ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

Transcript

1 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Τίτλος: Κλωνοποίηση, έκφραση και χαρακτηρισμός των ισοενζύμων της μεταφοράσης του γλουταθείου από Erwinia carotovora Ερευνητική Εργασία στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Εξειδίκευσης του ΠΑΝΑΓΙΩΤΗ ΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΥ ΑΘΗΝΑ 2012

2 H παρούσα μεταπτυχιακή μελέτη πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο της Ενζυμικής Τεχνολογίας του τμήματος Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Ο ορισμός του θέματος και της πενταμελούς συμβουλευτικής και εξεταστικής επιτροπής έγινε με απόφαση της γενικής συνέλευσης ειδικής σύνθεσης του Tμήματος Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας που έλαβε χώρα στις 18/05/2007. Η πενταμελής συμβουλευτική και εξεταστική επιτροπή: 1) Λάμπρου Νικόλαος, Αναπληρωτής Καθηγητής (Άμεσος Επιβλέπων-Εισηγητής) 2) Κλώνης Ιωάννης, Καθηγητής (Μέλος) 3) Κίντζιος Σπυρίδων, Καθηγητής (Μέλος) 4) Κατινάκης Παναγιώτης, Καθηγητής (Μέλος) 5) Γεωργακόπουλος Δημήτριος, Επίκουρος Καθηγητής (Μέλος)

3 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερμά όλα τα μέλη του εργαστηρίου, προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές, υποψήφιους διδάκτορες, για την αμέριστη βοήθεια που μου έδωσαν, για την ομαλή συνεργασία που είχαμε και το πνεύμα αλληλεγγύης που καλλιεργήθηκε ανάμεσά μας, καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας αυτής. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή Νίκο Λάμπρου που με καθοδήγησε με γνώμονα το πώς θα στηριχθώ για να αποκομίσω τα μέγιστα δυνατά από τη δουλειά μου αυτή. Θα ήθελα επίσης να επισημάνω την οικειότητα που με έκανε να νιώσω από την πρώτη στιγμή ο Καθηγητής Ιωάννης Κλώνης, όταν πρώτος με υποδέχτηκε στο Ίδρυμα αυτό.

4 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ EDTA SDS TEMED TRIS Αιθυλενοδιαμινο-τετραοξικό οξύ Δωδεκανοθειϊκό νάτριο Ν,Ν,Ν,Ν -τετραμεθυλ-αιθυλενοδιαμίνη Τρις-υδροξυμεθυλοαμινομεθάνιο

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ένζυμα Τρανσφεράσες της Γλουταθειόνης Κατηγοριοποίηση των ενζύμων GSTs Κυτοσολικές GSTs Γενωμική οργάνωση Γενική δομή και θεωρήσεις λειτουργίας των cgsts Kappa GSTs Μικροσωμικές GSTs Δομή και λειτουργία των μικροσωμικών GSTs Mέθοδοι εύρεσης λειτουργίας των GST Βιοτεχνολογικές εφαρμογές Κατευθυνόμενη εξέλιξη α. Ορθολογική στρατηγική β. Στοχαστική στρατηγική Διαγονίδιακοί οργανισμοί ως προς GSTs ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ ΥΛΙΚΑ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ - ΟΡΓΑΝΑ ΜΕΘΟΔΟΙ Κατασκευή πηκτώματος αγαρόζης για την ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA Πρωτόκολλο της PCR Ανάπτυξη της σε Ε. carotovora subsp. Atroseptica..40

6 3.4. Πρωτόκολλο απομόνωσης γενωματικού DNA Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (αλκαλική λύση) Λύση κυττάρων και παραλαβή τον ενζυμικού εκχυλίσματος Φωτομετρικός προσδιορισμός της GST Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με τη χρωματομετρική μέθοδο Bradford Διαπίδυση Προετοιμασία μεμβρανών διαπίδυσης Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) Προετοιμασία τον δείγματος και ηλεκτροφόρηση κάτω από συνθήκες μετουσίωσης Βαφή Coomassie Briliant Blue R Παρασκευή στήλης συγγένειας με ακινητοποιημένη GSH με βραχίονα 1,4-βουτανεδιολ-διγλυκιδυλ-αιθέρα Ένωση των προϊόντων PCR σε πλασμιδιακό φορέα pcr T7/CT- TOPO και μετασχηματισμός των δεκτικών κυττάρων Ε. coli TOP10F με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια Αρχές εξασφάλισης σωστού προσανατολισμού στην ένθεση του γονιδίου στον φορέα pcr T7/CT-TOPO Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli BL21 με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και διαδικασία ετερόλογης έκφρασης του γονιδίου GST σε αυτά Διαδικασία ετερόλογης έκφρασης Μακροπροθεσμη αποθήκευση βακτηριακών κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Απομόνωση των διαφορετικων ισοτύπων των γονιδίων που κωδικοποιούν τρανσφεράσες της γλουταθειόνης Βιοϋπολογιστική ανάλυση Απομόνωση γενωματικού DNA από Erwinia carotovora..63

7 Αντίδραση PCR για την απομόνωση και την ενίσχυση των γονιδίων των διαφορετικών ισοτύπων της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης από γενωματικό DNA Κλωνοποίηση των προϊόντων PCR στον φορέα pcr T7/CT-TOPO και μετασχηματισμός των δεκτικών κυττάρων Ε. coli TOP10F με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια Προσδιορισμός ενεργότητας των διαφόρων ισοτύπων τρανσφερασης της γλουταθειόνης μετά την ετερόλογη έκφραση στα κύτταρα E. coli BL21 DE ΣΥΖΗΤΗΣΗ...75 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 80

8 1 Περίληψη Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GST) μπορούν να μεταβολίσουν πλήθος υποστρωμάτων κύρια σε διαδικασίες αποτοξίνωσης αλλά και σε πλήθος μεταβολικών διαδικασιών, κάτι που τους δίνει προοπτικές να αξιοποιηθούν σε πολλές βιοτεχνολογικές εφαρμογές που άλλωστε πληθαίνουν τα τελευταία χρόνια. Το βακτήριο Erwinia carotovora subsp. Atroseptica SCRI1043 είναι πανταχού παρών φυπαθογόνο. Η επιτυχία του ως τέτοιο πιθανότατα οφείλεται σε ένζυμα που διαθέτει και το κάνουν ανθεκτικό στους μηχανισμούς άμυνας των φυτών, ανάμεσα στα οποία είναι και οι GSTs. Το βακτήριο αυτό εκφράζει τουλάχιστον έξι ισοτύπους GSTs, παρουσιάζοντας ενδιαφέρον από την άποψη αυτή. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε κατορθωτό να απομονωθούν τα έξι γονίδια που κωδικοποιούν αυτές τις GSTs από το γονιδίωμα του βακτηριακού αυτού στελέχους μέσω PCR. Ακολούθησε κλωνοποίηση των γονιδίων σε φορείς έκφρασης pcr T7/CT-TOPO και ετερόλογη έκφρασή του σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3). Μετά απ αυτήν προσδιορίστηκε φωτομετρικά η καταλυτική τους ικανότητα απέναντι στο υπόστρωμα CDNB. Έτσι πραγματοποιήθηκε το πρώτο βήμα για τη μελέτη των ενζύμων αυτών και την ενδεχόμενη βιοτεχνολογική τους αξιοποίηση.

9 2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

10 Τα ένζυμα Τρανσφεράσες της Γλουταθειόνης Οι Τρανσφεράσες (μεταφοράσες) της Γλουταθειόνης (γλουταθείου) (GSTs) είναι μια υπεροικογένεια πολυλειτουργικών πρωτεϊνών με θεμελιώδεις ρόλους στην κυτταρική αποτοξίνωση μιας μεγάλης γκάμας εξωγενών και ενδογενών μεταβολιτών. Αν και αρκετές απ αυτές δεν έχουν καθόλου δράση τρανσφεράσης, αυτές οι πρωτεΐνες συνεχίζουν να αποκαλούνται συνολικά GSTs, επειδή οι πρώτες που ανακαλύφθηκαν ήταν πράγματι τρανσφεράσες. Στα φυτά και τα ζώα, οι GSTs είναι τα κύρια ένζυμα της φάσης ΙΙ στις μεταβολικές διαδικασίες αποτοξίνωσης. Η κύρια τους αποστολή είναι να καταλύουν την ένωση του τριπεπτιδίου Γλουταθειόνη (γ-glu-cys-gly ή GSH) με ηλεκτρονιόφιλους, συνήθως τοξικούς, μεταβολίτες ξενοβιοτικούς ή ενδογενείς για το σχηματισμό περισσότερο διαλυτών και λιγότερο τοξικών πεπτιδικών καταλοίπων. Κατόπιν αυτές οι ενώσεις της γλουταθειόνης είναι έτοιμες να επεξεργαστούν σε ενώσεις μερκαπτουρικού οξέος, να διασπαστούν περαιτέρω και τελικά να αποβληθούν από τα κύτταρα, διαδικασίες που αναλαμβάνουν τα ένζυμα της φάσης ΙΙΙ. Συγκεκριμένα οι GSTs καταλύουν την πυρηνόφιλη προσβολή από τη GSH στο ηλεκτρονιόφιλο κέντρο (R) μιας ένωσης, όπως φαίνεται στην παρακάτω χημική εξίσωση (Armstrong, 1998). RX + GSH GSR + XH Η R μπορεί να είναι μια άλκυλ-, άλλυλ- ή και άρυλ- ομάδα η οποία ως ηλεκτρονιόφιλο κέντρο μπορεί να περιέχει υπεροξυ-ομάδες, άτομα οξυγόνου με ασύζευκτα ηλεκτρόνια (πχ ρίζες), αλδεϋδομάδες-κετονομάδες κ.α. Αυτό που πρακτικά συμβαίνει είναι η αναγωγή αυτών των ηλεκτρονιόφιλων κέντρων οξυγόνου με την ταυτόχρονη οξείδωση της θειολικής ομάδας (-SH) της GSH. Στην παραπάνω εξίσωση η Χ μπορεί να είναι μια μεγάλη ποικιλία οργανικών ή ανόργανων ομάδων.

11 4 Επιπρόσθετα οι GSTs μπορούν να υπηρετήσουν ως υπεροξειδάσες, ισομεράσες και θειόλο-τρανσφεράσες ή να έχουν μη-καταλυτικές λειτουργίες μεταξύ των οποίων να ενώνονται με μη-υποστρωματικά προσδέματα και να συμμετέχουν στη ρύθμιση μεταγωγής σήματος. Τέλος οι ρόλοι τους εκτείνονται σε διάφορες άλλες μεταβολικές πορείες, όπως στη βιοσύνθεση λευκοτριενίων και προσταγλανδινών καθώς και στον καταβολισμό αρωματικών αμινοξέων Κατηγοριοποίηση των ενζύμων GSTs Γενικά αναγνωρίζονται 3 κύριες υποοικογένειες GSTs που καθεμιά κωδικοποιείται από ξεχωριστές πολυγονιδιακές οικογένειες: 1) Οι διαλυτές ή κυτοσολικές GSTs που αναφέρονται στη βιβλιογραφία και ως κανονικές. 2) Οι μικροσωμικές GSTs που ονομάζονται MAPEG, δηλαδή σχετιζόμενες με τις μεμβράνες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των εικοσανοειδών και της γλουταθειόνης. 3) Οι GSTs που κωδικοποιούνται από πλασμίδια βακτηρίων και εμπλέκονται στην αντίσταση κατά της φωσφομυκίνης και άλλων αντιβιοτικών. Μια διάκριση που χρησιμοποιείται σε πολλές περιπτώσεις είναι αυτή μεταξύ των GSTs που εκφράζονται στους ευκαρυωτικούς και των GSTs που εκφράζονται στους προκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι ευκαρυωτικές GSTs περιλαμβάνουν τη μεγάλη πλειοψηφία των μελών των υποοικογενειών των κυτοσολικών, των Kappa (αναφέρονται παρακάτω) και των μικροσωμικών GSTs. Στις GSTs των βακτηρίων περιλαμβάνονται περίπου το 15% των μέχρι τώρα χαρακτηρισμένων κυτοσολικών, περίπου το 30% των φερόμενων ως μικροσωμικών και οι πλασμιδιακές GSTs. Πρόσφατα ευρήματα υποδεικνύουν πως οι GSTs κλάσης Kappa, που παλαιότερα θεωρούνταν απλώς ως μια κλάση των διαλυτών GSTs, αποτελούν μια διακριτή υποοικογένεια (Jowsey et al., 2003; Ladner et al., 2004; Robinson et al., 2004).

12 5 Οι μικροσωμικές GSTs είναι εξαιρετικά ετερογενείς. Μάλιστα έχουν ταυτοποιηθεί μικροσωμικές GSTs με πρωτογενή και τριτογενή δομή περισσότερο όμοια με αυτή των διαλυτών, κλάσης Α, GSTs παρά με αυτή των άλλων μικροσωμικών. Είναι, λοιπόν, πιθανό ότι ο αριθμός των υποοικογενειών των GSTs να είναι μεγαλύτερος από αυτόν που μέχρι τώρα θεωρείται. Ακόμα παραπέρα, γενωμικές και μεταγενωμικές μελέτες τονίζουν συνεχώς την ύπαρξη δεσμών με «σχετιζόμενες οικογένειες» πρωτεϊνών των οποίων τα όρια με τις GSTs μπορεί να είναι αρκετά λεπτά και δυσδιάκριτα. Αυτές οι GST-σχετιζόμενες πρωτεΐνες περιλαμβάνουν τις γλουταρεδοξίνες (GRX) (Xia et al., 2001; Collison and Grant, 2003), τα διακυτταρικά κανάλια χλωρίου (CLIC) (Cromer et al., 2002), τις δεϋδροασκορβικο-ρεδουκτάσες (DHAR) (Dixon et al., 2002), τις σεληνοκυστεϊνικές υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (SecGPX) (Epp et al., 1983), την βακτηριακή DsbA (Martin et al., 1993) και τους ευκαρυωτικούς παράγοντες επιμύκηνσης (eef1bγ) (Jeppesen et al., 2003). Όλες αυτές μοιράζονται με τις GSTs ένα βασικό δομικό μοτίβο, την πτυχή της θειορεδοξίνης. Τέλος οι βακτηριακές GSTs μέχρι τώρα έχουν χαρακτηριστεί λιγότερο σε σχέση με τις άλλες GSTs, ειδικά σε ότι αφορά τις λειτουργίες τους και την επέκτασή τους στα διάφορα βακτηριακά είδη. Η μεγάλη πλειοψηφία των βακτηριακών GSTs που έχουν μέχρι τώρα ερευνηθεί αφορούν στην κατάλυση εξειδικευμένων αντιδράσεων σε μονοπάτια καταβολισμού ενδογενών, κυρίως, χημικών ουσιών (Vuilleumier 1997). Οι αρχικά χαρακτηρισμένες βακτηριακές GSTs εμφανίζαν μικρή δραστικότητα απέναντι στη μεγάλη ποικιλία των ηλεκτρονιόφιλων ουσιών που μπορούν να ενωθούν με τη γλουταθειόνη στις ευκαρυωτικές GSTs όπως αλογονιδιομένα αρωματικά και αλειφατικά σύμπλοκα, υπεροξείδια και εποξείδια, α, β-ακόρεστα καρβονυλικά σύμπλοκα, ισοθειο-εστέρες του κυανιδικού οξέως και δισουλφίδια μικρού μοριακού βάρους (Hayes and Pulford 1995). Τα συσσωρευμένα όμως αποτελέσματα των ερευνών που έχουν ακολουθήσει σε σχέση με τις GSTs των βακτηρίων, φαίνεται να ανατρέπουν την άποψη αυτή, ενώ υπάρχει και έντονο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον για αυτές.

13 Κυτοσολικές GSTs Αυτή η υποοικογένεια που απαντάται ευρέως σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς είναι κατά πολύ η πιο άφθονη και συχνά αριθμεί δεκάδες μέλη σε κάθε είδος. Για παράδειγμα, έχουν ταυτοποιηθεί διαφορετικά γονίδια GSTs στον άνθρωπο και σε άλλα θηλαστικά, στα φυτά, στα βακτήρια και πάνω από 10 στα έντομα. Βασιζόμενοι σε διάφορα κριτήρια, συμπεριλαμβανομένων της ομοιότητας αμινοξικών και νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, της φυσικής δομής των γονιδίων (πχ θέση και αριθμός εσωνίων) και ανοσολογικών ιδιοτήτων, οι κυτοσολικές GSTs έχουν ομαδοποιηθεί σε πολυάριθμες κλάσεις, μερικές από τις οποίες έχουν ευρεία διάδοση, ενώ άλλες απαντούν σε συγκεκριμένα είδη. Προς το παρόν έχουν αναγνωριστεί στα θηλαστικά 7 κλάσεις cgsts, δηλαδή οι ειδικές κλάσεις Alpha (Α), Mu (Μ), Pi (Π) και οι κοινές Sigma (Σ), Theta (Θ), Zeta (Ζ) και Omega (Ω). Τα φυτά έχουν 6 κλάσεις, τις ειδικές Lambda (Λ), Phi (Φ), Tau (Τ) και DHAR (δεϋδρο-ασκορβικό-ρεδουκτάσες) και τις κοινές Theta και Zeta, ενώ 5 κλάσεις έχουν αναγνωριστεί στα έντομα, η ειδική Delta (Δ) και οι κοινές Sigma, Theta, Zeta και Omega. Στα βακτήρια η εικόνα είναι λιγότερο καθαρή. Βέβαια έχουν μια ειδική κλάση, την Beta (Β), καθώς και άλλα ένζυμα σχετιζόμενα περισσότερο με τις Theta και πιθανώς με άλλες κλάσεις. Πρόσφατα ανακοινώθηκε μια νέα ειδική κλάση των βακτηρίων, η Chi (X) (Wiktelius et al., 2007). Σχεδόν όλες οι διαλυτές GSTs είναι ενεργές ως διμερή, είτε ως ομοδιμερή, είτε ως ετεροδιμερή. Ο ετεροδιμερισμός περιορίζεται σε υπομονάδες ίδιας κλάσης. Πάντως έχουν αναφερθεί σπάνια μονομερή ένζυμα κυρίως από τις φυτικές κλάσεις Lambda και DHAR. Τα μονομερή ένζυμα στερούνται GSH-εξαρτώμενης συζευκτικής ικανότητας και δράσης υπεροξειδάσης με τυπικά υποστρώματα (Dixon et al., 2002). Παρόλα αυτά, θεωρούνται GSTs στη βάση της αλληλουχικής και δομικής

14 7 ομοιότητάς τους και επειδή μοιράζονται κάποιες άλλες κλασικές για GSTs καταλυτικές ιδιότητες, όπως τη δραστικότητα μεταφοράσης της θειόλης Γενωμική οργάνωση Η ολοκλήρωση διαφόρων γενωμικών διαδικασιών αλληλούχισης καθώς και της εξέλιξης ισχυρών εργαλείων βιοπληροφορικής, έχει οδηγήσει σε εκτενείς αναφορές νέων γονιδίων και κατασκευή φυσικών χαρτών που αποκάλυψαν την διασπορά των γονιδίων στο γονιδίωμα ολοένα αυξανόμενου αριθμού οργανισμών. Τα περισσότερα γονίδια GST φαίνεται να σχηματίζουν σφιχτές γονιδιακές συστάδες συνήθως της ίδιας κλάσης. Πχ τα ανθρώπινα γονίδια Α, Μ και Θ κλάσης ή τα Π γονίδια ποντικού ομαδοποιούνται σε ειδικές και περιορισμένες χρωμοσωμικές περιοχές. Τα γονίδια των βακτηριακών GST καταλαμβάνουν παρακείμενες θέσεις σε οπερόνια ή συστάδες γονιδίων που εμπλέκονται σε ειδικά καταβολικά μονοπάτια Γενική δομή και θεωρήσεις λειτουργίας των cgsts Οι διαλυτές GSTs είναι κατά κανόνα βιολογικά ενεργές ως διμερή υπομονάδων βάρους kda και με μέσο μήκος αμινοξέα. Οι ομοιότητες στην αμινοξική αλληλουχία μέσα στην ίδια κλάση είναι τυπικά λίγο μεγαλύτερες από 40%, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι δεν έχουν βρεθεί και άλλοι βαθμοί ομοιότητας. Ανάμεσα σε διαφορετικές κλάσεις οι ομοιότητες είναι σημαντικά μικρότερες, σχεδόν 25% στα θηλαστικά και 20% στα φυτά. Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί οι κρυσταλλικές δομές περίπου 20 διαλυτών GSTs που ανήκουν στις κύριες φυτικές, ζωικές και βακτηριακές κλάσεις. Η ανάλυσή τους δηλώνει σαφώς πως, παρά τη προφανή συνολική αλληλουχική απόκλιση, όλες οι GST πρωτεΐνες δείχνουν χτυπητά επίπεδα δομικής συντηρητικότητας, δείχνοντας κοινή τρισδιάστατη αναδίπλωση και διμερή οργάνωση.

15 8 Κάθε υπομονάδα αποτελείται από δύο χωρικά διακριτές επικράτειες. Μία αμινοτελική αποτελούμενη από β-αλυσίδες και α-ελικες (επικράτεια Ι) και μια ολοελικοειδή καρβοξυτελικη (επικράτεια ΙΙ). Η επικράτεια Ι υιοθετεί μια θειορεδοξινικη (TRX) αναδίπλωση (βαβαββα) που αποτελείται από δυο δομικά μοτίβα, ένα αμινοτελικό βαβ και ένα καρβοξυτελικό ββα, που μεταξύ τους συνδέονται από ένα μακρύ βρόχο που περιέχει α-έλικα. Συνολικά σχηματίζουν μια β-πτυχωτή επιφάνεια από τρεις παράλληλες (β1β2β4) και μια αντιπαράλληλη (β3) β-αλυσίδες. Η επιφάνεια αυτή βρίσκεται ανάμεσα στην α2 έλικα από τη μια πλευρά και τις α1-α3 έλικες στην άλλη πλευρά. Η έλικα α2 και η β3 αλυσίδα συνδέονται μέσω μιας λούπας που περιέχει μια cis-προλίνη, κάτι που είναι υψηλά συντηρημένο σε όλες τις GSTs. Αυτή η λούπα μπορεί να μην εμπλέκεται απευθείας στην κατάλυση, όμως είναι σημαντική στη διατήρηση μιας καταλυτικά ικανής δομής για την GST (Allocati et al., 1999). Η επικράτεια ΙΙ αποτελείται από έναν κυμαινόμενο αριθμό (4-7) α-ελίκων που τοποθετούνται καθοδικά της TRX δομής και συνδέονται με αυτήν μέσω μιας κοντής αλληλουχίας 10 περίπου αμινοξέων. (σχήμα 1.1) Σχήμα 1.1: Διάγραμμα των δευτεροταγών δομών των πρωτεϊνών TRX. Τα βέλη υποδεικνύουν τις β-αλυσίδες ενώ τα ορθογώνια τις α-έλικες. Τα οβάλ σχήματα υποδεικνύουν τη θέση της επικράτειας ΙΙ. Η φύση της επικράτειας ΙΙ περιγράφεται στην παρένθεση δίπλα στα ονόματα των πρωτεϊνών (b και c).

16 9 Κάθε υπομονάδα διαθέτει μια περιοχή σύνδεσης της γλουταθειόνης (G-site) αποτελούμενη από αμινοξικά κατάλοιπα της επικράτειας Ι και μια υδρόφοβη περιοχή πρόσδεσης του ηλεκτρονιόφιλου υποστρώματος (H-site) αποτελούμενη κυρίως από κατάλοιπα με μη πολικές πλάγιες ομάδες της επικράτειας ΙΙ. Και οι δύο πλευρές (G- & H-sites) συγκροτούν από κοινού μία καταλυτικά ενεργή πλευρά. Η αμινοτελική δομή είναι αρκετά συντηρημένη και περιέχει ειδικά κατάλοιπα κρίσιμα για τη σύνδεση της γλουταθειόνης και τη γενικότερη καταλυτική δράση. (Σχήμα 1.2) Σχήμα 1.2: Διάγραμμα του μονομερούς της TaGSTU4 T-κλάσης από σιτηρά (a) και 2 απόψεις του διμερούς της TaGSTU4. Οι α-έλικες παριστάνονται ως ελικοειδείς κορδέλες και οι β-αλυσίδες ως ταινιώδη βέλη. Ο αναστολέας S-εξυλο-γλουταθειόνη (για να περιγραφεί ο τρόπος σύνδεσης της GSH) παριστάνεται με τη δομή τύπου μπίλια-αξονας σύμφωνα με τον ατομικό της τύπο. Τα λεπτά βέλη δείχνουν τη θέση του καταλυτικού καταλοίπου σερίνης (S), του καταλοίπου cis-pro στην αντίστοιχη λούπα ανάμεσα στην α2-έλικα και β3-αλυσίδα και την κοντή αλληλουχία που συνδέει τις δύο επικράτειες. Στο (b) φαίνεται ο διπτυχωτός άξονας ανάμεσα στα δύο μονομερή από δύο κάθετες μεταξύ τους απόψεις και η ρωγμή σχήματος V. (Thom et al., 2002)

17 10 Υψηλά συντηρητική είναι η Τyr7 στις κλάσεις A, M και Π των θηλαστικών και η Ser17 των πανταχού παρόντων Θ και Ζ, των φυτικών Φ και των GSTs Δ κλάσης. Αυτά τα κατάλοιπα έχουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του ενζύμου, καθώς το υδροξύλιο της σερίνης ή της τυροσίνης δρα ως δότης δεσμού υδρογόνου με τη θειολική ομάδα της GSH, προωθώντας τη δημιουργία και τη σταθεροποίηση ενός ισχυρά δραστικού θειολικού ανιόντος το οποίο μπορεί πράγματι να πραγματοποιήσει πυρηνόφιλη επίθεση στο εκάστοτε ηλεκτρονιόφιλο υπόστρωμα (Dirr et al., 1994). Ο σημαντικός ρόλος αυτών των καταλοίπων επιβεβαιώθηκε από στοχοπροσηλωμένες μεταλλάξεις της τυροσίνης διαφόρων κλάσεων ενζύμων. Σε όλες τις περιπτώσεις χάθηκε η καταλυτική ικανότητα του ενζύμου (Dirr et al., 1994; Caccuri et al., 1997; Thom et al., 2002). Μερικές κλάσεις GST έχουν αντί μιας σερίνης ή τυροσίνης, μια κυστεΐνη στην ίδια G-site. Αυτό το κατάλοιπο με τη θειολική του ομάδα προωθεί το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ της θειολικής ομάδας της GSH και άλλων υποστρωμάτων, παρά τη δημιουργία ενός θειολικού ανιόντος. Αυτό είναι χαρακτηριστικό των κλάσεων Ω, Β και Λ καθώς και των, σχετιζόμενων με τις GST, οικογενειών των DHARs, GRX και CLICs. Όλα αυτά τα ένζυμα έχουν φτωχή, αν όχι μηδενική, συζευκτική δραστηριότητα με την GSH και αντ αυτού εμπλέκονται σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής. Ενώ οι Λ, DHARs, GRX και CLICs είναι βιολογικά ενεργά ως μονομερή, οι Ω και Β κλάσεις είναι διμερή. Οι Ω υπάρχουν σε αρκετά θηλαστικά, έντομα και νηματώδεις. Όπως οι GRX, έχουν δράση GSHεξαρτώμενης θειολικής τρανσφεράσης και μπορούν επίσης να καταλύσουν τη δεϋδρο-ασκορβική αναγωγή. Όμως η συζευκτική με την GSH δραστηριότητα είναι αμελητέα (Board et al., 2000). Σε ότι αφορά τις GST Β κλάσης, μελέτες στο αντίστοιχο ένζυμο από τον Proteus έδειξαν ότι επιδεικνύει τόσο συζευκτική δραστηριότητα όσο και οξειδοαναγωγική δράση απέναντι σε δισουλφίδια. Η Cys10 είναι σημαντική για την οξειδοαναγωγική δράση αλλά όχι για την σύζευξη με την GSH. Για αυτά τους τα χαρακτηριστικά, οι Β θεωρούνται ως ενδιάμεσα ένζυμα που γεφυρώνουν το εξελικτικό μονοπάτι από τις θειολο-δισουλφιδικές οξειδοαναγωγάσες στις τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (Caccuri et al., 2002).

18 11 Η καρβοξυτελικη περιοχή, αντίθετα με την αμινοτελική, ποικίλει τόσο σε αλληλουχία όσο και σε τοπολογία με αποτέλεσμα να καθορίζονται με συγκεκριμένο τρόπο οι άφθονες και διακριτές μεταξύ τους υδροφοβικές ιδιαιτερότητες με το κάθε υπόστρωμα που παρατηρούνται στα διάφορα ένζυμα. Κάθε υπομονάδα των διμερών GST είναι καταλυτικά ανεξάρτητη καθώς διαθέτει τόσο G- όσο και H-site. Όμως πέρα των προαναφερόμενων εξαιρέσεων, όλες οι καταλυτικά ενεργές GSTs που βρίσκονται στη φύση είναι διμερή. Οι λόγοι αυτής της αντίφασης παρέμεναν για πολύ καιρό σκοτεινοί και μόνο πρόσφατες μελέτες έχουν αρχίσει να φωτίζουν τη μοριακή βάση του διμερισμού και τους λόγους για τους οποίους αυτός έχει τόσο υψηλά διατηρηθεί στη διαδικασία της εξέλιξης. Σε όλες τις διμερείς GSTs οι δύο υπομονάδες σχετίζονται μέσω ενός διπτυχωτού άξονα (σχήμα 1.2). Οι κύριες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων συμβαίνουν μεταξύ της επικράτειας Ι της μιας και της επικράτειας ΙΙ της άλλης υπομονάδας. Διαφορετικοί τύποι αλληλεπιδράσεων διαπλέκονται στην συναρμολόγηση και διατήρηση της τεταρτοταγής διαμόρφωσης. Στις Θ, Β, Τ και Σ οι αλληλεπιδράσεις είναι κυρίως υδρόφιλες, ενώ στις Α, Μ, Π, Ω και Φ οι αλληλεπιδράσεις διμερισμού είναι υδρόφοβες (όπως και οι επιφάνειες των πρωτεϊνικών υπομονάδων που εμπλέκονται). Μια σημαντική υδροφοβική αλληλεπίδραση στις Α, Μ, Π και Φ GSTs αποκαλύπτεται σε ένα μοτίβο κλειδιού-κλειδαριάς. Σε αυτό η πλάγια ομάδα ενός αρωματικού αμινοξέος (συνήθως φαινυλαλανίνη ή τυροσίνη) αποτελεί το κλειδί που ξεπροβάλει από τη λούπα που προηγείται της β3 αλυσίδας της επικράτειας Ι της μιας υπομονάδας. Αυτό το κλειδί προσαρμόζεται σε μια υδρόφιλη κοιλότητα (θήκη) που σχηματίζεται από τις α4 και α5 έλικες της επικράτειας ΙΙ της άλλης υπομονάδας (Armstrong et al., 1997; Hegazy et al., 2004). Μετάλλαξη αυτού του καταλοίπου στις ανθρώπινες GSTP1-1, GSTA1-1 και GSTM1-1 οδηγεί σε περιορισμένο διμερισμό ή/και αποσταθεροποίηση του διμερούς και περιορισμένη καταλυτική δράση (Hornby et al., 2002).

19 12 Στην περίπτωση της πρώτης εξ αυτών, ο διμερισμός θεωρείται πως σταθεροποιεί την τριτοταγή δομή κάθε υπομονάδας και αποτελεί τη δομική βάση της συνεργασίας ανάμεσα στις δύο υπομονάδες για την πρόσδεση της GSH (Caccuri et al., 1999). Αργότερα (Hegazy et al, 2004) δείχθηκε πως οι δύο δραστικές πλευρές της GSTP1-1 λειτουργούν συνεργατικά. Από μετάλλαξη της Tyr50 σε αλανίνη δημιουργήθηκε η υπομονάδα Υ50Α, που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία μιας ομοδιμερούς μεταλλαγμένης πρωτεΐνης Υ50Α/Υ50Α και μιας ετεροδιμερούς Υ50Α/GSTP1-1, δηλαδή με μια άγριου τύπου υπομονάδα. Χρησιμοποιώντας το τυπικό υπόστρωμα CDNB, βρέθηκε ότι το μεταλλαγμένο ομοδιμερές ήταν πρακτικά ανενεργό, αφού είχε χιλιάδες φορές μικρότερη ενεργότητα από το φυσιολογικό ομοδιμερές. Επίσης το ετεροδιμερές βρέθηκε να έχει 27 φορές μικρότερη ενεργότητα από το φυσιολογικό ένζυμο, αν και θα αναμενόταν μόνο 2 φορές αν οι δύο υπομονάδες λειτουργούσαν πράγματι ανεξάρτητα. Αυτό αποδεικνύει ότι η διμερής οργάνωση αυξάνει κατά πολύ την ενεργότητα του συγκεκριμένου ενζύμου, πράγμα που συνηγορεί στη συνεργατική λειτουργία των δύο υπομονάδων του. Πρόσφατα παρόμοια μοτίβα κλειδιού-κλειδαριάς, αν και λιγότερο μελετημένα, βρέθηκαν και σε άλλες κυτοσολικές GSTs. Στα περισσότερα διμερή GST παρατηρείται μια εξωτερική, σχετικά βαθιά, σχήματος V ρωγμή (σχήμα 1.2) ανάμεσα στις δύο υπομονάδες και μια κρυμμένη περιοχή μήκους Angstrom. Στις Θ, Ω και Κ GSTs η ρωγμή είναι περισσότερο ανοιχτή και η κρυφή περιοχή περιορισμένη. Το άνοιγμα της ρωγμής και η πολικότητα της H-site κάθε υπομονάδας επιδρούν στις λειτουργικές ιδιαιτερότητες κάθε ενζύμου. Για παράδειγμα, οι Ω έχει βρεθεί ότι μπορούν να προσδέσουν πολύ μεγάλα και σχετικά υδρόφιλα υποστρώματα, πχ άλλες πρωτεΐνες. Δεδομένης της παρουσίας της κυστεΐνης ως ενεργό κατάλοιπο στη G-site, είναι κατανοητό ότι οι Ω GSTs παίζουν ρόλο στην αναγωγή με GSH ή κυστεΐνη S- θειολικών μορίων που δημιουργούνται από διάφορες κυτταρικές πρωτεΐνες σαν επακόλουθο οξειδωτικού στρες (Board et al, 2000). Επίσης έχει προταθεί για τις Κ GSTs η πρόσδεσή τους σε άλλες πρωτεΐνες ως μέρος της λειτουργίας τους (Ladner et al., 2004).

20 Kappa GSTs Τα πρώτα ίχνη αυτού που τώρα φαίνεται ως μία διακριτή υποοικογένεια GSTs χρονολογούνται από το 1991, όταν ένα ένζυμο GST απομονώθηκε από το μάτριξ υπατικών μιτοχονδρίων αρουραίου (Harris et al, 1991). Το ένζυμο αυτό τοποθετήθηκε αρχικά στις GSTs Θ κλάσης στη βάση περιορισμένης ανάλυσης της αμινοτελικής αλληλουχίας. Με τον πλήρη καθορισμό της αλληλουχίας του cdna και της πρωτεΐνης, επισημάνθηκαν σημαντικές διαφορές με τις άλλες γνωστές GSTs θηλαστικών και γι αυτό εισήχθη μια νέα κλάση, η Κ, προκειμένου να τοποθετηθεί αυτό το ένζυμο. Επίσης αναφέρθηκαν και άλλα, ανθρώπινα και χοιρινά ομόλογα, παρόλο που δεν χαρακτηρίστηκαν. Η μοριακή κλωνοποίηση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός Κ GSTs από ποντικό και άνθρωπο καθώς και ο τρισδιάστατος καθορισμός της δομής των ενζύμων αυτών των δύο οργανισμών πρόσθεσαν νέα στοιχεία για την αποσαφήνιση αυτής της νέας υποοικογένειας GSTs (Jowsey et al., 2003; Robinson et al., 2004; Ladner et al, 2004). Όλα τα Κ ένζυμα θηλαστικών κωδικοποιούνται από γονίδια ενός αντιγράφου, με υψηλή ομοιότητα ανάμεσα στα τρία αυτά είδη (αρουραίος, χοίρος, άνθρωπος) τόσο στην αμινοξική αλληλουχία (περίπου 70%) όσο και στην οργάνωσή τους: όλα τα γονίδια αποτελούνται από οχτώ εξώνια και επτά εσώνια σε συντηρημένες θέσεις (Jowsey et al., 2003). Συγκριτικές έρευνες σε EST βάσεις δεδομένων έχουν αποκαλύψει όμοιες αλληλουχίες από B. taurus, S. scrofa, G. gallus, X. laevis, C. elegans, ενώ τρανσφεράσες της γλουταθειόνης σχετιζόμενες με τα Κ ένζυμα βρέθηκαν επίσης σε βακτήρια (Vuilleumier and Pagni, 2002). Φαίνεται πως η παρουσία τους σε εξελικτικά μακρινά είδη προτάσσει μια θεμελιώδη και συντηρητική βιολογική λειτουργία που ενδεχομένως έχουν. Τα Κ ένζυμα παρουσιάζουν GSH-εξαρτώμενη δραστηριότητα σύζευξης και δραστηριότητα υπεροξειδάσης με τυπικά υποστρώματα, γι αυτό μοιράζονται κοινά καταλυτικά χαρακτηριστικά με τις τυπικές GSTs.

21 14 Τα γονίδια των Κ GSTs έχουν ένα πλατύ ιστοειδικό προφίλ έκφρασης και βρίσκονται συνήθως στα μιτοχόνδρια και όχι στο κυτταρόπλασμα (Jowsey et al., 2003). Επιπρόσθετα, το ανθρώπινο ένζυμο έχει ανιχνευθεί επίσης στα υπεροξυσωμάτια. Από τη στιγμή που τα μιτοχόνδρια και τα υπεροξυσωμάτια εμπλέκονται στον μεταβολισμό των λιπιδίων και είναι κυτταρικές θέσεις όπου παράγονται μεγάλες ποσότητες αντιδραστικού οξυγόνου (πχ ρίζες), η τοποθέτηση των ανθρώπινων Κ GSTs και στα δύο οργανίδια προτείνει για αυτές ένα ρόλο στη β-οξείδωση των λιπαρών οξέων και στην αποτοξίνωση από λιπιδικά υπεροξείδια. Συγκρίσεις αμινοξικών αλληλουχιών υποδεικνύουν ότι τα Κ ένζυμα δεν μοιράζονται σημαντική συνολική ομολογία με καμία από τις άλλες κλάσεις GSTs, είναι όμως κοντύτερα στην DsbA της E. coli, μία ισομεράση του δισουλφιδικού δεσμού, και στη βακτηριακή HCCA ισομεράση, μια GSH-εξαρτώμενη οξειδοαναγωγάση που εμπλέκεται στην αποδόμηση της ναφθαλίνης (Robinson et al., 2004; Ladner et al, 2004). Επίσης και η δευτεροταγής δομική τοπολογία των Κ GSTs έχει περισσότερες ομοιότητες με τα δύο αυτά βακτηριακά ένζυμα παρά με τις κυτταροπλασματικές GSTs. Ενώ στις τελευταίες η ελικοειδής επικράτεια ΙΙ τοποθετείται καθοδικά της πτυχής της θειορεδοξίνης, στις Κ GSTs, DsbA και HCCA αυτή εισέρχεται μέσα στη θηλιά, ανάμεσα στο αμινοτελικό (βαβ) και καρβοξυτελικό (ββα) μοτίβο. Τα ευρήματα αυτά οδήγησαν ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες να υποθέσουν πως η εξελικτική πορεία των K GSTs διαφοροποιείται από των κυτοσολικών (Robinson et al., 2004; Ladner et al, 2004). Όμως παρά την αμινοξική απόκλιση με τις κανονικές GSTs, είναι δυνατή μια αντιστοίχηση των δευτεροταγών δομικών στοιχείων της θειορεδοξικής θηλιάς. Όταν οι συγκρίσεις περιορίζονται στα βαβ και ββα μοτίβα, οι ανθρώπινες Κ GSTs (hgstk) μοιάζουν περισσότερο στις GSTs Θήτα κλάσης απ ότι στις GSTs άλλων κλάσεων και στη DsbA. Επιπρόσθετα, τα διμερή Κ ένζυμα ανθρώπου και αρουραίου έχουν σχήμα ανοιχτής πεταλούδας απ όπου λείπει η βαθιά ρωγμή σχήματος V ανάμεσα στις δύο υπομονάδες, όπως ακριβώς και στις GSTs Θ κλάσης (Robinson et al., 2004; Ladner et al, 2004).

22 Μικροσωμικές GSTs Οι μικροσωμικές GSTs, που πλέον αποκαλούνται MAPEG, είναι επίσης πανταχού παρούσες με καλά καταγεγραμμένη παρουσία σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών, καταλαμβάνοντας όλες τις θέσεις της εξελικτικής κλίμακας (Bressel et al., 2005). Όμως αριθμητικά είναι λιγότερες από τις κυτοσολικές GSTs και πολύ λιγότερο χαρακτηρισμένες, με εξαίρεση τις MAPEG θηλαστικών. Οι περισσότερες MAPEG εμπλέκονται στη σύνθεση εικοσανοϊδών, λευκοτριενίων και προσταγλανδινών καταλύοντας αντιδράσεις GSH-εξαρτώμενης τρανσφεράσης ή ισομεράσης. Άλλες έχουν διαφορετικές λειτουργίες. Για παράδειγμα, η πρώτη MAPEG που χαρακτηρίστηκε τo 1982, η ανθρώπινη MGST1, επιδεικνύει καταλυτικές δράσεις περισσότερο συνηθισμένες για τις κυτοσολικές GSTs. Καταλύει τη σύζευξη της γλουταθειόνης σε πολλά αλογονοειδή υποστρώματα, μεταξύ τους και το CDNB, καθώς και σε διάφορους πολυαλογονιδιομένους ακόρεστους υδατάνθρακες. Μαζί με αυτήν τη δράση τρανσφεράσης, η MGST1 πιστεύεται ότι είναι κυρίως ένα ένζυμο αποτοξίνωσης που εμπλέκεται στην κυτταρική άμυνα ενάντια στα τοξικά ξενοβιοτικά όπως επίσης και ενάντια σε μεταβολίτες που παράγονται ως επίπτωση οξειδωτικού στρες. Για πολύ καιρό η MGST1 ήταν η μόνη χαρακτηρισμένη MAPEG. Αργότερα ταυτοποιήθηκαν και άλλες MAPEG όπως η συνθάση του λευκοτριένιου C 4 (LTC 4 S), η πρωτεΐνη που ενεργοποιεί την 5-λιποξυγενάση (FLAP) και η συνθάση-1 της προσταγλανδίνης Ε (PGES1). H FLAP είναι μια μη καταλυτική πρωτεΐνη που προσδένεται μη ενζυματικά στο αραχιδονικό οξύ και απαιτείται για να ενεργοποιήσει την 5-λιποξυγενάση, το ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε λευκοτριένιο Α 4 (LTA 4 ). H FLAP φαίνεται να εμπλέκεται επίσης στη σύνθεση του λευκοτριένιου Β 4 (Mandal et al., 2004). Η LTC 4 S έχει δράση τρανσφεράσης της γλουταθειόνης και καταλύει τη σύνθεση του λευκοτριένιου C 4 (LTC 4 ) από την LTA 4 και την ανηγμένη γλουταθειόνη. Η PGES1, που παλαιότερα ονομαζόταν MGST1-L1 λόγω της ομολογίας της με τη MGST1,

23 16 έχει ελάχιστη δράση τρανσφεράσης της γλουταθειόνης με τo LTA 4 ή το CDNB. Σε αντίθεση όμως με τη LTC 4 S και την FLAP που δεν έχουν δράση υπεροξειδάσης, η PGES1 δύναται να ανάγει κουμανικό υδρο-υπεροξείδιο και άλλα υποστρώματα (Thoren et al., 2003). Όμως η κύρια δράση της PGES1 είναι να καταλύει την GSHεξαρτωμένη ισομερίωση του PGD 2 σε PGE 2 (σχήμα 1.3). Επίσης έχουν προταθεί επιπρόσθετοι ρόλοι για τη PGES1 στην εξέλιξη του καρκίνου, την απόπτωση των κυττάρων και τη νόσο του Alzheimer λόγω της ισχυρής της αυξορρύθμισης από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 τόσο σε μια κυτταρική σειρά για τον καρκίνο του παχέος εντέρου όσο και σε αστροκύτταρα αρουραίου παρουσία του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου. Σχήμα 1.3: Εμπλοκή των MAPEG στα μεταβολικά μονοπάτια βιοσύνθεσης των λευκοτριενίων και προσταγλανδινών. Έρευνες βιοπληροφορικής στην EST βάση δεδομένων του ανθρώπου οδήγησαν στην ταυτοποίηση δύο ακόμα ΜΑPEG, των MGST2 και MGST3 (Jacobsson et al., 1996). Με την κλωνοποίηση, τον καθαρισμό και τον χαρακτηρισμό τους και τα δύο ένζυμα βρέθηκαν να καταλύουν τη σύζευξη της GSH στo LTA 4 και άρα τη δημιουργία του LTC 4. Όταν όμως χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα το CDNB μόνο γιa την MGST2 ανιχνεύεται δράση τρανσφεράσης.

24 17 Και τα δύο ένζυμα επιδεικνύουν δράση υπεροξειδάσης στο ότι καταλύουν την GSH-εξαρτώμενη αναγωγή του 5-υδροξυ-υπεροξυ-εικοσατετρανοϊκού οξέος (5- HPETE) σε 5-υδροξυ-εικοσατετρανοϊκό οξύ (5-HETE). Λόγω αυτών των καταλυτικών τους δράσεων, τα δύο αυτά ένζυμα πιθανότατα παίζουν ρόλους τόσο στην αποτοξίνωση από ξενοβιοτικά και στην κυτταρική προστασία απέναντι σε οξειδωτική βλάβη Δομή και λειτουργία των μικροσωμικών GSTs Σε πρώτη ανάλυση, η οικογένεια των MAPEG περιλαμβάνει 13 πρωτεΐνες, 6 θηλαστικών, 4 από φυτά και μύκητες και 3 από τα βακτήρια E. coli, V. Cholera, Synecocistis. Οι 13 αυτές πρωτεΐνες είναι μακρινά ομόλογες με μόνο δύο αμινοξικά κατάλοιπα, την Asn78 και την Arg114, να είναι συντηρημένα σε όλες και το Glu81 να είναι συντηρημένο σε όλες πλην της FLAP (η αρίθμηση έχει γίνει στη βάση της αλληλουχίας της MGST1). Άλλα σχεδόν καθολικά συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα είναι η Pro47 και η Arg74 (συντηρημένα σε όλες πλην της FLAP και δυο βακτηριακών) η Pro85 και η Tyr122 (που δεν βρίσκονται συντηρημένα ανάμεσα στις βακτηριακές) (Jacobsson et al., 1999). Για κάποια εξ αυτών έχει υποτεθεί ένας ειδικός ρόλος στην κατάλυση. Η Arg51 στην LTC 4 S (αντιστοιχεί στην Arg74 της MGST1) πιστεύεται πως είναι ο πρωτονιοδότης για το άνοιγμα του εποξειδικού δακτυλίου της LTΑ 4. Στο ίδιο ένζυμο η Tyr93 έχει ταυτοποιηθεί ως το υπεύθυνο κατάλοιπο για το σχηματισμό του θειολικού ανιόντος της γλουταθειόνης και αντιστοιχεί στην Tyr122 του MGST1 που φαίνεται να κάνει την ίδια δουλειά. Η αρχική ομάδα των 13 MAPEG έχει εν τω μεταξύ επεκταθεί χάρη στις αναλύσεις βιοπληροφορικής σε EST και γενωμικές βάσεις δεδομένων. Συνολικά έχουν βρεθεί 131 διακριτές MAPEG, 52 σε προκαρυώτες και 79 σε ένα ευρύ φάσμα ευκαρυωτικών (Bressel et al., 2005) - ανάμεσά τους 24 έχουν ανιχνευθεί σε φυτά. Και σε αυτή την εκτεταμένη ομάδα MAPEG, κάποια αμινοξικά κατάλοιπα - ανάμεσά τους και αυτά που αναφέρθηκαν παραπάνω είναι συντηρημένα σε όλα σχεδόν τα μέλη.

25 18 Οι μικροσωμικές GSTs αποκλίνουν σημαντικά από τις κυτοσολικές, αφού η αλληλουχική τους ταυτότητα με τις cgsts είναι μικρότερη από 10% και οι υπομονάδες τους είναι μικρότερες με ένα μέσο μήκος περίπου 150 αμινοξέων. Το πιο σημαντικό είναι ότι η δομή τους είναι εντελώς διαφορετική αφού οι MAPEG που μέχρι τώρα έχουν χαρακτηρισθεί έχουν διαμεμβρανικές επικράτειες, τα αμινοκαι καρβοξυ-τελικά τους άκρα προεξέχουν στην εσωτερική πλευρά της μεμβράνης, ενώ οι περιοχές που θεωρούνται ότι συνδέονται με τα υποστρώματα και τη γλουταθειόνη βρίσκονται σε θηλιές προς το κυτταρόπλασμα. Ενώ αρχικά προβλέπονταν οι διαμεμβρανικές επικράτειες να είναι τρεις, νέες ερμηνείες υδροφοβικών αποτυπωμάτων, ενισχυμένες από τη μελέτη τρισδιάστατων δομικών χαρτών, προτείνουν πλέον ότι οι διαμεμβρανικές επικράτειες είναι πιθανότατα τέσσερις (Bressel et al, 2005). Ο τρισδιάστατος χάρτης της MGST1 υποδεικνύει πως το ένζυμο αυτό είναι ομοτριμερές. Σε αντίθεση με τις κυτοσολικές, η MGST1 τόσο του ανθρώπου όσο και του ποντικού προσδένει ένα υπόστρωμα ανά τριμερές, υποδεικνύοντας ότι τα μονομερή της MGST1 δεν είναι κινητικά ανεξάρτητα, αλλά αλληλεπιδρούν για τη δημιουργία του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Από απεικονίσεις δομών των LTC 4 S και PGES1 φαίνεται πως και τα δύο αυτά ένζυμα είναι ομοτριμερή (Thoren et al., 2003). Μέσω αναλύσεων μεταλλάξεων έλλειψης και αντικατάστασης, ταυτοποιήθηκε μια καρβοξυτελική επικράτεια (αμινοξέα ) απαραίτητη ή και ικανή για τον ολιγομερισμό και την επακόλουθη δράση της LTC 4 S, δείχνοντας ότι ο ολιγομερισμός είναι απαραίτητος για τη δομική και καταλυτική σταθερότητα του ενεργού ενζύμου. Αντιθέτως η FLAP μπορεί να υπάρχει και ως τριμερές, διμερές αλλά και μονομερές. Επίσης υπάρχουν ενδείξεις ότι οι υπομονάδες της FLAP και LTC 4 S μπορούν να αλληλεπιδράσουν σχηματίζοντας ετεροδιμερή και ετεροτριμερή, χωρίς όμως να έχει διασαφηνιστεί η σύσταση των ετεροτριμερών (Mandal et al, 2004).

26 19 Σε ό, τι αφορά τις τεταρτοταγείς δομές των MGST2 και MGST3, προς το παρών ελάχιστα είναι γνωστά. Συνοψίζοντας, αρκετές αβεβαιότητες παραμένουν προς το παρόν ως προς τη χωροδιάταξη, τη σύσταση σε υπομονάδες των ολιγομερών και τη μεμβρανική τοπολογία των MAPEGs Μέθοδοι εύρεσης λειτουργίας των GST Οι λειτουργίες των GST ποικίλλουν αρκετά όχι μόνο μεταξύ των διαφόρων κλάσεων αλλά και μέσα στα όρια μιας κλάσης. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης συνέβησαν τόσο θεμελιώδεις όσο και πιο λεπτές αλλαγές στην αλληλουχία και τη δομή τους που οδήγησαν στη λειτουργική ποικιλότητα στα πλαίσια της χημείας, της δράσης ή/και της ειδικότητάς τους με το υπόστρωμα. Γι αυτό στη γκάμα των GSTs που υπάρχουν στη φύση περιλαμβάνονται ένζυμα που καταλύουν αντιδράσεις σύζευξης, αναγωγής και ισομερίωσης καθώς και πρωτεΐνες που δρουν μη ενζυματικά ως προσδέτες-μεταφορείς ή ρυθμιστές μεταγωγής σήματος. Μια ποικιλία προσεγγίσεων, που περιλαμβάνουν την πρόκληση και ανάλυση μεταλλάξεων, βιοχημικές και κινητικές δοκιμασίες με διάφορα υποστρώματα καθώς και κατάρτιση προφίλ έκφρασης και δραστικότητας σε διαφορετικούς ιστούς και στάδια ανάπτυξης, κάτω από ποικιλία συνθηκών, έχουν συμβάλλει στο να διασαφηνιστούν πλατιά λειτουργίες των GSTs (σχήμα 1.4). Με τη βοήθεια των προσεγγίσεων της δομικής βιολογίας έγινε δυνατό να κατανοηθεί, πολλές φορές λεπτομερώς, η αλληλεξάρτηση μεταξύ της πρωτεϊνικής δομής και της λειτουργίας της. Καθορίζοντας το ρόλο συγκεκριμένων αμινοξέων σε κατάλληλες πρωτεϊνικές επικράτειες, οι μελέτες αυτές αποσαφήνισαν τις αρχές που διέπουν τη χημική βάση και την επιλεκτικότητα σε σχέση με το υπόστρωμα για συγκεκριμένα ένζυμα. Γι αυτό το λόγο οι μελέτες αυτές υπήρξαν θεμελιώδεις για την ανάδειξη της μοριακής βάσης σε ό, τι αφορά τη λειτουργική απόκλιση συγγενικών GSTs, ιδιαίτερα όσων ανήκουν στην ίδια κλάση. Η γνώση αυτή βρίσκει εφαρμογές στο να μας εφοδιάσει με κατευθυντήριες γραμμές για τον χειρισμό της φυσικής λειτουργίας ενζύμων μέσω κατευθυνόμενης εξέλιξης.

27 20 Σχήμα 1.4: Παραδείγματα αντιδράσεων που καταλύονται από GSTs παρουσία διαφόρων υποστρωμάτων: a) με CDNB, b) με Sulforaphane, c) με CuOOH, d) με 4-νιτροφαινυλ-οξικό οξύ, e) με Τρινιτρογλυκερίνη, f) με Μαλέυλ-ακετοξικό οξύ, g) με PGH 2. Οι f και g αποτελούν αντιδράσεις ισομερίωσης, οι c και e κλασσικές αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, η d αποτελεί αντίδραση θειόλυσης και οι a, b αποτελούν αντιδράσεις σύζευξης με GSH. (Hayes et al., 2005)

28 21 Πολύ καλό παράδειγμα είναι οι GSTs της Α κλάσης των θηλαστικών που παρουσιάστηκαν παραπάνω. Από τα 5 ανθρώπινα ένζυμα, τα 4 έχουν χαρακτηρισθεί ενδελεχώς. Παρόλο που μοιράζονται υψηλή αλληλουχική ομολογία και τη χαρακτηριστική παρουσία μιας καρβοξυτελικής έλικας (α 9 ) που αναδιπλώνεται προς τα πίσω, προς την αμινοτελική επικράτεια, σε ό, τι αφορά τη σύνδεσή τους με την γλουταθειόνη και ηλεκτρονιόφιλα υποστρώματα, τα 4 χαρακτηρισμένα αυτά ένζυμα δείχνουν αρκετά διακριτές χημικές λειτουργίες και προτιμήσεις υποστρωμάτων. Πιο συγκεκριμένα η GSTA1-1 δείχνει υψηλή καταλυτική δράση με το CDNB αλλά πολύ μικρότερη ικανότητα με αλκενικά υποστρώματα. Αντίθετα η GSTA4-4 δείχνει ως και 200 φορές πιο υψηλή δραστικότητα απέναντι σε τέτοια υποστρώματα σε σχέση με την GSTA1-1. Μια σύγκριση ανάμεσα στα δύο ένζυμα υποδεικνύει ότι οι διαφορετικές προδιαγραφές υποστρώματος εξαρτώνται κυρίως από το σχήμα και τα χαρακτηριστικά της θέσης σύνδεσης του υποστρώματος, που με τη σειρά της καθορίζεται από τη τοποθέτηση και τη διάταξη των αμινοξικών καταλοίπων στα γύρω δομικά στοιχεία, δηλαδή τη β 1 -α 1 λούπα, την καρβόξυτελική περιοχή της α 4 έλικας και το καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεΐνης. Μέσω μεταλλάξεων και δομικών μελετών (Bijornestedt et al., 1995), ταυτοποιήθηκε ένας περιορισμένος αριθμός αμινοξικών καταλοίπων που βρίσκονται μέσα σε αυτά τα δομικά στοιχεία που είναι κρίσιμα για την υψηλή ενεργότητα της GSTA4-4 απέναντι σε αλκένια. Αυτά είναι η Gly12 (Ala στην GSTA1-1) στη β 1 -α 1 λούπα, Ile107 (Leu), Met108 (Leu) και Phe111 (Val) στο τέλος της α 4 έλικας, Pro208 (Met), Tyr212 (Ser), Val213 (Leu), Val 216 (Ala) και Pro222 (Phe) στη καρβοξυτελική περιοχή. Τα περισσότερα απ αυτά τα κατάλοιπα διατηρούνται σε όλες τις GSTs που έχουν υψηλή ενεργότητα απέναντι σε αλκένια. Ιδιαίτερα το κατάλοιπο Tyr212 είναι το καταλυτικό κλειδί και βρίσκεται τοποθετημένο ώστε να αλληλεπιδρά με την αλδεϋδομάδα του αλκενικού υποστρώματος και να το πολώνει προκειμένου να του πραγματοποιηθεί πυρηνόφιλη προσθήκη από τη γλουταθειόνη.

29 22 Η λειτουργία και η σωστή τοποθέτηση της τυροσίνης αυτής θα εμποδιζόταν από την παρουσία οποιασδήποτε πλευρικής ομάδας στο 12 ο κατάλοιπο, πράγμα το οποίο εξηγεί την απαίτηση να βρίσκεται εκεί η γλυκίνη. Αυτό έχει δειχθεί και από μελέτες μεταλλάξεων στη συγκεκριμένη θέση. Επίσης η παρουσία της προλίνης στη θέση 208 συνεισφέρει στην κάμψη της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στη καρβοξυτελικής περιοχή για τη σωστή χωρική τοποθέτηση της Tyr212. Λόγω του μεγάλου αριθμού των μελών της οικογένειας των GSTs, είναι πιθανή η μερική λειτουργική τους επικάλυψη σε ότι αφορά τις λειτουργίες του κάθε οργανισμού όπου εκφράζονται, ειδικά για τις πιο πολυπληθείς τάξεις. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η καταστολή GST γονιδίων -μέσω των λεγόμενων knock out μελετών- δεν είναι πολύ χρήσιμη για τις παραπάνω τάξεις, αλλά έχει δώσει πολύτιμες πληροφορίες για τις πιο ολιγομελείς κλάσεις GSTs, όπως οι κοινές Σ και Ζ, η Α και Π των θηλαστικών και οι MAPEGs. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιων μελετών ήταν αυτές που έλαβαν χώρα κατά τη μελέτη των GSTs Ζ κλάσης. Αυτές οι GSTs εμπλέκονται στο μονοπάτι φαινυλαλανίνης / τυροσίνης, καταλύοντας την ισομερίωση του 4-μηλεϊνυλοακετοξικού οξέος σε 4-φουμαρυλο-ακετοξικό, το προτελευταίο βήμα στον καταβολισμό της τυροσίνης. Η δράση ισομεράσης του μηλεϊνυλο-ακετοξικού οξέος (ΜΑΑΙ) που έχει η mgstz1 επιβεβαιώθηκε in vivo σε ποντίκια με μηδενική mgstz1 τα οποία έχασαν τη δραστικότητά τους απέναντι στη μηλεϊνυλο-ακετόνη και το χλωρο-φθωρο-οξικό οξύ. Τα ζώα αυτά δεν νοσούν κάτω από κανονικές συνθήκες δίαιτας, όμως χάνουν γρήγορα βάρος και τελικά πεθαίνουν όταν τρέφονται με 2% επιπλέον φαινυλαλανίνη (Fernandez-Canon et al., 2002). Καταστολή της παραγωγής (νοκάουτ) mgstz1 διεγείρει την αυξορρύθμιση, δηλαδή την υπερέκφραση των GSTs άλλων κλάσεων, των Α, Μ και Φ (Lim et al, 2004). Είναι αξιοσημείωτο ότι όλα αυτά τα γονίδια GSTs έχουν στους υποκινητές τους στοιχεία (ARE) που ανταποκρίνονται σε αντιοξειδωτικά, όπως η γλουταθειόνη, και στοιχεία (EpRE) που ανταποκρίνονται σε ηλεκτρονιόφιλα, όπως είναι τα υποστρώματα των GST (Hayes et al., 2005).

30 Βιοτεχνολογικές εφαρμογές Λόγω της αρθρωτής δομής τους, τα ένζυμα GST αντιπροσωπεύουν μια πολύ ευπροσάρμοστη πλατφόρμα για την υλοποίηση ενζύμων με νέες βελτιωμένες καταλυτικές ιδιότητες μέσω τεχνικών κατευθυνόμενης εξέλιξης. Αυτό είναι και το πρώτο πεδίο βιοτεχνολογικής έρευνας στις GSTs που μάλιστα προσελκύει πλατύ ενδιαφέρον, ιδιαίτερα στους τομείς της έρευνας για νέα φάρμακα και βιοκαταλύτες. Ένα δεύτερο πεδίο είναι η δημιουργία διαγονιδιακών οργανισμών. Αυτοί μπορούν να συνεισφέρουν σε πολλούς σκοπούς, ανάμεσα στους οποίους είναι: 1) Η κατανόηση γονιδιακών λειτουργιών in vivo, όπως το παράδειγμα που περιγράφηκε παραπάνω. 2) Η δημιουργία «κυτταρικών εργοστασίων» για την παραγωγή συνθετικών ουσιών με εφαρμογές στην ιατρική και την τεχνολογία. 3) Η υλοποίηση οργανισμών με νέα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Ως προς αυτό, φυτά και βακτήρια είναι μέχρι τώρα οι κύριοι στόχοι τέτοιων διαδικασιών. Με σχετικά, λοιπόν, εύκολο τρόπο μπορούν να φτιαχτούν διαγονιδιακά φυτά με νέες GSTs που αναπτύσσουν ανθεκτικότητα απέναντι σε ζιζάνιοκτόνα και ρυπαντές είτε σε σημαντικές σοδειές είτε για την ανάπτυξη ποικιλιών κατάλληλων για φυτοθεραπεία. Στα δε βακτήρια, οι τρέχουσες έρευνες στοχεύουν στη δημιουργία στελεχών ικανών για την αποικοδόμηση τοξικών και καρκινογενών σύνθετων ουσιών. Οπωσδήποτε τα δύο πεδία βιοτεχνολογικής έρευνας που αναφέρθηκαν δεν είναι ανεξάρτητα. Διαγονιδιακοί οργανισμοί μπορούν να δημιουργηθούν με τη χρήση γονιδίων που προήλθαν από μεθόδους κατευθυνόμενης εξέλιξης.

31 Κατευθυνόμενη εξέλιξη Ως προς αυτήν υιοθετούνται δύο κύριες στρατηγικές που συνήθως αναφέρονται ως ορθολογική και στοχαστική. Η ορθολογική σχεδίαση συνίσταται στην εισαγωγή συγκεκριμένων αλλαγών αμινοξικών καταλοίπων στη βάση λεπτομερών πληροφοριών από τις πρωτεϊνικές δομές, τις λειτουργίες και τους καταλυτικούς μηχανισμούς. Η γνώση της χωρικής οργάνωσης του ενεργού κέντρου και των ρόλων των διαφορετικών καταλοίπων που εμπλέκονται στην κατάλυση, απαιτείται για την επιλογή των καταλοίπων-στόχων α. Ορθολογική στρατηγική Η πρώτη επιτυχία μέσω αυτής της στρατηγικής ήταν η ανασχεδίαση της GSTA1-1 Α κλάσης του ανθρώπου. Όπως ήδη έχει αναφερθεί, το ένζυμο αυτό είναι πολύ ενεργό με CDNB αλλά δείχνει μικρή δραστικότητα με αλκεναλικά υποστρώματα, σε αντίθεση με την GSTA4-4. Τα δύο αυτά ένζυμα είναι κατά 53% όμοια από πλευράς αμινοξικής αλληλουχίας. Προσεκτική σύγκριση των ενεργών τους κέντρων έδειξαν ότι 4 κατάλοιπα (Gly12, Ile107, Met108, Phe111) και η καρβοξυτελική έλικα της GSTA4-4 (κατάλοιπα ) είναι κρίσιμα για την υψηλή ενεργότητα απέναντι στις αλκενάλες. Οι αντίστοιχες περιοχές του GSTA1-1 τροποποιήθηκαν αντιστοίχως και, έτσι, ένα νέο ένζυμο δημιουργήθηκε που αντί της πυρηνόφιλης υποκατάστασης (φυσικός μηχανισμός δράσης της GSTA1-1) πραγματοποιούσε πυρηνόφιλη προσθήκη κατά Michael και είχε λοιπόν υψηλή καταλυτική ικανότητα απέναντι σε αλκενάλες. Η νέα ενζυμική δραστικότητα υλοποιήθηκε με κόστος την δραστικότητα σε CDNB, η οποία μειώθηκε περίπου 20 φορές (Nilsson et al., 2000). Έκτοτε ακολούθησαν πολλές επιτυχημένες ανάλογες μελέτες. Για παράδειγμα η ανθρώπινη GSTA1-1 απέκτησε μία εντελώς νέα καταλυτική ικανότητα υδρόλυσης θειολικού εστέρα (όπως του S-βενζοϋλεστέρα της γλουταθειόνης) με την απλή αντικατάσταση της Ala216 από Ιστιδίνη (Hederos et al., 2004).

32 25 Σε μία άλλη έρευνα επετεύχθη η τροποποίηση της H-site της ανθρώπινης GSTA2-2 με την υποκατάσταση πέντε αμινοξέων που οδήγησε στην αλλαγή της δράσης υπεροξειδάσης του ενζύμου σε δράση ισομεράσης στεροειδών (Pettersson et al., 2002). Στη δε GSTF1-1 του καλαμποκιού έγιναν κατορθωτές ουσιώδεις αλλαγές στην εξάρτηση των κινητικών παραμέτρων του ενζύμου από το ph, μέσω προσεκτικά σχεδιασμένων μεταλλάξεων σε κατάλοιπα της G-site του ενζύμου (Λάμπρου και συν., 2004). Επίσης η μετάλλαξη ενός καταλοίπου-κλειδιού και συγκεκριμένα η υποκατάσταση της Ile118 σε Φαινυλαλανίνη στην H-site του ίδιου ενζύμου, οδήγησε σε τέσσερις φορές βελτιωμένη ειδίκευση του ενζύμου απέναντι στο ζιζανιοκτόνο alachlor (Λάμπρου και συν., 2005). Ένα πολύ ενδιαφέρον αποτέλεσμα της εφαρμογής της ορθολογικής στρατηγικής ήταν η δημιουργία μιας GST ικανής να ανάγει το υπεροξείδιο του υδρογόνου, δηλαδή με δράση υπεροξειδάσης τυπική των ενζύμων GPXs. Αυτή η ικανότητα εξαρτάται από την παρουσία μιας σεληνοκυστεΐνης στο ενεργό κέντρο των GPXs. Από τη στιγμή που το αμινοξύ αυτό κωδικοποιείται από το κωδικόνιο λήξης UGA, οι προσπάθειες εισαγωγής τέτοιου καταλοίπου στις GSTs μέσω παραδοσιακών τεχνικών ανασυνδυασμένου DNA υπήρξαν ατελέσφορες. Οι Yu et al. (2005) κατάφεραν να μετατρέψουν την GST κλάσης Δ από τον L. cuprina σε ένα σεληνιούχο ένζυμο, υιοθετώντας την εξής στρατηγική. Αφού αντικατέστησαν την Ser7 του ενεργού κέντρου από μία κυστεΐνη, βιοσυνθετικά την υποκατέστησαν με σεληνοκυστεϊνη σε βακτηριακά αυξοτροφικά ως προς την κυστεΐνη συστήματα. Το νέο σεληνο-lcgst1-1 ένζυμο παρουσίασε μία σημαντικά υψηλή ικανότητα στην αναγωγή του υπεροξείδιο του υδρογόνου, συγκρίσιμη με αυτήν των φυσικών GPXs.

33 β. Στοχαστική στρατηγική Από την άλλη οι στοχαστικές αναλύσεις είναι πολύ ενδιαφέρουσες ως προς το ότι στην ουσία αναπαράγουν in vitro φυσικούς εξελικτικούς μηχανισμούς. Το σημείο έναρξης των στοχαστικών αναλύσεων είναι συνήθως το ανακάτεμα (shuffling) μονογονικού ή πολυγονικού DNA. Με τον τρόπο αυτό δημιουργούνται μεγάλες ανασυνδυασμένες DNA βιβλιοθήκες, οι οποίες κατόπιν εκφράζονται και σκανάρονται για την ενδεχόμενη ύπαρξη νέας και βελτιωμένης ενζυμικής δραστικότητας. Προφανώς οι δυνατότητες shuffling του DNA και οι γενωματικές αποκλίσεις που μπορούν έτσι να επιτευχθούν είναι σχεδόν ατελείωτες, όμως η διαδικασία σκαναρίσματος και εξέτασης είναι εξαιρετικά επίπονες και χρονοβόρες. Παρά τον περιορισμό αυτό και το ότι υπεισέρχεται έντονα ο παράγοντας της τύχης, αρκετά παραδείγματα από τη βιβλιογραφία επισημαίνουν στην επιτυχία μίας στοχαστικής προσέγγισης στην εξέλιξη ενζύμων GSTs με αλλαγμένες λειτουργίες. Με τέτοιες μεθόδους αποκτήθηκαν ένζυμα με τουλάχιστον νέες, αν όχι καλύτερες, καταλυτικές ικανότητες για τις GSTs Μ (Hansson et al., 1999) και Θ κλάσης (Broo et al., 2002). Ειδικά η μελέτη για τις Τ GSTs ανέδειξε τη δύναμη της μεθόδου. Δημιουργήθηκε μία ανασυνδυασμένη DNA βιβλιοθήκη από ανακατεμένες αλληλουχίες γονιδίων ανθρώπινων GSTT1-1 και GSTT2-2 από ποντικό. Λειτουργικός χαρακτηρισμός λιγότερων από 100 τυχαία επιλεγμένων ανασυνδυασμένων κλώνων οδήγησε στην αναγνώριση πάνω από 40 ενζυμικών ποικιλιών με χαρακτηριστικά δραστικότητας απέναντι σε έξι διαφορετικά ηλεκτρονιόφιλα υποστρώματα που διαφέρουν ουσιωδώς από τα αντίστοιχα γονεϊκά γονίδια των ανθρώπινων GSTT1-1 και GSTT2-2 ποντικού. Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα στη συνέχεια βελτιώθηκαν. Όπως και στη φύση, η κατευθυνόμενη εξέλιξη προχωρά μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων μεταλλαξογενέσεων και απομόνωσης των βελτιωμένων μεταλλαγμάτων. Όμως η επιλογή των καλύτερων μεταλλαγμένων γονιδίων από τον ένα κύκλο που με τη σειρά τους θα χρησιμοποιηθούν από έναν επόμενο κύκλο, δεν είναι πάντα προφανής.

34 27 Οι Larsson et al. (2004), έδειξαν πως η χρήση στατιστικών εργαλείων μπορεί να βοηθήσει στην «ορθολογική» πλέον επιλογή των μεταλλαγμένων γονιδίων που θα χρησιμοποιηθούν ως γονεϊκά γονίδια για την επόμενη γενιά χιμαιρικών γονιδίων. Εφαρμόζοντας διασταυρούμενες αναλύσεις διαφορετικών κάθε φορά ομάδων από τις παραπάνω 40 αναγνωρισμένες ποικιλίες στη hgstt1/rgstt2 βιβλιοθήκη, κατάφεραν να αναγνωρίσουν τους πέντε καλύτερους κλώνους γονιδίων, ώστε να ξεκινήσουν ένα δεύτερο κύκλο shuffling. Από την αντίστοιχη βιβλιοθήκη δεύτερης γενιάς απομονώθηκε ένα νέο ένζυμο Θ κλάσης με 65 φορές βελτιωμένη δράση αλκυλοτρανσφεράσης. Αυτό είναι ένα παράδειγμα κατευθυνόμενης εξέλιξης, στο οποίο μία βασικά στοχαστική μέθοδος συνδυάζεται με ένα ορθολογικό βήμα. Επίσης έχουν υλοποιηθεί και άλλοι τέτοιοι συνδυασμοί στρατηγικής, κυρίως για τη βελτίωση των GSTs Τ κλάσης (ZmGSTU1-1 και ZmGSTU2-2) στο καλαμπόκι. Στην περίπτωση αυτή το βέλτιστο χιμαιρικό γονίδιο από επαναλαμβανόμενους κύκλους shuffling αναλύθηκε ως προς την αλληλουχία και τη δομή του για να βρεθούν οι ακριβείς μεταλλάξεις που έλαβαν χώρα βελτιώνοντας τη λειτουργία του κωδικοποιημένου ενζύμου. Η ουσιώδης μετάλλαξη αφορούσε την υποκατάσταση από λευκίνη της γλουταμίνης στην θέση 115 (Q115L) της καρβοξυτελικής επικράτειας. Το συγκεκριμένο γονίδιο υποβλήθηκε και σε ορθολογικά σχεδιασμένες σημειακές μεταλλάξεις σε αυτή τη θέση με αποτέλεσμα τελικά να αυξηθεί η αποτοξινωτική του δράση απέναντι στο ζιζανιοκτόνο fluorodifen 29 φορές σε σχέση με το ZmGSTU2-2, το δραστικότερο φυσικό GST ένζυμο του καλαμποκιού (Dixon et al.,2003).

35 Διαγονίδιακοί οργανισμοί ως προς GSTs Τα πρώτα διαγονιδιακά φυτά ως προς τη GST ήταν καπνά που υπερέκφραζαν μία ενδογενή GST Τ κλάσης (Nt107) με δράση υπεροξειδάσης. Η υπερέκφραση αυτή είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερες δράσεις τρανσφεράσης και υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GST και GPX αντίστοιχα) ούτως ώστε τα διαγονιδιακά αυτά καπνά να είναι πιο ανθεκτικά στο στρές λόγω υψηλών ή χαμηλών θερμοκρασιών, το στρες αλατότητας και την έκθεσή τους σε ζιζανιοκτόνα (Roxas et al., 1997, 2000). Όμως διαγονιδιακό βαμβάκι με την έκφραση του ίδιου Nt107 ενζύμου, παρουσίαζε μεν αυξημένη GST/GPX ικανότητα, δεν έδειχνε όμως ανθεκτικότητα σε παράγοντες οξειδωτικού στρες όπως χαμηλή θερμοκρασία, αλατότητα και τα ζιζανιοκτόνα atrazine και imazetrapyr (Light et al., 2005). Οι ερευνητές υποστήριξαν ότι η είσοδος του ξένου Nt107 προφανώς διατάραζε το ενδογενές σύστημα προσαρμογής στο στρες του βαμβακιού και γι αυτό δεν παρείχε προστασία απέναντι σε οξειδωτικές βλάβες που επάγονταν από το στρες. Και τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν αυτό που είναι πλατιά γνωστό, ότι δηλαδή η σχεδίαση διαγονιδιακών οργανισμών χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή και να λαμβάνονται υπόψη οι ενδογενείς παράγοντες του προς τροποποίηση οργανισμού. Ένα από τα πιο πολλά υποσχόμενα πεδία στην γενετική τροποποίηση φυτών με διαγονίδια GSTs είναι η υλοποίηση της δυνατότητας αποτοξίνωσης από ξενοβιοτικά, όπως ζιζανιοκτόνα και ρυπαντές. Σε μερικά καλλιεργήσιμα ήδη, όπως το καλαμπόκι και σόγια, οι GSTs έχουν ρόλους κλειδιά στον καθορισμό του καταβολισμού των ζιζανιοκτόνων και του περιορισμού της δράσης τους αποκλειστικά απέναντι στα ζιζάνια χωρίς να εγκυμονείται κίνδυνος για την καλλιέργεια. Όμως για πολλές άλλες καλλιέργειες η χρήση ζιζανιοκτόνων είναι εν πολλοίς περιορισμένη λόγω του ότι οι σοδειές δεν διαθέτουν τις απαραίτητες GSTs για την αποτοξίνωση.

36 29 Για παράδειγμα τα καπνά και τα σιτηρά είναι σχετικά ευαίσθητα σε πλατιά χρησιμοποιούμενα ζιζανιοκτόνα, όπως τα θειοκαρβαμιδικά και τα χλωρο-ακετοανιλινοειδή πχ το alachlor. H GSTIV καλαμποκιού, ένα ένζυμο GST Φ κλάσης που είναι πολύ δραστικό απέναντι στο alachlor, εκφράστηκε στο καπνό. Τα διαγονιδιακά καπνά έδειξαν σημαντικά αυξημένη ανθεκτικότητα απέναντι στα θειοκαρβαμιδικά και τα χλωρο-ακετο-ανιλινοειδή ζιζανιοκτόνα (Jepson et al., 1997). Επίσης η ZmGSTIV χρησιμοποιήθηκε και για την γενετική τροποποίηση σιτηρών. Και στην περίπτωση αυτή τα διαγονιδιακά φυτά έδειξαν ανθεκτικότητα απέναντι σε αντίστοιχα ξενοβιοτικά και η ανθεκτικότητα των ομόζυγων διαγονιδιακών φυτών συσχετιζόταν με τα επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου (Milligan et al., 2001). Ακόμα πιο πολλά υποσχόμενες έρευνες επιτεύχθηκαν με την γενετική τροποποίηση του A. Thaliana με τη βελτιωμένη Τ GST του καλαμποκιού που αναφέρθηκε παραπάνω (Dixon et al., 2003). Οι Τ GSTs προστατεύουν τα φυτά από την απώλεια χρώματος που προκαλούν τα διφαινυλεθερικά ζιζανιοκτόνα, όπως το fluorodifen. To A. Thaliana είναι αρκετά ευαίσθητο στο fluorodifen, ίσως επειδή τα επίπεδα έκφρασης Τ GSTs είναι μέτρια. Όντως τα διαγονιδιακά φυτά A. Thaliana που εκφράζουν το βελτιωμένο ένζυμο του καλαμποκιού είναι εμφανώς πιο ανθεκτικό στο fluorodifen σε σχέση με τα μη τροποποιημένα φυτά ή τα τροποποιημένα με τα άγριου τύπου ένζυμα από καλαμπόκι (Dixon et al., 2003). Βιοθεραπεία - ή φυτοθεραπεία αν εμπλέκονται τα φυτά και όχι τα βακτήρια είναι μια γρήγορα αναπτυσσόμενη νέα τεχνολογία που χρησιμοποιεί βακτήρια ή φυτά προκειμένου να απομακρυνθούν ή να αποδομηθούν ρυπαντές από το νερό ή το έδαφος. Ρυπαντές που μπορούν να εξαλειφθούν από την αξιοποίηση GSTs περιλαμβάνουν τοξικά μέταλλα, ραδιενεργά στοιχεία, κατάλοιπα ζιζανιοκτόνων και τοξικές σύνθετες οργανικές ουσίες. Μάλιστα για την καταπολέμηση κάποιων εξ αυτών των ουσιών, κατάλληλα βακτηριακά φυτικά είδη είτε δεν υπάρχουν, είτε επιδεικνύουν χαμηλή ικανότητα αποικοδόμησης. Η «θεραπευτική» τους ικανότητα όμως μπορεί σημαντικά να αυξηθεί με γενετικές μεθόδους.

37 30 Τα χλωριωμένα αιθένια (CE) είναι εξαιρετικά τοξικά και πιθανότατα καρκινογενή σύνθετα και περιλαμβάνονται ανάμεσα στους πιο κοινούς εδαφικούς και υδάτινους μολυσματικούς παράγοντες. Η θεραπεία τους από βακτήρια είναι δύσκολη, αφού το πρώτο βήμα για την αποτοξίνωσή τους, η οξείδωσή τους μέσω μονοξυγενάσης, δημιουργεί εποξειδικά ενδιάμεσα που είναι τοξικά για τα ίδια τα βακτήρια. Από τη στιγμή που τα εποξυ-αιθάνια είναι ηλεκτρονιόφιλα, είναι βάσιμο πως θα μπορούσαν να συζευχθούν στη GSH μέσω GSTs προκειμένου να αποτοξινωθούν βιολογικά. Βασιζόμενοι σε αυτή την υπόθεση, οι Rui et al. (2004) δημιούργησαν ένα στέλεχος του βακτηρίου E. coli στο οποίο συνεκφράζονταν μία στοχαστικά βελτιωμένη μονοξυγενάση του τολουενίου από την Burkholderia cepacia με αυξημένη ικανότητα αποικοδόμησης του cis-διχλωρο-ακετυλενίου (cis-dce), μία καινούρια GST από το Rhodococcus καθώς και μία μεταλλαγμένη συνθετάση της γλουταθειόνης της E. coli που αυξάνει τα επίπεδα της GSH στο γενετικά τροποποιημένο βακτήριο. Το ανασυνδυαμένο βακτηριακό αυτό στέλεχος εξέφραζε ταυτόχρονα 8 γονίδια, 5 φυσιολογικά και τα 3 παραπάνω μέσω της τοποθέτησης των τελευταίων σε κοινό οπερόνιο. Έτσι δημιουργήθηκε ένα τεχνητό μεταβολικό μονοπάτι μέσω του οποίου τα ανασυνδυασμένα βακήρια E. coli μπορούσαν να αποδομήσουν επαρκώς το cis-dce, χωρίς να βλάπτονται από τα εποξυ-αιθάνια, αφού αυτά μπορούσαν να ανάγονται άμεσα από την GST του Rhodococcus. Αυτός ο ορθολογικός συνδυασμός καταβολικών σταδίων καταλυόμενων από ένζυμα διαφορετικών οργανισμών, είναι ένα έξοχο παράδειγμα των δυνατοτήτων της μεταβολικής μηχανικής στη βιοθεραπεία περιβαλλοντικών ρυπαντών (Rugh et al., 1998). Τέλος σκόπιμο είναι να αναφερθεί το γενετικά τροποποιημένο καπνό με το γονίδιο GSTF1 από καλαμπόκι. Το διαγονιδιακό αυτό φυτό έδειχνε σημαντικά υψηλότερη αντοχή στο alachlor σε σχέση με τα άγριου τύπου φυτά. Τα διαγονιδιακά αυτά φυτά πιθανότατα μπορούν να αξιοποιηθούν στη φυτοθεραπεία καλλιεργήσιμων εκτάσεων βεβαρυμμένων με κατάλοιπα ζιζανιοκτόνων που είχαν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες καλλιέργειες (Καραβαγγέλης και συν., 2005).

38 31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ - ΟΡΓΑΝΑ

39 ΥΛΙΚΑ Ο πλασμιδιακός φορέας pcr T7/CT-TOPO που χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση των γονιδίων της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης από το βακτήριο Εrwinia carotovora subsp.atroseptica SCRI1043 καθώς και τα δεκτικά κύτταρα E. coli TOP10F στα οποία πραγματοποιήθηκε η επιλογή, ο πολλαπλασιασμός και η διατήρηση των μετασχηματισμένων πλασμιδίων προήλθαν από το pcr T7/CT- TOPO TA Expression Kit της εταιρείας Invitrogen (USA). Τα κύτταρα E. coli BL21(DE3) που χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση των GST γονιδίων αγοράστηκαν από την εταιρεία Novagene (USA). Ο επαγωγέας έκφρασης ισοπρόπυλο-β-d-θειογαλακτο-πυρανοζίδιο (IPTG), το αντιβιοτικό αμπικιλλίνη καθώς και η αγαρόζη αγοράστηκαν από την εταιρεία Genaxis (UK), η χρωστική Coomasie Blue (G-250) από την εταιρεία Merck (Γερμανία). Το εκχύλισμα ζύμης, η πεπτόνη και το άγαρ από την ισπανική εταιρεία Scharlau (Ισπανία). Το κιτ απομόνωσης DNA από Ε. carotovora ήταν από την Sigma-Aldrich (USA). Οι Extent και η Go-Taq DNA πολυμεράσες και τα dntps αγοράστηκαν από την εταιρεία Promega. To QIAquick TM Mini Prep Kit που χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA αγοράστηκε από την γερμανική εταιρεία Qiagen. Αμπικιλλίνη Ζυγίζεται στο ζυγό σκόνη αμπικιλλίνης και φτιάχνεται πυκνό διάλυμα αμπικιλλίνης 100 mg/ml. Διατηρείται στο ψυγείο. Απ αυτήν θα χρησιμοποιώ 1 μl για κάθε ml θρεπτικού υλικού (δηλαδή για τελική συγκέντρωση Amp 100 μg/ml καλλιέργειας) LB υγρό θρεπτικό μέσο 0,5 % (w/v) εκχύλισμα ζύμης, 1 % (w/v) NaCl, 1 % (w/v) πεπτόνη. Ακολουθεί αποστείρωση. Για στερεό θρεπτικό μέσο προστίθεται 1,5 % (w/v) άγαρ αμέσως μετά την αποστείρωση.

40 33 IPTG 24 mg/ml σε ddh 2 O. Διατηρείται στους -20 ο C. Διάλυμα ΤΒ για την προετοιμασία δεκτικών κυττάρων Τελικές συγκεντρώσεις συστατικών: 10mM MES, 55mM MgCl 2.6H 2 O, 15mM CaCl 2.2H 2 O και 250mM KCl σε ddh 2 O. Το ph ρυθμίζεται στο 6,7 με προσθήκη πυκνού KOH. Το διάλυμα αποστειρώνεται με φίλτρο και αποθηκεύεται στους 4 ο C. Διάλυμα λύσης κυττάρων Αναμιγνύονται 0,1M KH 2 PO 4 με 1mM β-μερκαπτοαιθανόλης (MeSH). Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται στο 7. 50X Ρυθμιστικό Διάλυμα TAE Το 1 Lt περιέχει 24,2 gr Tris-base, 100ml 0,5M EDTA ph 8,0 και 57 ml CH 3 COOH. Βρωμιούχο Αιθίδιο 5 mg/ml σε ddη 2 Ο. Το διαλυμα διατηρείται σε σκουρόχρωμο δοχείο στους 4 ο C. Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης Αναμιγνύονται 10 ml γλυκερόλης 50 % (w/v), 200 μl EDTA από 0,5M ph 8,0 και 25 mg της χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης. Lysis Buffer για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA Για 12 απομονώσεις στα οποία διαμοιράζεται βακτηριακή προκαλλιέργεια, χρησιμοποιούνται: 150 μl 0,5M Tris HCl ph=8, 60 μl 0,5M EDTA ph=8, 75 μl 2M γλυκόζη. Προστίθενται 3 ml ddh 2 O και πραγματοποιείται ανάδευση.

41 34 Διάλυμα NaOH / SDS για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA Για 12 απομονώσεις στα οποία διαμοιράζεται βακτηριακή προκαλλιέργεια, χρησιμοποιούνται: 114 μl 10M NaOH, 568 μl 10% SDS και συμπληρώνουμε με ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 5 ml. Πραγματοποιείται ανάδευση. Επειδή το SDS είναι δυσδιάλυτο, το διάλυμα ζεσταίνεται ελαφρά μέχρι να γίνει διαυγές. Διάλυμα οξικού αμμωνίου (AmAc) για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA Για 12 απομονώσεις, στα οποία διαμοιράζεται βακτηριακή προκαλλιέργεια, χρησιμοποιούνται: 45 μl 10 mg/ml ενζύμου RNAase A, που φυλάσσεται στους - 20 ο C και 4,5 ml 7,5M AmAc ph=7,8.

42 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΟΡΓΑΝΑ Οι προσδιορισμοί της ενζυμικής δραστικότητας των GST ενζύμων έγιναν σε φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης, ορατού-υπεριώδους, μοντέλο U-2000 της ιαπωνικής εταιρείας Hitachi με μήκος οπτικής διαδρομής 10 mm. H υποδοχή της κυψελίδας του οργάνου είναι θερμορυθμιζόμενη μέσω υδραυλικού συστήματος που τροφοδοτείται από υδατόλουτρο. Για τις διάφορες φυγοκεντρήσεις που περιγράφονται παρακάτω, χρησιμοποιήθηκαν οι φυγόκεντροι Heraeus SEPATECH Contrifuge 17RS, Varifuge 20RS και η φυγόκεντρος Heraeus Biofuge primo. Οι μετρήσεις ph των διαλυμάτων πραγματοποιήθηκαν από το phμετρο ORION μοντέλο 410Α. Οι λύσεις των κυττάρων έγιναν με τη χρησιμοποίηση υπερήχων από το όργανο Sonics & Materials Inc. Vibra Cell. Οι ηλεκτροφορήσεις του DNA σε πήκτη αγαρόζης έγιναν στη συσκευή HE 99X της αμερικάνικης εταιρείας Hoefer. Οι ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών σε πήκτη πολυακρυλαμίδης έγιναν σε ψυχώμενη κάθετη συσκευή SE 600 της Hoefer. Το τροφοδοτικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μοντέλο SP 500 x T με παρεχόμενα κανάλια 500 Volt και 400 ma επίσης της εταιρείας Hoefer. Για τον επιχειρημένο καθαρισμό των ενζύμων GST χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφία συγγένειας μέσω στήλης σεφαρόζης με βραχίονα 1,4-βουτανεδιολδιγλυκιδυλ-αιθέρα συνδεδεμένο με γλουταθειόνη. Η στήλη παρασκευάστηκε στο εργαστήριο με διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω.

43 36 Για την διαδικασία PCR (Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) χρησιμοποιήθηκε ο θερμοκυκλοποιητής PE Applied Biosystems Gene Amp Η συγκεκριμένη συσκευή διαθέτει θερμαινόμενο καπάκι και δεν χρειάζεται προσθήκη λαδιού για την τέλεση της αντίδρασης.

44 37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΜΕΘΟΔΟΙ

45 Κατασκευή πηκτώματος αγαρόζης για την ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA. Αραίωση διαλύματος 50Χ ΤΑΕ 50 φορές σε αποστειρωμένο νερό σε τελικό όγκο 50 ml. Διάλυση υπό θέρμανση φούρνο μικροκυμάτων 0,5 g αγαρόζης στο παραπάνω διάλυμα μέσα σε κωνική φιάλη. Αφήνεται το διάλυμα να κρυώσει σε θερμοκρασία περίπου 50 ο C. Κατόπιν προστίθεται 4,5λ βρωμιούχο αιθίδιο. Το διάλυμα αναδεύεται ώστε το βρωμιούχο αιθίδιο να διαλυθεί εντελώς. Το διάλυμα κατόπιν μεταγγίζεται στο ειδικό καλούπι, ώστε να πήξει Πρωτόκολλο της PCR. Τα αντιδραστήρια που τελικά τελεσφόρησαν στην παρούσα εργασία είναι τα παρακάτω: H 2 O 33,3λ Buffer Taq 10λ MgCl 2 3λ dntps (0,2M) 1λ Εκκινητής FGC 0,6λ Εκκινητής RGC 0,6λ μήτρα 1λ Η μήτρα χρωμοσωμικού DNA που χρησιμοποιήθηκε αποτελεί το αραιωμένο 1/10 πρώτο διάλυμα έκλουσης του βήματος 10 απ την διαδικασία απομόνωσης γενωματικού DNA από το βακτήριο Erwinia carotovora με τη χρησιμοποίηση του ειδικού kit της Sigma. Περιγράφεται παρακάτω. Οι δύο εκκινητές που σχεδιάσαμε και χρησιμοποιήσαμε για την απομόνωση και αντιγραφή κάθε γονίδιου και αποτελούνται από 25 νουκλεοτίδια έκαστος:

46 39 Ο εκκινητής FGC είναι συμπληρωματικός στο 3 άκρο της αντικωδικής (μη κωδικής) αλυσίδας του γονιδίου και κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου της PCR θα οδηγήσει στη σύνθεση της κωδικής αλυσίδας του γονιδίου από την DNAπολυμεράση με καλούπι την αντικωδική. O εκκινητής RGC έχει ίδια αλληλουχία με τις 25 πρώτες βάσεις (του 5 άκρου) της αντικωδικής αλυσίδας του γονιδίου και είναι άρα συμπληρωματικός με το 3 άκρο της κωδικής αλυσίδας του γονιδίου. Αυτός κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου της PCR θα οδηγήσει στη σύνθεση της αντικωδικής αλυσίδας του γονιδίου από την DNA-πολυμεράση με καλούπι την κωδική. Οι ποσότητες των εκκινητών που αναγράφονται στο πρωτόκολλο βρέθηκαν ώστε να υπάρχουν για κάθε αντίδραση PCR ~2 pmoles από τον καθένα. Τo διάλυμα που χρησιμοποιώ για τον κάθε εκκινητή είναι 1/10 αραιωμένο σε σχέση με την συγκέντρωση του κατασκευαστή (42 pmol/μl για τον FGC και 40 pmol/μl για τον RGC). Η Extent και η Go-Taq DNA πολυμεράσες λειτουργούν στους 72 ο C και είναι γρηγορότερες της Taq πολυμεράσης. Τελικά χρησιμοποιήθηκε η Go-Taq DNA πολυμεράση. Τελικός όγκος των συστατικών της αντίδρασης είναι τα 50λ, που τοποθετούνται σε φιαλίδια eppendorf χωρητικότητας 0,5 ml κατάλληλα για αντιδράσεις PCR. Ακολούθως αναμειγνύονται καλά σε vortex και φυγοκεντρούνται για λίγο (μερικά δευτερόλεπτα) προκειμένου να συγκεντρωθούν στον πυθμένα του φιαλιδίου όπου μπορούν να αντιδράσουν αποδοτικότερα στις γρήγορες εναλλαγές της θερμοκρασίας κατά το χρονικό διάστημα που παραμένουν στον θερμοκυκλοποιητή. Ο θερμοκυκλοποιητής προγραμματίζεται με το κατάλληλο πρόγραμμα που στη παρούσα εργασία καθορίστηκε να περιλαμβάνει 30 διαδοχικούς επαναλαμβανόμενους κύκλους, στον καθένα από τους οποίους η θερμοκρασία αρχικά ανεβαίνει στους 96 ο C για 2,5 λεπτά (σε αυτή τη φάση αποδιατάσσεται το δίκλωνο DNA), κατόπιν η θερμοκρασία κατεβαίνει για 2 λεπτά στους 43 o C δηλαδή

47 40 σε θερμοκρασία επανυβριδοποίησης κατώτερη των θερμοκρασιών υβριδοποίησης (T m ) των δύο εκκινητών (μας ενημερώνει ο κατασκευαστής σχετικά) προκειμένου αυτοί να υβριδοποιηθούν με τις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες, ακολούθως η θερμοκρασία ανεβαίνει στους 72 ο C για 2 λεπτά όπου δρα η Go-Taq DNAπολυμεράση επιμηκύνοντας τους εκκινητές. Η τελική επιμήκυνση πραγματοποιείται στους 72 ο C για 10 λεπτά. Η αρχική αποδιάταξη όπου προστέθηκε και η DNA-πολυμεράση έγινε στους 72 ο C για 3 λεπτά. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, τα προϊόντα αναλύονται σε πήκτη αγαρόζης. Για την επιλογή του ακριβούς προγράμματος χρειάζεται να ληφθούν υπόψη μια σειρά παράμετροι, να γίνουν δοκιμές και να αξιολογηθούν διάφορα πιθανά λάθη με τη χρήση διαφόρων ελεγκτικών δειγμάτων Ανάπτυξη της σε Ε. carotovora subsp. atroseptica. Αρχικά οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν για δύο ημέρες σε τρυβλία με θρεπτικά υλικά ΜSΜ και LB. Η σύσταση του θρεπτικού υλικού Minimal Salts Media (MSM) είναι η εξής : 6 g/l Na 2 ΗΡΟ 4, 3 g/l ΚΗ 2 ΡΟ 4, 0.5 g/l ΝαCΙ, pη 7.4, 100 g/l ΝΗ 4 C1, pη 7.4, 1.0 Μ ΜgSO 4, 20% (w/ν) D-γλυκόζη, 0.5 Μ CaCl 2. Στη συνέχεια όμως για τις υγρές καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκε μόνο LΒ ως θρεπτικό υλικό. Η καλλιέργεια αναπτύχθηκε σε φιάλες Erlnmeyer με αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο LB περιεκτικότητας 1% (w/v) πεπτόνη, 1% (w/v) εκχύλισμα ζύμης, 0,5%(w/v) ΝaCl. Παρακάτω ακολουθεί η περιγραφή της διαδικασίας: σε 250 ml του θρεπτικού υλικού LΒ εμβολιάστηκαν 40 μl βακτηριακής καλλιέργειας. Η καλλιέργεια αφήνεται για επώαση σε περιστροφικό επωαστήρα (210rpm) στους 30 C για 18h περίπου. Tα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στις 8000 στροφές για 20 min στους 4 C.

48 Πρωτόκολλο απομόνωσης γενωματικού DNA Χρησιμοποιήθηκε το kit από την εταιρεία Sigma-Aldrich. 1) Προθερμαίνουμε ένα υδατόλουτρο ή heating block στους 55 ο C και για θετικά και για αρνητικά κατά Gram βακτήρια. Προθερμαίνουμε άλλο ένα υδατόλουτρο ή heating block στους 37 ο C μόνο για θετικά κατά Gram βακτήρια. Βέβαια η Εrwinia carotovora ανήκει στα αρνητικά κατά Gram βακτήρια, γι αυτό και δεν πραγματοποιήθηκε το τελευταίο βήμα. 2) Εξετάζουμε τα αντιδραστήρια που προμηθεύονται με το kit για τυχούσες καθιζήσεις. Αν υπάρχουν, θερμαίνουμε το αντιδραστήριο που τις παρουσιάζει στους ο C μέχρι να επαναδιαλυθεί το ίζημα. Επαναφέρουμε σε θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση. 3) Για το διάλυμα Dillute Wash Solution Concentrate: Διαλύουμε το συμπυκνωμένο διάλυμα (βρίσκεται διαμοιρασμένο σε 10 minipreps) με 10 ml 95-96% αιθανόλη. Μετά από κάθε χρήση κλείνουμε ερμητικά το καπάκι του αραιωμένου Wash Solution για να αποφευχθεί η εξάτμιση της αιθανόλης. 4) Για τo διάλυμα Reconstitute Proteinase K: διαλύουμε το παρεχόμενο ένζυμο σε σκόνη σε ένα falcon για την παρασκευή stock διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ 20mg/ml. Το διάλυμα αυτό μπορεί να αποθηκευτεί για μερικές μέρες στους 2-8 ο C. Για πιο μακροπρόθεσμη αποθήκευση, το διάλυμα πρέπει να αποθηκεύεται σε δείγματα στους -20 ο C. Εφόσον τα παραπάνω έχουν φτιαχτεί, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για κάθε επόμενη απομόνωση χρωμοσωμικού DNA.

49 42 Κύρια διαδικασία 1) Φυγοκεντρούμε στις rpm για 2 min 1,5 ml από μια καλλιέργεια βακτηρίων που αναπτύχθηκε για ώρες. Απομακρύνουμε εντελώς το θρεπτικό μέσο (υπερκείμενο) και κρατάμε το ίζημα των κυττάρων. 2) Διαλύουμε το ίζημα σε 180 λ του Lyse-T (B6678), που παρέχεται μαζί με το kit. Εάν μας ενδιαφέρει να απομονώσουμε DNA απαλλαγμένο από RNA, τότε προσθέτουμε 20 λ RNAase A Solution (R6148) - που παρέχεται μαζί με το kit - αναδεύουμε σε vortex και επωάζουμε για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στην παρούσα εργασία αυτό το στάδιο πραγματοποιήθηκε. 3) Προσθέτουμε στο δείγμα 20 λ του διαλύματος της πρωτεϊνάσης Κ που παρασκευάσαμε παραπάνω. Αναδεύουμε σε vortex και επωάζουμε για 30 λεπτά στους 55 ο C. 4) Κατόπιν προσθέτουμε 200 λ του Lyse (B8803), αναδεύουμε σε vortex για 15 δευτερόλεπτα και επωάζουμε για 10 λεπτά στους 55 ο C. Ένα αποτελεσματικό ανακάτεμα είναι σημαντικό για αποτελεσματική λύση. 5) Για να ετοιμάσουμε την κολόνα διαχωρισμού που θα χρησιμοποιήσουμε στη διαδικασία: Προσθέτουμε 500 λ του ειδικού διαλύματος προετοιμασίας της κολόνας σε κάθε προσυναρμολογημένη GenΕlute Miniprep κολόνα πρόσδεσης που την έχουμε τοποθετήσει σε ένα σωλήνα συλλογής των 2 ml. Φυγοκεντρούμε στις rpm για 1 λεπτό. Απομακρύνουμε το έκλουμα. Το διάλυμα προετοιμασίας της κολόνας μεγιστοποιεί την πρόσδεση του DNA στην κολόνα. Το διάλυμα προετοιμασίας, η κολόνα πρόσδεσης και οι σωλήνες συλλογής των 2 ml παρέχονται στο kit.

50 43 6) Προσθέουμε 200 λ αιθανόλης (95 100%) στο επωασμένο λελυμένο δείγμα από το βήμα 4 και αναδεύουμε σε vortex για 5-10 sec. Το ομογενές ανακάτεμα είναι σημαντικό. 7) Μεταφέρουμε προσεκτικά το περιεχόμενο του βήματος 6 στην κολόνα πρόσδεσης, όπως την αφήσαμε από το βήμα 5. Έναντι του κινδύνου σπασίματος του DNA κατά τη μεταφορά αυτή, χρησιμοποιούμε μεγάλη πιπέτα. Φυγοκεντρούμε στις 8360 rpm για 1 λεπτό. Πετάμε το σωλήνα συλλογής μαζί με το έκλουμα και τοποθετούμε την κολόνα σε ένα νέο σωλήνα συλλογής των 2 ml. 8) Προσθέτουμε 500 λ του Wash Solution 1 (W0263) παρέχεται στο kit στην κολόνα και φυγοκεντρούμε στις 8360 rpm για 1 λεπτό. Πετάμε το σωλήνα συλλογής μαζί με το έκλουμα και τοποθετούμε την κολόνα σε ένα νέο σωλήνα. 9) Προσθέτουμε 500 λ του Wash solution με την αιθανόλη που παρασκευάσαμε προκαταρκτικά και φυγοκεντρούμε για 3 λεπτά σε μέγιστη ταχύτητα ώστε να στεγνώσει η κολόνα. Πριν εκλούσουμε το DNA, η κολόνα δεν πρέπει να έχει αιθανόλη. Γι αυτό επαναφυγοκεντρούμε ένα επιπλέον λεπτό σε μέγιστη ταχύτητα (αν βλέπουμε εναπομένουσα αιθανόλη στην κολόνα), αφού αδειάσουμε το σωλήνα συλλογής και του ξαναβάλουμε την κολόνα. Τέλος πετάμε το σωλήνα συλλογής και τοποθετούμε την κολόνα σε ένα νέο σωλήνα συλλογής. 10) Βάζουμε 200 λ του διαλύματος έκλουσης Elution Solution (Β6803) παρέχεται στο kit κατευθείαν στο κέντρο της κολόνας. Φυγοκεντρούμε για 1 λεπτό στις 8360 rpm ώστε να εκλουσθεί το DNA. Για να αυξήσουμε την ικανότητα έκλουσης, επωάζουμε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου αφού προσθέσουμε το Elution Solution και κατόπιν φυγοκεντρούμε. Συλλέχθηκε επίσης και μία δεύτερη έκλουση με την επανάληψη του βήματος 10 σε ένα δεύτερο σωλήνα συλλογής. Τα κλάσματα έκλουσης περιέχουν καθαρό γενωμικό DNA.

51 44 Για βραχυπρόθεσμη αποθήκευση συνιστώνται οι 2 8 ο C, ενώ η μακροπρόθεσμη πρέπει να γίνει στους -20 ο C. Να αποφεύγεται εναλλασσόμενο πάγωμα και ξεπάγωμα που προκαλεί σπάσιμο των κλώνων του DNA. Τo Elution Solution βοηθά στη σταθεροποίηση του DNA στις θερμοκρασίες αυτές Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (αλκαλική λύση) Η προκαλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων διαμοιράζεται σε eppendorfs (στη παρούσα εργασία διαμοιράζεται σε 12 eppendorfs) των 1,5 ml. Κάθε eppendorf φυγοκεντρείται στις rpm για 2 λεπτά. Το υπερκείμενο πετιέται και κάθε eppendorf αφήνεται αντεστραμμένο να στεγνώσει για λίγα λεπτά. Προστίθεται σε κάθε eppendorf 200 λ Lysis Buffer και ακολουθεί ισχυρή ανάδευση σε vortex μέχρι να προκύψει ομοιογενές διάλυμα. Κατόπιν με γρήγορες κινήσεις προστίθενται 400 λ NaOH / SDS στα τοιχώματα κάθε eppendorf και τα δείγματα αναδεύονται μέσω τεσσάρων αναστροφών της βάσης (στατό) στην οποία βρίσκονται. Κατόπιν τοποθετούνται σε πάγο για πέντε λεπτά. Λίγο πριν περάσουν 4,5 λεπτά, στο ίδιο αριθμό άλλων eppendorfs με αυτά της προκαλλιέργειας, προστίθενται στο καθένα 45 λ σε 4,5 ml AmAc. Αμέσως μόλις περάσουν τα 5 λεπτά, μεταφέρονται από 300 λ από κάθε eppendorf σε κάθε eppendorf προκαλλιέργειας. Τα δείγματα αναδεύονται με γρήγορες και ήρεμες κινήσεις αναστροφής τους 5 φορές και αφήνονται στο πάγο για άλλα 10 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις rpm για 15 λεπτά. Τα υπερκείμενα παραλαμβάνονται και τοποθετούνται σε νέα eppendorfs, όπου συμπληρώνουμε με 700 λ ισοπροπανόλης στο καθένα. Αναδεύουμε και αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 10 λεπτά.

52 45 Κατόπιν φυγοκεντρούμε στις rpm για 15 λεπτά. Δημιουργείται ίζημα που δεν είναι ευδιάκριτο. Το υποκείμενο πετιέται χωρίς πιπέτα ώστε να μην συμπαρασυρθεί και το ίζημα. Στο ίζημα σε κάθε eppendorf προστίθεται 1 ml 70% αιθανόλης και ακολουθεί σύντομη ανάδευση σε vortex. Κατόπιν φυγοκεντρούμε στις rpm για 8-10 λεπτά. Το υπερκείμενο αποβάλλεται (χωρίς πιπέτα) και το κάθε eppendorf αφήνεται αντεστραμμένο να στεγνώσει για περίπου μία ώρα μέχρι να εξατμιστεί όλη η αιθανόλη. Προσθέτουμε 30 λ αποσταγμένο νερό και αναδεύουμε καλά σε vortex. Τέλος ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 3 λεπτά και το υπερκείμενο, που περιέχει σε σχετικά καθαρή μορφή το πλασμίδιο, τοποθετείται σε νέα eppendorfs και φυλάσσεται στους 4 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί σε σύντομο χρονικό διάστημα Λύση κυττάρων και παραλαβή τον ενζυμικού εκχυλίσματος. Κύτταρα που έχουν παραλειφθεί από καλλιέργεια αιωρούνται, μετά από την ισχυρή τους ανάδευση σε vortex, σε τριπλάσιο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος 0,1 Μ ΚΗ 2 ΡΟ 4 pη 6,5 37 C. Για τη λύση των κυττάρων γίνεται εφαρμογή υπερήχων για 15 δευτερόλεπτα εντός του διαλύματος με την ειδική συσκευή υπερήχων στο 20% της ισχύος της. Ακολουθεί ηρεμία για περίπου 45 δεύτερα. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 4 φορές. Η διαδικασία πραγματοποιείται σε παγόλουτρο (2-4 C) για να αποφευχθεί υπερθέρμανση. Το αιώρημα φυγοκεντρείται στις rpm για 5-10 min στους 4 C και το υπερκείμενο συλλέγεται για περαιτέρω επεξεργασία.

53 Φωτομετρικός προσδιορισμός της GST Η μέτρηση της δραστικότητας της GST βασίζεται στον προσδιορισμό της ταχύτητας σχηματισμού του συμπλόκου GS-CDNB. Η αντίδραση παρακολουθείται φωτομετρικά και υπολογίζεται η απορρόφηση στα 340nm, οφειλόμενη στο σχηματισμό του συμπλόκου GS-CDNB. GSH + CDNB GS-CDNB + HCL Στις κυψελίδες εισάγεται μίγμα επώασης συνολικού όγκου 1ml και αποτελείται από: 90 mm διάλυμα φωσφορικού καλίου (pη 6,5), 2,5 mm GSH (γλουταθειόνη), 1,0 mm CDNB και ένζυμο (GST ως 0.02 units*). Στη παρούσα εργασία στην κάθε κυψελίδα προσθέτουμε 923 λ διαλύματος φωσφορικού καλίου, 33 λ CDNB, 33 λ GSH και 10 λ από το υπερκείμενο που παραλείφθηκε μετά τη λύση των κυττάρων, μέσω της διαδικασίας που περιγράφεται αμέσων πριν, και περιέχει το ένζυμο. Η διαδικασία διαρκεί 2 min και το φωτοφασματόμετρο παίρνει μέτρηση κάθε 6 δευτερόλεπτα. Σε κάθε μέτρηση υπολογίζει και την ταχύτητα κατάλυσης του ενζύμου σε D/min. Υπολογίζουμε το μέσο όρο της ταχύτητας κατάλυσης. Για να προσδιορίσουμε ποσοτικά το σύμπλοκο GS-CDNB χρησιμοποιήσαμε ως συντελεστή μοριακής απόσβεσης την τιμή 9,6 1/mmol x cm και την σχέση: U/ml = (D/min*Vολ) / (Vενζ*9,6*αραίωση ενζύμου) = D/min * 10,42 Όταν γίνεται αναφορά σε ενζυμική μονάδα GST εννοείται η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει τη μετατροπή ενός μmol CDNB σε προϊόν ανά min στους 37 C.

54 Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με τη χρωματομετρική μέθοδο Bradford Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη ικανότητα της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250 να αλλάζει χρώμα όταν αλληλεπιδρά με άλλες πρωτεΐνες υπό την επίδραση όξινου περιβάλλοντος. Η ελεύθερη χρωστική έχει χρώμα καστανό και απορροφά στα 465 nm, ενώ το σύμπλοκο πρωτεΐνης-χρωστικής είναι γαλάζιο και απορροφά στα 595 nm. Η αξιοπιστία της μεθόδου περιορίζεται σε πρωτεϊνικά δείγματα που η συγκέντρωση τους κυμαίνεται μεταξύ των 0,04 mg/ml και 0,20 mg/ml. Συγκεκριμένα η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά 100mg της χρωστικής διαλύονται σε 100ml υδατικού διαλύματος μεθανόλης (50%v/v). Επίσης στο διάλυμα προστίθενται 100ml πυκνού φωσφορικού οξέος (85%v/v). Όλα τα υλικά προστίθενται εντός σκοτεινού δοχείου και το διάλυμα που προκύπτει αποτελεί το πυκνό αντιδραστήριο Bradford, το οποίο διατηρείται σε θερμοκρασία 25 C. Για να προσδιορίσουμε την πρωτεΐνη αραιώνουμε το αντιδραστήριο με νερό σε αναλογία 1/4. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό άγνωστου δείγματος αναμιγνύουμε 950 μl του αντιδραστηρίου Bradford με 50 μl πρωτεΐνης κατάλληλης συγκέντρωσης (2-10 μg) και αφήνουμε για επώαση στους 25 C για 25 min. Στη συνέχεια λαμβάνεται η απορρόφηση στα 595 nm χρησιμοποιώντας διάλυμα αναφοράς που περιέχει όλα τα αντιδραστήρια εκτός της πρωτεΐνης. Με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς η απορρόφηση ανάγεται σε συγκέντρωση πρωτεΐνης (Επιπλέον από την καμπύλη υπολογίζεται ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης). Για το σχεδιασμό της καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιούνται ως πρότυπο γνωστές ποσότητες (2-10 μg) αλβουμίνης από ορό μόσχου (fraction V).

55 Διαπίδυση Προετοιμασία μεμβρανών διαπίδυσης Το ενζυμικό εκχύλισμα πριν τον καθαρισμό υποβάλλεται σε διαπίδυση έναντι 2000 όγκων ρυθμιστικού διαλύματος 0,1 Μ ΚΗ 2 ΡΟ 4, pη 7. Χρησιμοποιείται ημιπερατή μεμβράνη κυτταρίνης με όριο αποκλεισμού 12 kd (Sigma-Aldrich). Η διαδικασία διαρκεί 18-24h και πραγματοποιείται στους 4 C και έχει ως στόχο την απομάκρυνση όλων των ενώσεων μικρού μοριακού βάρους (<12 kda). Οι μεμβράνες διαπίδυσης που χρησιμοποιούνται αγοράζονται σε ρολό από τη Sigma-Aldrich. Για την προετοιμασία τους κόβονται με ψαλίδι κάθε περίπου 1m και εμβαπτίζονται σε διάλυμα 2 lt με 10 gr EDTA και 17 gr NaHCO 3. Εκεί βράζονται για 2 ώρες. Μετά το πέρας του βρασίματος, ξεπλένεται καλά κάθε κομμάτι μεμβράνης με dh 2 O. Διατηρείται στους 4 ο C μέσα σε υδατικό διάλυμα 20% (v/v) αιθανόλη Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) Η ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία SDS έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο του Laemmli (1979) σε ασυνεχές σύστημα ρυθμιστικών διαλυμάτων, που αποτελούνται από: Α) Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων: Tris (0.025Μ) - γλυκίνη (0,192Μ), SDS (0,1% w/v), ph 8,3. Β) Ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού : Tris/HCl (3Μ), pη 8,8. Γ) Ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής επιστοίβαξης : Τris/HCl (0,5Μ), pη 6,8. Δ) Διάλυμα ακρυλαμιδίου: ακρυλαμίδιο (30g, 0,42mol) και Ν, Ν'-μεθυλενο-bisακρυλαμίδιο (0,8g, 5,2 mmol) διαλυμένα σε 100ml νερού.

56 49 Ε) Ρυθμιστικό διάλυμα μετουσίωσης πρωτεϊνικών δειγμάτων: Τris/HCl (0,125Μ) pη 6,8, SDS (4% w/ν), γλυκερόλη (20% v/ν) και β-μερκαπτοαιθανόλη (10% ν/ν) Στ) Διάλυμα SDS (10% w/ν) Ζ) Διάλυμα υπερθειΐκού αμμωνίου (1,5% w/ν) Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκε πηκτή διαχωρισμού και επιστοίβαξης με περιεκτικότητα ακρυλαμιδίου 12,5%. Η διαδικασία παρασκευής της πηκτής επιστοίβαξης και διαχωρισμού είναι η ακόλουθη: Ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού (875μ1) αναμειγνύεται με διάλυμα SDS (70μ1) και διάλυμα ακρυλαμιδίου (2937,5μ1). Το μίγμα αραιώνεται με προσθήκη νερού (2937,5μ1) και στη συνέχεια απαερώνεται με τη βοήθεια αντλίας νερού για 15 min. Μετά την απαέρωση, προστίθενται ΤΕΜΕD (6,25μ1) και υπερθειϊκό αμμώνιο (1,5ml), το μίγμα αναδεύεται ελαφρώς και εισάγεται στο γυάλινο κάθετο καλούπι (1,5mm πάχος και 12cm βάθος). Η επιφάνεια της πηκτής καλύπτεται με διάλυμα βουτανόλης κορεσμένης με νερό και αφήνεται να πολυμεριστεί (1h, C). Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός, απομακρύνεται το διάλυμα της βουτανόλης και αφού ξεπλυθεί με νερό η επιφάνεια της πηκτής εισάγεται η πηκτή επιστοίβαξης, η οποία παρασκευάζεται ως εξής: ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής επιστοίβαξης (~62μ1), αναμειγνύεται με διάλυμα SDS (50μ1) και διάλυμα ακρυλαμιδίου (625μ1). Το μίγμα αραιώνεται με προσθήκη νερού (3450μ1) και στη συνέχεια απαραιώνεται με τη βοήθεια αντλίας νερού για 15 min. Μετά την απαραίωση προστίθεται ΤΕΜΕD (6,25μ1) και υπερθειϊκό αμμώνιο (1,0ml), το μίγμα αναδεύεται ελαφρώς και εισάγεται στο γυάλινο κάθετο καλούπι (1,5 mm πάχος και 4 cm βάθος). Πριν ξεκινήσει ο πολυμερισμός, στην κορυφή της πηκτής εισάγεται κατάλληλος υποδοχέας (χτένα) ώστε να δημιουργηθούν τα κανάλια-θέσεις εισαγωγής των δειγμάτων. Ο πολυμερισμός ολοκληρώνεται σε -30 min (25 C).

57 Προετοιμασία τον δείγματος και ηλεκτροφόρηση κάτω από συνθήκες μετουσίωσης. Πριν την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα συμπυκνώνονται με λυοφιλίωση. Στη συνέχεια, κατάλληλη ποσότητα πρωτεϊνικού δείγματος (~35μg) διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα μετουσίωσης (~10μl) όπου θερμαίνεται στους C. Σε κάθε δείγμα προστίθεται ως μάρτυρας η χρωστική μπλε της βρωμοκρεζόλης (0.02% w/ν). Ακολούθως το πρωτεϊνικό δείγμα εισάγεται στα κανάλια της πηκτής και η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται (20-25 C) σε σταθερή ένταση 30 mα για κάθε πηκτή Βαφή Coomassie Briliant Blue R-250. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται μετά από ηλεκτροφόρηση για την βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών σε συνθήκες μετουσίωσης. Η διαδικασία έχει ως εξής: μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή εμβαπτίζεται σε υδατικό διάλυμα που περιέχει μεθανόλη (40% ν/ν), οξικό οξύ (7% ν/ν) και Coomassie Brilliant Blue R-250 (0,025-0,1% w/ν) όπου και επωάζεται για 10 ώρες περίπου. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται μετά από επώαση για 5 ώρες περίπου στο καθένα από τα παρακάτω δύο υδατικά διαλύματα που περιέχουν: α) μεθανόλη (50% ν/ν) και οξικό οξύ (10% ν/ν) και β) μεθανόλη (5% ν/ν) και οξικό οξύ 7% ν/ν).

58 Παρασκευή στήλης συγγένειας με ακινητοποιημένη GSH με βραχίονα 1,4-βουτανεδιολ-διγλυκιδυλ-αιθέρα. Η Sepharose CL-6B είναι ένας χρωματογραφικός φορέας με εξαιρετικές ιδιότητες απορροής και υψηλή χωρητικότητα για πρωτεΐνες. Ο βραχίονας προβλέπεται να συγκρατεί στο ένα του άκρο την γλουταθειόνη (GSH, που είναι υπόστρωμα της GST). Η στήλη αυτή θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την υπό προϋποθέσεις απομόνωση ενζύμων GST. Σφαιρίδια Sepharose CL-6B τοποθετούνται σε ηθμό και διηθούνται με τη βοήθεια αντλίας κενού. Κατόπιν ξεπλένονται με 120 ml dd H 2 O. Ακολούθως ζυγίζονται περίπου 10 g Sepharose CL 6B. Προσθέτονται 10 ml 0.6M NaOH, ώστε να ιονιστούν οι υδρόφιλες ομάδες της Sepharose CL 6B και έτσι αυτή να ενεργοποιηθεί. Αναδεύονται κυκλικά (16 rpm) για περίπου 2,5 ώρες. Κατόπιν προστίθενται 2 ml 1,4-βουτανεδιολ-διγλυκιδυλαιθέρα (που θα παίξει το ρόλο βραχίονα). Στις ίδιες συνθήκες αναδεύεται κυκλικά για 2 ώρες. Το αιώρημα διηθείται και ξεπλένεται με 150 ml ddh 2 O σε αντλία κενού. Ζυγίζονται 200 mg από την στεγνή Sepharose CL 6B με τον βραχίονα σε ependorf, που θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικό test για την διαπίστωση της ικανότητας πρόσδεσης του γλουταθείου. Διαλύονται 0,614 gr γλουταθείου σε 15 ml ρυθμιστικού φωσφορικών 1M, ph=8. Κατόπιν αναμιγνύεται το διάλυμα αυτό με τον στεγνό προσροφητή που παρασκευάστηκε με την παραπάνω διαδικασία. Η ποσότητα του γλουταθείου που επιλέγεται πρέπει να είναι τουλάχιστον η εικοσαπλάσια σε απόλυτο αριθμό μmoles από τα γραμμάρια της Sepharose CL 6B, αφού τόσο υπαγορεύει η ικανότητα υποκατάστασής του. Αφήνεται υπό κυκλική ανάδευση στις ίδιες συνθήκες για τουλάχιστον 42 ώρες.

59 52 Ζύγιση 200 μg του προσροφητή σε ependorf, δείγμα που θα χρησιμοποιηθεί για τον ποιοτικό του έλεγχο. Ακολουθεί διήθηση και ξέπλυμα με 150 ml ddh 2 O. Ο έτοιμος, στεγνός προσροφητής τοποθετείται σε διάλυμα 20% αιθανόλη, ώστε το διάλυμα να υπερκαλύπτει τον προσροφητή σε ηρεμία. Φυλάσσεται στους 4 ο C. Ακολουθεί ποιοτικός έλεγχος του προσροφητή. Αυτός γίνεται ως εξής: Σε κάθε ένα από τα δύο ependorf με τον προσροφητή από τα δύο διαφορετικά στάδια της παρασκευής του (πριν και μετά την προσθήκη γλουταθείου). Προστίθενται τα εξής: διάλυμα 2 mg Na 2 CO 3 σε 100 μl ddh 2 O και διάλυμα 2 mg χρωστικής Porcion Red HB σε 100 μl DMSO. Η κόκκινη αυτή χρωστική έχει ικανότητα πρόσδεσης στον βραχίονα. Αφήνονται υπό συνεχή κυκλική ανάδευση (20 rpm) σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες. Κατόπιν διηθούνται στην αντλία κενού και ξεπλένονται με ddh 2 O. Τα χρώματα ήταν τα αναμενόμενα, υποδηλώνοντας επιτυχία στην παρασκευή του προσροφητή. Το δείγμα χωρίς GSH ήταν έντονα κόκκινο και αυτό με GSH ήταν σχεδόν λευκό, αφού η προσδεμένη GSH δεν επέτρεπε το ανταγωνιστικό δέσιμο των μορίων της χρωστικής πάνω στον προσροφητή Ένωση των προϊόντων PCR σε πλασμιδιακό φορέα pcr T7/CT-TOPO και μετασχηματισμός των δεκτικών κυττάρων Ε. coli TOP10F με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια Η αντίδραση ένωσης (ligation) των προϊόντων PCR στον πλασμιδιακό φορέα pcr T7/CT-TOPO και ο μετασχηματισμός των δεκτικών κυττάρων Ε. Coli TOP10F με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια, έγινε με την τεχνολογία του TOPO Cloning όπως περιγράφεται στον οδηγό pcr T7/CT-TOPO ΤΑ Expression Kit (Invitrogen). Αναλυτικότερα ακολουθήθηκαν τα τρία παρακάτω στάδια:

60 53 1 ο στάδιο: Ένωση καταλοίπων αδενίνης (Α) στα 3 άκρα του πολυνουκλεοτιδικού PCR προϊόντος προκειμένου να μπορεί να γίνει η ενσωμάτωσή του στον πλασμιδιακό φορέα, που με τη σειρά του παρέχεται ήδη ευθύγραμμος, με συμπληρωματικά προεξέχοντα 3 δεοξυθυμιδινο-κατάλοιπα. Για να γίνει η αντίδραση αυτή, αναμειγνύονται 50 λ PCR προϊόντος με 2 Units Taq DNAπολυμεράσης. Το δείγμα επωάζεται στους 72 ο C για 10 λεπτά, χρονικό διάστημα κατά το οποίο η Taq DNA-πολυμεράση επιμηκύνει με κατάλοιπα δεοξυαδενοσίνης τα 3 άκρα του PCR προϊόντος, λόγω της δραστηριότητας τελικής 3 τρανσφεράσης που έχει, ανεξαρτήτως ακολουθίας. Αυτό το στάδιο στην παρούσα εργασία δεν πραγματοποιήθηκε, αφού η Go-Taq DNA πολυμεράση που χρησιμοποιήθηκε αφήνει τα 3 άκρα του PCR προϊόντος αδενοσινιομένα. 2 ο στάδιο: Κλωνοποίηση του αδενοσινιομένου PCR προϊόντος στον πλασμιδιακό φορέα (TOPO Cloning Reaction). Έτσι σε eppendorf που βρίσκεται σε πάγο αναμειγνύονται 4 λ PCR προϊόντος, 1 λ διάλυμα αλάτων (1,2Μ NaCl, 0,06M MgCl 2 ) και 1 λ απ το πλασμιδιακό φορέα. Για την κλωνοποίηση (ενσωμάτωση) δεν απαιτείται DNA-δεσμάση για την δημιουργία των τελικών 3, 5 φωσφοδιεστερικών δεσμών ανάμεσα στο πλασμίδιο και το προς ανασυνδυασμό PCR προϊόν. Αυτό εξασφαλίζεται από το ότι σε καθένα απ τα 3 άκρα του, ο πλασμιδιακός φορέας έχει προσδεμένη την τοποϊσομεράση Ι του ιού Vaccinia, μέσω ενός ομοιοπολικού δεσμού ανάμεσα στην 3 -υδροξυλομάδα της ακραίας θυμιδίνης και ενός φωσφορυλιωμένου καταλοίπου τυροσίνης (Tyr-274) της τοποϊσομεράσης Ι. Κατόπιν η τοποϊσομεράση Ι καταλύει τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα στην κάθε 5 -φωσφορική ομάδα του PCR προϊόντος και της 3 -υδροξυλομάδας του φορέα με την ταυτόχρονη απελευθέρωση του ενζύμου και την αποφωσφορυλίωσή του, η οποία και εξασφαλίζει την απαραίτητη ενέργεια για την κατάλυση τη δημιουργίας του φωσφοδιεστερικού δεσμού. Το TOPO Cloning λοιπόν εκμεταλλεύεται αυτή την αντίδραση για την επιτυχή και σχετικά αποδοτική κλωνοποίηση PCR προϊόντων.

61 54 Η τοποϊσομεράση Ι φυσιολογικά χρησιμοποιείται από τον ιό Vaccinia προκειμένου να κόψει το DNA του κυττάρου-ξενιστή με τη διάσπαση του φωσφοδιεστερικού δεσμού μετά την αλληλουχία 5 -CCCTT-3 σε μία εκ των δύο αλυσίδων του και σε αυτή τη θέση να ενσωματωθεί το ιικό γενετικό υλικό. (Σχήμα 3.1) Σχήμα 3.1: Οι αλληλουχίες του πλασμιδιακού φορέα pcr T7/CT-TOPO. Τ7 είναι ο υποκινητής του βακτηριοφάγου Τ7, που χρησιμοποιείται για την υπερέκφραση του εισηγμένου γονιδίου προϊόντος PCR. RBS είναι η αλληλουχία από τη μεταγραφή της οποίας θα προκύψει η θέση αναγνώρισης και δέσμευσης της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος για την έναρξη της μετάφρασης από το κωδικόνιο έναρξης του εισηγμένου γονιδίου. Μετά από αυτήν ακολουθεί η θέση εισαγωγής του γονιδίου PCR προϊόντος. V5 epitope είναι η αλληλουχία που κωδικοποιεί το επιτόπιο V5 πεπτίδιο (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) ώστε να μπορεί να γίνει ανίχνευση συντηγμένων πρωτεϊνών με αντι-v5 αντισώματα. 6xHis είναι η αλληλουχία που κωδικοποιεί ένα αμινοτελικό πεπτίδιο 6 Ιστιδινών που επιτρέπουν το καθαρισμό της παραγόμενης πρωτεΐνης μέσω στήλης Ni-NTA. Stop είναι το κωδικόνιο λήξης της μετάφρασης, εφόσον το PCR-προϊόν δεν διαθέτει προκειμένου να εκφραστούν οι επόμενες 2 αλληλουχίες που μόλις αναφέρθηκαν. Τ7 term είναι οι αλληλουχίες λήξης της μεταγραφής του βακτηριφάγου T7. Zeocin και Ampicillin είναι τα γονίδια ανθεκτικότητας στη ζεοκίνη και την αμπικιλλίνη αντίστοιχα. puc origin είναι η θέση έναρξης για την αυτόνομη αντιγραφή του πλασμιδίου εντός βακτηρίων-ξενιστών.

62 55 3 ο στάδιο: Γίνεται μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων Ε. Coli TOP10F. Για να γίνει αυτό, αναμιγνύω με ήπιο τρόπο 25 λ από αυτά τα κύτταρα με 2 λ από το προϊόν της παραπάνω αντίδρασης και άλλα 25 λ κύτταρα με τα υπόλοιπα 4λ από την αντίδραση σε ξεχωριστά eppendorfs. Τα δύο δείγματα επωάζονται 30 λεπτά στον πάγο. Ακολουθεί θερμικό σοκ των βακτηρίων με την επώαση των δύο δειγμάτων στους 42 ο C για 30 δευτερόλεπτα. Αμέσως μετά επιστρέφουν στον πάγο όπου παραμένουν για άλλα 3 λεπτά. Κατόπιν σε κάθε eppendorf προστίθενται 250 λ θρεπτικού μέσου SOC και αφού αναμειχθούν καλά, επωάζονται για 1 ώρα στους 37 ο C υπό οριζόντια ανάδευση στις 200 rpm. Κατόπιν επιστρώνω 100 λ από το eppendorf όπου προστέθηκαν 4 λ από το προϊόν της αντίδρασης cloning σε ένα τρυβλίο και 200 λ από το άλλο eppendorf σε ένα άλλο τρυβλίο, με την παρουσία φλόγας. Και τα δύο τρυβλία περιέχουν στέρεο LB θρεπτικό μέσο με παρουσία αντιβιοτικού αμπικιλλίνη. Αφού περάσουν περίπου 10 λεπτά κάτω από την φλόγα ώστε να στεγνώσουν, τα τρυβλία επωάζονται για ώρες στους 37 ο C. Οι αποικίες βακτηρίων που θα προκύψουν θα είναι ανθεκτικές στην αμπικιλλίνη και άρα θα έχουν μετασχηματιστεί με το πλασμίδιο pcr T7/CT- TOPO που περιέχει γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό αυτό. Kύτταρα Ε. coli TOP10F μετασχηματισμένα με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pcr T7/CT- TOPO χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA, το οποίο υποβλήθηκε σε αλληλούχιση (MWG, Γερμανία) για την επιβεβαίωση της σωστής νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Τα κύτταρα Ε. coli TOP10F, ο ευθύγραμμος πλασμιδιακός φορέας pcr T7/CT- TOPO και τα διάφορα διαλύματα, όπως το διάλυμα αλάτων του 2 ου σταδίου και το SOC θρεπτικό μέσο, παρέχονται από την Invitrogen.

63 Αρχές εξασφάλισης σωστού προσανατολισμού στην ένθεση του γονιδίου στον φορέα pcr T7/CT-TOPO Κατόπιν, από προκαλλιέργειες των βακτηριακών κλώνων (αποικιών) που θα προκύψουν, ακολουθεί απομόνωση πλασμιδιακού DNA και πέψη του με κατάλληλη περιοριστική ενδονουκλεάση (HindIII, BstBI, AgeI, PmeI ή XbaI μιας και η θέση αναγνώρισης τους αντιπροσωπεύεται μια φορά στο συγκεκριμένο πλασμίδιο). Η περιοριστική αυτή ενδονουκλεάση πρέπει να επιλεχθεί κατάλληλα ώστε να κόβει και μέσα στο γονίδιο (PCR product). To προϊόν της πέψης αναλύεται σε πήκτη αγαρόζης 1% (w/v). Από την απόσταση και το επίπεδο των ζωνών στην πήκτη μπορούμε να διαπιστώσουμε ποιοι κλώνοι έχουν ενσωματώσει το γονίδιο με κατάλληλο προσανατολισμό ώστε να μπορεί αυτό να εκφραστεί αργότερα, δηλαδή θα πρέπει το 5 άκρο της κωδικής αλυσίδας να βρίσκεται προς τον υποκινητή του βακτηριοφάγου T7 που περιέχει ο συγκεκριμένος φορέας. Οι κλώνοι που έχουν μετασχηματιστεί με το ανασυνδυαμένο πλασμίδιο θα δίνουν προφανώς 2 ζώνες στη πήκτη αγαρόζης γιατι το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο κόβεται από το επιλεχθέν περιοριστικό ένζυμο σε δύο θέσεις, μία μέσα στο γονίδιο και μία μετά το πλασμίδιο. Βακτηριακοί κλώνοι που δίνουν μία μόνο ζώνη έχουν ενσωματώσει μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Στην περίπτωση που το γονίδιο είναι σχετικά μικρό (κάτω από 650 ζεύγη βάσεων), όπως συμβαίνει και στην παρούσα μελέτη, αφενός μειώνεται πολύ η πιθανότητα ένα από τα παραπάνω περιοριστικά ένζυμα να αναγνωρίζει εντός του γονιδίου, αφετέρου δυσκολεύει η εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων από τον διαχωρισμό των διαφορετικών τμημάτων DNA στην ηλεκτροφόρηση, αφού αυτά θα έχουν μικρή απόκλιση στο μέγεθός τους.

64 57 Στην περίπτωση αυτή προχωράμε σε τυχαία επιλογή 12 βακτηριακών κλώνων TOP10F, απομονώνουμε το πλασμιδιακό DNA απ αυτούς, προχωρούμε στο μετασχηματισμό κυττάρων E. coli BL21 (DE3) και τα καλλιεργούμε με επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου και ακόλουθη ανίχνευση του γονιδιακού προϊόντος στις καλλιέργειες από αποικίες που είχαν ενσωματώσει με σωστό προσανατολισμό το εν λόγω γονίδιο, διαπιστώνοντας εκ των υστέρων τον σωστό αυτό προσανατολισμό Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli BL21 με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και διαδικασία ετερόλογης έκφρασης του γονιδίου GST σε αυτά Από προκαλλιέργειες των βακτηριακών κλώνων (αποικιών) Ε. Coli TOP10F που θα προκύψουν από την παραπάνω διαδικασία, ακολουθεί απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Από stock δεκτικών BL21 κυττάρων που έχουμε φτιάξει μεταφέρουμε 75 λ βακτηρίων σε αντίστοιχο αριθμό eppendorfs, όσες και οι αποικίες από τις οποίες απομονώσαμε πλασμιδιακό DNA. Από κάθε eppendorf που περιέχει πλασμιδιακό DNA προερχόμενο από μία αποικία βακτηρίων, μεταφέρουμε 1,5 λ πλασμιδιακού DNA στα 75 λ βακτηρίων και αριθμούμε προσεκτικά τα eppendorfs. Αφήνονται στον πάγο για 30 λεπτά. Υπόκεινται σε heat shock στους 42 ο C για 90 δευτερόλεπτα. Μεταφέρονται αμέσως ξανά στον πάγο και μετά από 2-3 λεπτά προστίθεται υπό φλόγα 300 λ LB στο καθένα eppendorf. Επωάζονται υπό οριζόντια ανάδευση (>130rpm) για 60 λεπτά. Κατόπιν βάζω το περιεχόμενο κάθε eppendorf σε αντίστοιχο 5 ml θρεπτικό υλικό LB παρουσία Amp. Οι προκαλλιέργειες επωάζονται στους 37 ο C για ώρες. Aπό κάθε προκαλλιέργεια μεταφέρονται 2 ml σε αντίστοιχο falcon που περιέχει 28 ml LB + Amp.

65 Διαδικασία ετερόλογης έκφρασης Μετά από λεπτά λαμβάνεται δείγμα από κάθε καλλιέργεια (1 ml) και φωτομετρείται στα 600 nm. Χρησιμοποιείται ως μάρτυρας θρεπτικό υλικό LB + Amp πριν τον εμβολιασμό του. Επαναλαμβάνονται οι μετρήσεις κάθε περίπου 15 λεπτά. Όταν η Απορρόφηση κάθε καλλιέργειας φθάσει 0,6 προστίθεται IPTG για τελική του συγκέντρωση 1 mm. Κατόπιν κάθε καλλιέργεια επωάζεται για 4 ώρες στους 37 ο C. Κάθε καλλιέργεια φυγοκεντρείται σε ψυχομένη φυγόκεντρο (στους 4 ο C) στις 8000 rpm για 20 λεπτά. Απορρίπτεται το υπερκείμενο, κάθε falcon αφήνεται ανεστραμμένο για 2 λεπτά και το ίζημα (τα κύτταρα BL21 που περιέχουν GST) στους -20 ο C Μακροπρόθεσμη αποθήκευση βακτηριακών κυττάρων. Μονή αποικία βακτηριακού στελέχους αναπτύσσεται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB (συνήθως παρουσία αντιβιοτικού για ανθεκτικό στέλεχος) στους 37 ο C για ώρες υπό συνεχή ανάδευση στις 250 rpm. Από την καλλιέργεια αυτή 500 λ μεταφέρονται σε eppendorf στο οποίο προστίθενται 500 λ γλυκερόλης 50% (v/v). Ακολουθεί καλή ανάμειξη. Τα δείγματα κυττάρων αποθηκεύονται στους -80 ο C.

66 59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

67 Απομόνωση των διαφορετικών ισοτύπων των γονιδίων που κωδικοποιούν τρανσφεράσες της γλουταθειόνης Βιοϋπολογιστική ανάλυση. Στην Erwinia carotovora εντοπίζονται τουλάχιστον έξι γονίδια που φαίνεται να κωδικοποιούν τρανσφεράσες της γλουταθειόνης. Σκοπός ήταν η κλωνοποίηση και η ετερόλογη έκφραση των γονιδίων αυτής της οικογένειας στο βακτήρια E. coli. Κατόπιν τα ένζυμα αυτά θα μπορέσουν να χαρακτηρισθούν και να μελετηθούν ως προς την κινητική τους συμπεριφορά και την ενεργότητά τους σε διαφορετικά υποστρώματα και υπό διάφορες συνθήκες. Τα γονίδια που επιλέχτηκαν από την E. carotovora subsp. Atroseptica SCRI1043 για μελέτη και οι αντίστοιχοι κωδικοί κατάθεσης (σε παρένθεση είναι οι συντομογραφίες που δόθηκαν) στη βάση δεδομένων NCBI είναι: Glutathione S transferase Probable glutathione S transferase Glutathione S transferase Putative glutathione S transferase Putative glutathione S transferase Putative glutathione S transferase YP_ (PaGST1) YP_ (PaGST2) YP_ (PaGST6) YP_ (PaGST3) YP_ (PaGST4) YP_ (PaGST5) Αρχικά οι αλληλουχίες υποβλήθηκαν σε αμινοξική στοίχιση όπως φαίνεται στην Εικόνα 4.1. Οι ομοιότητα σε αμινοξικό επίπεδο φαίνεται στον Πίνακα 4.1. Είναι φανερό ότι οι αλληλουχίες διαθέτουν χαμηλά ποσοστά ομοιότητας.

68 61 Εικόνα 4.1. Στοίχιση των αλληλουχιών των GST ενζύμων που επιλέχτηκαν από την E. carotovora subsp. Atroseptica SCRI1043 για μελέτη και το αντίστοιχο φυλογενετικό δέντρο. Η στοίχιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL W.

69 62 Πίνακας 4.1. Σύγκριση των GST ενζύμων που επιλέχτηκαν από την E. carotovora subsp. Atroseptica SCRI1043 για μελέτη. Όνομα Μέγεθος αλληλουχίας Όνομα Μέγεθος αλληλουχίας Score PaGST1 209 PaGST PaGST1 209 PaGST PaGST1 209 PaGST PaGST1 209 PaGST PaGST1 209 PaGST PaGST2 230 PaGST PaGST2 230 PaGST PaGST2 230 PaGST PaGST2 230 PaGST PaGST3 214 PaGST PaGST3 214 PaGST PaGST3 214 PaGST PaGST4 228 PaGST PaGST4 228 PaGST PaGST5 208 PaGST Για την κλωνοποίηση των παραπάνω γονιδίων η διαδικασία που ακολουθήθηκε μπορεί να αναλυθεί σε επιμέρους βήματα: 1) Αρχικά απομονώθηκαν οι έξι διαφορετικοί ισότυποι των γονιδίων που κωδικοποιούν τρανσφεράσες της γλουταθειόνης από το γονιδίωμα της Erwinia carotovora μέσω της μεθόδου PCR.

70 63 2) Κατόπιν κλωνοποιήθηκαν αυτά τα γονίδια στον πλασμιδιακό φορέα pcr T7/CT-TOPO και κατόπιν μετασχηματίστηκαν κύτταρα E. coli TOP10F με τους ανασυνδυασμένους φορείς. 3) Από την καλλιέργεια αυτών των κυττάρων σε στέρεο θρεπτικό υλικό επιλέχθηκαν 12 αποικίες για κάθε διαφορετικό ισότυπο. Από αντίστοιχες προκαλλιέργειες των αποικιών αυτών απομονώθηκε το πλασμιδιακό DNA. 4) Κατόπιν μετασχηματίστηκαν με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια δεκτικά κύτταρα E. coli BL21 DE3. Τα κύτταρα αυτά καλλιεργούνται σε υγρές καλλιέργειες, όπου γίνεται επαγωγή έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου με IPTG. 5) Από το εκχύλισμα των κυττάρων αυτών μετρήθηκε η δραστικότητα του αντίστοιχου ενζύμου μέσω του προσδιορισμού της ταχύτητας σχηματισμού του συμπλόκου GS-CDNB που προσδιορίζεται φωτομετρικά Απομόνωση γενωματικού DNA από Erwinia carotovora Για να προχωρήσω στην απομόνωση έπρεπε να απομονώσουμε το γενωματικό DNA του βακτηρίου Erwinia carotovora. Για να γίνει αυτό χρησιμοποίησα το αντίστοιχο kit της Sigma-Aldrich, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα δύο κλάσματα έκλουσης που παραλήφθηκαν με τη μέθοδο απομόνωσης του γενωματικού DNA αναλύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης, προκειμένου να διαπιστωθεί η απομόνωση του γενετικού υλικού (Σχήμα 4.1).

71 64 Σχήμα 4.1. Ανάλυση γενωματικού DNA του βακτηρίου Erwinia carotovora. Φαίνονται τα περιεχόμενα σε δύο διαφορετικές ποσότητες από κάθε κλάσμα έκλουσης Αντίδραση PCR για την απομόνωση και την ενίσχυση των γονιδίων των διαφορετικών ισοτύπων της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης από γενωματικό DNA Στην συνέχεια για την απομόνωση και ενίσχυση των 6 αυτών γονιδίων από το γενωματικό DNA του βακτηρίου E. carotovora, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της PCR. Δοκιμάστηκε και αξιολογήθηκε μια πληθώρα συνθηκών (κυρίως η θερμοκρασία επανυβριδοποίησης του γενωματικού DNA με τους εκκινητές) και συγκεντρώσεων των συστατικών μέχρι να έχω το επιθυμητό αποτέλεσμα. Το πρωτόκολλο το οποίο ήταν επιτυχημένο παρουσιάζεται στις μεθόδους. Αρχικά σχεδιάστηκαν τα ζεύγη εκκινητών και για τα 6 γονίδια της οικογένειας με τον τρόπο που περιγράφεται στις μεθόδους. Αυτοί παραγγέλθηκαν και κατασκευάστηκαν από την γερμανική Eurofins MWG GmbH. Παρακάτω ακολουθούν τα αντίστοιχα ζεύγη εκκινητών με πρώτο τον FGC και δεύτερο τον RGC. Για τον ισότυπο YP_049688: 5 ΑΤG CTT AAC GCT CAG TTG ACG CTT A- 3 5 TCA GGT TGT CTT ACA CAT TGA GTC T- 3

72 65 Για τoν ισότυπο YP_051134: 5 ATG ATT GAC CTG TAT TAC GCA CCA A- 3 5 TTA CTG CTC GGC TAG CTG GTA AGC C- 3 Για τον ισότυπο YP_050035: 5 ATG AAA CTG TTT TAC AAA GCT GAA A- 3 5 TTA TCC TTT CAA CCT TTC AAC TTT A- 3 Για τον ισότυπο YP_050807: 5 ATG ATA CAC GTT CAT CAC CTC GAA A- 3 5 TTA ATC CTG AGC AAG AGC CCG TTG A- 3 Για τον ισότυπο YP_050882: 5 ATG TAT CAG TTG TAC ATC GCC AAT A- 3 5 TTA CGC GCG AGT GCG AAA ATC CTC T- 3 Στην επόμενη σελίδα (Σχήμα 4.2.) παρουσιάζεται η ανάλυση σε πήκτη αγαρόζης των προϊόντων PCR και για τα 6 γονίδια. Στην 1 η θέση ο marker, στην 3 η για τον ισότυπο YP_049179, στην 4 η για τον ισότυπο YP_049688, στην 5 η για τον ισότυπο YP_050807, στην 6 η για τον ισότυπο YP_050882, στην 7 η για τον ισότυπο YP_ και στην 8 η για τον ισότυπο YP_ Χρησιμοποιήθηκε η ίδια θερμοκρασία επανυβριδοποίησης (43 ο C) και 1λ αραιωμένη 1/10 μήτρα γενωματικού DNA.

73 66 Σχήμα 4.2. Ανάλυση σε πήκτη αγαρόζης των προϊόντων PCR για τα έξι γονίδια. Στην 1 η θέση ο marker, στην 3 η για τον ισότυπο YP_049179, στην 4 η για τον ισότυπο YP_049688, στην 5 η για τον ισότυπο YP_050807, στην 6 η για τον ισότυπο YP_050882, στην 7 η για τον ισότυπο YP_ και στην 8 η για τον ισότυπο YP_ Παρατηρούμε ότι ενώ υπήρξε πολύ καλό επίπεδο ενίσχυσης για τα γονίδια και των 6 ισοτύπων, υπάρχουν και άλλα παραπροϊόντα PCR για τους ισοτύπους YP_ και YP_ (5 η και 6 η θέση αντίστοιχα). Αυτό σημαίνει ότι οι εκκινητές σε αυτή τη θερμοκρασία επανυβριδοποίησης (43 ο C) υβριδοποιούνται ασθενώς και σε άλλες εν μέρει συμπληρωματικές αλληλουχίες, με αποτέλεσμα να αντιγράφονται ασθενώς και άλλες αλληλουχίες. Για το λόγο αυτό επαναλαμβάνεται η διαδικασία PCR μόνο για την απομόνωση και ενίσχυση των γονιδίων των δύο αυτών ισοτύπων, αυτή τη φορά σε θερμοκρασία επανυβριδοποίησης 47 ο C, ώστε να μειωθεί ο υβριδισμός με λιγότερο συμπληρωματικές αλληλουχίες στο γενωματικό DNA της E. carotovora. Στην επόμενη σελίδα (Σχήμα 4.3) παρουσιάζεται η ανάλυση σε πήκτη αγαρόζης των προϊόντων PCR για τα 2 αυτά γονίδια. Στην 1 η θέση ο marker, στην 3 η το προϊόν PCR για τον ισότυπο YP_ και στην 5 η θέση το προϊόν PCR για τον ισότυπο YP_

74 67 Σχήμα 4.3. Ανάλυση σε πήκτη αγαρόζης των προϊόντων PCR. Στην 1 η θέση ο marker, στην 3 η το προϊόν PCR για τον ισότυπο YP_ και στην 5 η θέση το προϊόν PCR για τον ισότυπο YP_ Πλέον τα προϊόντα PCR και για τους ισοτύπους YP_ και YP_ είναι αρκούντως καθαρά για να προχωρήσουμε στην κλωνοποίησή τους σε πλασμιδιακούς φορείς pcr T7/CT-TOPO Κλωνοποίηση των προϊόντων PCR στον φορέα pcr T7/CT-TOPO και μετασχηματισμός των δεκτικών κυττάρων Ε. coli TOP10F με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια Η διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν έχουν περιγραφεί αναλυτικά στις μεθόδους και καταλήγουν στην απομόνωση πλασμιδιακού DNA από 12 βακτηριακούς κλώνους Ε. coli TOP10F. Παρακάτω παρουσιάζονται οι αναλύσεις σε πηκτή αγαρόζης του πλασμιδιακού DNA αυτών των βακτηριακών κλώνων σε κάθε περίπτωση ανασυνδυασμού του με το αντίστοιχο γονίδιο των 6 διαφορετικών ισοτόπων (Σχήμα 4.4).

75 68 Α (YP_049179) Β (YP_049688) Γ (YP_051134) Δ (YP_050035) Ε (YP_050807) ΣΤ (YP_050882) Σχήμα 4.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από 12 βακτηριακούς κλώνους Ε. coli TOP10F.

76 Προσδιορισμός ενεργότητας των διαφόρων ισοτύπων τρανσφερασης της γλουταθειόνης μετά την ετερόλογη έκφραση στα κύτταρα E. coli BL21 DE3. Επιλεγμένοι κλώνοι χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό δεκτικών κυττάρων E. coli BL21 DE3. Μετά την ανάπτυξη της καλλιέργειας και η απορρόφηση κάθε καλλιέργειας φθάσει 0,6 προστίθεται IPTG για τελική του συγκέντρωση 1 mm. Κατόπιν κάθε καλλιέργεια επωάζεται για 4 ώρες στους 37 ο C. Κάθε καλλιέργεια φυγοκεντρείται σε ψυχομένη φυγόκεντρο (στους 4 ο C) στις 8000 rpm για 20 λεπτά. Για τη λύση των κυττάρων γίνεται εφαρμογή υπερήχων για 15 δευτερόλεπτα εντός του διαλύματος με την ειδική συσκευή υπερήχων. Το αιώρημα φυγοκεντρείται στις rpm για 5-10 min στους 4 C και το υπερκείμενο συλλέγεται και πραγματοποιείται δοκιμασία Bradford και φωτομετρικός προσδιορισμός των διαφόρων ισοτύπων τρανσφερασης της γλουταθειόνης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 4.2 και σχηματικά στο σχήμα Πίνακας 4.2. Συγκριτικός πίνακας για την ενεργότητας με χρήση CDNB/GSH σαν σύστημα υποστρωμάτων. Ισότυποι GSTs της Er. car. Αριθμός κλώνου Units /ml Ειδική δραστικότητα YP_ Νο 5 2,28 0,21 YP_ Νο 4 0,02 0,0018 YP_ Νο 4 0,22 0,036 YP_ Νο 4 0,036 0,00259 YP_ Νο 2 0,66 0,051 YP_ Νο 2 0,13 0,031 Ακολούθως στα δείγματα πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS). Τα αποτελέσματα φαίνονται στα Σχήματα

77 70 Σχήμα 4.5. Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) του εκχυλίσματος από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) με το γονίδιο YP_ Στη θέση 1 (από αριστερά) φαίνεται το δείγμα και στη θέση 2 είναι το control (μετασχηματισμένα E. coli BL21 (DE3) με τυφλό πλασμίδιο). Σχήμα 4.6. Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) του εκχυλίσματος από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) με το γονίδιο YP_ Στη θέση 1 και 2 (από αριστερά) φαίνεται το δείγμα και στη θέση 3 είναι το control (μετασχηματισμένα E. coli BL21 (DE3) με τυφλό πλασμίδιο).

78 71 Σχήμα 4.7. Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) του εκχυλίσματος από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) με το γονίδιο YP_ Στη θέση 2 (από αριστερά) φαίνεται το δείγμα και στη θέση 1 είναι το control (μετασχηματισμένα E. coli BL21 (DE3) με τυφλό πλασμίδιο). Σχήμα 4.8. Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) του εκχυλίσματος από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) με το γονίδιο YP_ Στη θέση 1 (από αριστερά) φαίνεται το δείγμα και στη θέση 2 είναι το control (μετασχηματισμένα E. coli BL21 (DE3) με τυφλό πλασμίδιο).

79 72 Σχήμα 4.9. Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) του εκχυλίσματος από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) με το γονίδιο YP_ Στη θέση 1 (από αριστερά) φαίνεται το δείγμα και στη θέση 2 είναι το control (μετασχηματισμένα E. coli BL21 (DE3) με τυφλό πλασμίδιο). YP_ (209) YP_ (230) YP_ (214) YP_ (228) YP_ (208) YP_ (202) Σχήμα Συγκεντρωτική ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) των εκχυλισμάτων από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) για όλους τους διαφορετικούς ισότυπους GST γονιδίων (σε παρένθεση ο αριθμός των αμινοξέων τους). Αριστερά ο marker.

80 73 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Σχήμα Συγκριτικός αναπαράσταση της ειδικής δραστικότητας των επιλεγμένων GSTs. H ενζυμική ενεργότητα προσδιορίστηκε με χρήση CDNB/GSH σαν σύστημα υποστρωμάτων.

81 74 Ακολούθως έγινε προσπάθεια καθαρισμού των ισότυπων από E. carotovora με εφαρμογή χρωματογραφίας συγγένειας σε προσροφητή με ακινητοποιημένη GSH και βραχίονα 1,4-βουτανεδιολ-διγλυκιδυλ-αιθέρα. Ο προσροφητής συντέθηκε χρησιμοποιώντας ως φορέα Sepharose CL 6B. Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης ο προσροφητής δοκιμάστηκε για την ικανότητα του να καθαρίζει ανασυνδυασμένες GSTs χρησιμοποιώντας σα μοντέλο το ισοένζυμο GSTA1-1 από άνθρωπο. Οι συνθήκες προσρόφησης και πλύσεων ήταν 20mM KH 2 PO 4, ph=7 και η έκλουση πραγματοποιήθηκε εκλεκτικά χρησιμοποιώντας 10 ml του ρυθμιστικού που περιέχει διαλυμένη 10 mm GSH. Τα αποτελέσματα μετά το χρωματογραφικό καθαρισμό φαίνονται στο Σχήμα 4.12 από το οποίο φαίνεται η αποτελεσματικότητα του προσροφητή. Ακολούθως επιχειρήθηκε να πραγματοποιηθεί καθαρισμός των ισότυπων από E. carotovora στον ίδιο προσροφητή. Χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες συνθήκες προσρόφησης 20mM KH 2 PO 4, ph=7. Σε όλες τις προσπάθειες που έγιναν ο προσροφητής δεν ήταν αποτελεσματικός στην προσρόφηση του ενζύμου κάτι το οποίο μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικά δομικά χαρακτηριστικά των ισότυπων από E. carotovora. Σχήμα Ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία δωδεκανοθειϊκού νατρίου (SDS) του καθαρισμού του ενζύμου hgsta1-1 από μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3). Στην δεύτερη θέση φαίνεται οι μάρτυρες μοριακής μάζας, στην τέταρτη θέση το cruder, στην πέμπτη θέση το μη προσροφημένο κλάσμα. Στις υπόλοιπες τρεις θέσεις βλέπουμε τα κλάσματα των εκλούσεων.