετικά με συγκεκριμένα προϊόντα, ανατρέξτε στο σχετικό εγχειρίδιο ή οδηγίες χρήσης του κιτ QIAGEN. Οι οδηγίες ή τα εγχειρίδια χρήσης των κιτ QIAGEN είναι διαθέσιμα στο ή μπορούν να ζητηθούν από τις τεχνικές υπηρεσίες της QIAGEN ή από τον τοπικό σας διανομέα. Εγχειρίδιο πάνελ RespiFinder RG 11/

44

45 Εμπορικά σήματα: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene (Όμιλος QIAGEN Group) BHQ (Biosearch Technologies, Inc.) Cy (GE Healthcare) FAM, GeneAmp, ROX (Life Technologies Corporation) RespiFinder (PathoFinder BV). Άδεια περιορισμένης χρήσης για το πάνελ RespiFinder RG Η χρήση αυτού του προϊόντος ισοδυναμεί με την αποδοχή από πλευράς οποιουδήποτε αγοραστή ή χρήστη του προϊόντος των εξής όρων: 1. Το προϊόν επιτρέπεται να χρησιμοποιείται μόνο σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται με το προϊόν και αυτό το εγχειρίδιο και για χρήση με τα συστατικά που περιέχονται στο πάνελ μόνο. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του πάνελ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό το πάνελ, εκτός και αν περιγράφεται διαφορετικά στα πρωτόκολλα που παρέχονται με το προϊόν, αυτό το εγχειρίδιο και πρόσθετα πρωτόκολλα που είναι διαθέσιμα στη διεύθυνση Ορισμένα από αυτά τα πρωτόκολλα έχουν παρασχεθεί από χρήστες της QIAGEN για χρήστες της QIAGEN. Αυτά τα πρωτόκολλα δεν έχουν ελεγχθεί διεξοδικά ή βελτιστοποιηθεί από την QIAGEN. Η QIAGEN δεν εγγυάται γι' αυτά, και δεν παρέχει καμία εγγύηση πως δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 2. Με την εξαίρεση των ρητά αναφερόμενων αδειών, η QIAGEN δεν παρέχει καμία εγγύηση πως αυτό το πάνελ και/ή η χρήση(-εις) του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το πάνελ και τα συστατικά του φέρουν άδεια χρήσης για μία μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επανάχρηση, η εκ νέου επεξεργασία ή η μεταπώλησή του. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά οποιεσδήποτε άλλες άδειες, ρητές ή έμμεσες εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής ή ο χρήστης του πάνελ συμφωνεί να μην προβεί και να μην επιτρέψει σε κανέναν άλλο να προβεί σε οποιεσδήποτε ενέργειες που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ή να διευκολύνουν οποιεσδήποτε πράξεις που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και θα αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δαπανών υπεράσπισης στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή αυτής της Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε των πνευματικών δικαιωμάτων της σχετικά με το πάνελ και/ή τα συστατικά του. Για τους ενημερωμένους όρους της άδειας, βλ. Σημείωση για τον αγοραστή Αυτό το προϊόν είναι ένα προϊόν RespiFinder που παράγεται από την PathoFinder BV στο Μάαστριχτ, Ολλανδία, στα πλαίσια συστημάτων ποιότητας πιστοποιημένα κατά ISO13485:2003. Αυτά τα προϊόντα πωλούνται για χρήση από τον τελικό χρήστη και δεν επιτρέπεται η μεταπώληση, διανομή ή επανασυσκευασία τους QIAGEN,με την επιφύλαξη κάθε δικαιώματος.

46 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK EL Sample & Assay Technologies