ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Βιοχηµικοί δείκτες που επάγονται από το κλάδεµα (αναγέννηση) στην ελιά (Olea europaea L.)

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Βιοχηµικοί δείκτες που επάγονται από το κλάδεµα (αναγέννηση) στην ελιά (Olea europaea L.) 108

2 4. Βιοχηµικοί δείκτες που επάγονται από το κλάδεµα (αναγέννηση) στην ελιά (Olea europaea L) 4.1. Περίληψη Η ελιά (Olea europaea L. cv Χονδρολιά Χαλκιδικής) δοκιµάστηκε ως πρότυπο φυτό για τη µελέτη των αλλαγών φάσης σε ελαιώνες. Μελετήθηκε η επίδραση του κλαδέµατος [σε ύψος 5εκ ως µέσο αναγέννησης (5cm)] και µηκλαδέµατος [φυτά µε κεντρική κορυφή ή ένα βλαστό (SSP)] σε διάφορες βιοχηµικές παραµέτρους. Εκτιµήθηκαν τα επίπεδα υπεροξειδάσης, οι συνολικές πρωτεΐνες, η ειδική δραστηριότητα της υπεροξειδάσης (SA), η θερµική σταθερότητα, ο ρυθµός φωτοσύνθεσης, η συνολική χλωροφύλλη και το συνολικό περιεχόµενο σε φαινολικές ουσίες. Η συνολική δραστηριότητα της υπεροξειδάσης (µονάδες / g.νβ) όπως επίσης και η ειδική δραστηριότητα (µονάδες / µg πρωτεΐνης) ήταν σηµαντικά υψηλότερες στα φύλλα των κλαδεµένων φυτών σε σχέση µε τα SSP. Αντίθετα, υψηλότερες τιµές σε συνολικό περιεχόµενο πρωτεϊνών εντοπίστηκαν στα SSP φυτά. Ακόµη παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση µεταξύ του συνολικού περιεχοµένου πρωτεϊνών και του ρυθµού φωτοσύνθεσης. H υπεροξειδάση της ελιάς εµφάνισε µια αξιοσηµείωτη δραστηριότητα σε σχετικά υψηλή θερµοκρασία (40 o C) και σε σταθερό χρόνο επώασης µέχρι είκοσι λεπτά. εν παρατηρήθηκε καµία διαφορά όσον αφορά το συνολικό περιεχόµενο χλωροφύλλης µεταξύ των δύο µεταχειρίσεων. Τα φύλλα των SSP φυτών είχαν περισσότερες φαινολικές ουσίες σε σχέση µε τα κλαδεµένα, ενώ και στις δυο µεταχειρίσεις παρατηρήθηκε αρχικά µια µείωση στις φαινολικές ουσίες µε την έναρξη της περιόδου ανάπτυξης η οποία ακολουθήθηκε από ελαφρά αύξηση που έφτανε στο µέγιστο στο τέλος της περιόδου ανάπτυξης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση µεταξύ της συνολικής δραστηριότητας υπεροξειδάσης και του συνολικού περιεχοµένου σε φαινολικές ουσίες. Η δράση της υπεροξειδάσης όπως επίσης και η συνολική συγκέντρωση φαινολών µπορεί να χρησιµοποιηθούν ως δείκτες για την αναγνώριση των δυο φάσεων της νεανικότητας. 109

3 4.1. Abstract Olive (Olea europaea L. cv Chondrolia Chalkidiki) has been used as a plant model to study the phase changes phenomena. The effect of pruning [at 5cm height as a mean of rejuvenation, (5cm)] and non-pruning [plants with central leader or single stem, (SSP)] on different biochemical parameters was studied. 5cm pruning was considered as early phase of juvenility. Peroxidase, total proteins, peroxidase specific activity (SA), thermal stability, photosynthetic rate, total chlorophyll, and total phenolics content were estimated. Total peroxidase activity (units/g.fw) as well as specific activity (units/µg protien) was significantly higher in the leaves of 5cm rather than in SSP plants. Conversely, higher values of total protein content were exhibited in SSP leaves. Positive correlation between the total protein content and photosynthetic rates was also observed. Olive tree showed a remarkable activation of peroxidase at relatively high temperature (40 o C) and for a constant time of incubation up to 20 minutes. No differences in terms of total chlorophyll content between the two treatments were noticed. Reverse relationship between total chlorophyll and total phenolic contents was observed. Leaves of SSP exhibited significantly higher content of phenols than those of 5cm plants. Both treatments started with low phenolic content and then, increased through the growing season registering the maximum contents on October. Negative relationship between total peroxidase activity and total phenolics content was also observed. Peroxidase activity as well as total phenolic content may use as a convenient markers to identify the two phases of juvenility. 110

4 4.2. Εισαγωγή Η ελιά (Olea europaea L.) θεωρείται η πιο σηµαντική καλλιέργεια στις µεσογειακές χώρες, γιαυτό έχει επιλεχθεί ως πρότυπο σύστηµα για τη µελέτη των αλλαγών φάσης νεανικότητας-ωριµότητας στα δένδρα σε βιοχηµικό επίπεδο. Η µετάβαση από τη φάση νεανικότητας στην αναπαραγωγική συνήθως συµβαίνει βαθµιαία (Lawson & Poethig, 1995) και το φυτό περνά από διαφορετικά στάδια: µια αρχική φάση νεανικότητας που ακολουθείται από µια πιο προχωρηµένη και τελικά ακολουθεί η φάση ωριµότητας (αναπαραγωγική). Η διάρκεια της φάσης νεανικότητας στα δένδρα είναι γνωστό ότι κρατάει από λίγα έως πολλά χρόνια (Hackett, 1985; Poethig, 1990). Στην ελιά, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες διαρκεί µέχρι 15 χρόνια (Lavee κ.α., 1996). Προκειµένου να µελετηθούν οι µηχανισµοί που εµπλέκονται σε αυτή τη φάση όπως επίσης και οι αλλαγές που συµβαίνουν, συστήνεται η ανανέωση των δένδρων κατά την οποία οι ιστοί που βρίσκονται στη φάση ωριµότητας µπορούν να επιστρέψουν στη νεανικότητα. Γενικά, η οντογενετική ανάπτυξη των φυτών εκφράζεται ως µια πολύπλοκη εξέλιξη των βιοχηµικών και µορφολογικών χαρακτηριστικών (Salaj & Schornagel, 2001). Μορφολογικές όπως επίσης και φυσιολογικές αλλαγές έχουν περιγραφεί για διάφορα είδη (Hackett & Murray, 1993; Meilan, 1997). Ωστόσο µελέτες σε βιοχηµικό επίπεδο ιδιαίτερα στην ελιά είναι σπάνιες (Tazzari κ.α., 1995). Πολλές µελέτες έχουν κατευθυνθεί προς την αναγνώριση βιοχηµικών δεικτών, οι οποίοι θα µπορούσαν να ανιχνεύουν αλλαγές σε µοριακό επίπεδο πριν την εµφάνιση µορφολογικών αλλαγών (Racchi κ.α., 1996). Μια από τις πιο σηµαντικές αλλαγές είναι η παραγωγή αντιοξειδωτικών ενζύµων όπως η υπεροξειδάση, καταλάση, υπεροξειδική δισµουτάση και άλλων αντιοξειδωτικών ουσιών χαµηλού µοριακού βάρους συµπεριλαµβανοµένων των φαινολικών ενώσεων. Αυτές οι αντιοξειδωτικές ενώσεις πιστεύεται ότι έχουν διάφορες λειτουργίες µέσα στα φυτικά κύτταρα (Hand, 1996). Οι υπεροξειδάσες είναι ευρέως διαδεδοµένες στο φυτικό βασίλειο. Μέχρι σήµερα η κύρια πηγή εµπορικά διαθέσιµης υπεροξειδάσης είναι οι ρίζες του horseradish (Armoracia resticana) (Sakharov κ.α., 2001). Ένας αριθµός µελετών είχαν ως αντικείµενο την έκφραση και δραστηριότητα αυτού του ενζύµου, το οποίο αναγνωρίζεται ως ένα από τα σηµαντικότερα ένζυµα που σχετίζονται µε τον έλεγχο της διαφοροποίησης και ανάπτυξης του φυτού (Hand, 1994; Sakharov κ.α., 2001). 111

5 Είναι γνωστό ότι αυτό το ένζυµο εµπλέκεται στο σχηµατισµό και σκλήρυνση των κυτταρικών τοιχωµάτων συµβάλλοντας στο σχηµατισµό λιγνίνης και συνδέσεων µεταξύ των πρωτεϊνών του κυτταρικού τοιχώµατος, στην οξείδωση των φαινολικών ουσιών, στο µεταβολισµό του H 2 O 2, στον καταβολισµό της αυξίνης, στην προστασία των ιστών από φθορά και µόλυνση από παθογόνους µικροοργανισµούς ή προσβολή από έντοµα, τραυµατισµό (Gasper κ.α., 1982; Farrell κ.α., 1989; Dunford, 1991; Gulen και Eris, 2004). Ωστόσο, η διαθεσιµότητα υπεροξειδασών σε ξυλώδη φυτά µε υψηλότερη θερµοσταθερότητα µπορεί να ενισχύσουν τον εγκλιµατισµό τους. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των φαινολικών ενώσεων, ως φυσικά αντιοξειδωτικά, έχει µελετηθεί για πολλά φυτά. Τα φυτά συνθέτουν φαινολικές ενώσεις ως ένα µηχανισµό άµυνας εναντίον µικροοργανισµών και ισχυρής UV ακτινοβολίας (Karabourniotis κ.α., 1992; Skaltsa κ.α., 1994; Robards και Antolovich, 1997). Πολλές από τις φαινολικές ενώσεις, όπως η συµπυκνωµένη τανίνη, ανιχνεύθηκαν σε ιστούς σταδίου ωριµότητας αλλά όχι νεανικότητας (Fernandez- Lorenzo κ.α., 1999). Στην ελιά, οι πολυφαινόλες εντοπίζονται στα κυτταρικά τοιχώµατα των τριχών στα φύλλα (Karabourniotis και Fasseas, 1996). Αρχικά συντίθενται στο κυτόπλασµα και κατόπιν µεταφέρονται στο κυτταρικό τοίχωµα κατά τη διάρκεια του µικρού διαστήµατος όπου συµβαίνει η τελική ανάπτυξη των τριχών (Karabourniotis κ.α., 1998). Γενικά, η κατανόηση της βάσης των διαφορετικών φάσεων σε διάφορα επίπεδα συµπεριλαµβανοµένου του βιοχηµικού θα µπορούσε να θεωρηθεί χρήσιµη για την ανάπτυξη στρατηγικών έρευνας που θα σκοπεύουν στον περιορισµό ή αποφυγή της περιόδου νεανικότητας. Ο κύριος σκοπός αυτής της µελέτης ήταν η ανίχνευση των αλλαγών σε µοριακό επίπεδο που επάγονται από αυστηρό κλάδεµα (αναγέννηση) στην ελιά (Olea europaea L.). 112

6 4.3. Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό Μοσχεύµατα µήκους εκ µε τέσσερα φύλλα στο άκρο τους αποκόπηκαν από παραφυάδες θάµνων ελιάς (Olea europaea L. var. Χονδρολιά Χαλκιδικής), οι οποίοι αναπτύσσονταν στο Αγρόκτηµα του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Τα µοσχεύµατα εµβαπτίστηκαν σε διάλυµα µυκητοκτόνου (Benlate 3%) για 10 λεπτά. Αφού στέγνωσαν, η βάση τους ανανεώθηκε και κατόπιν έγινε εµβάπτιση για 5 δευτερόλεπτα σε διάλυµα 50:50 (νερό και αιθυλικής αλκοόλης) που περιείχε 3- Ίνδολυλο-Βουτυρικό οξύ (IBA) (4000 ppm). Στη συνέχεια τα µοσχεύµατα φυτεύτηκαν σε κασσάκια ριζοβόλησης ( cm) όπου υπήρχε τύρφη και περλίτης ως υπόστρωµα (1:1 v). ιατηρήθηκαν σε υδρονέφωση για µια περίοδο έξι εβδοµάδων. Το έρριζα µοσχεύµατα φυτεύτηκαν σε µαύρες πλαστικές σακούλες (2 λίτρων) και µεταφέρθηκαν για εγκλιµατισµό στο θερµοκήπιο καθ όλη τη διάρκεια της περιόδου ανάπτυξης. Στο τέλος της περιόδου ανάπτυξης, τα φυτά µεταφυτεύθηκαν σε µεγάλες γλάστρες χωρητικότητας 9 λίτρων. Όταν έφτασαν σε ύψος ενός µέτρου εφαρµόστηκαν δυο µεταχειρίσεις: α) κλάδευµα [σε ύψος 5εκ από τη βάση ως µέσο αναγέννησης] και β) µη-κλάδευµα [φυτά µε κεντρικό βλαστό ή µε ένα βλαστό (SSP)]. Οι µεταχειρίσεις αυτές θεωρήθηκαν ως πρώιµη και µετέπειτα φάση στο στάδιο της νεανικότητας. Κατά τη διάρκεια του χειµώνα που τα φυτά διατηρούνταν στις συνθήκες θερµοκηπίου ( C), τα κλαδιά αναπτυσσόταν ελεύθερα χωρίς κλάδεµα. Στη συνέχεια, µεταφέρθηκαν και κατανεµήθηκαν στον αγρό σε ένα πλήρως τυχαιοποιηµένο σχέδιο τετραγώνου (20 φυτά / µεταχείριση τεσσάρων επαναλήψεων) ειγµατοληψία Για όλες τις µετρήσεις χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα πλήρως αναπτυγµένων φύλλων τα οποία πάρθηκαν από το µέσο νεαρών βλαστών (5-6 µηνών) Μετρήσεις φωτοσύνθεσης έκα φύλλα από κάθε µεταχείριση χρησιµοποιούνταν για τη µέτρηση του ρυθµού φωτοσύνθεσης (Pn) κατά τη διάρκεια της εποχής ανάπτυξης χρησιµοποιώντας µια 113

7 φορητή συσκευή IRGA (Li-Cor 6400). Οι µετρήσεις διεξάγονταν µηνιαία. Τα αποτελέσµατα εκφραζόταν ως µmol CO 2 m -2 s Περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη και φαινολικές ουσίες στα φύλλα Η συνολική χλωροφύλλη και η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικές ουσίες µετρούνταν µηνιαίως κατά τη διάρκεια της περιόδου ανάπτυξης (Ιούλιο-Οκτώβρη). 0.5 γρ. φρέσκου ιστού από 12 φύλλα (3 φύλλα ανά πειραµατικό τεµάχιο * τέσσερις επαναλήψεις) κόπηκε σε µικρά κοµµάτια µε τη βοήθεια ενός ψαλιδιού. Η εκχύλιση της χλωροφύλλης έγινε χρησιµοποιώντας 80% παγωµένη ακετόνη για 48 h. Προκειµένου να επιταχυνθεί η εκχύλιση χλωροφύλλης, οι σωλήνες τοποθετήθηκαν σε λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά, αφέθηκαν για 10 ώρες και κατόπιν το υπερκείµενο (διάλυµα ακετόνης-χλωροφύλλης) µεταφέρθηκε σε ογκοµετρική φιάλη των 50 ml. Οι ιστοί ξεπλύθηκαν (5 φορές) µε 10 ml 80% ακετόνη/νερό έως ότου να µην µπορεί να εκχειλιστεί άλλη χρωστική. Το εκχύλισµα συµπληρώθηκε µε ακετόνη µέχρι τελικού όγκου 50 ml. Το συνολικό περιεχόµενο χλωροφύλλης καθορίστηκε µε φασµατοφωτοµετρία στα 645 και 663 nm σύµφωνα µε τον Arnon (1949). Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως µg χλωρ. / g. ΝΒ σύµφωνα µε την εξίσωση C (µg χλωρ. / g. ΜΒ) = 20,2 A 645nm + 8,02 A 663nm Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικές ουσίες εκτιµήθηκε µε χρωµατοµετρία χρησιµοποιώντας το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu σύµφωνα µε τη µέθοδο που περιγράφεται από τους Ketsa και Atantee (1998). Από κάθε δείγµα, χρησιµοποιήθηκαν 0.25 ml του τελικού διαλύµατος (διάλυµα ακετόνηςχλωροφύλλης) στα οποία προστέθηκαν 0.25 ml αιθανόλης 95% και ακολούθησε ανάδευση. Σε αυτό το µείγµα προστέθηκε µια ποσότητα 2.50 ml του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (αραιωµένο 10 φορές σε απεσταγµένο νερό) και αναδεύτηκε ξανά. Μετά από 1-8 λεπτά, προστέθηκαν 2 ml Na 2 CO 3 και ακολούθησε πάλι ανάδευση. Τελικά, τα δείγµατα επωάστηκαν για 5 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 50 o C και έπειτα αφέθηκαν να κρυώσουν για 10 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των δειγµάτων στους 5 o C, σε g για 10 λεπτά. Η απορρόφηση καταγράφηκε αµέσως στα 760 nm. Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως mg ισοδυνάµου γαλλικού οξέος ανά g. ΝΒ. 114

8 Περιεκτικότητα πρωτεϊνών και µετρήσεις ενζύµων -Πρωτόκολλο εκχύλισης: Η εκχύλιση συνολικής πρωτεΐνης έγινε µε τροποποίηση της µεθόδου που περιγράφεται από τον Edriva A, (προσωπική επικοινωνία) ώστε να είναι κατάλληλη για τα φύλλα ελιάς. Τα φύλλα συλλέχθηκαν, ζυγίστηκαν (1.0 g) και αµέσως οµογενοποιήθηκαν µε ιγδίο πορσελάνης σε 4 ml διαλύµατος εκχύλισης (0.2 M φωσφορικό κάλιο, 2 mm EDTA, 0.5 M σακχαρόζη, 25 mm ασκορβικό νάτριο, 1 M χλωριούχο νάτριο, ph 7,8) παρουσία µείγµατος Dowex 1 8 ( mesh) και PVP. Το µείγµα προετοιµάστηκε 24 h πριν τη χρήση. 0.2 g σκόνης Dowex και 0.3 g PVP τοποθετήθηκαν σε γυάλινο δοχείο Becher και ξεπλύθηκαν τρεις φορές µε νερό βρύσης (το µείγµα κατακάθισε ως ίζηµα και το νερό αποµακρύνθηκε), κατόπιν το ίζηµα διαλυτοποιήθηκε σε 5 ml διαλύµατος εκχύλισης και παρέµεινε όλο το βράδυ στους 5 o C. Την επόµενη µέρα το διάλυµα αποµακρύνθηκε και το υγρό µείγµα µεταφέρθηκε στο φυτικό υλικό στο ιγδίο. Έπειτα, προστέθηκαν 6 mg/ml πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG 3000). Το εκχύλισµα φυγοκεντρήθηκε στους 2 o C για 30 λεπτά στις g. Το καθαρό υπερκείµενο µεταφέρθηκε σε δοκιµαστικούς σωλήνες και το υπόλειµµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml διαλύµατος εκχύλισης, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε και συλλέχθηκε το υπερκείµενο. Τελικά, ο συνολικός όγκος του υπερκειµένου συµπληρώθηκε µε διάλυµα εκχύλισης έως τα 4.5 ml. Αυτό το µη επεξεργασµένο εκχύλισµα χρησιµοποιήθηκε για τον καθορισµό της συνολικής πρωτεΐνης και της δραστηριότητας υπεροξειδάσης. -Συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης: Η συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης εκτιµήθηκε µε φασµατοφωτοµετρία στα 595 nm σύµφωνα µε τη µέθοδο του Bradford (1976), όπως τροποποιήθηκε από τον Peterson (1983). Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως mg πρωτεΐνης ανά γρ. νωπού βάρους. Η πρότυπη καµπύλη έγινε χρησιµοποιώντας ορό αλβουµίνης βοδιού (BSA). - οκιµή υπεροξειδάσης: Η δραστηριότητα υπεροξειδάσης εκτιµήθηκε µε φασµατοφωτοµετρία σύµφωνα µε τη µέθοδο των Ngo και Lenhoff (1980) χρησιµοποιώντας 100 mm διαλύµατος φωσφορικού νατρίου (ph=6.5), που περιείχε 2 mm 3-Methyl-2-Benzothiolinonhydrazon Hydrochloride Hydrate (MBTH), 1 mm 3- διµέθυλοάµινο βενζοϊκό οξύ (DMAB) και 0.3 mm H 2 O 2. Η αντίδραση άρχισε προσθέτοντας 30 µl ακατέργαστου εκχυλίσµατος. Η απορρόφηση µετρήθηκε στα 595 nm. Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως µονάδες ενζύµου (U). Η εξειδικευµένη 115

9 δραστηριότητα εκφράστηκε ως µονάδες ανά µg πρωτεΐνης. Μια µονάδα ενζύµου ορίστηκε ως 1 αλλαγή οπτικής πυκνότητας ανά λεπτό. -Θερµική σταθερότητα της υπεροξειδάσης: Η εκτίµηση της θερµικής σταθερότητας της υπεροξειδάσης στην ελιά έλαβε χώρα ακολουθώντας τη µέθοδο των (Gazaryan και Lagrimini, 1996). 20 µl ακατέργαστου εκχυλίσµατος προστέθηκαν σε 980 µl διαλύµατος εκχύλισης και το µείγµα επωάστηκε στους 40 o C. Σε διαφορετικούς χρόνους (0-60 λεπτά.), η δραστηριότητα της υπεροξειδάσης µετρήθηκε όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Σε ένα άλλο πείραµα, τα διαλύµατα του ενζύµου (20 µl ακατέργαστο εκχύλισµα και 980 µl διάλυµα εκχύλισης) επωάστηκαν για 10 λεπτά σε διαφορετικές θερµοκρασίες (20-90 o C) και έπειτα µετρήθηκε η δραστηριότητά του. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε µε επώαση για 10 και 20 λεπτά σε διαφορετικές θερµοκρασίες επώασης Ανάλυση δεδοµένων Χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS (SPSS for windows, standard version, release 8) για τον προσδιορισµό των στατιστικώς σηµαντικών διαφορών µεταξύ των µεταχειρίσεων (ανάλυση παραλλακτικότητας και t-test). 116

10 4.4. Αποτελέσµατα Τα φύλλα των SSP φυτών εµφάνισαν σηµαντικά υψηλότερες τιµές ρυθµού φωτοσύνθεσης σε σχέση µε τα κλαδεµένα φυτά κατά τη διάρκεια της περιόδου ανάπτυξης (Σχ. 1). Και οι δυο µεταχειρίσεις έδειξαν µια βαθµιαία µείωση της συνολικής χλωροφύλλης κατά τη διάρκεια της περιόδου ανάπτυξης (Σχ. 2). Ωστόσο, υψηλότερη περιεκτικότητα χλωροφύλλης, αν και όχι στατιστικώς σηµαντική, φάνηκε στα φύλλα των SSP φυτών σε σχέση µε τα κλαδεµένα. Τα φύλλα των SSP φυτών εµφάνισαν επίσης σηµαντικά υψηλότερη περιεκτικότητα φαινολικών ουσιών απ ότι αυτά που κλαδεύτηκαν στα 5εκ. Και οι δυο µεταχειρίσεις ξεκίνησαν µε χαµηλή περιεκτικότητα φαινολικών ουσιών η οποία αυξήθηκε κατά την περίοδο ανάπτυξης και έφτασε το µέγιστο τον Οκτώβρη (Σχ. 3). Παρόµοια αποτελέσµατα προέκυψαν όταν χρησιµοποιήθηκε αιθανόλη 95% ως µέσο εκχύλισης (Σχ. 3). Ακόµη παρατηρήθηκε αντίστροφη συσχέτιση µεταξύ των ολικών φαινολικών ουσιών και της ολικής χλωροφύλλης (Σχ. 4). Η συνολική δραστηριότητα της υπεροξειδάσης αυξήθηκε σηµαντικά στα φύλλα των κλαδεµένων φυτών κατά µονάδες / g. ΝΒ σε σύγκριση µε αυτή των SSP φυτών (Πίνακας 1). Επιπλέον, η ειδική δραστηριότητα υπεροξειδάσης των φύλλων των κλαδεµένων φυτών αυξήθηκε (2.36 µονάδες / µg πρωτεΐνης) σε σχέση µε τα φύλλα των SSP (1.43 µονάδες / µg πρωτεΐνης). Ωστόσο, η συνολική πρωτεΐνη των φύλλων των SSP φυτών ( µg πρωτεΐνης / g. ΝΒ) ήταν υψηλότερη σε σχέση µε τα κλαδεµένα ( µg πρωτεΐνης / g. ΝΒ). Σε σχετικά υψηλή θερµοκρασία 40 o C και για σταθερό χρόνο επώασης παρουσιάστηκε αξιοσηµείωτη δραστηριότητα της υπεροξειδάσης της ελιάς µε είκοσι λεπτά επώασης (Σχ. 5). Ακόµη, διατηρήθηκε υψηλή δράση της για διάφορους χρόνους επώασης µε µέγιστη δραστηριότητα στους 50 o C (Σχ. 6). Επιπλέον παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση µεταξύ των συνολικών φαινολικών ουσιών και της δραστηριότητας της υπεροξειδάσης στα φύλλα των κλαδεµένων και SSP φυτών (Πίνακας 1, Σχ. 7). 117

11 4.4. (Πίνακας 1). ράση υπεροξειδάσης, συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και φαινολικές ουσίες στα φύλλα των µη-κλαδεµένων (SSP) και κλαδεµένων στα 5εκ (5cm) ελαιοδέντρων. (n=9; ± SE, τυπικό σφάλµα; στατιστικώς σηµαντικές διαφορές σε P<0,05). Παράµετροι 5εκ SSP Συνολική δραστηριότητα υπεροξειδάσης (µονάδες / g. ΜΒ) 8.457± ±0.02 a Συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης (µg πρωτεΐνης / g. ΜΒ) ± ±2.62 a Εξειδικευµένη δραστηριότητα υπεροξειδάσης (µονάδες / g. ΜΒ) 2.36± ±0.04 a Συνολική περιεκτικότητα φαινολικών ουσιών mg γαλλικού οξέος / g. ΜΒ 2.28± ±0.02 a 5cm SSP Photosynthetic rate (µmol CO2 m -2 s -1 ) July August September October 4.5. (Σχ. 1). Εποχικές αλλαγές του ρυθµού φωτοσύνθεσης (µmol CO 2 m -2 s -1 ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ). 118

12 5cm SSP mg.chl. / g.fw July August September October 4.5. (Σχ. 2). Εποχικές αλλαγές της συνολικής περιεκτικότητας χλωροφύλλης (mg. χλωρ. / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ). 4 Acetone 5cm Acetone SSP Ethanol 5cm Ethanol SSP mg. Gallic acid / g.fw July August September October 4.5. (Σχ. 3). Εποχικές αλλαγές της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικές ουσίες (mg ισοδύναµα Γαλλικού οξέος / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ). 119

13 mg. Gallic acid/g.fw 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Phenol 5cm Phenol SSP Chl. 5cm Chl. SSP July August September October mg Chl./g.FW 4.5. (Σχ. 4). Συσχέτιση µεταξύ ολικής χλωροφύλλης (mg χλωρ. / g. ΜΒ) και ολικών φαινολικών ουσιών (mg ισοδύναµα Γαλλικού οξέος / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ) Units / g.fw Time course (minutes) 4.5. (Σχ. 5). ραστηριότητα της αναγωγάσης (µονάδες / g. ΜΒ) σε σχέση µε το χρόνο επώασης σε σταθερή θερµοκρασία 40 o C. 120

14 5 min 10 min 20 min Units / g.fw Temperature 4.5. (Σχ. 6). Υπολειµµατική δραστηριότητα υπεροξειδάσης (µονάδες / g. ΜΒ) σε σχέση µε τους διαφορετικούς χρόνους επώασης (5, 10 και 20 λεπτά). Total phenolic Total peroxidase 9,0 9,0 8,0 8,0 mg. Gallic acid / g.fw 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 units / g.fw 1,0 1,0 0,0 5cm SSP 0, (Σχ. 7). Η συσχέτιση µεταξύ της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικές ουσίες (mg. Γαλλικού οξέος / g. ΜΒ) και της συνολικής δραστηριότητας υπεροξειδάσης (µονάδες / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ). 121

15 4.5. Συζήτηση Οι υψηλότερες τιµές ρυθµού φωτοσύνθεσης που εµφάνισαν τα SSP φυτά σε σχέση µε τα κλαδεµένα στα 5εκ θα µπορούσε να αποδοθεί είτε σε αυξηµένη στοµατική αγωγιµότητα και / ή σε µη-στοµατικούς παράγοντες (Cornic & Massacci, 1996). Η στοµατική αγωγιµότητα έχει ήδη αναπτυχθεί στο κεφάλαιο 4. Ωστόσο, αυτό το κεφάλαιο σχετίζεται µε τους µη-στοµατικούς περιορισµούς. Η αυξηµένη συγκέντρωση συνολικών πρωτεϊνών στα φύλλα των SSP φυτών θα µπορούσε να δικαιολογήσει το σηµαντικά υψηλότερο ρυθµό φωτοσύνθεσης που αυτά εµφανίζουν σε σύγκριση µε τα κλαδεµένα φυτά. Η καρβοξυλάση της Rubisco αντιπροσωπεύει το 60% των συνολικών πρωτεϊνών στα C 3 φυτά (Ku κ.α., 1979),στα οποία συγκαταλέγεται και η ελιά. Εποµένως, η υψηλότερη περιεκτικότητα και δραστηριότητα της Rubisco θα µπορούσε να οδηγήσει σε πιο αποτελεσµατική φωτοσύνθεση (Beer κ.α., 1991). Επιπλέον, η υψηλότερη περιεκτικότητα χλωροφύλλης που παρατηρήθηκε στα φύλλα των SSP φυτών µπορεί να στηρίζεται σε ένα πιο αποτελεσµατικό σύστηµα φωτοσύνθεσης (Nielson & Sand-Jensen, 1989; Nielson, 1993; Kofidis κ.α., 2003). Η σταδιακή µείωση στη συνολική περιεκτικότητα χλωροφύλλης κατά την περίοδο ανάπτυξης και στις δυο µεταχειρίσεις φαίνεται να σχετίζεται στενά µε τη µεγαλύτερη συσσώρευση φαινολικών ουσιών αυτή την περίοδο, η οποία τελικά καταλαµβάνει υψηλότερη αναλογία των κυττάρων του φύλλου (Patakas κ.α., 2003). Πράγµατι, οι φαινολικές ουσίες θεωρήθηκε ότι είναι τα τελικά προϊόντα στη διαδροµή µεταβολισµού του φυτού, που είναι υπεύθυνα για τη µη-καταστροφική απώλεια της πλεονάζουσας ενέργειας στους φωτοσυνθετικούς ιστούς, που εκτίθενται σε υψηλή ένταση φωτός αλλά δεν µπορούν να συνεχίσουν τη φωτοσύνθεση για άλλες αιτίες (Christodoulakis, 1989). Αυτή η αύξηση του συνολικού περιεχοµένου φαινολικών ουσιών στα φύλλα που συνοδεύεται από µεγάλη µείωση στην περιεκτικότητα χλωροφύλλης κατά την περίοδο αύξησης και ιδιαίτερα τον Οκτώβρη θα µπορούσε να αποδοθεί στη χαµηλή θερµοκρασία, τη µικρή φωτοπερίοδο και τη µικρή ένταση φωτός. Όσον αφορά τη δραστηριότητα της υπεροξειδάσης, τα αποτελέσµατα έδειξαν υψηλότερη δραστηριότητα (µονάδες / g. ΜΒ) όπως επίσης και υψηλότερη ειδική δράση της υπεροξειδάσης (µονάδες / µg πρωτεΐνης) στα φύλλα κλαδεµένων φυτών (πρώιµη φάση νεανικότητας, φυτά 5εκ) απ ότι στα SSP φυτά. Αυτή η παρατήρηση 122

16 συµφωνεί µε τους Gasper κ.α., (1982) και Chaitanya κ.α., (2002), που βρήκαν ότι το αυστηρό κλάδεµα, που θεωρείται ως καταπόνηση, (5εκ-κλάδεµα) ενισχύει τη δραστηριότητα της υπεροξειδάσης ως αντιοξειδωτικός µηχανισµός περιορίζοντας τη δέσµευση του CO 2 κατά τη φωτοσύνθεση (Lawlor, 1995). Αυξηµένη δραστηριότητα υπεροξειδάσης βρέθηκε σε σπορόφυτα Sequoia sempervirens από την Verschoore-Martouzet (1985). Ωστόσο, αντίθετα αποτελέσµατα σηµειώθηκαν από τον Barnal και τους συνεργάτες του (1993) που ασχολήθηκαν µε άλλο είδος (Capsicum annuum). Αυτό το θέµα της δραστηριότητας της υπεροξειδάσης της ελιάς σε σπορόφυτα και κλαδεµένα-ανανεωµένα φυτά χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Η εµφανιζόµενη υψηλή δραστηριότητα της υπεροξειδάσης της ελιάς σε σχετικά υψηλή θερµοκρασία (40οC) και σε σταθερό χρόνο µέχρι είκοσι λεπτά µπορεί να οφείλεται στις δοµικές αλλαγές των µορίων του ενζύµου, οι οποίες εξαρτώνται από τη θερµοκρασία. Παρόλο αυτά, βασιζόµενοι στη εµπλοκή της υπεροξειδάσης στη βιοσύνθεση της λιγνίνης [η υπεροξειδάση είναι γνωστό ότι εµπλέκεται στον σχηµατισµό και τη σκλήρυνση των κυτταρικών τοιχωµάτων συµβάλλοντας στο σχηµατισµό λιγνίνης και συνδέσµων µεταξύ των πρωτεϊνών του κυτταρικού τοιχώµατος (Farrell κ.α., 1989; Dunford, 1991)]. Για το λόγο αυτό, η ύπαρξη υπεροξειδάσης στην ελιά εξηγεί την επιβίωσή της (εγκλιµατισµός) σε ξηρά κλίµατα και θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως δείκτης για την επιλογή γενοτύπου που θα επιβίωνε σ αυτές τις συνθήκες. Παρόµοια αποτελέσµατα καταγράφηκαν στην δαµασκηνιά από τον Sakharove και τους συνεργάτες του (2001). Πράγµατι, υπάρχουν διάφοροι µηχανισµοί που έχουν σχέση µε την προσαρµογή των φυτών σε υψηλές θερµοκρασίες, λόγω της επαγωγής της πρωτεϊνοσύνθεσης ή άλλων σχετικών πρωτεϊνικών λειτουργιών (Teeri, 1980), που προκαλούν αλλαγές στο µεταβολισµό του φυτού όπως η διάσπαση των λιπών ή η διατάραξη της συνέχειας των µεµβρανών (Levitt, 1980). Τα φυτά που δεν προσαρµόζονται δεν µπορούν να διεξάγουν δοµικές ή λειτουργικές αλλαγές στις πρωτεΐνες (Gulen και Eris, 2004). Η σταθερότητα της κυτταρικής µεµβράνης έχει χρησιµοποιηθεί ευρέως για τη διαφοροποίηση ευπαθών ποικιλιών από αυτές που αντέχουν σε συνθήκες καταπόνησης. 123

17 Η χαµηλότερη δραστηριότητα της υπεροξειδάσης που παρατηρήθηκε στο τέλος της περιόδου ανάπτυξης µπορεί να ερµηνευτεί από την υψηλότερη περιεκτικότητα φαινολικών ουσιών που εντοπίζεται και στις δυο µεταχειρίσεις. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται επίσης από τον Gaspar και τους συνεργάτες του (1991) και τον Dunford (1991), που υποστήριξε ότι, η υπεροξειδάση καταλύει την οξείδωση υποστρωµάτων, που είναι δότες ηλεκτρονίων, από το υπεροξείδιο του υδρογόνου και οδηγεί στη συσσώρευση αυτών των ενώσεων. Επιπλέον, και οι δυο µεταχειρίσεις παρουσίασαν κάτω από τις πειραµατικές µας συνθήκες πολύ χαµηλές δραστηριότητες καταλάσης και υπεροξειδικής δισµουτάσης Συµπεράσµατα Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το κλάδεµα των φυτών στα 5 εκ. χαρακτηρίζεται από υψηλότερη δραστηριότητα υπεροξειδάσης και χαµηλότερη περιεκτικότητα σε φαινολικές ουσίες. Το αντίθετο παρατηρείται στα SSP φυτά. Επιπλέον, η υπεροξειδάση στην ελιά φαίνεται ότι έχει µια αξιοσηµείωτη δραστηριότητα σε σχετικά υψηλές θερµοκρασίες, η οποία καθιστά αυτό το δένδρο ικανό να προσαρµόζεται (εγκλιµατίζεται) σε πολύ θερµά κλίµατα. Περαιτέρω µελέτη απαιτείται για τις πρωτεΐνες που σχετίζονται µε κάθε φάση καθώς δεν υπάρχουν πολλές εργασίες σχετικά µε το θέµα αυτό. Περισσότερες πληροφορίες απαιτούνται επίσης όσον αφορά τη δραστηριότητα συγκεκριµένων ενζύµων σε σχέση µε τη νεανικότητα και την ανανέωση της κόµης. 124

18 4.7. Βιβλιογραφία Arnon DI, Copper enzyme in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology, 24: 1-5. Barnal MA, Pedreno MA, Calderon AA, Munoz R, Ros Barcelo A, Merino de Caceres F, The subcellular localization of isoperoxidases in Capsicum annuum leaves and their different expression in vegetative and flowered plants. Annals of Botany, 72: Beer S, Sand-Jensen K, Madsen TV, Nielson SL, The carboxylase activity of Rubisco and the photosynthetic performance in aquatic plants. Oecologia, 87: Bradford MN, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal of Biochemistry, 72: Chaitanya D, Sunder D, Masilamani A, Ramachandra Reddy, Variation in heat stress-induced antioxidant enzyme activities among three mulberry cultivars. Plant Growth Regulators, 36: Christodoulakis NS, An anatomical study of seasonal dimorphism in the leaves of Phomis fructicosa. Annals of Botany, 63, Cornic G, Massacci A, Leaf photosynthesis under drought stress. In: Advances in photosynthesis: Photosynthesis and the Environment. Baker NR, (ed.), Kluwer Acadimec Publishers, Dordrecht, vol. 5, pp Dunford HB, Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties. In: Peroxidase in Chemistry and Biology. Everse J, Everse KE, Grisham MB, (eds.), CRC Press, Boca Raton, Fl, pp Farrell RL, Murtagh KE, Tien M, Mozuch MD, Kirk TK, Physical and Enzymatic properties of lignin-peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium, Enzyme Microbiology and Technology, 11: Fernandez-Lorenzo JL, Riguiro A, Ballester A, Polyphenols as potential markers to differentiate juvenile and mature chestnut shoot cultures. Tree Physiology, 19:

19 Garcia JL, Sarmiento R, Troncoso A, Some biochemical differences between juvenile and young olive plant material. Acta Horticulturae, 586: Gaspar T, Penel C, Thorpe T, Greppin, H, Peroxidases A survey of their biochemical and physiological roles in higher plants. Centre de Botanique, Universite de Geneve, Geneve. Gaspar T, Penel C, Hagege D, Greppin H, Peroxidase in plant growth, differentiation, and development processes. In: Biochemical, Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases. Lobarzweski J, Greppin H, Penel C, Gaspar T, (eds), University press, Geneve, pp Gazaryan IG, Lagrimini LM, Purification and unusual kinetic properties of a tobacco anionic peroxidase, Phytochemistry, 41: Gulen H, Eris A, Effect of heat stress on peroxidase activity and total protein content in strawberry plants. Plant Science. In press. Hackett WP, Juvenility, maturation, and rejuvenation in woody plants. Horticultural Review, 7: Hackett WP, Murray JR, Maturation and rejuvenation in woody species. In: Micropropagation in woody plants. Ahuja MR, (ed.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, pp Hand P, Biology of adventitious root formation. Davis TD, Haissing BE, (eds.) Plenum Press, N.Y., pp Hand P, Protein markers of juvenility and rejuvenation. In: Molecular and morphological markers in woody plant species. Thompson D, Welander M, (eds.) AIR3-CT pp Karabourniotis G, Papadopoulos K, Papamarkou M, Manetas Y, Ultraviolet-B radiation absorbing capacity of leaf hairs. Plant Physiology, 86, Karabourniotis G, Kofidis G, Fasseas C, Liakoura V, Drossopoulos I, Polyphenol deposition in leaf hair of Olea europaea (Oleaceae) and Quercus ilex (Fagaceae). American Journal of Botany, 85: Karabourniotis G, Fasseas C, The dense indumentums with its polyphenol content may replace the protective role of the epidermis in some young xeromorphic leaves. Canadian Journal of Botany, 74:

20 Ketsa S, Atantee S, Phenolics, lignin, peroxidase activity and increased firmness of damaged pericarp of mangosteen fruit after impact. Postharvest Biology and Technology. 14: Kofidis G, Bosabalidis AM, Moustakas M, Contemporary seasonal and altitudinal variations of leaf structural features in oregano (Origanum vulgare L.). Annals of Botany, 92: Ku MSB, Schmitt MR, Edward GE, Quantitative determination of RuBP carboxylase oxygenase protein in leaves of several C 3 and C 4 plants. Journal of Experimental Botany, 30: Lavee S, Avidan N, Haskal A, Ordovich A, Juvenility period reduction in olive seedlings. A tool for enhancement of breeding. Olivae, 60: Lawlor DH, The effects of water deficit on photosynthesis. In: Environment and Plant Metabolism-Flexibility and Acclimation. Smirnoff N, (ed.), BIOS Scientific Publishers, Oxford, pp Lawson EJR, Poethig RS, Shoot developments in plants: time for a change. Trends in Genetics, Vol 11: Levitt J, Responses of plants to environmental stress. Academic press, New York, pp Meilan R, Floral induction in woody angiosperms. New Forests, 14: Meloni DA, Oliva MA, Martinez CA, Cambraia J, Photosynthesis and activity of superoxide dismutase, peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress. Environmental and Experimental Botany, 49: Ngo T, Lenhoff HM, FEBS Letter, 116: Nielson SL, A comparison of aerial and submerged photosynthesis in some Danish amphibious plants. Aquatic Botany, 45: Nielson SL, Sand-Jensen K, Regulation of photosynthetic rates of submerged rooted macrophytes. Oecologia, 81: Patakas A, Kofidis G, Bosabalidis AM, The relationship between CO 2 transfer mesophyll resistance and photosynthetic efficiency in grapevine cultivars. Scientia Horticulturae, 97:

21 Peterson GL, A simplification of the protein assay method of Lowry et al., which is more generally applicable. Analytical Biochemistry, 53: Poethig RS Phase changes and the regulation of shoot morphogenesis in plants. Science 250, Racchi ML, Chiusi AP, Giannini R, Catalase isoenzymes as biochemical markers of different developmental stages in cypress (Cupressus sempervirens L.). Canadian Journal of forest Research, 26: Robards K, Antolovich M, Analysis, R. Sakharov IY, Vesga MK, Galaev IY, Sakharova IV, Pletjushkina OY, Peroxidase from leaves of royal palm tree Roystonea regia: purification and some properties. Plant Science, 161: Salaj J, Schornagel MJ, Picturing phase changes in Acacia mangium Wild. In: Identification and control of phase change in rejuvenation. Sean Mac An tsaoir ed. COST 822, WG3, pp Skaltsa H, Verycokidou E, Harvala C, Karabourniotis G, Manetas Y, UV-B protective potential and flavonoid content of leaf hairs of Quercus ilex. Phytochemistry, 37: Tazzari L, Bartolini G, M sallem M, Pestelli P, Phase change in Olea europaea L.: leaf proteins in juvenile and adult shoots. Ninth Consultation of the Inter-regional Cooperative Research Network on Olives, Hammamet (Tunisia). Published by: Coordination Center. C.I.D.A., Cordoba (Spain), pp. 65. Teeri JA, Adaptation of kinetic properties of enzymes to temperatures variability. In: Adaptation of plants to water and high temperature stress. Turner NC, Kramer PJ, (eds.), Wiley-Interscience, New York, pp Verschoore-Martouzet B, Etude de la variation topophysique an cours du clonage de Sequoia sempervirens (Eudlicher). These 3eme Cycle. Univ. Paris VI.. 128

22 4.8. Πίνακας και σχήµατα 4.4. (Πίνακας 1). ράση υπεροξειδάσης, συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και φαινολικές ουσίες στα φύλλα των µη-κλαδεµένων (SSP) και κλαδεµένων στα 5εκ (5cm) ελαιοδέντρων. (n=9; ± SE, τυπικό σφάλµα; στατιστικώς σηµαντικές διαφορές σε P<0,05) (Σχ. 1). Εποχικές αλλαγές του ρυθµού φωτοσύνθεσης (µmol CO 2 m -2 s -1 ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ) (Σχ. 2). Εποχικές αλλαγές της συνολικής περιεκτικότητας χλωροφύλλης (mg. χλωρ. / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ) (Σχ. 3). Εποχικές αλλαγές της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικές ουσίες (mg ισοδύναµα Γαλλικού οξέος / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ) (Σχ. 4). Συσχέτιση µεταξύ των περιεχοµένων συνολικής χλωροφύλλης (mg χλωρ. / g. ΜΒ) και συνολικών φαινολικών ουσιών (mg ισοδύναµα Γαλλικού οξέος / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ) (Σχ. 5). ραστηριότητα της αναγωγάσης (µονάδες / g. ΜΒ) σε σχέση µε το χρόνο επώασης σε σταθερή θερµοκρασία 40 o C (Σχ. 6). Υπολειµµατική δραστηριότητα υπεροξειδάσης (µονάδες / g. ΜΒ) σε σχέση µε τους διαφορετικούς χρόνους επώασης (5, 10 και 20 λεπτά) (Σχ. 7). Η συσχέτιση µεταξύ της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικές ουσίες (mg. Γαλλικού οξέος / g. ΜΒ) και της συνολικής δραστηριότητας υπεροξειδάσης (µονάδες / g. ΜΒ) στα φύλλα ελαιοδέντρων µε ένα βλαστό (SSP) και κλαδεµένων (5εκ). 129