Μελέτη των μικροθηλαστικών του γένους Mus σε δύο διαφορετικούς τύπους οικοτόπων στην Κύπρο.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Οικολογία, Διαχείριση και Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος Μελέτη των μικροθηλαστικών του γένους Mus σε δύο διαφορετικούς τύπους οικοτόπων στην Κύπρο. Ερευνητική Εργασία Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης Δέδε Κυριακή Α.Μ. 400 ΠΑΤΡΑ, 2010

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Οικολογία, Διαχείριση και Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος Μελέτη των μικροθηλαστικών του γένους Mus σε δύο διαφορετικούς τύπους οικοτόπων στην Κύπρο. Ερευνητική Εργασία Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης Δέδε Κυριακή Α.Μ. 400 ΠΑΤΡΑ, 2010

3 Επιβλέπουσα καθηγήτρια Φραγγεδάκη Τσώλη Στέλλα, Αναπλ. Καθηγήτρια Τριμελής Εξεταστική επιτροπή Φραγγεδάκη - Τσώλη Στέλλα, Αναπλ. Καθηγήτρια Χονδρόπουλος Βασίλειος, Αναπλ. Καθηγητής Σφενδουράκης Σπυρίδων, Επίκ. Καθηγητής

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μελέτη εκπονήθηκε στο εργαστήριο Ζωολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά τη χρονική περίοδο στα πλαίσια του μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης για το μεταπτυχιακό κύκλο σπουδών με τίτλο «Οικολογία, Διαχείριση και Προστασία του Φυσικού Περιβάλλοντος». Η διεκπεραίωση της εργασίας αυτής έχει ιδιαίτερη σημασία για μένα διότι σηματοδοτεί το τέλος των σπουδών μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά κάποιους ανθρώπους που με βοήθησαν με τον ένα ή τον άλλο τρόπο, ώστε να φέρω εις πέρας το έργο που μου ανατέθηκε και να βρίσκομαι σήμερα στην ευχάριστη θέση να παρουσιάζω τη δουλειά μου. Θα ήθελα αρχικά να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου, Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Στέλλα Φραγγεδάκη - Τσώλη και τον Αναπλ. Καθηγητή κ. Βασίλειο Χονδρόπουλο ο οποίος συμμετείχε στην τριμελή επιτροπή, για την ευκαιρία που μου έδωσαν με την ανάθεση αυτού του θέματος. Τους ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν, την υπομονή τους, τις συμβουλές τους, τη συνεχή καθοδήγησή τους από την πρώτη στιγμή μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταπτυχιακής μου εργασίας και για όλη τη βοήθειά τους μέχρι να φτάσω εδώ και να κρατάτε στα χέρια σας αυτό το κείμενο. Παράλληλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκ. Καθηγητή κ. Σπυρίδων Σφενδουράκη, που συμφώνησε να συμμετάσχει στην τριμελή επιτροπή, για την πολύτιμη βοήθειά του κατά την επεξεργασία των αποτελεσμάτων και για την καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της εργασίας αυτής. Ένα θερμό ευχαριστώ οφείλω στα παιδιά του εργαστηρίου, Γιώργο Τρυφωνόπουλο, Ευανθία Θάνου, Μαρία Καμηλάρη και Παναγιώτη Κορνήλιο, γιατί απ την πρώτη στιγμή που ξεκίνησα την ερευνητική μου εργασία στο εργαστήριο με αγκάλιασαν και με στήριξαν, με βοήθησαν και ουσιαστικά με εισήγαγαν στον κόσμο της μοριακής βιολογίας και της μορφομετρίας... Τους ευχαριστώ για την πολύτιμη βοήθειά τους, την άψογη συνεργασία μας αλλά και για τις γνώσεις που με τόση επιθυμία και απίστευτη υπομονή μου μετέδωσαν... Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τις φίλες μου, Έλενα Χρίστου και Άννα Μακρή, όχι απλά για τη φιλοξενία τους, αλλά κυρίως για τη συμπαράσταση και τη βοήθειά τους στις δύσκολες στιγμές που περάσαμε μαζί απ την πρώτη μέρα των σπουδών μας... Σημαντική επίσης ήταν και η συνεισφορά της Έλενας για την ολοκλήρωση των δειγματοληψιών. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το χρωστάω στην οικογένεια μου... τους γονείς μου, Ιωάννη και Μέμνια, που με δικές τους στερήσεις είμαι ακόμα εδώ, την αδελφή μου Δώρα και τον Ζήνωνα. Η συμπαράσταση των τελευταίων λειτούργησε ως κινητήρια δύναμη για να ολοκληρωθεί αυτή η εργασία. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ οφείλω ξεχωριστά στον πατέρα μου, που καθ όλη τη διάρκεια των δειγματοληψιών υπήρξε όχι μόνο οδηγός και βοηθός μου, αλλά και η πιο ευχάριστη παρέα που θα μπορούσα να ζητήσω... Στους τελευταίους θα ήθελα να αφιερώσω την εργασία αυτή... Σας ευχαριστώ

5 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΔΙΑΤΥΠΩΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΜΕΡΙΚΑ ΦΥΣΙΟΓΡΑΦΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΟΥ Γενικές Πληροφορίες Η παλαιογεωγραφία Η γεωμορφολογία ΤΟ ΚΛΙΜΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΟΥ Μια σύντομη αναφορά Η βροχόπτωση Το Χαλάζι και οι Καταιγίδες Η θερμοκρασία του αέρα Η ηλιοφάνεια Η ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΟΥ Εισαγωγή Το κυπριακό τοπίο Οι κυπριακοί οικότοποι Η πανίδα της Κύπρου Τα θηλαστικά Τα θηλαστικά της παρούσας εργασίας Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΥΨΟΜΕΤΡΟΥ ΣΤΗΝ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ Η ατμοσφαιρική πίεση Η θερμοκρασία Η διαθεσιμότητα νερού Η ακτινοβολία Το έδαφος Η επίδραση του υψομέτρου στην πανίδα μιας περιοχής Η ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ mtdna ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) - Γενικά στοιχεία Η προέλευση του mtdna Το mtdna ως πειραματικό υλικό H ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR)

6 Περιεχόμενα 1.8. Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ (SEQUENCING) ΤΜΗΜΑΤΟΣ DNA Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΣΗ Μοντέλο Jukes & Cantor Μοντέλο Tajima & Nei Μοντέλο Tamura & Nei ΤΑ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΑ ΔΕΝΔΡΑ Η ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΑ Κλασική μορφομετρία Γεωμετρική μορφομετρία Ανάλυση Περιγράμματος ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Περιοχή Νοσοκομείου και λίμνης Παραλιμνίου Περιοχή ποταμού Λιοπετρίου Περιοχή Πλατρών ΣΥΛΛΟΓΗ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Επεξεργασία στο ύπαιθρο Επεξεργασία στο εργαστήριο ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΛΛΕΧΘΕΝΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ Απομόνωση ολικού DNA από ιστό ήπατος Ηλεκτροφόρηση του ολικού DNA Πολλαπλασιασμός του συγκεκριμένου τμήματος του mtdna με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Ηλεκτροφόρηση DNA Καθαρισμός του πολλαπλασιασμένου τμήματος της D-loop περιοχής Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) του τμήματος της περιοχής D-loop Στατιστική επεξεργασία των δεδομένων της νουκλεοτιδικής αλληλούχησης ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΣΥΛΛΕΧΘΕΝΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ Επεξεργασία φωτογραφιών Στατιστική επεξεργασία των δεδομένων της μορφομετρικής ανάλυσης ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΑΓΙΔΕΥΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ

7 Περιεχόμενα Τα μελετηθέντα είδη του γένους Mus Αριθμητικά δεδομένα των παγιδεύσεων Εποχική ποικιλότητα στις συλλήψεις των τρωκτικών Κατανομή των ατόμων σε κλάσεις μήκους ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ανάλυση mtdna και σύγκριση αλληλουχιών Γενετικές αποστάσεις των μελετηθέντων πληθυσμών Ποικιλότητα των μελετηθέντων πληθυσμών Σχέσεις συγγένειας ατόμων που ανήκουν στο γένος Mus της Κύπρου ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ανάλυση διάκρισης μεταξύ των μελετηθέντων ατόμων Mus musculus domesticus και Mus cypriacus της Κύπρου και Mus musculus domesticus της Ελλάδας Ανάλυση διάκρισης μεταξύ όλων των μελετηθέντων ατόμων Mus ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΑΓΙΔΕΥΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Εξάπλωση των ειδών του γένους Mus Εποχική ποικιλότητα στις συλλήψεις των πειραματοζώων Διαφορές σωματικού μεγέθους ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

8 Εισαγωγή 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. ΔΙΑΤΥΠΩΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε μελέτη των μικροθηλαστικών του γένους Mus σε δύο διαφορετικούς τύπους οικοτόπων στην Κύπρο και σύγκριση των επιμέρους στοιχείων τους. Η επιλογή των μικροθηλαστικών ως αντικείμενο μελέτης για την παρούσα μεταπτυχιακή εργασία οφείλεται κατά κύριο λόγο στις ελλιπείς γνώσεις μας ως προς την πανίδα των μικροθηλαστικών της Κύπρου. Απόδειξη είναι το γεγονός ότι το 2006 δημοσιεύτηκε μια εργασία (Cucchi et al., 2006) που αποκάλυπτε την ύπαρξη ενός νέου είδους ποντικού στο νησί, του Mus cypriacus, εκτός από το μέχρι τότε γνωστό Mus musculus domesticus. Έτσι γεννήθηκε το ερώτημα κατά πόσο τα δύο είδη ποντικών συνυπάρχουν στους ίδιους βιοτόπους. Έτσι αποφασίστηκε να δοθεί έμφαση σε δύο περιοχές οι οποίες χαρακτηρίζονται από διαφορετικούς βιότοπους, εξαιτίας κυρίως της έντονης υψομετρικής διαφοράς. Συγκεκριμένα, δείγματα συλλέχθηκαν από την περιοχή των Κάτω Πλατρών στο Όρος Τρόοδος. Επίσης έγινε μία προσπάθεια να προσεγγισθεί μια νέα περιοχή, η ελεύθερη περιοχή της επαρχίας Αμμοχώστου, για την οποία μέχρι τώρα δεν υπήρχαν παρά μόνο διάσπαρτα στοιχεία για την παρουσία αυτών των ζώων. Η αποτυχία των κλασικών μεθόδων ανάλυσης των εξωτερικών αλλά και των κρανιακών μορφολογικών χαρακτηριστικών των δύο ειδών να αποκαλύψει την ταυτότητα των συλλεχθέντων ατόμων, οδήγησε στην απόφαση να εφαρμοστεί η ανάλυση αλληλουχίας σε τμήμα της περιοχής ελέγχου του μιτοχονδριακού DNA. Για να πραγματοποιηθεί η σύγκριση μεταξύ των πληθυσμών, εφαρμόστηκε και γεωμετρική μορφομετρική ανάλυση σε κρανιακούς και οδοντικούς χαρακτήρες. Τα βασικά ερωτήματα γύρω από τα οποία περιστράφηκε αυτή η εργασία ήταν: Πώς αλλάζει η σύνθεση της πανίδας των μικροθηλαστικών του γένους Mus σε δύο περιοχές όπου η κύρια διαφορά τους είναι το υψόμετρο; Υπάρχει, και αν ναι, ποιο είναι το μέγεθος της ενδοειδικής ποικιλότητας μεταξύ των ειδών του γένους Mus που διαβιούν στις περιοχές μελέτης; Μπορούν να διακριθούν οι υπό μελέτη πληθυσμοί του γένους Mus με βάση τη μορφομετρική ανάλυση συγκεκριμένων κρανιακών χαρακτηριστικών και του ακριβούς περιγράμματος του πρώτου άνω γομφίου (Μ 1 ); - 1 -

9 Εισαγωγή 1.2. ΜΕΡΙΚΑ ΦΥΣΙΟΓΡΑΦΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΟΥ Γενικές Πληροφορίες Η Κύπρος είναι το τρίτο σε μέγεθος νησί της Μεσογείου, μετά τη Σικελία και τη Σαρδηνία, με συνολική έκταση 9250 km 2. Βρίσκεται στο βορειοανατολικό άκρο της μεσογειακής λεκάνης σε θέση με βόρειο γεωγραφικό πλάτος από 34 ο, 33 έως 35 ο, 34 και ανατολικό γεωγραφικό μήκος από 32 ο, 15 μέχρι 32 ο, 37 (Εικόνα 1). Το μέγιστο μήκος της (ανατολικά - δυτικά) είναι 226 km, ενώ το μέγιστο πλάτος (βόρεια - νότια) είναι 97 km. Εικόνα 1: Γεωγραφική θέση της Κύπρου (σε πράσινο κύκλο) στον ευρωπαϊκό χώρο Η παλαιογεωγραφία Η γένεση και γεωλογική εξέλιξη της Κύπρου συντελέστηκαν μέσα από μια σειρά τεκτονικών επεισοδίων. Ο σχηματισμός της Κύπρου οφείλεται στη μετακίνηση της αφρικανικής προς την ευρασιατική λιθοσφαιρική πλάκα. Η καταβύθιση της αφρικανικής πλάκας κάτω από την ευρασιατική πλάκα είχε ως αποτέλεσμα την παραμόρφωση των θαλάσσιων ιζημάτων, τη συμπίεσή τους και τελικά την αναγκαστική ανύψωσή τους επάνω από την επιφάνεια της θάλασσας (Hübscher et al., 2009). Με την ανύψωση αυτή σχηματίστηκε η «σπονδυλική στήλη» της Κύπρου, δηλαδή η οροσειρά του Τροόδους (Εικόνα 2)

10 Εισαγωγή Πριν από περίπου 20 εκατομμύρια χρόνια (Πρώιμο Μειόκαινο) εμφανίστηκε η πρώτη ξηρά στην περιοχή του Τροόδους ως ένα μικρό νησί που αναδύθηκε από τη θάλασσα, εκεί όπου σήμερα βρίσκεται ο Όλυμπος (Robertson,1998). Έχουν δημοσιευθεί πολυάριθμες υποθέσεις και θεωρίες για τη τεκτονική εξέλιξη της ανατολικής Μεσογείου (Robertson, 1998 Aksu et al., 2005). Η πιο ευρέως αποδεκτή θεωρία για την τεκτονική εξέλιξη της Κύπρου αναφέρει ότι η συγκλίνουσα κίνηση της αφρικανικής και της ευρασιατικής πλάκας, διατάραξε τη διάταξη μικροπλακών που κινήθηκαν βορειότερα. Οι μικροπλάκες αυτές είχαν δημιουργηθεί από τον κατατεμαχισμό του βόρειου περιθωρίου της Αφρικής. Μία σύγκρουση μιας μικροπλάκας με τον σχηματισθέντα ωκεάνιο φλοιό του Τροόδους και ταυτόχρονα η συνεχιζόμενη πίεση της αφρικανικής πλάκας, ανάγκασαν το Τρόοδος (μέρος του οποίου ευρισκόταν ακόμη κάτω από την επιφάνεια της θάλασσας) σε μία σταδιακή αριστερόστροφη περιστροφή 90 ο (Robertson & Woodcock,1979). Η περιστροφή αυτή, σε συνδυασμό με την πίεση της αφρικανικής πλάκας, επηρέασε μια μικροπλάκα και δημιούργησε έντονες τεκτονικές διαταραχές βόρεια έως βορειοανατολικά του Τροόδους. Επακόλουθο ήταν η μεταμόρφωση (ανακρυστάλλωση), η πτύχωση και ο θρυμματισμός των εναποτιθέμενων ασβεστολιθικών ιζημάτων και άλλων πετρωμάτων που αναδύθηκαν από τη θάλασσα, σχηματίζοντας έτσι την οροσειρά του Πενταδακτύλου κατά το Ύστερο Μειόκαινο. Έτσι πριν από 15 εκατομμύρια χρόνια περίπου, έχουμε το σχηματισμό δύο νησιών, το Τρόοδος και τον Πενταδάκτυλο. Η προσκόλληση της οροσειράς του Πενταδακτύλου στη βόρεια πλευρά της Ζώνης του Τροόδους και η ανύψωση της Κύπρου στη σημερινή ενιαία μορφή ξεκίνησε το Μειόκαινο (10-15 εκ. χρόνια) και αποτέλεσε το προτελευταίο τεκτονικό επεισόδιο. Ο θαλάσσιος χώρος μεταξύ των δύο νησιών, δηλαδή η σημερινή κεντρική πεδιάδα της Κύπρου, η Μεσαορία, καθώς και οι υπόλοιπες περιοχές γύρω από τα δύο νησιά, καλύπτονταν από αβαθή μέχρι και βαθιά νερά. Ο βυθός της θάλασσας στις περιοχές αυτές δεχόταν υλικά προερχόμενα από τη διάβρωση τόσο των πετρωμάτων του Τροόδους όσο και του Πενταδακτύλου. Ανατολικά της Κύπρου η Τηθύς Θάλασσα έκλεισε και το δυτικότερο τμήμα της, η Μεσόγειος, απέκτησε σχεδόν το σημερινό της σχήμα. Η απότομη ανύψωση του χώρου της Κύπρου έγινε κατά το τέλος του Πλειοκαίνου, πριν από 2 περίπου εκατομμύρια χρόνια (τελευταίο τεκτονικό επεισόδιο), οπότε το σημερινό Τρόοδος και ο Πενταδάκτυλος ανυψώθηκαν πολύ περισσότερο από ό,τι σήμερα. Σιγά-σιγά - 3 -

11 Εισαγωγή (Α) Ύστερο Κρητιδικό (90 εκ. χρόνια) (Β) Μέσο Μειόκαινο (20 εκ. χρόνια) (Γ) Ύστερο Μειόκαινο (10 εκ. χρόνια) (Δ) Πλειόκαινο - Πλειστόκαινο (3-0,5 εκ. χρόνια) Εικόνα 2: Σχηματική απεικόνιση (Α) της δημιουργίας του οφιολιθικού συμπλέγματος του Τροόδους και (Β-Δ) των φάσεων της γεωλογικής εξέλιξης της Κύπρου (Τμήμα Γεωλογικής Επισκόπησης Κύπρου,

12 Εισαγωγή δημιουργήθηκαν λιμνοθάλασσες που αποκόπηκαν από την υπόλοιπη θάλασσα, ενώ συνεχιζόταν και η ανυψωτική κίνηση μέχρι και το Πλειστόκαινο. Η ανύψωση αυτή, συνδυασμένη με έντονες βροχοπτώσεις, είχε ως αποτέλεσμα την εκτεταμένη διάβρωση των οροσειρών, κυρίως εκείνης του Τροόδους (Poole & Robertson, 1998), και τη μεταφορά τεράστιων ποσοτήτων προϊόντων διάβρωσης (κλαστικά ιζήματα) που αποτέθηκαν στις κοιλάδες των μεγάλων ποταμών και στο χώρο της Μεσαορίας, σχηματίζοντας τις κλαστικές πλειστοκαινικές αποθέσεις. Η τελική διαμόρφωση της Κύπρου ήταν αποτέλεσμα αφενός της διακύμανσης της στάθμης της θάλασσας κατά τις περιόδους των παγετώνων του Πλειστοκαίνου και αφετέρου της διαφορικής ανύψωσης του νησιού Η γεωμορφολογία Η Κύπρος χωρίζεται σε 4 φυσικές περιοχές (Εικόνα 3): (α) Την οροσειρά του Τροόδους, που βρίσκεται στο κεντρικό-δυτικό μέρος του νησιού και η ψηλότερη κορυφή της, ο Όλυμπος, έχει ύψος 1951 m πάνω από την επιφάνεια της θάλασσας, (β) Την οροσειρά του Πενταδακτύλου, που έχει σχετικά μικρό πλάτος και εκτείνεται κατά μήκος των βόρειων ακτών του νησιού με κορυφές μέχρι περίπου 1000 m ύψος, (γ) Την πεδιάδα της Μεσαορίας, που βρίσκεται μεταξύ των οροσειρών του Τροόδους και του Πενταδακτύλου και έχει γενικά χαμηλό υψόμετρο, το οποίο στην περιοχή της Λευκωσίας δεν ξεπερνά τα 180 m, και (δ) Τις παράλιες πεδιάδες και κοιλάδες κατά μήκος των ακτών

13 Εισαγωγή Εικόνα 3: Δύο οροσειρές δεσπόζουν στο νησί, διασχίζοντάς το παράλληλα, με κατεύθυνση από δυτικά προς ανατολικά. Πρόκειται για την οροσειρά του Πενταδάκτυλου στο βόρειο και την οροσειρά του Τροόδους στο κεντρικό προς νότιο τμήμα της Κύπρου, οι οποίες διαχωρίζονται μεταξύ τους από την κεντρική πεδιάδα της Μεσαορίας. ΤΡΟΟΔΟΣ Στο κεντρικό προς νότιο μέρος της Κύπρου κυριαρχεί η οροσειρά του Τροόδους που καλύπτει συνολικά έκταση 3200 km 2 και περιλαμβάνει μια σειρά από κορυφές, αρκετές από τις οποίες ξεπερνούν τα 1300 m. Ο ορεινός όγκος του Τροόδους, είναι ελλειπτικής μορφής και αποτελείται από πυριγενή οφιολιθικά πετρώματα 90 εκατομμυρίων χρόνων (Poole & Robertson, 1998). Το οφιολιθικό σύμπλεγμα του Τροόδους θεωρείται ότι αποτελείται από υλικά ενός αρχαίου ωκεάνιου φλοιού, της Θάλασσας της Τηθύος και του ανώτερου μανδύα της γης. Τα πετρώματα της οροσειράς του Τροόδους είναι γενικά υδατοστεγανά, εκτός από τις περιπτώσεις ρηγμάτων που αφθονούν στην περιοχή. Η στεγανότητα των πετρωμάτων σε συνάρτηση με τη μεγάλη κλίση των πλαγιών, συντελούν ώστε το μεγαλύτερο μέρος της βροχόπτωσης, να καταλήγει στους ποταμούς. Από τα βουνά του Τροόδους πηγάζουν όλοι οι μεγάλοι ποταμοί της Κύπρου, οι οποίοι μεταφέρουν ιζήματα και νερό στις πεδιάδες. Η οροσειρά του Τροόδους είναι ο δημιουργός του ήπιου κλίματος της Κύπρου και το οφιολιθικό σύμπλεγμα του Τροόδους, το οποίο είναι το «θεμέλιο» επάνω στο - 6 -

14 Εισαγωγή οποίο κτίστηκε το νησί, είναι - όπως προαναφέρθηκε - η γεωλογική και μορφολογική «σπονδυλική στήλη» της Κύπρου. Τυπικό παράδειγμα παρουσίας προηγούμενου μικρού νησιού το οποίο ενώθηκε με την ξηρά, με ιζήματα μεταφερόμενα από τους ποταμούς που πηγάζουν από την οροσειρά του Τροόδους, αποτελεί η χερσόνησος του Ακρωτηρίου. Σ αυτήν, οι αποθέσεις των ποταμών Κούρη και Γαρύλλη και οι αποθέσεις της θάλασσας ένωσαν εκείνο το νησί με την υπόλοιπη ξηρά, απομονώνοντας ένα κομμάτι θάλασσας στο μέσο του Ακρωτηρίου, τη σημερινή αλυκή της Λεμεσού. ΠΕΝΤΑΔΑΚΤΥΛΟΣ Η οροσειρά του Πενταδακτύλου εκτείνεται κατά μήκος της βόρειας παράλιας ζώνης, αποκόπτοντας έτσι την ενδοχώρα από τη θάλασσα. Ο Πενταδάκτυλος βρίσκεται σε μικρή απόσταση από τη θάλασσα, είναι μια στενή και επιμήκης οροσειρά με υψηλές και απόκρημνες κορυφές, κατακόρυφες πλαγιές, βαθιά φαράγγια και μικρές κοιλάδες στις οποίες ρέουν μικροί ποταμοί. Καλύπτει έκταση μήκους 80 περίπου χιλιομέτρων και έχει μέσο πλάτος 5 χιλιόμετρα. Αποτελείται από μια σειρά ασβεστολιθικών κορυφών με υψόμετρο που κυμαίνεται από 700 έως 1024 m. Η επίδραση των ορογενικών κινήσεων που δημιούργησαν τον Πενταδάκτυλο μαζί με τεκτονικές κινήσεις προκάλεσαν ανακατατάξεις στα πετρώματα του, με αποτέλεσμα σήμερα τα παλαιότερα στρώματα ασβεστόλιθου να βρίσκονται πάνω από νεότερα. Τα καρστικά φαινόμενα που χαρακτηρίζουν τα ασβεστολιθικά πετρώματα της οροσειράς, δημιούργησαν υπόγειες σπηλιές με σταλακτίτες και σταλαγμίτες, κατακρημνίσεις και έγκοιλα. Έτσι μια ποσότητα νερού διείσδυσε στα υδατοπερατά πετρώματα, με αποτέλεσμα τη δημιουργία - στους πρόποδες της οροσειράς - των γνωστών κεφαλόβρυσων της Κυθραίας, της Λαπήθου και του Καραβά. Η καρστική τοπογραφία, παρά την παρουσία του ασβεστόλιθου στην οροσειρά, δεν είναι τόσο έντονη και βοήθησε περισσότερο στη δημιουργία ποταμών παρά στην αποθήκευση νερού. ΜΕΣΑΟΡΙΑ Ανάμεσα στους δύο ορεινούς όγκους της Κύπρου βρίσκεται η πεδιάδα της Μεσαορίας που εκτείνεται από τον κόλπο της Μόρφου μέχρι τον κόλπο της Αμμοχώστου και βρίσκεται έτσι μεταξύ των οροσειρών του Τροόδους και του - 7 -

15 Εισαγωγή Πενταδακτύλου, καλύπτοντας απόσταση 88 περίπου χιλιομέτρων. Το μεγαλύτερο μέρος της Μεσαορίας βρίσκεται σε υψόμετρο χαμηλότερο των 150 m. Η κεντρική πεδιάδα της Κύπρου μπορεί να χαρακτηριστεί ως πεδιάδα αλλουβιακών αποθέσεων. Τα πετρώματά της είναι από τα πιο πρόσφατα της Κύπρου, είναι ιζηματογενούς προέλευσης, μεταφέρθηκαν από τον Πενταδάκτυλο και το Τρόοδος και εναποτέθηκαν στον βυθό της τότε θάλασσας, ακριβώς εκεί όπου βρίσκεται σήμερα η κεντρική πεδιάδα. Μετά τη δημιουργία των οροσειρών του Τροόδους και του Πενταδακτύλου, η μεταξύ τους περιοχή ήταν μια βαθιά τάφρος. Κατά το τέλος της Μειόκαινης περιόδου και στις αρχές της Πλειόκαινης περιόδου, η τάφρος άρχισε να γεμίζει με τα προϊόντα διάβρωσης των εκρηξιγενών πετρωμάτων του Τροόδους και των ασβεστόλιθων του Πενταδακτύλου. Στο κέντρο της πεδιάδας εναποτέθηκαν ιλύς και άργιλοι και στο ανατολικό και δυτικό τμήμα χονδρόκοκκοι ψαμμίτες και ασβεστολιθικοί ψαμμίτες. Στο νότιο τμήμα, κοντά στα κράσπεδα του Τροόδους, αποτέθηκαν αργότερα χονδρόκοκκοι ψαμμίτες, κλαστικά ιζήματα και άργιλοι (σχηματισμοί Λευκωσίας και Αθαλάσσας) (Robertson, 1998). Οι διάφορες τεκτονικές κινήσεις που ακολούθησαν, έφεραν τα στρώματα της τάφρου στην επιφάνεια και η θάλασσα υποχώρησε. Με την υποχώρηση της θάλασσας αρχίζει η περίοδος της διάβρωσης των στρωμάτων της πεδιάδας από τους ποταμούς, οι οποίοι με τη σειρά τους αποθέτουν μεγάλες ποσότητες κροκαλών, άμμων, ιλύος και αργίλων κοντά στις εκβολές τους, δελταϊκές αποθέσεις, αυξάνοντας έτσι την έκταση της ξηράς σε βάρος της θάλασσας. Οι ασβεστολιθικοί ψαμμίτες στο νοτιοανατολικό τμήμα και οι δελταϊκές αποθέσεις και οι παλαιότεροι ψαμμίτες στο δυτικό τμήμα αποτέλεσαν κατόπιν τις δύο κυριότερες λεκάνες της Κύπρου, των Κοκκινοχωριών και της Μόρφου. ΠΑΡΑΛΙΑ ΖΩΝΗ Η παράλια ζώνη της Κύπρου αποτελείται συνήθως από ομαλές ακτές, ενώ είναι σπάνιες οι περιπτώσεις όπου βουνά καταλήγουν απότομα στη θάλασσα. Αρκετές από τις ακτές του νησιού είναι πετρώδεις βραχώδεις, ενώ σε αρκετά σημεία υπάρχουν αμμώδεις κόλποι με μεγαλύτερους αυτούς της Αμμοχώστου και της Μόρφου

16 Εισαγωγή 1.3. ΤΟ ΚΛΙΜΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΟΥ Μια σύντομη αναφορά Η Κύπρος περιβρέχεται από την ανατολική Μεσόγειο Θάλασσα, στην επίδραση της οποίας οφείλει το μεσογειακό κλίμα της. Τα κύρια χαρακτηριστικά του μεσογειακού κλίματος της Κύπρου είναι το μακρύ, ζεστό και ξηρό καλοκαίρι από τα μέσα του Μαΐου ως τα μέσα του Σεπτεμβρίου, ο σχετικά βραχύς, ήπιος και υγρός χειμώνας από τα μέσα του Νοεμβρίου ως τα μέσα Μαρτίου και οι δύο ενδιάμεσες μεταβατικές εποχές, το φθινόπωρο και η άνοιξη. Στη διάρκεια του καλοκαιριού η βροχόπτωση είναι πολύ χαμηλή με μέση τιμή που δεν ξεπερνά το 5% της μέσης ολικής βροχόπτωσης του όλου χρόνου (Μετεωρολογική Υπηρεσία Κύπρου, Στη διάρκεια του χειμώνα η Κύπρος επηρεάζεται από τη συχνή διέλευση ασθενών υφέσεων και μετώπων που κινούνται στη Μεσόγειο με κατεύθυνση από τα δυτικά προς τα ανατολικά. Οι καιρικές αυτές διαταραχές διαρκούν συνήθως από μία μέχρι τρεις μέρες κάθε φορά και δίνουν τις μεγαλύτερες ποσότητες βροχής. Η συνολική μέση βροχόπτωση στους μήνες Δεκέμβριο, Ιανουάριο και Φεβρουάριο αντιστοιχεί περίπου στο 60% της βροχόπτωσης ολόκληρου του έτους. Η οροσειρά του Τροόδους και σε μικρότερο βαθμό η οροσειρά του Πενταδακτύλου, παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μετεωρολογικών συνθηκών στις διάφορες περιοχές της Κύπρου και στη δημιουργία τοπικών φαινομένων. Η παρουσία επίσης της θάλασσας που περιβάλλει το νησί είναι αιτία δημιουργίας τοπικών φαινομένων στις παράλιες περιοχές Η βροχόπτωση Η μέση ετήσια βροχόπτωση σε όλο το νησί είναι περίπου 480mm (μέση τιμή για την περίοδο ). Η επίδραση του αναγλύφου της ξηράς στην κατανομή της βροχόπτωσης είναι σημαντική. Η μέση ετήσια βροχόπτωση στις νοτιοδυτικές προσήνεμες περιοχές της οροσειράς του Τροόδους αυξάνεται από 450mm περίπου στους πρόποδες σε 1100mm στην κορυφή του Ολύμπου (Μετεωρολογική Υπηρεσία Κύπρου, Στις υπήνεμες πλαγιές η βροχόπτωση - 9 -

17 Εισαγωγή ελαττώνεται σταθερά κατεβαίνοντας προς τα βόρεια και τα ανατολικά με τιμές μεταξύ mm στην κεντρική πεδιάδα και τις πεδινές νοτιοανατολικές περιοχές. Η οροσειρά του Πενταδακτύλου στο βόρειο τμήμα του νησιού προκαλεί σχετικά μικρή αύξηση στη βροχόπτωση που φτάνει στα 550mm στις κορυφογραμμές της. Οι περισσότερες βροχές πέφτουν στην περίοδο από το Νοέμβριο μέχρι το Μάρτιο (Μετεωρολογική Υπηρεσία Κύπρου, Την άνοιξη και το φθινόπωρο οι βροχές είναι κυρίως τοπικές. Η βροχόπτωση του καλοκαιριού είναι πολύ χαμηλή, οι βροχές έχουν συνήθως τοπικό χαρακτήρα και παρατηρούνται στις ορεινές περιοχές και στην κεντρική πεδιάδα κατά τις πρώτες απογευματινές ώρες. Χιονόπτωση συμβαίνει σπάνια στις πεδινές περιοχές και στην οροσειρά του Πενταδακτύλου, συμβαίνει όμως συχνά κάθε χειμώνα σε περιοχές της οροσειράς του Τροόδους με υψόμετρο πάνω από 1000 m. Κατά μέσο όρο η πρώτη χιονόπτωση παρατηρείται μέσα στην πρώτη βδομάδα του Δεκεμβρίου και η τελευταία γύρω στα μέσα του Απριλίου. Το χιόνι δεν καλύπτει μόνιμα το έδαφος σε όλη τη διάρκεια του χειμώνα, για αρκετές όμως βδομάδες στους πιο ψυχρούς μήνες του χρόνου το ύψος του χιονιού είναι σημαντικό κυρίως στις βόρειες πλαγιές του Τροόδους. Μετά την τελευταία χιονόπτωση το χιόνι μπορεί να εξακολουθήσει να καλύπτει το έδαφος στις επόμενες δέκα μέχρι δεκαπέντε μέρες Το Χαλάζι και οι Καταιγίδες Χαλάζι πέφτει κατά μέσο όρο 2 ως 3 φορές το χρόνο στις πεδινές περιοχές και μέχρι 10 φορές το χρόνο στις ορεινές περιοχές, συνήθως μεταξύ Νοεμβρίου και Μαΐου. Η πιο πιθανή περίοδος για να συμβεί σοβαρή χαλαζόπτωση είναι από τον Δεκέμβριο μέχρι τον Απρίλιο. Οι καταιγίδες είναι σπάνιες από τον Ιούνιο μέχρι τον Σεπτέμβριο, συμβαίνουν όμως κατά μέσον όρο 4 έως 5 μέρες σε κάθε μήνα από τον Οκτώβριο μέχρι τον Ιανουάριο και 2 έως 3 μέρες το μήνα από τον Φεβρουάριο μέχρι τον Μάιο (Μετεωρολογική Υπηρεσία Κύπρου, Η θερμοκρασία του αέρα Η Κύπρος έχει ζεστό καλοκαίρι και ήπιο χειμώνα, όμως η γενική αυτή κατάσταση διαφοροποιείται από τόπο σε τόπο από δύο παράγοντες,

18 Εισαγωγή (α) το ανάγλυφο, που ελαττώνει τη θερμοκρασία κατά 5 βαθμούς Κελσίου περίπου ανά 1000 m ύψους, και (β) την επίδραση της θάλασσας, που έχει ως αποτέλεσμα πιο δροσερό καλοκαίρι και σχετικά πιο ήπιο χειμώνα στις παράλιες περιοχές και ειδικότερα στις δυτικές. Το ετήσιο εύρος της θερμοκρασίας του αέρα είναι αρκετά μεγάλο και κυμαίνεται γύρω στους 18 ο C στις εσωτερικές περιοχές και γύρω στους 14 ο C στα παράλια. Οι διαφορές μεταξύ της ψηλότερης θερμοκρασίας ημέρας και της χαμηλότερης θερμοκρασίας νύχτας είναι επίσης μεγάλες κυρίως στις εσωτερικές περιοχές το καλοκαίρι. Το χειμώνα οι διαφορές αυτές είναι 8-10 ο C στις πεδινές περιοχές και 5-6 ο C στις ορεινές. Το καλοκαίρι αυτές αυξάνονται σε 16 ο C στην κεντρική πεδιάδα και σε 9-12 ο C στις άλλες περιοχές (Μετεωρολογική Υπηρεσία Κύπρου, Τον Ιούλιο και Αύγουστο οι μέσες ημερήσιες θερμοκρασίες κυμαίνονται μεταξύ 29 ο C στην κεντρική πεδιάδα και 22 ο C στις ψηλότερες κορυφές του Τροόδους, ενώ οι μέσες μέγιστες θερμοκρασίες στους μήνες αυτούς είναι 36 και 27 ο C αντίστοιχα (Μετεωρολογική Υπηρεσία της Κύπρου). Τον Ιανουάριο οι μέσες ημερήσιες θερμοκρασίες είναι 10 ο C στην κεντρική πεδιάδα και 3 ο C στις ψηλότερες κορυφές του Τροόδους, με μέσες ελάχιστες θερμοκρασίες 5 και 0 ο C αντίστοιχα Η ηλιοφάνεια Όλες οι περιοχές της Κύπρου έχουν μεγάλη διάρκεια ηλιοφάνειας σε σύγκριση με πολλές χώρες. Στις πεδινές περιοχές ο μέσος αριθμός ωρών ηλιοφάνειας για ολόκληρο το χρόνο είναι 75% των ωρών που ο ήλιος είναι επάνω από τον ορίζοντα. Σ όλη τη διάρκεια του καλοκαιριού η ηλιοφάνεια είναι κατά μέσον όρο 11,5 ώρες την ημέρα, ενώ στους μήνες Δεκέμβριο και Ιανουάριο που έχουν την πιο μεγάλη νέφωση η διάρκεια της ηλιοφάνειας ελαττώνεται μόνο στις 5,5 ώρες την ημέρα. Ακόμη και στις πιο ψηλές περιοχές του Τροόδους στους χειμερινούς μήνες με πολύ μεγάλη νέφωση, η μέση ηλιοφάνεια είναι περίπου 4 ώρες την ημέρα και στους μήνες Ιούνιο και Ιούλιο η τιμή αυτή φτάνει στις 11 ώρες. Η μεγαλύτερη δυνατή διάρκεια της ηλιοφάνειας (δηλαδή από την ανατολή μέχρι τη δύση του ήλιου) στην Κύπρο κυμαίνεται από 9,8 ώρες την ημέρα το Δεκέμβριο σε 14,5 ώρες την ημέρα τον Ιούνιο (Μετεωρολογική Υπηρεσία Κύπρου,

19 Εισαγωγή Οι άνεμοι Στην περιοχή της ανατολικής Μεσογείου οι γενικοί άνεμοι είναι κυρίως ελαφροί ως μέτριοι δυτικοί ή νοτιοδυτικοί το χειμώνα και βόρειοι ή βορειοδυτικοί το καλοκαίρι. Οι πολύ ισχυροί άνεμοι είναι σπάνιοι. Στις διάφορες περιοχές της Κύπρου οι γενικοί άνεμοι τροποποιούνται από τους τοπικούς ανέμους. Οι τοπικοί αυτοί άνεμοι είναι οι θαλάσσιες και απόγειες αύρες στις παράλιες περιοχές και οι αναβατικοί και καταβατικοί άνεμοι στις ορεινές περιοχές. Οι θαλάσσιες και απόγειες αύρες οι οποίες παρατηρούνται σε παράλιες περιοχές μπορούν να γίνουν αισθητές σε απόσταση μέχρι και 35 km περίπου από την παραλία. Αυτό το σύστημα κυκλοφορίας του αέρα οφείλεται βασικά στη διαφορά θερμοκρασίας μεταξύ της ξηράς από τη μια και του νερού της θάλασσας από την άλλη, που δημιουργεί διαφορές στην ατμοσφαιρική πίεση πάνω από την ξηρά και τη θάλασσα. Τα αντίστοιχα φαινόμενα στις ορεινές περιοχές είναι οι αναβατικοί άνεμοι (αύρες των κοιλάδων) την ημέρα και οι καταβατικοί άνεμοι (αύρες των ορέων) τη νύχτα. Και σ αυτή την περίπτωση η αιτία της δημιουργίας των τοπικών αυτών ανέμων είναι ο διαφορετικός βαθμός θέρμανσης ή ψύξης γειτονικών περιοχών. Σύμφωνα με δεδομένα της Μετεωρολογικής Υπηρεσίας Κύπρου ( οι θαλάσσιες αύρες στις παράλιες περιοχές και οι αναβατικοί άνεμοι στις ορεινές περιοχές έχουν τη μεγαλύτερή τους ένταση κατά τους καλοκαιρινούς μήνες, ενώ οι απόγειες αύρες στις παράλιες περιοχές και οι καταβατικοί άνεμοι στις ορεινές περιοχές έχουν τη μεγαλύτερή τους ένταση κατά τους χειμερινούς μήνες. Όσον αφορά στην ταχύτητα, οι άνεμοι στην περιοχή της Κύπρου είναι κυρίως ελαφροί ως μέτριοι. Οι ισχυροί άνεμοι με ταχύτητα 24 κόμβων και πάνω είναι μικρής διάρκειας και συμβαίνουν σε περιπτώσεις μεγάλης κακοκαιρίας. Οι πολύ ισχυροί άνεμοι (ταχύτητα ανέμου 34 κόμβοι και πάνω) είναι σπάνιοι και συμβαίνουν κυρίως στις προσήνεμες περιοχές όταν επηρεάζουν την Κύπρο συστήματα με πολύ χαμηλές πιέσεις

20 Εισαγωγή 1.4. Η ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΟΥ Εισαγωγή Το ποικιλόμορφο γεωμορφολογικό ανάγλυφο της Κύπρου και οι έντονες διακυμάνσεις στη θερμοκρασία και τη βροχόπτωση από περιοχή σε περιοχή, είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός πλήθους διαφορετικών οικοτόπων. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό τόσο με τη θέση της Κύπρου στη συμβολή τριών ηπείρων (Ευρώπης, Ασίας, Αφρικής) που την καθιστά μεταναστευτικό κέντρο, όσο και με τη μακραίωνη απομόνωση του νησιού, είχε ως αποτέλεσμα τη διαμόρφωση μιας πλούσιας και μοναδικής βιολογικής ποικιλότητας με ένα σημαντικό αριθμό ενδημικών ειδών. Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν την Κύπρο μια από τις πιο πλούσιες από άποψη βιοποικιλότητας περιοχές της Ευρώπης Το κυπριακό τοπίο Η απότομη, στενή και επιμήκης ασβεστολιθική οροσειρά του Πενταδακτύλου, ύψους 1024 m, εκτείνεται κατά μήκος της βόρειας παραλιακής πεδιάδας, που είναι σκεπασμένη με το πράσινο της ελιάς και της χαρουπιάς. Στα νότια, ο επιβλητικός ορεινός όγκος του Τροόδους με τις βαθιές καταπράσινες κοιλάδες και τις κορυφογραμμές, που φτάνει στην κορυφή του Ολύμπου τα 1951 m, φιλοξενεί μια εκπληκτική ποικιλία ορεινών βιότοπων. Το δυτικό μέρος της οροσειράς του Τροόδους καλύπτεται από το δάσος Πάφου που απλώνεται σε μια έκταση ha. με τη μοναδική και εξαιρετικά όμορφη Κοιλάδα των Κέδρων. Ανάμεσα στις δυο οροσειρές εκτείνεται η εύφορη πεδιάδα της Μεσαορίας. Το εσωτερικό της καλύπτεται από εκτεταμένες πεδιάδες, που διακόπτονται από λοφίσκους κάθε γεωμετρικού σχήματος και από δασοσκεπή βουνά. Στη βορειοδυτική πλευρά του νησιού βρίσκεται η χερσόνησος του Ακάμα, το πιο απόμακρο και απομονωμένο κομμάτι γης του νησιού. Ο Ακάμας αποτελεί μια μοναδική για τον τόπο μας παρθένα περιοχή με ποικιλόμορφα χαρακτηριστικά όπως η πλούσια χλωρίδα και πανίδα, όμορφες και θεαματικές ακρογιαλιές, μεγάλη ποικιλία βιοτόπων και ένα δυναμικό τοπίο με μεγάλη εναλλαγή γεωγραφικών μορφωμάτων

21 Εισαγωγή Η σημερινή Κύπρος διατηρεί εκτεταμένα δάση (κρατικά και ιδιωτικά) που καλύπτουν το 32 % της ολικής έκτασης του νησιού (περίπου 18,5% είναι τα ψηλά κρατικά δάση και 13,5% η μακκία βλάστηση) και κατανέμονται κυρίως στις οροσειρές του Τροόδους και του Πενταδακτύλου (Τμήμα Δασών Κύπρου, Οι χαμηλότεροι λόφοι καλύπτονται από θαμνώνες διαφόρων τύπων που εναλλάσσονται με καλλιέργειες και κατά τόπους με οικισμούς. Οι πεδινές περιοχές, με κύρια την εκτεταμένη πεδιάδα της Μεσαορίας, και η παράκτια ζώνη καλύπτονται από καλλιέργειες (περίπου 45% της έκτασης του νησιού) και οικισμούς, αλλά τοπικά διατηρούνται μεγαλύτερες ή μικρότερες εκτάσεις φυσικής ή ημι-φυσικής βλάστησης. Η Κύπρος χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός πλήθους διαφορετικών τύπων οικοτόπων. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη διαμόρφωση περιβάλλοντος που να είναι δυνατό να ικανοποιεί τις εξειδικευμένες απαιτήσεις και να φιλοξενεί ένα μεγάλο αριθμό φυτικών και ζωικών ειδών. Μέχρι στιγμής αναγνωρίστηκαν στην Κύπρο περισσότερα από 1900 φυτικά taxa, από τα οποία τα 143 είναι ενδημικά για το νησί Οι κυπριακοί οικότοποι Σύμφωνα με δεδομένα του Τμήματος Περιβάλλοντος Κύπρου ( και του Τμήματος Δασών Κύπρου ( του Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος Κύπρου αλλά και του Εικονικού Μουσείου Βιοποικιλότητας της Κύπρου ( η Κύπρος χαρακτηρίζεται από τους παρακάτω τύπους οικοτόπων: Τα θερμόφιλα πευκοδάση της τραχείας πεύκης (Pinus brutia) αποτελούν τα πλέον εκτεταμένα δάση, που εξαπλώνονται από το επίπεδο της θάλασσας μέχρι και τα 1400m, καλύπτοντας μεγάλο μέρος των οροσειρών του Τροόδους και του Πενταδακτύλου και μέρος της Χερσονήσου του Ακάμα (δάση Αδελφοί, Μαχαιρά και δάσος Πάφου). Τα δάση κυπαρισσιών (Cupressus sempervirens) εμφανίζονται μόνο στον Πενταδάκτυλο. Η ημιφυλλοβόλος βελανιδιά Quercus infectoria subsp. veneris σχηματίζει μεμονωμένες συστάδες στο δυτικό κυρίως μέρος του νησιού

22 Εισαγωγή Τα δάση μαύρης πεύκης (Pinus nigra subsp. pallasiana) και του ενδημικού κέδρου Cedrus brevifolia, καθώς και συστάδες ορεινών ειδών αρκεύθου (Juniperus foetidissima, J. oxycedrus, J. excelsa) εμφανίζονται στα μεγάλα υψόμετρα της οροσειράς του Τροόδους. Η χρυσόφυλλη δρυς (Quercus alnifolia) εμφανίζεται είτε στον υπόροφο των κωνοφόρων, είτε σε αμιγείς συστάδες, κυρίως σε υψόμετρα μεγαλύτερα των 700m, σε όλη την οροσειρά του Τροόδους. Οι θαμνώνες διαφόρων τύπων επικρατούν στη θερμο-μεσογειακή και την ημίξηρη ζώνη. Πιο συχνά εμφανίζεται η χαμηλή βλάστηση με τους αγκαθωτούς θαμνώνες των φρυγάνων. Σπανιότερα συναντάμε τους θαμνώνες με ελιά Olea europaea και χαρουπιά Ceratonia siliqua, καθώς επίσης και τους ψηλούς θαμνώνες με περνιά Quercus coccifera subsp. calliprinos. Στην παράκτια ζώνη είναι χαρακτηριστική η παρουσία των παράκτιων αόρατων Juniperus phoenicea matorral. Τα λιβάδια διαφόρων τύπων, σχηματίζονται σε ανοιχτές θέσεις, ανάμεσα στους θαμνώνες και σε ανοίγματα δασών ή σε παρυφές καλλιεργειών και δρόμων και σε εγκαταλειμμένες καλλιέργειες. Στην κατηγορία των υγρών λιβαδιών εντάσσονται οι μοναδικοί αλκαλικοί τυρφώνες που στην ουσία είναι ένας υγρότοπος με κοινότητες καλαμιών που χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό τύρφης (peat). Σχηματίζονται σε δύο μόνο γειτονικές θέσεις του Τροόδους, στο Αλμυρολίβαδο και στο Πασιά Λιβάδι, σε υψόμετρο περίπου m. Οι αμμώδεις ακτές είναι ως επί το πλείστον στενές, με αμμόφιλες κοινότητες σε χαμηλές πρωτογενείς ή κινούμενες θίνες. Εκτεταμένα αμμοθινικά συστήματα που περιλαμβάνουν και σταθεροποιημένες αμμοθίνες με θάμνους, με αμμόφιλα λιβάδια, ακόμα και υγρές κοιλότητες με υδρόφιλα είδη, αναπτύσσονται σε λίγες θέσεις, όπως για παράδειγμα στον Απόστολο Ανδρέα, στην Καρπασία και στον Ακάμα. Η παραποτάμια βλάστηση, μια ασυνεχής και μάλλον στενή λωρίδα, αναπτύσσεται κατά μήκος των ρυακιών που διασχίζουν το νησί, συχνά διαμέσου καλλιεργούμενης γης. Μόνιμες υδατοσυλλογές είναι μόνο τα τεχνητά φράγματα και υδατοδεξαμενές, που φιλοξενούν σημαντική υγρόφιλη βλάστηση

23 Εισαγωγή Οι χασμοφυτικές κοινωνίες που υπάρχουν σε βραχώδεις οικοτόπους, αναπτύσσονται σε ασβεστολιθικό υπόστρωμα (Ακάμας, Πενταδάκτυλος) ή σε πυριτικούς βράχους (Τρόοδος). Ενδημικές σερπεντινόφιλες χασμοφυτικές κοινότητες αναπτύσσονται σε διάφορες περιοχές, κυρίως στο Τρόοδος, τον Ακάμας και το Δάσος Λεμεσού. Οι υγροβιότοποι είναι μια σπάνια για τον τόπο κατηγορία βιότοπων. Οι πιο σημαντικοί από αυτούς είναι οι αλυκές της Λάρνακας και του Ακρωτηρίου και ο υγροβιότοπος στο Μερρά Ακρωτηρίου. Οι αλυκές παρά το γεγονός ότι είναι λίμνες το χειμώνα και αλμυρές έρημοι το καλοκαίρι, εντούτοις χαρακτηρίζονται από μια δυναμική οικολογική ισορροπία και συντηρούν μια εκπληκτική ποικιλία από πτηνά, αμφίβια, ερπετά, θηλαστικά και άλλους οργανισμούς που όλα μαζί συγκροτούν μια πολύπλοκη αλλά ευαίσθητη και εύθραυστη τροφική αλυσίδα. Η μεγάλη ποικιλότητα σε τοπία και τύπους οικοτόπων που εμφανίζεται στο νησί, αντικατοπτρίζεται στον αριθμό των διαφορετικών τύπων οικοτόπων της Κύπρου που έχουν περιληφθεί στο Παράρτημα Ι της Ευρωπαϊκής Οδηγίας των Οικοτόπων (92/43/EΟΚ). Συγκεκριμένα αναφέρεται ότι στην Κύπρο έχουν καταγραφεί 46 διαφορετικοί τύποι οικοτόπων του Παραρτήματος Ι της Οδηγίας των Οικοτόπων (92/43/EOK) Η πανίδα της Κύπρου Από την αρχή της δημιουργίας της, πριν 20 εκατ. χρόνια περίπου, η Κύπρος ήταν πάντα νησί. Κατά την περίοδο του Πλειστοκαίνου, πριν 1,5 εκατ. χρόνια, αποίκησαν την Κύπρο τα πρώτα ζώα της ξηράς. Αυτά ήταν ιπποπόταμοι και ελέφαντες, είδη που και τα δύο ήταν πολύ καλοί κολυμβητές. Έφτασαν εδώ, από γειτονικές περιοχές, και με το πέρασμα του χρόνου λόγω της απομόνωσης και της περιορισμένης τροφής εξελίχθηκαν σε πυγμαία είδη (Davis, 2003). Η πανίδα του Πλειστοκαίνου της Κύπρου χαρακτηρίζεται από υψηλό ενδημισμό και χαμηλή βιοποικιλότητα (Davis, 2003). Σε αυτήν περιλαμβάνονται είδη όπως ο πυγμαίος ελέφαντας (Elephas cypriotes), ο πυγμαίος ιπποπόταμος (Planourios minutes), μια μυγαλή (Crocidura suaveolens praecypria), ακόμα και ένα μη εξακριβωμένο είδος του γένους Mus (Marra, 2005)

24 Εισαγωγή Ο ιπποπόταμος Planourios minutes, αισθητά μικρότερος σε μέγεθος, με ιδιαίτερες μορφολογικές διαφοροποιήσεις από τον κοινό ιπποπόταμο, Hippopotamus amphibius, είναι το πιο κοινό είδος ανάμεσα στα απολιθώματα των σπονδυλωτών που έχουν βρεθεί. Ο ελέφαντας Elephas cypriotes πιθανώς είχε προέλθει από το είδος Elephas aquaticus, με αξιοσημείωτη διαφοροποίηση ως προς το μέγεθός του. Απολιθώματα αυτών των πυγμαίων ελεφάντων (Elephas cypriotes) και ιπποπόταμων (Planourios minutes) βρέθηκαν σε σπηλιές. Για πολλά χρόνια τα δεδομένα που υπήρχαν έδειχναν ότι η αποίκηση της Κύπρου από τον άνθρωπο πραγματοποιήθηκε περίπου πριν από 9000 χρόνια. Όμως όπως έδειξαν οι ανασκαφές στον οικισμό Αετόκρεμμο στο Ακρωτήρι (Simmons, 1988), οι άνθρωποι αποίκησαν την Κύπρο πριν από χρόνια. Με την παρουσία των πρώτων ανθρώπων στο νησί, εκατοντάδες τέτοια θηλαστικά θανατώθηκαν από τον άνθρωπο και κατατεμαχίστηκαν με σκοπό τη διατροφή του, με αποτέλεσμα τελικά τα ζώα αυτά να εξαφανιστούν πριν από 8-10 χιλιάδες χρόνια. Σύμφωνα όμως με τους Guilaine et al. (2000) και Davis (2003), τα απολιθώματα αυτά (ηλικίας περίπου 9000 χρόνων) δεν επιβεβαιώνουν με σαφήνεια τη συνύπαρξη των ειδών αυτών με τον άνθρωπο και την εξαφάνισή τους εξαιτίας του. Θεωρούν ότι η πανίδα της εποχής μπορεί να έχει εξαφανιστεί είτε πριν, είτε αμέσως μετά την απόβαση του ανθρώπου στο νησί, πιθανώς λόγω ανταγωνισμού με τα είδη που εισήχθησαν από τον άνθρωπο και δραπέτευσαν, σχηματίζοντας άγριους πληθυσμούς (Davis, 2003). Εκτός από ένα σχετικά μικρό αριθμό σκίουρων και ποντικών, αυτά τα μεγάλα θηλαστικά ήταν τα μόνα θηλαστικά που κυριαρχούσαν στο νησί. Σημαντικό είναι το γεγονός ότι στην Κύπρο δεν υπήρξαν ποτέ αρπακτικά σαρκοφάγα ζώα, όπως οι αρκούδες και τα αιλουροειδή. Σε πιο πρόσφατες εποχές διάφορα είδη της κυπριακής πανίδας, στα οποία αναφέρονται συγγραφείς από τον 15 ο μέχρι τον 19 ο αιώνα, έχουν εξαφανιστεί ή ελαττωθεί σε πολύ σημαντικό βαθμό (Ενημερωτικό Φυλλάδιο Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος, 2004). Τέτοια είδη είναι τα εξής: το Ελάφι της Μεσοποταμίας (Dama dama mesopotamica) το Πλατώνι (Dama dama) το Κοινό ελάφι (Cervus elaphus) η Νυφίτσα (Mustela nivalis) ο Αγριόγατος (Felis silvestris)

25 Εισαγωγή Σήμερα, η Κύπρος χαρακτηρίζεται από την πλούσια πανίδα της, η οποία περιλαμβάνει μεταξύ άλλων: 38 είδη θηλαστικών (Πίνακας 1), από τα οποία 34 είναι χερσόβια θηλαστικά, (22 από αυτά τα είδη ανήκουν στα χειρόπτερα) και 4 είδη είναι θαλάσσια θηλαστικά (Fauna Europaea Web Service, 2004 Wilson & Reeder, 2005). Ένα είδος θηλαστικού, το ποντίκι Mus cypriacus, είναι ενδημικό της Κύπρου (Cucchi et al., 2006). 370 είδη πτηνών τα οποία ανήκουν σε 61 οικογένειες. Η κυπριακή ορνιθοπανίδα, σύμφωνα με τον Πτηνολογικό Σύνδεσμο Κύπρου ( περιλαμβάνει 324 μεταναστευτικά είδη, εκ των οποίων 200 είναι κοινά μεταναστευτικά, 90 είναι χειμερινοί επισκέπτες, 20 είναι τυχαίοι επισκέπτες, 27 είναι τυχαίοι χειμερινοί επισκέπτες και 27 είναι μετανάστες αναπαραγωγής. Επίσης περιλαμβάνει 46 είδη μόνιμων κατοίκων, εκ των οποίων 2 είναι ενδημικά είδη και 5 είναι ενδημικά υποείδη. 24 είδη ερπετών (Ενημερωτικό Φυλλάδιο Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος, 2004). Από τα 10 είδη φιδιών, ένα μόνο είδος θεωρείται ενδημικό, το Coluber cypriensis, καθώς και δύο υποείδη, τα Natrix natrix cypriaca και Telescopus fallax cyprianus. Τρία από τα είδη φιδιών που ζουν στην Κύπρο είναι δηλητηριώδη, αλλά μόνον ένα είναι επικίνδυνο για τον άνθρωπο, η Macrovipera lebetina (η γνωστή στην Κύπρο ως "φίνα"). Στις σαύρες ανήκουν 11 είδη της κυπριακής πανίδας και τρεις σαύρες σε επίπεδο υποείδους θεωρούνται ενδημικές της Κύπρου. Η ερπετοπανίδα της Κύπρου συμπληρώνεται από την παρουσία 3 χελωνών (δύο θαλάσσιων και μίας του γλυκού νερού). 3 είδη αμφιβίων (Ενημερωτικό Φυλλάδιο Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος, 2004), τον δενδρόβιο βάτραχο, Hyla savignyi, τον βαλτόβιο βάτραχο, Pelophylax bedriage και τον πράσινο φρύνο, Pseudepidalea viridis. 200 είδη ψαριών, και

26 Εισαγωγή περισσότερα από είδη εντόμων. Σύμφωνα με το Fauna Europaea (Fauna Europaea Web Service, 2004) στην Κύπρο έχουν ήδη αναγνωριστεί γύρω στα είδη εντόμων αλλά ο αριθμός τους πιστεύεται πως ανέρχεται στα 5000 είδη. Εξέχουσα θέση μεταξύ τους κατέχουν οι πεταλούδες (τάξη Λεπιδόπτερα) και έχουν μελετηθεί επαρκώς. Έχουν ήδη αναγνωρισθεί 52 είδη πεταλούδων, από τα οποία τα 9 είναι ενδημικά Τα θηλαστικά Μεταξύ των ειδών της πανίδας των χερσόβιων θηλαστικών, το πιο μεγαλόσωμο άγριο ζώο που συναντούμε σήμερα ελεύθερο στο φυσικό περιβάλλον του νησιού είναι το αγρινό (Ovis aries), ένα είδος άγριου προβάτου που είναι σπάνιο στην Κύπρο. Κατά τον Μεσαίωνα το είδος αυτό κυριαρχούσε σχεδόν σε όλα τα μέρη του νησιού και σε μεγάλους αριθμούς. Το αγρινό αποτελούσε εκλεκτό είδος κυνηγιού για την αριστοκρατία της εποχής όπως απεικονίζεται και σε ρωμαϊκά μωσαϊκά στην Οικία του Διονύσου στην Κάτω Πάφο. Από το έντονο κυνήγι το αγρινό άγγιξε τα όρια της εξαφάνισης κατά το 1937 με μόνο 15 ζώα να επιβιώνουν. Ευτυχώς, σήμερα και χάρη στη λήψη νομοθετικών μέτρων και την προστασία του δάσους Πάφου, που είναι ο κατ εξοχή βιότοπος του ζώου, το αγρινό έχει ξεφύγει τον κίνδυνο του πλήρους αφανισμού. Το πλατώνι της Μεσοποταμίας (Dama dama mesopotamica) φαίνεται ότι εξαφανίστηκε σχετικά πρόσφατα, πριν από 400 περίπου χρόνια, ίσως λόγω εντατικού κυνηγιού. Η αλεπού (Vulpes vulpes) είναι το μόνο σαρκοφάγο θηλαστικό της περιοχής. Αν και συναντάται σε όλες τις περιοχές, ο πληθυσμός της έχει μειωθεί αισθητά, επειδή κυνηγήθηκε ανελέητα κατά τις δεκαετίες ως επιβλαβής για την κτηνοτροφία. Παρόλα αυτά σήμερα, μετά από επιστημονικές έρευνες, έχει αποδειχθεί ότι είναι οικολογικά ωφέλιμη και προστατεύεται στις χώρες της Ευρώπης. Ωστόσο ακόμη υπάρχει προκατάληψη απέναντί της, ιδιαίτερα από τους κυνηγούς, εξαιτίας των κοινών τους θηραμάτων. Η Κύπρος χαρακτηρίζεται από ένα ενδημικό υποείδος λαγού, το Lepus europaeus cyprius. Είναι το κύριο και μεγαλύτερο θηραματικό είδος. Ζει σε όλες τις επαρχίες και σε υψόμετρο μέχρι 1800 m. Απαντάται σε ικανοποιητικούς αριθμούς, παρά την ισχυρή πίεση που δέχεται από το εντατικό κυνήγι. Ο κυπριακός γάιδαρος θεωρείται ότι προέρχεται από το άγριο είδος Equus asinus της βόρειας Αφρικής. Η πλειονότητα των ατόμων του είδους συναντάται στο

27 Εισαγωγή βόρειο τμήμα της Κύπρου, στη χερσόνησο της Καρπασίας. Δυστυχώς, είναι είδος προς εξαφάνιση αφού ελάχιστα έχουν παραμείνει στο νησί. Ο αριθμός τους δεν έχει εξακριβωθεί, ωστόσο σύμφωνα με υπολογισμούς ο πληθυσμός τους ανέρχεται στα 300 άτομα. Γενικά, θα μπορούσε να λεχθεί ότι η πανίδα της Κύπρου παρουσιάζει μια ανομοιομορφία ως προς το βαθμό μελέτης και γνώσης της. Υπάρχουν βέβαια ομάδες όπως τα πουλιά, τα θηλαστικά, τα ερπετά και τα ψάρια που είναι λίγο-πολύ γνωστά

28 Εισαγωγή Πίνακας 1: Τα αρτίγονα είδη (με έντονα στοιχεία τα ενδημικά) και τα ενδημικά υποείδη θηλαστικών που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα στην Κύπρο (Fauna Europaea Web Service, 2004 Wilson & Reeder, 2005). Τάξη Είδος Υποείδος Λαγόμορφα Lepus europaeus L. e. cyprius Μυγαλόμορφα Crocidura suaveolens Suncus etruscus Ακανθοχοιρόμορφα Hemiechinus auritus H. a. dorotheae Χειρόπτερα Σαρκοφάγα Περισσοδάκτυλα Αρτιοδάκτυλα Κητώδη Τρωκτικά Rousettus aegyptiacus Rhinolophus ferrumequinum Rhinolophus hipposideros Rhinolophus euryale Rhinolophus mehelyi Rhinolophus blasii Myotis blythii Myotis nattereri Myotis emarginatus Myotis capaccinii Eptesicus serotinus Eptesicus anatolicus Hypsugo savii Pipistrellus pipistrellus Pipistrellus pygmaeus Pipistrellus kuhlii Nyctalus noctula Nyctalus leisleri Nyctalus lasiopterus Plecotus austriacus Miniopterus schreibersii Tadarida teniotis Vulpes vulpes Monachus monachus Equus asinus Ovis aries Delphinus delphis Stenella coeruleoalba Tursiops truncatus Acomys nesiotes Mus cypriacus Mus musculus Rattus rattus Rattus norvegicus M. m. domesticus R. r. frugivorus

29 Εισαγωγή Όμως ομάδες, όπως αυτές των εντόμων που είναι και τα περισσότερα σε αριθμό ειδών, είναι πολύ λιγότερο γνωστές. Ακόμα λιγότερα πράγματα γνωρίζουμε για τα μικροθηλαστικά, για τον τρόπο ζωής τους, τη χρησιμότητα και τον ρόλο τους στο οικοσύστημα, καθώς και την κατάσταση των πληθυσμών τους λόγω της αυξανόμενης επίδρασης του ανθρώπου. Όπως φαίνεται στον πίνακα 2 τα μικροθηλαστικά που απαντώνται στην Κύπρο είναι 1 είδος ακανθοχοιρόμορφου, 2 είδη μυγαλομόρφων και 5 είδη τρωκτικών: Πίνακας 2: Τα είδη των μικροθηλαστικών που απαντώνται στην Κύπρο Οικογένεια Είδος / Υποείδος Κοινή ονομασία Erinaceidae Soricidae Muridae Hemiechinus auritus, Gmelin, 1770 / H. a. dorotheae, Boye, 1991 Crocidura suaveolens, Pallas, 1811 Suncus etruscus, Savi, 1822 Rattus rattus, Linnaeus, 1758 / R. r. frugivorus, Rafinesque, 1814 Rattus norvegicus, Berkenhout, 1769 Mus musculus, Linnaeus, 1758 / M. m. domesticus, Schwarz & Schwarz, 1943 Mus cypriacus, Cucchi, 2006 Acomys nesiotes, Bate, 1903 Ασιατικός σκαντζόχοιρος Μυγαλή Ετρουσκομυγαλή Μαυροποντικός Δεκατιστής Σπιτικός ποντικός ή σταχτοποντικός Κυπριακός ποντικός Ακανθοποντικός της Κύπρου Ο κυπριακός σκαντζόχοιρος, Hemiechinus auritus dorotheae είναι το μοναδικό ακανθοχοιρόμορφο και το δεύτερο ενδημικό υποείδος θηλαστικού του νησιού. Όπως συμβαίνει με τα περισσότερα μικρά θηλαστικά που ζουν κοντά σε κατοικημένες περιοχές, τα αυτοκίνητα αποτελούν τη μεγαλύτερη απειλή για τους σκαντζόχοιρους. Άλλη συνηθισμένη αιτία κινδύνου που προέρχεται από τον άνθρωπο είναι η χρήση εντομοκτόνων. Τα δύο είδη του γένους Rattus, ο μαυροποντικός (Rattus rattus frugivorus) και ο δεκατιστής (Rattus norvegicus) προκαλούν αρκετές επιπτώσεις σε τοπικά είδη πτηνών και σε γεωργικές καλλιέργειες. Επίσης καταναλώνουν μεγάλες ποσότητες σπερμάτων κωνοφόρων δέντρων δυσκολεύοντας την αναγέννησή τους. Ο ακανθοποντικός της Κύπρου (Acomys nesiotes) είναι ένα από τα δύο ενδημικά είδη θηλαστικών και μάλιστα τρωκτικών που συναντώνται στην Κύπρο. Δεν υπάρχουν δεδομένα για το συγκεκριμένο είδος για την περίοδο Το

30 Εισαγωγή 2007 εντοπίστηκαν τέσσερα άτομα του είδους στην περιοχή της κατεχόμενης Λευκωσίας σε υψόμετρο 600m (Kryštufek & Amori, 2008). Θεωρείται ότι η κατανομή του εξαπλώνεται στις βραχώδεις περιοχές του Τροόδους και της Κερύνειας. Η ετρουσκομυγαλή (Suncus etruscus) είναι ένα από τα μικρότερα είδη θηλαστικών, αφού τα ενήλικα άτομα του είδους ζυγίζουν 1,5-2,5g. Στις μεσογειακές χώρες συναντάται σε περιοχές που καλύπτονται από χαμηλή μακκία βλάστηση αλλά και σε κήπους (Μacdοnald & Barrett, 1993). Τα άτομα του είδους Crocidura suaveolens (μυγαλή) χαρακτηρίζονται από λευκά δόντια, αλλά παρουσιάζουν μεγαλύτερη ποικιλομορφία στο μέγεθος των δοντιών τους σε σχέση με άλλα είδη μυγαλών που φέρουν λευκά δόντια (Μacdοnald & Barrett, 1993). Ζει σε περιοχές με ψηλή βλάστηση που παρέχουν προστασία

31 Εισαγωγή Τα θηλαστικά της παρούσας εργασίας Mus musculus domesticus Συστηματική κατάταξη Βασίλειο (Kingdom): Ζώα (Animalia) Φύλο (Phylum): Χορδωτά (Chordata) Υπόφυλο (Subphylum): Σπονδυλωτά (Vertebrata) Κλάση (Class): Θηλαστικά (Mammalia) Τάξη (Order): Τρωκτικά (Rodentia) Υπόταξη (Suborder): Μυόμορφα (Myomorpha) Οικογένεια (Family): Muridae Υποοικογένεια (Subfamily): Murinae Γένος (Genus): Mus Είδος (Species): Mus musculus Υποείδος (Subspecies): Mus musculus domesticus Εικόνα 4: Άτομο του σπιτικού ποντικού Mus musculus domesticus. Μορφολογικά χαρακτηριστικά Το τρίχωμα του σπιτικού ποντικού (Εικόνα 4) εμφανίζει ένα ομοιόμορφο γκρίζο - καφετί χρωματισμό στο ραχιαίο μέρος του σώματός του, ενώ κοιλιακά είναι ελαφρά πιο ανοικτό. Τα μάτια του είναι σχετικά μικρά σε μέγεθος, τα πτερύγια των αυτιών του αρκετά μεγάλα και το ρύγχος του οξύληκτο. Η ουρά του έχει σχεδόν το ίδιο μήκος με το μήκος του κεφαλοκορμού του και φέρει επιδερμικούς μεταμερικούς δακτυλίους (Μacdοnald & Barrett, 1993). Το μήκος του σώματος των ενήλικων ατόμων (εξαιρουμένης της ουράς) είναι mm. Η ουρά έχει μήκος mm, ενώ το μήκος του οπίσθιου ακροποδίου είναι mm (Cucchi et al., 2006). Τέλος, το βάρος των ενηλίκων ατόμων κυμαίνεται από 12 έως 22 g, με τα θηλυκά να έχουν μέσο βάρος 14,6 g και τα αρσενικά 15,8 g. Ο οδοντικός τύπος είναι 1/1, 0/0, 0/0, 3/3 = 16. Οι κοπτήρες της άνω γνάθου έχουν μια διακριτή εγκοπή στην οπίσθια επιφάνεια του ελεύθερου άκρου τους, η οποία είναι ορατή σε πλάγια όψη (Μacdοnald & Barrett, 1993)

32 Εισαγωγή Βιότοπος Ο σταχτοποντικός στην Κύπρο είναι κοινός σε μια μεγάλη ποικιλία αστικών οικοτόπων, όπως κατοικίες, εργοστάσια και αποθήκες. Σε αγροτικές περιοχές συναντάται σε αγροικίες, αποθήκες σιτηρών, χοιροστάσια, φράκτες, ακόμη και σε χώρους ρίψης απορριμμάτων. Απαντάται επίσης και σε φυσικούς οικοτόπους, αλλά όχι τόσο συχνά. Οι πληθυσμοί του είδους που διαβιούν κοντά σε ανθρωπογενείς περιοχές (commensal populations) είναι κατά πολύ μεγαλύτεροι από τους αγροδίαιτους πληθυσμούς (field populations) και δεν συνηθίζουν να συλλέγουν τροφή και να την αποθηκεύουν στη φωλιά τους. Όταν οι κλιματικές συνθήκες μιας περιοχής είναι ευνοϊκές (π.χ. σε περιοχές γύρω από τη λεκάνη της Μεσογείου), οι σπιτικοί ποντικοί μπορεί να επαναστραφούν σε φυσικούς οικοτόπους και να επιβιώσουν ανεξάρτητα από τον άνθρωπο. Αυτό το γεγονός είναι πολύ συνηθισμένο σε νησιωτικούς πληθυσμούς του είδους. Οι στοές που σκάβουν στο έδαφος έχουν κυκλική διατομή και μία μόνο είσοδο η οποία επικοινωνεί με τη φωλιά που βρίσκεται περίπου σε βάθος 20cm. Οι σπιτικοί ποντικοί μπορούν να συλλέξουν και να αποθηκεύσουν στη φωλιά τους μεγάλη ποσότητα τροφής. Σε αστικά κτίσματα, κατασκευάζουν τις φωλιές τους από οποιοδήποτε διαθέσιμο υλικό αλλά και σε οποιοδήποτε σημείο έχουν πρόσβαση, πχ κάτω από ξύλινα δάπεδα ή ανάμεσα σε στοιβαγμένα αντικείμενα (Macdonald & Barrett, 1993). Έχει καταγραφεί η μετακίνηση ορισμένων σταχτοποντικών μέχρι και 2400 m μακριά από τη φωλιά τους, αλλά συνήθως μετακινούνται σε μικρότερες αποστάσεις, ειδικά όταν διαβιούν σε κτίσματα, οπότε η μετακίνησή τους περιορίζεται κατά κανόνα στα 3-10 m, ενώ σπάνια διασχίζουν δρόμους ή περιοχές χωρίς κάποιο είδος κάλυψης. Η απόσταση των μετακινήσεων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη διαθεσιμότητα τροφής. Άτομα του είδους πολύ συχνά μεταφέρονται τυχαία σε μεγάλες αποστάσεις από τον άνθρωπο. Συμπεριφορά Είναι κυρίως νυκτόβιος οργανισμός αφού οι περισσότερες μετακινήσεις του, η πρόσληψη τροφής και νερού γίνονται κυρίως κατά τις νυκτερινές ώρες, ενώ αναπαύεται την ημέρα

33 Εισαγωγή Τροφή Είναι παμφάγο ζώο, η διατροφή του περιλαμβάνει σχεδόν τα πάντα, όμως εμφανίζει προτίμηση προς τους καρπούς των δημητριακών. Η μέση κατανάλωση τροφής είναι της τάξης των 3,5 g ανά ημέρα. Μπορεί να χρησιμοποιήσει μέχρι και 20 διαφορετικές πηγές τροφής σε μια μόνο νυκτερινή έξοδο, ενώ εάν υπάρχει μόνο μία πηγή τροφής μπορεί να πραγματοποιήσει μέχρι και 200 επισκέψεις σ' αυτήν, προσλαμβάνοντας ποσότητα 20 mg κάθε φορά. Οι σταχτοποντικοί καταναλώνουν κυρίως τροφές πλούσιες σε λίπη και πρωτεΐνες, ενώ σε δεύτερη προτίμηση έχουν τα φρούτα και τα λαχανικά. Σε ανθρωπογενείς οικοτόπους μπορεί περιστασιακά να καταναλώσουν και ουσίες όπως πλαστικό, σαπούνι και κόλλα, ενώ σε φυσικούς οικοτόπους μπορεί να καταναλώσουν προνύμφες εντόμων, ρίζες, σκώληκες και αρθρόποδα (Macdonald & Barrett, 1993). Αναπαραγωγή Ο σπιτικός ποντικός μπορεί να αναπαράγεται καθ όλη τη διάρκεια του έτους εφόσον η τροφή είναι επαρκής. Τα θηλυκά γεννούν 5-10 φορές ανά έτος, 4-8 νεογνά κάθε φορά. Στους πληθυσμούς των αγροτικών οικοτόπων η αναπαραγωγή εμφανίζει εποχικότητα, με τη μέγιστη αναπαραγωγική δραστηριότητα να εμφανίζεται τον Μάιο και τον Ιούνιο. Η αναπαραγωγική ωριμότητα εμφανίζεται σε ηλικία 8-12 εβδομάδων ή όταν αποκτήσουν βάρος μεταξύ 7,5-10 g. Εικόνα 5: Νεογνό Mus musculus domesticus. γυμνό, με κλειστά μάτια και αυτιά. Ο αριθμός των γεννών ανά έτος επηρεάζεται και από το περιβάλλον των ποντικών. Έτσι, σε φυσικούς πληθυσμούς οι γέννες ανά έτος είναι κατά μέσο όρο 10,2, ενώ σε αστικούς είναι μόνο 5,5. Τα νεογνά κατά τη γέννησή τους ζυγίζουν 0,8-1,5g (Εικόνα 5) και τρέφονται με γάλα από τη μητέρα η οποία Εικόνα 6: Mus musculus domesticus. φέρει 5 ζεύγη θηλών (Εικόνα 6). Σε 3 Θηλασμός νεαρού ατόμου 7 ημερών. εβδομάδες τα νεαρά άτομα τρέφονται

34 Εισαγωγή πλέον με στερεά τροφή και αρχίζουν τις εξόδους τους από τη φωλιά. Τα θηλυκά άτομα φροντίζουν αποκλειστικά τα νεογνά μέχρι τον απογαλακτισμό τους. Σε ελάχιστες περιπτώσεις συμβάλλουν και τα αρσενικά. Τα θηλυκά άτομα κατασκευάζουν τις φωλιές από ξερά χόρτα, χαρτί ή οποιοδήποτε άλλο διαθέσιμο υλικό. Όταν η πυκνότητα του πληθυσμού είναι υψηλή ή οι ευνοϊκές θέσεις για δημιουργία φωλιάς είναι περιορισμένες, τα άτομα του πληθυσμού μοιράζονται τις φωλιές, και στις περιπτώσεις αυτές τα θηλυκά θηλάζουν αδιακρίτως όλα τα νεογνά της φωλιάς (Macdonald & Barrett, 1993)

35 Εισαγωγή Mus cypriacus Συστηματική κατάταξη Βασίλειο (Kingdom): Ζώα (Animalia) Φύλο (Phylum): Χορδωτά (Chordata) Υπόφυλο (Subphylum): Σπονδυλωτά (Vertebrata) Κλάση (Class): Θηλαστικά (Mammalia) Τάξη (Order): Τρωκτικά (Rodentia) Υπόταξη (Suborder): Μυόμορφα (Myomorpha) Οικογένεια (Family): Muridae Υποοικογένεια (Subfamily): Murinae Γένος (Genus): Mus Είδος (Species): Mus cypriacus Εικόνα 7: Άτομο του κυπριακού ποντικού Mus cypriacus. Μορφολογικά χαρακτηριστικά Ο κυπριακός ποντικός (Εικόνα 7) εμφανίζει εξωτερικά τα τυπικά χαρακτηριστικά του γένους του. Το τρίχωμά του εμφανίζει ένα ομοιόμορφο γκρίζο - καφετί χρωματισμό στο ραχιαίο μέρος του σώματός του, ενώ κοιλιακά το χρώμα είναι ελαφρά πιο ανοικτό έως λευκό. Το ρύγχος του είναι οξύληκτο και τα πτερύγια των αυτιών του είναι πολύ μεγάλα σε σχέση με τα υπόλοιπα είδη του γένους Μus. Σύμφωνα με τους Cucchi et al., 2006, στην οπίσθια επιφάνειά τους τα πτερύγια των αυτιών φέρουν λευκό τρίχωμα. Τα μάτια του είναι επίσης πολύ μεγαλύτερα και προεξέχοντα. Η ουρά του είναι μεγάλη σε μήκος σε σχέση με τον κεφαλοκορμό του (αν και συνήθως λίγο μικρότερη από την ουρά του M. musculus domesticus) και χαρακτηρίζεται από μεταμερικούς δακτυλίους (Cucchi et al., 2006). Το μήκος του σώματος (των ενηλίκων ατόμων εξαιρουμένης της ουράς) είναι mm. Η ουρά έχει μήκος mm, ενώ το μήκος του οπίσθιου ακροποδίου είναι mm. Ο οδοντικός τύπος του είδους είναι 1/1, 0/0, 0/0, 3/3 = 16, με τους κοπτήρες της άνω γνάθου να έχουν μια διακριτή εγκοπή στην οπίσθια επιφάνεια του ελεύθερου άκρου του, η οποία είναι ορατή σε πλάγια όψη (Cucchi et al., 2006)

36 Εισαγωγή Βιότοπος Το είδος αυτό ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα (Cucchi et al., 2006) και θεωρείται ότι είναι αγροδίαιτο είδος, το οποίο εξαπλώνεται στην περιοχή του Όρους Τρόοδος σε υψόμετρο m. Ο βιότοπός του περιλαμβάνει εγκαταλειμμένους αμπελώνες, λιβάδια και θαμνώδεις εκτάσεις. Σε υψόμετρο m θεωρείται από τους ίδιους μελετητές ότι ζει συντοπικά με τον σπιτικό ποντικό σε παραποτάμια δάση. Κατά τους ίδιους ερευνητές δεν εξαπλώνεται σε περιοχές με υψόμετρο χαμηλότερο των 100m, καθώς και σε περιοχές με ισχυρή ανθρωπογενή πίεση, όπως καλλιέργειες στη Μεσαορία (στο κεντρικό τμήμα του νησιού), ανθρώπινες κατοικίες και φάρμες, όπου εξαπλώνεται κυρίως το Mus musculus domesticus. Συμπεριφορά Όπως και ο σπιτικός ποντικός, είναι νυκτόβιος οργανισμός αφού οι περισσότερες μετακινήσεις του, η πρόσληψη τροφής και νερού γίνονται κυρίως κατά τις νυκτερινές ώρες, ενώ αναπαύεται την ημέρα. Τροφή Είναι παμφάγο ζώο, η διατροφή του περιλαμβάνει σχεδόν τα πάντα, όμως εμφανίζει προτίμηση προς τους καρπούς των δημητριακών. Αναπαραγωγή Μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν στοιχεία που να αφορούν στην αναπαραγωγική δραστηριότητα του είδους

37 Εισαγωγή 1.5. Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΥΨΟΜΕΤΡΟΥ ΣΤΗΝ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ Οι δύο περιοχές συλλογής δεδομένων έχουν ως κύριο διαχωριστικό γνώρισμα την υψομετρική διαφορά, στην οποία αποδίδονται και όλα τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά τους. Το υψόμετρο επηρεάζει τις κύριες κλιματικές παραμέτρους όπως είναι η ατμοσφαιρική πίεση, η θερμοκρασία, η διαθεσιμότητα νερού και ο άνεμος. Αποτέλεσμα είναι η ανάπτυξη διαφορετικών τύπων οικοτόπων (Λυκάκης, 1996 Brown & Lomolino, 1998 Emberlin, 2002) Η ατμοσφαιρική πίεση Η πτώση της ατμοσφαιρικής πίεσης με την αύξηση του υψομέτρου οφείλεται σε δύο αίτια (Brown & Lomolino, 1998), τα οποία σχετίζονται και τα δύο με τη βαρύτητα: 1. Η δύναμη με την οποία έλκει η γη τα μόρια του αέρα είναι μεγαλύτερη για τα μόρια τα οποία βρίσκονται σε μικρότερη απόσταση από τη γη, παρά σε εκείνα που βρίσκονται μακρύτερα. Αυτό σημαίνει ότι τα πρώτα έχουν μεγαλύτερο «βάρος», μειώνεται έτσι η απόσταση μεταξύ τους και αυξάνεται η πίεση. 2. Μόρια τα οποία βρίσκονται σε μεγαλύτερη απόσταση από τη γη έχουν αφενός μικρότερο «βάρος», αφετέρου ασκούν πίεση με το βάρος τους στα μόρια που βρίσκονται σε κατώτερο επίπεδο από αυτά. Ως αποτέλεσμα, τα μόρια του κατώτερου επιπέδου, επειδή στηρίζουν τα μόρια του ανώτερου επιπέδου, αναπτύσσουν μεγαλύτερη πίεση μεταξύ τους. Η χαμηλή ατμοσφαιρική πίεση θεωρείται ότι δεν επιδρά άμεσα στους οργανισμούς αλλά έμμεσα, προκαλώντας αλυσιδωτές αλλαγές σε μια σειρά άλλων φυσικών παραγόντων όπως είναι μεταβολές στη θερμοκρασία, την ακτινοβολία τη διαθεσιμότητα νερού, τον άνεμο κ.τ.λ Η θερμοκρασία Η θερμοκρασία έχει άμεσες επιπτώσεις πάνω στους οργανισμούς καθώς επηρεάζει το ρυθμό των χημικών αντιδράσεων. Έμμεσα, σε συνδυασμό με το φως και το νερό επηρεάζει τη φωτοσύνθεση αλλά και την απώλεια υγρασίας από τους οργανισμούς. Οι διακυμάνσεις της θερμοκρασίας είναι έντονες στο χώρο και το

38 Εισαγωγή χρόνο, με αποτέλεσμα οι οργανισμοί να εμφανίζουν διαφορετικό εύρος αντοχής (στενόθερμα και ευρύθερμα είδη) ή ακόμα και διαφορετικούς μηχανισμούς για τον έλεγχο των εσωτερικών τους θερμοκρασιών (εξώθερμα και ενδόθερμα είδη). Η πτώση της θερμοκρασίας με την αύξηση του υψομέτρου είναι άμεσο επακόλουθο της πτώσης της πίεσης. Για κάθε 1000 m αύξησης του υψομέτρου, η πτώση της θερμοκρασίας είναι της τάξης των 6 ο C. Η πτώση αυτή, εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, σημαντικότεροι από τους οποίους είναι η παρουσία μεγάλων ηπειρωτικών εκτάσεων, ο όγκος του βουνού και το γεωγραφικό πλάτος στο οποίο βρίσκεται Η διαθεσιμότητα νερού Η διαθεσιμότητα νερού εξαρτάται από την κατακράτηση των ατμοσφαιρικών κατακρημνισμάτων. Στα ατμοσφαιρικά κατακρημνίσματα περιλαμβάνονται το χιόνι, το χιονόβροχο, η καταιγίδα, το χαλάζι, η ομίχλη, η δρόσος, η πάχνη και κυρίως η βροχόπτωση. Η κατανομή της θερμοκρασίας, των ανέμων και των ρευμάτων επηρεάζουν τις βροχοπτώσεις, συνεπώς και τη διαθεσιμότητα νερού. Στις εύκρατες περιοχές, η ποσότητα των ατμοσφαιρικών κατακρημνισμάτων είναι μεγαλύτερη με την αύξηση του υψομέτρου Η ακτινοβολία H ακτινοβολία στα μεγάλα υψόμετρα είναι πιο έντονη σε σχέση με περιοχές χαμηλότερου υψομέτρου, εξαιτίας της χαμηλής ατμοσφαιρικής πίεσης. Αποτελεί έναν πολύ ισχυρό περιοριστικό παράγοντα για τους οργανισμούς, τόσο λόγω των άμεσων επιπτώσεών της, όσο και έμμεσα, λόγω του ότι συμβάλλει στην αύξηση της ατμοσφαιρικής ξηρασίας Το έδαφος Το έδαφος μπορεί να οριστεί ως το άνω αποσαθρωμένο τμήμα του φλοιού της γης που έχει διαμορφωθεί από τα φυτά και τα ζώα. Η ανάπτυξη των φυτών εξαρτάται από τα φυσικά και χημικά συστατικά του εδάφους

39 Εισαγωγή Η τοπογραφία (ανάγλυφο του εδάφους, η γωνία κλίσης του εδάφους, ο προσανατολισμός της επιφάνειάς του και το υψόμετρο) μπορεί να προκαλέσει διακυμάνσεις στην ένταση του φωτός σε μια περιοχή. Συγκεκριμένα, η γωνία και ο προσανατολισμός των κεκλιμένων επιφανειών επηρεάζουν σημαντικά τα ποσά της φωτεινής ενέργειας που προσλαμβάνονται από ένα οικοσύστημα Η επίδραση του υψομέτρου στην πανίδα μιας περιοχής Η πλειονότητα των ερευνητών επικεντρώνεται στη μελέτη της διαφοροποίησης είτε ενός τάξου, είτε της πανίδας μιας περιοχής κατά μήκος του υψομέτρου σε μια συγκεκριμένη εποχή. Κοινή διαπίστωση των ερευνητών που έχουν ασχοληθεί με αυτό το θέμα είναι η μείωση της αφθονίας των ειδών (species richness) με την αύξηση του υψομέτρου, τουλάχιστον από κάποια τιμή του και άνω. Η μείωση της ποικιλότητας της πανίδας μιας περιοχής σε σχέση με την αύξηση αυτή μπορεί να οφείλεται σε ένα ή περισσότερα αίτια (Lawton et al.,1987), όπως τα παρακάτω: 1. Η μείωση της έκτασης των ενδιαιτημάτων στα μεγάλα υψόμετρα 2. Η μείωση της ποικιλότητας των φυσικών πόρων 3. Η δραστική επιδείνωση των περιβαλλοντικών παραγόντων στα μεγάλα υψόμετρα και 4. Η μείωση της πρωτογενούς παραγωγής στα μεγάλα υψόμετρα Οι πιο συνήθεις εξηγήσεις για τα μοντέλα διαβάθμισης της ποικιλότητας σε σχέση με το υψόμετρο φαίνεται να σχετίζονται με απλούς παράγοντες, όπως η βροχόπτωση, η θερμοκρασία, η παραγωγικότητα, η αφθονία των πόρων, η ποικιλία των ενδιαιτημάτων κ.τ.λ. (McCain, 2005). Φυσικά υπάρχουν και άλλες διαδικασίες οι οποίες μπορεί να λαμβάνουν χώρα (ανταγωνισμός, θήρευση κ.τ.λ.) και να επηρεάζουν τον αριθμό των ειδών, αλλά θεωρείται απίθανο αυτές να καθορίζουν την αφθονία των ειδών σε σχέση με το υψόμετρο

40 Εισαγωγή 1.6. Η ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ mtdna ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) - Γενικά στοιχεία Στα κύτταρα των θηλαστικών κάθε μιτοχόνδριο περιέχει μερικές χιλιάδες αντίγραφα ενός κυκλικού μορίου DNA, το οποίο είναι μοναδικό για κάθε είδος και είναι γνωστό ως μιτοχονδριακό DNA. Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) αντιγράφεται και μεταγράφεται αυτόνομα μέσα στο μιτοχόνδριο, ανεξάρτητα από το πυρηνικό DNA (ndna), γι αυτό εξάλλου χαρακτηρίζεται ως εγωιστικό. Τα μιτοχόνδρια διαθέτουν ένα ενδογενές και σχεδόν πλήρες σύστημα παραγωγής πρωτεϊνών. Τα μιτοχονδριακά γονίδια κωδικοποιούν για αρκετά από τα συστατικά που είναι απαραίτητα για την σωστή λειτουργία του συστήματος αυτού, ενώ άλλα μόρια, που είναι προϊόντα των πυρηνικών γονιδίων, εισάγονται στο μιτοχόνδριο από το κυτταρόπλασμα. Οι πρωτεΐνες που παράγονται ως αποτέλεσμα της έκφρασης των μιτοχονδριακών γονιδίων, αποτελούν συστατικά ενζυμικών συμπλόκων που εντοπίζονται στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου και χρησιμεύουν στη μεταφορά ηλεκτρονίων κατά μήκος της αναπνευστικής αλυσίδας καθώς και στην οξειδωτική φωσφορυλίωση (Bibb et al., 1981). Στον ποντικό το μόριο του mtdna αποτελείται από ζεύγη βάσεων (base pairs, bp). Η κύρια κωδική αλυσίδα είναι η βαριά αλυσίδα (Heavy strand) (Bibb et al., 1981). Οι χαρακτηρισμοί βαριά (H) και ελαφριά (L) αλυσίδα οφείλονται στο περιεχόμενό τους σε ζεύγη βάσεων G:C, τα οποία τους δίνουν διαφορετικές πυκνότητες άνωσης σε κλινές αποδιάταξης CsCl (CsCl gradient) (Taanman, 1999). Αξιοσημείωτος είναι επίσης ο τρόπος κληρονόμησης του mtdna. Σε όλα τα ζώα το mtdna ακολουθεί το μητρικό τρόπο κληρονόμησης καθώς, εκτός από πολύ σπάνιες εξαιρέσεις, τα μιτοχόνδρια των απογόνων προέρχονται εξ ολοκλήρου από το ωάριο. Το γονιδίωμα του μιτοχονδρίου παρουσιάζει εξαιρετική οικονομία στην οργάνωσή του, με τα trna γονίδια διάσπαρτα μεταξύ των γονιδίων των rrna και αυτών που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες, ενώ υπάρχουν λίγα ή καθόλου νουκλεοτίδια μεταξύ των κωδικών περιοχών. Μόνο δύο περιοχές του γονιδιώματος, α) ο βρόχος εκτόπισης, γνωστός ως D-loop (Displacement loop), με 879 νουκλεοτίδια στον ποντικό και πολύ μεγάλη ποικιλότητα στα διάφορα taxa, ο οποίος περιέχει την περιοχή έναρξης της αντιγραφής της Η αλυσίδας (O H ), και β) η περιοχή έναρξης της αντιγραφής της L αλυσίδας (O L ) με 32 νουκλεοτίδια, αποτελούν μη κωδικές περιοχές

41 Εισαγωγή Η περιοχή του βρόχου εκτόπισης διατηρείται σε κατάσταση τριπλής έλικας λόγω της συνεχούς σύνθεσης και αποσύνθεσης μιας οικογένειας κοντών, μονόκλωνων DNA, συμπληρωματικών της L αλυσίδας (Anderson et al., 1981) Η προέλευση του mtdna Έχουν προταθεί δύο εναλλακτικά μοντέλα όσον αφορά στην προέλευση του mtdna. Και τα δύο στηρίζονται στη θεωρία της ενδοσυμβίωσης. Κατά το πρώτο μοντέλο το κύτταρο με μιτοχόνδρια προήλθε από ενδοσυμβίωση ενός αρχαιοβακτηρίου και ενός πρωτεοβακτηρίου σε ένα εξελικτικό βήμα, ενώ κατά το δεύτερο μοντέλο, από την ενδοσυμβίωση αρχικά ενός αρχαιοβακτηρίου και ενός πρωτεοβακτηρίου και στη συνέχεια ενός απρωτεοβακτηρίου σε δύο εξελικτικά βήματα. Κατά τη διάρκεια της ενδοσυμβίωσης πολλά γονίδια χάθηκαν ή μετανάστευσαν από το πρωτεοβακτήριο στον πυρήνα του ευκαρυώτη. Την τύχη αυτή ακολούθησαν γονίδια των οποίων είτε η λειτουργία συμπληρωνόταν από πυρηνικά ομόλογα είτε υπήρχαν σε περισσότερα αντίγραφα και έτσι ήταν διαθέσιμα για γενετικές αλλαγές (Gray et al., 1999 Lang et al., 1999) Το mtdna ως πειραματικό υλικό Το mtdna των ζώων αποτελεί το καλύτερα μελετημένο τμήμα του ευκαρυωτικού DNA. Αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ευκολία απομόνωσής του σε σχέση με οποιοδήποτε τμήμα του πυρηνικού DNA. Η ευκολία αυτή έγκειται στην ασυνήθιστα μικρή πυκνότητά του σε κλινές CsCl, στον μεγάλο αριθμό αντιγράφων και στην παρουσία του σε ένα οργανίδιο ξεχωριστό από τον πυρήνα. Επιπλέον, εξαιτίας του μικρού μεγέθους του και της απουσίας των πολύπλοκων χαρακτηριστικών του ndna, όπως ιντρόνια, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, μεταθετά στοιχεία, είναι εύκολος ο χαρακτηρισμός του (Wilson et al., 1985). Tο mtdna παρουσιάζει γοργό εξελικτικό ρυθμό σε σχέση με το ndna, κάτι που οφείλεται κατά κύριο λόγο στην απουσία επαρκών μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA εντός του μιτοχονδρίου. Το γεγονός ότι παρατηρείται συγκέντρωση εξαιρετικά μεγάλου αριθμού μεταλλάξεων, συνηγορεί στην άποψη της ανεπαρκούς επιδιόρθωσης του mtdna (Wilson et al., 1985). Η ευκολία απομόνωσής του mtdna σε συνδυασμό με το γρήγορο εξελικτικό ρυθμό που παρουσιάζει, το καθιστούν εξαιρετικό πειραματικό υλικό για διεξαγωγή εξελικτικών και φυλογενετικών μελετών. Συγκεκριμένα, η περιοχή της D-loop, εξαιτίας

42 Εισαγωγή του μικρού μεγέθους της ( bp), της εκτεταμένης γνώσης για τα χαρακτηριστικά της αντιγραφής και μεταγραφής του mtdna και της μεγάλης επάρκειας γνώσης των αλληλουχιών της σε διάφορα είδη, αποτελεί ένα πολύ καλό πρότυπο μελέτης της εξέλιξης κατά τα τελευταία 150 εκατομμύρια χρόνια της μη κωδικοποιούσας ρυθμιστικής περιοχής στα θηλαστικά. Παρά τη λειτουργική της σπουδαιότητα αποτελεί την ταχύτερα εξελισσόμενη περιοχή του mtdna. Η D-loop αποτελείται από τις περιοχές ETAS, CD και CSB (Εικόνα 8). Η κεντρική περιοχή της D-loop, η CD, εμφανίζει ομολογία μεταξύ διαφόρων ειδών και διαφοροποιείται σχεδόν στον ίδιο βαθμό σε σχέση με τις περιοχές των μιτοχονδριακών γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, ενώ οι δύο περιφερειακές της περιοχές, οι ETAS και CSB, εξελίσσονται ραγδαία δημιουργώντας ετερογένεια, τόσο στο μήκος όσο και στη σύνθεση τους σε βάσεις (Sbisa et al., 1997). Η ψηλή συντήρηση της περιοχής CD (σε σχέση με τις περιοχές ETAS και CSB) την κάνει κατάλληλη για εξελικτικές αναλύσεις. Όμως η συντήρηση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ύπαρξη λίγων εξελικτικά σημαντικών περιοχών, οι οποίες δίνουν μικρό βαθμό στήριξης σε ορισμένους κόμβους των φυλογενετικών δένδρων (Larissa et al., 2002). Από την D-loop περιοχή άλλη, οι δύο υπερμεταβλητές περιοχές (ETAS και CSB) εμπεριέχουν εξελικτικά συντηρημένες υποπεριοχές που εμφανίζονται σε όλα τα θηλαστικά. Εντούτοις, ο ρυθμός εξέλιξής τους είναι τόσο μεγάλος ώστε σε ορισμένες περιπτώσεις δεν είναι δυνατή η στοίχιση αλληλουχιών των περιοχών αυτών ακόμα και σε άτομα του ιδίου είδους (Pesole et Εικόνα 8: Σχηματική απεικόνιση του mtdna και της περιοχής ελέγχου D-loop. al., 1999)

43 Εισαγωγή 1.7. H ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης είναι µια απλή μέθοδος η οποία χρησιμοποιείται για την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού μιας συγκεκριμένης περιοχής ενός μορίου DNA, προσφέροντας έτσι μεγάλη ευαισθησία και ταχύτητα. Δηλαδή, μπορεί να πολλαπλασιάσει ένα τμήμα από ένα μόνο μόριο DNA, με αποτέλεσμα, σε σύντομο χρόνο να έχουμε μεγάλη ποσότητα του ζητούμενου τμήματος (Brown, 2006). Η τεχνολογία της PCR ανακοινώθηκε στην επιστημονική κοινότητα το 1985 από τον εφευρέτη της Karry Muller, ο οποίος τιμήθηκε με το βραβείο Nobel το Σήμερα, θεωρείται ως μία από τις πιο επαναστατικές ανακαλύψεις του 20 ου αιώνα, η οποία συνέβαλε στην ευρεία εφαρμογή της μοριακής βιολογίας στη γενικότερη βιολογική και ιατρική έρευνα και διάγνωση. Οι εφαρμογές της (Αναστασιάδου & Καπράνος, 1998) εκτείνονται από την ανίχνευση και τυποποίηση παθογόνων παραγόντων με έμφαση στους ιούς, τη διάγνωση γενετικών ασθενειών και την ανίχνευση λοιμωδών νόσων (ιώσεων, μικροβιακών λοιμώξεων κ.τ.λ.), μέχρι τις εγκληματολογικές έρευνες, αλλά και στην ιατροδικαστική, όπου από ένα απλό ίχνος αίματος ή άλλου ιστού (ακόμα και από ένα κύτταρο) μπορεί να αναγνωριστεί η ταυτότητα ενός ατόμου (γενετικό αποτύπωμα genetic fingerprint ). Ιδιαίτερα δημοφιλής μέθοδος έγινε από τη δεκαετία του 70 οπότε και έγινε εργαλείο μελέτης της γενετικής των πληθυσμών, της φυλογένεσης και της συστηματικής. Η τεχνική της PCR βασίζεται στον επαναλαμβανόμενο κύκλο τριών απλών αντιδράσεων, οι οποίες διαφέρουν ως προς τη θερμοκρασία και τον χρόνο (Saiki et al.,1988). Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται μια ειδική συσκευή (Εικόνα 9), η οποία ακολουθεί ένα πρόγραμμα αυξομειώσεων της θερμοκρασίας με κυκλικές Εικόνα 9: Προγραμματιζόμενος επαναλήψεις με αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό Θερμικός Κυκλοποιητής (Programmable Thermal της αλληλουχίας-στόχου. Κάθε κύκλος αποτελείται Controller - PTC) - PTC100, MJ Research Inc. από τα εξής στάδια (Εικόνα 10):

44 Εισαγωγή 1. Αποδιάταξη του δίκλωνου DNA (denaturation): Στο στάδιο αυτό γίνεται η αποδιάταξη του DNA αφού η θερμοκρασία αυξάνεται στους C περίπου. Με αυτό τον τρόπο απομακρύνονται οι συμπληρωματικοί κλώνοι του DNA, ώστε να σχηματιστούν μονόκλωνες αλυσίδες πάνω στις οποίες θα μπορούν να συνδεθούν τα ολιγονουκλεοτίδια έναρξης ή εκκινητές (primers). 2. Υβριδισμός των εκκινητών με την αλληλουχία στόχο του μορίου του DNA (primer annealing): Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται συνήθως σε θερμοκρασία C. Η σωστή επιλογή της θερμοκρασίας παίζει μεγάλο ρόλο στην επιτυχία της αντίδρασης. Αν η θερμοκρασία έχει τιμή πολύ χαμηλότερη από την ιδανική, οι εκκινητές δεν θα καταφέρουν να προσδεθούν ειδικά στη συμπληρωματική τους αλληλουχία αλλά τυχαία σε ένα οποιοδήποτε σημείο του αποδιαταγμένου DNA. Αντίθετα, αν η τιμή της θερμοκρασίας είναι πολύ υψηλότερη από την ιδανική, οι εκκινητές δεν θα μπορέσουν να συνδεθούν καθόλου στη νουκλεοτιδική αλυσίδα. Η καταλληλότερη θερμοκρασία εξαρτάται από το σημείο τήξης των ολιγονουκλεοτιδίων έναρξης και από την εξειδίκευση που αυτά παρουσιάζουν ως προς την αλληλουχία-στόχο. Eικόνα 10: Σχηματική απεικόνιση των επαναλαμβανόμενων σταδίων της PCR

45 Εισαγωγή 3. Σύνθεση συμπληρωματικών κλώνων του DNA με τη βοήθεια της Taqπολυμεράσης (primer extension): Στο τρίτο και τελευταίο στάδιο η Taq πολυμεράση χρειάζεται θερμοκρασία 72 C για να επιτρέψει τη σύνθεση των συμπληρωματικών κλώνων με κατεύθυνση από το 5 άκρο προς το άκρο 3 του μορίου του εκκινητή. Όταν ολοκληρώνεται αυτό το στάδιο της πορείας, από την αρχική δίκλωνη αλυσίδα DNA δημιουργούνται δύο νέες θυγατρικές δίκλωνες αλυσίδες. Η ίδια διαδικασία των τριών σταδίων επαναλαμβάνεται επί ακόμα φορές ώστε τελικά να παραχθεί μεγάλος αριθμός δίκλωνων μορίων DNA, αντιγράφων της αλληλουχίας - στόχου Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ (SEQUENCING) ΤΜΗΜΑΤΟΣ DNA O προσδιορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων συγκεκριμένων γενετικών τόπων αποτελεί τον πιο άμεσο τρόπο για τον προσδιορισμό της ταυτότητας ενός ατόμου και γίνεται σήμερα με μεγάλη ευαισθησία και ταχύτητα με τη χρήση αυτοματοποιημένων τεχνικών που στηρίζονται σε τελευταίας τεχνολογίας μηχανήματα. Η πρώτη τεχνική που χρησιμοποιήθηκε για την αλληλούχηση είχε εφευρεθεί από τους Maxam και Gilbert, αλλά πλέον δεν χρησιμοποιείται. Το 1977 ο Sanger και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν μια άλλη τεχνική, η οποία περιλαμβάνει τη χρήση διδεοξυ-νουκλεοτιδίων (2', 3' - dideoxy) τα οποία διακόπτουν -ελεγχόμενα- την επιμήκυνση των αλυσίδων κατά τη διάρκεια της in vitro σύνθεσης του DNA. Η σύνθεση αρχίζει χρησιμοποιώντας έναν συγκεκριμένο ολιγονουκλεοτιδικό εκκινητή. Κατά τη διάρκεια της αντιγραφής, ενσωματώνονται ραδιενεργά νουκλεοτίδια (συνήθως datp) στα σκέλη που επιμηκύνονται. Ταυτόχρονα πραγματοποιούνται τέσσερις χωριστές αντιδράσεις (Εικόνα 11), καθεμία από τις οποίες περιέχει και τα 4 dntp s και ένα ddntp. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση του ddntp, τόσο συχνότερα θα ολοκληρώνεται η επιμήκυνση των αλυσίδων. Μετά από τις αντιδράσεις επέκτασης τα προϊόντα διαχωρίζονται με κατακόρυφη ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Τα αποτελέσματα φαίνονται όταν το πήκτωμα ξηρανθεί και αυτοραδιογραφηθεί. Οι ζώνες που βρίσκονται κοντά στο κατώτατο άκρο του

46 Εισαγωγή πηκτώματος αντιπροσωπεύουν τα προϊόντα της αντίδρασης που βρίσκονται προς το 3' άκρο του εκκινητή και εκείνες που βρίσκονται πιο κοντά στην κορυφή του πηκτώματος αντιπροσωπεύουν τα προϊόντα που βρίσκονται προς το 5' άκρο του εκκινητή. Πλέον, η σήμανση των νουκλεοτιδίων με ραδιενεργό στοιχείο έχει εγκαταλειφθεί λόγω της επικινδυνότητας της χρήσης της ραδιενέργειας. Σήμερα, το κάθε διδεοξυνουκλεοτίδιο σημαίνεται με φθορίζουσα χρωστική (διαφορετική για το καθένα πχ. μπλε για τη κυτοσίνη, μαύρο για τη γουανίνη, πράσινο για την αδενίνη και κόκκινο για τη θυμίνη) και το πήκτωμα μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης σαρώνεται από ένα αισθητήρα ανιχνευτή, ο οποίος αναγνωρίζει το τερματικό νουκλεοτίδιο της κάθε αντίδρασης (Εικόνα 12). Έτσι, αφενός μεν η επικινδυνότητα της μεθόδου μειώνεται και αφετέρου δεν τίθενται πλέον φαινόμενα υποκειμενικότητας της παρατήρησης του φιλμ μετά την αυτοραδιογραφία. Εικόνα 11: Ανάλυση αλληλουχίας του DNA με βάση την τεχνική του Sanger με τη χρήση ραδιενεργών νουκλεοτιδίων. Εικόνα 12: Ανάλυση αλληλουχίας του DNA με βάση την τεχνική του Sanger με τη χρήση φθορίζουσας χρωστικής

47 Εισαγωγή 1.9. Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΣΗ Η γενετική ποικιλότητα που υπάρχει μεταξύ των πληθυσμών αλλά και μεταξύ των ατόμων του ίδιου πληθυσμού μπορεί να μετρηθεί ποσοτικά με τη γενετική απόσταση (D). Ο Nei (1972) όρισε ως γενετική απόσταση τη γενετική διαφορά μεταξύ των πληθυσμών ή των ατόμων, η οποία αντανακλά τις διαφορές των γονιδιακών συχνοτήτων τους. Από καθαρά γενετικής πλευράς, ο καλύτερος τρόπος υπολογισμού της γενετικής απόστασης είναι η μέτρηση της διαφοράς του αριθμού των νουκλεοτιδίων ανά μονάδα μήκους του DNA. Θεωρητικά είναι εύκολη η εύρεση των νουκλεοτιδικών διαφορών με βιοχημικές μεθόδους. Ωστόσο, τέτοιες τεχνικές είναι χρονοβόρες και δαπανηρές (Αλαχιώτης, 1992). Για τον λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί στατιστικές μέθοδοι-μοντέλα με τα οποία μπορεί να υπολογιστεί η γενετική απόσταση. Τα επικρατέστερα μοντέλα αναλύονται πιο κάτω: Μοντέλο Jukes & Cantor Στο μοντέλο Jukes & Cantor (1969) ο ρυθμός νουκλεοτιδικής υποκατάστασης θεωρείται ότι είναι ο ίδιος για όλα τα νουκλεοτίδια. Παραδέχεται επίσης ότι τα τέσσερα νουκλεοτίδια συναντώνται με ίσες συχνότητες στο DNA (0.25) και ότι ο ρυθμός νουκλεοτιδικής υποκατάστασης είναι ο ίδιος για όλες τις θέσεις στο γονιδίωμα. Περαιτέρω, δεν γίνεται καμία διόρθωση όσον αφορά την συχνότητα των μεταστροφών σε σχέση με τις μεταπτώσεις η οποία θεωρείται η ίδια. Με βάση αυτό το μοντέλο η γενετική απόσταση υπολογίζεται από την παρακάτω εξίσωση: όπου: D = η γενετική απόσταση p = η αναλογία των νουκλεοτιδικών θέσεων που διαφέρουν.,

48 Εισαγωγή Μοντέλο Tajima & Nei Το μοντέλο των Tajima & Nei (1984) είναι πιο ρεαλιστικό και δίνει μια καλύτερη εκτίμηση του αριθμού των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων σε σχέση με το μοντέλο των Jukes & Cantor (1969), δεδομένου ότι στην πραγματικότητα η συχνότητα των νουκλεοτιδίων διαφέρει σημαντικά από αυτή του 0.25, κάτι που λαμβάνεται υπόψη στο μοντέλο αυτό. Εντούτοις, όπως και στο μοντέλο των Jukes & Cantor (1969), η συχνότητα των μεταπτώσεων θεωρείται η ίδια με αυτή των μεταστροφών και ο ρυθμός νουκλεοτιδικής υποκατάστασης είναι ο ίδιος για όλες τις θέσεις στο γονιδίωμα. Η μαθηματική διατύπωση του μοντέλου αυτού είναι οι εξής: όπου: D = η γενετική απόσταση p = η αναλογία των νουκλεοτιδικών θέσεων που διαφέρουν, όπου:, x ij = η σχετική συχνότητα νουκλεοτιδικών ζευγών i και j g i, g j = οι νουκλεοτιδικές συχνότητες Μοντέλο Tamura & Nei Το μοντέλο των Tamura & Nei (1993) θεωρείται πολύ καλύτερο από τα δύο προηγούμενα, δεδομένου ότι λαμβάνει υπόψη τη διαφορά που υπάρχει στη συχνότητα των μεταπτώσεων σε σχέση με τις μεταστροφές, όπως επίσης και ότι τα νουκλεοτίδια δεν απαντώνται με την ίδια συχνότητα στο γονιδίωμα. Ωστόσο και πάλι ο ρυθμός νουκλεοτιδικής υποκατάστασης θεωρείται ο ίδιος για όλες τις θέσεις στο γονιδίωμα. Ο αριθμός των υποκαταστάσεων μετάπτωσης ανά θέση υπολογίζεται από τον τύπο:

49 Εισαγωγή Ο αριθμός των υποκαταστάσεων μεταστροφής ανά θέση υπολογίζεται από τον τύπο: Ο λόγος του αριθμού των υποκαταστάσεων μετάπτωσης προς τον αριθμό των μεταστροφών υπολογίζεται από τον τύπο: Το μοντέλο των Tamura & Nei περιγράφεται από τον παρακάτω μαθηματικό τύπο:, όπου: g R = g A + g G g Y = g T + g C, όπου: P 1 και P 2 = η αναλογία των υποκαταστάσεων μετάπτωσης μεταξύ των νουκλεοτιδίων Α και G, και μεταξύ Τ και C, αντίστοιχα Q = η αναλογία των υποκαταστάσεων μεταστροφής ga, gc, gg, gt = οι συχνότητες των νουκλεοτιδίων A, C, G και Τ, αντίστοιχα

50 Εισαγωγή ΤΑ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΑ ΔΕΝΔΡΑ Τα φυλογενετικά δένδρα αποτελούν γραφικές παραστάσεις των πραγματικών εξελικτικών σχέσεων μεταξύ των ταξινομικών μονάδων (OUT, Operational Taxonomic Unit). Οι ταξινομικές μονάδες μπορεί να αφορούν σε taxa οποιασδήποτε ταξινομικής κατηγορίας ή σε άτομα. Οι μονάδες αυτές διαχωρίζονται σε σημεία που ονομάζονται κόμβοι, ενώ οι διαδρομές που ενώνουν τους κόμβους ονομάζονται κλάδοι. Οι εσωτερικοί κόμβοι αναπαριστούν τα νεότερα στην εξέλιξη taxa ενώ οι εξωτερικοί τα πρωτόγονα (αρχαιότερα). Τα μήκη των κλάδων αντικατοπτρίζουν τον αριθμό των εξελικτικών αλλαγών σε κάθε διαδρομή προγόνου-απογόνου. Όταν ένας εσωτερικός κόμβος αναπαριστάνει τον κοινό πρόγονο όλων των OTU τότε έχουμε ένα δένδρο με ρίζα (Avise, 1994). Υπάρχουν διάφορες μεθόδοι με βάση τις οποίες μπορούν να κατασκευαστούν φυλογενετικά δένδρα. Οι μέθοδοι αυτές μπορούν να διακριθούν στις ακόλουθες κατηγορίες: (α) μέθοδοι μήτρας αποστάσεων (Distance Matrix), (β) μέθοδοι φειδωλότητας (Parsimony), (γ) μέθοδοι αμεταβλητότητας (Invariability) και (δ) μέθοδοι μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximun Likehood). Η πρώτη κατηγορία (μέθοδοι της οποίας χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και η οποία αναλύεται εκτενώς πιο κάτω) περιλαμβάνει ποσοτικές μεθόδους, ενώ οι υπόλοιπες τρεις περιλαμβάνουν ποιοτικές μεθόδους ή μεθόδους καταστάσεων χαρακτήρα (Swofford & Olson, 1990). Οι μέθοδοι μήτρας αποστάσεων βασίζονται σε μια αρχική μήτρα απόστασης ή ομοιότητας μεταξύ των εξεταζόμενων ταξινομικών μονάδων: Μέθοδοι Ανάλυσης Ομαδοποίησης (Clustering Analysis) Σύμφωνα με την μέθοδο αυτή, αρχικά ενώνονται οι δύο λιγότερο απομακρυσμένες ταξινομικές μονάδες (OTU), ακολούθως προστίθεται η επόμενη λιγότερο απομακρυσμένη ταξινομική μονάδα δημιουργώντας μια νέα ομάδα και σταδιακά προστίθενται όλες οι ταξινομικές μονάδες. Οι πλέον διαδεδομένες και χρησιμοποιούμενες μέθοδοι αυτής της κατηγορίας είναι οι UPGMA και WPGMA. Η διαφορά των δύο αυτών μεθόδων έγκειται στον τρόπο υπολογισμού του μέσου των δύο ταξινομικών μονάδων της ομάδας που μελετάται σε κάθε βήμα της δημιουργίας του δένδρου (Swofford & Olson, 1990). Η κύρια παραδοχή των μεθόδων αυτών είναι ότι υπάρχει ίδιος ρυθμός εξέλιξης κατά μήκος των κλάδων του δένδρου, γεγονός που δεν ισχύει πάντα

51 Εισαγωγή Μέθοδοι Γειτονίας-Ένωσης ή Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining) Η μέθοδος Neighbor-Joining είναι μια από τις πιο δημοφιλείς μεθόδους κατασκευής φυλογενετικών δένδρων. Ο αλγόριθμος αυτός δεν στηρίζεται στην προηγούμενη παραδοχή ότι όλες οι φυλογενετικές σειρές παρουσιάζουν τον ίδιο εξελικτικό ρυθμό. Σε κάθε βήμα της ανάλυσης αυτής, με βάση τη μέση διαφοροποίηση των δύο ταξινομικών μονάδων που δημιουργούν μια ομάδα απ όλες τις άλλες ταξινομικές μονάδες, κατασκευάζεται μια τροποποιημένη μήτρα αποστάσεων με βάση την οποία αναπροσαρμόζονται τα μήκη των κλάδων στο δένδρο που δημιουργείται (Swofford & Olson, 1990). Για να αρχίσει η κατασκευή, θεωρείται αρχικά ότι υπάρχει μόνο ένας εσωτερικός κόμβος από τον οποίο ξεκινούν όλες οι αλληλουχίες. Στη συνέχεια επιλέγεται τυχαία ένα ζεύγος αλληλουχιών, μετατοπίζεται από τον κόμβο και συνδέεται σε ένα δεύτερο εσωτερικό κόμβο, ο οποίος συνδέεται με κλάδο με τον αρχικό. Χρησιμοποιείται στη συνέχεια η μήτρα αποστάσεων για να υπολογιστεί το ολικό μήκος του κλάδου σε αυτό το καινούριο δένδρο. Οι αλληλουχίες επανέρχονται στη αρχική τους θέση και ένα άλλο ζεύγος αλληλουχιών συνδέεται σε ένα δεύτερο κλάδο και υπολογίζεται το μήκος του κλάδου. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου έχουν ελεγχθεί όλα τα πιθανά ζεύγη και έχει βρεθεί ο συνδυασμός που θα δώσει το μικρότερο μήκος κλάδου. Αυτό το ζεύγος θα είναι γείτονες (neighbors) στο τελικό δένδρο. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται με αποτέλεσμα την κατασκευή ενός ολοκληρωμένου δένδρου. Μέθοδος Fitch-Margoliash και παρόμοιες μεθόδοι Ο αλγόριθμος αυτός, επίσης δεν θεωρεί ότι υπάρχει ο ίδιος ρυθμός εξέλιξης σε όλους τους κλάδους του δένδρου. Τα δεδομένα που αναλύονται μπορεί να περιέχουν ασάφειες και ανακρίβειες ικανές να δημιουργήσουν δένδρα με τελείως ασταθή τοπολογία. Ανάλογα με τα δεδομένα που λαμβάνονται υπόψη για την κατασκευή ενός δένδρου, χρησιμοποιούνται δύο παρόμοιοι αλγόριθμοι, το Σταθμισμένο Κριτήριο Ελάχιστων Τετραγώνων (Balanced Criterion of Least Squares) και το Σταθμισμένο Κριτήριο των Απόλυτων Διαφορών (Balanced Criterion of Absolute Differences) (Swofford & Olson, 1990). Μέθοδος απόστασης Wagner και παρόμοιες μέθοδοι Οι δύο προηγούμενοι αλγόριθμοι προσπαθούν να αποδώσουν μια μήτρα αποστάσεων με ένα προσθετικό δένδρο με τις υπολογιζόμενες αποστάσεις μεταξύ των ταξινομικών μονάδων στο δένδρο αυτό να είναι μεγαλύτερες ή μικρότερες από τις αντίστοιχες τιμές τους στη μήτρα αποστάσεων. Στην περίπτωση αυτή το μήκος

52 Εισαγωγή της διαδρομής που συνδέει δύο ταξινομικές μονάδες πρέπει να ισούται ή να είναι μεγαλύτερο της κανονικής τιμής της απόστασής τους. Με τη μέθοδο Wagner και τις παρόμοιες το επιθυμητό δένδρο έχει το ελάχιστο συνολικό μήκος κλάδων, χρησιμοποιώντας τις αποστάσεις ανά ζεύγος ταξινομικών μονάδων ως τις κατώτερες τιμές του αντίστοιχου μονοπατιού που τις ενώνει (Swofford & Olson, 1990)

53 Εισαγωγή Η ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΑ Η ανάλυση του σχήματος μιας βιολογικής δομής παίζει σημαντικό ρόλο στην επίλυση αρκετών προβλημάτων. Πολλές βιολογικές διαδικασίες όπως η οντογένεση, η προσαρμογή σε τοπικούς γεωγραφικούς παράγοντες αλλά και η εξέλιξη στο χρόνο έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση αλλαγών σε κάποιους μορφολογικούς χαρακτήρες (Zelditch et al., 2004). Η ανάλυση του σχήματος τέτοιων χαρακτήρων είναι μια προσέγγιση ώστε να κατανοήσουμε την αιτία αυτών των μορφολογικών διαφοροποιήσεων. Η μορφομετρική ανάλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω εφαρμογής της Κλασικής Μορφομετρίας (Traditional Morphometrics), της Γεωμετρικής Μορφομετρίας (Geometric Morphometrics) και της Ανάλυσης Περιγράμματος (Outline Analysis) Κλασική μορφομετρία Παραδοσιακά, τα μορφομετρικά δεδομένα περιλαμβάνουν μετρήσεις όπως μήκος, πλάτος, ύψος κ.τ.λ. (Adams et al., 2004). Τέτοια πακέτα δεδομένων περιλαμβάνουν πολύ λίγη πληροφορία σχετικά με την πραγματική δομή του οργανισμού που μελετάται (Zelditch et al., 2004). Η κλασική μορφομετρία περιλαμβάνει κυρίως την εφαρμογή πολυμεταβλητών στατιστικών αναλύσεων σε πακέτα δεδομένων μορφολογικών μεταβλητών. Χρησιμοποιούνται κυρίως γραμμικές αποστάσεις μεταξύ σημείων αλλά και αναλογίες ή ακόμη και γωνίες (Rohlf & Marcus, 1993). Για την ανάλυση τέτοιων δεδομένων χρησιμοποιούνται στατιστικές αναλύσεις όπως η Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (Principal Components Analysis, PCA), η Παραγοντική Ανάλυση (Factor Analysis, FA), η Ανάλυση Κανονικών Μεταβλητών (Canonical Variates Analysis, VCA) και η Ανάλυση Διάκρισης (Discriminant Analysis, DA). Παρόλο που η κλασική μορφομετρία συνδύασε τις πολυμεταβλητές στατιστικές μεθόδους με την ποσοτική μορφομετρία, εν τούτοις παρέμειναν αρκετές δυσκολίες σ αυτού του είδους τις αναλύσεις. Για παράδειγμα, οι μετρήσεις γραμμικών αποστάσεων σχετίζονται συνήθως με το μέγεθος ενός οργανισμού, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη μεθόδων για την αναίρεση της επίδρασης του μεγέθους. Η χρήση

54 Εισαγωγή καθεμίας μεθόδου οδηγεί όμως σε ελαφρώς διαφορετικά αποτελέσματα. Παράλληλα η ομολογία των γραμμικών αποστάσεων είναι δύσκολο να εκτιμηθεί, γιατί πολλές από αυτές δεν καθορίζονται από ομόλογα σημεία. Επίσης, ίδια πακέτα δεδομένων μπορεί να προκύπτουν από διαφορετικά σχήματα. Τέλος, δεν είναι πάντα εφικτή η ανασύσταση του σχήματος που μελετάται έχοντας ως δεδομένα τις γραμμικές αποστάσεις μεταξύ σημείων του, αφού με αυτό τον τρόπο δεν μπορεί να καταγραφεί η γεωμετρία του σχήματος με αποτέλεσμα να χάνονται δεδομένα της γεωμετρίας της υπό εξέταση δομής (Rohlf & Marcus, 1993) Γεωμετρική μορφομετρία Το 1993 οι Rohlf & Marcus μίλησαν για μια επανάσταση στο πεδίο της μορφομετρίας, καθώς οι ερευνητές έδειξαν μεγάλο ενδιαφέρον στη λήψη δεδομένων που αντικατοπτρίζουν τη γεωμετρία μιας δομής και στην ανάπτυξη τεχνικών που αναλύουν τέτοιου είδους δεδομένα (Rohlf & Marcus, 1993 Adams, 1999). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τα πακέτα δεδομένων που μέχρι τότε αφορούσαν γραμμικές αποστάσεις να αντικατασταθούν από πακέτα δισδιάστατων ή τρισδιάστατων συντεταγμένων από ορόσημα (landmarks) που τοποθετούνταν στην υπό μελέτη δομή. Οι συντεταγμένες των οροσήμων εμπεριέχουν περισσότερη πληροφορία σε σχέση με τα δεδομένα της κλασικής μορφομετρίας, επειδή περιλαμβάνουν και δεδομένα γραμμικών αποστάσεων. Οι μεθόδοι που αναπτύχθηκαν έχουν τη δυνατότητα να αναλύσουν δεδομένα οροσήμων αλλά και δεδομένα που αφορούν στο περίγραμμα μιας δομής Ορόσημα (landmarks) Οι μέθοδοι γεωμετρικής μορφομετρίας που βασίζονται σε ορόσημα ξεκινούν με τη συλλογή δισδιάστατων ή τρισδιάστατων συντεταγμένων σε σημεία που έχουν βιολογική σημασία. Μεγάλη έμφαση δίνεται στη λήψη συντεταγμένων από ομόλογες δομές ώστε να δίνεται καλύτερη βιολογική ερμηνεία στα αποτελέσματα. Στην περίπτωση που δεν είναι εφικτό να βρεθεί κάποιο ομόλογο ορόσημο, τότε χρησιμοποιούνται «ψευδοορόσημα» (pseudolandmarks). Είναι σημεία που βρίσκονται στα άκρα των υπό μελέτη δομών, ή στα ακραία σημεία της καμπυλότητας του περιγράμματος μιας

55 Εισαγωγή δομής, ή ακόμα και αυθαίρετα σημεία κατά μήκος του εν λόγω περιγράμματος (Rohlf & Marcus, 1993). Οι συντεταγμένες αυτές δεν είναι δυνατόν να θεωρηθούν ως μεταβλητές και να χρησιμοποιηθούν σε στατιστικές αναλύσεις. Πρέπει πρώτα να αφαιρεθεί η επίδραση της θέσης, του προσανατολισμού και της κλίμακας για όλα τα δείγματα. Επομένως, με κατάλληλη μαθηματική συνάρτηση αφαιρείται η επίδραση αυτών των παραγόντων και οι συντεταγμένες μπορούν πλέον να χρησιμοποιηθούν για στατιστική ανάλυση. Τέτοιες μεθόδοι είναι η Μέθοδος Thin-Plate Spline (TPS) και η Μέθοδος Απόστασης Προκρούστη (Generalized Procrustes Analysis, GPA). Εκτός όμως από τις παραπάνω μεθόδους, έχουν επίσης προταθεί και άλλες εναλλακτικές μεθόδοι για τη λήψη πληροφοριών από συντεταγμένες ορόσημων, όπως είναι η Euclidean Distance Matrix Analysis (EDMA) και η Finite Element Scaling Analysis (FESA) (Adams et al., 2004). Μέθοδος Thin Plate Spline (TPS) Ο D Arsy Thomson (1917) κατασκεύασε πλέγματα με τα οποία επέδειξε πώς ένα μέρος ενός οργανισμού μπορεί να περιγραφεί ως παραμόρφωση του ίδιου μέρους ενός άλλου οργανισμού. Οποιεσδήποτε διαφορές μεταξύ των δύο δομών περιγράφονται ως παραμορφώσεις στο πλέγμα. Η παραμόρφωση μεταξύ δύο δειγμάτων, σύμφωνα με τις περιγραφές του Thomson αναπαρίσταται με τη μορφή πλεγμάτων, όπου οι συντεταγμένες των οροσήμων μιας δομής στρεβλώνονται ώστε να ταιριάξουν με τις συντεταγμένες των οροσήμων μιας δεύτερης δομής. Οι διαφορές που προκύπτουν μεταξύ των οροσήμων εκφράζονται με τη μορφή συνεχούς παραμόρφωσης (Rohlf & Marcus, 1993 Adams et al., 2004). Μετά από αρκετές ανεπιτυχείς προσπάθειες διαφόρων ερευνητών, ο Bookstein (1991) εισηγήθηκε τη μέθοδο Thin-Plate Spline για να υπολογίσει την παραμόρφωση των πλεγμάτων του Thomson. Ο όρος Thin-Plate Spline (TPS) προέρχεται από ένα μοντέλο παραμόρφωσης ενός λεπτού μεταλλικού φύλλου. Η συνάρτηση TPS επιτρέπει τη σύγκριση ενός συνόλου ορόσημων σε περισσότερα από δύο δείγματα. Αυτός ο αλγόριθμος υπολογίζει την παραμόρφωση μέσω παλινδρόμησης στην οποία τα ομόλογα σημεία των δομών που μελετούνται υφίστανται επεξεργασία κατά ζεύγη, με τέτοιο τρόπο ώστε να ελαχιστοποιείται η ενέργεια μετασχηματισμού. Η εξίσωση αυτή συνήθως εφαρμόζεται στις κορυφές ενός πλέγματος ώστε οι αλλαγές του σχήματος μεταξύ δύο δομών να γίνονται εύκολα αντιληπτές από την

56 Εισαγωγή παραμόρφωση του πλέγματος (Εικόνα 13). Η συνάρτηση TPS εφαρμόζεται στον καθένα από τους δύο άξονες συντεταγμένων χωριστά, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε δισδιάστατες και τρισδιάστατες συντεταγμένες. Εικόνα 13: Η διαμόρφωση ενός περιγράμματος Α (αριστερά) και η διαμόρφωση ενός περιγράμματος Β (δεξιά) απεικονίζονται με πέντε ορόσημα. Η παραμόρφωση που παρατηρείται στο πλέγμα της δεξιάς εικόνας δείχνει την επίδραση της συνάρτησης Thin-Plate Spline καθώς εφαρμόζεται στο περίγραμμα που βρίσκεται αριστερά. Είναι ουσιαστικά μια απεικόνιση των διαφορών μεταξύ των δυο σχημάτων (Μitteroecker & Gunz, 2009). Μέθοδος Απόστασης Προκρούστη (Generalized Procrustes Analysis, GPA) Ως Απόσταση Προκρούστη ορίζεται η ελάχιστη τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των τετραγώνων της απόστασης μεταξύ δύο συνόλων οροσήμων σε δείγματα που υπόκεινται σε γεωμετρική μορφομετρική ανάλυση (Bookstein 1997). Η Απόσταση Προκρούστη βασίζεται στην ιδέα της επικάλυψης των εικόνων δύο ή περισσότερων δειγμάτων με τέτοιο τρόπο ώστε τα ομόλογα ορόσημα να ταιριάξουν όσο το δυνατόν περισσότερο (Rohlf & Marcus, 1993). Στη συνέχεια ακολουθείται μια διαδικασία όπως περιγράφεται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 14). Όταν πλέον γίνει αυτό, το τελικό στάδιο είναι να παρατηρηθούν όλες οι πιθανές διαφορές που προκύπτουν στα σχήματα (Rohlf & Marcus, 1993)

57 Εισαγωγή Εικόνα 14: Τα στάδια της Μεθόδου Απόστασης Προκρούστη. Αρχικά τα σχήματα διαμορφώνονται με τέτοιο τρόπο ώστε να μοιράζονται το ίδιο κεντροειδές (Β). Στη συνέχεια διαμορφώνονται ώστε να έχουν το ίδιο μέγεθος κεντροειδούς (centroid size) (Γ) και τέλος το ένα από αυτά περιστρέφεται γύρω από το κεντροειδές του ώστε να ελαχιστοποιηθεί η απόσταση μεταξύ των ομόλογων οροσήμων (Δ). Οι τελικές συντεταγμένες των οροσήμων που προκύπτουν με αυτή τη μέθοδο ονομάζονται Προκρούστειες συντεταγμένες σχήματος (Procrustes shape coordinates) (Μitteroecker & Gunz, 2009) Ανάλυση Περιγράμματος Ένα σημαντικό μειονέκτημα της γεωμετρικής μορφομετρίας που στηρίζεται σε ορόσημα είναι ότι ακόμα και ένας ικανοποιητικός αριθμός οροσήμων ενδέχεται να μην είναι ικανός να αποδώσει το σχήμα της δομής που μελετάται. Αυτό συμβαίνει γιατί μπορεί να υπάρξουν μεγάλες περιοχές μιας δομής στις οποίες να μην εμφανίζονται σημεία με βιολογική σημασία. Από την άλλη, ενδέχεται να υπάρξουν και σημαντικές διαφορές του σχήματος στο ενδιάμεσο των τοποθετημένων οροσήμων. Σε τέτοιες περιπτώσεις η μέθοδος που χρησιμοποιείται περιλαμβάνει την δημιουργία των περιγραμμάτων τέτοιων δομών, κάτι που αναπόφευκτα όμως αγνοεί όλες τις διαφορές που μπορεί να κρύβονται ανάμεσα στις ομόλογες θέσεις των οροσήμων (Adams et al., 2004). Τα περιγράμματα αυτά καταγράφονται είτε ως μια αλληλουχία χ,ψ συντεταγμένων κατά μήκος ενός περιγράμματος, είτε ως αλληλουχία κωδικών αλυσίδας (chain codes), οι οποίοι έχουν τη δυνατότητα να αποκωδικοποιηθούν σε συντεταγμένες (Kuhl & Giardina, 1982 Rohlf, 1990). Οι κωδικοί αλυσίδας (chain code) προσεγγίζουν το περίγραμμα της υπό μελέτη δομής με μια συνεχή αλληλουχία κωδικών οι οποίοι απαρτίζονται από οκτώ ψηφία (από το 0 έως το 7). Καθένα από αυτά τα ψηφία προσδιορίζει την κατεύθυνση του επόμενου βήματος ώστε να γίνει ο σχεδιασμός του περιγράμματος. Ο κωδικός ενός

58 Εισαγωγή περιγράμματος (V) με μήκος Κ είναι μια συνεχής αλυσίδα των οκτώ αυτών ψηφίων, πχ: V = α 1,α 2,α 3...α K Στην εικόνα που ακολουθεί (Εικόνα 15) φαίνεται η κατεύθυνση που κωδικοποιεί κάθε ψηφίο (Kuhl & Giardina, 1982). Ο κωδικός αλυσίδας στην προκειμένη περίπτωση είναι ο εξής: V 1 = Εικόνα 15: Κωδικός αλυσίδας V 1 = (Α) απεικόνιση της κατεύθυνσης που κωδικοποιεί κάθε ψηφίο, (Β, Γ) δημιουργία κωδικού αλυσίδας σχήματος, (Δ) αρμονικές αναπαραστάσεις του κωδικού αλυσίδας V 1 (Kuhl & Giardina, 1982)

59 Εισαγωγή Τέλος, στα δεδομένα του κωδικού αλυσίδας εφαρμόζεται η κατάλληλη συνάρτηση (ανάλυση Fourier) και στη συνέχεια συγκρίνονται οι καμπύλες χρησιμοποιώντας τις παραμέτρους των αρμονικών της ανάλυσης ως μεταβλητές σε πολυμεταβλητές στατιστικές αναλύσεις (Adams et al., 2004). Η συνάρτηση της ανάλυσης Fourier είναι μία τριγωνομετρική συνάρτηση η οποία εφαρμόζεται σε ένα περίγραμμα και οι συντελεστές της συνάρτησης Fourier χρησιμοποιούνται ως μεταβλητές για να πραγματοποιηθεί στη συνέχεια στατιστική ανάλυση με κάποια πολυπαραγοντική μέθοδο (Rohlf, 1990). Υποπερίπτωση της ανάλυσης Fourier αποτελεί η Ελλειπτική Ανάλυση Fourier (EFA), η οποία είναι μια μέθοδος κατά την οποία μια κλειστή καμπύλη προσαρμόζεται κατά μήκος των διατεταγμένων σημείων ενός επίπεδου σχήματος δύο διαστάσεων. Με τη μέθοδο αυτή, μια καμπύλη αναλύεται σε ένα σύνολο αρμονικά συνδεδεμένων ελλείψεων στο καρτεσιανό σύστημα συντεταγμένων. Οποιαδήποτε κλειστή καμπύλη μπορεί να ανασυσταθεί με συνδυασμό αυτών των ελλείψεων. Ένα από τα πλεονεκτήματα της ανάλυσης αυτής είναι ότι οι συντελεστές περιγράφουν την κλειστή καμπύλη ανεξαρτήτως μεγέθους, προσανατολισμού και θέσης της στο καρτεσιανό σύστημα συντεταγμένων (Kuhl & Giardina, 1982). Επίσης, όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των αρμονικών που χρησιμοποιούνται, τόσο καλύτερη είναι η περιγραφή του υπό μελέτη σχήματος

60 Υλικά και μέθοδοι 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Για τη διεξαγωγή της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες μικροθηλαστικών κατά το χρονικό διάστημα μεταξύ Απριλίου 2008 και Μαΐου Οι περιοχές μελέτης ήταν δύο απομακρυσμένες μεταξύ τους περιοχές της Κύπρου: α) η πεδινή περιοχή της επαρχίας Αμμοχώστου και συγκεκριμένα οι περιοχές της Λίμνης Παραλιμνίου, του Νοσοκομείου Παραλιμνίου και του ποταμού Λιοπετρίου, και β) η ορεινή περιοχή του όρους Τροόδους, στην ευρύτερη περιοχή του χωριού Κάτω Πλάτρες (Εικόνα 16). Εικόνα 16: Περιοχές μελέτης (επάνω) και τοποθεσίες δειγματοληψίας σ αυτές (κάτω). Ορεινή περιοχή Τροόδους, (κάτω αριστερά) και πεδινή περιοχή Αμμοχώστου (κάτω δεξιά)

61 Υλικά και μέθοδοι Ειδικότερα, σ αυτές τις δύο περιοχές επιλέχθηκαν κατάλληλες επιμέρους τοποθεσίες δειγματοληψίας (Πίνακας 3). Πίνακας 3: Οι τοποθεσίες δειγματοληψίας, το στίγμα και το υψόμετρό τους. Ευρύτερη περιοχή μελέτης Επαρχία Αμμοχώστου Τοποθεσίες δειγματοληψίας Στίγμα τοποθεσίας Υψόμετρο (m) Ποταμός Λιοπετρίου Ν 34 ο 58 26,5 Ε 33 ο 58 54,4 8 Νοσοκομείο Παραλιμνίου Ν 35 ο 03 53,1 Ε 33 ο 58 15,2 44 Λίμνη Παραλιμνίου Ν 35 ο 03 06,6 Ε 33 ο 58 09,8 76 Λιβάδι κοντά στις Πλάτρες Ν 34 ο 53 05,3 Ε 32 ο 51 20, Όρος Τρόοδος Λιβάδι κοντά στον Κρυό ποταμό Ν 34 ο 52 54,9 Ε 32 ο 51 40, Περιοχή Τροοδίτισσας Ν 34 ο 54 57,3 Ε 32 ο 50 34, Πευκοδάσος Τροόδους Ν 34 ο 54 08,8 Ε 32 ο 51 37, Συνολικά καλύφθηκαν 60 ημέρες παγίδευσης που κατανέμονταν ανά περιοχή και δειγματοληπτική περίοδο όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 4). Πίνακας 4: Οι τοποθεσίες και ο αριθμός ημερών πραγματοποίησης των δειγματοληψιών. Περιοχή Περίοδος Άνοιξη 2008 Καλοκαίρι 2008 Φθινόπωρο 2008 Χειμώνας 2008 Άνοιξη 2009 Σύνολο Αμμόχωστος Τρόοδος Σύνολο

62 Υλικά και μέθοδοι Περιοχή Νοσοκομείου και λίμνης Παραλιμνίου Βλάστηση Από φυτοκοινωνική άποψη η ευρύτερη περιοχή του Παραλιμνίου ανήκει στη διάπλαση των σκληροφύλλων αείφυλλων θαμνώνων, γνωστή ως «μακκία» βλάστηση (Εικόνες 17, 18, 19). Η χλωρίδα αποτελείται κυρίως από ψηλούς και χαμηλούς θάμνους των ειδών Οlea europaea (ελιά), Ceratonia siliqua (χαρουπιά), Pistacia lentiscus (σχίνος), καθώς και Quercus coccifera (περνιά). Μεγάλη έκταση καλύπτει επίσης και η ακακία του είδους Acacia saligna, η οποία όμως δεν αποτελεί ιθαγενές είδος της Κύπρου και γίνονται προσπάθειες απομάκρυνσής της. Στην περιοχή υπάρχουν και άλλα ξενικά είδη, όπως τα Eucalyptus spp. (ευκάλυπτος) και Pinus brutia (τραχεία πεύκη). Συναντώνται επίσης φρύγανα, όπως το Sarcopoterium spinosum, ανάμικτα με μικρές εκτάσεις ψευδοστέπας µε αγρωστώδη και µονοετή φυτά. Χαρακτηριστικά μονοετή φυτά της περιοχής είναι τα Centaurea hyalolepis, Chrysanthemum coronarium, Notobasis cypriaca, Oxalis pes-caprae, Anchusa undulata, Teucrium micropodioides, Ranunculus muricatus και Malva sylvesrtis. Επίσης απαντώνται τα είδη Phagnalon rupestre, Noaea mucronata, Allium willeanum, Allium ampeloprasum, Limonium sinuatum κ.ά. Αυτού του είδους φρυγανώδης βλάστηση αποτελεί τον πιο συχνό τύπο βλάστησης σε όλη Εικόνα 17: Ευρύτερη περιοχή της λίμνης Παραλιμνίου. Εικόνα 18: Φυσική βλάστηση της περιοχής συλλογής δειγμάτων κοντά στο Νοσοκομείο Παραλιμνίου. Εικόνα 19: Φυσική βλάστηση της περιοχής συλλογής δειγμάτων κοντά στο Νοσοκομείο Παραλιμνίου

63 Υλικά και μέθοδοι την Κύπρο (Τμήμα Περιβάλλοντος Κύπρου, Στην ευρύτερη περιοχή της λίμνης Παραλιμνίου συναντώνται κυρίως καλλιέργειες σιτηρών διακοπτόμενες από ακαλλιέργητες εκτάσεις. Οι ακαλλιέργητες εκτάσεις καταλαμβάνονται από θαμνώνες με χαμηλούς μαξιλορόμορφους θάμνους (Τμήμα Περιβάλλοντος Κύπρου, Η λίμνη Παραλιμνίου μαζί με το εθνικό πάρκο του Κάβο Γκρέκο αποτελούν τους σημαντικότερους βιοτόπους της επαρχίας Αμμοχώστου. Η λίμνη Παραλιμνίου καταλαμβάνει μια έκταση 5 km 2 περίπου και βρίσκεται στα δυτικά του Παραλιμνίου. Καλύπτει επίσης εκτάσεις των γειτονικών χωριών Εικόνα 20: Μέρος της λίμνης Παραλιμνίου, κατά την Δερύνειας και Σωτήρας. Η λίμνη άνοιξη (Εικόνα 20) είναι φυσική, σχετικά μικρή και ρηχή και ουσιαστικά, παρουσιάζει εποχιακό χαρακτήρα. Τα τελευταία χρόνια ο Δήμος Παραλιμνίου έχει υποστεί ραγδαίες οικιστικές και δημογραφικές αλλαγές, που οφείλονται κυρίως στην ανάπτυξη της τουριστικής βιομηχανίας και στην αστικοποίηση της περιοχής. Σήμερα η λίμνη Παραλιμνίου βρίσκεται αντιμέτωπη με μια πληθώρα απειλών και κινδύνων, όπως η οικοπεδοποίηση, η μόλυνση υπόγειων υδάτων από την απόρριψη σκουπιδιών και λυμάτων στη λίμνη, ακόμα και η ηχορύπανση που προκαλείται από τη λειτουργία ενός σκοπευτηρίου στην περιοχή και η διεξαγωγή αγώνων ταχύτητας. Οι δυσμενέστατες επιπτώσεις που έχει δεχθεί η ευρύτερη περιοχή έχουν ως αποτέλεσμα σήμερα να αντιμετωπίζει αυτή μεγάλα οικολογικά προβλήματα που έχουν σοβαρό αντίκτυπο στην οικολογική ισορροπία του βιοτόπου (Τμήμα Δασών Κύπρου, Ιδιαίτερα στοιχεία της πανίδας της περιοχής Το κυπριακό νερόφιδο Νatrix natrix cypriaca είναι ένα από τα δύο ενδημικά υποείδη φιδιών της Κύπρου και είναι αρκετά εξαρτημένο από το νερό γι αυτό και συναντάται συνήθως μέσα ή πολύ κοντά σ αυτό. Το υποείδος αυτό εθεωρείτο ότι είχε εξαφανιστεί από το 1960 εξαιτίας της χρήσης επιβλαβών χημικών ουσιών στις καλλιέργειες, οι οποίες κατέληγαν στις λίμνες. Έτσι, όταν η χρήση χημικών διακόπηκε

64 Υλικά και μέθοδοι οριστικά το κυπριακό νερόφιδο ξαναεντοπίστηκε το 1992 σε ορισμένες περιοχές του Τροόδους και στο φράγμα Ξυλιάτου. Σύμφωνα με την εμπειρογνώμονα κ. Birgit Blosat, στη λίμνη Παραλιμνίου έχει εντοπιστεί ένας σχετικά αξιόλογος βιώσιμος πληθυσμός του νερόφιδου (Blosat, 2006). Η σημαντικότητα του νερόφιδου ως ενδημικού είδους της Κύπρου έχει αναγνωρισθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση, καθότι το είδος αυτό έχει περιληφθεί στο Παράρτημα II της Ευρωπαϊκής Οδηγίας των Οικοτόπων (Οδηγία 92/43/ΕΟΚ). Στο Παράρτημα II περιλαμβάνονται τα είδη που κινδυνεύουν με εξαφάνιση και των οποίων η προστασία τους χρήζει τη διατήρηση των οικοτόπων τους. Ο βιότοπος της λίμνης Παραλιμνίου έχει ήδη συμπεριληφθεί στο δίχτυο «Natura 2000» και από τις 16 Ιανουαρίου 2009 έχει χαρακτηριστεί ως Οικότοπος Κοινοτικής Σημασίας. Η λίμνη είναι μια από τις πιο σημαντικές περιοχές στο νησί για την αναπαραγωγή σπάνιων και απειλούμενων πουλιών, όπως π.χ. τα Vanellus spinosus (πελλοκατερίνα), Himantopus himantopus (καλαμοκανάς) και Calandrella brachydactyla (μικρογαλιάντρα) (Πτηνολογικός Σύνδεσμος Κύπρου, Στην ευρύτερη περιοχή του Παραλιμνίου μπορεί κάποιος να συναντήσει διάφορα είδη θηλαστικών, όπως τα Vulpes vulpes (αλεπού), Lepus europaeus cyprius (λαγός) και Hemiechinus auritus dorotheae (ασιατικός σκαντζόχοιρος), καθώς και διάφορα είδη ερπετών, όπως φίδια και σαύρες

65 Υλικά και μέθοδοι Περιοχή ποταμού Λιοπετρίου Σύμφωνα με τον Δασικό Νόμο, από τις 30 Απριλίου 1984 η περιοχή έχει αναγνωριστεί ως «Εθνικό Δασικό Πάρκο». Το τοπίο παρουσιάζει μια φυσική ομορφιά με βραχότοπους και άγρια βλάστηση. Ο ποταμός ο οποίος βρίσκεται κοντά στο χωριό Λιοπέτρι είναι μια στενή ελικοειδής λωρίδα της θάλασσας που μοιάζει με φιόρδ και έχει μήκος περίπου 600 m και πλάτος από m (Εικόνα 21). Λόγω του σχήματός του, ο ποταμός χρησιμεύει ως φυσικό ψαρολίμανο από επαγγελματίες και ερασιτέχνες Εικόνα 21: Ο ποταμός Λιοπετρίου. λόγω του σχήματός του ψαράδες και μικρά τουριστικά χρησιμεύει ως φυσικό ψαρολίμανο. σκάφη. Βλάστηση Στην περιοχή επικρατεί η μακκία βλάστηση (Εικόνες 22 Α, Β). Κυρίαρχα είδη είναι τα, Οlea europaea (ελιά), Ceratonia siliqua (χαρουπιά), Pistacia lentiscus (σχίνος), Acacia saligna (ακακία), Eucalyptus spp. (ευκάλυπτος) καθώς και Quercus coccifera (περνιά). Μεγάλη έκταση καλύπτει και η φρυγανώδης βλάστηση με είδη όπως τα Ferula communis, Sarcopoterium spinosum και Zizyphus lotus, αλλά και μονοετή φυτά όπως τα Phagnalon rupestre, Noaea mucronata, Allium willeanum και Allium (Α) (Β) Εικόνα 22 Α, Β: Φυσική βλάστηση της περιοχής συλλογής δειγμάτων κοντά στον ποταμό Λιοπετρίου

66 Υλικά και μέθοδοι ampeloprassum. Η περιοχή γύρω από τον ποταμό καλύπτεται από αλοφυτική βλάστηση με κυρίαρχα τα είδη Salicornia sp., Tamarix tetragyna, Spergularia didra και Lolium rigidum (Τμήμα Περιβάλλοντος Κύπρου, Ιδιαίτερα στοιχεία της πανίδας της περιοχής Η περιοχή γύρω από τον ποταμό Λιοπετρίου μαζί με τα νησιά Κλείδες είναι από τις λίγες περιοχές στον κόσμο όπου μπορεί κανείς να παρατηρήσει το παγκοσμίως απειλούμενο είδος γλάρου Larus audouinii (νησόγλαρος) (Πτηνολογικός Σύνδεσμος Κύπρου, Περιοχή Πλατρών Οι Κάτω Πλάτρες είναι χωριό της επαρχίας Λεμεσού και βρίσκεται 42 km βορειοδυτικά της πόλης της Λεμεσού. Το χωριό είναι κτισμένο σε πανοραμική θέση στη καρδιά του όρους Τροόδους και συνδέει το Τρόοδος, τη Λεμεσό και την Πάφο. Το κλίμα της περιοχής ευνοεί την καλλιέργεια φυλλοβόλων οπωροφόρων, όπως είναι οι μηλιές, οι κερασιές, οι αχλαδιές, οι ροδακινιές, και οι δαμασκηνιές. Μεγάλες εκτάσεις χρησιμοποιούνται επίσης για την αμπελοκαλλιέργεια. Η μεγαλύτερη έκταση γύρω από το χωριό είναι ακαλλιέργητη με άγρια φυσική βλάστηση. Μέρος της διοικητικής έκτασης των Πλατρών περιλαμβάνεται στο Εθνικό Εικόνα 23: Γεωγραφική θέση του Εθνικού Δασικού Πάρκου του όρους Τροόδους στην Κύπρο (κάτω αριστερά). Με κόκκινη διακεκομμένη γραμμή διαγράφονται τα όρια του Εθνικού Δασικού Πάρκου Τροόδους. Δασικό Πάρκο Τροόδους. Το Δάσος του Τροόδους (Εικόνα 23) καλύπτει μια έκταση 110 km 2 και υψομετρικά εκτείνεται από τα 700 m μέχρι την κορυφή της Χιονίστρας (Όλυμπος) στα 1952 m, που αποτελεί και την ψηλότερη κορυφή της Κύπρου. Το

67 Υλικά και μέθοδοι μεγαλύτερο μέρος του δάσους (περίπου 90 km 2 ) έχει ανακηρυχθεί σε εθνικό πάρκο, με κύρια λειτουργία την αναψυχή του κοινού. Επίσης από τις 22 Νοεμβρίου 2005 η περιοχή έχει χαρακτηριστεί ως Ζώνη Ειδικής Προστασίας (Πρόγραμμα LIFE Φύση, Ο κυριότερος ποταμός που διασχίζει την περιοχή είναι ο Κρυός, ο οποίος πηγάζει από την Χιονίστρα (Όλυμπος) και κατευθύνεται προς νότο. Ρέει στην ανατολική πλευρά των Πλατρών. Σχηματίζει στο πέρασμα του μια καταπράσινη κοιλάδα με μοναδική χλωρίδα, πανίδα και καταρράκτες (Εικόνα 24). Η ροή του νερού του είναι συνεχής, με αυξομειώσεις ανάλογα με τις καιρικές συνθήκες. Υπάρχουν δύο καταρράκτες στον Κρυό Ποταμό, ο καταρράκτης των Καληδονιών και ο καταρράκτης του Μιλλομέρη, οι οποίοι είναι οι πιο γνωστοί στη Εικόνα 24: Ο Κρυός ποταμός που διασχίζει τις Πλάτρες. Κύπρο. Βλάστηση Το όρος Τρόοδος περιλαμβάνει ποικιλία τύπων οικοτόπων (14 τύποι οικοτόπων του Παραρτήματος Ι της Οδηγίας 92/43/EOK) και θεωρείται σημαντική περιοχή για τη βιοποικιλότητα της Κύπρου, καθώς φιλοξενεί 343 σημαντικά φυτικά και ζωικά είδη. Μεγάλο ποσοστό των φυτών αυτών είναι ενδημικά και για τον λόγο αυτό θεωρείται ως ένα από τα 13 "Θερμά σημεία βιοποικιλότητας των φυτών" στη Μεσόγειο (Τμήμα Δασών Κύπρου, Η περιοχή του Τροόδους κυριαρχείται από δασικά οικοσυστήματα με Pinus brutia (τραχεία πεύκη), Pinus nigra pallasiana (μαύρη πεύκη) και Juniperus foetidissima. Στο υψόμετρο από 1200 έως 1500 m απαντώνται τα Pinus brutia αναμεμιγμένα με Pinus nigra pallasiana. Το δάσος μαύρης πεύκης Pinus nigra pallasiana (ζώνη των μαυρόπευκων) (Εικόνα 25) ξεκινάει από τα 1400 m και φτάνει μέχρι την κορυφή (1952 m) του

68 Υλικά και μέθοδοι βουνού. Το δάσος αυτό καλύπτει το 39% της περιοχής και περιλαμβάνει τα είδη Quercus alnifolia, Juniperus oxycedrus, Juniperus foetidissima, Sorbus aria ssp. cretica, Berberis cretica, Arbutus andrachne, Rosa chionistrae, Rosa canina, Cotoneaster racemiflorus κ.λπ. Επίσης, σε ορισμένα σημεία συναντάται και μόνος του ο οικότοπος των θαμνώνων και των δασικών συστάδων του Quercus alnifolia (Εικόνα 26). Η βλάστηση της περιοχής των Πλατρών αποτελείται κυρίως από πευκοδάση Pinus brutia (Εικόνα 26). Στον υπόροφο υπάρχουν είδη όπως το ενδημικό Quercus alnifolia (Εικόνα 27), το Arbutus andrachne, το Pistacia terebinthus, το Styrax officinalis και πολλοί άλλοι θάμνοι και πόες. Εικόνα 25: Συστάδα Pinus nigra pallasiana (μαύρη πεύκη) με υπόροφο φτέρης στο Τρόοδος. Εικόνα 26: Μικτή συστάδα Cedrus brevifolia (κυπριακός κέδρος), Quercus alnifolia (λατζιά) και Pinus brutia (τραχεία πεύκη). Εικόνα 27: Συστάδες Quercus alnifolia (λατζιά) σε βραχώδεις πλαγιές του όρους Τροόδους. Εικόνα 28: Πλαγιές στις Πλάτρες με Prunus dulcis (αμυγδαλιά) και αμπέλια. Τα είδη Prunus dulcis (Εικόνα 28), Cistus creticus και Cistus salvifolius, Onopordum cyprium, Capparis spinosa, Salvia fruticosa, Quercus coccifera, καθώς και το Olea europaea ήταν κυρίαρχα στην περιοχή όπου γινόταν η συλλογή των δειγμάτων της παρούσας εργασίας (Εικόνα 29). Διάσπαρτα, υπήρχαν δένδρα του ενδημικού είδους κέδρου Cedrus brevifolia (Τμήμα Δασών Κύπρου,

69 Υλικά και μέθοδοι Εικόνα 29: Η περιοχή συλλογής δειγμάτων στις Κάτω Πλάτρες. Τα παρόχθια δάση που σχηματίζονται γύρω από τον Κρυό ποταμό αποτελούνται κυρίως από Platanus orientalis και Liquidambar orientalis. Ιδιαίτερα στοιχεία της πανίδας της περιοχής Το όρος Τρόοδος με 78 καταγεγραμμένα σημαντικά είδη πουλιών έχει προταθεί ως περιοχή SPA (Special Protection Areas - Περιοχές Ειδικής Προστασίας). Διάφορα αρπακτικά πουλιά, όπως τα Hieraetus fasciatus (σπιζαετός, περτικοσιάχινο), Falco eleonorae (μαυροπετρίτης) και Falco peregrinus (πετρίτης) απαντούν στην περιοχή, ενώ αποτελεί μία από τις δύο περιοχές της Κύπρου που χρησιμοποιείται από τον Gyps fulvus (όρνιο) (Πτηνολογικός Σύνδεσμος Κύπρου, Η περιοχή είναι μία από τις σημαντικότερες στην Κύπρο για έξι είδη πουλιών του Παραρτήματος Ι της Οδηγίας 79/409/ΕΟΚ, καθώς φιλοξενεί πληθυσμούς των ενδημικών πουλιών της Κύπρου, όπως τα Sylvia melanothorax (τρυποπάσιης) και Oenanthe cypriaca (σκαλιφούρτα), αλλά και μεγάλους πληθυσμούς του ενδημικού Loxia curvirostra quillemardi (σταυρομύτης) (Πτηνολογικός Σύνδεσμος Κύπρου,

70 Υλικά και μέθοδοι 2.2. ΣΥΛΛΟΓΗ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Η σύλληψη των πειραματοζώων έγινε με τη χρήση 14 παγίδων πολλαπλής σύλληψης τύπου Ugglan (Εικόνες 30, 31). Κάθε παγίδα είναι μια παραλληλόγραμμη κατασκευή από μεταλλικό πλέγμα στερεωμένη σε ξύλινη επιφάνεια. Στην πρόσθια πλευρά φέρει μηχανισμό καταπακτής από όπου εισέρχονται τα ζώα, ενώ στην οπίσθια πλευρά έχει μία αποσπώμενη μεταλλική επιφάνεια η οποία καλύπτει τη θυρίδα απομάκρυνσης των συλληφθέντων ζώων. Εικόνα 30: Παγίδα πολλαπλής σύλληψης τύπου Ugglan, με μηχανισμό καταπακτής. Εικόνα 31: Παγίδα πολλαπλής σύλληψης τύπου Ugglan, στην οποία βρίσκεται παγιδευμένο ένα άτομο του είδους Μus cypriacus. Οι παγίδες το τοποθετούνταν κατά τις απογευματινές ώρες, είτε σε ανθρωπογενείς (αποθήκες σιτηρών, φάρμες κλπ) είτε σε αγροτικούς οικοτόπους (εγκαταλειμμένες αποθήκες, κτίσματα και καλλιέργειες κ.τ.λ.), σε θέσεις όπου υπήρχαν ενδείξεις παρουσίας μικροθηλαστικών (π.χ. περιττώματα). Η τοποθέτηση των παγίδων γινόταν σε σημεία που μπορούσαν να προσφέρουν κάλυψη στα ζώα, επειδή είναι γνωστόν ότι τα μικρά θηλαστικά δεν κινούνται σε ακάλυπτους χώρους, αλλά προτιμούν διαδρομές κατά μήκος τοίχων ή διαμέσου σημείων που προσφέρουν κάλυψη (Εικόνα 32). Ο Εικόνα 32: Παγίδα πολλαπλής σύλληψης τύπου Ugglan τοποθετημένη σε κατάλληλο σημείο στη φύση

71 Υλικά και μέθοδοι έλεγχος των παγίδων γινόταν το επόμενο πρωί. Οι παγίδες ήταν εφοδιασμένες με μικρή ποσότητα από βαμβάκι ώστε να προστατεύονται τα παγιδευμένα ζώα από το κρύο, ειδικά κατά τους χειμερινούς μήνες δειγματοληψιών. Ως δόλωμα χρησιμοποιήθηκαν ξηροί καρποί και συγκεκριμένα καρύδια, τα οποία τοποθετούνταν μέσα και πάνω στην καταπακτή της παγίδας, ενώ μικρή ποσότητα καρπού υπήρχε λιωμένη στην είσοδο της παγίδας, ώστε να αναδύονται οι μυρωδιές και να προσελκύουν τα ζώα ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Επεξεργασία στο ύπαιθρο Η θανάτωση των ζώων γινόταν την ίδια μέρα της σύλληψής τους, με βαθιά νάρκωση σε ατμόσφαιρα χλωροφορμίου. Στη συνέχεια προσδιοριζόταν το φύλο, γίνονταν οι απαραίτητες μορφολογικές παρατηρήσεις και τέλος λαμβάνονταν οι εξής σωματικές μετρήσεις κάθε ζώου (Εικόνα 33), με τη βοήθεια υποδεκάμετρου: 1) Ολικό σωματικό μήκος (Total Body Length - TBL): η απόσταση από το άκρο του ρύγχους μέχρι το άκρο της ουράς, χωρίς να περιλαμβάνεται ο ακραίος θύσανος τριχών της ουράς, 2) Μήκος ουράς (Tail Length - TL): η απόσταση από το οπίσθιο χείλος της έδρας μέχρι το άκρο της ουράς, χωρίς να περιλαμβάνεται ο ακραίος θύσανος τριχών, 3) Μήκος πτερυγίου αυτιού (Ear Length - EL): η απόσταση από το κατώτερο σημείο της εγκοπής του πτερυγίου η οποία υπάρχει στο κάτω χείλος της εισόδου του έξω ακουστικού πόρου μέχρι το ανώτερο σημείο του χείλους του πτερυγίου, και 4) Μήκος οπίσθιου ακροποδίου (Hind Foot Length - HFL): η απόσταση από την άρθρωση της φτέρνας μέχρι το ελεύθερο άκρο του μεγαλύτερου δακτύλου, χωρίς να περιλαμβάνεται το μήκος του νυχιού

72 Υλικά και μέθοδοι Εικόνα 33: Απεικόνιση του τρόπου λήψης των κύριων σωματικών μετρήσεων: ολικό σωματικό μήκος (ΤBL), μήκος ουράς (ΤL), μήκος πτερυγίου αυτιού (EL) και μήκος οπίσθιου ακροποδίου (HFL). Οι ημερομηνίες συλλογής και θανάτωσης, οι παρατηρήσεις, οι σωματικές μετρήσεις, το φύλο του κάθε ζώου, καθώς και στοιχεία από τις περιοχές συλλογής (γεωγραφικές συντεταγμένες, τοποθεσία και τύπος οικοτόπου) καταγράφονταν σε σχετικό αρχείο του προγράμματος Excel. Τα άτομα που συλλέχθηκαν έφθασαν στο Εργαστήριο Ζωολογίας μέσα σε γυάλινα δοχεία, συντηρημένα είτε σε αλκοόλη 95% είτε σε πάγο για περαιτέρω επεξεργασία Επεξεργασία στο εργαστήριο Στο Εργαστήριο Ζωολογίας γινόταν η αφαίρεση, ο καθαρισμός και η κατεργασία των δερμάτων και των κρανίων όλων των ζώων. Με το τέλος της επεξεργασίας τους, τα ζώα έπαιρναν τον αύξοντα αριθμό της συλλογής δειγμάτων των θηλαστικών του Ζωολογικού Μουσείου του Πανεπιστημίου Πατρών στην οποία παραμένουν κατατεθειμένα. Ο αριθμός αυτός αναγράφεται σε μικρή καρτέλα, δεμένη στο δεξιό οπίσθιο ακροπόδιο κάθε ζώου, καθώς και στο φιαλίδιο που φέρει το κρανίο του. Ο ίδιος αριθμός μαζί με το όνομα του συλλέκτη και τα στοιχεία κάθε συλλεγέντος ζώου που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη ενότητα (2.3.1) καταγράφονταν στο επίσημο βιβλίο συλλογών του Ζωολογικού Μουσείου. Από κάθε άτομο απομονωνόταν το ήπαρ, το οποίο μεταφερόταν σε ειδικό πλαστικό φιαλίδιο (cryogenic vial) των 2 ml που έφερε τον επίσημο αύξοντα αριθμό συλλογής του ατόμου. Τα φιαλίδια αυτά τοποθετούνταν σε κατάλληλα πλαστικά δοχεία (cryoboxes) και φυλάσσονταν σε θερμοκρασία -80 ο C, με σκοπό τη διατήρηση του πειραματικού υλικού για χρήση σε μελλοντικά πειράματα ανάλυσης DNA

73 Υλικά και μέθοδοι Ο ταξινομικός προσδιορισμός του είδους των ζώων που συλλέχθηκαν έγινε αρχικά με βάση τα διακριτικά εξωτερικά μορφολογικά χαρακτηριστικά των ειδών, σύμφωνα με τα γνωστά από τη βιβλιογραφία (Niethammer & Krapp, 1978 Macdonald & Barrett, 1993 Cucchi et al., 2006). Επειδή για πολλά από τα συλλεγέντα άτομα ο ταξινομικός προσδιορισμός δεν μπορούσε να γίνει με βεβαιότητα, λόγω επικαλυπτόμενης ποικιλότητας των ειδών, έγινε επαλήθευση του προσδιορισμού με τη χρήση μοριακών μεθόδων (βλέπε ενότητα 2.4). Περαιτέρω, για να γίνει μορφομετρική σύγκριση των πληθυσμών, λήφθηκαν φωτογραφίες όλων των κρανίων με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή SONY CYBERSHOT DSC F-717. Οι φωτογραφίες κάθε ατόμου αφορούσαν στην κοιλιακή, πλευρική και ραχιαία επιφάνεια του κρανίου, στις δύο πλευρικές επιφάνειες (εξωτερική και εσωτερική) των κάτω ημιγναθίων αλλά και στην κάτοψη των δοντιών της άνω γνάθου ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΛΛΕΧΘΕΝΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ Όπως προαναφέρθηκε, για τη σωστή ταξινόμηση των συλλεχθέντων ποντικών σε είδη του γένους Mus, κρίθηκε αναγκαία η μελέτη πολλών ατόμων από τα δύο πληθυσμιακά δείγματα, ως προς την αλληλουχία τμήματος της περιοχής ελέγχου (control region, D-loop) του μιτοχονδριακού DNA (mtdna). Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε έλεγχος σε 44 από τα 70 συλλεχθέντα άτομα του γένους Mus. Η μοριακή ταυτοποίηση ενός μέρους των συλλεχθέντων ατόμων οφείλεται κυρίως σε οικονομική αδυναμία μοριακής ανάλυσης του συνόλου των ατόμων, καθώς το κόστος της είναι ιδιαίτερα υψηλό. Η επιλογή των ατόμων έγινε με μοναδικά κριτήρια να καλυφθούν: α) όλες οι διαφορετικές θέσεις μέσα στην ευρύτερη περιοχή συλλογής κάθε πληθυσμού και β) όλες οι εποχές συλλογής. Τέλος, σε κάθε θέση δειγματοληψίας και κάθε εποχή συλλογής, η επιλογή των ατόμων γινόταν με τυχαίο τρόπο. Στη συνέχεια, για τα άτομα αυτά ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Απομόνωση του ολικού DNA από ιστό ήπατος. 2. Ηλεκτροφόρηση του ολικού DNA. 3. Πολλαπλασιασμός του συγκεκριμένου τμήματος του mtdna με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR)

74 Υλικά και μέθοδοι 4. Ηλεκτροφόρηση πολλαπλασιασμένου DNA. 5. Καθαρισμός του πολλαπλασιασμένου τμήματος της d-loop περιοχής. 6. Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του πολλαπλασιασμένου τμήματος (sequencing). 7. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Απομόνωση ολικού DNA από ιστό ήπατος Σύμφωνα με όσα έχουν προαναφερθεί, στο εργαστήριο από κάθε άτομο απομονωνόταν το ήπαρ, το οποίο φυλασσόταν σε θερμοκρασία -80 ο C για τη χρήση σε πειράματα ανάλυσης DNA. Όσον αφορά στα άτομα που συντηρούνταν σε αλκοόλη, έπρεπε να γίνει μία προεργασία πριν λάβει χώρα η διαδικασία της απομόνωσης του DNA ώστε να αφαιρεθεί η αλκοόλη. Για τον σκοπό αυτόν οι ιστοί επωάζονταν σε 600λ ρυθμιστικού διαλύματος TE9 καθ όλη τη διάρκεια της νύκτας σε ανακινούμενο υδατόλουτρο θερμοκρασίας δωματίου (TE9 buffer: 500mM Tris, 20mM EDTA, 10mM NaCI, ph 9.0) (Shiozawa et ai., 1992 Wirgin et ai., 1997). Στη συνέχεια εφαρμοζόταν η εξής διαδικασία για όλα τα δείγματα των 44 μελετηθέντων ατόμων. Γινόταν απομόνωση mtdna από κύτταρα ήπατος με τη χρήση ειδικού συνόλου αντιδραστηρίων με την επωνυμία Invisorb Spin Tissue Mini Kit της εταιρείας Invitek. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε έχει ως εξής (Εικόνα 34): 1. Ποσότητα περίπου 25 mg κατεψυγμένου ιστού ήπατος από κάθε άτομο υποβαλλόταν σε ξηρή μηχανική ομογενοποίηση, με τη χρήση ομογενοποιητή χειρός μέσα σε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο eppendorf χωρητικότητας 1,5ml. Στα σωληνάρια γινόταν προσθήκη 400 μl Lysis Buffer G και 40 μl Proteinase K, και ανακινούνταν με αναδευτήρα vortex. Ακολούθως, τα μείγματα επωάζονταν σε υδατόλουτρο συνεχούς ανάδευσης σε σταθερή θερμοκρασία 52 o C, επί 3 ώρες. Κατά την επώαση, όταν δεν παρατηρούνταν πλέον συσσωματώματα ιστού στη βάση των σωληναρίων, η λύση των κυττάρων κρινόταν ικανοποιητική και η επώασή τους σταματούσε. 2. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση επί 2 min στις rpm (στροφές/λεπτό) για να καθιζάνουν όλα τα αδιάλυτα συσσωματώματα και μεταφορά του υπερκείμενου σε νέο eppendorf του 1,5ml. 3. Για την απομάκρυνση των μορίων RNA γινόταν προσθήκη 16μl RNase A, ανάδευση με vortex και επώαση επί 5 min σε θερμοκρασία δωματίου

75 Υλικά και μέθοδοι 4. Στη συνέχεια γινόταν προσθήκη 200μl ρυθμιστικού διαλύματος Τ (Binding Buffer T) και ανάδευση με vortex επί 10 sec. Με αυτό τον τρόπο τα νουκλεϊκά οξέα των κυττάρων απελευθερώνονταν στο διάλυμα. Αυτό το διάλυμα μεταφερόταν σε ειδικά σωληνάρια φυγοκέντρησης (Spin Column) τα οποία τοποθετούνταν σε ειδικό σωληνάριο συλλογής (Receiver Tube, 2,0 ml). Ακολουθούσε επώαση επί 1 min και φυγοκέντρηση στις rpm επί 2 min. Το υγρό διήθημα απορριπτόταν και τα νουκλεϊκά οξέα παρέμεναν συγκρατημένα στη μεμβράνη απορρόφησης των σωληναρίων φυγοκέντρησης, τα οποία τοποθετούνταν και πάλι στα σωληνάρια συλλογής. 5. Ακολούθως, γινόταν προσθήκη 550μl ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης (Wash Buffer), φυγοκέντρηση στις rpm επί 1 min και απόρριψη του υγρού διηθήματος. Το βήμα αυτό επαναλαμβανόταν ακόμα μια φορά. Για να εξασφαλιστεί η πλήρης απομάκρυνση των πρωτεϊνών του αποσυντεθειμένου RNA και της αιθανόλης από το διάλυμα αλλά και για να επιτευχθεί η πλήρης Εικόνα 34: Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας που ακολουθήθηκε για την απομόνωση ολικού DNA

76 Υλικά και μέθοδοι κατακράτηση του DNA στη μεμβράνη απορρόφησης των σωληναρίων φυγοκέντρησης, πραγματοποιόταν μια τελευταία φυγοκέντρηση στις rpm επί 2 min και απόρριψη του διηθήματος. 6. Τέλος, τα σωληνάρια φυγοκέντρησης τοποθετούνταν σε νέα αποστειρωμένα σωληνάρια συλλογής και στα πρώτα γινόταν προσθήκη 200μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης D (Elution Buffer D) το οποίο ήταν προθερμασμένο στους 52 o C. Ακλουθούσε επώαση επί 3 min και μια τελική φυγοκέντρηση στις rpm επί 2 min, ώστε να αποδεσμευτεί το DNA από τη μεμβράνη απορρόφησης των σωληναρίων φυγοκέντρησης. 7. Με αυτή τη διαδικασία συλλεγόταν διάλυμα ολικού DNA το οποίο παρέμενε πλέον σε θερμοκρασία -20 o C Ηλεκτροφόρηση του ολικού DNA Για τη διαπίστωση της απομόνωσης του ολικού DNA πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφορητικός έλεγχος. Η διαδικασία εφαρμογής του η οποία επαναλαμβάνεται και σε δύο ακόμη στάδια της όλης διαδικασίας (πολλαπλασιασμός και καθαρισμός του μελετηθέντος γονιδίου περιγράφεται στην ενότητα Πολλαπλασιασμός του συγκεκριμένου τμήματος του mtdna με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε πολλαπλασιασμός τμήματος της περιοχής ελέγχου (D-Ioop) του mtdna. Για να εφαρμοστεί η τεχνική της PCR χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα υλικά (Herrington & O Leary, 1998): Μικρή ποσότητα δίκλωνου mtdna που περιλαμβάνει το τμήμα της περιοχής ελέγχου και θα λειτουργήσει ως μήτρα για την αντιγραφή. Taq πολυμεράση: είναι το ένζυμο που θα συνδεθεί στη αλληλουχία μήτρα και συνθέτει περίπου 2000 νουκλεοτίδια το λεπτό. Έχει απομονωθεί από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus, έναν οργανισμό που ζει σε θερμές πηγές, και όπως πολλά από τα ένζυμά του, έτσι και η Taq πολυμεράση είναι θερμοσταθερή (αντέχει σε επαναλαμβανόμενη θέρμανση σε ο C), δηλαδή δεν αποδιατάσσεται όταν αλλάζει η θερμοκρασία του περιβάλλοντός της. Αυτό το χαρακτηριστικό της είναι που την καθιστά ιδιαίτερα σημαντική στη μέθοδο της PCR, γιατί δεν χρειάζεται η προσθήκη νέου ενζύμου μετά από κάθε κύκλο

77 Υλικά και μέθοδοι πολυμερισμού (Μίντζας & Φλυτζάνης, 2002 Brown, 2006). Ζεύγος εκκινητών (primers). Τα συνθετικά αυτά ολιγονουκλεοτίδια έχουν μήκος συνήθως ζευγών βάσεων (bp) και καθορίζουν την αλληλουχία του DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. Οι εκκινητές αποτελούνται από διαφορετικές, μη συμπληρωματικές αλληλουχίες, με αποτέλεσμα να μην υβριδίζονται μεταξύ τους, αλλά με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες του mtdna (Saiki et al., 1988). dntp s: ελεύθερα 5 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια σε συγκέντρωση ίση μεταξύ τους, τα οποία θα συνθέσουν τις συμπληρωματικές προς την αλληλουχίαμήτρα αλυσίδες DNA. Ιόντα MgCl 2 : Τα ιόντα αυτά δρουν ως προσθετική ομάδα και ενεργοποιούν τη δράση της πολυμεράσης. Επίσης, το μαγνήσιο, ως δισθενές κατιόν (και δεδομένου ότι το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο) έχει την ικανότητα να υποβοηθά στον υβριδισμό των εκκινητών στο υπόστρωμα. Κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (PCR Buffer), το οποίο είναι απαραίτητο για να επιτευχθούν οι κατάλληλες συνθήκες για τη δράση της πολυμεράσης. Συνήθως περιλαμβάνει Tris-HCL για τη ρύθμιση του pη και KCl που διευκολύνει τον υβριδισμό των ολιγονουκλεοτιδίων έναρξης με την περιοχή έναρξης της αντιγραφής του τμήματος του DNA και αυξάνει τον ρυθμό σύνθεσης της συμπληρωματικής αλληλουχίας. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο εκκινητές από αυτούς που αναφέρονται από τους Kocher et al. (1989) και έχουν χρησιμοποιηθεί για άτομα του γένους Μus από πολλούς ερευνητές (Πίνακας 5). Πίνακας 5: Αλληλουχία εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη εργασία. Εκκινητής L15774 Η16498 Αλληλουχία 5'-TGA ATC GGA GGA CAA CCA GT-3' (forward) 5'-CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG-3' (reverse) Για τον πολλαπλασιασμό του τμήματος της περιοχής ελέγχου, τροποποιήθηκε το πρωτόκολλο των Gündüz et al. (2000). Για κάθε δείγµα ατόμου ποντικού στο οποίο θα γινόταν πολλαπλασιασμός του συγκεκριμένου τµήµατος του mtdna ετοιμαζόταν ένα διάλυµα µε την ακόλουθη σύσταση (Πίνακας 6):

78 Υλικά και μέθοδοι Πίνακας 6: Συστατικά διαλύματος και αντίστοιχες ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό του συγκεκριμένου τµήµατος του mtdna. Συστατικά διαλύματος Ποσότητες (λ) PCR Buffer 2,5 MgCl 2 0,75 L ,5 Η ,5 dntp s 0,5 Taq 0,2 DNA 1 H 2 O 19,05 Σύνολο 25 Ο πολλαπλασιασμός των τμημάτων του mtdna της παρούσας μελέτης έγινε στον Προγραμματιζόμενο Θερμικό Κυκλοποιητή (Programmable Thermal Controller - PTC) PTC100 της εταιρείας MJ Research INC (Εικόνα 8). Αναλυτικότερα, η διαδικασία περιελάμβανε τα στάδια που περιγράφονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 7). Ν ο Πίνακας 7 : Διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον πολλαπλασιασμό του τμήματος της περιοχής ελέγχου του mtdna. Στάδιο Χρόνος παραμονής (min.) Θερμοκρασία ( ο C) Αριθμός επαναλήψεων 1 Προεπώαση Αρχικό στάδιο αποδιάταξης Στάδιο υβριδισμού Στάδιο της επιμήκυνσης Τελικό στάδιο Ολοκλήρωση και διατήρηση 4 1 Τα προϊόντα της PCR ελέγχονταν ηλεκτροφορητικά, ακριβώς όπως και στην περίπτωση του απομονωμένου ολικού DNA που περιγράφεται στην επόμενη ενότητα. Τα δείγματα-προϊόντα της PCR φυλάσσονταν σε καταψύκτη, σε θερμοκρασία -20 C

79 Υλικά και μέθοδοι Ηλεκτροφόρηση DNA Για να ελεγχθεί η επιτυχία της απομόνωσης του ολικού mtdna από τους ιστούς, αλλά και η επιτυχία του πολλαπλασιασμού του συγκεκριμένου τμήματός του που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφορητικός έλεγχος. Η ηλεκτροφόρηση είναι η πιο κλασική μέθοδος για τον διαχωρισμό τμημάτων DNA, βασιζόμενη στο μέγεθος και στο ηλεκτρικό φορτίο των μορίων. Η ηλεκτροφόρηση γινόταν σε πήκτωµα αγαρόζης 1%. Η αγαρόζη είναι ένα γραμμικό πολυμερές το οποίο παράγεται από εκχυλίσματα θαλάσσιων φυκών (ροδοφυκών). Όταν το πήκτωμα στερεοποιηθεί στην πλαστική μήτρα, τοποθετείται μέσα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και εφαρμόζεται Εικόνα 35: Σχηματική απεικόνιση της ηλεκτρικό πεδίο στα άκρα του πηκτώματος ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα αγαρόζης. (Εικόνα 35). Από τους στενούς πόρους του πηκτώματος διέρχονται ευκολότερα τα μικρότερου μήκους θραύσματα DNA, με αποτέλεσμα, στον ίδιο χρόνο, αυτά να μετατοπίζονται σε μεγαλύτερη απόσταση από τα μεγαλύτερα θραύσματα. Όσο πιο μακριά από το σημείο τοποθέτησης του προς ηλεκτροφόρηση δείγματος βρίσκεται μια ηλεκτροφορητική ζώνη, τόσο πιο μικρά είναι τα θραύσματα που τη συγκροτούν. Τα θραύσματα αυτά μπορούν να γίνουν εύκολα ορατά μετά από χρώση τους με βρωμιούχο αιθίδιο, μιας χρωστικής που δεσμεύεται στα νουκλεϊκά οξέα του DNA και προκαλεί φθορισμό όταν φωτίζεται με υπεριώδες φως. Το βρωμιούχο αιθίδιο ενσωματώνεται στο πήκτωμα της αγαρόζης κατά την παρασκευή του. Μαζί με το δείγμα ηλεκτροφορείται και ο μάρτυρας (ladder), ο οποίος περιέχει θραύσματα DNA γνωστού μήκους και επιτρέπει να υπολογίσουμε το μέγεθος των θραυσμάτων του δείγματος. Η παρουσία DNA σε ικανοποιητική συγκέντρωση, χωρίς προσμίξεις RNA και πρωτεϊνών, δηλωνόταν µε την παρουσία μίας µόνο ευκρινούς ζώνης. Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε έχει ως εξής (Εικόνα 36): 1. Ζυγίζονταν 0,7g αγαρόζης σε ζυγό ακριβείας και τοποθετούνταν σε κωνική φιάλη των 200ml

80 Υλικά και μέθοδοι 2. Μετά από προσθήκη 70ml διαλύματος ΤΒΕ 1x (Tris-Base, Boric Acid (H 3 BO 3 ), EDTA) η φιάλη μεταφερόταν σε φούρνο μικροκυμάτων, όπου με βρασμό διαλυόταν η αγαρόζη. 3. Όταν το διάλυμα γινόταν διαυγές, αφηνόταν για λίγο να κρυώσει και, όταν η θερμοκρασία του ήταν ανεκτή στο χέρι, γινόταν προσθήκη 3,5μl βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) και η φιάλη αναδευόταν ελαφρά. 4. Το διάλυμα μεταγγιζόταν στην πλαστική μήτρα. Στη μήτρα επίσης τοποθετούνταν και δύο κτενοειδή πλαστικά ενθέματα ( χτενάκια ), καθένα από τα οποία θα σχηματίσει στο πήκτωμα 14 Εικόνα 36: Σχηματική απεικόνιση της πορείας διεξαγωγής της ηλεκτροφόρησης DNA σε υποδοχές τοποθέτησης πήκτωμα αγαρόζης. 1. Ετοιμασία της πλαστικής μήτρας. 2. Μετάγγιση του διαλύματος στην δειγμάτων. πλαστική μήτρα. 3. Τοποθέτηση δύο χτενακίων 5. Όταν το διάλυμα γινόταν πλέον τα οποία θα σχηματίσουν στο πήκτωμα τις υποδοχές τοποθέτησης δειγμάτων. 4. Σύνδεση πήκτωμα, τα χτενάκια της μήτρας με τη συσκευή ηλεκτροφόρησης. αφαιρούνταν και έτσι σχηματίζονταν στο πήκτωμα μικρές υποδοχές στις οποίες θα τοποθετηθούν στη συνέχεια τα προς έλεγχο δείγματα DNA (ολικό DNA ή προϊόν PCR). 6. Ακολούθως γινόταν τοποθέτηση της μήτρας στη συσκευή ηλεκτροφόρησης η οποία γεμιζόταν με διάλυμα TBE 1x, ώστε να καλυφθεί πλήρως το πήκτωμα και οι υποδοχείς δειγμάτων. 7. Τα προς ανάλυση δείγματα (3μl DNA) αναμειγνύονταν με τη χρωστική φόρτωσης (1μl Loading Dye) και τοποθετούνταν με σειρά στις υποδοχές. Η χρήση της χρωστικής επιτρέπει την παρακολούθηση της μετανάστευσης του κάθε δείγματος στο πήκτωμα. 8. Για να ταυτοποιηθεί η παρουσία DNA στα υπό μελέτη δείγματα χρησιμοποιήθηκε ένας μάρτυρας ζωνών (ladder) που περιείχε θραύσματα DNA γνωστού μήκους, τα οποία διέφεραν μεταξύ τους κατά 100 βάσεις (bp). Έτσι, μετά την ηλεκτροφόρηση ο μάρτυρας εμφανιζόταν ως μια σειρά ζωνών. Σε κάθε σειρά δειγμάτων μελέτης περιλαμβανόταν και ένα επιπλέον δείγμα που περιείχε 1,5μl χρωστική φόρτωσης και 1μl μάρτυρα ζωνών

81 Υλικά και μέθοδοι 9. Το δοχείο ηλεκτροφόρησης συνδεόταν με τη συσκευή παροχής συνεχούς ρεύματος και το πήκτωμα ηλεκτροφορείτο επί 45 min στα 90V. 10. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωµα απομακρυνόταν από το δοχείο ηλεκτροφόρησης και μεταφέρονταν σε ένα θάλαμο µε υπεριώδη φωτισμό και ενσωματωμένη ψηφιακή κάμερα (UV Transilluminator, BioDoc-It TM System). Αυτό το σύστημα καταγραφής εικόνας περιλαμβάνει επίσης και σύστημα μεταφοράς των εικόνων σε ηλεκτρονικό υπολογιστή (Εικόνα 37). Με αυτόν τον τρόπο υπάρχει πλέον εικόνα των ηλεκτροφορημάτων των υπό μελέτη δειγμάτων και του μάρτυρα. Εικόνα 37: Σύστημα απεικόνισης και καταγραφής των ηλεκτροφορημάτων 11. Οι εικόνες αυτές αποθηκεύονταν και BioDoc-It. καταγράφονταν σε ειδικό αρχείο Καθαρισμός του πολλαπλασιασμένου τμήματος της D- loop περιοχής Η διαδικασία καθαρισμού πραγματοποιείται για την απομάκρυνση των καταλοίπων ορισμένων ουσιών, όπως ένζυμα ή ολιγονουκλεοτίδια που παραμένουν μέσα στο διάλυμα των νουκλεϊκών οξέων μετά το πέρας των διαδικασιών της απομόνωσής τους, της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) κ.λπ. Το τελικό προϊόν πρέπει να καθαρίζεται από τα κατάλοιπα αυτά, τα οποία μειώνουν τη συγκέντρωση του DNA στο διάλυμα και είναι πηγή θορύβου σε πολλές μεθόδους ανάλυσής του. Στην περίπτωση που ένα τμήμα γενετικού υλικού πολλαπλασιάστηκε µε σκοπό τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του, ο καθαρισμός του προϊόντος της PCR είναι απαραίτητος λόγω της μεγάλης ευαισθησίας που έχουν οι αναλυτές αλληλουχίας (sequencers) στις προσμίξεις. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη χρήση μεμβράνης µε βασικό συστατικό το πυρίτιο ή άλλων πηκτωμάτων που έχουν σχεδιαστεί ειδικά ώστε να προσδένουν και να συγκρατούν τα νουκλεϊκά οξέα. Η πρόσδεση των νουκλεϊκών οξέων στη μεμβράνη γίνεται παρουσία διαλύματος υψηλής αλατότητας, ενώ τα κατάλοιπα που υπήρχαν στο αρχικό προϊόν διαπερνούν τη μεμβράνη και απομακρύνονται. Τα συγκρατηθέντα

82 Υλικά και μέθοδοι νουκλεϊκά οξέα επαναδιαλύονται µε διάλυµα Tris-Hcl ή απεσταγμένο νερό. Στο τελικό διάλυμα περιέχονται % της αρχικής ποσότητας νουκλεϊκών οξέων, μεγάλης καθαρότητας. Για τον καθαρισμό των δειγμάτων της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκε το σύνολο (kit) των αντιδραστηρίων Invisorb DNA CleanUp, της εταιρείας Invitek. Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε περιγράφεται στο πρωτόκολλο που παρέχεται μαζί με τα αντιδραστήρια και είναι η εξής (Εικόνα 38): Γινόταν προσθήκη 130μl Buffer P κατευθείαν μέσα στο σωληνάριο της PCR στο οποίο υπήρχε το πολλαπλασιασμένο τμήμα της περιοχής D-loop, το διάλυμα που προέκυπτε μεταφερόταν σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης (Spin Filter) και επωαζόταν επί ένα λεπτό. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση επί 30sec στις rpm και απόρριψη του υγρού διηθήματος. Ακολουθούσε προσθήκη 700μl Wash Buffer στο σωληνάριο φυγοκέντρησης και φυγοκέντρηση επί 30sec στις rpm. Το υγρό διήθημα απορριπτόταν. Για να εξασφαλιστεί η πλήρης απομάκρυνση της αιθανόλης (που περιεχόταν στο Wash Buffer) από το διάλυμα και η πλήρης κατακράτηση του DNA στη μεμβράνη απορρόφησης των σωληναρίων φυγοκέντρησης, γινόταν ακόμα μία φυγοκέντρηση επί 3 min στις rpm. Τέλος, το σωληνάριο φυγοκέντρησης (Spin Filter) μεταφερόταν σε ένα νέο αποστειρωμένο σωληνάριο συλλογής Εικόνα 38: Σχηματική απεικόνιση της πειραματικής πορείας που ακολουθήθηκε για τον καθαρισμό του DNA

83 Υλικά και μέθοδοι (Receiver Tube, 1,5 ml) και γινόταν προσθήκη 20μl Elution Buffer (ρυθμιστικό διάλυμα προθερμασμένο στους 70 ο C ) στο κέντρο της μεμβράνης του σωληναρίου φυγοκέντρησης. Ακολουθούσε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου επί 10 min (για καλύτερη απόδοση) και μια τελευταία φυγοκέντρηση επί 1 min στις rpm. Με αυτό τον τρόπο επιτρεπόταν η αποδέσμευση των νουκλεϊκών οξέων από τη μεμβράνη και η επαναδιάλυσή τους στα 20 µι του Elution Buffer. Το σωληνάριο φυγοκέντρησης απορριπτόταν ενώ το διήθηµα που περιείχε τα τμήματα της περιοχής ελέγχου D-loop που καθαρίζονταν διατηρούνταν στην κατάψυξη, σε θερμοκρασία -20 C, μέχρι να σταλούν για αλληλούχηση Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) του τμήματος της περιοχής D-loop Η ανάλυση αλληλουχίας των δειγμάτων της παρούσας μελέτης βασίστηκε στην τεχνική των Sanger et al. (1977) και έγινε από την εταιρεία VBC- Biotech Service GmbH, Αυστρία. Η αποστολή των δειγμάτων στην εταιρεία γινόταν µε διαδικασία ταχυμεταφοράς (courier). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αλληλουχίας αποστέλλονταν από την εταιρεία µέσω ηλεκτρονικού ταχυδρομείου ( ) Στατιστική επεξεργασία των δεδομένων της νουκλεοτιδικής αλληλούχησης Στοίχιση των αλληλουχιών του τμήματος της περιοχής D-loop του mtdna Το πολλαπλασιασμένο τμήμα της περιοχής αυτής του mtdna κάθε πειραματοζώου της παρούσας μελέτης δεν είχε σε όλα τον ίδιο αριθμό βάσεων. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε στη μικρή συγκέντρωση του DNA σε ορισμένα δείγματα (κάτι που δυσχεραίνει την ανάγνωση των βάσεων κατά την εφαρμογή της μεθόδου αλληλούχησης των Sanger et al. (1977)), είτε στη δέσμευση των ολιγονουκλεοτιδίων έναρξης σε συμπληρωματικές αλληλουχίες που βρίσκονταν σε διαφορετικές θέσεις κατά μήκος του τμήματος της περιοχής D-loop. Επιπλέον, το μήκος των τμημάτων που μελετήθηκαν μπορεί να επηρεάστηκε από πιθανές ενθέσεις ή ελλείψεις βάσεων. Οι αλληλουχίες των υπό μελέτη δειγμάτων δεν αναμένεται να είναι εντελώς

84 Υλικά και μέθοδοι όμοιες, αλλά να παρουσιάζουν κάποιες διαφορές ως προς τις βάσεις ορισμένων νουκλεοτιδικών θέσεων. Για την αποκάλυψη αυτών των διαφορών, οι αλληλουχίες στοιχίζονταν αρχικά με βάση την αντιστοιχία όσο το δυνατόν περισσότερων ομόλογων περιοχών και στη συνέχεια με βάση τις νουκλεοτιδικές θέσεις που δεν χαρακτηρίζονταν από την ίδια αλληλουχία βάσεων. Η διαδικασία που αφορά στη στοίχιση του ίδιου τμήματος DNA σε περισσότερα από δύο δείγματα ονομάζεται πολλαπλή στοίχιση (multiple alignment) και γίνεται προοδευτικά, αρχίζοντας µε τη στοίχιση των αλληλουχιών ανά ζεύγος. Αρχικά ομαδοποιούνται οι αλληλουχίες που μοιράζονται τις περισσότερες ομολογίες και σταδιακά προστίθενται όσες είναι περισσότερο διαφοροποιημένες. Σε κάθε στάδιο εξετάζεται η ορθότητα της στοίχισης µέσω της σύγκρισης πινάκων που δημιουργεί το πρόγραμμα και οι οποίοι καταγράφουν τον αριθμό των νουκλεοτιδίων που ήταν όμοια, όσων δεν ήταν όμοια και το βαθμό των ενθέσεων και ελλείψεων που παρουσιάζει η στοίχιση. Η διαδικασία συνεχίζεται μέχρι να μεγιστοποιηθεί ο αριθμός των νουκλεοτιδίων που είναι ομόλογα και ταυτόχρονα να ελαχιστοποιηθούν οι τιμές των άλλων τριών παραμέτρων (ανομοιότητα, ελλείψεις, ενθέσεις) (Feng & Doolittle, 1987 Τhompson et al., 1994). Για τη διερεύνηση της ταυτότητας των 44 ατόμων που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον δημοσιευμένες αλληλουχίες από προηγούμενες μελέτες ζώων που ανήκουν σε όλα τα είδη του γένους Mus. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από τις εργασίες των: Bonhomme et al (5 άτομα Mus cypriacus - GenBank: AY562505, AY562506, AY562507, AY και AY562509), Macholan et al (2 άτομα Mus cypriacus - GenBank: EU106209, και EU106281), Prager et al (1 άτομο Mus macedonicus - GenBank: U47535), Prager et al (2 άτομα Mus musculus musculus - GenBank: U47515 και U47524), Prager et al (1 άτομο Mus spretus - GenBank: U47539), Prager et al (1 άτομο Mus musculus castaneus - GenBank: AF074538), Prager et al (1 άτομο Mus musculus gentilulus - GenBank: AF074544), Tryfonopoulos et al (1 άτομο Mus macedonicus - GenBank: AY551962), Tryfonopoulos et al (2 άτομα Mus musculus domesticus - GenBank: AY και AY551961), Mitsainas et al., 2009 (3 άτομα Mus spicilegus - GenBank: EU626224, EU και EU626226). Αδημοσίευτα δεδομένα (1 άτομο Mus musculus domesticus αύξων αριθμός της

85 Υλικά και μέθοδοι συλλογής θηλαστικών του Ζωολογικού Μουσείου του Πανεπιστημίου Πατρών: ZMUP/M 8012). Η στοίχιση αυτών των αλληλουχιών έγινε µε το πρόγραμμα BioEdit ν (Hall, 1999) Κατασκευή δενδρογραμμάτων Το σύνολο των νουκλεοτιδικών αποκλίσεων των αλληλουχιών οι οποίες εμφανίζονται στα δεδομένα των προαναφερθεισών εργασιών και στα δικά μας χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή δενδρογραμμάτων που απεικονίζουν τις σχέσεις συγγένειας των ατόμων που μελετήθηκαν. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή των δενδρογραμμάτων ήταν η μέθοδος της μήτρας αποστάσεων, που στηρίζεται στην ομαδοποίηση ανάλογα µε το βαθμό της γενετικής απόστασης. Η μέθοδος σύνδεσης γειτόνων (Neighbor-Joining) μετατρέπει τα δεδομένα (π.χ. τις στοιχισμένες αλληλουχίες) σε πίνακα αποστάσεων των διαφορών (αποστάσεις) ανά ζεύγος τάξα. Με το πρόγραμμα ΜEGA ν.4.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Tamura et al., 2007) κατασκευάστηκε το δένδρο που προκύπτει από την εφαρμογή της μεθόδου Neighbor-Joining µε βάση τα μοντέλα των Tamura-Nei, Jukes-Cantor και Tajima-Nei. Με τη δειγματοληπτική μέθοδο που ονομάζεται bootstrap και πραγματοποιεί ψευδο-επαναλήψεις των δεδομένων, έγιναν 1000 επαναλήψεις από τις οποίες προέκυψαν 1000 εναλλακτικά δένδρα. Από αυτά, στο τέλος προέκυψε ένα δένδρο στο οποίο για κάθε κλάδο, αναγράφεται (ως ποσοστό) πόσες φορές αυτός ο κλάδος εμφανίστηκε στις bootstrap επαναλήψεις Γενετική διαφοροποίηση πληθυσμών Για τη διερεύνηση της ενδοπληθυσμιακής και διαπληθυσμιακής ποικιλότητας των δύο ειδών του γένους Mus που υπάρχουν στην Κύπρο χρησιμοποιήθηκαν και δημοσιευμένες αλληλουχίες του αντίστοιχου τμήματος της D-loop περιοχής του mtdna από προηγούμενες μελέτες. Συγκεκριμένα, εκτός από τα 44 ταξινομικώς αναγνωρισθέντα άτομα τα οποία συλλέχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από τις εργασίες των Macholan et al., 2005, για αλληλουχίες του είδους Mus cypriacus και των Tryfonopoulos et al., 2005, για αλληλουχίες του είδους Mus musculus domesticus, όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 8)

86 Υλικά και μέθοδοι Πίνακας 8: Στοιχεία ατόμων των οποίων οι αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών. *ο κωδικός αριθμός του ζώου στην GenBank και **o αύξων αριθμός κάθε ζώου όπως έχει κατατεθεί στη συλλογή θηλαστικών του Ζωολογικού Μουσείου του Πανεπιστημίου Πατρών. Πληθυσμός Taxon Κωδικός αριθμός Περιοχή 1 Μ. m. domesticus 2 Μ. m. domesticus 3 M. m. domesticus 4 Mus cypriacus 5 Mus cypriacus 6 Mus cypriacus 7 Mus cypriacus 8 Mus cypriacus AY551955* AY551956* ZMUP/M (8104, 8089, 8082)** ZMUP/M (8041, 8043, 8046, 8049, 8051, 8057, 8061, 8065, 8067, 8068, 8074, 8075, 8105, 8107, 8109, 8113, 8116, 8118)** ZMUP/M (8086, 8039, 8114)** EU106216* EU106215* EU106214* EU106213* EU106194* EU106198* EU106197* EU106196* EU106195* EU106213* ZMUP/M (8038, 8069, 8070, 8071,8072, 8073, 8076, 8077, 8078, 8079, 8080, 8081, 8087, 8088, 8098, 8099, 8100, 8101, 8102, 8103)** EU106281* EU106280* EU106279* EU106278* EU106212* EU106211* EU106210* EU106209* EU106208* EU106207* EU106206* EU106205* EU106204* EU106203* EU106202* EU106201* EU106200* Αμαλιάδα, Πελοπόννησος Λάσση, Κεφαλονιά Πλάτρες Παραλίμνι Παραλίμνι Κερύνεια Άγιος Ιλαρίωνας Κόρνος Ανδρολίκου Πελαθούσα Νέο Χωριό Πάφου Όρος Όλυμπος Πλάτρες Παραμύθα Αψιού Ευρύτερη Περιοχή Ελλάδα Τρόοδος, Κύπρος Αμμόχωστος, Κύπρος Αμμόχωστος, Κύπρος Κερύνεια, Κύπρος Πάφος, Κύπρος Τρόοδος, Κύπρος Λεμεσός, Κύπρος

87 Υλικά και μέθοδοι Οι περιοχές συλλογής των ζώων, ομαδοποιήθηκαν με βάση τη γεωγραφική τους θέση (Εικόνα 39) σε 5 ομάδες. Λαμβάνοντας υπόψη όμως και την ταξινομική ταυτότητα κάθε πληθυσμού, προέκυψαν τελικά 8 ομάδες (Πίνακας 8). Τα ζώα κάθε είδους, προερχόμενα από καθεμία από αυτές τις ευρύτερες περιοχές θεωρήθηκε ότι αποτελούν ένα πληθυσμό του αντίστοιχου είδους. Εικόνα 39: Χάρτης της Κύπρου όπου απεικονίζεται η ομαδοποίηση των περιοχών συλλογής των μελετηθέντων πληθυσμών της παρούσας εργασίας και των προερχόμενων από τη βιβλιογραφία, με βάση τη γεωγραφική τους θέση. Ο ελλαδικός χώρος αποτέλεσε την έκτη γεωγραφική περιοχή. Η επεξεργασία των δικών μας δεδομένων και των προαναφερθέντων εργασιών πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος MEGΑ ν.4.1. (Tamura et al., 2007). Τα άτομα ομαδοποιήθηκαν -όπως προαναφέρθηκε- ανάλογα με τον πληθυσμό στον οποίο ανήκουν και συγκρίθηκαν οι στοιχισμένες αλληλουχίες τους. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών υπολογίστηκε μέσω της γενετικής απόστασης κατά Jukes-Cantor, Tajima-Nei και Tamura-Nei. Τα δεδομένα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός δενδρογράμματος που απεικονίζει τις σχέσεις συγγένειας των ατόμων αυτών µε βάση το μοντέλο των Tamura-Nei. Τέλος, τα άτομα που συλλέχθηκαν στην παρούσα εργασία ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με τον πληθυσμό στον οποίο ανήκουν και με το στατιστικό πρόγραμμα Arlequin v (Excoffier et al., 2005) υπολογίστηκαν η νουκλεοτιδική πoικιλότητα (nucleotide diversity, π) καθώς και η απλοτυπική ποικιλότητα (haplotype diversity, h)

88 Υλικά και μέθοδοι 2.5. ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΣΥΛΛΕΧΘΕΝΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ Όπως αναφέρθηκε ήδη στην ενότητα της Εισαγωγής, για να ολοκληρωθεί η σύγκριση μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών του γένους Mus, εφαρμόστηκε και γεωμετρική μορφομετρική ανάλυση σε κρανιακούς και οδοντικούς χαρακτήρες. Για το σκοπό αυτό λήφθηκαν φωτογραφίες των κρανίων όλων των ζώων με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή SONY CYBERSHOT DSC F-717. Οι φωτογραφίες αυτές αφορούσαν στην ραχιαία, κοιλιακή και πλευρική επιφάνεια του κρανίου (Εικόνες 40, 41 και 42 αντίστοιχα), στην κάτοψη των δοντιών της άνω γνάθου (Εικόνα 43) αλλά και στις δυο πλευρικές επιφάνειες (εξωτερική και εσωτερική) των κάτω ημιγναθίων (Εικόνες 44 και 45 αντίστοιχα). Εικόνα 40: Φωτογραφία κάτοψης ραχιαίας επιφάνειας κρανίου. Εικόνα 41: Φωτογραφία κάτοψης κοιλιακής επιφάνειας κρανίου. Εικόνα 42: Φωτογραφία κάτοψης δεξιάς πλευρικής επιφάνειας κρανίου. Εικόνα 43: Φωτογραφία κάτοψης των γομφίων της άνω γνάθου. Εικόνα 44: Φωτογραφία της εξωτερικής πλευρικής επιφάνειας του αριστερού κάτω ημιγναθίου. Εικόνα 45: Φωτογραφία της εσωτερικής πλευρικής επιφάνειας του αριστερού κάτω ημιγναθίου

89 Υλικά και μέθοδοι Επεξεργασία φωτογραφιών Οι φωτογραφίες που αφορούσαν στη ραχιαία και κοιλιακή επιφάνεια των κρανίων των ζώων εισάγονταν στο πρόγραμμα tpsdig2 με τη χρήση του οποίου έγινε η τοποθέτηση προκαθορισμένων οροσήμων (landmarks) (Εικόνες 46 και 47). Όλα τα ορόσημα τοποθετούνταν στην αριστερή πλευρά του κρανίου. Η επιλογή των συγκεκριμένων οροσήμων έγινε με βάση τη μέθοδο των Cucchi et al Εικόνα 46: Τοποθέτηση προκαθορισμένων οροσήμων (landmarks) στη ραχιαία επιφάνεια των κρανίων, με τη χρήση του προγράμματος tpsdig2. Εικόνα 47: Τοποθέτηση προκαθορισμένων οροσήμων (landmarks) στην κοιλιακή επιφάνεια των κρανίων, με τη χρήση του προγράμματος tpsdig

90 Υλικά και μέθοδοι Οι φωτογραφίες του πρώτου άνω γομφίου κάθε ζώου εισάγονταν στο πρόγραμμα CorelDRΑW (Corel Corporation, 2008), όπου και σχεδιαζόταν το περίγραμμα της εξωτερικής επιφάνειάς του (Εικόνα 48) με τις επιλογές του freehand tool και στη συνέχεια του shape tool. Ακολούθως από κάθε φωτογραφία γινόταν επιλογή μόνο του περιγράμματος (Εικόνα 49) το οποίο και αποθηκευόταν. Εικόνα 48: Φωτογραφία του πρώτου άνω γομφίου (αριστερά) με σχεδιασμένο το περίγραμμα της εξωτερικής επιφάνειάς του με το πρόγραμμα CorelDRΑW. Εικόνα 49: Περίγραμμα της εξωτερικής επιφάνειάς του πρώτου άνω γομφίου με το πρόγραμμα CorelDRΑW

91 Υλικά και μέθοδοι Στατιστική επεξεργασία των δεδομένων της μορφομετρικής ανάλυσης Η επεξεργασία των φωτογραφιών της ραχιαίας και κοιλιακής επιφάνειας των κρανίων έγινε με τα προγράμματα TpsUtil (Rohlf, 2004) και TPSdig (Rohlf, 2005), με τα οποία προστέθηκαν 13 και 16 ορόσημα, αντίστοιχα, σε κάθε επιφάνεια. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια των προγραμμάτων CoordGen6 (Sheets, 2001) και TPSrelw (Rohlf, 1998), οι συντεταγμένες των οροσήμων τροποποιήθηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε να μην εξαρτώνται από τον προσανατολισμό, τη θέση και την κλίμακα. Με αυτόν τον τρόπο η σύγκριση μεταξύ των συντεταγμένων γίνεται μόνο με βάση τις διαφορές που εμφανίζονται στην τοπολογία των οροσήμων. Η επεξεργασία των περιγραμμάτων του πρώτου άνω γομφίου κάθε ζώου πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό πρόγραμμα Shape (Iwata & Ukai 2002). Πρόκειται για ένα πακέτο προγραμμάτων που επεξεργάζονται κλειστά σχήματα βάσει του περιγράμματός τους με τη μέθοδο της Ελλειπτικής Ανάλυσης Fourier (EFA). Υπολογίζονται οι κανονικοποιημένοι συντελεστές Fourier, σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφηκε από τους Kuhl & Giardina (1982), και πραγματοποιείται ανάλυση κυρίων συνιστωσών. Χρησιμοποιήθηκαν 20 αρμονικές για να εξεταστούν τα υπό μελέτη σχήματα. Για μια ανάλυση με Ν αρμονικές προκύπτουν 4Ν-3 σημαντικές παράμετροι που αναλύουν τον υπό μελέτη χαρακτήρα. Στην προκειμένη περίπτωση, για κάθε άτομο προέκυψαν (20 x 4) 3 = 77 τιμές. Οι τιμές αυτές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση διάκρισης των πληθυσμών, η οποία περιγράφεται στη συνέχεια. Ανάλυση Διάκρισης (General Discriminant Analysis, GDA) Για να επιτευχθεί ο διαχωρισμός των πληθυσμών με βάση τις μεταξύ τους διαφορές και όχι με βάση την ενδοπληθυσμιακή διασπορά από τη μέση τιμή του πληθυσμού πραγματοποιήθηκε η Ανάλυση Διάκρισης (GDA). Με αυτή την ανάλυση τα αρχικά δεδομένα μπορούν να αναπαρασταθούν σε ένα καρτεσιανό σύστημα συντεταγμένων που εξηγεί το μεγαλύτερο ποσοστό της διακύμανσης των πληθυσμών. Κάθε άτομο που συμμετέχει στην ανάλυση διάκρισης φέρει την πληροφορία του πληθυσμού από τον οποίο προέρχεται. Με αυτόν τον τρόπο προκύπτει ένας πίνακας σωστής κατάταξης των ατόμων. Ο πίνακας αυτός παραθέτει τα ποσοστά των ατόμων

92 Υλικά και μέθοδοι που με βάση τα μορφομετρικά τους χαρακτηριστικά εντάσσονται από την ανάλυση σωστά στον πληθυσμό στον οποίον ανήκουν. Οι πολυμεταβλητές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση των προγραμμάτων Statistika7 (StatSoft Inc., 2004) και SPSS ν (SPSS Inc., 2004)

93 Αποτελέσματα 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. ΠΑΓΙΔΕΥΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Τα μελετηθέντα είδη του γένους Mus Κατά τη διάρκεια των παγιδεύσεων συλλέχθηκαν άτομα και των δύο ειδών ποντικού του γένους Mus που ζουν στην Κύπρο. Η ταξινομική ταυτότητά τους αναφέρθηκε αναλυτικά στην ενότητα Επίσης συλλέχθηκαν και δύο άτομα της μυγαλής Crocidura suaveolens (Θηλαστικά, Μυγαλόμορφα, Soricidae). Επίσης στις παγίδες παρατηρήθηκε ένας μεγάλος αριθμός εντόμων και αραχνών, οργανισμοί που πιθανώς εισέρχονταν σ αυτές λόγω του δολώματος Αριθμητικά δεδομένα των παγιδεύσεων Στον πίνακα 9 δίνεται ο συνολικός αριθμός των ημερών που πραγματοποιήθηκαν παγιδεύσεις μικροθηλαστικών ανά περιοχή και εποχή. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 60 ημέρες παγίδευσης, με τη χρήση 14 παγίδων τύπου Ugglan, άρα συνολικά 840 «παγιδοημέρες» (14 παγίδες x 60 ημέρες) (Πίνακας 10). Πίνακας 9: Συνολικός αριθμός των ημερών κατά τις οποίες πραγματοποιήθηκαν παγιδεύσεις μικροθηλαστικών ανά περιοχή και εποχή. Ευρύτερη περιοχή μελέτης Επαρχία Αμμοχώστου Άνοιξη 08 Καλοκαίρι 08 Φθινόπωρο 08 Χειμώνας 08 Άνοιξη 09 Σύνολο Όρος Τρόοδος Σύνολο Πίνακας 10: Συνολικός αριθμός των παγιδοημερών ανά περιοχή και εποχή. Ευρύτερη περιοχή μελέτης Επαρχία Αμμοχώστου Άνοιξη 08 Καλοκαίρι 08 Φθινόπωρο 08 Χειμώνας 08 Άνοιξη 09 Σύνολο Όρος Τρόοδος Σύνολο

94 Αποτελέσματα Η επιτυχία των παγιδεύσεων διέφερε ανάλογα με την τοποθεσία δειγματοληψίας και την εποχή. Η πλειονότητα των συλλήψεων πραγματοποιήθηκε στις περιοχές του Νοσοκομείου Παραλιμνίου, της λίμνης Παραλιμνίου, καθώς και σε ένα λιβάδι κοντά στις Πλάτρες (Πίνακας 11), ενώ μόνο ένα άτομο συλλέχθηκε στον ποταμό Λιοπετρίου. Όσον αφορά στις υπόλοιπες τοποθεσίες (πευκοδάσος Τροόδους, περιοχή Τροοδίτισσας και περιοχή λιβαδιού κοντά στον Κρυό ποταμό), δεν πραγματοποιήθηκε καμία σύλληψη μικροθηλαστικού. Πίνακας 11: Συνολικός αριθμός των παγιδευμένων μικροθηλαστικών ανά τοποθεσία δειγματοληψίας και εποχή. Ευρύτερη περιοχή μελέτης Επαρχία Αμμοχώστου Όρος Τρόοδος Τοποθεσία δειγματοληψίας Ποταμός Λιοπετρίου Νοσοκομείο Παραλιμνίου Λίμνη Παραλιμνίου Πευκοδάσος Τροόδους Περιοχή Τροοδίτισσας Λιβάδι κοντά στον Κρυό ποταμό Λιβάδι κοντά στις Πλάτρες Άνοιξη 08 Καλοκαίρι 08 Φθινόπωρο 08 Χειμώνας 08 Άνοιξη 09 Σύνολο Στην εικόνα 50 δίνονται οι συνολικοί αριθμοί των συλληφθέντων μικροθηλαστικών ανά είδος σε όλες τις εποχές και για το σύνολο των τοποθεσιών δειγματοληψίας στις δύο περιοχές μελέτης. Όπως φαίνεται συνολικά καταγράφηκαν 72 άτομα τα οποία κατατάσσονται στα τρία είδη θηλαστικών που προαναφέρθηκαν, δηλαδή τα τρωκτικά Mus cypriacus και Mus musculus domesticus, και το μυγαλόμορφο Crocidura suaveolens. Από αυτά, σε 26 άτομα του γένους Μus η ταξινόμησή τους σε επίπεδο είδους έγινε μόνο με μορφολογικά κριτήρια, ενώ για τα υπόλοιπα 44 η ταξινόμησή τους επιβεβαιώθηκε και με μοριακή ανάλυση. Οι τοποθεσίες δειγματοληψίας και ο αριθμός των ατόμων που συλλέχθηκαν φαίνονται σε αντίστοιχο πίνακα στο Παράρτημα

95 Αποτελέσματα Εικόνα 50: Συνολικός αριθμός των συλληφθέντων μικροθηλαστικών ανά είδος σε όλες τις εποχές και για το σύνολο των τοποθεσιών δειγματοληψίας Εποχική ποικιλότητα στις συλλήψεις των τρωκτικών Από το σύνολο των πέντε περιόδων δειγματοληψιών φαίνεται ότι τα τρωκτικά παρουσιάζουν μεγαλύτερη κινητικότητα κατά τους ζεστούς μήνες της άνοιξης και του καλοκαιριού, αφού οι περισσότερες συλλήψεις τρωκτικών έγιναν κατά το καλοκαίρι 08 και την άνοιξη 09 (Πίνακας 12). Στον ίδιο πίνακα φαίνεται επίσης και η μεγαλύτερη αφθονία τρωκτικών στις πεδινές περιοχές του νησιού (Επαρχία Αμμοχώστου) σε σύγκριση με τις ορεινές (Όρος Τρόοδος). Πίνακας 12: Συνολικός αριθμός των παγιδευθέντων τρωκτικών ανά τύπο περιοχής και εποχή. Ευρύτερη περιοχή μελέτης Επαρχία Αμμοχώστου Άνοιξη 08 Καλοκαίρι 08 Φθινόπωρο 08 Χειμώνας 08 Άνοιξη 09 Σύνολο Όρος Τρόοδος Σύνολο Για να ελεγχθεί όμως η πιθανή διαφορά στις συλλήψεις των θηλαστικών αυτών μεταξύ των εποχών δειγματοληψίας, εφαρμόζουμε τη μέθοδο χ 2. Ο αναμενόμενος αριθμός συλλήψεων υπολογίζεται από τη διαίρεση του συνολικού αριθμού των συλλήψεων (n=70) με τον συνολικό αριθμό παγιδοημερών (n=840) και πολλαπλασιασμό του με τον αντίστοιχο αριθμό παγιδοημερών για κάθε εποχή

96 Αποτελέσματα Δηλαδή, υποθέτουμε ότι οι αριθμοί συλλήψεων είναι εποχικά σταθεροί και εξαρτώνται μόνον από τον αριθμό των χρησιμοποιούμενων παγίδων. Στον παρακάτω πίνακα 13 φαίνονται τα αποτελέσματα του στατιστικού ελέγχου των εποχικών διαφορών στον αριθμό συλλήψεων ατόμων του γένους Mus για το σύνολο των παγιδεύσεων. Πίνακας 13: Αποτελέσματα του στατιστικού ελέγχου των εποχικών διαφορών στον αριθμό συλλήψεων ατόμων του γένους Mus για το σύνολο των παγιδεύσεων. Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας Άνοιξη Σύνολο Σύνολο συλλήψεων Αρ. παγιδοημερών Αρ. ημερών δειγματοληψιών Αναμενόμενες συλλήψεις 8, ,83 15,17 19,83 70 x 2 1,80 7,14 1,15 8,22 0,07 18,38 Βαθμοί ελευθερίας = n - 1 = 4. χ 2 0,05 < 18,38 Συνεπώς η μηδενική υπόθεση, ότι δεν υπάρχουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στους αριθμούς συλλήψεων μεταξύ των εποχών δειγματοληψίας απορρίπτεται. Στον πίνακα 14 φαίνονται τα αποτελέσματα του στατιστικού ελέγχου των εποχικών διαφορών στον αριθμό συλλήψεων ατόμων του γένους Mus για τις παγιδεύσεις στην πεδινή περιοχή. Πίνακας 14: Αποτελέσματα του στατιστικού ελέγχου των εποχικών διαφορών στον αριθμό συλλήψεων ατόμων του γένους Mus για τις παγιδεύσεις την πεδινή περιοχή. Άνοιξη 08 Καλοκαίρι 08 Βαθμοί ελευθερίας = n - 1 = 4. χ 2 0,05 < 29,94 Φθινόπωρο 08 Χειμώνας 08 Άνοιξη 09 Σύνολο Σύνολο συλλήψεων Αρ. παγιδοημερών Αρ. ημερών δειγματοληψιών Αναμενόμενες συλλήψεις 5,88 8,81 8,81 10,28 13,22 47 x 2 4,47 11,78 5,27 8,38 0,05 29,

97 Αποτελέσματα Συνεπώς η μηδενική υπόθεση, ότι δεν υπάρχουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στους αριθμούς συλλήψεων μεταξύ των εποχών δειγματοληψίας στην πεδινή περιοχή απορρίπτεται. Στον πίνακα 15 φαίνονται τα αποτελέσματα του στατιστικού ελέγχου των εποχικών διαφορών στον αριθμό συλλήψεων ατόμων του γένους Mus για τις παγιδεύσεις στην ορεινή περιοχή. Πίνακας 15: Αποτελέσματα του στατιστικού ελέγχου των εποχικών διαφορών στον αριθμό συλλήψεων ατόμων του γένους Mus για τις παγιδεύσεις την ορεινή περιοχή. Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας Άνοιξη Σύνολο Σύνολο συλλήψεων Αρ. παγιδοημερών Αρ. ημερών δειγματοληψιών Αναμενόμενες συλλήψεις 2,46 4,93 4,11 4,93 6,57 23 x 2 0,87 0,001 2,04 0,75 0,028 3,69 Βαθμοί ελευθερίας = n - 1 = 4. χ 2 0,05 > 3,69 Συνεπώς, η μηδενική υπόθεση ότι δεν υπάρχουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στους αριθμούς συλλήψεων μεταξύ των εποχών δειγματοληψίας στην ορεινή περιοχή ισχύει

98 Αποτελέσματα Κατανομή των ατόμων σε κλάσεις μήκους Με βάση τα μετρηθέντα ολικά μήκη σώματος (Total body length - TBL) των ατόμων του γένους Mus δημιουργήθηκαν κλάσεις μήκους των 10 mm (Πίνακας 19). Στην πρώτη κλάση κατατάχθηκαν τα άτομα που είχαν μήκος mm (δεν υπήρχαν άτομα με μήκος μικρότερο από 100 mm), στη δεύτερη από mm κ.ο.κ. Πίνακας 19: Κατανομή των ατόμων του γένους Mus για κάθε φύλο και τύπο περιοχής δειγματοληψίας, στις κλάσεις ολικού μήκους σώματος. F = θηλυκά, M = αρσενικά άτομα. Φύλο /περιοχή Κλάσεις μήκους (ΤΒL) Σύνολο F / πεδινή περιοχή F / ορεινή περιοχή Μ / πεδινή περιοχή Μ / ορεινή περιοχή Σύνολο Η κατανομή των ατόμων ανεξαρτήτως είδους, σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος (Εικόνα 54 Α) δείχνει ότι τα περισσότερα άτομα κατατάσσονται σε κλάσεις μεταξύ 120 και 159 mm. Φανερό είναι ότι τα άτομα της ορεινής περιοχής (ανεξαρτήτως φύλου) κατατάσσονται σε κλάσεις μεγαλύτερου μήκους από τα άτομα της πεδινής περιοχής. Το ίδιο φαίνεται και από τα διαγράμματα των Εικόνων 54 Γ και Δ, όπου τα αρσενικά και θηλυκά άτομα της πεδινής περιοχής κατατάσσονται σε κλάσεις μικρότερου μήκους από τα αντίστοιχα της ορεινής περιοχής. Τέλος, όσον αφορά στις διαφορές μεταξύ των δύο φύλων, ανεξαρτήτως τύπου περιοχής, φαίνεται ότι τα αρσενικά είναι μικρότερα σε μέγεθος (Εικόνα 54 Β). Βέβαια, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι ο αριθμός των συλλεχθέντων θηλυκών ήταν μικρός. Εν συνεχεία εξετάσθηκαν συγκριτικά οι κατανομές των ατόμων σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος για τα είδη Mus cypriacus και Mus musculus domesticus, για κάθε φύλο και τύπο περιοχής δειγματοληψίας

99 Αποτελέσματα Α. Β. Γ. Δ. Εικόνα 54 Α, Β, Γ, Δ: Διαγράμματα κατανομής των ατόμων του γένους Mus σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος ανάλογα με το φύλο και τον τύπο περιοχής δειγματοληψίας. Α) Mus cypriacus Ακολουθώντας την ίδια διαδικασία, δημιουργήθηκαν κλάσεις ολικού μήκους σώματος των 10 mm και έγινε η κατανομή των ατόμων Mus cypriacus σε αυτές τις κλάσεις μήκους (Πίνακας 20). Φανερό είναι ότι τα άτομα αυτά στην πλειονότητά τους κατατάσσονται σε κλάσεις μήκους mm (Πίνακας 20, Εικόνα 55). Πίνακας 20: Κατανομή των ατόμων Mus cypriacus σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος, για κάθε φύλο και τύπο περιοχής δειγματοληψίας. Φύλο /περιοχή Κλάσεις μήκους (ΤΒL) Σύνολο F / πεδινή περιοχή F / ορεινή περιοχή Μ / πεδινή περιοχή Μ / ορεινή περιοχή Σύνολο

100 Αποτελέσματα Εικόνα 55: Κατανομή των ατόμων Mus cypriacus σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος ανά φύλο και τύπο περιοχής δειγματοληψίας. Β) Mus musculus domesticus Τέλος, ακολουθεί ο πίνακας κατανομής των μηκών των ατόμων Mus musculus domesticus σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος (Πίνακας 21) και το αντίστοιχο διάγραμμα (Εικόνα 56). Παρατηρείται ένα πιο ομοιόμορφο πρότυπο κατανομής, αλλά και πάλι η πλειονότητα των ατόμων κατανέμεται στις μεσαίες κλάσεις μήκους (Πίνακας 21, Εικόνα 56). Πίνακας 21: Κατανομή των ατόμων Mus musculus domesticus σε κλάσεις ολικού σωματικού μήκους για κάθε φύλο και τύπο περιοχής δειγματοληψίας. Φύλο /περιοχή Κλάσεις μήκους (ΤΒL) Σύνολο F / πεδινή περιοχή F / ορεινή περιοχή Μ / πεδινή περιοχή Μ / ορεινή περιοχή Σύνολο

101 Αποτελέσματα Εικόνα 56: Κατανομή των ατόμων Mus musculus domesticus σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος ανά φύλο και τύπο περιοχής δειγματοληψίας

102 Αποτελέσματα 3.2. ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ανάλυση mtdna και σύγκριση αλληλουχιών Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο «Υλικά και Μέθοδοι», από τα 70 άτομα του γένους Mus που συλλέχθηκαν επιλέχθηκαν 44 άτομα. Από τα άτομα αυτά απομονώθηκε mtdna από κύτταρα ήπατος και ακολούθησε ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων της περιοχής ελέγχου D-loop. Για τη διερεύνηση της ταυτότητας αυτών των ατόμων χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον δημοσιευμένες αλληλουχίες της περιοχής ελέγχου D-loop από προηγούμενες μελέτες ζώων που ανήκουν σε όλα τα είδη του γένους Mus: M. cypriacus, M. macedonicus, M. spretus, M. musculus castaneus, M. musculus domesticus, M. musculus gentilulus, M. musculus musculus, και M. spicilegus. Μέσω του προγράμματος ΜEGA ν.4.1 δημιουργήθηκαν τρία φαινετικά δένδρα κατά Jukes-Cantor, Tajima-Nei και Tamura-Nei (Εικόνα 57). Οι τιμές bootstrap που υπολογίστηκαν είναι υψηλές, οπότε η εικόνα των σχέσεων μεταξύ των ατόμων φαίνεται να είναι αξιόπιστη. Αξίζει να αναφερθεί ότι κατά την εφαρμογή και των τριών αυτών μεθόδων σχηματίστηκαν οι ίδιες ομάδες ατόμων, καθεμιά από τις οποίες αποτελείται από άτομα του ιδίου είδους. Μια ομάδα με ποσοστό bootstrap 99% περιλαμβάνει τα τρία γνωστής ταυτότητας άτομα Mus musculus domesticus και 21 αταξινόμητα άτομα. Τρία από αυτά είχαν συλλεγεί στην ορεινή περιοχή του Τροόδους, ενώ τα υπόλοιπα 18 στην πεδινή περιοχή της επαρχίας Αμμοχώστου. Μια άλλη ομάδα με ποσοστό bootstrap 99% περιλαμβάνει όλα τα γνωστά άτομα Mus cypriacus και 23 αταξινόμητα άτομα, από τα οποία τρία είχαν συλλεγεί στην πεδινή περιοχή της επαρχίας Αμμοχώστου ενώ τα υπόλοιπα 20 στο Όρος Τρόοδος

103 Αποτελέσματα Εικόνα 57: Φαινετικό δενδρόγραμμα των σχέσεων των μελετηθέντων ατόμων που σχεδιάστηκε με τη μέθοδο της σύνδεσης γειτόνων Neighbor-Joining με βάση το μοντέλο νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων των Tamura-Nei. Οι αριθμοί στους κόμβους αντιπροσωπεύουν τις τιμές bootstrap για 1000 επαναλήψεις. GenBank είναι ο κωδικός αριθμός του ζώου στην GenBank και ZMUP/M είναι o αύξων αριθμός κάθε ζώου στη συλλογή θηλαστικών του Ζωολογικού Μουσείου του Πανεπιστημίου Πατρών

104 Αποτελέσματα Γενετικές αποστάσεις των μελετηθέντων πληθυσμών Η στατιστική επεξεργασία που ακολουθεί, πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος MEGΑ ν.4.1. (Tamura et al., 2007) και αφορά στα δεδομένα από τις ομαδοποιήσεις των ατόμων (βλέπε Κεφ ) ανάλογα με τον πληθυσμό στον οποίο ανήκουν. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών υπολογίστηκε μέσω της γενετικής απόστασης με βάση τα μοντέλα Jukes-Cantor, Tajima-Nei και Tamura-Nei. Υπολογίστηκαν οι ενδοπληθυσμιακές γενετικές αποστάσεις (Within Group Distances), οι διαπληθυσμιακές γενετικές αποστάσεις (Between Group Distances) καθώς και οι καθαρές γενετικές αποστάσεις (Net Distances) των προαναφερθέντων πληθυσμών. Η νουκλεοτιδική πoικιλότητα (nucleotide diversity, π) και η απλοτυπική ποικιλότητα (haplotype diversity, h). Υπολογίστηκαν με το στατιστικό πρόγραμμα Arlequin v (Excoffier et al., 2005) Ενδοπληθυσμιακές γενετικές αποστάσεις (Within Group Distances) Οι τιμές ενδοπληθυσμιακής απόστασης κατά Jukes-Cantor κυμάνθηκαν μεταξύ και 0.026, κατά Tajima-Nei μεταξύ και και κατά Tamura-Nei από μέχρι (Πίνακας 22). Τις μεγαλύτερες τιμές γενετικής απόστασης εμφάνισαν οι πληθυσμοί Mus musculus domesticus και Mus cypriacus της επαρχίας Αμμοχώστου. Αντίθετα, οι μικρότερες τιμές γενετικής απόστασης εμφανίστηκαν στον πληθυσμό Mus cypriacus της επαρχίας Λεμεσού (Πίνακας 22). Μεταξύ των πληθυσμών Mus musculus domesticus της Κύπρου υπάρχει μεγαλύτερη ενδοπληθυσμιακή γενετική διαφοροποίηση στον πληθυσμό της πεδινής περιοχής Αμμοχώστου (d = ) σε σχέση με τον πληθυσμό του Όρους Τροόδους (d = 0.015). Τέλος, μεταξύ των πληθυσμών Mus cypriacus οι χαμηλότερες τιμές ενδοπληθυσμιακής γενετικής διαφοροποίησης παρατηρούνται στους πληθυσμούς των επαρχιών Λεμεσού, Κερύνειας και Πάφου ( ), ενώ οι μεγαλύτερες τιμές παρατηρούνται στον πληθυσμό της Αμμοχώστου (0.026). Ο πληθυσμός του Όρους Τροόδους εμφανίζει αρκετά μεγάλη γενετική διαφοροποίηση (d = 0.021)

105 Αποτελέσματα Πίνακας 22: Τιμές της ενδοπληθυσμιακής απόστασης d κατά Jukes-Cantor, Tajima-Nei και Tamura-Nei, οι οποίες υπολογίστηκαν για όλους τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν. Η μικρότερη τιμή απεικονίζεται με γκρί φόντο, ενώ οι μεγαλύτερες με πορτοκαλί. Πληθυσμός d (Jukes-Cantor) d (Tajima-Nei) d (Tamura-Nei) Taxon Περιοχή Μ. m. domesticus Ελλάδα Μ. m. domesticus Όρος Τρόοδος M. m. domesticus Αμμόχωστος Mus cypriacus Αμμόχωστος Mus cypriacus Κερύνεια Mus cypriacus Πάφος Mus cypriacus Όρος Τρόοδος Mus cypriacus Λεμεσός Διαπληθυσμιακές γενετικές αποστάσεις (Between Group Distances) Οι τιμές της γενετικής απόστασης μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών κατά Jukes-Cantor κυμάνθηκαν μεταξύ και 0.130, κατά Tajima-Nei μεταξύ και και κατά Tamura-Nei από μέχρι (Πίνακες 23, 24, 25). Και με τα τρία αυτά μοντέλα, τις υψηλότερες τιμές γενετικής απόστασης εμφάνισαν ο πληθυσμός Mus musculus domesticus του Όρους Τροόδους με τον πληθυσμό Mus cypriacus της ίδιας περιοχής. Η διαπληθυσμιακή διαφοροποίηση του είδους Mus musculus domesticus κυμαίνεται μεταξύ 0,011 και 0,028. Αξιοσημείωτο είναι ότι οι πληθυσμοί του Mus musculus domesticus εμφάνισαν τις χαμηλότερες τιμές γενετικής απόστασης, μεταξύ των πληθυσμών του Όρους Τροόδους με τους αντίστοιχους της Ελλάδας, ενώ μεγάλη διαπληθυσμιακή διαφοροποίηση παρατηρήθηκε μεταξύ των κυπριακών πληθυσμών του Όρους Τροόδους με τους αντίστοιχους της Αμμοχώστου. Η διαπληθυσμιακή διαφοροποίηση του είδους Mus cypriacus κυμαίνεται μεταξύ 0,012 και 0,020. Όσον αφορά στους πεδινούς πληθυσμούς του Mus cypriacus, αυτοί χαρακτηρίζονται από μικρή γενετική διαφοροποίηση σε σχέση με τον ορεινό πληθυσμό, καθώς η τιμή d κυμαίνεται από έως

106 Αποτελέσματα Πίνακας 23: Τιμές της γενετικής απόστασης μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών κατά Jukes-Cantor. Η μικρότερη τιμή απεικονίζεται με γκρί φόντο, ενώ η μεγαλύτερη με πορτοκαλί Πίνακας 24: Τιμές της γενετικής απόστασης μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών κατά Tajima-Nei. Η μικρότερη τιμή απεικονίζεται με γκρι φόντο, ενώ η μεγαλύτερη με πορτοκαλί Πίνακας 25: Τιμές της γενετικής απόστασης μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών κατά Tamura-Nei. Η μικρότερη τιμή απεικονίζεται με γκρι φόντο, ενώ η μεγαλύτερη με πορτοκαλί

107 Αποτελέσματα Καθαρές γενετικές αποστάσεις των μελετηθέντων πληθυσμών (Net Distances) Αν από τις τιμές της διαπληθυσμιακής απόστασης αφαιρεθεί το ποσοστό της απόστασης που οφείλεται στην ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα, τότε προκύπτει η τιμή της καθαρής διαπληθυσμιακής απόστασης για κάθε ζεύγος πληθυσμών. Ανεξαρτήτως του στατιστικού μοντέλου, οι χαμηλότερες τιμές της καθαρής διαπληθυσμιακής γενετικής απόστασης (0,000) για μεν το είδος Mus cypriacus βρέθηκαν μεταξύ των πληθυσμών του Όρους Τροόδους (7) και της Λεμεσού (8), της Πάφου (6) και της Λεμεσού (8), της Πάφου (6) και της Κερύνειας (5), για δε το είδος Mus musculus domesticus μεταξύ των πληθυσμών της Ελλάδας (1) και της Αμμοχώστου (3) (Πίνακες 26, 27, 28). Οι υψηλότερες τιμές της καθαρής γενετικής απόστασης ήταν 0,112 κατά Jukes- Cantor, 0,114 κατά Tajima-Nei και 0,114 κατά Tamura-Nei μεταξύ των πληθυσμών του Mus cypriacus και του Mus musculus domesticus του Όρους Τροόδους (2,7). Κατά Tajima-Nei υψηλή ήταν και η απόσταση μεταξύ των πληθυσμών Mus cypriacus της Κερύνειας (5) και Μ. m. domesticus του Όρους Τροόδους (2)(Πίνακες 26, 27, 28)

108 Αποτελέσματα Πίνακας 26: Τιμές της καθαρής γενετικής απόστασης κατά Jukes-Cantor, Οι μικρότερες τιμές απεικονίζονται με γκρι φόντο, ενώ η μεγαλύτερη με πορτοκαλί. Στις περιπτώσεις που η ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τη διαπληθυσμιακή ποικιλότητα του ζεύγους πληθυσμών, οι καθαρές διαπληθυσμιακές αποστάσεις δεν λαμβάνουν κάποια τιμή, και απεικονίζονται με παύλα Πίνακας 27: Τιμές της καθαρής γενετικής απόστασης κατά Tajima-Nei, Οι μικρότερες τιμές απεικονίζονται με γκρι φόντο, ενώ οι μεγαλύτερες με πορτοκαλί. Στις περιπτώσεις που η ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τη διαπληθυσμιακή ποικιλότητα του ζεύγους πληθυσμών, οι καθαρές διαπληθυσμιακές αποστάσεις δεν λαμβάνουν κάποια τιμή, και απεικονίζονται με παύλα Πίνακας 28: Τιμές της καθαρής γενετικής απόστασης κατά Tamura-Nei, Οι μικρότερες τιμές απεικονίζονται με γκρι φόντο, ενώ η μεγαλύτερη με πορτοκαλί. Στις περιπτώσεις που η ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τη διαπληθυσμιακή ποικιλότητα του ζεύγους πληθυσμών, οι καθαρές διαπληθυσμιακές αποστάσεις δεν λαμβάνουν κάποια τιμή, και απεικονίζονται με παύλα

109 Αποτελέσματα Ποικιλότητα των μελετηθέντων πληθυσμών Οι τιμές νουκλεοτιδικής και απλοτυπικής ποικιλότητας, π και h αντίστοιχα, μεταξύ των ατόμων Mus cypriacus και M. m. domesticus των πληθυσμών του Όρους Τροόδους και της Αμμοχώστου φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 29). Πίνακας 29: Τιμές νουκλεοτιδικής (π) και απλοτυπικής ποικιλότητας (h) των κυπριακών ατόμων του γένους Mus. Πληθυσμοί π h M. m. domesticus M. cypriacus Κύπρου (συνολικά) ± ± Όρους Τροόδους ± ± Αμμοχώστου ± ± Κύπρου (συνολικά) ± ± Όρους Τροόδους ± ± Αμμοχώστου ± ± Η υψηλότερη τιμή νουκλεοτιδικής ποικιλότητας παρατηρήθηκε στον πληθυσμό M. m. domesticus του Όρους Τροόδους και η χαμηλότερη στον πληθυσμό M. m. domesticus της Αμμοχώστου. Αντίστοιχα, η υψηλότερη τιμή απλοτυπικής ποικιλότητας παρατηρήθηκε στους πληθυσμούς M. m. domesticus του Όρους Τροόδους και Mus cypriacus της Αμμοχώστου και η χαμηλότερη στον πληθυσμό Mus cypriacus της Κύπρου συνολικά. Αξίζει να αναφερθεί ότι όλες οι τιμές απλοτυπικής ποικιλότητας βρίσκονται κοντά στη μονάδα (1) Σχέσεις συγγένειας ατόμων που ανήκουν στο γένος Mus της Κύπρου Για τη διερεύνηση των σχέσεων των ατόμων του είδους Mus cypriacus και του είδους Mus musculus domesticus της Κύπρου βάσει της γενετικής τους ομοιότητας σχεδιάστηκε ένα δενδρόγραμμα μέσω του προγράμματος ΜEGA ν.4.1, με τη μέθοδο Neighbor-Joining και το μοντέλο Tamura-Nei (Εικόνα 58), στο οποίο απεικονίζεται ο τρόπος ομαδοποίησης των ατόμων αυτών. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν και οι αλληλουχίες δύο ατόμων Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο. Το δενδρόγραμμα που προέκυψε αποκάλυψε δύο ομάδες φαινοτυπικής συγγένειας

110 Αποτελέσματα καθεμία από τις οποίες περιλάμβανε τα άτομα ενός εκ των δύο ειδών που μελετήθηκαν. Επιπλέον, σε κάθε ένα από τους δύο κύριους κλάδους που δημιουργήθηκαν, τα άτομα δεν ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με τον πληθυσμό στον οποίο ανήκουν και οι τιμές bootstrap που υπολογίστηκαν μέσα στους δύο αυτούς κλάδους συνήθως είναι χαμηλές

111 Αποτελέσματα Εικόνα 58: Φαινετικό δενδρόγραμμα των σχέσεων των μελετηθέντων ατόμων του γένους Mus από την Κύπρο, που σχεδιάστηκε με τη μέθοδο της σύνδεσης γειτόνων Neighbor-Joining με βάση το μοντέλο νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων των Tamura-Nei. Οι αριθμοί στους κόμβους αντιπροσωπεύουν τις τιμές bootstrap για 1000 επαναλήψεις. GenBank είναι ο κωδικός αριθμός του ζώου στην GenBank και ZMUP/M είναι o αύξων αριθμός κάθε ζώου στη συλλογή θηλαστικών του Ζωολογικού Μουσείου του Πανεπιστημίου Πατρών. 1-8: οι μελετηθέντες πληθυσμοί, όπως περιγράφονται στον Πίνακα

112 Αποτελέσματα 3.3. ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Σύμφωνα με τους Cucchi et al. (2006) δεν εμφανίζεται κάποιος φυλετικός διμορφισμός ως προς το μέγεθος και το σχήμα των κρανιακών και οδοντικών χαρακτηριστικών των κυπριακών ποντικών. Οπότε η απουσία φυλετικού διμορφισμού είναι ένας παράγοντας που δεν επηρεάζει την ανάλυση διάκρισης που εφαρμόζεται στο πειραματικό υλικό της παρούσας μελέτης, και για το λόγο αυτό και δεν λήφθηκε υπόψη. Έτσι, για τη μορφομετρική ανάλυση διάκρισης των ατόμων με βάση τα κρανιακά (ραχιαία και κοιλιακή επιφάνεια) και οδοντικά τους χαρακτηριστικά (περίγραμμα πρώτου άνω γομφίου, Μ 1 ), χρησιμοποιήθηκαν άτομα και των δύο φύλων Ανάλυση διάκρισης μεταξύ των μελετηθέντων ατόμων Mus musculus domesticus και Mus cypriacus της Κύπρου και Mus musculus domesticus της Ελλάδας Για την ανάλυση διάκρισης μεταξύ των μελετηθέντων ατόμων Mus musculus domesticus και Mus cypriacus της Κύπρου και των ατόμων Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο με βάση τα κρανιακά και οδοντικά τους χαρακτηριστικά, χρησιμοποιήθηκαν μοριακώς ταυτοποιημένα άτομα και των δύο φύλων, όπως περιγράφεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 30). Πίνακας 30: Οι πληθυσμοί και ο αριθμός ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση διάκρισης μεταξύ των μελετηθέντων ατόμων του Mus musculus domesticus και Mus cypriacus της Κύπρου και των Mus musculus domesticus της Ελλάδας. Μ 1 : ο πρώτος γομφίος της άνω γνάθου. Μελετηθείσα κρανιακή και οδοντική επιφάνεια Πληθυσμοί M. m. domesticus M. cypriacus M. m. domesticus Κύπρος Κύπρος (Αμμοχ./Όρος Τρ.) (Αμμοχ./Όρος Τρ.) Ελλάδα Ραχιαία κρανιακή 19 (17 / 2) 19 (1 / 18) 47 Κοιλιακή κρανιακή 15 (14 / 1) 18 (1 / 17) 42 Κάτοψη του Μ 1 21 (18 / 3) 22 (3 / 19)

113 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα της ανάλυσης συνοψίζονται στον πίνακα 31, όπου φαίνεται καθαρά ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά ως προς τον χαρακτήρα που μελετάται κάθε φορά, αφού η τιμή p που υπολογίστηκε είναι σε όλες τις περιπτώσεις μικρότερη του 0,001. Πίνακας 31: Περιγραφικά στοιχεία της ανάλυσης διάκρισης των μελετηθέντων ατόμων του Mus musculus domesticus και Mus cypriacus της Κύπρου και των Mus musculus domesticus της Ελλάδας. Μ 1 : ο πρώτος γομφίος της άνω γνάθου, Wilks' λ: Η τιμή αυτή (Wilks' lambda distribution) είναι μια κατανομή πιθανοτήτων που χρησιμοποιείται στη στατιστική ανάλυση, % of Variance: το ποσοστό της ποικιλομορφίας, df: οι βαθμοί ελευθερίας. Μελετηθείσα κρανιακή και οδοντική επιφάνεια Ραχιαία κρανιακή Κοιλιακή κρανιακή Ιδιοτιμή (Eigenvalue) % of Variance Wilks' λ χ 2 df p 34,061 94,9 0, , ,00 1,848 5,1 0,351 72, ,00 17,777 86,7 0, , ,00 2,722 13,3 0,269 76, ,00 Κάτοψη του Μ ,951 98,1 0, , ,00 77,808 1,9 0, , ,00 Στον πίνακα 32 παρουσιάζονται τα ποσοστά σωστής κατάταξης των ατόμων στους πληθυσμούς τους, καθώς και ο αριθμός των ατόμων που βάσει των μελετηθέντων μορφολογικών χαρακτήρων θα μπορούσαν να ενταχθούν σε διαφορετικούς πληθυσμούς από αυτούς που ανήκουν στην πραγματικότητα. Τα ποσοστά σωστής κατάταξης κυμαίνονται σε πολύ ψηλά επίπεδα, από 94,7 μέχρι 100%, οι τιμές αυτές όμως μειώνονται αισθητά στο cross-validation καθώς κυμαίνονται από 23,7-100%. Ακολουθούν τα διαγράμματα διασποράς των ατόμων των προαναφερθέντων πληθυσμών στους δύο πρώτους άξονες της ανάλυσης διάκρισης, με βάση τη ραχιαία κρανιακή και την κοιλιακή κρανιακή επιφάνεια (Εικόνα 59 Α, Β.) και το περίγραμμα της κάτοψης του πρώτου άνω γομφίου (M 1 ) (Εικόνα 60). Εξετάζοντας τα τρία αυτά διαγράμματα παρατηρείται ο σχηματισμός τριών διαχωρισμένων νεφών. Και στις τρεις περιπτώσεις το νέφος που αφορά στον πληθυσμό M. m. domesticus από τον ελλαδικό χώρο βρίσκεται σε θετικότερες τιμές, ενώ οι κυπριακοί πληθυσμοί βρίσκονται σε αρνητικότερες τιμές στον άξονα χ χ. Με βάση την ανάλυση διάκρισης ένα άτομο του πληθυσμού Mus cypriacus κατατάχθηκε στον πληθυσμό Mus musculus domesticus και ένα άτομο του πληθυσμού Mus musculus domesticus κατατάχθηκε στον πληθυσμό Mus cypriacus

114 Αποτελέσματα Πίνακας 32 : Ποσοστό (%) σωστής κατάταξης (Percent Correct) των ατόμων στους πληθυσμούς που ανήκουν. Παρατίθενται οι αναμενόμενες κατατάξεις (στήλες) (Predicted classifications) και οι παρατηρηθείσες από την ανάλυση (σειρές) (Observed classifications). Μ 1 : ο πρώτος γομφίος της άνω γνάθου 1: πληθυσμός Mus cypriacus, 2: πληθυσμός Mus musculus domesticus της Κύπρου, 3: πληθυσμός Mus musculus domesticus της Ελλάδας. Ραχιαία κρανιακή επιφάνεια Αρχική κατάταξη Crosssvalidated κατάταξη Class total Percent Correct , , ,0 total , , , ,0 total ,1 Κοιλιακή κρανιακή επιφάνεια Αρχική κατάταξη Crosssvalidated κατάταξη Class total Percent Correct , , ,0 total , , , ,0 total ,3 Επιφάνεια κάτοψης του Μ 1 Αρχική κατάταξη Crosssvalidated κατάταξη Class total Percent Correct , , ,0 total , , , ,0 total ,

115 Αποτελέσματα Α. Β. Εικόνα 59 Α, Β: Διάγραμμα διασποράς των ατόμων των δύο πληθυσμών Mus musculus domesticus και Mus cypriacus από τον κυπριακό και Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο στους δύο πρώτους άξονες της ανάλυσης διάκρισης που ερμηνεύουν το 100% της διακύμανσης των χαρακτηριστικών της ραχιαίας κρανιακής επιφάνειας (Α) και της κοιλιακής κρανιακής επιφάνειας (Β). Κεντροειδές μέγεθος είναι η τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των τετραγώνων των αποστάσεων των ατόμων από το κέντρο του συνόλου των ατόμων

116 Αποτελέσματα Εικόνα 60: Διάγραμμα διασποράς των ατόμων των δύο πληθυσμών Mus musculus domesticus και Mus cypriacus από τον κυπριακό και Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο στους δύο πρώτους άξονες της ανάλυσης διάκρισης που ερμηνεύουν το 100% της διακύμανσης του περιγράμματος πρώτου άνω γομφίου (Μ 1 ). Κεντροειδές μέγεθος είναι η τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των τετραγώνων των αποστάσεων των ατόμων από το κέντρο του συνόλου των ατόμων

117 Αποτελέσματα Ανάλυση διάκρισης μεταξύ όλων των μελετηθέντων ατόμων Mus Στη συνέχεια η ανάλυση διάκρισης πραγματοποιήθηκε συμπεριλαμβάνοντας και τα άτομα στα οποία δεν είχε γίνει ταξινομικός προσδιορισμός. Έτσι, για την ανάλυση διάκρισης των ατόμων με βάση τα κρανιακά και οδοντικά τους χαρακτηριστικά, χρησιμοποιήθηκαν άτομα και των δύο φύλων των ειδών Mus cypriacus και Mus musculus domesticus τα οποία προήλθαν από 2 κυπριακούς πληθυσμούς (πεδινή και ορεινή περιοχή), καθώς και άτομα Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο, όπως περιγράφεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 33). Πίνακας 33: Οι πληθυσμοί και ο αριθμός ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση διάκρισης μεταξύ όλων των μελετηθέντων πληθυσμών του γένους Mus. Μ 1 : ο πρώτος γομφίος της άνω γνάθου. Μελετηθείσα κρανιακή και οδοντική επιφάνεια Πληθυσμοί Mus spp. Mus spp. M. m. domesticus Αμμόχωστος Όρος Τρόοδος Ελλάδα Ραχιαία κρανιακή Κοιλιακή κρανιακή Κάτοψη του Μ Τα αποτελέσματα της ανάλυσης συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 34). Η τιμή p που υπολογίστηκε είναι σε όλες τις περιπτώσεις μικρότερη του 0,001 κάτι που δείχνει καθαρά ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά ως προς τον εκάστοτε υπό μελέτη χαρακτήρα

118 Αποτελέσματα Πίνακας 34: Περιγραφικά στοιχεία της ανάλυσης διάκρισης όλων των μελετηθέντων πληθυσμών του γένους Mus. Μ 1 : ο πρώτος γομφίος της άνω γνάθου. Wilks' λ: Η τιμή αυτή (Wilks' lambda distribution) είναι μια κατανομή πιθανοτήτων που χρησιμοποιείται στη στατιστική ανάλυση, % of Variance: το ποσοστό της ποικιλομορφίας, df: οι βαθμοί ελευθερίας. Μελετηθείσα κρανιακή και οδοντική επιφάνεια Ιδιοτιμή (Eigenvalue) % of Variance Wilks' λ χ 2 df p Ραχιαία κρανιακή 33,970 92,5 0, , ,00 2,761 7,5 0, , ,00 Κοιλιακή κρανιακή 15,032 83,5 0, , ,00 2,978 16,5 0, , ,00 1 Κάτοψη του Μ 27844,148 99,1 0, , ,00 25,534 0,01 0, , ,00 Στον πίνακα 35 παρουσιάζονται τα ποσοστά σωστής κατάταξης των ατόμων στους πληθυσμούς τους, καθώς και ο αριθμός των ατόμων που βάσει των μελετηθέντων μορφολογικών χαρακτήρων θα μπορούσαν να ενταχθούν σε διαφορετικούς πληθυσμούς από αυτούς που ανήκουν στην πραγματικότητα. Τα ποσοστά σωστής κατάταξης κυμαίνονται από 95 μέχρι 100%, οι τιμές αυτές όμως μειώνονται αισθητά στο cross-validation (63,6 μέχρι 100%). Με βάση την ανάλυση διάκρισης, ένα άτομο του πληθυσμού Mus spp. του Όρους Τροόδους κατατάχθηκε στον πληθυσμό Mus spp.της Αμμοχώστου. Ακολουθούν τα διαγράμματα διασποράς των ατόμων των δύο κυπριακών πληθυσμών Mus spp. (πεδινή και ορεινή περιοχή) και των ατόμων Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο, με βάση τη ραχιαία και την κοιλιακή κρανιακή επιφάνεια (Εικόνα 61 Α, Β.) και το περίγραμμα της κάτοψης του πρώτου άνω γομφίου (Εικόνα 62). Εξετάζοντας τα τρία αυτά διαγράμματα παρατηρείται και πάλι ο σχηματισμός τριών διαχωρισμένων νεφών με μοναδική εξαίρεση ένα άτομο του πληθυσμού Mus spp. του Όρους Τροόδους το οποίο με βάση τα χαρακτηριστικά της ραχιαίας κρανιακής του επιφάνειας κατατάχθηκε στον πληθυσμό Mus spp.της Αμμοχώστου

119 Αποτελέσματα Πίνακας 35 : Ποσοστό (%) σωστής κατάταξης (Percent Correct) των ατόμων στους πληθυσμούς που ανήκουν. Παρατίθενται οι αναμενόμενες κατατάξεις (στήλες) (Predicted classifications) και οι παρατηρηθείσες από την ανάλυση (σειρές) (Observed classifications). Μ 1 : ο πρώτος γομφίος της άνω γνάθου. 1: πληθυσμός Mus spp. Αμμοχώστου, 2: πληθυσμός Mus spp. Όρους Τροόδους, 3: πληθυσμός M. m. domesticus Ελλάδας. Ραχιαία κρανιακή επιφάνεια Κοιλιακή κρανιακή επιφάνεια Αρχική κατάταξη Crosssvalidated κατάταξη Αρχική κατάταξη Crosssvalidated κατάταξη Class total Percent Correct , , ,0 total , , , ,0 total ,1 Class total Percent Correct , , ,0 total , , , ,0 total ,9 Επιφάνεια κάτοψης του Μ 1 Αρχική κατάταξη Crosssvalidated κατάταξη Class total Percent Correct , , ,0 total , , , ,0 total ,

120 Αποτελέσματα Α. Β. Εικόνα 61 Α, Β: Διάγραμμα διασποράς των ατόμων των πληθυσμών Mus spp. από τον κυπριακό, και Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο στους δύο πρώτους άξονες της ανάλυσης διάκρισης που ερμηνεύουν το 100% της διακύμανσης των χαρακτηριστικών της ραχιαίας κρανιακής επιφάνειας (Α) και της κοιλιακής κρανιακής επιφάνειας (Β). Κεντροειδές μέγεθος είναι η τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των τετραγώνων των αποστάσεων των ατόμων από το κέντρο του συνόλου των ατόμων

121 Αποτελέσματα Εικόνα 62: Διάγραμμα διασποράς των ατόμων των πληθυσμών Mus spp. από τον κυπριακό, και Mus musculus domesticus από τον ελλαδικό χώρο στους δύο πρώτους άξονες της ανάλυσης διάκρισης που ερμηνεύουν το 100% της διακύμανσης του περιγράμματος πρώτου άνω γομφίου (Μ 1 ). Κεντροειδές μέγεθος είναι η τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των τετραγώνων των αποστάσεων των ατόμων από το κέντρο του συνόλου των ατόμων

122 Συζήτηση 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. ΠΑΓΙΔΕΥΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Η συλλογή μικροθηλαστικών στα πλαίσια της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνει την παρουσία των ειδών Mus musculus domesticus (σπιτικός ποντικός), Mus cypriacus (κυπριακός ποντικός) και Crocidura suaveolens (μυγαλή) στην Κύπρο. Η παρουσία αυτών των ειδών έχει αναφερθεί και από τους Kryštufek & Vohralik (2001) και Cucchi et al. (2006) Εξάπλωση των ειδών του γένους Mus Η επιτυχία των παγιδεύσεων διέφερε ανάλογα με την τοποθεσία δειγματοληψίας και την εποχή. Η πλειονότητα των συλλήψεων πραγματοποιήθηκε στις περιοχές του Νοσοκομείου Παραλιμνίου, της Λίμνης Παραλιμνίου και σε ένα λιβάδι κοντά στο χωριό Πλάτρες, ενώ μόνο ένα άτομο συλλέχθηκε στον ποταμό Λιοπετρίου. Οι δειγματοληψίες στις υπόλοιπες τοποθεσίες (πευκοδάσος Τροόδους, περιοχή Τροοδίτισσας και περιοχή λιβαδιού κοντά στον Κρυό ποταμό) δεν ήταν επιτυχείς. Στην περιοχή του Όρους Τροόδους, όλες οι συλλήψεις των ζώων έγιναν σε ένα λιβάδι κοντά στις Πλάτρες όπου κυρίαρχο φυτικό είδος είναι το αμπέλι, καθώς πρόκειται για εγκαταλειμμένη αμπελοκαλλιέργεια. Η περιοχή δεν βόσκεται από ζώα και γι αυτό η ποώδης - χαμηλή θαμνώδης βλάστηση είναι πυκνή, με αποτέλεσμα να προσφέρει προστασία στα μικροθηλαστικά κατά τις μετακινήσεις τους. Όπως προέκυψε από τη μοριακή ταυτοποίηση των συλληφθέντων ζώων, 20 από τα 23 άτομα του ορεινού αυτού πληθυσμού Mus ανήκαν στο είδος Mus cypriacus. Όσον αφορά στις συλλήψεις που πραγματοποιήθηκαν στην πεδινή περιοχή της επαρχίας Αμμοχώστου και για τα τρία είδη μικροθηλαστικών, η πλειονότητά τους έγινε σε παγίδες που είχαν τοποθετηθεί κοντά ή μέσα σε αποθήκες σιτηρών. Το γεγονός ότι πλειονότητα των συλλήψεων έγινε σε σημεία άμεσα επηρεαζόμενα από τον άνθρωπο, δικαιολογεί την κυριαρχία του είδους Mus musculus domesticus στην περιοχή. Πράγματι, 18 από τα 21 συλληφθέντα και μοριακά ταυτοποιημένα άτομα ανήκαν στο είδος αυτό, το οποίο όπως υποδηλώνει και το όνομά του, εξαπλώνεται κυρίως σε ποικιλία αστικών οικοτόπων (Macdonald & Barrett, 1993)

123 Συζήτηση Οι δύο περιοχές που μελετήθηκαν χαρακτηρίζονται από διαφορετικούς βιοτόπους, εξαιτίας όχι μόνο της ανθρώπινης επίδρασης, αλλά κυρίως λόγω της έντονης υψομετρικής διαφοράς. Η πεδινή περιοχή, δηλαδή η ελεύθερη περιοχή της επαρχίας Αμμοχώστου, προσεγγίστηκε για τέτοιου είδους μελέτη για πρώτη φορά. Μέχρι τώρα, στη βιβλιογραφία το είδος Mus cypriacus χαρακτηρίζεται ως αγροδίαιτο είδος, ο βιότοπος του οποίου περιλαμβάνει εγκαταλειμμένους αμπελώνες, λιβάδια, θαμνώδεις εκτάσεις και παραποτάμια δάση στην περιοχή του Όρους Τροόδους σε υψόμετρο m (Cucchi et al., 2006). Κατά τους ίδιους ερευνητές θεωρείται ότι σε υψόμετρο m ζει συντοπικά με τον σπιτικό ποντικό σε παραποτάμια δάση, ενώ δεν εξαπλώνεται σε περιοχές με υψόμετρο χαμηλότερο των 100m. Επίσης θεωρείται ότι απουσιάζει από περιοχές που επηρεάζονται άμεσα από τον άνθρωπο, όπως καλλιέργειες στη Μεσαορία, ανθρώπινες κατοικίες και φάρμες, περιοχές όπου εξαπλώνεται κυρίως το είδος Mus musculus domesticus (Cucchi et al., 2006 Macholán et al., 2008). Εντούτοις, από τα δεδομένα της παρούσας εργασίας προκύπτει καθαρά ότι τα δύο είδη ποντικών συνυπάρχουν στους ίδιους βιοτόπους, καθώς το Mus cypriacus φαίνεται να κατανέμεται και σε μια ευρύτερη ομάδα οικοτόπων από ό,τι ήταν μέχρι σήμερα γνωστό, καθώς συλλέχθηκε όχι μόνο σε φυσικούς οικοτόπους, αλλά και σε οικοτόπους με έντονη ανθρωπογενή επίδραση, όπως φάρμες, αποθήκες σιτηρών και εγκαταλειμμένες καλλιέργειες σιτηρών και αμπελιού. Όσον αφορά στην κατακόρυφη κατανομή του είδους, διαπιστώθηκε από την παρούσα μελέτη ότι αυτό εξαπλώνεται σε υψόμετρο από 44 m (Παραλίμνι, κοιλάδα Μεσαορίας) μέχρι 1015 m (Κάτω Πλάτρες, Όρος Τρόοδος). Τα ευρήματα, λοιπόν, της παρούσας μελέτης διευρύνουν την περιοχή εξάπλωσης του Mus cypriacus, τόσο ως προς τον οικολογικό χαρακτήρα των βιοτόπων του όσο και ως προς την οριζόντια και κατακόρυφη εξάπλωσή του Εποχική ποικιλότητα στις συλλήψεις των πειραματοζώων Τα τρωκτικά φαίνεται να παρουσιάζουν μεγαλύτερη κινητικότητα κατά τους ζεστούς μήνες της άνοιξης και του καλοκαιριού, αφού οι περισσότερες συλλήψεις τους έγιναν κατά το καλοκαίρι 08 και την άνοιξη 09, όπως αποκάλυψε η ανάλυση με τη μέθοδο χ 2 των εποχικών διαφορών ως προς τις συνολικές συλλήψεις των ατόμων του γένους Mus

124 Συζήτηση Η συνολική αυτή διαφορά φαίνεται να οφείλεται κατά κύριο λόγο στην εποχιακή διαφορά της αφθονίας των τρωκτικών στην πεδινή περιοχή, καθώς στην ορεινή περιοχή δεν υπάρχουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στους αριθμούς συλλήψεων μεταξύ των εποχών δειγματοληψίας. Αυτό πιθανών να οφείλεται στο ότι το δείγμα της ορεινής περιοχής, παρά τις επανειλημμένες προσπάθειες παγίδευσης παρέμεινε πολύ μικρό (1-7 άτομα σε κάθε ομάδα, 23 άτομα συνολικά) (Πίνακας 12). Είναι γνωστό ότι προϋπόθεση για να ισχύει η ανάλυση χ 2 η οποία εφαρμόστηκε στην προκειμένη περίπτωση είναι: α) το δείγμα να είναι πολύ μεγάλο (συνήθως μεγαλύτερο του 50), καθώς τα μεγάλα δείγματα θεωρούνται περισσότερο αξιόπιστα σχετικά με τα μικρά δείγματα, γιατί όσο αυξάνει το μέγεθος του δείγματος τόσο μειώνεται το δειγματοληπτικό λάθος, και β) όλες οι συγκρινόμενες ομάδες ατόμων πρέπει να έχουν συνήθως μέγεθος μεγαλύτερο του πέντε (5) (Αλαχιώτης, 2003). Από αυτά προκύπτει ότι η ανάλυση χ 2 στην περίπτωση της εποχικής ποικιλότητας δεν είναι αξιόπιστη ως προς τις συλλήψεις στην ορεινή περιοχή μελέτης, καθώς δεν πληρούνται οι προϋποθέσεις που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Επιπρόσθετα, στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι το μέγεθος των πληθυσμών των τρωκτικών παρουσιάζει διακύμανση η οποία εξαρτάται από παράγοντες, όπως η διαθεσιμότητα τροφής, η επάρκεια σημείων φωλεοποίησης, η θερμοκρασία, η κοινωνική καταστολή της αναπαραγωγής και οι ασθένειες (Macdonald & Barrett, 1993). Ορισμένοι από αυτούς τους παράγοντες παρουσιάζουν εποχικότητα. Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην ενότητα 1.3. η Κύπρος είναι ένα νησί με μεσογειακού τύπου κλίμα, όπου καταγράφεται ένα δίπολο εποχών. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στην έντονη μεταβολή της θερμοκρασίας αλλά και στη βροχόπτωση που συγκεντρώνεται σχεδόν αποκλειστικά στην ψυχρή περίοδο του έτους (χειμώνας). Έτσι, η άνοιξη και το φθινόπωρο αποτελούν μεταβατικές περιόδους από την εποχή του ψύχους και της υγρασίας (χειμώνας) στην εποχή της αυξημένης θερμοκρασίας και της απουσίας βροχοπτώσεων (καλοκαίρι) και αντιστρόφως. Σύμφωνα με τα παραπάνω κατά την περίοδο της άνοιξης και του καλοκαιριού όπου επικρατούν πολύ υψηλές θερμοκρασίες στο νησί υπάρχουν μεγάλα αποθέματα τροφής και ευνοείται η αύξηση των πληθυσμών. Αντιθέτως, οι χαμηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια του χειμώνα κατά τους φθινοπωρινούς και χειμερινούς μήνες οδηγούν σε μείωση της επάρκειας τροφής η οποία δρα ως περιοριστικός παράγοντας στην αναπαραγωγή των ατόμων, με επακόλουθη μείωση της πυκνότητας των πληθυσμών (Berry, 1981). Συμπερασματικά, οι εποχικές διαφορές που παρατηρήθηκαν στις συλλήψεις πιθανώς να οφείλονται στο συνδυασμό των δύο αυτών παραγόντων: (α) της αναξιοπιστίας της εφαρμογής της μεθόδου χ 2 για την ανάλυση της εποχικής

125 Συζήτηση ποικιλότητας στις συλλήψεις που πραγματοποιήθηκαν στην ορεινή περιοχή και (β) της εποχιακής διαφοράς στη διαθεσιμότητα τροφής ως κύριο περιβαλλοντικό παράγοντας που επηρεάζει τη αναπαραγωγή και διακύμανση των πληθυσμών των ποντικών Διαφορές σωματικού μεγέθους Παρατηρώντας τα αποτελέσματα της κατανομής των ατόμων του γένους Mus με βάση τα μετρηθέντα ολικά μήκη σώματος (Total body length - TBL) σε κλάσεις μήκους σώματος των 10 mm, αποκαλύπτεται ότι τα περισσότερα άτομα κατατάσσονται σε κλάσεις μεταξύ 120 και 159 mm. Αν και ο αριθμός των συλλεχθέντων θηλυκών ήταν μικρός (17 άτομα) και η ηλικιακή κατανομή των ατόμων δεν λήφθηκε υπόψη, εν τούτοις μεταξύ των δύο φύλων και ανεξαρτήτως περιοχής, φαίνεται ότι τα αρσενικά άτομα είναι μικρότερα σε μέγεθος σε σχέση με τα θηλυκά. Το ίδιο προκύπτει και από την εξέταση των κατανομών των ατόμων σε κλάσεις ολικού μήκους σώματος για τα δύο είδη του γένους Mus, για κάθε φύλο και περιοχή συλλογής. Φαίνεται καθαρά ότι το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων Mus cypriacus κατατάσσεται σε κλάσεις μεγάλου μήκους και η πλειονότητά των ατόμων του Mus musculus domesticus κατανέμεται στις μεσαίες κλάσεις μήκους, αν και γενικά παρουσιάζει ένα πιο ομοιόμορφο πρότυπο κατανομής. Βέβαια, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι το γεγονός ότι τα άτομα της ορεινής περιοχής ανεξαρτήτως φύλου κατατάσσονται σε κλάσεις μεγαλύτερου μήκους σε σχέση με της πεδινής περιοχής, μπορεί να οφείλεται στο ότι ο ορεινός πληθυσμός του γένους Mus αποτελείται ως επί το πλείστον (20 από τα 23 άτομα του πληθυσμού) από άτομα του είδους Mus cypriacus. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία τα άτομα του είδους Mus cypriacus είναι λίγο μεγαλύτερα σε μέγεθος (TBL = mm) σε σχέση με τον σπιτικό ποντικό Mus musculus domesticus (TBL = mm) (Cucchi et al., 2006)

126 Συζήτηση 4.2. ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Στην προσπάθεια να γίνει με βεβαιότητα ο ταξινομικός προσδιορισμός των συλλεχθέντων ατόμων, εφαρμόστηκε η ανάλυση αλληλουχίας σε τμήμα της περιοχής ελέγχου του μιτοχονδριακού DNA. Για να βρεθεί η ομαδοποίηση των ατόμων βάσει της γενετικής τους σύστασης, πραγματοποιήθηκε φαινετική ανάλυση με τη μέθοδο Neighbor-Joining. Τα φαινετικά δένδρα που προέκυψαν με βάση τα μοντέλα Jukes- Cantor, Tajima-Nei και Tamura-Nei (Εικόνα 67) αποκάλυψαν ότι τα άτομα ομαδοποιούνται ανάλογα με το είδος στο οποίο ανήκουν (σύμφωνα με τους γνωστούς απλότυπους των δύο ειδών), και μάλιστα με μεγάλη στατιστική υποστήριξη, καθώς οι κλάδοι του φαινογράμματος χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα μεγάλες τιμές bootstrap (99%). Αρκετές πληροφορίες προκύπτουν από τα μοριακά δεδομένα της παρούσας μελέτης σχετικά με την ενδοπληθυσμιακή και τη διαπληθυσμιακή ποικιλότητα των δύο ειδών του γένους Mus που συλλέχθηκαν στην Κύπρο στο πλαισιο της παρούσας μελέτης, και υπολογίστηκαν με βάση τα μοντέλα Jukes-Cantor, Tajima-Nei και Tamura-Nei. Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα, ο υπολογισμός της καθαρής γενετικής απόστασης για κάθε ζεύγος πληθυσμών προκύπτει όταν από τις τιμές της διαπληθυσμιακής απόστασης αφαιρείται η τιμή της απόστασης που οφείλεται στην ενδοπληθυσμιακή ποικιλότητα. Στις περιπτώσεις που η γενετική διαφοροποίηση κάποιων πληθυσμών είναι μεγάλη, και οι τιμές των ενδοπληθυσμιακών αποστάσεων που υπολογίζονται από τα στατιστικά προγράμματα είναι μεγαλύτερες των διαπληθυσμιακών αποστάσεων, τότε οι διαπληθυσμιακές αποστάσεις είναι μηδενικές ή σε ορισμένες περιπτώσεις υπολογίζονται με μικρές αρνητικές τιμές. Στις τελευταίες αυτές περιπτώσεις, επειδή δεν έχει καμία βιολογική έννοια η αρνητική απόσταση, αυτή θεωρείται μηδενική, και η ενδοπληθυσμιακή απόσταση αποτελεί και ολόκληρη την παρατηρούμενη απόσταση. Η ενδοπληθυσμιακή γενετική απόσταση του πληθυσμού Mus musculus domesticus της επαρχίας Αμμοχώστου (0.041) είναι πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές ελληνικών πληθυσμών του είδους που σύμφωνα με τους Tryfonopoulos et al. (2005) κυμαίνονται από έως Από το γεγονός αυτό φαίνεται ότι η ποικιλομορφία των κυπριακών πληθυσμών αυτού του είδους είναι αρκετά μεγαλύτερη σε σχέση με τους αντίστοιχους ελληνικούς. Το ζεύγος πληθυσμών Ελλάδας/Αμμοχώστου για το είδος Mus musculus domesticus

127 Συζήτηση χαρακτηρίζεται από τη μικρότερη μετρήσιμη τιμή καθαρής γενετικής απόστασης, δηλαδή μηδέν (0), ενώ η καθαρή γενετική απόσταση μεταξύ των πληθυσμών του είδους δεν λάμβανε κάποια τιμή στην περίπτωση των ζευγών Ελλάδας/Όρους Τροόδους και Όρους Τροόδους/Αμμοχώστου. Στο σημείο αυτό αξίζει να αναφερθεί ότι οι τιμές ενδοπληθυσμιακής απόστασης των μελετηθέντων πληθυσμών Mus cypriacus κυμάνθηκαν μεταξύ (πληθυσμός της επαρχίας Λεμεσού) και (πληθυσμός της επαρχίας Αμμοχώστου). Όσον αφορά στις τιμές καθαρών γενετικών αποστάσεων, τα ζεύγη πληθυσμών Όρους Τροόδους/Λεμεσού, Πάφου/Λεμεσού και Πάφου/Κερύνειας για το είδος Mus cypriacus χαρακτηρίζονται από τη μικρότερη μετρήσιμη τιμή γενετικής απόστασης, δηλαδή μηδέν (0). Σε πολλά ζευγάρια πληθυσμών η τιμή της καθαρής ενδοπληθυσμιακής απόστασης καταλήγει σε αρνητικές τιμές. Στην προκειμένη περίπτωση παρατηρήθηκε στα ζεύγη των πληθυσμών του είδους Mus cypriacus Αμμοχώστου/Κερύνειας, Αμμοχώστου/Πάφου, Αμμοχώστου/Όρους Τροόδους Αμμοχώστου/Λεμεσού και τέλος Κερύνειας/Λεμεσού. Οι υψηλότερες τιμές της καθαρής γενετικής απόστασης παρατηρήθηκαν μεταξύ των πληθυσμών του είδους Mus cypriacus και του Mus musculus domesticus του Όρους Τροόδους, αλλά και των πληθυσμών του Mus cypriacus της Κερύνειας και του Μ. m. domesticus του Όρους Τροόδους, κάτι που οφείλεται προφανώς στο ότι οι πληθυσμοί που απαρτίζουν καθένα από αυτά τα ζεύγη είναι πληθυσμοί δύο διαφορετικών ειδών. Τα αίτια της τόσο χαμηλής διαπληθυσμιακής διαφοροποίησης μπορούν να αποδοθούν στην ύπαρξη σημαντικής γονιδιακής ροής μέσω ενεργητικής μετανάστευσης ή παθητικής μεταφοράς ατόμων μεταξύ των πληθυσμών κάθε είδους. Τα ζώα αυτά συνήθως μετακινούνται σε μικρές αποστάσεις. Όταν διαβιούν σε κτίρια, οι μετακινήσεις από τη φωλιά περιορίζονται στα 3-10m, ενώ σπάνια διασχίζουν δρόμους ή περιοχές που δεν τους προσφέρουν κάλυψη στις μετακινήσεις τους. Αντίθετα, στο ύπαιθρο η κινητικότητα των ατόμων του γένους Mus σε κάποιες περιπτώσεις είναι ιδιαίτερα μεγάλη, αφού η δραστηριότητά τους έχει καταγραφεί σε απόσταση μέχρι και 2,4 km μακριά από τη φωλιά τους. Η απόσταση των μετακινήσεων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη διαθέσιμη τροφή στους οικοτόπους. Συχνά, τα άτομα του γένους Mus μεταφέρονται τυχαία σε μεγάλες αποστάσεις από τον άνθρωπο κατά τις εμπορικές και άλλες μεταφορές. Γενικά, η έκταση της περιοχής κίνησής τους κυμαίνεται από 4 m 2 μέχρι 1-2 km 2 (Macdonald & Barrett, 1993)

128 Συζήτηση Αξίζει να σημειωθεί ότι η αποίκηση της Κύπρου από τον άνθρωπο, όπως αναφέρεται στην Ενότητα πραγματοποιήθηκε περίπου πριν από χρόνια. Με την παρουσία των πρώτων ανθρώπων στο νησί, μεταφέρθηκε πιθανώς και το είδος Mus musculus domesticus (Auffray et al., 1990). Σύμφωνα με τους Boekschoten and Sondaar (1972) βρέθηκαν απολιθώματα του είδους στην Κυθραία και τη Χοιροκοιτία, που χρονολογούνται στα χρόνια π.χ. Αντιθέτως, το είδος Mus cypriacus εμφανίστηκε στο νησί πριν από περίπου χρόνια (Macholán et al., 2007). Σύμφωνα με τους ίδιους ερευνητές, θεωρείται ότι αποίκησαν το νησί κάποια άτομα που έμοιαζαν με το Mus macedonicus από τα βορειοανατολικά πριν από χρόνια. Στη συνέχεια ακολούθησε το φαινόμενο του ιδρυτή και λόγω της απομόνωσης του νησιού διαφοροποιήθηκε δίνοντας ένα νέο είδος, το Mus cypriacus. Το είδος αυτό όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα θεωρείται ως αγροδίαιτο είδος, το οποίο δεν ζει σε ανθρωπογενείς περιοχές, άρα δεν έχει έντονη επαφή με τον άνθρωπο. Συνεπώς, αυτός είναι ο λόγος που αν και εντός του νησιού η κίνησή του είναι επαρκής ώστε να υπάρχει γενετική ροή μεταξύ των πληθυσμών και η διαπληθυσμιακή διαφοροποίηση να είναι χαμηλή, η σχέση του με τον άνθρωπο δεν έχει συμβάλει στον αποικισμό περιοχών εκτός των ορίων του νησιού. Ωστόσο, οι μετακινήσεις των ατόμων σε τόσο μεγάλες αποστάσεις μεταφέρουν αλληλόμορφα από τον ένα πληθυσμό στον άλλο, μειώνοντας έτσι τις διαφορές μεταξύ των γονιδιακών δεξαμενών των εν λόγω πληθυσμών. Ουσιαστικά, διαχέονται με αυτό τον τρόπο οι διαφοροποιήσεις μεταξύ των πληθυσμών. Με άλλα λόγια, η χαμηλή γενετική διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε αντικατοπτρίζει τη γενετική ροή, η οποία πρέπει να είναι αρκετά συνηθισμένο φαινόμενο μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών. Το δένδρο Neighbor-Joining (Εικόνα 68) που βασίστηκε τόσο στα ήδη δημοσιευμένα δεδομένα αλληλουχιών της περιοχής ελέγχου του mtdna ατόμων Mus που προέρχονται από την Κύπρο όσο και στα δεδομένα της παρούσας εργασίας ομαδοποιεί μεν τα άτομα των δύο ειδών Mus σε δύο διακριτούς κλάδους, αλλά δεν δίνει σαφή σχέση μεταξύ των ατόμων των διαφόρων πληθυσμών. Παρατηρώντας τον κύριο κλάδο του δενδρογράμματος που περιλαμβάνει τα άτομα Mus cypriacus, φαίνεται ότι τα άτομα κάθε πληθυσμού είναι κατανεμημένα σε όλους τους δευτερεύοντες κλάδους, δηλαδή δεν επιτεύχθηκε ομαδοποίηση των ατόμων ανάλογα με τον γεωγραφικό πληθυσμό στον οποίο ανήκουν. Το ίδιο ισχύει και για τα άτομα του Mus musculus domesticus που αποτελούν τον δεύτερο κύριο κλάδο. Γενικά, η ομαδοποίηση που παρατηρήθηκε στους κλάδους των δένδρων δεν ακολούθησε το πρότυπο της γεωγραφικής εγγύτητας των τοποθεσιών κάθε πληθυσμού, αφού σε

129 Συζήτηση κάποιες περιπτώσεις ομαδοποιήθηκαν άτομα από απομακρυσμένες περιοχές, ενώ σε κάποιες άλλες, γεωγραφικά κοντινά άτομα βρέθηκαν τοποθετημένα σε απομακρυσμένους κλάδους του δενδρογράμματος. Το μικρό μέγεθος του δείγματος ανά πληθυσμό μπορεί να είναι ένας πιθανός παράγοντας υποεκτίμησης της γενετικής ποικιλότητας. Επίσης οι χαμηλές τιμές bootstrap που υπολογίστηκαν υποδηλώνουν ότι η τοπολογία των ατόμων στο δένδρο είναι ασταθής και ότι η γενετική διαφοροποίηση των μελετηθέντων ατόμων δεν οδηγεί σε σαφή συμπεράσματα όσον αφορά στη φαινοτυπική συγγένειά τους. Η περιοχή ελέγχου D-loop είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος μοριακός δείκτης για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ πληθυσμών με πολύ στενή συγγένεια (όπως για παράδειγμα πληθυσμών ή ομάδων ατόμων που ανήκουν στο ίδιο είδος) γιατί είναι λιγότερο συντηρημένη σε σχέση με τις κωδικές περιοχές. Η ταχέως εξελισσόμενη περιοχή της D-loop χρησιμοποιείται για την ανάλυση σε ενδοειδικό επίπεδο (Avise, 1994). Η μελέτη των Greenberg et al. (1983) στο ανθρώπινο mtdna αποκάλυψε ότι ειδικά η ανάλυση αλληλουχίας της περιοχής D- loop είναι ιδιαίτερα πληροφοριακή όσον αφορά στην αναλυτική ικανότητα του mtdna να διαχωρίζει τα εξεταζόμενα taxa. Η αποτυχία ομαδοποίησης των μελετηθέντων ατόμων ανάλογα με τον πληθυσμό στον οποίο ανήκουν, πιθανώς εξηγείται και από τη ραγδαία εξέλιξη των περιοχών ETAS και CSB της D-loop και τα προβλήματα που προκαλεί. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία (Nachman et al., 1994 Pesole et al., 1999). ο ρυθμός εξέλιξής τους είναι τόσο μεγάλος ώστε σε ορισμένες περιπτώσεις δεν είναι δυνατή η στοίχιση αλληλουχιών των περιοχών αυτών ακόμα και σε άτομα του ιδίου είδους. Για τη δημιουργία των φαινογραμμάτων στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η περιοχή του ETAS της D-loop του mtdna. Με βάση την περιοχή αυτή, η ομαδοποίηση των ατόμων ανάλογα με το είδος τους ήταν επιτυχής. Εντούτοις, ο γρήγορος εξελικτικός ρυθμός της υποθέτουμε ότι είναι ένας λόγος για τη μη ομαδοποίηση των ατόμων σε κάθε κλάδο ανάλογα με την περιοχή του πληθυσμού στον οποίο ανήκουν. Η μελέτη των μοριακών παραμέτρων των μελετηθέντων πληθυσμών έδειξε ότι αυτές δεν διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με τις αντίστοιχες παραμέτρους άλλων πληθυσμών του γένους Mus που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα (Πίνακας 36). Οι τιμές νουκλεοτιδικής και απλοτυπικής ποικιλότητας των κυπριακών πληθυσμών M. m. domesticus (π= h=0.9476) είναι μεγαλύτερες από αυτές που αναφέρουν οι Tryfonopoulos et al. (2005) για πληθυσμούς της Ελλάδας (π= , h=0.8912), οι Prager et al. (1996, 1998) για πληθυσμούς της Ευρώπης, της Β. Αφρικής και της Ν.Δ. Ασίας (π=0.0057, h= και π=0.0056, h= αντίστοιχα), οι Gündüz et

130 Συζήτηση al., (2000) για πληθυσμούς της Τουρκίας και του Ιράν (π=0.0100) και οι Gündüz et al., (2001) για πληθυσμούς της Μαδέιρα (π=0.0014, h=0.9000). Παρομοίως, οι τιμές που υπολογίστηκαν από την παρούσα εργασία για τους πληθυσμούς M. cypriacus (π= , h=0.9476) είναι μεγαλύτερες από τις τιμές που αναφέρουν οι Macholán et al. (2007) (π= και h=0.9801). Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω δεδομένα, οι κυπριακοί πληθυσμοί εμφάνισαν τα υψηλότερα επίπεδα μοριακού πολυμορφισμού που έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα. Πίνακας 36: Τιμές μοριακών παραμέτρων που υπολογίστηκαν σε μελέτες του γένους Mus από διάφορους ερευνητές. Πληθυσμός Νουκλεοτιδική ποικιλότητα (π) Απλοτυπική ποικιλότητα (θ) Gündüz et al., 2000 M. m. domesticus Gündüz et al., 2001 M. m. domesticus Macholán et al., 2007 M. cypriacus Prager et al., 1996 M. m. domesticus Prager et al., 1998 M. m. domesticus Tryfonopoulos et al., 2005 M. m. domesticus Τα ευρήματα αυτά δεν αποκλείουν την πιθανότητα ότι το απλοτυπικό πρότυπο που παρατηρήθηκε έχει διαμορφωθεί σε κάποιο βαθμό και από τη διαδικασία της γενετικής ροής. Επίσης, η δημιουργία δήμων και η αναπαραγωγική διαδικασία των ποντικών ευνοούν τη γενετική εκτροπή και θα μπορούσαν να δημιουργήσουν το περιπλεγμένο πρότυπο εξάπλωσης των απλοτύπων που παρατηρήθηκε. Φυσικά και η δημιουργία δήμων από λίγα, τυχαία άτομα ενός προϋπάρχοντος δήμου είναι δυνατόν να έχει ως αποτέλεσμα την επικράτηση διαφορετικών απλοτύπων στους γονικούς και θυγατρικούς δήμους. Η παρουσία προγονικών πολυμορφισμών στο mtdna των ατόμων του M. m. domesticus που αποίκησαν την Ευρώπη και τη Β. Αφρική μπορεί να είχε ως αποτέλεσμα την εγκαθίδρυση στον κυπριακό χώρο και την επικράτηση ατόμων με ποικιλία διαφορετικών απλοτύπων και τελικά την επικράτηση ατόμων με ποικιλία διαφορετικών απλοτύπων ακόμα και σε γεωγραφικά κοντινά πληθυσμούς. Η παρουσία πολυμορφισμών έχει διαπιστωθεί από τους Nachman et al., (1994), σύμφωνα με τα δεδομένα των οποίων οι απλότυποι των ατόμων της Ελλάδας, της Ιταλίας και της Ισπανίας ήταν πολυμορφικοί πριν την αποίκηση της Ευρώπης (Εικόνα 63). Αν και δεν είναι πιθανόν όλη η ποικιλότητα που παρατηρήθηκε στους πληθυσμούς της παρούσας μελέτης να οφείλεται σε προϋπάρχοντες πολυμορφισμούς, οι πολυμορφισμοί αυτοί σίγουρα διαμόρφωσαν σε κάποιο βαθμό το πρότυπο εξάπλωσης των απλοτύπων που αποκαλύφθηκε

131 Συζήτηση Εικόνα 63: Κλαδόγραμμα των φυλογενετικών σχέσεων των απλοτύπων του είδους Mus musculus domesticus από ευρωπαϊκές περιοχές εξάπλωσης. Η γκρι κάθετη στήλη αναπαριστά την είσοδο του είδους στην Ευρώπη. (Nachman et al., 1994)

132 Συζήτηση 4.3. ΜΟΡΦΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ανάλυση διάκρισης διαχωρίζει πλήρως τους τρεις πληθυσμούς (M. m. domesticus και M. cypriacus της Κύπρου και M. m. domesticus της Ελλάδας), καθώς η τιμή p που υπολογίστηκε κατά την ανάλυση διάκρισης με βάση τη ραχιαία κρανιακή επιφάνεια είναι στατιστικώς σημαντική (p<0,001) μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών. Τα άτομα που είχαν προσδιοριστεί ταξινομικά με μοριακή τεχνική, έλαβαν τιμή σωστής κατάταξης στους τρεις αυτούς πληθυσμούς, που ανέρχεται στο 97,6%. Μοναδικές εξαιρέσεις από την απόλυτα σωστή κατάταξη (100%) αποτελούν δύο άτομα τα οποία, σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της ραχιαίας επιφάνειας του κρανίου τους, κατατάσσονται σε διαφορετικό πληθυσμό. Το ένα άτομο ανήκει στα M. cypriacus της Αμμοχώστου (ZMUP/M 8114) και ενσωματώνεται στον πληθυσμό M. m. domesticus, και το δεύτερο άτομο ανήκει στα M. m. domesticus του Όρους Τροόδους (ZMUP/M 8104) και ενσωματώνεται στον πληθυσμό M. cypriacus. Αναφορικά με τα χαρακτηριστικά της κοιλιακής κρανιακής επιφάνειας και το σχήμα της κάτοψης του πρώτου άνω γομφίου (Μ 1 ), τα άτομα του κάθε πληθυσμού εμφανίζονται πολύ καλά ομαδοποιημένα και διακρίνονται πολύ ικανοποιητικά από τα άτομα των υπόλοιπων πληθυσμών (p<0,001). H σωστή κατάταξη των ατόμων στους πληθυσμούς που από πριν είχε οριστεί ότι ανήκουν ανέρχεται στο 100%. Παρατηρείται λοιπόν πλήρης διάκριση των πληθυσμών βάσει της κοιλιακής κρανιακής επιφάνειάς τους και του σχήματος της κάτοψης του πρώτου άνω γομφίου (Μ 1 ). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα συμπεράσματα που παραθέτουν οι Cucchi et al. (2006), οι οποίοι υποστηρίζουν τον πλήρη μορφομετρικό διαχωρισμό του είδους M. cypriacus από άλλα είδη του γένους Mus (Mus musculus domesticus, Mus macedonicus και Mus spretus), ενώ τα τελευταία δεν διαχωρίζονται πλήρως με βάση μορφομετρικές μεθόδους. Σύμφωνα με τους ίδιους ερευνητές, το M. cypriacus φαίνεται να διαχωρίζεται προς θετικότερες τιμές των αξόνων, σε αντίθεση με το M. m. domesticus, και η διαφοροποίηση αυτή πιθανώς εξηγείται από το μεγάλο μέγεθος του κρανίου του είδους M. cypriacus και τις διαφορές που παρουσιάζει με τα υπόλοιπα είδη ως προς το λεπιδοειδές οστό του κρανίου. Οι Macholán et al. (2008) επιβεβαιώνουν τα ευρήματα των Cucchi et al. (2006), θεωρώντας ως διαγνωστικό κριτήριο για τον προσδιορισμό του M. cypriacus το μεγάλο μέγεθος του κρανίου του. Το χαρακτηριστικό αυτό μπορεί να αποδοθεί στο φαινόμενο του γιγαντισμού (Cucchi

133 Συζήτηση et al., 2006 Macholán et al., 2008). Συνεπώς, το κρανίο του κυπριακού είδους χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερο μέγεθος σε σχέση με τα άλλα αγροδίαιτα είδη του γένους Mus. Επίσης, έχει γενικότερα πιο στιβαρή δομή, με ευρεία και γωνιώδη ζυγωματικά τόξα κυρίως στο οπίσθιο τμήμα του λεπιδοειδούς οστού. Η ζυγωματική πλάκα είναι πιο πλατιά και μετατοπισμένη προς το ρύγχος (Εικόνα 64). Αντίθετα, το σχήμα της κοιλιακής πλευράς του κρανίου σε μεγάλο βαθμό μοιάζει με αυτά των άλλων αγροδίαιτων πληθυσμών (Macholán et al., 2008). Εικόνα 64: Ραχιαία κρανιακή επιφάνεια του M. cypriacus (Α) και του Mus macedonicus (Β). Το κρανίο του M. cypriacus χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερο μέγεθος σε σχέση με τα άλλα αγροδίαιτα είδη του γένους Mus, όπως το Mus macedonicus. Γενικότερα έχει πιο στιβαρή δομή, με ευρεία και γωνιώδη ζυγωματικά τόξα κυρίως στο οπίσθιο τμήμα του λεπιδοειδούς οστού. Η ζυγωματική πλάκα είναι πιο πλατιά και μετατοπισμένη προς το ρύγχος (Macholán et al., 2008). Από την άλλη πλευρά τα αποτελέσματα του επανελέγχου σωστής κατάταξης (cross-validation) αποκαλύπτουν ότι τα ποσοστά σωστής κατάταξης μειώνονται σε κάποιες περιπτώσεις σε μεγάλο βαθμό. Αυτός ο επανέλεγχος είναι μια μέθοδος βασιζόμενη στην αναδειγματοληψία, που εκτιμά το λάθος και είναι προτιμητέα όταν μελετώνται μικρά δείγματα, όπως στην προκείμενη περίπτωση. Με βάση τη συγκεκριμένη ανάλυση για τη ραχιαία επιφάνεια των κρανίων, ένα άτομο του είδους M. m. domesticus από το Τρόοδος (ZMUP/M 8104) ομαδοποιείται με τα άτομα του είδους M. cypriacus, τα οποία στην πλειονότητά τους ανήκουν στον πληθυσμό τους Όρους Τροόδους. Επίσης δύο άτομα M. m. domesticus της Αμμοχώστου (ZMUP/M 8041 και 8057) ομαδοποιούνται με τα M. cypriacus. Παράλληλα, από τον πληθυσμό των M. cypriacus, δύο άτομα κατατάσσονται στον πληθυσμό των M. m. domesticus (ZMUP/M 8114 από την Αμμόχωστο και ZMUP/M 8100 από το Όρος Τρόοδος). Αντίστοιχα, με βάση τους μελετηθέντες μορφομετρικούς χαρακτήρες της κοιλιακής επιφάνειας των κρανίων, τρία άτομα M. m. domesticus από την Αμμόχωστο (ZMUP/M 8049, 8105 και 8113) ομαδοποιούνται με τα άτομα M. cypriacus και από τον πληθυσμό των M. cypriacus δύο άτομα (ZMUP/M 8114 από την Αμμόχωστο και ZMUP/M 8100 από το Όρος Τρόοδος) κατατάσσονται στον πληθυσμό των M. m. domesticus. Όσον αφορά στην ανάλυση διάκρισης με βάση τον οδοντικό χαρακτήρα,