ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΧΗΜΙΚΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΛΕΥΧΑΙΜΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΜΕ ΜΟΥΣΤΑΡΔΕΣ ΑΖΩΤΟΥ

Transcript

1 ΕΛΕΝΗ ΗΜΑ Β Ι Ο Λ Ο Γ Ο Σ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΧΗΜΙΚΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΛΕΥΧΑΙΜΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΜΕ ΜΟΥΣΤΑΡΔΕΣ ΑΖΩΤΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Π Α Τ Ρ Α

2 ΕΛΕΝΗ ΗΜΑ Β Ι Ο Λ Ο Γ Ο Σ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΧΗΜΙΚΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΛΕΥΧΑΙΜΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΜΕ ΜΟΥΣΤΑΡΔΕΣ ΑΖΩΤΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ Ε Ξ Ε Τ Α Σ Τ Ι Κ Η Ε Π Ι Τ Ρ Ο Π Η ΑΝ ΡΕΑΣ ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΪΡΑΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΣΩΤΗΡΗΣ ΝΙΚΟΛΑΡΟΠΟΥΛΟΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ 2

3 Aφιερώνεται στους γονείς μου και στους δασκάλους μου 3

4 Π Ρ Ο Λ Ο Γ Ο Σ Η εργασία που ακολουθεί εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Πειραματικής Χημειοθεραπείας του Θεαγένιου Αντικαρκινικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης υπό τη ιεύθυνση του κ. Αθανάσιου Παπαγεωργίου και στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας και Γενετικής του Τμήματος Ιατρικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης υπό τη διεύθυνση του Καθηγητή κ. ιονύση Μουρελάτου, τους οποίους και ευχαριστώ. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον Επίκουρο Καθηγητή Φαρμακευτικής Χημείας κ. Σωτήρη Νικολαρόπουλο για την υπόδειξη του θέματος, την καθοδήγησή του κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της εργασίας και τις υποδείξεις του κατά τη συγγραφή της. Επίσης ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακολογίας κ. Ανδρέα Παπαπετρόπουλο για την ουσιαστική συμπαράσταση που μου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια της ερευνητικής αυτής εργασίας και τον Επίκουρο Καθηγητή Φαρμακευτικής Χημείας κ. Γεώργιο Πάϊρα για τις ουσιαστικές υποδείξεις και τη συνεχή καθοδήγηση του σε όλα τα στάδια της εκπόνησης και συγγραφής της μελέτης αυτής. Θερμά ευχαριστώ το Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, που μου έδωσε τη δυνατότητα και την ευκαιρία να υλοποιήσω την παρούσα εργασία. Τέλος ευχαριστώ την οικογένειά μου για την ουσιαστική συμπαράσταση που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια, καθώς χωρίς αυτή η υλοποίηση της παρούσας εργασίας δεν θα ήταν δυνατή. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ Ιστορική αναδρομή 8 Καρκίνος-Καρκινικό κύτταρο 9 Βλάβες στο γενετικό υλικό 9 Φάσεις του κυτταρικού κύκλου 12 ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Γενικά περί αλκυλιωτικών παραγόντων 14 ιλειτουργικοί αλκυλιωτικοί παράγοντες 17 Μηχανισμός δράσης αλκυλιωτικών παραγόντων 19 Αντίσταση των αντικαρκινικών φαρμάκων 20 Αναγκαιότητα εξειδίκευσης της δράσης των μουσταρδών αζώτου 22 Mόρια-φορείς αλκυλιωτικών παραγόντων 23 ΣΤΕΡΟΕΙ ΙΚΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΜΕΤΑ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Γενικά περί στεροειδών ορμονών 27 Μηχανισμός δράσης στεροειδών ορμονών 27 Εισαγωγή των στεροειδών ως βιολογικών εξεδρών 30 Σταθεροί δεσμοί μεταξύ στεροειδούς-αλκυλιωτικού παράγοντα 31 Εύκολα υδρολυόμενοι δεσμοί μεταξύ στεροειδούς και 32 αλκυλιωτικού παράγοντα Εισαγωγή ομο-αζωτούχων στεροειδών ως βιολογικών εξεδρών 34 στη θεραπεία του καρκίνου ΧΡΩΜΑΤΙ ΙΑΚΕΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΕΣ Ορισμός-Ιστορία 37 Αυτόματες και προκλητές SCEs 38 Πλεονεκτήματα της μεθόδου 39 Μειονεκτήματα της μεθόδου 40 Εφαρμογές της μεθόδου των χρωματιδιακών ανταλλαγών 40 Κυτταρογενετικές βλάβες από αλκυλιωτικούς παράγοντες 41 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΙΜΟΙ ΟΓΚΟΙ Γενικά 42 5

6 Ανάπτυξη-χαρακτηριστικά πειραματικών μεταμοσχεύσιμων όγκων 43 Λεμφοκυτταρική λευχαιμία Ρ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γενικά 47 Σκοπός της παρούσας μελέτης 48 ΣΥΝΘΕΣΗ ΜΟΥΣΤΑΡ ΩΝ ΑΖΩΤΟΥ Σύνθεση ενδιάμεσων και τελικών προϊόντων 49 Σύνθεση των τροποποιημένων αζωτούχων στεροειδών αλκοολών 51 ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΕΛΙΚΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙ ΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ Γενικά 64 Σύνθεση τoυ μικτού ανυδρίτη του καρβοξυλικού οξέος του Μe- CABA Αντίδραση του μικτού ανυδρίτη του καρβοξυλικού οξέος μετά του 2,4,6-τριχλωροβενζοϊκού οξέος με τις στεροειδείς αλκοόλες ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΧΗΜΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Aντιδραστήρια-Όργανα 74 Μέθοδοι σύνθεσης των αρωματικών μουσταρδών αζώτου 75 Μέθοδοι σύνθεσης των τροποποιημένων αζωτούχων στεροειδών 76 Γενική μέθοδος παρασκευής των τελικών στεροειδικών εστέρων 87 μουσταρδών αζώτου ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ Κυτταρογενετικά πειράματα 89 In vivo πειράματα 92 Αποτέλεσματα κυτταρογενετικά 93 Μελέτες τοξικότητας 98 ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤA 100 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 108 6

7 7 Γ Ε Ν Ι Κ Ο Μ Ε Ρ Ο Σ

8 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 1 Εισαγωγή Ο καρκίνος σήμερα αποτελεί μία από τις πρώτες αιτίες θανάτου στις αναπτυγμένες χώρες μαζί με τα καρδιοαγγειακά νοσήματα. Ενώ όμως έχει γίνει μεγάλη πρόοδος στην πρόληψη και στη θεραπεία των καρδιοαγγειακών νοσημάτων στην περίπτωση του καρκίνου δεν συνέβη το ίδιο. Οι γνώσεις για τον καρκίνο ολοένα αυξάνονται όμως παρά τις προσπάθειες των ερευνητών, οι θεραπείες που εφαρμόζονται στους ασθενείς δεν είναι αποτελεσματικές και συχνά οι ασθενείς καταλήγουν ή επιζούν για να καταλήξουν μερικά χρόνια αργότερα από δευτερογενείς νεοπλασίες 1,2. Οι κύριοι λόγοι για τους οποίους συμβαίνουν αυτό είναι η ανικανότητα των φαρμάκων να δρουν επιλεκτικά, οι μεταστάσεις, η ετερογένεια της νόσου, η ανθεκτικότητα στα φάρμακα και άλλοι. Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις που ακολουθούνται είναι η χειρουργική αφαίρεση του όγκου, η χημειοθεραπεία και οι ακτινοβολίες. Μια σημαντική μείωση της θνησιμότητας έχει επέλθει τα τελευταία χρόνια στους καρκίνους που η έγκαιρη διάγνωση και η χειρουργική επέμβαση του όγκου είναι δυνατή, όπως στην περίπτωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Έτσι στην πραγματικότητα η αποτελεσματική θεραπεία αφορά περισσότερο στην ακρίβεια των διαγνωστικών εξετάσεων, όπως είναι το τεστ Παπανικολάου, η μαστογραφία, η ανίχνευση καρκινικών δεικτών (PSA) παρά στη λειτουργικότητα των φαρμάκων. 1. Ιστορική Αναδρομή Την ύπαρξη του καρκίνου ως ανθρώπινη νόσο μαρτυρούν ιερογλυφικά κείμενα των Αιγυπτίων καθώς και αυτοψίες που έγιναν σε μούμιες που έπασχαν από καρκίνο των οστών. Στην περίοδο του Ιπποκράτη (4 ος π.χ. αιώνας) αρκετοί τύποι καρκίνου ήταν γνωστοί, ευδιάκριτοι και αναγνωρίσιμοι. Υποστηρίζεται ότι πρώτος ο Ιπποκράτης επινόησε τον όρο καρκίνωμα για να δηλώσει την ύπαρξη μιας μάζας ιστού που διασπείρεται στον οργανισμό και επιφέρει το θάνατο. Τα βήματα του Ιπποκράτη ακολούθησε ο Γαληνός που προσπάθησε να εμβαθύνει περισσότερο στους όγκους ως ιστούς που έχουν ξεπεράσει τη φύσης τους, υπονοώντας ότι οι όγκοι προέρχονται από εκτροπές ανάπτυξης και λειτουργίας των φυσιολογικών ιστών. Σήμερα είναι γνωστό ότι ο καρκίνος μπορεί να αναπτυχθεί σε όλους σχεδόν τους πολυκύτταρους οργανισμούς και ιδιαίτερα στα θηλαστικά και στον άνθρωπο. Το ποσοστό, η γεωγραφική κατανομή και η παθοφυσιολογία κάθε νεοπλάσματος σχετίζεται με διάφορους παράγοντες όπως η ηλικία, το φύλο, η φυλή, διατροφή, γενετικές 8

9 ανωμαλίες και περιβάλλον κ.ά. Ιδιαίτερα το περιβάλλον ασκεί ουσιαστική επίδραση και συμβάλλει στην καρκινογένεση Γενικά περί καρκίνου Με τον όρο καρκίνο εννοούμε μία γενετική ασθένεια που προκύπτει από αλλαγές σε συγκεκριμένα γονίδια. εν είναι όμως τις περισσότερες φορές μια κληρονομική ασθένεια, διότι στις κληρονομούμενες ασθένειες η γενετική αλλαγή υπάρχει στα χρωμοσώματα των γεννητικών κυττάρων και συνεπώς μεταβιβάζεται στους απογόνους. Αντίθετα οι γενετικές αλλαγές, που οδηγούν στους περισσότερους καρκίνους, προέρχονται από αλλαγές στο DA στα σωματικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της ζωής του ατόμου. Εξαιτίας των γενετικών αλλαγών τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα. Αρχικά συγκροτούν μία μάζα και αργότερα ένα συμπαγή όγκο ή νεόπλασμα που αυξάνεται απεριόριστα. Οι όγκοι ταξινομούνται σύμφωνα με τον ιστό και τον κυτταρικό τύπο από τον οποίο προέρχονται. Οι καρκίνοι του επιθηλίου καλούνται καρκινώματα, του συνδετικού ιστού σαρκώματα και του αίματος λευχαιμίες και λεμφώματα. Κάθε μία από τις κατηγορίες υποδιαιρείται σύμφωνα με τον κυτταρικό τύπο από τον οποίο προέρχεται, τη θέση στο σώμα και τη δομή του όγκου. Σχεδόν το 90% των καρκίνων του ανθρώπου είναι καρκινώματα. Σε αυτά περιλαμβάνονται οι καρκίνοι του δέρματος, του παχέως εντέρου, των πνευμόνων, του στήθους και του προστάτη. Η προτίμηση αυτή ίσως να σχετίζεται με την ικανότητα των επιθηλιακών κυττάρων να πολλαπλασιάζονται με μεγαλύτερη συχνότητα από τα άλλα κύτταρα και να έρχονται σε επαφή με τα διάφορα φυσικά και χημικά καρκινογόνα περισσότερο από τα κύτταρα των άλλων ιστών Βλάβες στο γενετικό υλικό Η σταθερότητα των γενετικών πληροφοριών, οι οποίες είναι κωδικοποιημένες και αποθηκευμένες στο DA αποτελεί την απαραίτητη προϋπόθεση για την ύπαρξη και συνέχιση της ζωής των οργανισμών και οφείλεται στη πιστότητα του αντιγραφικού μηχανισμού και τη συνεχή ακεραιότητα της διπλής έλικας του μορίου του DA. Το τελικό προϊόν της αντιγραφής είναι ένα πιστό αντίγραφο του μορίου με ελάχιστα αντιγραφικά λάθη. Όμως το γενετικό υλικό δεν είναι άτρωτο άλλα ευαίσθητο και επειδή δέχεται καθημερινά ποικίλλες ενδογενείς και εξωγενείς βλαπτικές επιδράσεις 5 εμφανίζει βλάβες. Προς απάντηση των βλαβών κινητοποιούνται είτε ενζυμικοί επιδιορθωτικοί μηχανισμοί που ελέγχουν και επιδιορθώνουν τις βλάβες, είτε ενζυμικοί μηχανισμοί που τις παρακάμπτουν μειώνοντας έτσι τις συνέπειες τους. Ελαττωματικό 9

10 σύστημα επιδιόρθωσης οδηγεί σε δημιουργία καρκίνου, αναπτυξιακές ανωμαλίες και πρόωρη γήρανση Πρόκληση και ταξινόμηση βλαβών στο DA Οι βλάβες φαινοτυπικά είναι δυνατόν να εμφανιστούν: 1. ως χρωμοσωμικές ατυπίες 2. ως χρωματιδιακές ανταλλαγές 3. ως θάνατος του κυττάρου Οι κυριότερες βλάβες περιλαμβάνουν: 1. αλλοίωση του ζεύγους των βάσεων του DA 2. έλλειψη βάσης 3. χημική προσθήκη (adduct) στην έλικα με την ενσωμάτωση ογκώδους μορίου 4. σχηματισμός διμερών μεταξύ δύο γειτονικών βάσεων πχ. πυριμιδίνης 5. σχηματισμός χιαστών δεσμών (crosslinks) α) ως εσωτερικών (μεταξύ βάσεων των δύο αλυσίδων) β) ως εξωτερικών (μεταξύ βάσεων της ίδιας αλυσίδας) γ) ως σύνδεση του DA με πρωτεΐνες. 6. Θραύσεις μονόκλωνες ή δίκλωνες από κλαστογόνους παράγοντες. Σημαντική θεωρείται η με προσθήκη βάσεων παρεμβολή (intercalation) στην αλληλουχία των βάσεων, η οποία προκαλεί μετατόπιση του πλαισίου μεταγραφής (frame shift mutation). Τέτοιες μεταλλάξεις αλλάζουν το μεταφραστικό πλαίσιο του mra, μεταβάλλοντας ολόκληρη την αλληλουχία αμινοξέων από το σημείο της μετάλλαξης και μετά (όταν η προσθήκη ή η απάλειψη νουκλεοτιδίων δεν είναι ακριβές πολλαπλάσιο του τρία σε περιοχή κωδικοποίησης του DA. Ο Cleaver το αποδεχόμενος ότι κάθε παράγοντας προκαλεί διαφορετικού τύπου βλάβες, πρότεινε την ακόλουθη κατάταξη των αρχικών βλαβών, που προκαλούνται από την επίδραση διαφόρων παραγόντων. 1. ιμερή πυριμιδίνης υπεριώδης ακτινοβολία 2. Αλκυλίωση αλκυλιωτικοί παράγοντες 3. Αποπουρινοποίηση αλκυλιωτικοί παράγοντες 4. Λάθος ενσωμάτωση βάσεων BrdU, νιτρικό οξύ 5. Θραύση αλυσίδων ιονίζουσα ακτινοβολία, αλκυλιωτικοί παράγοντες 6. Χιαστές συνδέσεις (δεσμοί) αλκυλιωτικοί παράγοντες διπλής δράσης (bifunctional) 7. Παρεμβολή βάσεων πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες, ακριδίνη 8. Αναστολή επιδιόρθωσης του DA καφεΐνη, θεοφυλλίνη, 3-αμινοβενζαμίδ 10

11 3.2 Μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DA Στα προκαρυωτικά αλλά και στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα, υπάρχουν τέσσερις κύριοι μηχανισμοί επιδιόρθωσης των βλαβών του DA : 1. φωτοεπιδιόρθωση 2. επιδιόρθωση S..S 3. επιδιόρθωση με εκτομή 4. μετααντιγραφική επιδιόρθωση Η επιδιόρθωση S..S ενεργοποιείται σε βακτήρια όταν βαριάς μορφής βλάβες του DA κυρίως από την επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας, χρειάζονται επειγόντως επιδιόρθωση. Ο μηχανισμός δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί ακριβώς, ωστόσο γνωρίζουμε ότι στο σημείο του DA που υπάρχει τοποθετημένη λανθασμένη βάση ή δεν υπάρχει καθόλου βάση, μία ειδική DA πολυμεράση εισάγει τυχαία μία οποιαδήποτε βάση. Ο μηχανισμός αυτός δεν είναι καθόλου ακριβής και θεωρείται ίσως η σημαντικότερη πηγή μεταλλάξεων στα κύτταρα μετά από επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας. 3.3 Ρίχνοντας ματιές προς το μέλλον Τις τελευταίες δεκαετίες οι προσπάθειες για την ανεύρεση νέων αντικαρκινικών φαρμάκων συνεχίζονται εντατικά ωστόσο τα νέα γενιάς φάρμακα δεν εμφανίζουν βελτίωση όσον αφορά στις παρενέργειες τους, με την μείωση των λευκών αιμοσφαιρίων και την καταστροφή φυσιολογικού ιστού παράλληλα με τον καρκινικό να είναι ανάμεσα στις πιο σημαντικές. Για αυτούς τους λόγους είναι σημαντικό να μελετήσουμε τους παράγοντες που επιδρούν στη φαρμακοκινητική και στη φαρμακοδυναμική των φαρμάκων. Ανάμεσα σε αυτούς είναι και οι γενετικοί πολυμορφισμοί (SPs) στο επίπεδο των ενζύμων που μεταβολίζουν τους αντικαρκινικούς παράγοντες. Για ένα μικρό ποσοστό γενετικών πολυμορφισμών έχει προσδιοριστεί η σχέση τους με την πρακτική ογκολογία 8,9. Οι γενετικοί παράγοντες θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα και την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων. Ο όρος "φαρμακογονιδιωματική" χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά τη δεκαετία του 1950, καθώς έγινε προφανές ότι ο παράγοντας της κληρονομικότητας έπαιζε σημαντικό ρόλο στη διαθεσιμότητα και στις επιπτώσεις των φαρμάκων και των άλλων ξενοβιοτικών. 10 H επιστήμη της φαρμακογονιδιωματικής εστιάζει στην πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας και της τοξικότητας της θεραπείας που βασίζεται στο γενετικό προφίλ του ασθενούς το οποίο μπορεί να εξεταστεί με απλά γενετικά τεστ ρουτίνας 11. Ο απώτερος στόχος είναι να επιλέγεται για τον κάθε ασθενή η 11

12 κατάλληλη θεραπευτική αντιμετώπιση. Θεωρείται ότι οι συνδυασμοί αρκετών πολυμορφισμών σε γονίδια που εμπλέκονται στο ίδιο μονοπάτι είναι υπεύθυνες για το θεραπευτικό αποτέλσμα, από ότι τα SPs στο επίπεδο ενός μόνο γονιδίου Φάσεις του κυτταρικού κύκλου Για την κατανόηση των βασικών μηχανισμών δράσης των αντινεοπλασματικών φαρμάκων και την ευαισθησία των νεοπλασμάτων απαιτείται κατανόηση του κυτταρικού κύκλου αφού αυτός έχει άμεση σχέση με την ταχύτητα αναπαραγωγής του νεοπλάσματος και το βαθμό διαφοροποίησης του. Ο κυτταρικός κύκλος διαιρείται σε 4 φάσεις που ονομάζονται G1, S, G2 και M. Στη φάση G1 τα κύτταρα αναπτύσσονται. Κύτταρα που δε πολλαπλασιάζονται, αλλά έχουν το δυναμικό αναπαραγωγής μετά από διέγερση, εισέρχονται σε μία άλλη φάση G0 (φάση ηρεμίας) από την οποία μπορούν να εξέλθουν σε μια δεδομένη στιγμή κάτω από τη διέγερση με μιτογόνους παράγοντες (όπως η ουσία φυτοαιματογλουτινίνη 13 και να διαγράψουν τον κυτταρικό κύκλο. Κατά τη φάση S συμβαίνει ο διπλασιασμός του γενετικού υλικού, κατόπιν στη φάση G2, παράγονται πρωτεΐνες και συμπληρώνονται οι προετοιμασίες για την φάση Μ. Στη φάση Μ το μητρικό κύτταρο διαιρείται και δίνει δύο θυγατρικά κύτταρα. Στα καρκινικά κύτταρα η G0 φάση είναι χρονικά μικρή και τα κύτταρα οδηγούνται μετά από αυτή με μεγάλη ταχύτητα στη φάση S. Έτσι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού του καρκινικού κυττάρου είναι υψηλός με αποτέλεσμα την ταχύτατη ανάπτυξη κακοήθους όγκου. Σχήμα 1 Φάσεις του κυτταρικού κύκλο 12

13 Το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου ποικίλλει ανάμεσα στα νεοπλάσματα και καθορίζει την ευαισθησία τους στα χημειοθεραπευτικά. Το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση S είναι μεγαλύτερο σε όγκους που αναπτύσσονται γρήγορα όπως οι λευχαιμίες από ότι σε εκείνα τα νεοπλάσματα που αναπτύσσονται σχετικά αργά όπως οι συμπαγείς όγκοι. Ο μηχανισμός δράσης των περισσότερων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων δε βασίζεται στην άμεση καταστροφή των νεοπλασμάτων αλλά στην παρεμπόδιση της κυτταρικής διαίρεσης. Έτσι δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη ή στερούνται επιλεκτικής δράσης με αποτέλεσμα να προκαλούν ποικίλλες παρενέργειες. Τα φάρμακα είναι κυτταροτοξικά και επιφέρουν το θάνατο κυρίως σε ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όπως τα καρκινικά και τα Τ-λεμφοκύτταρα παρεμβαίνοντας κυρίως στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Στα αντινεοπλασματικά φάρμακα ανήκουν φάρμακα που διαφέρουν κατά πολύ τόσο στη δομή, όσο και στις φυσικοχημικές ιδιότητες και στους μηχανισμούς δράσης. Ορισμένα από αυτά δρουν εκλεκτικά σε συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου, ενώ άλλα δρουν ανεξάρτητα της φάσης του κυτταρικού κύκλου. Στα αντινεοπλασματικά ανήκουν α) αλκυλιωτικοί παράγοντες, β) αντιμεταβολίτες, γ) αντιμιτωτικά δ) αναστολείς των τοποϊσομερασών ε) αντιβιοτικά αντινεοπλασματικής δράσης στ) μακρομοριακοί παράγοντες (ιντερφερόνες, νεκρωτικοί παράγοντες των όγκων), ζ) ορμόνες κά. 13

14 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 2 1. ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Οι μουστάρδες αζώτου αποτελούν τα πρώτα αλκυλιωτικά φάρμακα. Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς εδώ και δεκαετίες. Η μουστάρδα του θείου συντέθηκε για πρώτη φορά το 1854 και μέχρι το 1919 είχαν αναφερθεί πολλές από τις επικίνδυνες επιπτώσεις της στον ανθρώπινο οργανισμό. Το Σεπτέμβριο του 1917, κατά τη διάρκεια του Α` Παγκόσμιου πολέμου χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από το γερμανικό στρατό το αέριο της μουστάρδας. Το όνομα της ουσίας ήταν β-χλωροαιθυλ-σουλφίδιο (b-chloroethyl sulphide), όμως πήρε το όνομα της από τη χαρακτηριστική μυρωδιά της- αέριο της μουστάρδας. Επειδή χρησιμοποιήθηκε πρώτα στην περιοχή Υπέρ στο Βέλγιο, έγινε επίσης γνωστή ως υπερίτης 14. Ήταν το πιο θανατηφόρο από όλα τα δηλητηριώδη αέρια που είχαν χρησιμοποιηθεί μέχρι τότε. Το αέριο της μουστάρδας προκαλούσε εξωτερική και εσωτερική αιμορραγία, χτυπούσε τους βρογχικούς αγωγούς και όπως φάνηκε αργότερα προκαλούσε χρόνιες μολύνσεις και προβλήματα. Tη δεκαετία του 1930 γίνονταν εντατικές έρευνες για να βρεθούν καινούρια, πιο τοξικά αέρια προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στο Β παγκόσμιο πόλεμο που επρόκειτο να ξεκινήσει παρά την απαγόρευση από τη συνθήκη της Γενεύης 15. Έτσι, με πρότυπο τη μουστάρδα θείου δημιουργήθηκε μια νέα τάξη ουσιών στην οποία το θείο έχει αντικατασταθεί από άζωτο. Τα καινούρια αέρια δεν χρησιμοποιήθηκαν στο Β` Παγκόσμιο πόλεμο, ωστόσο η πρόσβαση σε υλικό που να σχετίζεται με τους μουστάρδες του αζώτου δεν ήταν εύκολη για μεγάλο χρονικό διάστημα. Υπήρχαν ωστόσο πληροφορίες από μελέτες, που υποστήριζαν ότι τα αέρια της μουστάρδας του αζώτου όπως και τα αέρια της μουστάρδας του θείου είναι ικανά να προκαλέσουν θραύση των χρωμοσωμάτων και να επέμβουν έτσι στη διαδικασία της μίτωσης 16,17,18,19,20. Στα αρχικά στάδια, όλες οι ερευνητικές προσπάθειες διεξήχθησαν από μυστικούς περιορισμούς οι οποίοι επιβάλλονταν από τη χρήση απόρρητων πολεμικών χημικών ενώσεων. Μετά τη λήξη όμως του εύτερου Παγκοσμίου Πολέμου, οι μουστάρδες του αζώτου έπαψαν να είναι κρατικό μυστικό, και η αξιολόγηση όλων των πειραματικών αποτελεσμάτων οδήγησε στην αρχή της χρησιμοποίησης της μουστάρδας αζώτου ως αντικαρκινικό, χημειοθεραπευτικό παράγοντα 21. Ήταν μία από τις λίγες φορές που η έρευνα για ένα θανατηφόρο όπλο πήρε στροφή και οδηγήθηκε στην έρευνα για την καταπολέμηση του θανάτου, του καρκίνου. 14

15 Από τότε μέχρι σήμερα, έχουν συντεθεί χιλιάδες ανάλογα της βασικής χημικής δομής των μουσταρδών αζώτου αλλά από αυτά λίγα έχουν αποδειχτεί αποτελεσματικότερα της πρωταρχικής σε εξειδικευμένες κλινικές καταστάσεις. Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται σήμερα στη χημειοθεραπεία νεοπλασματικών νοσημάτων κατατάσσονται σε 5 κατηγορίες 22 οι οποίες είναι : Mουστάρδες του αζώτου Αιθυλενιμίνες και μεθυλενιμίνες Σουλφονικοί αιθυλεστέρες Νιτροζουρίες Τριαζένια Πίνακας 1 Όνομα του φαρμάκου Παρενέργειες και χρόνια τοξικότητα Ενδείξεις μυελοκαταστολή, Busulphan θρομβοκυτταροπενία, μεταλλαξιγένεση, χρόνια λευχαιμία, μυελογενής καρκινογένεση καρκίνος των ωοθηκών, Carboplatin ναυτία, έμετοι, μικροκυτταρικός καρκίνος (CBDCA/ CBP) Carmustine (BCU) Chlorambucil (CLB) μυελοκαταστολή ναυτία, έμετοι, καταστροφή των νεφρών, καρκινογένεση Ναυτία, μυελοκαταστολή, αμηνόρροια, στειρότητα, μεταλλαξιγένεση, καρκινογένεση του πνεύμονα, καρκίνος των όρχεων Μυέλωμα, λέμφωμα, καρκίνος του εγκεφάλου, νόσος του Ηodgkin s Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, κακοήθες λέμφωμα, νόσος του Ηodgkin s, καρκίνος των ωοθηκών ναυτία, έμετοι, Cisplatin νεφροτοξικότητα, μυελοτοξικότητα, περιφερειακή νευροπάθεια, μεταλλαξιγένεση, καρκινογένεση Συμπαγείς όγκοι, καρκίνος των ωοθηκών, νεοπλάσματα των όρχεων, κακοήθες μελάνωμα 15

16 Cyclophosphamide (CPA) Εstramustine Ifosfamide (IF) Lomustine (CCU) Mechlorethamine (H2) Melphalan (L-PAM) Mitomycin Procarbazine Thiotepa ναυτία, έμετοι, μυελοκαταστολή, αλωπεκία, καρκινογένεση ναυτία, έμετοι, φλεβίτιδα, γυναικομαστία, καρδιοαγγειακές δυσλειτουργίες ναυτία, έμετοι, oυροτοξικότητα, αλωπεκία, μυελοκαταστολή Ναυτία, έμετοι, αλωπεκία, στοματίτιδα, τοξικότητα του ήπατος, καρκινογένεση ναυτία, έμετοι, μυελοκαταστολή, καρκινογένεση Ναυτία, μυελοκαταστολή, καρκινογένεση ναυτία, έμετοι, νεφροτοξικότητα, τοξικότητα στην καρδιά και στους πνεύμονες, καρκινογένεση ναυτία, έμετοι, μυελοκαταστολή, καρκινογένεση ναυτία, έμετοι, πόνος, αμηνόρροια, μυελοκαταστολή, καρκινογένεση Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, νόσος του Ηodgkin s, συμπαγείς όγκοι, Καρκίνος του προστάτη Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, λέμφωμα, συμπαγείς όγκοι νόσος του Ηodgkin s, καρκίνοι του εγκεφάλου νόσος του Ηodgkin s, λευχαιμίες Μυελωμάτωση, συμπαγείς όγκοι, λεμφώματα, καρκίνος των ωοθηκών Αδενοκαρκίνωμα του στομάχου και του παγκρέατος, καρκίνος του στήθους νόσος του Ηodgkin s, νόσος μη Ηodgkin s, κακοήθες μελάνωμα Καρκίνος της ουροδόχου κύστης, καρκίνος του στήθους Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες είναι γνωστό ότι προκαλούν μία σωρεία προβλημάτων στους ζωντανούς οργανισμούς όπως μεταλλάξεις, καρκινογένεση, κυτταρικό θάνατο, χρωμοσωμικές βλάβες, αναστολή βιοσυνθετικών μονοπατιών, προβλήματα στον κυτταρικό κύκλο και τερατογένεση. 16

17 Ο αλκυλιωτικοί παράγοντες αν και ανομοιογενείς ως προς τη χημική τους δομή, ωστόσο έχουν όλοι την ικανότητα να προσφέρουν αλκυλιωτικές ομάδες σε βιολογικώς σημαντικά μακρομόρια όπως DA, RA και πρωτεΐνες. Έχουν την ικανότητα να προσδένονται σε αλληλουχίες πλούσιες σε GC στην μεγάλη αύλακα του DA δημιουργώντας μια σειρά από προσθήματα, με τις χιαστές συνδέσεις που προκαλούν να είναι οι πλέον κυτταροτοξικές. Ωστόσο έχουν σχετικά μικρή συγγένεια σύνδεσης και εμφανίζουν μικρή επιλεκτικότητα για μεγάλες αλληλουχίες DA, πέραν του ότι υδρολύονται γρήγορα (πριν φτάσουν στον στόχο τους και τον αλκυλιώσουν) και αυτό μειώνει την αποτελεσματικότητά τους 23. Η φύση και η κατανομή των βλαβών που προκαλούνται από τους αλκυλιωτικούς παράγοντες εξαρτάται τελικά από ένα πλήθος παραγόντων όπως τα χημικά χαρακτηριστικά του παράγοντα, η φαρμακολογία του κυττάρου-ιστού, η περιοχή του DA που αλληλεπιδρούν κ.ά. Οι στόχοι προσβολής των αλκυλιωτικών παραγόντων είναι όλα τα άτομα του οξυγόνου 24 και του αζώτου των βάσεων του DA και των φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ των βάσεων καθώς και των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το DA 25. Τα σχετικά ποσοστά των προϊόντων αλκυλίωσης εξαρτώνται από τη χημική φύση των αλκυλιωτικών ενώσεων, ενώ οι συχνότερα απαντώμενες θέσεις βλάβης των βάσεων του DA είναι το Ν 7 και το Ο 6 της γουανίνης και η θέση 3 της αδενίνης. Οι αλκυλιώσεις των βάσεων είναι τόσο γονοτοξικές όσο και κυτταροτοξικές. Γενικά οι αλκυλιώσεις στο άτομο του οξυγόνου (Ο 6 -αλκυλοg και Ο 4 -αλκυλοg) είναι σε μεγάλο βαθμό μεταλλαξιγόνες και γονοτοξικές, ενώ οι αλκυλιώσεις στο άτομο του αζώτου (3- αλκυλοα και 1-αλκυλοΑ) είναι κυτταροτοξικές αλλά πολύ λιγότερο μεταλλαξιγόνες 26,27,28. H πιο συχνά απαντώμενη θέση προσβολής, τόσο στο DA, όσο και στο RA είναι το Ν 7 της γουανίνης, το οποίο θεωρείται σχετικά ακίνδυνο από μόνο του. Εν τούτοις υπόκειται σε γρήγορη και αυθόρμητη αποπουρίνωση και ενζυματική απομάκρυνση και έτσι προκύπτουν κυτταροτοξικές αβασικές θέσεις 25. Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες που δρουν με τον S -1 μηχανισμό (όπως το MU) αλκυλιώνουν τόσο άτομα οξυγόνου όσο και άτομα αζώτου στα νουκλεϊκά οξέα, ενώ οι αλκυλιωτικοί παράγοντες που δρουν με τον S -2 μηχανισμό (όπως το ΜΜS) κυρίως αλκυλιώνουν τα άτομα του αζώτου ΙΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΙ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Οι πιο αποτελεσματικοί αλκυλιωτικοί παράγοντες είναι οι διλειτουργικοί oι οποίοι έχουν την ικανότητα να προσδένονται στο DA μέσω χιαστού τύπου δεσμών (crosslinking). Οι δεσμοί αυτοί μπορούν να σχηματιστούν είτε μεταξύ νουκλεοτιδίων της μιας αλυσίδας της διπλής έλικας, είτε μεταξύ νουκλεοτιδίων που βρίσκονται σε 17

18 διαφορετική αλυσίδα, ή ακόμη μεταξύ μορίων του DA και πρωτεϊνών. 30,31,32 H δυνατότητα επιδιόρθωσης χιαστού τύπου δεσμών είναι μικρότερη σε σχέση με τη μονοϋποκατάσταση (mοnoadduct) με αποτέλεσμα οι ενώσεις αυτές να είναι πιο κυτταροτοξικές 33,34,35. Ο Ηopkins και οι συνεργάτες του περιέγραψαν το ένα γενικό μηχανισμό για την αλληλεπίδραση ενός διλειτουργικού αλκυλιωτικού παράγοντα με το DA, το οποίο πραγματοποιείται μέσω σχηματισμού ενός μη ομοιοπολικού δεσμού που μετά καταλήγει στη δημιουργία ενός ομοιοπολικά συνδεδεμένου προσθήματος. Το πρόσθημα αυτό μπορεί: 1) Να αντιδράσει με ένα εξωτερικό πυρηνόφιλο μόριο όπως μια πρωτεΐνη 2) Να αντιδράσει με μια βάση στο ίδιο το μόριο του DA και να δώσει χιαστή σύνδεση στην ίδια αλυσίδα (intrastrand crosslinking) 3) α αντιδράσει με μια βάση στην αντίθετη αλυσίδα του DA και να δώσει χιαστή σύνδεση μεταξύ των δύο αλυσίδων (interstrand crosslinking). Οι διλειτουργικοί αλκυλιωτικοί παράγοντες εμφανίζουν κυρίως κυτταροτοξική δράση σε αντίθεση με τους μονολειτουργικούς οι οποίοι έχουν μεγαλύτερη μεταλλαξιγόνο και καρκινογόνο δράση. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι οι βιοχημικές δράσεις των διλειτουργικών ενώσεων, όπως ο σχηματισμός χιαστού τύπου δεσμών, αποτελούν πολύ μεγαλύτερη απειλή για την κυτταρική επιβίωση σε σχέση με άλλες δράσεις, όπως η αλκυλίωση μίας μόνο βάσης και η επακόλουθη αποπουρίνωση και θραύση των αλυσίδων. Από την άλλη μεριά, οι τελευταίες αυτές δράσεις μπορεί να προκαλέσουν μόνιμες βλάβες στη δομή και στην αλληλουχία του DA συμβατές με την επιβίωση του κυττάρου και μεταβιβάσιμες στις επόμενες γενεές. Τέτοιου είδους αλλαγές είναι δυνατό να προκαλέσουν μεταλλαξιγόνο δράση ή καρκινογένεση. Τα κύτταρα μπορούν να επιδιορθώσουν τις βλάβες και να αποκαταστήσουν τη δομή του DA μέσω μηχανισμών επιδιόρθωσης. Αν και δεν έχουν αποσαφηνιστεί τα πάντα σχετικά με τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης, εντούτοις όλοι βασίζονται σε κάποιες γενικές αρχές, οι οποίες είναι η αναγνώριση της περιοχής που έχει υποστεί βλάβη από μία ή πολλές πρωτεΐνες που καταφτάνουν στην περιοχή του DA και κατόπιν η απομάκρυνση (αποκοπή) της κατεστραμένης περιοχής που πραγματοποιείται με μία σειρά ενζυμικών αντιδράσεων. Μετά από αυτό το στάδιο η DA πολυμεράση συνθέτει το σωστό τμήμα DA και η DA λιγάση ενώνει τα τμήματα του DA μεταξύ τους και δημιουργείται ένας ολόκληρος κλώνος 37. Στην Ε.coli όπως και στα ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχουν 4 τουλάχιστον διαφορετικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση των πρωτογενών βλαβών στο DA που προκαλούνται από απλούς μονολειτουργικούς παράγοντες. Αυτές περιλαμβάνουν : α) την απευθείας επιδιόρθωση της βάσης είτε με 18

19 μεθυλοτρανσφεράσες 6, είτε με οξειδωτικές απομεθυλάσες 38,39,40 β) την εκτομή βάσης μέσω DA γλυκοζυλασών 41 (BER), γ) επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου 42,43 (ER) και δ) επιδιόρθωση με ανασυνδυασμό, κυρίως για επιδιόρθωση δευτερογενών βλαβών όπως θραύση αλυσίδων 42. Αρκετοί τύποι παραγόντων πρωτογενούς αλκυλίωσης, όπως Ο 6 -χλωροαιθυλg, καθώς και δευτερογενείς βλάβες όπως χιαστί δεσμοί στο DA, παράνομα ζεύγη (mismatches), θραύση αλυσίδων και χιαστί δεσμοί μεταξύ DA και πρωτεϊνών συμβαίνουν μετά από έκθεση σε διλειτουργικούς αλκυλιωτικούς παράγοντες 44. ι βλάβες που προκαλούν οι διλειτουργικοί αλκυλιωτικοί παράγοντες είναι περίπλοκες και απαιτούν περίπλοκους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς 25. Τα χλωροαιθυλο- παράγωγα όπως το Ο 6 -G (που είναι μία από τις κυριότερες βλάβες που προκαλούνται στο DA αν και σε μικρό ποσοστό) επιδιορθώνονται με ειδικά πρωτεΐνες, τις ΑGT. ι Ο 6 -άλκυλοτρανσφεράσες είναι υψηλά συντηρημένα μόρια, από τα βακτήρια 45 μέχρι τα θηλαστικά 46. Η παρουσία των μορίων αυτών καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά στη βιολογική δράση των αλκυλιωτικών φαρμάκων και για αυτό χρησιμοποιούνται πλέον στην κλινική πράξη ουσίες όπως η Ο 6 -βενζυλοg 47 και το PaTrin-2 48 σε συνδυασμό με άλλες (όπως το temozolomide και το ΒCU), οι οποίες αδρανοποιούν τις ΑGT προκειμένου τα κύτταρα να ευαισθητοποιούν απέναντι στα αλκυλιωτικά,. Αντίθετα οι χιαστί τύπου δεσμού (ICLs) λόγω της δομικής τους πολυπλοκότητας αναγνωρίζονται από μια ποικιλία επιδιορθωτικών μηχανισμών 49,50,51, ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΡΑΣΗΣ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Ο μηχανισμός δράσης των αλκυλιωτικών παραγόντων είναι αρκετά γνωστός. Ο μηχανισμός συνεπάγεται κυκλοποίηση του μορίου και σχηματισμό του αιθυλενοιμωνίου το οποίο μέσω σχηματισμού του καρβανιόντος προκαλεί αλκυλίωση σε νουκλεόφιλα κέντρα των περισσοτέρων βιολογικών μορίων-ωστόσο, η χημειοθεραπευτική και κυτταροτοξική τους δράση σχετίζεται άμεσα με την αλκυλίωση του DA. Επιπλέον αλκυλίωση παρατηρείται και στις φωσφορικές ομάδες των αλυσίδων του DA και στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με το DA. Πρέπει να σημειωθεί ότι ένα μικρό ποσοστό των αλκυλιωτικών παραγόντων αλκυλιώνει το μόριο του DA, το μεγαλύτερο ποσοστό προσδένεται σε νουκλεόφιλες περιοχές άλλων βιολογικών μορίων. 19

20 Σχήμα 2 Μηχανισμός δράσης αλκυλιωτικών παραγόντων 4. ΑΝΤΙΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Η ανθεκτικότητα στα φάρμακα είναι ο πιο σημαντικός ανασταλτικός παράγοντας στη θεραπεία κατά του καρκίνου 53. Η εμφάνιση ενός ανθεκτικού φαινότυπου είναι τυχαία και δεν εξαρτάται από το επιλεγμένο φάρμακο. Η αντίσταση μπορεί να εμφανίζεται σε συγκεκριμένα αντικαρκινικά φάρμακα και τότε αποκαλείται μεμονωμένη αντίσταση στα φάρμακα 54. Τις περισσότερες φορές ωστόσο τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αντίσταση σε διαφορετικά φάρμακα που μπορεί να έχουν την ίδια ή διαφορετική δομή και αυτό αποκαλείται πλειοτροπική αντίσταση 55 (multidrug resistance). Σήμερα είναι γνωστό πως ο ανθεκτικός φαινότυπος είναι πολυπαραγοντικός, δηλαδή απαιτείται η ταυτόχρονη παρουσία δύο τουλάχιστον μηχανισμών αντίστασης στο ίδιο καρκινικό κύτταρο 56. Η αντίσταση στα φάρμακα επιτυγχάνεται μέσω ενός μικρού αριθμού μηχανισμών. Συγκρίνοντας τους μηχανισμούς αντίστασης σε βακτήρια, έντομα, φυτά 20

21 αλλά και στον άνθρωπο, αποκαλύφθηκαν αρκετές ομοιότητες καθώς και ότι ορισμένες οικογένειες πρωτεϊνών είναι υπεύθυνες για την ανθεκτικότητα σε διάφορα φάρμακα σε διαφορετικούς οργανισμούς. Οι μηχανισμοί αντίστασης σχετίζονται με: 1. μειωμένη πρόσβαση του φαρμάκου στο κύτταρο Για να είναι αποτελεσματικό ένα φάρμακο πρέπει να φτάνει σε όλα τα καρκινικά κύτταρα και να έχει μια ορισμένη συγκέντρωση. Ωστόσο στους συμπαγείς όγκους η διακίνηση των φαρμάκων μέσω των αγγείων είναι περιορισμένη 57. Ορισμένα κύτταρα που δεν βρίσκονται πλησίον των αγγείων εκτίθενται σε μικρές συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Ακόμη, έχει βρεθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται μέσα σε ένα μικροπεριβάλλον που έχει περιορισμένο οξυγόνο και θρεπτικά 58 και κατά συνέπεια στον περιβάλλοντα χώρο του καρκινικού κυττάρου επικρατούν διαφορετικές συνθήκες πού με τη σειρά τους επηρεάζουν την ενεργότητα κάποιων αντικαρκινικών φαρμάκων μειωμένη εισροή του φαρμάκου στο κύτταρο ή /και αυξημένη εκροή από αυτό 60,61 Υπάρχουν πάρα πολλοί τύποι μεμβρανικών μεταφορέων που συμβάλλουν στην αντίσταση στα φάρμακα. Πολύ σημαντική είναι μία ομάδα από πρωτεΐνες-μεταφορείς που ανήκουν σε μία υπεροικογένεια μεμβρανικών μεταφερουσών πρωτεϊνών, τις ABC (ATP-binding cassette proteins). Σημαντικές για τον άνθρωπο είναι οι Ρ- γλυκοπρωτεΐνες, οι ΜRP1-7 και η ΒCRP που σχετίζεται με τον καρκίνο του στήθους. Στα κύτταρα που εμφανίζουν ανθεκτικότητα υπάρχει υπερέκφραση αυτών των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Αυτές ως πρωτεΐνες-μεταφορείς ελέγχουν την είσοδο του φαρμάκου και ακολούθως και την συσσώρευση του στο εσωτερικό του κυττάρου. Γίνονται προσπάθειες από την επιστήμη της φαρμακευτικής και ήδη χρησιμοποιούνται στην πράξη- να βρεθούν αναστολείς για τις διαδικασίες της μεταφοράς έτσι ώστε να αρθεί η ανθεκτικότητα των κυττάρων 62. Νέες μελέτες ωστόσο αποδεικνύουν ότι σημαντικό ρόλο στην απόκτηση του ανθεκτικού φαινοτύπου παίζουν και άλλοι μεμβρανικοί υποδοχείς είτε με μια άμεση σχέση μεταξύ του μεταφορέα και του υποστρώματος ή με έμμεσους μηχανισμούς όπως είναι η ρύθμιση της απόπτωσης και ηλεκτροχημική βαθμίδωση μειωμένη αλληλεπίδραση του φαρμάκου με το στόχο του 4. αυξημένη αποτοξικοποίηση Ο μεταβολισμός και η επακόλουθη αδρανοποίηση των φαρμάκων οφείλεται σε ένζυμα με κυριότερα τα ένζυμα του κυτοχρώματος Ρ Η ομάδα αυτή των ενζύμων έχει βρεθεί ότι υπάρχει σχεδόν σε όλα τα είδη που έχουν μελετηθεί, όπως βακτήρια, μύκητες, έντομα, φυτά, αμφίβια και θηλαστικά. Τα κυτοχρώματα Ρ450 μπορούν να καταλύσουν χιλιάδες διαφορετικές αντιδράσεις για αυτό και παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της βιομετατροπής πολλών φαρμάκων και άλλων 21

22 ξενοβιοτικών 65,66. Τα τελευταία χρόνια μάλιστα μελετώνται οι γενετικοί πολυμορφισμοί που παρουσιάζει, και η σχέση που υπάρχει ανάμεσα σε αυτούς και το μεταβολισμό των αντικαρκινικών φαρμάκων αλλαγές στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του DA Έχει βρεθεί σε μια πληθώρα όγκων απώλεια της ικανότητας επιδιόρθωσης των κυττάρων, μέσω του μηχανισμού MMR (mismatch repair) κάτι που συνδέεται με ανικανότητα του κυττάρου να ανιχνεύσει βλάβες στο DA και να ενεργοποιήσει αποπτωτικούς μηχανισμούς 68. Ελαττωματικά γονίδια του συστήματος MMR ειδικά τα hmlh1 και το hμsh2 εμφανίζονται συχνά σε συγκεκριμένες μορφές καρκίνου που εμφανίζουν οικογενή πρότυπα όπως του μη πολυποειδούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Πειραματικά δεδομένα εμπλέκουν το ελαττωματικό MMR με ανθεκτικότητα σε ευρύ φάσμα παραγόντων συμπεριλαμβανομένου και των αναλόγων της πλατίνας. Η ανθεκτικότητα στο cisplatin συχνά συνδέεται με υπερμεθυλίωση του υποκινητή του hmlh1 69, αλλαγές στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου 7. αλλαγές στην απόπτωση 71,72,73,74 Είναι σημαντικό να τονίσουμε ότι όλοι οι προαναφερθέντες μηχανισμοί δε δρουν ανεξάρτητα αλλά συνδυαστικά. Για παράδειγμα έχει βρεθεί ότι οι ανθεκτικοί φαινότυποι έχουν πιο όξινο ρη στο εσωτερικό του κυττάρου και πιο βασικό στο εσωτερικό των οργανιδίων (σύστημα Golgi, ενδοσώματα, λυοσώματα). Η μεγάλη διαφορά στην τιμή του ρη οδηγεί στη δέσμευση και στην συσσώρευση του φαρμάκου στο εσωτερικό των οργανιδίων που ακολουθείται από τη μεταφορά τους στην κυτταρική επιφάνεια και τελικά απομάκρυνση τους από το κύτταρο 75. Αυτό ουσιαστικά σημαίνει ότι ο αλκυλιωτικός παράγοντας δεν φτάνει στο στόχο του. Aκόμη έχει βρεθεί ότι το όξινο ενδοκυττάριο περιβάλλον ενδέχεται να επαυξάνει το φαινόμενο της απόπτωσης 76, ΑΝΑΓΚΑΙΟΤΗΤΑ ΕΞΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΜΟΥΣΤΑΡ ΩΝ ΑΖΩΤΟΥ Ένα κοινό μειονέκτημα όλων των αλκυλιωτικών παραγόντων αποτελεί η υψηλή χημική τους δραστικότητα γεγονός το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια ενός ποσοστού του ενεργού φαρμάκου μέσω της αντίδρασής του με νουκλεόφιλα κέντρα του κυττάρου, όπως το νερό, οι πρωτεΐνες και οι χαμηλού μοριακού βάρους θειόλες 78. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν αντοχή στους αλκυλιωτικούς μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών που απενεργοποιούν το φάρμακο. Άμεση συνέπεια των παραπάνω είναι να φτάνει μόνο ένα μικρό ποσοστό στον πυρήνα του κυττάρου. Σημαντικό επίσης, μειονέκτημα των μουσταρδών αζώτου είναι η μη εκλεκτική δράση 22

23 τους έναντι των καρκινικών κυττάρων σε σχέση με τα φυσιολογικά. ρουν αδιάκριτα έναντι κάθε έντονα πολλαπλασιαζόμενου κυτταρικού πληθυσμού. Αποτέλεσμα αυτού είναι η εμφάνιση τοξικών παρενεργειών 79,80,81,82, από το αιμοποιητικό σύστημα (ερυθροκυτταροπενία, θρομβοκυτταροπενία, λευκοκυτταροπενία) που μπορεί να καταλήξουν σε έντονη αιμορραγική διάθεση και καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος των ασθενών, ενώ συνήθως συνοδεύονται από αλωπεκία, ναυτία, εμετό, διάρροια και βλεννογονίτιδα. Η αναγκαιότητα εξειδίκευσης της δράσης των μουσταρδών αζώτου και ταυτόχρονα ο περιορισμός των κυτταροτοξικών τους παρενεργειών συνεχίζει να έλκει το ερευνητικό ενδιαφέρον των επιστημόνων προκειμένου να βελτιστοποιηθούν τα θεραπευτικά αποτελέσματα κατά την κλινική εφαρμογή τους. Προς την κατεύθυνση αυτή, σχεδιάζονται και μελετώνται νέα ανάλογα των συγκεκριμένων ενώσεων, με στόχο την ανακάλυψη νέων δραστικότερων και αποτελεσματικότερων θεραπευτικών παραγόντων. Μια από τις βασικές ερευνητικές προσπάθειες προς την κατεύθυνση αυτή περιλαμβάνει τη σύνθεση αναλόγων 83,84,85,86,87,88 στα οποία ο αλκυλιωτικός παράγοντας προσδένεται χημικά σε κάποιο μόριο φορέα, αποδίδοντας μια μορφή προφαρμάκου στο οποίο συνδυάζονται οι ιδιότητες των δύο συστατικών του με στόχο τη βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου, τη μείωση της τοξικότητας, αλλά κυρίως την αύξηση της δράσης αυτού. Τα μόρια-φορείς των κυτταροτοξικών παραγόντων, γενικότερα, μπορούν να διαχωριστούν σε πολλές κατηγορίες ανάλογα με τον καρκινικό τύπο που αναγνωρίζουν και εδώ περιλαμβάνονται μεταξύ άλλων μονοκλωνικά αντισώματα, πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, το φολικό οξύ, το υαλουρονικό οξύ, και ολιγοπεπτίδια ΜΟΡΙΑ-ΦΟΡΕΙΣ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Οι ερευνητικές προσπάθειες για τη χρησιμοποίηση μορίων ως φορέων των αλκυλιωτικών παραγόντων και κατά συνέπεια την παρασκευή προφαρμάκων τους, έχουν ξεκινήσει λίγο μετά την εισαγωγή των μουσταρδών αζώτου στη θεραπευτική. ύο προσεγγίσεις έχουν ακολουθηθεί κυρίως: Α) Εισαγωγή αλκυλιωτικών ιδιοτήτων σε μόρια που έχουν την ικανότητα να συγκεντρώνονται εκλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα ή να στοχεύουν εκλεκτικά το DA Εκμεταλλευόμενοι την ιδιότητα των ανθελονοσιακών φαρμάκων Chloroquine και Quinacrine (παράγωγα της κινολίνης και της ακριδίνης αντίστοιχα) να συναθροίζονται στον πυρήνα των κυττάρων 90 ο Jones και οι συνεργάτες του 91 συνέθεσαν το 1958 τα παράγωγα μουσταρδών αζώτου των ενώσεων αυτών. Τα παράγωγα αυτά παρουσίασαν δράση σε μερικούς ασκητικούς όγκους σε ποντίκια και σε αρκετές λευχαιμίες σε τρωκτικά, χωρίς όμως τα αποτελέσματα των 23

24 βιολογικών μελετών να είναι ικανοποιητικά. Παρόλα αυτά σε μεταγενέστερες μελέτες μερικά νέα παράγωγα της ακριδίνης έδωσαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα καθώς προσδιορίστηκε ότι δρουν μέσω παρεμβολής (DA intercalation) σε συγκεκριμένες αλληλουχίες του DA 83,92,93,94 με αποτέλεσμα να ελαχιστοποιούνται οι παρακείμενες αντιδράσεις των μουσταρδών αζώτου με άλλα νουκλεόφιλα κέντρα του κυττάρου. Προς αυτή την κατεύθυνση έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί μόρια φορείς μουσταρδών αζώτου τα οποία στοχεύουν στη μικρή αύλακα του DA 95,96,97. Οι ενώσεις αυτές (DA minor groove alkylating agents) αποτελούν μια σχετικά νέα κατηγορία αντικαρκινικών παραγόντων, οι οποίες έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν αυξημένη κυτταροτοξική δραστικότητα σε in vitro 98,99 αλλά και σε in vivo προκλινικές μελέτες 100,101,102. Το αυξανόμενο ενδιαφέρον για την κατηγορία αυτή των ενώσεων σχετίζεται με την ικανότητα τους να αλληλεπιδρούν αντιστρεπτά με εκτεταμένες αλληλουχίες του DA με συγκεκριμένη αλληλουχία 103 και εδώ περιλαμβάνει ενώσεις όπως τα δισβενζιμιδαζόλια, τα ολιγοπυρρόλια και τα ολιγοϊμιδαζόλια, τα πολυβενζαμίδια και τις ανιλινοκινολίνες 78,104 Τα τελευταία χρόνια έχει επίσης μελετηθεί με ικανοποιητικά αρχικά αποτελέσματα, η εισαγωγή αλκυλιωτικών ιδιοτήτων σε προφάρμακα τα οποία μπορούν να ενεργοποιηθούν εκλεκτικά σε καρκινικούς ιστούς ενζυματικώς 87,105,106,107,108. Η προσέγγιση αυτή αποτελεί μέρος μιας νέας στρατηγικής κατά την οποία το θεραπευτικό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται μέσω στόχευσης του καρκίνου από ένζυμα που έχουν την ικανότητα να μετατρέπουν το προφάρμακο στην ενεργή μορφή του (directed enzyme-prodrug therapy, DEPT). Τα ένζυμα αυτά είναι δυνατό να βρίσκονται πάνω σε μονοκλωμικά αντισώματα 109 (antibody-directed enzyme-prodrug therapy, ΑDEPT) ή ακόμα να προστεθούν γονίδια που κωδικοποιούν αυτά τα ένζυμα στα καρκινικά αλλά και στα φυσιολογικά κύτταρα 110 (gene-directed enzyme-prodrug therapy, GDEPT) Προς αυτή την κατεύθυνση έχουν χρησιμοποιηθεί μουστάρδες αζώτου όπως η κυκλοφωσφαμίδη, δινιτροβενζάμιδο μουστάρδες αζώτου, μουστάρδες της ανιλίνης και της φαινόλης κ.α. B) Εισαγωγή αλκυλιωτικών ιδιοτήτων σε μόρια τα οποία έχουν ικανότητα ενεργητικής μεταφοράς Βάσει του σκεπτικού ότι, αφενός μεν ο ακλυλιωτικός παράγοντας πρέπει να διαπεράσει την κυτταρική όσο και την πυρηνική μεμβράνη πριν λάβει χώρα οποιαδήποτε βιολογικώς σημαντική αντίδραση, εφ ετέρου δε ότι οποιαδήποτε μοριακά χαρακτηριστικά τα οποία υποβοηθούν αυτή τη διαδικασία ενισχύουν τη δραστικότητα, συνετέθησαν διάφορα παράγωγα στα οποία οι αλκυλιωτικές ομάδες είναι χημικά συνδεδεμένες σε μόρια φορείς γνωστά και ως βιολογικές εξέδρες. Τα παράγωγα αυτά έχουν αποδειχθεί από τους πλέον αποτελεσματικούς αναστολείς της ανάπτυξης 24

25 νεοπλασμάτων. Ως βιολογικές εξέδρες έχουν χρησιμοποιηθεί αμινοξέα, υδατάνθρακες, ετεροκυκλικές βάσεις και στεροειδή. ΑΜΙΝΟΞΕΑ Η πιο χαρακτηριστική ένωση αυτής της κατηγορίας που συνδυάζει στο μόριο της μια ομάδα μουστάρδας αζώτου και ένα φυσικώς απαντώμενο αμινοξύ συνετέθη το 1953 από τους Bergel και Stock 111 και είναι το L-ισομερές της π-ν,ν-δις(2- χλωροαιθυλ)-αμινοφαινυλαλανίνης (Melphalan) το οποίο όταν χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε δόση 1mg/kg προκάλεσε πλήρη αναστολή του καρκινοσαρκώματος Walker σε ποντίκια. Αργότερα η ένωση αυτή εισήχθη σε κλινική εφαρμογή και σήμερα αποτελεί κύριο χημειοθεραπευτικό φάρμακο κατά του πολλαπλού μυελώματος 112, ενώ ενδοφλεβίως έχει δράση κατά διαφόρων στερεών όγκων και χορηγείται 113,114, σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα, σε μεταμοσχεύσεις μυελού των οστών και σε περιστατικά καρκίνων μαστού και ωοθηκών. Υ ΑΤΑΝΘΡΑΚΕΣ Το 1957 ο Vargha και οι συνεργάτες του 115,116 δημοσίευσαν παραδείγματα ενώσεων που συνδύαζαν στο μόριο τους ένα σάκχαρο και κάποια αλκυλιωτική ομάδα. Η πιο δραστική ένωση αυτών ήταν ένα παράγωγο της μαννιτόλης (mannomustine, Degranol), το οποίο αποδείχτηκε κλινικά δραστικό 117. Στη συνέχεια συνετέθησαν πολλά αλκυλιωτικά παράγωγα της γλυκόζης και της D-ριβόζης τα οποία έδειξαν σημαντική δράση κατά της λευχαιμίας L Η Streptozocin (SC ) μια ένωση που συνδυάζει στο μόριό της τον πυρήνα της D-ριβόζης και την αλκυλιωτική ιδιότητα ενός παραγώγου της νιτροζουρίας θεωρείται επίσης σήμερα ουσία με χρησιμότητα στη θεραπευτική. ΕΤΕΡΟΚΥΚΛΙΚΕΣ ΒΑΣΕΙΣ Ένας μεγάλος αριθμός ετεροκυκλικών μορίων τα οποία συσχετίζονται με δομές οι οποίες απαντώνται φυσικώς στον οργανισμό έχουν χρησιμοποιηθεί ως φορείς της ομάδας της Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλ)αμίνης. Παραδείγματα αυτής της κατηγορίας των ενώσεων είναι οι δακτύλιοι της πυριδίνης, της πυριμιδίνης και το βενζιμιδαζόλιο. Χαρακτηριστική ένωση της κατηγορίας αυτής με κλινική δράση είναι η μουστάρδα της ουρακίλης (Uracil mustard, SC-34462) 119. ΣΤΕΡΟΕΙ Η Τα στεροειδή παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση του καρκίνου και ειδικότερα στην αντιμετώπιση ορμονοεξαρτώμενων όγκων όπως είναι του καρκίνου του μαστού 120, του προστάτη 121, του ενδομητρίου 122, των ωοθηκών κά. Επιπρόσθετα, η 25

26 ανακάλυψη των στεροειδικών ορμονικών υποδοχέων ενθάρρυναν πολλούς ερευνητικές να συνεχίσουν τη σύνθεση αναλόγων όπου ένας κυτταροτοξικός παράγοντας συνδέεται χημικά με κάποιο στεροειδές προκειμένου η δράση του να κατευθυνθεί εκλεκτικά προς ορμονοεξαρτώμενους όγκους. CH 2 H CH H CH HC HC CH 2 H H HCH 2 CH 2 Cl HCH 2 CH 2 Cl Μανομουστίνη H CH 2 H H H H C CH 3 Στρεπτοζοκίνη Cl Cl Μελφαλάνη H 2 CH 2 CHCH H H CH 2 CH 2 Cl CH 2 CH 2 Cl Μουστάρδα Ουρακίλης Σχήμα 3 Χαρακτηριστικές ενώσεις που έχουν χρησιμοποιηθεί ως βιολογικές εξέδρες μουσταρδών αζώτου 26

27 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 3 ΣΤΕΡΟΕΙ ΙΚΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ 1. Γενικά περί στεροειδών ορμονών Ένα ποσοστό των καρκίνων, όπως εκείνος του προστάτη, του στήθους και του ενδομητρίου αναπτύσσεται σε όργανα των οποίων η ανάπτυξη και η λειτουργία βασίζεται σε στεροειδείς ορμόνες. Επίσης επιδημιολογικές μελέτες και πειράματα σε ζώα ενοχοποιούν ισχυρά τις φυλετικές ορμόνες στην ανάπτυξη ορισμένων μορφών καρκίνο 123,124,125. Έχει αποδειχτεί ότι οι στεροειδείς ορμόνες μπορούν να δράσουν ως κανονικά καρκινογόνα ικανές όχι μόνο να διεγείρουν τη μίτωση (υποκινητές του όγκου) αλλά και να ανεβάζοντας το ρυθμό μεταλλακτικότητας σε ευεπηρέαστα κύτταρα (εναρκτές του όγκου) 126,127,128,129. Yπάρχουν πολλά διαφορετικά είδη στεροειδών με διαφορετικές λειτουργίες. Μερικά είδη στεροειδών έχει βρεθεί ότι βοηθούν στον περιορισμό της ανάπτυξης ορισμένων νεοπλασμάτων (ορμονοεξαρτώμενων και μη) και μπορούν έτσι να συμβάλλουν στην πιο αποτελεσματική χημειοθεραπεία 130. Για παράδειγμα στην οξεία και στη χρόνια λευχαιμία, στα μυελώματα και στα λεμφώματα χρησιμοποιούνται αδρενοκορτικοειδείς 7 ορμόνες, στον καρκίνο του μαστού με θετικούς ορμονικούς υποδοχείς οιστρογόνων, αντιοιστρογόνα 131,132,133,134, ανδρογόνα 135,136 όπως η τεστοστερόνη προγεστογόνα και αντιπρογεστογόνα, ενώ στον καρκίν ο του προστάτη οιστρογόνα 137,138 αντιανδρογόνα 139,140,141,142, ή συνδυασμένη θεραπεία που περιλαμβάνει αντιανδρογόνα και GnRH 138. Ωστόσο η ανακάλυψη ότι οι ορμόνες μπορούν να δράσουν ως συγκαρκινογόνα ή ως υποκινητές καρκίνου σε διάφορα ζωϊκά είδη μετά από μακρόχρονη χρήση επισκίασε τα ωφέλιμα αποτελέσματα κατά του καρκίνου και τέθηκε όλη η προσπάθεια υπό λεπτομερέστερο έλεγχο 143. και 2. Μηχανισμός δράσης των στεροειδών ορμονών Οι στεροειδείς ορμόνες, αλλά και οι θυρεοειδείς ορμόνες, τα ρετινοειδή και η βιταμίνη D διαπερνούν την πλασματική μεμβράνη. Επειδή όμως είναι αδιάλυτες στο νερό, κυκλοφορούν στα υγρά του σώματος των οργανισμών δεσμευμένες σε ειδικές πρωτεΐνες-μεταφορείς. Μετά την αναγνώριση των κυττάρων-στόχων, οι στεροειδείς ορμόνες απελευθερώνονται από την πρωτεΐνη-μεταφορέα και εισέρχονται στο κύτταρο, όπου δεσμεύονται με ειδικούς κυτταροπλασματικούς ή πυρηνικούς υποδοχείς με ταυτόχρονη αλλαγή της διαμόρφωσης τους. Το γεγονός αυτό 27

28 ενεργοποιεί τον υποδοχέα, ο οποίος δρώντας ως μεταγραφικός παράγοντας δεσμεύεται στην ή στις ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες του DA όπου διεγείρει ή καταστέλλει την επαγωγή ορισμένων γονιδίων. Είναι γνωστό ότι οι βιολογικές αποκρίσεις στις στεροειδείς ορμόνες επιτυγχάνεται μέσω μεσολάβησης των υποδοχέων τους. 144,145,146 Οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών είναι πρωτεΐνες που απαντώνται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων. Υπάρχουν τρεις κατηγορίες στις οποίες χωρίζονται οι υποδοχείς των ορμονών : η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει τους υποδοχείς των στεροειδών ορμονών (γλυκοκορτικοειδών, αλατοκορτικοειδών, ανδρογόνων και προγεστερόνης), η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τους υποδοχείς των θυρειδικών ορμονών (Τ3, Τ4) και η τελευταία κατηγορία αποτελείται από τους υποδοχείς των οιστρογόνων. Στην τελευταία κατηγορία κατατάσσονται και οι ορφανοί υποδοχείς. Οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών αποτελούνται από διάφορες πρωτεϊνικές περιοχές με ανεξάρτητη λειτουργία. Οι διάφορες περιοχές εμφανίζουν ομολογία ανάμεσα στα μέλη που συγκροτούν την οικογένεια των πρωτεϊνών αυτών. Η περιοχή που φέρει την μεγαλύτερη ομολογία μεταξύ των μελών της οικογένειας είναι η περιοχή πρόσδεσης στο DΑ (περιοχή C) που φέρει τους δύο δακτυλίους ψευδαργύρου. Οι δακτύλιοι ψευδαργύρου σχηματίζονται από 4 κυστεΐνες η κάθε μια. Το αμινοτελικό άκρο έχει την μικρότερη έως καθόλου ομολογία μεταξύ των μελών της οικογένειας και λειτουργεί ως ενεργοποιητής. Προς το καρβοξυτελικό άκρο βρίσκεται (περιοχή Ε) η περιοχή της πρωτεΐνης στην οποία προσδένεται η ορμόνη. Παρότι η περιοχή αυτή διαφέρει στους διάφορους υποδοχείς (ώστε να παρέχεται η εξειδίκευση για τη πρόσθεση διαφορετικών ορμονών), διατηρεί κάποια ομολογία η οποία είναι αναγκαία για τη δημιουργία της ειδικής στερεοδιάταξης που χρειάζεται η πρόσδεση ενός στεροειδούς. Η περιοχή D χρησιμεύει σα γέφυρα ανάμεσα στις περιοχές πρόσδεσης στο DA και πρόσδεσης της ορμόνης καθώς επίσης και για το διμερισμό των πρωτεϊνικών μορίων. Οι στεροειδείς ορμόνες ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων-στόχων με την πρόσδεση στον αντίστοιχο υποδοχέα που βρίσκεται ανενεργός στο κυτταρόπλασμα, ενεργοποίηση και μεταφορά του στον πυρήνα όπου ο υποδοχέας προσδένεται σε ένα ειδικό σημείο απόκρισης. Οι υποδοχείς που βρίσκονται συνδεδεμένοι στον ενισχυτή (περιοχή του DA) δεν επιδρούν άμεσα στο βασικό μεταγραφικό σύμπλοκο αλλά διαμέσου ενός συνενεργοποιητικού συμπλόκου. Τα τελευταία χρόνια έχουν βρεθεί και μελετηθεί αρκετές πρωτεΐνες που είναι μέρη του συνεργοποιητικού συμπλόκου όπως είναι οι μεθυλοτρανσφεράσες, οι ακετυλοτρανσφεράσες, οι κινάσες, οι ουμπικουιτινάσες, οι αποακετυλάσες και οι απομεθυλάσες οι οποίες έχουν την ικανότητα να τροποποιούν τόσο τις ιστόνες όσο και μη-ιστόνες πρωτεΐνες 147 και 28

29 ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων. Η πρωτεΐνη CBP/p300, για παράδειγμα αλλάζει τη δομή της χρωματίνης ακετυλιώνοντας τις ιστόνες Η3 και Η4. Ωστόσο, εκτός από το να ρυθμίζουν τις ιστόνες, οι πρωτεΐνες αυτές αλληλεπιδρούν άμεσα, τροποποιούν και ρυθμίζουν και την ενεργότητα και των ίδιων των στεροειδικών υποδοχέων 147. Σχήμα 4 Πορεία του στεροειδούς μορίου μέσα στο κύτταρο Επιπρόσθετα με τις επιπτώσεις στη μεταγραφή των γονιδίων έχει βρεθεί ότι στεροειδείς ορμόνες ενεργοποιούν μια αλυσίδα μηνυμάτων στο κυτταρόπλασμα 148,149 (cytoplasmic signaling cascades). Τα οιστρογόνα και οι προγεστίνες για παράδειγμα, έχει βρεθεί ότι ενεργοποιούν αλυσιδωτές αντιδράσεις (MAPKinases) με απώτερο στόχο, μάλλον, την ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων και συνενεργοποιητών που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου 150. Νέες μελέτες αποδεικνύουν κατάφωρα ότι οι προγεστίνες σε κύτταρα του στήθους και κύτταρα του ενδομητρίου ενεργοποιώντας άμεσα τα μονοπάτια Src/Erk1/2 και PI3K/Akt αποτελούν το έναυσμα για πολλαπλασιασμό των κυττάρων 151. Ωστόσο βρέθηκε ότι υπάρχει σχέση μεταξύ της γρήγορης ενεργοποίησης του Erk1 και της μεταγραφικής επαγωγής ορμονικών γονιδιακών-στόχων 148 και φαίνεται ότι ένα σημαντικό ποσοστό από τα γονίδια στόχων των ορμονών χρειάζονται τη συνεργασία και της γονιδιωματικής και της μη γονδιωματικής λειτουργίας των ορμονών για τη επαγωγής τους 152. Στο ίδιο μήκος κύματος κινούνται και άλλες μελέτες οι οποίες αποδεικνύουν οι υποδοχείς στεροειδών ορμονών δρουν όχι άμεσα 29

30 στο DA, αλλά μέσω ενεργοποίησης διαμεμβρανικών υποδοχέων, όπως οι ιντεγκρίνες αvβ3 153, υποδοχέων δεσμευμένων με G πρωτεΐνες (GCPR) 154. Ακόμα έχει βρεθεί ότι και μεταβολίτες των υποδοχέων, όπως η 3-ιωδοθυροναμίνη (μεταβόλιτης της θυροειδούς ορμόνης) είναι ενεργοποιητής μιας όχι γονιδιωματικής διαδικασίας που περιλαμβάνει τη ρύθμιση της θερμογένεσης στα θηλαστικά 155. Βασιζόμενοι σε όλες αυτές τις γνώσεις νέες στρατηγικές αναπτύσσονται προκειμένου να φτιαχτούν νέα ανάλογα ορμονών που να ρυθμίζουν τόσο τη γονιδιωματική όσο και τη μη γονιδιωματική τους δράση 156. Σχήμα 5 Μη γονιδιωματική δράση των στεροειδών ορμονών που περιλαμβάνει συμμετοχή μεμβρανικών υποδοχέων και αλυσιδωτών αντιδράσεων στο κυτταρόπλασμα 3. Εισαγωγή των στεροειδών ως βιολογικών εξέδρων Τα στεροειδή έχουν χρησιμοποιηθεί ως μόρια φορείς αλκυλιωτικών παραγόντων με σκοπό: Τη βελτίωση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του αλκυλιωτικού παράγοντα, ώστε λόγω της μεγάλης λιποφιλικότητας του στεροειδικού σκελετού, να διευκολύνεται 30

31 η μεταφορά της δραστικής ομάδας αζώτου διαμέσου της κυτταρικής και πυρηνικής μεμβράνης στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων Την αύξηση της συγκέντρωσης του αλκυλιωτικού παράγοντα μέσα στον πυρήνα των κυττάρων του ιστού-στόχου. Αφενός η υδρόλυση της δραστικής ομάδας της μουστάρδας αζώτου πριν φτάσει στον πυρήνα των κυττάρων ελαττώνεται σημαντικά, αφ ετέρου η περιοχή πρόσδεσης και δράσης των στεροειδών ορμονών βρίσκεται στον κυτταρικό πυρήνα, με αποτέλεσμα το μεγαλύτερο ποσοστό του φαρμάκου να οδηγείται και να εμφανίζει εκεί τη δράση του. Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στην αναχαίτιση των ορμονο-εξαρτώμενων όγκων στους οποίους καταγράφονται θετικοί δείκτες ορμονικών υποδοχέων, λόγω των ορμονικών ιδιοτήτων ορισμένων στεροειδών. Στη μείωση της τοξικότητας του αλκυλιωτικού παράγοντα, με το σκεπτικό ότι ο αλκυλιωτικός παράγοντας θα μεταφέρεται μεν από το στεροειδές σε όλο τον οργανισμό, αλλά η απελευθέρωση του από αυτό, είτε με υδρόλυση ή με ενζυμική δράση θα γίνεται σε μεγαλύτερο ποσοστό στα καρκινικά κύτταρα Την πιθανή συνέργεια της δράσης των δύο μορίων, του στεροειδούς και του αλκυλιωτικού παράγοντα. Με δεδομένη την κυτταροτοξική δράση του αλκυλιωτικού παράγοντα και την αποτελεσματικότητα κάποιων στεροειδών έναντι διαφόρων τύπων νεοπλασιών πιθανόν να μπορεί να επιτευχθεί ακόμη και αθροιστική δράση έναντι ορισμένων καρκινικών τύπων εάν πραγματοποιηθεί ο κατάλληλος συνδυασμός μεταξύ των δύο μορίων. 4. Σταθεροί δεσμοί μεταξύ στεροειδούς-αλκυλιωτικού παράγοντα Η πρώτη αναφορά στη βιβλιογραφία που περιγράφει την εισαγωγή αλκυλιωτικών ιδιοτήτων στο στεροειδικό σκελετό παρουσιάστηκε το 1952 από τους Vavasour et al 157. Ως μόριο φορέας χρησιμοποιήθηκε η χολεστερόλη στην οποία συνδέθηκε στη 3-θέση η αλκυλιωτική ομάδα της Ν,Ν-δις(χλωροαιθυλ)αμίνης (σχήμα 5) μέσω ενός σταθερού δεσμού με το άτομο του αζώτου της μουστάρδα. ClH 2 CH 2 C ClH 2 CH 2 C Σχήμα 6 Χημικός τύπος της Ν,Ν-δις(χλωροαιθυλ)αμίνης 31