Μοριακή μελέτη και έλεγχος αντοχής σε αντιιικά φάρμακα, στελεχών ιών γρίπης Α απομονωθέντων στη Β. Ελλάδα.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Β ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ ΚΑΘ. Β. ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥ- ΔΑΛΑΪΝΑ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αρ.Διατριβής 2724 Μοριακή μελέτη και έλεγχος αντοχής σε αντιιικά φάρμακα, στελεχών ιών γρίπης Α απομονωθέντων στη Β. Ελλάδα. ΑΓΓΕΛΙΚΗ ΜΕΛΙΔΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

2 ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Β. ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥ-ΔΑΛΑΙΝΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ε. ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Σ. ΑΛΕΞΙΟΥ-ΔΑΝΙΗΛ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Β. ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥ-ΔΑΛΑΙΝΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ε. ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Σ. ΑΛΕΞΙΟΥ-ΔΑΝΙΗΛ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Φ. ΦΡΑΝΤΖΙΔΟΥ-ΑΔΑΜΟΠΟΥΛΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Γ. ΓΚΙΟΥΛΑ, ΛΕΚΤΟΡΑ Ν. ΜΑΛΙΣΙΟΒΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Λ. ΣΙΧΛΕΤΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΓΗΣ 2

3 «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, άρθρ και ν. 1268/82, αρθρ.50 8) 3

4 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 4

5 5 Στην οικογένειά μου

6 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 10 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Εισαγωγή Ταξινόμηση των ιών της γρίπης Ορθοβλεννοϊοί Ιοί Γρίπης Τύποι των ιών γρίπης Ονοματολογία Δομή του σωματιδίου του ιού Σχήμα κατασκευή Μοριακή δομή ιών γρίπης Α Παθογόνος δράση Συμπτώματα και επιπλοκές Συμπτώματα της γρίπης των πτηνών Παθογένεια Επιδημιολογία Αντιγονική εκτροπή και μεταβολή Επιδημιολογικά στοιχεία πανδημικών στελεχών Εργαστηριακή διάγνωση Άμεση και ταχεία διάγνωση Καλλιέργεια του ιού Απομόνωση-Τυποποίηση Ορολογικές μέθοδοι για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων Μοριακή επιδημιολογική διερεύνηση Προφύλαξη και θεραπεία Εμβολιασμός Εμβόλια σε χρήση

8 7.1.2 Εμβόλια υπό έρευνα Εμβόλια έναντι της γρίπης των πτηνών Προβληματισμοί για τη χρήση εμβολίων Αντιιικά φάρμακα Αναστολείς της μητρικής πρωτεΐνης Αναστολείς της νευραμινιδάσης Αντιιική προστασία έναντι της γρίπης των πτηνών Αντιιικά φάρμακα υπό έρευνα Εργαστηριακός έλεγχος ανθεκτικότητας σε αντιιικά φάρμακα Παγκόσμια Παρακολούθηση Γρίπης.. 55 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Σκοπός Υλικό Μέθοδοι Ταχεία Ανίχνευση Απομόνωση RNA από το κλινικό δείγμα Ανάστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Υποτυποποίηση των ιών γρίπης Α με nested RT-PCR Καλλιέργεια και Απομόνωση ιών Γρίπης Κυτταροκαλλιέργεια Καλλιέργεια σε εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας Έλεγχος ανάπτυξης ιού με δοκιμασία αιμοσυγκόλλησης (ΗΑ) Τυποποίηση με αναστολή αιμοσυγκόλλησης (ΗΑΙ) Μοριακή ανάλυση των ιών γρίπης Α(Η3Ν2) Απομονωση RNA από τις καλλιέργειες των ιών Α(Η3Ν2) Ανάστροφη μεταγραφή - Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης

9 3.3.3 Καθαρισμός προϊόντος PCR Ανεύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων προιόντος PCR (DNA sequencing) Πρωτόκολλο της πορείας του δείγματος στο εργαστήριο Συμμετοχή του Εργαστηρίου σε εξωτερικούς ποιοτικούς ελέγχους Αποτελέσματα Αποτελέσματα ταχείας ανίχνευσης και τυποποίησης ιών γρίπης Α και Β με ποσοτική RT-PCR (real time reverse transcription-pcr) Αποτελέσματα υποτυποποίησης ιών γρίπης Α με RT-PCR (reverse transcription-pcr) Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) Αποτελέσματα καλλιεργητικής απομόνωσης ιών γρίπης Α(Η3Ν2) Αποτελέσματα της ενίσχυσης τμήματος των γονιδίων της ΗΑ, Μ2 και ΝΑ πρωτεΐνης Αποτελέσματα διαδικασίας ανεύρεσης της αλληλουχίας των ενισχυμένων τμηματων των ΗΑ, Μ2 και ΝΑ Αποτελέσματα του μοριακού ελέγχου των στελεχών γρίπης Α(Η3Ν2) Μοριακός έλεγχος στελεχών Α(Η3Ν2) περιόδου Μοριακός έλεγχος στελεχών Α(Η3Ν2) περιόδου Μοριακός έλεγχος στελεχών Α(Η3Ν2) περιόδου Αποτελέσματα μοριακού ελέγχου της ευαισθησίας στα αντιιικά φάρμακα Συζήτηση Συμπεράσματα Περίληψη Summary Βιβλιογραφία

10 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ- ΕΛΛΗΝΙΚΑ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, Polymerase Chain Reaction Αιμοσυγκολλητίνη, Haemagglutinin Αιμοσυγκόλληση, Haemagglutination Αναστολή Αιμοσυγκόλλησης, Haemagglutination inhibition Ανάστροφη μεταγραφή, Reverse Transcription Διδεοξυριβονουκλεοτιδίων Ιικό RNA, viralrna Μη δομική πρωτεΐνη 1, Non structural protein 1 Μη δομική πρωτεΐνη 2, Non structural protein 2 Mητρική πρωτεΐνη, matrix protein Mητρική πρωτεΐνη 1, matrix protein Mητρική πρωτεΐνη 2, matrix protein Νευραμινιδάση, Neuraminidase Νουκλεοπρωτεΐνη, Nucleoprotein Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας, World Health Organisation Ριβονουκλεοπρωτεϊνη, Ribonucleoprotein Συμπληρωματικό RNA, Complementary RNA PCR HA HA HAI RT dntps Vrna NS1 NS2 M M1 M2 NA NP Π.Ο.Υ. RNP crna ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑΓΓΛΙΚΑ Basic Local Alignment Search Tool Centre for Disease Control and prevention Dulbecco s Modified Eagles Medium European Influenza Surveillence Scheme Extracellular signal Regulated Kinase Foetal Calf Serum Health Protection Agency Heamagglutinin-esterase fusion protein Influenza-like illness Madin-Darby canine kidney Mitogen Activated Protein Kinase National Centre for Biotechnology Information Νuclear export protein Phosphate Buffered Saline BLAST CDC DMEM EISS ERK FCS HPA HEF ILI MDCK MAPK NCBI NEP PBS 10

11 Protein kinase C Receptor Restroying Enzyme RNA polymerase Transforming Growth Factor-β Quality Control for Molecular Diagnostics PKC RDE PB1, PB2, PA TGF-β QCMD ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Αλανίνη, Alanine Ala A Αργινίνη, Arginine Arg R Ασπαραγίνη, Asparagine Asn N Ασπαρτικό οξύ, Aspartic acid Asp D Βαλίνη, Valine Val V Γλουταμίνη, Glutamine Gln Q Γλουταμικό οξύ, Glutamic acid Glu E Γλυκίνη, Glycine Gly G Θρεονίνη, Threonine Thr T Ισολευκίνη, Isoleucine Ile I Κυστεϊνη, Cysteine Cys C Λευκίνη, Leucine Leu L Λυσίνη, Lysine Lys K Μεθιονίνη, Methionine Met M Προλίνη, Proline Pro P Σερίνη, Serine Ser S Τρυπτοφάνη, Tryptophan Trp W Τυροσίνη, Tyrosine Tyr Y Υστιδίνη, Histidine His H Φαινυλαλανίνη, Phenylalanine Phe F 11

12 Πρόλογος Η γρίπη αποτελεί λοιμώδες νόσημα γνωστό από την εποχή του Ιπποκράτη. Οφείλεται στον ομώνυμο ιό που διαχωρίζεται σε 3 τύπους, Α, Β και C, και ανήκει στην οικογένεια των ορθοβλεννοϊών. Από αυτούς πλέον παθογόνος θωρείται ο τύπος Α, ο οποίος ευθύνεται για την τυπική γρίπη που εκδηλώνεται με υψηλό πυρετό, ρίγη, κεφαλαλγία, μυαλγίες και συμπτώματα προσβολής του ανώτερου και κατώτερου αναπνευστικού. Ο ιός της γρίπης είναι από τους πιο πολυσυζητημένους ιούς, απασχολώντας την ιατρική κοινότητα με τις εποχικές επιδημίες, που απειλούν κάθε χρόνο τον πληθυσμό. Σήμερα απασχολεί εκ νέου με την απειλή μιας νέας πανδημίας. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του, να αποτελείται από 8 κατακερματισμένα τμήματα RNA τον κάνει ευάλλωτο σε μεταλλάξεις. Έτσι κάθε χρόνο κυκλοφορούν διαφορετικά στελέχη ιών παγκοσμίως, με παραλλαγμένα χαρακτηριστικά, διαφορετική παθογόνο δράση, άλλοτε άλλη αντίδραση σε αντιιικά φάρμακα κτλ. Είναι άλλωστε γνωστή η αναγκαιότητα της ετήσιας αναθεώρησης του αντιγριπικού εμβολίου. Η προσπάθεια για παρακολούθηση των ιών που κυκλοφορούν έχει ενταθεί και είναι πλεον οργανωμένη, με τον ΠΟΥ (Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας) να έχει επεκτείνει το δίκτυό του σε 94 χώρες με 122 Εθνικά Κέντρα Γρίπης που λαμβάνουν σαφείς οδηγίες για τις μεθόδους απομόνωσης και τυποποίησης των ιών. Οργανώνονται πολυάριθμα συνέδρια και σεμινάρια κάθε χρόνο με θέμα την διάγνωση, την πρόληψη, τη θεραπεία και την έρευνα πάνω στον ιό της γρίπης, στα οποία λαμβάνουν μέρος ιατροί και βιολόγοι των Κέντρων Γρίπης με τη παρότρυνση και πολλές φορές τη χορηγεία του EISS (European Influenza Surveillence Scheme). Στην Ελλάδα το ΚΕΕΛΠΝΟ έχει αναλάβει το ενημερωτικό και οργανωτικό μέρος και τα δύο Εθνικά Κέντρα Γρίπης, της Βόρειας και της Νότιας Ελλάδας το διαγνωστικό και ερευνητικό μέρος, έτσι ώστε και η χώρα μας να συμμετέχει ενεργά στην προσπάθεια του ΠΟΥ. Η μελέτη αυτή εκπονήθηκε στο Μοριακό Τμήμα του Β Εργαστηρίου Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης όπου φιλοξενείται και το Εθνικό Κέντρο Γρίπης Βορείου Ελλάδας. Για τη συμβολή τους στην εκπόνηση της διατριβής ευχαριστώ θερμά: 12

13 Την επιβλέπουσα Καθηγήτρια Μικροβιολογίας και Ιολογίας και Διευθύντρια του Β Μικροβιολογικού Εργαστηρίου, κ. Βασιλική Κυριαζοπούλου-Δαλαΐνα για την ανάθεση του θέματος και τις ιδέες της. Την ευχαριστώ περισσότερο από όλα για την εμπιστοσύνη της, τις συμβουλές της και την καθοδήγησή της σε όλα τα στάδια της διατριβής. Η βαθιά της γνώση και η θέλησή της να μας τη μεταβιβάσει αποτέλεσε για μένα σημαντική πηγή έμπνευσης, παράδειγμα και βοήθεια αυτά τα χρόνια. Την ευχαριστώ βαθύτατα για την ειλικρίνειά της και για το πραγματικό της ενδιαφέρον. Την Καθηγήτρια κ. Ευδοξία Δίζα-Ματαυτσή, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, ευχαριστώ για το αμείωτο ενδιαφέρον της, την επίβλεψή της και τις καίριες παρατηρήσεις της κατά τη διόρθωση της εργασίας. Την Καθηγήτρια κ. Στέλλα Αλεξίου-Δανιήλ, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη θετική της συμβολή κατά τη διάρκεια της διατριβής. Ευχαριστώ τα μέλη της επταμελούς επιτροπής κ Φραντζίδου, κ Μαλισιόβα, κ Σιχλετίδη και κ Γκιούλα για την τιμή που μου έκαναν να συμμετέχουν στη διδακτορική μου διατριβή και για το χρόνο που μου διέθεσαν. Πολλές ευχαριστίες επίσης στον Κο Μπένο και τους συνεργάτες του για την προθυμία τους να μου διαθέσουν χρήσιμα επιδημιολογικά στοιχεία. Τους συνεργάτες μου στο Β Εργαστήριο Μικροβιολογίας, κ Μαρία Εξηντάρη, κ. Γεωργία Γκιούλα, κ. Χατζηδημητρίου Δημήτρη για τις συζητήσεις, τη συμπαράστασή τους και τις χρήσιμες συμβουλές τους, καθώς επίσης και την παρότρυνσή τους όταν χρειαζόταν. Επίσης τις συνεργάτες μου, κ. Εύα Βούλτσου, κ. Λία Μπουλομύτη και κ. Χρύσα Δούμα για τη θετική τους ενέργεια και τη βοήθειά τους. Τέλος ολόψυχα ευχαριστώ τον σύζυγό μου, Πάνο Αλμπάνη, που είναι πάντα δίπλα μου σε όποιον στόχο και αν έχω βάλει τα τελευταία 7 χρόνια. 13

14 1. Εισαγωγή Από το 412 π.χ., που ο Ιπποκράτης περιέγραψε τη γρίπη, το νόσημα αυτό έχει απασχολήσει σε μεγάλο βαθμό την επιστημονική κοινότητα και εξακολουθεί να βρίσκεται στο προσκήνιο με τη μόνιμη 1 απειλή τυχόν πανδημίας. Ο διεθνής όρος Influenza που χρησιμοποιείται για τη γρίπη προέρχεται από το λατινικό influentia. Οι αστρολόγοι του 16 ου αιώνα απέδιδαν την εμφάνιση της γρίπης στην επίδραση των ουράνιων σωμάτων, στην προσπάθειά τους να εξηγήσουν την εποχική έξαρση της νόσου κάθε χρόνο στις ίδιες περιοχές. 2 Περιγραφές κάποιων χαρακτηριστικών της νόσου και της μετάδοσής της, μεταξύ του 1500 και του 1800 μ.χ., συμφωνούν με την κλινική εικόνα που σήμερα, περιγράφεται ως γρίπη. Επιδημίες αναφέρονται σχετικά συχνά αλλά σε άτακτα χρονικά διαστήματα, έχουν διαφορές στη βαρύτητά τους, εμφανίζουν συνήθως μεγάλη θνησιμότητα στις προχωρημένες ηλικίες, και κάποιες από αυτές (όπως του 1781 και του 1830) φαίνεται ότι εξαπλώθηκαν από τη Ρωσία και την Κίνα. 1 Η ιδιόμορφη επιδημιολογία των ιών της γρίπης με τις 31 πιθανές πανδημίες ανά τους αιώνες από τις οποίες οι 12 αποδεδειγμένες, διατηρούν αμείωτο το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. 3 Από τους τρεις τύπους του ιού της γρίπης, ο τύπος Α κυρίως απασχολεί τη διεθνή κοινότητα προκαλώντας επιδημίες, σποραδικά κατ έτος κρούσματα, εκτεταμένες επιδημίες αλλά και πανδημίες ανά τους αιώνες. 3 Από το 1997 που εμφανίστηκαν στην Κίνα σποραδικά κρούσματα γρίπης βαριάς μορφής από ιούς πτηνών απ ευθείας μεταδιδόμενους σε ανθρώπους, η γρίπη απασχολεί εκ νέου σοβαρά τον ΠΟΥ (Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας) για τον κίνδυνο εμφάνισης νέας πανδημίας. 4 Οι ιοί αυτοί των πτηνών συνεχίζουν μέχρι σήμερα να προσβάλλουν πτηνά και ανθρώπους και σε άλλες περιοχές εκτός της Κίνας. Το συνεχώς μεταβαλλόμενο γονιδίωμα των ιών της γρίπης, καθώς επίσης και τα αναπάντητα ερωτηματικά σχετικά με το ρόλο του κάθε γονιδίου στην παθογένεια, την επιλογή του ξενιστή και σε άλλα χαρακτηριστικά του ιού, καθιστά απαραίτητη τη συνεχή παρακολούθησή τους. Επομένως η μελέτη της μοριακής δομής των 14

15 ιών της γρίπης συμβάλλει καθοριστικά στην πρόληψη, την πρόγνωση και την αντιμετώπιση των ετήσιων επιδημιών αλλά και μιας νέας τυχόν πανδημίας. 15

16 2. Ταξινόμηση των ιών της γρίπης 2.1 Ορθοβλεννοϊοί Ιοί γρίπης Ανήκουν στους βλεννοϊούς (myxoviruses) όπου περιλαμβάνονται οι οικογένειες των ορθοβλεννοϊών, των παραβλεννοϊών και η υποοικογένεια των πνευμοϊών. Οι βλεννοϊοί εκτός των ιών που προσβάλουν τον άνθρωπο περιλαμβάνουν και ιούς ζώων (χοίρων, ίππων, πτηνών κ.τ.λ.). 5 Στην οικογένεια των ορθοβλεννοϊών ανήκουν εκτός από τους γνωστούς ιούς της γρίπης και οι thogotoviruses που αλλιώς ονομάζονται ιοί γρίπης D Τύποι των ιών γρίπης Οι ιοί της γρίπης διακρίνονται σε τρεις τύπους Α, Β και C και μπορούν να διαχωριστούν με βάση τις αντιγονικές διαφορές της μητρικής τους πρωτεΐνης, καθώς επίσης και του νουκλεοκαψιδίου τους, ενώ διαχωρίζονται και σε υπότυπους με βάση τις γλυκοπρωτεΐνες τους. Οι ιοί της Γρίπης Α φαίνεται να έχουν μεγαλύτερη γενετική αστάθεια στις γλυκοπρωτεΐνες τους σε σχέση με τους ιούς της Γρίπης Β. Οι ιοί γρίπης C έχουν 7 μόρια RNA αντί των 8, στερούνται της νευραμινιδάσης (ΝΑ) και έχουν μόνο μία γλυκοπρωτεΐνη, την HEF (heamaglutinin-esterase fusion protein). Εκτός αυτών έχουν παρατηρηθεί και μορφολογικές διαφορές στους διάφορους τύπους του ιού. 1,3,6 Η ριβονουκλεοπρωτεΐνη (RNP) του ιού, που αποτελεί το «συνδέον το συμπλήρωμα» αντιγόνο των ιών αυτών, γνωστό και ως διαλυτό αντιγόνο (soluble-s antigen), διαφέρει σε κάθε έναν από τους τύπους Α, Β και C. Ο κάθε τύπος επίσης διαθέτει διαφορετική μητρική πρωτεΐνη (matrix protein, Μ) και διαφορετικές πρωτεΐνες νουκλεοκαψιδίου. Οι ιοί γρίπης Β δεν διαθέτουν την μητρική πρωτεΐνη 2, γεγονός που καθιστά ανενεργά για αυτούς τα φάρμακα που στοχεύουν τη μητρική πρωτεΐνη 2 (Μ2). 1,3,6 Ακόμη μια διαφορά μεταξύ των τύπων είναι ότι ενώ οι ιοί της γρίπης Α προσβάλλουν κυρίως πτηνά, τον άνθρωπο και διάφορα άλλα είδη θηλαστικών όπως χοίρους, αιλουροειδή και άλογα, οι ιοί της 16

17 γρίπης Β έχουν βρεθεί μόνο σε ανθρώπους και οι ιοί της γρίπης C έχουν βρεθεί σε ανθρώπους και σε χοίρους στην Κίνα. 1,3,6 Οι ιοί της γρίπης Α, όπως προαναφέρθηκε, χωρίζονται σε υπότυπους ανάλογα με τις γλυκοπρωτεΐνες τους, την αιμοσυγκολλητίνη (Haemagglutinin, ΗΑ) και τη νευραμινιδάση (Neuraminidase, ΝΑ). Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 16 τύποι ΗΑ (Η1-16) και 9 τύποι ΝΑ (Ν1-9). 6,7 Όλοι οι υπότυποι κυκλοφορούν στα άγρια υδρόβια πτηνά, στα οποία ο ιός έχει καταφέρει να προσαρμοστεί πολύ καλά ώστε να αποτελούν το φυσικό του ξενιστή. Από τους υπότυπους αυτούς μόνο οι Η1, Η2, Η3 και οι Ν1, Ν2 σε συνδυασμούς μεταδίδονταν μέχρι το 1997 στους ανθρώπους, αποτελούν δηλαδή ανθρώπεια στελέχη του ιού. Πρόσφατα έχει αναγνωριστεί μικρής έκτασης προσβολή ανθρώπων και από τους υποτύπους Η5, Η7, Η9 και Ν7 χωρίς όμως να επιβεβαιωθεί ευχέρεια μετάδοσης των ιών που τις φέρουν από άνθρωπο σε άνθρωπο Ονοματολογία Με βάση τις προτάσεις του ΠΟΥ στην ονοματολογία των στελεχών ιών γρίπης περιλαμβάνονται οι παρακάτω πληροφορίες : - Ο αντιγονικός τύπος του ιού (Α, Β ή C) - Η γεωγραφική προέλευση του στελέχους - Ο εργαστηριακός αριθμός του στελέχους - Το έτος της απομόνωσης του στελέχους - Για στελέχη ιών γρίπης Α προστίθεται ο τύπος της αιμοσυγκολλητίνης και της νευραμινιδάσης σε παρένθεση, π.χ. Α/Thessaloniki/85/2007 (H3N2) - Για ιούς γρίπης των ζώων προστίθεται και το είδος του ζώου από το οποίο απομονώθηκε ο ιός, π.χ. A/chicken/Thailand/CU-K2/2004 (H5N1) 17

18 3. Δομή του σωματιδίου του ιού 3.1 Σχήμα κατασκευή Τα σωματίδια των ιών της Γρίπης περιέχουν 1% RNA, 70% πρωτεΐνες, 20% λιπίδια και 5-8% υδατάνθρακες. Έχουν διάμετρο nm και το σχήμα τους μπορεί να είναι σφαιρικό, απιοειδές, ελλειπτικό ή νηματοειδές με κύριο χαρακτηριστικό την πολυμορφία και την ανομοιογένεια, ιδιαίτερα στα φυσικά στελέχη. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των ιών της Γρίπης καθορίζονται από τη γενετική σύσταση τους, όπως επίσης και από τον τύπο του κυττάρου μέσα στο οποίο αναπαράγεται ο ιός. Τα γονίδια που παίζουν ρόλο στη μορφολογία του ιού δεν έχουν προσδιοριστεί ακόμα. 1 Στο εσωτερικό του ιού βρίσκεται το γενετικό υλικό του, που αποτελείται από οχτώ τμήματα μονόκλωνου RNA. Τεσσάρων ειδών πρωτεΐνες περιβάλλουν το γενετικό υλικό του ιού και αποτελούν το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό του σύμπλεγμα. Οι πρωτεϊνες αυτές είναι η νουκλεοπρωτεΐνη (Nucleoprotein, NP) και οι τρεις πολυμεράσες του ιού. Η NP περιβάλλει το RNA και είναι η επικρατέστερη πρωτεϊνη του νουκλεοκαψιδίου. Κάθε μονάδα NP περικλείει 20 νουκλεοτίδια RNA. Το σύμπλεγμα των τριών RNA πολυμερασών του ιού, PB1, PB2 και PA, απαντάται σε αντίγραφα ανά ιικό σωματίδιο. 9 Μια άλλη μη δομική πρωτεΐνη του ιού, η NS2 (Non structural protein 2), συνδέεται με τη μητρική πρωτεΐνη, την Μ1(Matrix protein 1), του ιού και παίζει ρόλο στην εξαγωγή του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλέγματος από τον πυρήνα του ξενιστή κυττάρου κατά την αναπαραγωγή του ιού. Έχει προταθεί να αλλαχτεί η ονομασία της NS2 σε NEP (Νuclear Εxport Protein) λόγω αυτής της λειτουργίας της. Η ΝS2 βρίσκεται σε αντίγραφα ανά ιϊκό σωματίδιο. 3,9 Μια στιβάδα λιπιδίων που προέρχεται από το κύτταρο ξενιστή, περιβάλλει το όλο σωματίδιο του ιού. Η μητρική πρωτεΐνη 1 (Μ1) βρίσκεται κάτω από τη λιπιδική στοιβάδα, συνδέεται με πρωτεΐνες του νουκλεοκαψιδίου και χρησιμεύει ως θεμελιώδης μάζα. Η Μ1 είναι και η πιο πολυάριθμη πρωτεΐνη του ιού. Σε λίγα αντίγραφα απαντάται η μητρική πρωτεΐνη 2 (Matrix protein 2, M2) που διαπερνά το λιπιδικό φάκελο του ιού. Περιφερικά του σωματιδίου του ιού 18

19 υπάρχουν γλυκοπρωτεΐνες. Είναι μια στοιβάδα 500 προεκβολών (spikes) που προεξέχουν από τον λιπιδικό φάκελο κατά 10-14nm. Αυτές οι προεξοχές είναι δύο γλυκοπρωτεΐνες που διαφέρουν στο σχήμα τους, οι αιμοσυγκολλητίνες (ΗΑ) και οι νευραμινιδάσες (ΝΑ). Η αναλογία ΗΑ:NA είναι συνήθως 4:1 ή 5: Μοριακή δομή ιών γρίπης Α Η μοριακή δομή των ιών αυτών έχει μελετηθεί εκτενώς και τα αποτελέσματα αυτών των μελετών έχουν συμβάλει στην αντιμετώπιση της νόσου με την παρασκευή εμβολίων και αντι-ιϊκών φαρμάκων. Παρ όλα αυτά οι μελέτες συνεχίζονται καθώς νέα στελέχη ιών προκύπτουν συνεχώς και πολλές μοριακές διαδικασίες που συμβάλλουν στη λοιμογόνο δύναμή τους μένουν ακόμα ανεξιχνίαστες. Οι ιοί της γρίπης Α περιέχουν ως πυρηνικό οξύ, μονόκλωνο RNA αρνητικής πόλωσης, κατατετμημένο σε οκτώ μόρια. Το καθένα από τα οκτώ τμήματα RNA του ιού είναι υπεύθυνο για την κωδικοποίηση συγκεκριμένων πρωτεϊνών, αναγκαίων για την επιβίωση και αναπαραγωγή του ιού. Τα πρώτα τρία τμήματα RNA εκφράζονται ως το σύμπλεγμα των πολυμερασών του ιού (PB1, PB2 και PA). Το τέταρτο τμήμα εκφράζεται ως η αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) του ιού. Το πέμπτο τμήμα κωδικοποιεί την νουκλεοπρωτεΐνη (ΝP) και το έκτο την νευραμινιδάση (ΝΑ). Το έβδομο τμήμα κωδικοποιεί τις δύο μητρικές πρωτεΐνες (M1 και Μ2) και το όγδοο τμήμα τις δύο μη δομικές πρωτεΐνες (Non Structural protein 1, NS1 και Non Structural protein 2, NS2). (Εικ. 1) Κάθε τμήμα RNA περιλαμβάνει περιοχές στα άκρα των γονιδίων οι οποίες δεν εκφράζουν πρωτεΐνες και εικάζεται ότι περιέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη μεταγραφή και την αναπαραγωγή του γονιδιώματος του ιού. 9 19

20 ( N S 2 ) Μη δομική πρωτεΐνη Λιποειδική στοιβάδα ( Ν Α ) Νευραμινιδάση ( Η Α ) Αιμοσυγκολλητίνη ( Μ 2 ) Δίαυλος ιόντων ( Μ 1 ) Μητρική πρωτεΐνη ( P B 1,P B 2, P A ) Σύμπλεγμα πολυμερασών ( NP ) Νουκλεοπρωτεΐνες ( N S 1 ) Μη δομική πρωτεΐνη στο μολυσμένο κύτταρο Εικόνα 1. Σχηματικό διάγραμμα δομής του σωματιδίου του ιού γρίπης A. (Ελήφθη από το σύγγραμμα Field s Virology με μετάφραση των όρων) 4 Έχουν αποδοθεί ποικίλες ιδιότητες στις διάφορες πρωτεΐνες του ιού, καθώς αυτές καθορίζουν τη συμπεριφορά του σε σχέση με το κύτταρο-ξενιστή, τη μεταδοτικότητά του και την παθογόνο δράση του, πολλές όμως από τις ιδιότητες αυτές είναι ακόμα υπό έρευνα. (Πίν. 1) 20

21 Πίνακας 1. Γονίδια ιού γρίπης A, εκφραζόμενες πρωτεΐνες και λειτουργίες τους. Τμήμα RNA Πρωτεΐνες PB2 PB1 Πολυμεράσες PA HA 1 Αιμοσυγκολλητίνες HA 2 Τοποθεσία στο ιικό σωματίδιο Eσωτερικό Προσεκβολές περιβλήματος 5 NP Νουκλεοπρωτεΐνη Εσωτερικό Λειτουργίες και σχόλια Σύμπλεγμα ενζύμων, Συμβολή στη μεταγραφή RNΑ και στην παθογένεια του ιού. Γλυκοπρωτεΐνες, Αντιγόνα, Δέσμευση σε υποδοχείς σιαλικού οξέος. Μετακίνησή RNP προς πυρήνα, πολλαπλασιασμός. 6 ΝA Νευραμινιδάση Προσεκβολές περιβλήματος Γλυκοπρωτεΐνη, Ενζυμική και αντιγονική δραστηριότητα. 7 8 M1 M2 Μητρικές πρωτεΐνες NS1 Μη δομικές πρωτεΐνες NS2 Κάτω από περίβλημα Διαπερνά περίβλημα & καψίδιο Εσωτερικό Δομικό υλικό. Δίαυλος ιόντων,προσαρμογή ph. Παρεμπόδιση παραγωγής ιντερφερόνης από το κύτταρο. Δομικό υλικό. Νουκλεοπρωτεΐνη H νουκλεοπρωτεΐνη είναι η κύρια δομική πρωτεΐνη του ιού και μαζί με το RNA και τις πολυμεράσες δημιουργούν το ριβονουκλεϊνικό σύμπλεγμα. Παίζει ρόλο στον πολλαπλασιασμό του ιού, ανάλογα με τη φωσφορυλίωση που υφίσταται και που εξαρτάται από συγκεκριμένα ένζυμα του κάθε ξενιστή. Είναι ακόμη αναγκαία η NP για τη σύνθεση του νέου vrna(viral RNA), που θα αποτελέσει το γενετικό υλικό των νέων ιικών σωματιδίων 10, καθώς και για τη μεταγραφή του mrna, που θα μεταφραστεί στις αναγκαίες πρωτεΐνες για τα νέα σωματίδια του ιού. 11 Στην NP έχουν προσδιοριστεί δύο σημεία εντοπισμού του πυρήνα του κυττάρου ξενιστή. Αυτά φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν με διαλυτούς υποδοχείς πρωτεϊνών και εμπλέκονται με τη μετακίνηση του RNP προς τον κυτταρικό πυρήνα και την είσοδό τους σε αυτόν μέσω πυρηνικών πόρων. Στα τελευταία 21

22 στάδια ζωής των μολυσμένων κυττάρων γίνεται διάσπαση της NP του ιού από κυτταρικές κασπάσες. 12 Η διάσπαση αυτή αποτελεί και την αρχή της κυτταρικής απόπτωσης με κάποιο μηχανισμό, ο οποίος όμως δεν έχει ακόμη πλήρως διευκρινιστεί και βρίσκεται υπό μελέτη. Η NP αποτελεί επίσης τον κυριότερο στόχο των κυτταροτοξικών T- λεμφοκυττάρων. 13 RNA- Πολυμεράσες Τα τρία πρώτα γονίδια του ιού εκφράζουν τις τρεις πρωτεΐνες (PB2, PB1, PA) που αποτελούν το σύμπλεγμα των RNAπολυμερασών του. Το σύμπλεγμα αυτό έχει την ενδογενή τάση να μεταναστεύει στον πυρήνα όπου συμμετέχει στη διαδικασία αναπαραγωγής του ιού. Εκεί οι πολυμεράσες χρησιμοποιώντας τα γονίδια του ιού ως εκμαγεία προκαλούν την παραγωγή δύο τύπων RNA θετικής πόλωσης, του ιικού αγγελιοφόρου RNA (messenger RNA, mrna) και του συμπληρωματικού ιικού RNA (complementary RNA). 1,3 Προηγείται η σύνθεση του ιικού mrna ως εξής 14 : Η PB2 πρωτεΐνη αναγνωρίζει και δεσμεύει το κυτταρικό mrna. Μία ενδονουκλεάση η οποία έχει εντοπιστεί στο ίδιο το σύμπλεγμα των πολυμερασών και συγκεκριμένα στην PB1 πρωτεΐνη, διασπά το mrna του κυττάρου ξενιστή. 15 Αυτά τα διασπασμένα τμήματα του κυτταρικού mrna χρησιμοποιούνται ως τυχαίες αφετηρίες για τη σύνθεση του ιικού mrna, με τη μεσολάβηση της PB1 πολυμεράσης στην επικόλληση των νουκλεοτιδίων. 16,17 Στη συνέχεια το ιικό mrna εξέρχεται από τον πυρήνα με τη βοήθεια μιας άλλης πρωτεΐνης, της NS1, και μεταφέρεται στα ριβοσώματα του κυττάρου όπου και συντίθενται οι ιικές πρωτεΐνες. Οι νεοσχηματιζόμενες πολυμεράσες επανεισέρχονται στον πυρήνα για να επαναλάβουν τη διαδικασία αναπαραγωγής. 18 Στον πυρήνα, το συμπληρωματικό ιικό crna θετικής πόλωσης χρησιμεύει ως μήτρα για την παραγωγή νέων ιικών RNA αρνητικής πόλωσης (vrna), τα οποία θα αποτελέσουν το γενετικό υλικό των νεοσχηματιζόμενων ιικών σωματιδίων. 11,18 Στις διαδικασίες παραγωγής του crna αλλά και της μετατροπής του σε vrna, σημαντικός είναι ο ρόλος της NP. 11 H μετάβαση από τη μία διαδικασία μεταγραφής (mrna) στην άλλη διαδικασία της αναπαραγωγής του ιικού RNA (crna και vrna), γίνεται με τη μεσολάβηση της πρωτεΐνης PA. 14 Δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα η 22

23 ακριβής λειτουργία της PA, αλλά έρευνες έχουν δείξει ότι είναι αναγκαία για την αναπαραγωγή του γενετικού υλικού του ιού, καθώς μετάλλαξη στο γονίδιο της PA παρεμποδίζει τη διαδικασία αυτή. 14,15,19 Πρόσφατες έρευνες έχουν επίσης δείξει ότι η PA έχει και δράση πρωτεάσης και έτσι μπορεί να ελέγχει τα επίπεδα έκφρασής της αλλά και των συνεκφραζόμενων πρωτεϊνών. 19,20 Θεωρείται επίσης ότι η PB2 συμβάλλει καθοριστικά και στην παθογένεια του ιού, καθώς σε πρόσφατες μελέτες του υψηλά παθογόνου στέλεχους γρίπης A(H5N1), έχει βρεθεί ότι μετάλλαξη στη θέση 627 του γονιδίου της, προκαλεί αλλαγές στην παθογόνο δράση του ιού μετά την εισαγωγή του σε μύεςς. 21 Έχει ακόμη βρεθεί ότι η PΒ2 παίζει σημαντικό ρόλο στην επιλογή του ξενιστή του ιού και ότι αντικατάσταση της γλουταμίνης με λυσίνη στην ίδια θέση του γονιδίου της ΡΒ2 μετατρέπει έναν ιό πτηνού σε ιό ανθρώπου. Το ίδιο πιθανότατα ισχύει και για άλλες αντικαταστάσεις ή και συνδυασμούς αντικαταστάσεων στο ίδιο γονιδίο. 10 Όσον αφορά στο γονίδιο της ΡΒ1 πολυμεράσης, φαίνεται ότι κωδικοποιεί ένα μικρό πεπτίδιο το οποίο προκαλεί κυτταρικό θάνατο. 22 Οι πολυμεράσες συμμετέχουν στη δημιουργία της RNP, καθώς αναγνωρίζουν και συνδέουν το RNA και την NP στο σύμπλεγμα. 23 Τα συμπλέγματα RNP φαίνεται ότι είναι σε θέση να προάγουν διαδικασίες αναπαραγωγής του ιού χωρίς τη μεσολάβηση και άλλων παραγόντων. 11 Οι δύο πρώτες πολυμεράσες, PB1 και PB2, έχουν ph αλκαλικό ενώ η PA έχει όξινο ph, γεγονός που επηρεάζει τη δομή του νουκλεοκαψιδίου στο χώρο. 1,22 Μη δομικές πρωτεΐνες Παλιότερα υπήρχε η πεποίθηση ότι οι πρωτεΐνες αυτές δεν ήταν δομικές, γεγονός στο οποίο οφείλουν την ονομασία τους. Όντως η μη δομική πρωτεΐνη 1 (NS1) βρίσκεται μόνο σε μολυσμένα από τον ιό κύτταρα και δεν συμβάλλει στη δομή του σωματιδίου του ιού. 1 Αρχικά προστατεύει τον ιό από την πρώτη ανοσολογική αντίδραση του ξενιστή, με την αποτροπή της παραγωγής ιντερφερόνης. 24 Έτσι ο ιός δεν έχει να αντιμετωπίσει τη δράση της ιντερφερόνης που θα εμπόδιζε την έκφραση των πρωτεϊνών του. Στη συνέχεια η λειτουργία της NS1 έγκειται στην αποτροπή της εξόδου του κυτταρικού mrna από τον πυρήνα, έτσι ώστε να σταματήσει η παραγωγή των πρωτεϊνών του κυττάρου και να επικεντρωθεί το κύτταρο στην 23

24 έκφραση των ιικών πρωτεϊνών, μεσολαβώντας παράλληλα και στην έξοδο του ιικού mrna από τον πυρήνα. 16 Η μη δομική πρωτεΐνη 2 (ΝS2) σήμερα πιστεύεται ότι αποτελεί δομικό συστατικό του ιικού σωματιδίου, καθώς μικρές ποσότητες της πρωτεΐνης αυτής έχουν εντοπιστεί σε απομονωμένα σωματίδια ιών γρίπης Α. 18 Και οι δύο αυτές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από το ίδιο τμήμα RNA. Η NS1 προέρχεται από το αρχικό RNA μεταγράφημα, ενώ η NS2 προκύπτει μετά από την κατάτμησή του. 1,22 Μητρικές πρωτεΐνες Είναι η μητρική πρωτεΐνη 1 (M1) και η μητρική πρωτεΐνη 2 (M2) και δημιουργούνται μετά από κατάτμηση του Μ γονιδίου. H Μ1 βρίσκεται μέσα από το περίβλημα του ιού και είναι ίσως το επικρατέστερο πολυπεπτίδιο στο ιικό σωματίδιο. 1 Πιστεύεται ότι αλληλεπιδρά με τις κυτταροπλασματικές άκρες των HA, NΑ και M2 πρωτεϊνών και επίσης με την RNP, και έτσι θεωρείται ότι προσφέρει δομική σταθερότητα στο περίβλημα του ιού. 3 Θεωρείται επίσης ότι παίζει καθοριστικό ρόλο στην έξοδο των RNP από τον πυρήνα, καθώς τις συνοδεύει στο κυτταρόπλασμα. Αντίθετα για την είσοδο του ιού σε νέα κύτταρα-ξενιστές απαιτείται η απομάκρυνση της M1, έτσι ώστε να μπορέσουν τα RNP να εισέλθουν στον πυρήνα και να αρχίσει η διαδικασία αναπαραγωγής. 18 Η M2 πρωτεΐνη αποτελεί μικρή αναλογία των πρωτεϊνών του ιού και ενεργεί ως δίαυλος για τη μεταφορά ιόντων, μεταβάλλοντας με τον τρόπο αυτό σε όξινο το ph στο εσωτερικό του ιού. 23 Το όξινο ph είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την έναρξη της αναπαραγωγής του ιού και συγκεκριμένα για το στάδιο της απομάκρυνσης της M1 από την RNP του ιού έτσι ώστε να επιτευχθεί η είσοδός της τελευταίας στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή. 18,24-26 Αιμοσυγκολλητίνη Η αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) είναι η πρώτη γλυκοπρωτεΐνη με βάση τη δομή της οποίας οι ιοί γρίπης A διακρίνονται σε υποτύπους. Όπως ήδη αναφέρθηκε υπάρχουν δεκαέξι γνωστοί υπότυποι ΗΑ (Η1- Η16) που όλοι κυκλοφορούν στα πτηνά, ενώ μόνο τρεις υπότυποι HA (H1, Η2, Η3) κυκλοφορούσαν στους ανθρώπους μέχρι το ,7 Έκτοτε εμφανίσθηκαν σε ανθρώπους και ιοί τύπου Α με αιμοσυγκολλητίνες 5, 7 και

25 Η δράση της ΗΑ σχετίζεται με την επιλογή του είδους του ξενιστή. Τούτο γιατί δεσμεύεται στους υποδοχείς της επιφάνειας του κυττάρου ξενιστή, που περιέχουν σιαλικό οξύ, προκαλώντας την επικόλληση του σωματιδίου του ιού στο κύτταρο. Το είδος του υποδοχέα διαφέρει από οργανισμό σε οργανισμό και οι ιοί ανάλογα με τη δομή του γονιδίου της ΗΑ τους διακρίνονται σε ιούς πτηνών και ιούς ανθρώπου. Παραδείγματος χάρη, αν στο γονίδιο της ΗΑ υπάρχει λευκίνη στη θέση 226, τότε η ΗΑ αυτή και ο ιός που τη φέρει δεσμεύεται από α-( 2,6 ) σιαλικό οξύ, υποδοχέα που εντοπίζεται στους ανθρώπους. 1,23 Αν στη θέση αυτή του γονιδίου υπάρχει γλουταμίνη, τότε η συγκεκριμένη ΗΑ δεσμεύεται από α-( 2,3 )σιαλικό οξύ, υποδοχέα που εντοπίζεται στα πτηνά. Και οι δυο προαναφερθέντες υποδοχείς υπάρχουν στους χοίρους, γεγονός που εξηγεί την ιδιότητα των ζώων αυτών να μολύνονται και από ιούς πτηνών και από ιούς ανθρώπων. 18 Πρόσφατες έρευνες όμως έχουν δείξει ότι ιοί γρίπης έχουν μολύνει κύτταρα που δεν φέρουν κανέναν από τους γνωστούς υποδοχείς. Αυτό σημαίνει ότι είτε υπάρχουν και άλλοι υποδοχείς, πέραν των σιαλικών οξέων, που δεσμεύουν την ΗΑ, είτε ότι η διαδικασία επικόλλησης του ιού στον ξενιστή είναι πιο πολύπλοκη από ό,τι θεωρούνταν μέχρι σήμερα. 28 Η ΗΑ είναι επίσης υπεύθυνη για την είσοδο του ιού στο κυτταρόπλασμα. Μετά τη δέσμευσή της στους υποδοχείς, το σωματίδιο του ιού εισέρχεται στο κύτταρο. Το χαμηλό κυτταρικό ph ( 5,5 ) προκαλεί αλλαγές στην τρισδιάστατη δομή της ΗΑ, αποτέλεσμα των οποίων είναι η απελευθέρωση ιικών στοιχείων όπως ριβονουκλεοπρωτεΐνων και μητρικών πρωτεϊνών Μ1 στο κυτταρόπλασμα. 18 Έχει ακόμη συσχετισθεί η HA με τη μολυσματικότητα του ιού ως εξής : το αρχικό μόριο της αιμοσυγκολλητίνης ΗΑ0 αποτελεί τον πρόγονο δύο άλλων πρωτεϊνών ΗΑ1 και ΗΑ2, που παράγονται από τη διάσπαση της ΗΑ0. Μετά τη μετάφραση του αρχικού μορίου της, κυτταρικές πρωτεάσες το διασπούν σε ΗΑ1 και ΗΑ2 και στη συνέχεια οι δύο αυτές γλυκοπρωτεΐνες αναλαμβάνουν τη δράση τους και τα σωματίδια του ιού γίνονται μολυσματικά. 29 Έχει επίσης βρεθεί μετά από μοριακές μελέτες στελεχών Α(Η5Ν1), ότι η ΗΑ έχει σχέση και με την παθογόνο δράση του ιού. Ότι δηλαδή η λοιμογόνος δύναμη του στελέχους αυξάνει όταν στο καρβοξυλικό άκρο της ΗΑ0, στο σημείο διάσπασής της, υπάρχουν πολλαπλά βασικά αμινοξέα. 21 Συγκεκριμένα, οι ιοί των πτηνών 25

26 διαχωρίζονται σε στελέχη υψηλής και χαμηλής παθογένειας. Τα στελέχη χαμηλής παθογένειας έχουν αργινίνη στο σημείο διάσπασης του αρχικού μορίου αιμοσυγκολλητίνης (ΗΑ0) και αυτό περιορίζει τη διασπορά τους μόνο σε όργανα του ξενιστή, όπου βρίσκονται τα απαραίτητα ένζυμα για τη διάσπασή της. Τέτοια ένζυμα υπάρχουν μόνο στο αναπνευστικό και πεπτικό σύστημα όπου και διασπείρονται οι ιοί προκαλώντας τοπική λοίμωξη. Αντιθέτως τα στελέχη υψηλής παθογένειας, όπως το στέλεχος Α(Η5Ν1), έχουν πολλαπλά βασικά αμινοξέα στο σημείο διάσπασης της αρχικής ΗΑ0, τα οποία της παρέχουν τη δυνατότητα να διασπάται από διάφορες πρωτεάσες που βρίσκονται σε όλα τα ζωτικά όργανα του πτηνού, προκαλώντας έτσι γενικευμένη λοίμωξη. 29 Η HA ακόμη αποτελεί το κύριο αντιγόνο του ιού και τα αντισώματα του ξενιστή στρέφονται κυρίως εναντίον της. Η εμφάνιση επιδημιών ή/και πανδημιών γρίπης οφείλεται σε μεγάλο βαθμό σε αλλαγή της μοριακής δομής του γονιδίου της. 1,3,23 Νευραμινιδάση Η νευραμινιδάση (ΝΑ) είναι η δεύτερη γλυκοπρωτεΐνη που σχετίζεται με το διαχωρισμό των υποτύπων του ιού. Υπάρχουν 9 διαφορετικές νευραμινιδάσες (Ν1-Ν9) που απαντώνται όλες στους ιούς γρίπης των πτηνών. Από αυτές μόνο δύο τύποι (Ν1 και Ν2) κυκλοφορούσαν στους ιούς των ανθρώπων μέχρι το 2003, οπότε εμφανίσθηκε και η Ν7. 3,23 Η βιολογική δράση της νευραμινιδάσης είναι η διάσπαση του σιαλικού οξέως και επομένως η αποδέσμευση των ιών που είχαν συνδεθεί με αυτό. Της έχει ακόμα αποδοθεί ο ρόλος μεταφοράς του ιού στο βλεννογόνο του αναπνευστικού συστήματος, βοηθώντας τον να προσανατολιστεί στο στόχο του, στα κύτταρα δηλαδή του αναπνευστικού επιθηλίου. 1 Παράλληλα έχει και αντιγονική δράση, εφόσον ο ξενιστής παράγει και αντισώματα που στρέφονται εναντίον της. Οι συχνές εκτροπές στη μοριακή της δομή είναι ένας από τους λόγους των εποχικών επιδημικών εξάρσεων γρίπης. 18,23 26

27 Εικόνα 2. Αναπαραγωγικός κύκλος του ιού της γρίπης. Συνοπτικά ο αναπαραγωγικός κύκλος του ιού της γρίπης έχει ως εξής: O ιός συνδέεται με ειδικούς υποδοχείς του κυτταρικού τοιχώματος του κυττάρου ξενιστή και εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα με σύντηξη των μεμβρανών. Το περίβλημα και οι υποκείμενες πρωτεΐνες αποβάλλονται και το γενετικό του υλικό (RNA αρνητικής πόλωσης), μεταγράφεται σε δύο ειδών RNA θετικής πόλωσης, το mrna και το crna, με τη βοήθεια των RNA πολυμερασών. Το mrna του ιού οδηγεί τα ριβοσώματα του κυττάρου ξενιστή στην παραγωγή των ιικών πρωτεϊνών και ενζύμων, όπως είναι οι γλυκοπρωτεΐνες, αιμοσυγκολλητίνη και νευραμινιδάση, ενώ το crna χρησιμεύει ως μήτρα για την παραγωγή των θυγατρικών ιικών RNA αρνητικής πόλωσης στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή. Ακολουθεί το στάδιο σύνθεσης των νέων ιικών σωματιδίων, με τη συναρμολόγηση των νεοσχηματισθέντων RNA αρνητικής πόλωσης και των πρωτεϊνών, τα οποία τελικά προσελκύονται στην κυτταρική μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή. Εκεί παραλαμβάνουν τμήμα του διπλού στρώματος λιπιδίων της μεμβράνης, ολοκληρώνοντας τη διαδικασία της συναρμολόγησης. Η απελευθέρωση των νέων ιών γίνεται μετά από λύση του κυττάρου ξενιστή, με εκβλάστηση. 27 (Εικ. 2) 27

28 4. Παθογόνος δράση 4.1 Συμπτώματα και επιπλοκές Οι ιοί της γρίπης προκαλούν την ομώνυμη νόσο. Η μετάδοση της επιτυγχάνεται μέσω της αναπνευστικής οδού από μολυσμένα σταγονίδια των εκκρίσεων των ασθενών. Ο ιός προσκολλάται σε ειδικούς υποδοχείς που βρίσκονται στη μεμβράνη των κυττάρων του βλεννογόνου της αναπνευστικής οδού. Ο πολλαπλασιασμός του ιού μέσα στα κύτταρα ακολουθείται από νέκρωση και εκτεταμένη αποφολίδωση του αναπνευστικού επιθηλίου στην οποία οφείλονται και τα συμπτώματα της νόσου. 5 Επειδή η κλινική εικόνα της γρίπης συμπίπτει με τις κλινικές εικόνες άλλων ιώσεων, γι αυτό το λόγο αναφέρεται γενικά ως σύνδρομο γρίπης (Influenza-like illness ILI), που ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ορίζει ως: 31 1) Απότομη έναρξη πυρετού άνω των 38 C 2) Μυαλγίες 3) Συμπτώματα από το ανώτερο αναπνευστικό Ο ορισμός της κλινικής περιγραφής που δίνει το Υπουργείο Υγείας της Ελλάδας στο Στρατηγικό Σχέδιο Δράσης ετοιμότητα για αντιμετώπιση επιδημίας και πανδημίας γρίπης είναι : Άτομο με ξαφνική εμφάνιση πυρετού άνω των 38 C, συμπτώματα από το ανώτερο αναπνευστικό, μυαλγίες και πονοκέφαλο. 32 Ο χρόνος επώασης είναι 1-5 ημέρες. Εκτός από το χαρακηριστικό υψηλό πυρετό, η εισβολή της νόσου είναι απότομη με μυαλγίες, κεφαλαλγία, ρινόρροια και ξηρό βήχα. Μετά την 3 η συνήθως ημέρα ο πυρετός υποχωρεί, ο βήχας γίνεται παραγωγικός και ο ασθενής αισθάνεται αδυναμία. Γαστρεντερικά συμπώματα παρατηρούνται συχνότερα σε παιδιά. Η νοσηρότητα στην παιδική ηλικία είναι της τάξεως του 30%. 5 Η γρίπη εμφανίζεται με βαρύτερη κλινική εικόνα σε έγκυες γυναίκες, βρέφη, υπερήλικες και σε άτομα με χρόνια νοσήματα. Επιπλοκές που συχνά εμφανίζονται σε αυτές τις ομάδες του πληθυσμού είναι : 5 1. Αναπνευστικό σύστημα: Πρωτοπαθής γριπώδης πνευμονία με θνητότητα 10%, συδυασμένη πνευμονία ιογενής και μικροβιακή με θνητότητα 12-42%, μεταγριπική μικροβιακή πνευμονία με θνητότητα 28

29 7%. Στις μικροβιακές επιπλοκές συνήθως εμπλέκονται ο στρεπτόκοκκος, ο σταφυλόκοκκος και ο αιμόφιλος της ινφλουέτζας. Ο σταφυλόκοκκος όμως έχει τη δυσμενέστερη πρόγνωση. 2. Καρδιαγγειακό σύστημα : Περικαρδίτιδα, μυοκαρδίτιδα, έμφραγμα του μυοκαρδίου και σύνδρομο τοξικής καταπληξίας. 3. Κεντρικό Νευρικό Σύστημα : Εγκεφαλίτιδα, σύνδρομο Guilain- Barre, οξεία ψύχωση, δευτεροπαθής μικροβιακή μηνιγγίτιδα. 4. Γαστρεντερικό σύστημα : Κοιλιακά άλγη, αιμοραγγική γαστρεντερίτιδα, αιματέμεση. Άλλες επιπλοκές που έχουν παρατηρηθεί είναι μυοσίτιδα σε άτομα κάτω των 18 ετών με γρίπη Β, συγγενείς ανωμαλίες του κεντρικού νευρικού συστήματος μετά απο νόσηση της μητέρας κατά την κύηση, απλαστική αναιμία και νεφρωσικό σύνδρομο. Στα βρέφη συχνή είναι η βρογχιολίτιδα (8-24%), τα γαστρεντερικά συμπτώματα εμφανίζονται σε συχνότητα 10%, η ωτίτιδα σε συχνότητα 4-5%, ενώ το σύνδρομο Reye είναι εξαιρετικά σπάνιο (0,37-0,88/ ασθενείς). Το σύνδρομο αυτό έχει υψηλή θνητότητα (22-42%) και η παθογένεσή του έχει συνδυαστεί με τον ιό της γρίπης Β σε συνδυασμό με τη λήψη σαλικυλικών φαρμάκων. Πρόκειται για οίδημα του εγκεφάλου και λιπώδη εκφύλιση των σπλάχνων, ιδιαίτερα του ήπατος Συμπτώματα της γρίπης των πτηνών Ο ιός Α(Η5Ν1) είναι ο υπότυπος του ιού της γρίπης των πτηνών που απασχολεί σήμερα την επιστημονική κοινότητα με τον κίνδυνο νέας πανδημίας. Ο υπότυπος αυτός κυκλοφορεί στα πτηνά περισσότερο από μια δεκαετία. Η μετάδοση του σ αυτά γίνεται μέσω της κοπρανοστοματικής οδού και η μόλυνση μπορεί να καταλήξει σε ασυμπτωματική λοίμωξη, ελαφριά αναπνευστική λοίμωξη, ή σπανιώτερα σε εκτεταμένη θανατηφόρο λοίμωξη. Υψηλά παθογόνα στελέχη έχουν απομονωθεί και ανήκουν στους υποτύπους Η5, Η7 και Ν7. 23 Η λοίμωξη των πτηνών από τα στελέχη αυτά παρουσιάζεται με αναπνευστικά συμπτώματα, χαμηλή ικανότητα αναπαραγωγής, δακρύρροια, οίδημα της κεφαλής, διάρροια, νευρολογικά συμπτώματα και θάνατο. Οι επιπτώσεις της λοίμωξης διαφέρουν ανάλογα με το είδος του πτηνού που μολύνθηκε. Βασικό μέσο στη διασπορά του ιού αποτελούν οι οικόσιτες πάπιες, καθώς πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι μπορούν να μολύνονται χωρίς να νοσούν, 29

30 συνεπώς και να μεταδίδουν σιωπηλά τον ιό σε άλλα είδη πτηνών, πιθανώς και σε ανθρώπους. 33 Ανησυχητικό είναι το ότι το συγκεκριμένο στέλεχος προκαλεί βαριά κλινική εικόνα στους ανθρώπους, που εμφανίζεται, μετά από επώαση 2-17 ημερών, με υψηλό πυρετό >38 C, εμέτους, αιμορραγικές διάρροιες, κοιλιακά και θωρακικά άλγη, αιμορραγίες από τα ούλα, αιμοπτύσεις, αναπνευστική δυσχέρεια, πνευμονία, καρδιακή-νεφρική ανεπάρκεια και ενδαγγειακή πήξη. Τα συμπτώματα συνοδεύονται από λευκοπενία, λεμφοπενία, θρομβοκυτταροπενία και αύξηση των τρανσαμινασών. Οι επιπλοκές συμπεριλαμβάνουν πολυσυστηματική ανεπάρκεια με αποτέλεσμα την υψηλή θνητότητα Αξιοσημείωτα είναι τα αποτελέσματα οροεπιδημιολογικών μελετών στην περιοχή της Ασίας, τα οποία έδειξαν ότι μεγάλο ποσοστό του πληθυσμού έχει μολυνθεί από ιούς γρίπης πτηνών Α(Η4-15) τις τελευταίες δεκαετίες. Συγκεκριμένα για τον ιό Α(Η5Ν1) έχουν ανακοινωθεί αποτελέσματα οροεπιδημιολογικών ερευνών με επίπεδα αντισωμάτων στο γενικό πληθυσμό της τάξεως του 2-7% Παθογένεια Ο ιός της γρίπης έχει αναπτύξει μηχανισμούς προσαρμογής στο εκάστοτε περιβάλλον του έτσι ώστε να διαπερνάει τα εμπόδια και να επιτυγχάνει αποτελεσματικά την αναπαραγωγή του. Διαπερνάει τις βλεννώδεις εκκρίσεις με τη νευραμινιδάση του, που έχει την ικανότητα να ρευστοποιεί τις βλέννες. Για να επιβιώσει αποφεύγει το 37 ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Ένας τρόπος είναι η ικανότητα της NS1 πρωτεϊνης του να εμποδίζει την αντιιική 38 δραστηριότητα της ιντερφερόνης. Επιπρόσθετα τα ίδια τα φαινόμενα της αντιγονικής εκτροπής και της αντιγονικής μεταβολής είναι μοναδικοί τρόποι για να ξεφεύγει από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή καθώς με τις ετήσιες μεταβολές στο γονιδίωμα και έτσι και στην αντιγονικότητά του, δεν εξουδετερώνεται από τα αντισώματα του ξενιστή. Επιτυγχάνει την εξάπλωση της λοίμωξης και σε άλλα σημεία του οργανισμού. Υψηλά παθογόνα στελέχη του ιού της γρίπης Α, φαίνεται ότι έχουν πολυβασικά αμινοξέα στο σημείο διάσπασης της ΗΑ και έτσι διασπούνται από πρωτεάσες που υπάρχουν σε διάφορα όργανα του ξενιστή. Έτσι η λοίμωξη μπορεί να προχωρήσει από το 30

31 αναπνευστικό σύστημα και σε άλλα συστήματα του οργανισμού, όπως το γαστρεντερικό και το νευρικό σύστημα. Τα στελέχη αυτά έχουν διαφορετική ευαισθησία στη θερμοκρασία, γεγονός που τα κάνει πιο ανθεκτικά και ικανά να αναπαραχθούν εξίσου στο ανώτερο αλλά και στο κατώτερο αναπνευστικό σύστημα. 39 Η παθογόνος δράση του ιού αλλά και η ειδικότητά του για συγκεκριμένα είδη ξενιστών είναι επίσης μηχανισμοί που αναπτύσσει για να βελτιώσει τις πιθανότητες επιβίωσής του. 37 Πρόσφατο παράδειγμα αποτελεί η γρίπη των πτηνών και η μετάδοσή της σε ανθρώπους. Ένας από τους βασικότερους μηχανισμούς παθογένειας του ιού της γρίπης είναι η απόπτωση των κυττάρων του ξενιστή. Έρευνες έχουν δείξει ότι η απόπτωση επιτυγχάνεται με τη βοήθεια της νευραμινιδάσης του ιού. Η πρωτεϊνη αυτή εμπλέκεται στη διαδικασία της απόπτωσης, καθώς κατά τη διάρκεια της επικόλλησης και της εισόδου του ιού στο κύτταρο, με τη διάσπαση των σιαλικών οξέων, ενεργοποιείται ο Transforming Growth Factor-β (TGF-β) που είναι γνωστός ενεργοποιητής της απόπτωσης. 39,40 Καθώς η απόπτωση αποτελεί βασική κυτταρική λειτουργία, η πρόκλησή της επιτυγχάνεται και μέσω άλλων μονοπατιών. Συγκεκριμένα, ρόλο φαίνεται να παίζουν οι κασπάσες 3 και 8 και ο υποδοχέας της πρωτεϊνικής κινάσης. 40 Έχει επίσης συσχετισθεί η απόπτωση με τα επίπεδα αναπαραγωγής του ιού. Έρευνες έδειξαν ότι τα στελέχη Α(Η3Ν2) προκαλούν υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης σε σχέση με τα στελέχη Α(Η1Ν1). 41 Άλλες έρευνες εδειξαν ότι σημαντικό ρόλο στην έκβαση της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης παίζουν και άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια του κυττάρου ξενιστή. Η παρουσία ενεργού μονοπατιού ΝF-kB είναι απαραίτητη προυπόθεση για να προχωρήσει η λοίμωξη. Για τις μελέτες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα λεμφώματος Burkitt όπου φαίνεται ότι δεν προσβάλλονται από τον ιό καθώς το ΝF-kB μονοπάτι τους είναι ανενεργό. Μόλυνση από άλλους ιούς ήταν εφικτή, ανεξάρτητα από το μονοπάτι αυτό, γεγονός που αποδεικνύει ότι σχετίζεται συγκεκριμένα με τη λοίμωξη από ιό γρίπης. 42 Οι έρευνες επικεντρώνονται σήμερα στην ανάλυση αυτών των μονοπατιών, καθώς αποτελούν στόχο για μελλοντικά αντιιικά φάρμακα. 31

32 5. Επιδημιολογία Η γρίπη με την πάροδο των αιώνων έχει αθροίσει εκατομμύρια θύματα λόγω των επιδημιών και πανδημιών της. Η ποιο γνωστή όμως πανδημία ήταν εκείνη του , η λεγόμενη Ισπανική γρίπη, που ευθύνεται για εκατομμύρια θανάτους παγκοσμίως και άλλαξε τη ροή της ιστορίας. Λέγεται ότι το 80% των απωλειών του αμερικανικού στρατού κατά τον πρώτο παγκόσμιο πόλεμο ήταν αποτέλεσμα της πανδημίας της γρίπης. Αρκετοί απεβίωσαν μόλις μερικές μέρες μετά τη λοίμωξη ενώ άλλοι απεβίωσαν από επιπλοκές λίγο αργότερα. Περίπου τα μισά από τα θύματα ήταν υγιείς και νέοι ενήλικες. Ο ιός που ήταν υπεύθυνος ήταν του τύπου Α (Η1Ν1), και συνέχισε έκτοτε να προκαλεί ετήσιες εξάρσεις μέχρι το Το εμφανίσθηκε ο υπότυπος Α(Η2Ν2), ο οποίος προκάλεσε την επονομασθείσα Ασιατική γρίπη, και αντικατέστησε τον υπότυπο Α(Η1Ν1). Ο νέος υπότυπος πρωτοεμφανίστηκε στην Κίνα τον Φεβρουάριο του 1957 και είχε ήδη μεταδοθεί στην Αμερική μέχρι τον Ιούνιο του ίδιου έτους. Ο ιός αυτός εξακολούθησε να κυκλοφορεί μέχρι το 1968 οπότε αντικαταστάθηκε από τον υπότυπο Α(Η3Ν2) 44, που πρωτοεμφανίστηκε το 1968 στο Hong Kong. Ο τελευταίος αυτός υπότυπος κυκλοφορεί ακόμα και σήμερα πολύ εκτενώς και δημιουργεί τις περισσότερες ετήσιες επιδημίες σε ολόκληρο τον κόσμο. 45 Το επανεμφανίστηκε ο υπότυπος Α(Η1Ν1) που είχε εξαφανιστεί το 1957 και έκτοτε μέχρι σήμερα κυκλοφορεί παγκόσμια, παράλληλα με τον Α(Η3Ν2) ή και εναλλάξ Αντιγονική εκτροπή και μεταβολή Υπάρχουν δυο μηχανισμοί που εξηγούν τη χαρακτηριστική επιδημιολογία των ιών γρίπης Α. Είναι η αντιγονική εκτροπή (drift) και η αντιγονική μεταβολή (shift). 3,5,23 Στην αντιγονική εκτροπή, σημειακές μεταλλάξεις που συχνά εμφανίζονται στα γονίδια που κωδικοποιούν τις δύο επιφανειακές πρωτεΐνες ΗΑ και ΝΑ, επιτρέπουν σε αυτούς τους ιούς να μην αναγνωρίζονται από τα αντισώματα του οργανισμού που προέρχονται από προηγούμενη επαφή του με τον ιό. Με τη διαδικασία της αντιγονικής εκτροπής, που συνήθως οφείλεται σε μεταλλάξεις, προκύπτουν νέες παραλλαγές 32

33 του ιού, οι οποίες προκαλούν επιδημίες σχεδόν κάθε χρόνο. Π.χ. στο Κέντρο Αναφοράς Γρίπης Βορείου Ελλάδος έχουν απομονωθεί στην πορεία του χρόνου δύο στελέχη ιών γρίπης Α, τα Α/Thessaloniki/1/95 (H3Ν2) και A/Thessaloniki/12/97 (Η3Ν2), με εμφανείς διαφορές από τα προϋπάρχοντα διεθνώς κυκλοφορούντα στελέχη. Το στέλεχος Α/Thessaloniki/1/95 (H3Ν2) είχε διαφορές από το αντιγονικά συγγενικό του στέλεχος, A/Johannesburg/33/94(Η3Ν2), στα αμινοξέα της ΗΑ1 πρωτεΐνης του και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο στέλεχος από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας. Στο στέλεχος A/Thessaloniki/12/97 (Η3Ν2) βρέθηκαν διαφορές από το πρότυπο συγγενικό του στέλεχος A/Wuhan/359/95 (Η3Ν2) στην Μ1 πρωτεΐνη. Η αλληλουχία του καταχωρήθηκε στη Γενετική Τράπεζα (GeneBank) με αριθμό πρόσβασης AJ Αντίθετα, με το φαινόμενο της αντιγονικής μεταβολής, προκύπτουν στελέχη ιών που περιέχουν νέες HA ή/και ΝΑ που δεν έχουν κυκλοφορήσει στους ανθρώπους στο παρελθόν. Τέτοιοι ιοί προκύπτουν είτε από απευθείας μετάδοση του ιού στον άνθρωπο από άλλους ξενιστές είτε από ανακατανομή γενετικού υλικού δύο ιών διαφορετικών ειδών σε ένα ξενιστή ο οποίος έχει μολυνθεί συγχρόνως και από τους δύο ιούς διαφορετικών ειδών, π.χ. πτηνών και ανθρώπου. (Εικ. 3) Αυτά τα στελέχη μπορεί να προκαλέσουν πανδημίες σε ανύποπτα χρονικά διαστήματα. Σε αυτή την κατηγορία ανήκει και το στέλεχος Α(Η5Ν1) που απειλεί με πανδημία τα τελευταία έτη. 39,45 33

34 Εικόνα 3. Αντιγονική μεταβολή: Σχηματική παράσταση ανακατανομής γενετικού υλικού δύο ιών γρίπης σε ενδιάμεσο ξενιστή χοίρο. 34

35 Έχει αποδειχτεί ότι η γενετική αυτή ανακατανομή συμβαίνει και στα γονίδια του ιού που κωδικοποιούν τις εσωτερικές του πρωτεΐνες. 47 Η μορφή του γονιδιώματος των ιών γρίπης Α με τα οκτώ κατακερματισμένα τμήματα RNA είναι ιδανική για αυτές τις ανακατανομές. Έχει υπολογιστεί ότι μπορούν να συμβούν 256 διαφορετικοί συνδυασμοί, αν κατά τη διάρκεια σύγχρονης λοίμωξης έρθουν σε επαφή δύο διαφορετικά στελέχη του ιού, με αποτέλεσμα τη δημιουργία νέων στελεχών του ιού με διαφορές στη λοιμογόνο και παθογόνο δράση τους και στην αντιγονικότητά τους. 18 (Εικ. 4) 35

36 Εικόνα 4. Αντιγονική μεταβολή: Σχηματική παράσταση ανακατανομής γενετικού υλικού δύο ιών γρίπης απ ευθείας στον άνθρωπο. 36

37 5.2 Επιδημιολογικά στοιχεία πανδημικών στελεχών Οι ιοί γρίπης Α υφίστανται κυρίως ανακατανομές γενετικού υλικού γιατί αυτοί μπορούν να μολύνουν διάφορα είδη πέρα από τον άνθρωπο, όπως πτηνά και χοίρους. Τα πτηνά θεωρούνται οι φυσικοί ξενιστές των ιών της γρίπης και όλοι οι γνωστοί υπότυποι κυκλοφορούν ανάμεσά τους. Οι ιοί των πτηνών δεν προσβάλλουν συνήθως τους ανθρώπους. Ωστόσο, από το 1997 έχουν αναφερθεί περιπτώσεις απευθείας μετάδοσης στελεχών ιών πτηνών στον άνθρωπο, όπως για παράδειγμα τα στελέχη Α(Η5N1), Α(Η9Ν2), Α(Η7Ν7). 18 Πιο συνηθισμένο όμως είναι το φαινόμενο μετάδοσης ιών των πτηνών σε χοίρους, που παράλληλα μολύνονται και από ιούς ανθρώπων και αποτελούν όχημα ανακατανομής ιών γρίπης διαφόρων ειδών (mixing vehicle). Έτσι κατά τον πολλαπλασιασμό των ιών διαφόρων ειδών στο ίδιο κύτταρο, στο στάδιο σύνθεσης των νέων σωματιδίων, γονίδια του ενός ιού μπορεί να αντικαταστήσουν γονίδια του άλλου με αποτέλεσμα εμφάνιση στελέχους με καινούριες ιδιότητες (Εικ. 3). Ο ιός αυτός θα αποτελεί νέο ιό ανθρώπου με γονίδια ιού πτηνού και επομένως θα μεταδίδεται πλέον από άνθρωπο σε άνθρωπο. 48 Με τα σημερινά όμως δεδομένα, o ιός Α(Η5Ν1) των πτηνών δεν έχει μετατραπεί σε ανθρώπειο ιό με ανασυνδυασμό του γενετικού του υλικού στο σώμα κάποιου ενδιάμεσου ξενιστή, όπως συνέβη με τους ιούς Α(Η2Ν2) του 1957 και Α(Η3Ν2) του Φαίνεται ότι προσπαθεί να προσαρμοστεί σε νέους ξενιστές, με τυχαίες μεταλλάξεις όπως συνέβη με το στέλεχος Α(Η1Ν1) του 1918, δημιουργώντας νέους κλάδους με δυνατότητα μετάδοσης στο νέο είδος. 49 Μεγάλο κίνδυνο ελλοχεύει το γεγονός ότι ο ιός Α(Η5Ν1) φαίνεται να ξεπερνάει το φραγμό των ειδών (species barrier). Αυτό μεγαλώνει την πιθανότητα πανδημίας καθώς, εφόσον συνεχίζουν να νοσούν άνθρωποι, αυξάνεται ο κίνδυνος δημιουργίας νέου ανθρώπειου στελέχους με ανασυνδυασμό γενετικού υλικού του ιού των πτηνών με ιούς ανθρώπων. Το νέο στέλεχος θα έχει χαρακτηριστικά και των δύο προγόνων του και θα μπορεί πλέον να μεταδίδεται με ευχέρεια από άνθρωπο σε άνθρωπο. 43 Συνολικά μέχρι το Φεβρουάριο του 2008 έχουν αναφερθεί 360 περιπτώσεις μόλυνσης 37

38 από ιό Η5Ν1 σε ανθρώπους σε όλο τον κόσμο, από τις οποίες οι 226 ήταν θανατηφόρες. 50 Οι μοριακές μελέτες συνεχίζονται καθώς νέα στελέχη ιών προκύπτουν συνεχώς και πολλές διαδικασίες που συμβάλλουν στη λοιμογόνο δύναμή τους παραμένουν ακόμα προς εξιχνίαση. 38

39 6. Εργαστηριακή διάγνωση 6.1 Άμεση και ταχεία διάγνωση Μεθοδος ανοσοφθορισμού Κατά τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα σημασμένα με φθοριόχρωμα έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών του ιού. Αυτή η μέθοδος μπορεί να γίνει απευθείας στο κλινικό δείγμα, αν απαιτείται άμεση διάγνωση, ή να χρησιμοποιηθεί για να ανιχνευθεί ο ιός, ο τύπος και ο υπότυπός του, σε μολυσμένη κυτταροκαλλιέργια. Μέθοδος ταχέως ελέγχου (Rapid test) Με αυτή τη μέθοδο, το δείγμα που περιέχει τον ιό της γρίπης προστίθεται στη μεμβράνη του φίλτρου της συσκευασίας του τεστ. Αν το δείγμα είναι θετικό και άρα υπάρχουν αντιγόνα, τότε αυτά δεσμεύονται στη μεμβράνη. Τα κιτ αυτά περιέχουν μονοκλωνικά αντισώματα που δεσμεύουν τον ιό που βρίσκεται πάνω στη μεμβράνη. Στη συνέχεια το ανοσοσύμπλεγμα μπορεί να ανιχνευθεί με προσθήκη χρωμογόνου διαλύματος. Ανάλογα με το αντίσωμα που υπάρχει ανιχνεύεται και ο τύπος του ιού. Έρευνες έχουν δείξει ότι μόνο 30% των ιών ανιχνεύονται με αυτή τη δοκιμασία. 51 Μοριακές μέθοδοι- Μέθοδος Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR) Επανάσταση στο χώρο της διάγνωσης έφερε η μέθοδος αυτή, καθώς δίνει τη δυνατότητα εκθετικού πολλαπλασιασμού οποιαδήποτε γονιδίου έτσι ώστε να γίνεται ορατό. Έτσι ανιχνεύεται άμεσα το ίδιο το γενετικό υλικό του ιού στο δείγμα. Αφού προηγηθεί η ανάστροφη μεταγραφή, δηλαδή η μετατροπή του RNA του ιού σε συμπληρωματικό DNA (cdna) με τη βοήθεια του ενζύμου ανάστροφη μεταγραφάση, ακολουθεί ενίσχυση τμήματος ενός γονιδίου του ιού. Αυτό επιτυγχάνεται με τη βοήθεια της δράσης ενός ενζύμου, της Taq πολυμεράσης, που πολλαπλασιάζει το DNA χωρίς να αποδιατάσσεται σε υψηλές θερμοκρασίες. Τρεις διαδοχικές φάσεις, η αποδιάταξη της έλικας του DNA (στους 95 C), η επικόλληση των εκκινητών που ορίζουν το προς ανίχνευση γονίδιο (στους C) και η επιμήκυνση του τμήματος αυτού της νέας 39

40 αλυσίδας του DNA (στους 72 C) επαναλαμβάνονται μέχρι και φορές. Ξεκινώντας από ένα αντίγραφο του γονιδίου και άρα του ιού το αποτέλεσμα είναι δισεκατομμύρια αντίγραφα, τα οποία ανιχνεύονται μετά από ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης καθώς δεσμεύουν βρωμιούχο αιθίδιο και εκπέμπουν φθρορισμό κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία. Στην περίπτωση του ιού της γρίπης, επειδή έχει ως γενετικό υλικό RNA, προηγείται της PCR ένα βήμα ανάστροφης μεταγραφής, μετατροπής δηλαδή του RNA στο συμπληρωματικό cdna του. Ανάλογα με την επιλογή των εκκινητών, καθορίζεται και το γονίδιο που θα πολλαπλασιαστεί. Έτσι μπορεί να γίνει τυποποίηση των ιών της γρίπης σε Α ή Β και στη συνέχεια υποτυποποίηση των ιών της γρίπης Α σε Η1, Η3, Η5 κτλ. Για την τυποποίηση επιλέγονται συνήθως η μητρική πρωτεΐνη ή η νουκλεοπρωτεΐνη του ιού, ενώ για την υποτυποποίηση σε Η1-16 η αιμοσυγκολλητίνη και σε Ν1-9 η νευραμινιδάση του ιού. Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι μεταβολές του γενετικού υλικού του ιού στις ετήσιες επιδημίες και να προσαρμόζονται οι εκκινητές αναλόγως Καλλιέργεια του ιού Οι ιοί της γρίπης προσκολλώνται με τη βοήθεια της αιμοσυγγολητίνης τους, στους σιαλικούς υποδοχείς των κυττάρων. Εισέρχονται στο κύτταρο με τη διαδικασία της ενδοκυττάρωσης και αποβάλλουν το πρωτεϊνικό τους περίβλημα μέσα στα ενδοσώματα του κυττάρου. Το RNA του ιού πολλαπλασιάζεται στον πυρήνα του κυττάρου ενώ οι πρωτεϊνες στο πρωτόπλασμα. Τα νεοσχηματιζόμενα σωματίδια του ιού εξέρχονται από το κύτταρο υποβοηθούμενα από τη δράση της νευραμινιδάσης, με ταυτόχρονη λύση του κυττάρου ξενιστή. Η ίδια διαδικασία ακολουθείται in vivo αλλά και in vitro. 52 Παραδοσιακά οι ιοί της γρίπης καλλιεργούνται in vitro στο αναπτυσσόμενο έμβρυο όρνιθας (8-12 ημερών) μετά από εμβολιασμό του κλινικού δείγματος στην αμνιακή κοιλότητα για την αρχική απομόνωση και στην αλλαντοϊκή κοιλότητα για ανακαλλιέγειες. Με τις ανακαλλιέργειες λαμβάνεται μεγαλύτερη ποσότητα ιού για την παρασκευη των εμβολίων. Κατά τις τελευταίες επιδημίες της γρίπης, πολλά από τα στελέχη A(H3N2) που κυκλοφόρησαν δεν απομονώνονται πλέον στα εμβρυοφόρα αβγά, όπως π.χ. και το στέλεχος του εμβολίου A/Fujian/411/2002 (Η3Ν2). Φαίνεται ότι αυτό 40

41 οφείλεται σε 4 μεταλλάξεις στο γονίδιο της αιμοσυγγολητίνης του ιού, τις G186V, V226I, H183L και V226A. Έρευνες έδειξαν ότι επαναφορά τουλάχιστον δύο εξ αυτών βελτιώνει την ικανότητα καλλιέργειας σε αβγά κατά ένα μεγάλο ποσοστό Σήμερα στην πλειονότητα των εργαστηρίων καλλιεργούνται οι ιοί της γρίπης σε κύτταρα MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Αυτού του είδους η καλλιέργεια έχει αρκετά πλεονεκτήματα. Απαιτεί λιγότερο χρόνο και εξειδίκευση του προσωπικού. Είναι πολύ αξιόπιστη καθώς δεν έχουν παρατηρηθεί ακόμα μεταλλάξεις που να επηρεάζουν την καλλιέργεια σε κύτταρα. Μέρος της επιστημονικής κοινότητας υποστηρίζει ότι θα πρέπει να αναθεωρηθεί η χρήση της καλλιέργειας των αβγών για την παραγωγή εμβολίων και λόγω του μεγάλου χρόνου παραγωγής (6 μήνες) αλλά και επειδή ο ιός που απομονώνεται από τις κυτταροκαλλιέργειες μοιάζει περισσότερο με το άγριο στέλεχος παρά μετά από απομόνωση σε αβγά όρνιθας. Τέλος ένα ακόμα πρόβλημα είναι η λευκωματίνη των αβγών, που πιθανόν να προκαλεί αλλεργίες σε τμήμα του πληθυσμού που εμβολιάζεται με εμβόλια που έχουν παραχθεί σε αβγά. 52, Απομόνωση Τυποποίηση Μέθοδος Αιμοσυγκόλλησης Haemagglutination (HA) Αφού γίνει η καλλιέργεια των ιών με τον έναν ή με τον άλλο τρόπο, η ανάπτυξη των ιών αναγνωρίζεται με δοκιμασίες αιμοσυγκόλλησης ερυθρών αιμοσφαιρίων όρνιθας ή ανθρώπου ομάδας Ο (Rh-). Αντίστοιχα στις καλλιέργειες κυττάρων μπορεί να γίνουν δοκιμασίες αιμοπροσρόφησης. Οι ιοί της γρίπης έχουν την ικανότητα να συγκολλούν ερυθρά αιμοσφαίρια. Επομένως, όταν η δοκιμασία είναι θετική θεωρείται ότι απομονώθηκε ιός. 52 Μέθοδος Αναστολής Αιμοσυγκόλλησης Haemagglutination inhibition (HAI) Η τυποποίησή των ιών γίνεται με δοκιμασίες αναστολής της αιμοσυγκόλλησης ή και αναστολής της αιμοπροσρόφησης αντίστοιχα για κυτταροκαλλιέργειες. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται είναι έναντι της ΗΑ πρωτεϊνης του ιού με αποτέλεσμα την αναστολή της αιμοσυγκόλλησης, στην περίπτωση που ο αντιορός αντιστοιχεί στο στέλεχος του ιού που απομονώθηκε από τον ασθενή. 41

42 Η δοκιμασία πραγματοποιείται σε πλάκα 96 βυθισμάτων (8x12), στην οποία σταθερή ποσότητα του απομονωθέντος ιού αναμιγνύεται με διαδοχικά αραιωμένο αντιορό. Στη συνέχεια προστίθενται ερυθρά αιμοσφαίρια. Το αποτέλεσμα είναι εξαιρετικά αξιόπιστο, δεδομένου ότι οι αντιοροί παρασκευάζονται κάθε χρόνο από τον ΠΟΥ έναντι των στελεχών που αναμένεται να προκαλέσουν τις ετήσιες εξάρσεις Ορολογικές μέθοδοι για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων Μέθοδος Αναστολής Αιμοσυγκόλλησης Haemagglutination inhibition (HAI) Η δοκιμασία που περιγράφηκε παραπάνω μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως ορολογική μέθοδος ανίχνευσης αντισωμάτων και μάλιστα ειδικών του υποτύπου του ιού, π.χ. anti A(H1), anti A(H3) κ.λ.π. Γίνεται με αντιγόνα τις ΗΑ εκάστου τύπου Η1 ή Η3 που παρασκευάζονται από εργαστήρια του Π.Ο.Υ. και διατίθενται στα Εθνικά Κέντρα Γρίπης ανανεούμενα κάθε χρόνο. 52 Προηγείται κατεργασία των ορών των ασθενών με Receptor Destroying Enzyme (RDE) για την απομάκρυνση μη ειδικών αναστολέων της αιμοσυγκόλλησης. Είναι η πλέον αξιόπιστη ορολογική μέθοδος. Μέθοδος ELISA Υπάρχουν εμπορικά κιτ που βασίζονται στην ανοσοενζυμική αυτή μέθοδο. Συνήθως ανιχνεύουν αντισώματα, έναντι ιών γρίπης Α ή Β. 52 Μέθοδος σύνδεσης συμπληρώματος Ως αντιγόνα χρησιμοποιούνται τα διαλυτά αντιγόνα S των τύπων Α και Β. Με τη μέθοδο αυτή ανιχνεύονται αντισώματα του ασθενή μόνο έναντι του τύπου του ιού, π.χ. anti-a ή anti-b. Η μέθοδος αυτή δεν χρησιμοποιείται πλέον ευρέως, διότι είναι εργώδης. 42

43 6.4 Μοριακή επιδημιολογική διερεύνηση Μέθοδος ανεύρεσης της αλληλουχίας DNA (DNA sequencing) Για περαιτέρω γενετική ανάλυση του ιού, το προϊόν της PCR μπορεί να αλληλουχηθεί, δηλαδή να προσδιοριστεί η ακολουθία των βάσεων του τμήματος του γονιδίου που έχει ενισχυθεί. Έτσι γίνεται ανίχνευση οποιασδήποτε τυχόν μετάλλαξης έχει το στέλεχος που κυκλοφορεί. Αλληλούχηση μπορεί να γίνει σε όλα τα γονίδια του ιού, πέρα από το γονίδιο της ΗΑ και της ΝΑ που χρησιμοποιούνται συνήθως για την τυποποίησή του. Με τη μέθοδο αυτή γίνεται και η διερεύνηση των ανθεκτικών στα αντιιικά φάρμακα στελεχών, κάτι που περιγράφεται στο οικείο κεφάλαιο. 52 Φυλογενετική ανάλυση Η αλληλουχία γονιδίων του ιού χρησιμοποιείται σε ειδικά προγράμματα για το σχεδιασμό συστοιχίσεων και φυλογενετικών δένδρων (ClustalW, MEGA 4). Με τη βοήθεια των προγραμμάτων αυτών που είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο βρίσκονται οι γενετικές αποστάσεις και η ομολογία που έχουν τα στελέχη που μελετώνται, από τα στελέχη άλλων χωρών ή και από τα στελέχη των αντίστοιχων ετήσιων εμβολίων

44 7. Προφύλαξη και θεραπεία Η πρόληψη της λοίμωξης από ιό γρίπης μπορεί να επιτευχθεί με διάφορους τρόπους. Ιδιαίτερα σημαντικός είναι ο καλός αερισμός των χώρων την περίοδο της επιδημίας και η τήρηση των κανόνων προσωπικής υγιεινής και ειδικά της υγιεινής των χεριών. Ευπαθείς ομάδες θα πρέπει να εμβολιάζονται και τα κρούσματα της γρίπης να αντιμετωπίζονται με τη δέουσα επιμέλεια. 7.1 Εμβολιασμός Εμβόλια σε χρήση Η πιο διαδεδομένη και αποτελεσματική μέθοδος προφύλαξης από τη γρίπη είναι ο εμβολιασμός. Λογω των συχνών μεταλλάξεων των ιών της γρίπης, κάθε χρόνο αναθεωρείται η σύσταση του εμβολίου. Το εμβόλιο που κυκλοφορεί στην Ελλάδα είναι τριπλό (trivalent) και αποτελείται από έναν εκπρόσωπο ιού γρίπης A(H1N1), έναν A(H3N2) και ένα Β. Από τις απομονώσεις των ιών γρίπης που γίνονται σε εξουσιοδοτημένα από τον ΠΟΥ εργαστήρια (Εθνικά Κέντρα Γρίπης) σε περισσότερες από 94 χώρες, ελέγχονται οι ετήσιες μεταλλάξεις των ιών. Τα δεδομένα αυτά χρησιμοποιούνται για την επιλογή των στελεχών που θα συμπεριληφθούν στο εμβόλιο του επόμενου έτους. Η παρακολούθηση των ιών αλλά και της νόσου που προκαλούν δίνουν σημαντικές πληροφορίες για την επιλογή των στελεχών του εμβολίου. Ένα στέλεχος αντικαθίσταται όταν: α) οι διαφορές της αντιγονικότητας των νεο-εμφανιζόμενων στελεχών από τα τρέχοντα στελέχη του εμβολίου είναι στατιστικά σημαντικές, β) ο πληθυσμός που έχει εμβολιαστεί παρουσιάζει χαμηλή ορολογική απάντηση στο νέο στέλεχος, γ) υπάρχουν γνωστές γενετικές αλλαγές στο νέο στέλεχος που προμηνύουν την εμφάνιση νέου κλάδου, δ) το νέο στέλεχος σχετίζεται με νόσο στον πληθυσμό. Πληροφορίες για τη νόσο είναι επίσης σημαντικές έτσι ώστε να προβλέπονται οι επιπτώσεις των νεο-εμφανιζόμενων στελεχών στην υγεία του πληθυσμού. 57 Τα εμβόλια που κυκλοφορούν περιέχουν αδρανοποιημένους ιούς ή υπομονάδες ιών (ΗΑ) σε ενέσιμη μορφή. Μέσα σε 2 εβδομάδες από τη χορήγηση του εμβολίου ο οργανισμός παράγει αντισώματα που προστατεύουν από πιθανή μόλυνση με το στέλεχος του εμβολίου. 44

45 Η σύσταση του εμβολίου για τις περιόδους ήταν η εξής : 2004/ A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-like strain A/Fujian/411/2002 (H3N2)-like strain B/Shanghai/361/2002-like strain 2005/ A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-like strain A/California/7/2004 (H3N2)-like strain B/Shanghai/361/2002-like strain 2006/ A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-like strain A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)-like strain B/Malaysia/2506/2004-like strain Όπως φαίνεται ο υπότυπος με τις συχνότερες μεταλλάξεις είναι ο Α(Η3Ν2) και για το λόγο αυτό το στέλεχος του εμβολίου κάθε χρόνο για τον υπότυπο αυτό διαφέρει Στη Ρωσία και τις ΗΠΑ κυκλοφορεί και εμβόλιο που περιέχει ζωντανό ιό και χορηγείται μέσω της αναπνευστικής οδού (από τη μύτη). Ο ιός έχει την ΝΑ και την ΗΑ του στελέχους που κυκλοφορεί ενώ οι υπόλοιπες πρωτεΐνες του προέρχονται από εργαστηριακό μη μολυσματικό στέλεχος. Το εμβόλιο αυτό στην Αμερική έχει εγκριθεί μόνο για ηλικίες από 5-49 ετών, επειδή μπορεί να προκαλέσει συμπτώματα λοίμωξης του αναπνευστικού Εμβόλια υπό έρευνα Συνεχής έρευνα επικεντρώνεται στην παρασκευή νέων βελτιωμένων εμβολίων, που θα έχουν καλύτερη και αμεσότερη ανοσολογική αντίδραση και που δεν θα χρειάζεται να μεταβάλλονται ετησίως. Συγκεκριμένα όσο αφορά στα εμβόλια με απενεργοποιημένους ιούς, φαίνεται ότι αν περιέχουν και τμήματα HA και ΝΑ που περιβάλλονται από λεκιθίνη προκαλούν εντονότερη παραγωγή αντισωμάτων. Τα εμβόλια που χορηγούνται μέσω της αναπνευστικής οδού αποτελούν πιθανή λύση στο πρόβλημα της ετήσιας αλλαγής του εμβολίου, αφού όμως ξεπεραστούν τα προβλήματα που προκαλούν οι παρενέργειες από τη χορήγησή τους. Υπό έρευνα είναι επίσης και εμβόλιο που χορηγείται διαδερμικά, 45

46 καθώς τα πρώτα στοιχεία δείχνουν ότι με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται υψηλή παραγωγή IgG αντισωμάτων αλλά και χαμηλή μόλυνση του βλεννογόνου με παραγωγή IgA. 71 Σημαντική είναι και η έρευνα που γίνεται γύρω από τη βελτίωση των συστατικών του εμβολίου. Ο εμπλουτισμός του με τμήματα ΝΑ φαίνεται να κάνει το εμβόλιο πιο αποτελεσματικό. Επίσης η χρήση των συντηρημένων (conserved) ΗΑ τμημάτων προκαλεί ανοσία έναντι των διαφόρων υποτύπων του ιού ανεξάρτητα από τυχόν μεταλλάξεις, καθώς είναι κοινά για όλους τους ιούς. Μολονότι η ικανότητα της Μ2 πρωτεΐνης να προκαλεί την παραγωγή αντισωμάτων είναι χαμηλή σε σχέση με την ΝΑ και την ΗΑ, παρατηρήθηκε ότι προκαλεί μερική προστασία έναντι όλων των υποτύπων των ιών γρίπης Α. 72 Μελλοντική λύση αποτελούν και τα DNA εμβόλια. Έχει δοκιμαστεί η χρήση ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA που εκφράζει το γονίδιο της NP πρωτεΐνης, καθώς είναι κοινό για όλους τους τύπους του ιού της γρίπης. Προκαλεί μερική προστασία αλλά δεν είναι τόσο αποτελεσματικό όσο το DNA εμβόλιο που περιέχει το γονίδιο της HA ή της ΝΑ πρωτεΐνης. Φαίνεται επίσης ότι η χρήση του κλάσματος C3d του συμπληρώματος σε συνδυασμό με το DNA της αιμοσυγκολλητίνης προκαλεί διασταυρούμενη ανοσία έναντι όλων των τύπων του ιού της γρίπης. 72 Σημαντική είναι και η έρευνα που γίνεται γύρω από τα ανασυνδυασμένα εμβόλια που περιέχουν ζωντανούς ιούς χαμηλής παθογόνου δράσης. Με την πρόοδο της γενετικής μηχανικής είναι θέμα χρόνου το να επιτευχθεί η δημιουργία ανασυνδυασμένων ιών γρίπης Α και Β από τα cdna, δίνοντας έτσι τη δυνατότητα στην επιλογή συνδυασμού και των 8 γονιδίων του ιού στο εμβόλιο. Τα πρώτα στοιχεία δείχνουν ότι τέτοια εμβόλια όχι μόνο προκαλούν υψηλή παραγωγή IgG αντισωμάτων στον ορό και υψηλή παραγωγή IgA αντισωμάτων από το βλενογόνο αλλά και ότι τα εμβόλια αυτά προστατεύουν από όλους τους τύπους των ιών γρίπης. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό στην περίπτωση του ιού της γρίπης των πτηνών

47 7.1.3 Εμβόλια έναντι της γρίπης των πτηνών Η παραγωγή ενός νέου εμβολίου για την αντιμετώπιση της γρίπης από τον ιό Α(Η5Ν1) μπορεί να αρχίσει από τη στιγμή που θα εμφανιστεί και θα απομονωθεί το πανδημικό στέλεχος, καθώς είναι αδύνατη η πρόβλεψη για τον ιό που θα προκαλέσει πανδημία. Λαμβάνοντας υπόψη τη διαδικασία παραγωγής του εμβολίου, το χρονικό περιθώριο μέχρι να γίνει διαθέσιμο, είναι περίπου 6 μήνες. Με βάση τα ανωτέρω, στα πρώτα στάδια της πανδημίας (1 ο εξάμηνο) είναι απίθανο να υπάρξει ειδικό εμβόλιο. Ωστόσο, ήδη από το 1997 γίνονται προσπάθειες παραγωγής εμβολίων με ανασυνδυασμένους ιούς. Επειδή η ΗΑ του ιού είναι ο πιο σημαντικός στόχος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων, γι αυτό και αποτελεί βασικό συστατικό των σημερινών εμβολίων. Οι προσπάθειες επικεντρώνονται στην παραγωγή εμβολίων είτε με αδρανοποιημένους ιούς, ή με υπομονάδες του ιού εκφρασμένες σε μικροοργανισμούς-οχήματα (vector expressed subunit vaccines), όπως αδενοϊούς, ή τέλος με γενετικό υλικό, των οποίων όμως η χρησιμότητα είναι αμφίβολη, δεδομένης της αντιγονικής διαφοροποίησης του ιού από το 1997 μέχρι σήμερα. 73 Πιο πρόσφατα έχουν δημιουργηθεί ανασυνδυασμένα στελέχη Α(Η5Ν1), τα οποία αντιπροσωπεύουν διάφορες γενετικές υπο-ομάδες του ιού και συμπεριλαμβάνουν HA πρόσφατων ιών στους οποίους έχουν παρατηρηθεί φαινόμενα αντιγονικής εκτροπής από το Ένα από αυτά είναι ήδη έτοιμο για χρήση και πρόκειται για το εμβόλιο από το στέλεχος A/Indonesia/5/2005 (Η5Ν1) που παρήχθη στο Κέντρο Ελέγχου Νοσημάτων (Centre of Disease Control, CDC) στην Ατλάντα των ΗΠΑ To CDC προτείνει τη χρήση εμβολίου που να περιέχει στελέχη και από τους τρεις κλάδους του ιου Α(Η5Ν1) που κυκλοφόρησαν στους ανθρώπους, δηλαδή εκτός από το A/Indonesia/5/2005 να περιλαμβάνει το A/Bar headed goose/qinghai/1a/2005 και το A/Anhui/1/ Με την τεχνική της γενετικής μηχανικής, παράγονται ανασυνδυασμένα μη παθογόνα πρότυπα στελέχη του ιού με ομόλογη ΗΑ (Η5) που όμως έχει χάσει τα πολυβασικά αμινοξέα στο σημείο διάσπασης της (polybasic cleavage site) και επομένως το στέλεχος έχει χάσει την υψηλή του παθογένεια. Τα ανασυνδυασμένα αυτά στελέχη είναι έτοιμα, ως υποψήφια, για παραγωγή εμβολίων όταν υπάρξει άμεση ανάγκη. 47

48 Ένα εμβόλιο που θα κάλυπτε όλες τις μοριακές και αντιγονικές αλλαγές του ιού θα ήταν το πλέον χρήσιμο, κάτι που έχει αποδειχτεί σε ερευνητικά μοντέλα ζώων. Η πιο ελπιδοφόρα προσέγγιση βασίζεται σε εμβόλια που θα επάγουν την παραγωγή αντισωματων έναντι πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από περιοχές του γονιδιώματος του ιού που θεωρούνται γενετικά σταθερές. 75 Οι τελευταίες έρευνες προς αυτή την κατεύθυνση στρέφονται στη δημιουργία εμβολίων που θα περιέχουν την εξωτερική περιοχή της πρωτεΐνης Μ2 και την εσωτερική υπομονάδα της ΗΑ ως ανοσογόνα. 76 Είναι βέβαια πιθανό να υπάρχουν και άλλες γενετικά σταθερές περιοχές που να επάγουν την παραγωγή προστατευτικών αντισωμάτων και ήδη ερευνητικά αναζητούνται, ενώ παράλληλα υπάρχουν ενδείξεις ότι εμβόλια που περιέχουν τμήματα μόνο ενός ιού μπορεί να είναι λιγότερο αποτελεσματικά από αυτά που περιέχουν ολόκληρο το σωματίδιο του ιού. 33 Επομένως με τα αντιφατικά δεδομένα των ερευνών όλα τα ενδεχόμενα είναι ανοιχτά μέχρις ότου ανεβρεθεί εμβόλιο αποτελεσματικό και ασφαλές για την προστασία του ανθρώπου από τη γρίπη των πτηνών Προβληματισμοί για τη χρήση εμβολίων Παρά τη χρησιμότητα του εμβολιασμού υπάρχουν και κάποιοι περιορισμοί όπως αναφέρονται παρακάτω: 1) τα επίπεδα εμβολιασμού στον πληθυσμό είναι χαμηλά και έτσι δεν μπορεί να επιτευχθεί γενικευμένη ανοσία 2) η αποτελεσματικότητα του εμβολίου μειώνεται στις ευπαθείς ομάδες του πληθυσμού όπως είναι τα βρέφη, οι υπερήλικες και οι ανοσοκατεσταλμένοι 3) η συνεχής αντιγονικη εκτροπή δημιουργεί την ανάγκη για ετήσια αναπροσαρμογή της σύνθεσης του εμβολίου 4) το ίδιο το φαινόμενο της αντιγονικής μεταβολής, με την πιθανότητα δημιουργίας νέου στελέχους ιού ανά πάσα στιγμή. Από τα ανωτέρω προκύπτει ότι εκτός από τα εμβόλια, η παραγωγή αντιιικών φαρμάκων είναι επιτακτική. Έτσι εκτεταμένη έρευνα επικεντρώνεται στην δημιουργία αντιιικών φαρμάκων που θα στοχεύουν στη θεραπεία της νόσου και όχι στην πρόληψη από αυτήν. 48

49 7.2 Αντιιικά φάρμακα Αναστολείς της μητρικής πρωτεΐνης 2 Υπάρχουν δύο κατηγορίες φαρμάκων που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο. Η πρώτη περιλαμβάνει τις κυκλικές αμίνες Αμανταδίνη (Symmetrel) και Ριμανταδίνη (Flumadine) που αναστέλλουν τη λειτουργία της μεμβρανικής πρωτεΐνης Μ2. Η Μ2 υπάρχει σε μικρές ποσότητες στον ιό και αποτελεί το δίαυλο ιόντων στο σωματίδιό του. Η λειτουργία της είναι η ρύθμιση του ph, κάτι ιδιαίτερα σημαντικό στα αρχικά στάδια της αναπαραγωγής του ιού. Μειονεκτήματα των αναστολέων της Μ2 πρωτεΐνης είναι ότι εμφανίζουν σημαντικές ανεπιθύμητες παρενέργειες, ότι γρήγορα οι ιοί γρίπης Α αποκτούν αντοχή κατά τη διάρκεια της χρήσης τους και ότι είναι δραστικοί μόνο έναντι των ιών γρίπης Α. Πέραν τούτων η ριμανταδίνη δεν κυκλοφορεί στην Ελλάδα. Οπως έχει ανακοινώσει ο ΠΟΥ υπάρχουν πέντε κρίσιμες μεταλλάξεις στο γονίδιο της Μ2 πρωτεΐνης που συνδέονται με την ανθεκτικότητα στους αναστολείς της. Αυτές είναι : α) Αντικατάσταση της λευκίνης με φαινυλαλανίνη στη θέση 26, β) της βαλίνης με αλανίνη ή θρεονίνη στη θέση 27, γ) της αλανίνης με θρεονίνη ή βαλίνη στη θέση 30, δ) της σερίνης με ασπαραγίνη ή αργινίνη στη θέση 31 και ε) της γλυκίνης με γλουταμικό οξύ στη θέση 34, στο διαμεμβρανικό τμήμα της M2 πρωτεΐνης (transmembrane domain). Οι μεταλλάξεις αυτές προκαλούν ανθεκτικότητα στα αντιιικά φάρμακα, αμανταδίνη και ριμανταδίνη. 77 Για το λόγο αυτό, αλλά και λόγω των παρενεργειών τους ο ΠΟΥ δεν συστήνει πλέον τη χρήση τους κατά τη διάρκεια της εποχικής γρίπης Αναστολείς της νευραμινιδάσης Η δεύτερη κατηγορία αντιιικών φαρμάκων περιλαμβάνει τους αναστολείς της νευραμινιδάσης (ΝΑ) του ιού, τη ζαναμιβίρη (Relenza) και οσελταμιβίρη (Tamiflu). Υπό εξέλιξη είναι και η παραγωγή ενός τρίτου φαρμάκου της ίδιας κατηγορίας, του Peramivir. 78 Η ΝΑ αποτελεί το δεύτερο στόχο των αντισωμάτων. Καταλύει τη διάσπαση των γλυκοζιδικών δεσμών μεταξύ κυττάρου-ξενιστή και ιού έτσι ώστε να επιτευχθεί η απελευθέρωση των νεοσχηματισμένων ιών από το κύτταρο-ξενιστή. Η αναστολή της λειτουργίας της ΝΑ 49

50 αποτελεί το στόχο του πιο διαδεδομένου μέχρι στιγμής αντιγριπικού φαρμάκου, του Tamiflu. Με τη χρήση των αναστολέων της ΝΑ, εάν χορηγηθούν εγκαίρως, ελαττώνεται η διάρκεια της νόσου, η αποτελεσματικότητά τους όμως όσον αφορά στην ελάττωση των επιπλοκών δεν έχει τεκμηριωθεί. Πλεονέκτημα αποτελεί η αποδεδειγμένη ταχεία δράση τους, η αποτελεσματικότητά τους που ξεπερνά το 80% και το γεγονός ότι η δραστικότητά τους περιλαμβάνει όλα τα στελέχη του ιού της γρίπης, συμπεριλαμβανομένου και του A(H5Ν1). Οι παρενέργειες σε σχέση με τους αναστολείς της Μ2 είναι μικρότερες και ο κίνδυνος εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών είναι μειωμένος. 76 Ωστόσο, ανθεκτικά στελέχη έχουν απομονωθεί σε ασθενείς μετά από χρήση του φαρμάκου και οι παραλλαγές της νευραμινιδάσης που προκαλούν ανθεκτικότητα έχουν διαπιστωθεί και είναι οι εξής: E119G, R292K, N294S, H274Y. Ακόμη συγκεκριμένες παραλλαγές στην αιμοσυγκολλητίνη των ιών σε συνδυασμό με τις προαναφερθέντες παραλλαγές στη νευραμιδάση τους, φαίνεται να συνδέονται με την ανθεκτικότητα στους αναστολείς της ΝΑ, αλλά μέχρι σήμερα υπάρχουν μόνο σποραδικά στοιχεία από ασθενείς που έκαναν χρήση του φαρμάκου. Τέτοιες μεταλλάξεις είναι οι S262Ν, R229 και R198T, περαιτέρω έρευνες όμως χρειάζονται για την αξιολόγησή τους. 81 Κατά την τελευταία περίοδο της γρίπης , εμφανίσθηκαν στελέχη γρίπης Α(Η1Ν1) που πιθανώς μέσω ενός τυχαίου φαινομένου αντιγονικής εκτροπής απέκτησαν την παραλλαγή στο αμινοξύ Η274Υ και κατά συνέπεια ανθεκτικότητα στην οσελταμιβίρη. Το γεγονός αυτό έχει προκαλέσει μεγάλη ανησυχία στην επιστημονική κοινότητα. 82 Επειδή τα αντιιικά φάρμακα αποβλέπουν μόνο στη θεραπεία και η ανοσία επιτυγχάνεται μόνο μέσω του εμβολιασμού, ιδανικά θα πρέπει να αναπτυχθεί μια συνδυασμένη στρατηγική χορήγησης φαρμάκων και εμβολιασμού ειδικά στην περίπτωση εμφάνισης πανδημικού στελέχους Α(Η5Ν1). 50

51 7.2.3 Αντιιική προστασία έναντι της γρίπης των πτηνών Τα φάρμακα που προαναφέρθηκαν θεωρούνται αποτελεσματικά όταν χορηγηθούν κατά την έναρξη των κλινικών συμπτωμάτων και έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν τη διάρκεια του πυρετού και των κλινικών εκδηλώσεων της λοίμωξης. Δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι μειώνουν τη θνητότητα ή προλαμβάνουν τις επιπλοκές. Έρευνες έχουν δείξει ότι τα περισσότερα στελέχη Α(Η5Ν1) που έχουν απομονωθεί από το 1997 και μετά είναι ανθεκτικά στους αναστολείς της Μ2 πρωτεΐνης, όμως τα στελέχη που απομονώθηκαν από τα πρόσφατα κρούσματα γρίπης πτηνών σε ανθρώπους στην Τουρκία ήταν ευαίσθητα στην αμανταδίνη. 83 Ο ΠΟΥ (CDC/WHO Avian Influenza Response Team, 2004) έχει ανακοινώσει τις 4 μεταλλάξεις που έχουν εμφανιστεί σε στελέχη ιών Α(Η5Ν1) και έχουν σχέση με την αντοχή τους στα αντιιικά φάρμακα. Ανάλυση της M2 πρωτεΐνης των στελεχών Α(Η5Ν1) που απομονώθηκαν από ανθρώπινα κρούσματα στην Ταϊλάνδη έδειξε ότι περιείχαν ασπαραγίνη αντί σερίνης στη θέση 31, υποδηλώνοντας επίσης αντίσταση στη ριμανταδίνη και την αμανταδίνη. Τα ίδια στελέχη είχαν, επίσης, αντικατάσταση της ισολευκίνης με λευκίνη στη θέση 26 της Μ 2 πρωτεΐνης, αλλά η τελευταία αυτή μετάλλαξη ίσως δεν επηρέασε την ανθεκτικότητα του ιού, λόγω της ομοιότητας των δύο αμινοξέων. 72 Λόγω της εκτεταμένης ανθεκτικότητας στην αμανταδίνη που εμφανίζουν τα στελέχη Α(Η5Ν1) ο ΠΟΥ με έγγραφό του στις 17 Μαρτίου 2006 προτείνει τη χρήση της οσελταμιβίρης για προφύλαξη και θεραπεία. Σε αυτό το έγγραφο συγκεντρώνει όλα τα μέχρι τώρα στοιχεία για τη δραστικότητα του φαρμάκου έναντι του Α(Η5Ν1). Λόγω έλλειψης κλινικών δοκιμών σε ανθρώπους που νόσησαν από Α(Η5Ν1) οι δόσεις που προτείνονται είναι οι ίδιες με της κοινής γρίπης, Α(Η1Ν1) και Α(Η3Ν2), και η δραστικότητα του φαρμάκου υπολογίζεται από την αντίστοιχη σε πειραματικά μοντέλα ζώων. 84 Όμως τον Νοέμβριο του 2007, στελέχη Η5Ν1 που απομονώθηκαν από κρούσματα στην Αίγυπτο βρέθηκαν να έχουν τη μετάλλαξη Ν294S στο γονίδιο της νευραμινιδάσης που προκαλεί ανθεκτικότητα στην οσελταμιβίρη. 83 Οπότε, πλέον, απαιτείται προσοχή και στη χρήση της οσελταμιβίρης. 51

52 7.2.4 Αντιιικά φάρμακα υπό έρευνα Μετά από αυτά τα δεδομένα, προκλινικές μελέτες σήμερα επικεντρώνονται στη χρήση αναστολέων των δράσεων του κυττάρουξενιστή. Πολλά υποσχόμενοι φαίνεται να είναι οι αναστολείς των κινασών MAPK (Μitogen Αctivated Protein Kinase), ERK (Extracellular Signal Regulated Kinase) και πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC). 85 Οι ΜΑΡΚ αναστολείς εμποδίζουν την έξοδο των νεοσχηματιζόμενων ριβονουκλεοπρωτεϊνών του ιού από τον πυρήνα και οι ΕRK και PKC αναστολείς εμποδίζουν την είσοδο του ιού στο κύτταρο με την ενδοκυττάρωση. Ένα ακόμα φάρμακο, η Ribavirin εμποδίζει τη μεταγραφή των ιικών mrna, ενώ οι αναστολείς της Η + - ATPase μεταβάλλουν τις συνθήκες του ph για τις αλλαγές της ΗΑ πρωτεΐνης κατά την είσοδο του ιού στο κύτταρο. 85 Υπό δοκιμή είναι επίσης και οι αναστολείς των πρωτεασών, που ρόλος τους είναι η διάσπαση του μορίου της ΗΑ0 σε ΗΑ1 και ΗΑ2. 6 Ακόμα έρευνες γίνονται και στη χρήση αναστολέων με στόχο ιικές πρωτεΐνες ή δράσεις. Τα ανάλογα του σιαλικού οξέως θα μπορούσαν να επηρεάσουν την επικόλληση του ιού στην επιφάνεια του κυττάρου-ξενιστή. Τα παράγωγα της κινόνης και της υφροξυκινόνης φαίνεται ότι εμποδίζουν την αλλαγή της τρισδιάστατης δομής της ΗΑ. Οι αναστολείς της πολυμεράσης PB2 του ιού καταστέλλουν τη μεταγραφή των ιικών mrna και κάποια συνθετικά τμήματα RNA (phosphotothioate oligos) εμποδίζουν τη δράση των πολυμερασών του ιού και έτσι σταματάνε την αναπαραγωγή των ιικών γονιδίων. 85 Όλα αυτά τα φάρμακα βρίσκονται σε προκλινικές μελέτες και κανένα ακόμα δεν είναι διαθέσιμο στο εμπόριο. 52

53 7.2.5 Εργαστηριακός έλεγχος ανθεκτικότητας σε αντιιικά φάρμακα Ανεύρεση της αλληλουχίας των βάσεων (DNA sequencing) Η μοριακή διερεύνηση των στελεχών της γρίπης με τη μέθοδο αλληλούχησης είναι μια εκ των ευρέως χρησιμοποιούμενων τεχνικών για την ανίχνευση των γνωστών μεταλλάξεων που προσδίδουν στον ιό ανθεκτικότητα στην αμανταδίνη, τη ριμανταδίνη, την οσελταμιβίρη και τη ζαναμιβίρη. Οι μεταλλάξεις αυτές βρίσκονται για τις μεν αδαμαντάνες στο γονίδιο της Μ2 πρωτεΐνης του ιού και συγκεκριμένα είναι οι L26F, V27A ήt, A30T ή V, S31N ή R, για τις δε οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη οι μεταλλάξεις αυτές συγκεντρώνονται στο γονίδιο ΝΑ και είναι οι Ε119G, R292K, N294S και Η274Υ. 79,81 Μέθοδος Pyrosequencing Για την ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου της Μ2, νέα μοριακή μέθοδο αποτελεί και το Pyrosequencing. Είναι ένα είδος ταχείας αλληλούχισης μικρών τμημάτων DNA. Με αυτή τη μέθοδο μπορούν να ανιχνευτούν γνωστές αλλά και άγνωστες μεταλλάξεις που συγκεντρώνονται σε περιορισμένη αλληλουχία DNA (~ 200 βάσεις) σε πολύ σύντομο διάστημα 20 λεπτών. Χρησιμεύει όταν απαιτείται έλεγχος μεγάλου αριθμού δειγμάτων και άμεσο αποτέλεσμα Μέθοδος ELISA Με την ανοσοενζυμική αυτή μέθοδο δίνεται ποιοτικό αποτέλεσμα (θετικό ή αρνητικό) ως προς την ανθεκτικότητα των στελεχών έναντι της αμανταδίνης. Μέθοδος φθορισμού MUNANA Με τη μέθοδο αυτή επιτυγχάνεται ο προδιορισμός της δράσης της νευραμινιδάσης των στελεχών γρίπης Α και Β. Χρησιμοποιούνται στελέχη ιών που έχουν καλλιεργηθεί σε κύτταρα. Το υπόστρωμα 2 - (4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic (MUNANA) που χρησιμοποιείται δίνει τη δυνατότητα να προσδιορίζεται η δράση της νευραμινιδάσης καθώς είναι ένα φθορίζον υπόβαθρο που κατακερματίζεται με τη δράση της. Αρχικά τα στελέχη τιτλοποιούνται, ώστε η δράση της οσελταμιβίρης να εκτιμηθεί έναντι κοινού τίτλου ενζύμου για κάθε στέλεχος. Διαδοχικές αραιώσεις D-tartarate salt of oseltamivir carboxylate προεπωάζονται παρουσία των στελεχών και ακολουθεί προσθήκη του υποστρώματος MUNANA και μέτρηση του 53

54 παραγόμενου φθορισμού. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η συγκέντρωση οσελταμιβίρης που προκαλεί μείωση της ενεργότητας του ενζύμου κατά 50% (IC50). Η δράση της ΝΑ εκτιμάται από το φθορισμό που εκπέμπεται από το υπόβαθρο, με τη χρήση πρότυπης καμπύλης. 94 Plaque assay Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην καλλιέργεια των ιών σε κύτταρα MDCK-SIAT1 και στη συνέχεια ποσοτική μέτρηση των πλακών λύσεων των κυττάρων παρουσία του αντιιικού φαρμάκου σε διάφορες συγκεντρώσεις του. Είναι ημιποσοτική μέθοδος και μπορεί να διερευνήσει την ανθεκτικότητα των ιών έναντι όλων των αντιιικών φαρμάκων που κυκλοφορούν

55 8. Παγκόσμια παρακολούθηση Γρίπης Η ιδέα για ένα διεθνές δίκτυο παρακολούθησης της γρίπης είχε πρωτοαναφερθεί το Το 1948 μετά την ίδρυση του ο Π.Ο.Υ. ανέλαβε την οργάνωσή του δικτύου αυτού. Σήμερα υπάρχουν 122 Εθνικά Κέντρα Γρίπης σε 94 χώρες που συμμετέχουν στο WHO Influenza Surveillence System. Σκοπός του δικτύου είναι η ανίχνευση των νεο-εμφανιζόμενων στελεχών γρίπης των γνωστών τύπων και υποτύπων του ιού, αλλά και η ανίχνευση νέων υποτύπων του ιού στον πληθυσμό. Οι πληροφορίες που συλλέγονται, χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία των εμβολίων. Έμφαση έχει δοθεί τα τελευταία χρόνια και στον έλεγχο της ανθεκτικότητας των ιών που κυκλοφορούν έναντι των αντιιικών φαρμάκων αμανταδίνη, ριμανταδίνη, οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη. Τέσσερα εργαστήρια ανά τον κόσμο, στο Λονδίνο, στο Τόκιο, στη Μελβούρνη και στην Ατλάντα είναι τα Διεθνή Εργαστήρια Αναφοράς της Γρίπης τα οποία διενεργούν λεπτομερείς μοριακές και αντιγονικές αναλύσεις των στελεχών που αποστέλλονται σε αυτά από όλα τα υπόλοιπα Κέντρα Αναφοράς Γρίπης. Στο CDC (Centre for Disease Control and prevention) της Ατλάντα των ΗΠΑ δημιουργούνται και παράγονται τα αντιγόνα και οι αντιοροί που στέλνονται σε όλα τα Κέντρα Αναφοράς Γρίπης έτσι ώστε να μπορούν να πραγματοποιήσουν την τυποποίηση των στελεχών που κυκλοφορούν στη χώρα τους. Όταν για οποιοδήποτε λόγο ένα Κέντρο Αναφοράς Γρίπης δεν δύναται να τυποποιήσει ένα στέλεχος, τότε το αποστέλει σε ένα από τα Διεθνή Εργαστήρια Αναφοράς για περαιτέρω ανάλυση. 94 Τα εβδομαδιαία αποτελέσματα της παρακολούθησης των επιδημιών δηλώνονται στην ειδική ιστοσελίδα του WHO FLUNET. Στα πλαίσια της παρακολούθησης της εκάστοτε επιδημίας το κάθε Εθνικό Κέντρο Γρίπης στέλνει αντιπροσωπευτικά στελέχη των ιών που έχει απομονώσει σε ένα από τα Διεθνή Εργαστήρια Αναφοράς για τον πλήρη έλεγχο και τη χρήση των στελεχών ως υποψήφια στελέχη εμβολίων. Στην Ελλάδα υπάρχουν δύο Εθνικά Κέντρα Γρίπης, το ένα ελέγχει την περιοχή της Βόρειας Ελλάδας και εδράζεται στο Β Εργαστήριο Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ και το άλλο στην περιοχή της Νότιας Ελλάδας και λειτουργεί στο Ινστιτούτο 55

56 Παστέρ στην Αθήνα. Τα δείγματα ασθενών που φτάνουν στα Κέντρα προέρχονται από ένα δίκτυο ιατρών του ΙΚΑ, των Κέντρων Υγείας και των Νοσοκομείων (Sentinel) που έχει οργανωθεί από το ΚΕΕΛΠΝΟ. 56

57 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 57

58 1. Σκοπός Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μοριακή μελέτη των ιών της γρίπης Α(Η3Ν2) που κυκλοφόρησαν στη Βόρεια Ελλάδα κατά τις τρεις τελευταίες περιόδους γρίπης ( , και ), η συσχέτιση τους με στελέχη της ίδιας χρονικής περιόδου από άλλες χώρες, η σύγκριση αυτών με τα στελέχη του εμβολίου που χορηγήθηκε την κάθε περίοδο και ο έλεγχος της ευαισθησίας τους στα αντιιικά φάρμακα αμανταδίνη, ριμανταδίνη και οσελταμιβίρη, ζαναμιβίρη. Για τους ελέγχους αυτούς χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές καλλιεργητικής απομόνωσης των ιών και μοριακές τεχνικές ώστε να ανιχνευθούν οι μεταλλάξεις που έφεραν τα στελέχη που κυκλοφόρησαν στη χώρα μας. Μελετήθηκαν τυχόν μεταλλάξεις στα γονίδια της αιμοσυγκολλητίνης, της νευραμινιδάσης και της μητρικής πρωτεΐνης 2 (Μ2). Η παρακολούθηση των στελεχών κατά τη διάρκεια των ετήσιων εξάρσεων ή/και επιδημιών είναι ιδιαίτερα σημαντική, και σε επίπεδο έρευνας αλλά και σε επίπεδο πρακτικής, καθώς με τον τρόπο αυτό το εργαστήριο συμβάλλει στην επιλογή των στελεχών των εμβολίων αλλά και στις προβλέψεις για εμφάνιση νέων επιδημικών ή ακόμα και πανδημικών στελεχών. Ιδιαίτερα υπό την απειλή μιας νέας πανδημίας η συνεχής επαγρύπνιση έχει γίνει κρίσημη. Απαραίτητη είναι επίσης και η γνώση της ευαισθησίας, έναντι των αντιιικών φαρμάκων των στελεχών της περιοχής μας, με γενικό αλλά και τοπικό ενδιαφέρον. Επιλέχτηκε για τη μελέτη μας ο υπότυπος Α(Η3Ν2) γιατί ήταν εκείνος που κυκλοφορεί στη χώρα μας αλλά και σε παγκόσμιο επίπεδο συχνότερα από τους υπόλοιπους και κυκλοφόρησε και στις τρεις περιόδους γρίπης που εξετάσθηκαν. 53 Επίσης γιατί υφίσταται συχνότερα μεταλλάξεις και συνδέεται με βαρύτερη μορφή νόσου και υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας διεθνώς. 58

59 2.Υλικό Το υλικό της εργασίας αποτέλεσαν 438 δείγματα ασθενών με γριπώδη συνδρομή από τη Βόρεια Ελλάδα, η συλλογή των οποίων έγινε κατά τις περιόδους , και Συγκεκριμένα κατά την περίοδο συλλέχθηκαν 170, κατά την περίοδο , 140 και κατά την περίοδο , 128 κλινικά δείγματα. Τα δείγματα στάλθηκαν στο Κέντρο Αναφοράς Γρίπης της Βόρειας Ελλάδας, που στεγάζεται στο Β Μικροβιολογικό Εργαστήριο της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ στα πλαίσια του Παγκόσμιου Προγράμματος Παρακολούθησης της Γρίπης (Global Influenza Surveillance Scheme). Συλλέχθηκαν από το δίκτυο Sentinel, ένα δίκτυο ιατρών του ΙΚΑ, των Κέντρων Υγείας και των Νοσοκομείων, που έχει οργανωθεί από το Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ). Στα σχεδιαγράμματα που παρατίθενται παρουσιάζονται οι περιοχές της Βορείου Ελλάδας απ όπου κατ έτος προήλθαν τα δείγματα. Συγκεκριμένα, κατά την περίοδο από τα 170 κλινικά δείγματα, το 77% προήλθε από την Κεντρική Μακεδονία, 3% από την Δυτική Μακεδονία και 20% των δειγμάτων προήλθε από τη Θράκη. (Εικ. 5) Κλινικά δείγματα περιόδου % 3% Κεντρική Μακεδονία Δυτική Μακεδονία Θράκη 77% Εικόνα 5. Γεωγραφική κατανομή κλινικών δειγμάτων από ασθενείς με γρίπωδη συνδρομή κατά την περίοδο

60 Αντίστοιχα από τα 140 κλινικά δείγματα της περιόδου , το 67% προήλθε από την Κεντρική Μακεδονία, 25% από τη Θράκη, 1% από την Ήπειρο, 4% από τη Δυτική Μακεδονία και 3% από τη Θεσσαλία. (Εικ. 6) Κλινικά δείγματα περιόδου % 4% 1% 25% Κεντρικη Μακεδονία Θράκη Ηπειρος Δυτική Μακεδονία Θεσσαλία 67% Εικόνα 6. Γεωγραφική κατανομή κλινικών δειγμάτων από ασθενείς με γριπώδη συνδρομή κατά την περίοδο Τέλος κατά την περίοδο , από τα 128 δείγματα, το 62% προήλθε από την Κεντρική Μακεδονία, 26% των δειγμάτων προήλθε από τη Θράκη, 10% από τη Δυτική Μακεδονία και 2% από τη Θεσσαλία.(Εικ. 7) 60

61 Κλινικά δείγματα περιόδου % 2% 26% 62% Κεντρική Μακεδονία Θράκη Δυτική Μακεδονία Θεσσαλία Εικόνα 7. Γεωγραφική κατανομή κλινικών δειγμάτων από ασθενείς με γριπώδη συνδρομή κατά την περίοδο Τα κλινικά δείγματα ήταν φαρυγγικά εκπλύματα ή επιχρίσματα που συλλέγονταν με βαμβακοφόρους στειλεούς, κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων ημερών από την εκδήλωση των συμπτωμάτων της λοίμωξης. Σε φυαλύδια που περιείχαν 10ml και 5ml αντίστοιχα από το ειδικό υλικό μεταφοράς 2-SP (Sucrose- Phosphate medium) τοποθετούνταν οι βαμβακοφόροι στειλεοί και τα εκπλύματα από το φάρυγγα. Η μεταφορά των δειγμάτων γίνονταν 1-2 ημέρες από τη λήψη του δείγματος σε θερμοκρασία δωματίου (22 C). Αντιβιοτικά προστίθενταν στο κλινικό δείγμα κατά την παραλαβή του στο εργαστήριο, για την αποφυγή επιμολύνσεως από μικροοργανισμούς. Τα αντιβιοτικά αυτά ήταν, για τα φαρυγγικά εκπλύματα και επιχρίσματα, Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη (Pen/Strep 10000μg/ml, Gibco, UK) 400μl ή 300 μl αντίστοιχα, αμφοτερικίνη Β (250μg/ml, Gibco, UK) 400μl ή 300μl αντίστοιχα και γενταμυκίνη (80mg/vial, Gibco,UK) 100μl ή 50μl αντίστοιχα. Όλα τα δείγματα διατηρούνταν σε θερμοκρασία +4 C μέχρι την εξέτασή τους και συνοδεύονταν από ειδικό πρωτόκολλο του ΚΕΕΛΠΝΟ με επιδημιολογικές πληροφορίες για τους ασθενείς και την κλινική τους εικόνα. Παρατίθεται ένα δείγμα του πρωτοκόλλου αυτού. 61

62 ΣΥΝΟΔΕΥΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΠΟΣΤΟΛΗΣ ΡΙΝΟΦΑΡΥΓΓΙΚΟΥ ΕΠΙΧΡΙΣΜΑΤΟΣ/ΕΚΠΛΥΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Για πληροφορίες από Εργαστήρια Αναφοράς: Νοτ. Ελλάδας: Βορ. Ελλάδας: Υποκατάστημα: ΕΒΔ* Γιατρός (αρχικά): Α.Α. ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ* Δείγμα: Ρινικό επίχρισμα Φαρυγγικό επίχρισμα Φαρυγγικό έκπλυμα Ημ/νία λήψης δείγματος: / / * Αφήστε κενό ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΣΘΕΝΟΥΣ ΗΜ/ΝΙΑ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ* Α.Α. ΣΤΟ ΚΕΕΛ* / / Επώνυμο: Όνομα: Ηλικία: Ετών (Σημειώστε ηλικία σε συμπληρωμένα (κλεισμένα) έτη. Εάν ηλικία <1 έτους: σημειώστε " 0 ") Φύλο: Άνδρας/αγόρι Γυναίκα/κορίτσι Κατοικία: Νομός: Πόλη/χωριό: ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Ημ/νία έναρξης συμπτωμάτων: / / Εμβολιασμός για γρίπη κατά τη φετεινή περίοδο (δηλ. από τελευταίο Σεπτέμβριο): ΟΧΙ ΝΑΙ Κλινικές εκδηλώσεις: 62

63 Πυρετός ΟΧΙ ΝΑΙ Μέγιστος πυρετός: C Αιφνίδια έναρξη συμπτ. ΟΧΙ Καταβολή ΟΧΙ Βήχας ΟΧΙ Κεφαλαλγία ΟΧΙ Καταρροή ΟΧΙ Μυαλγίες ΟΧΙ Πονόλαιμος ΟΧΙ Ενδείξεις πνευμονίας ΟΧΙ Επιπλοκές ΟΧΙ ΝΑΙ Τι/Πότε; Αφήστε κενά τα παρακάτω ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ - Απομόνωση ιού γρίπης; - Απομόνωση άλλου ιού; ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ ΝΑΙ Εργ. Αν. Νοτ. Ελλάδας Εργ. Αν. Βορ. Ελλάδας Ταυτοποίηση: Τι; Δελτίο ΟΝ1-ΣΠΝ2(ΓΡΙ)-Νο.1/

64 3.Μέθοδοι 3.1 Ταχεία Ανίχνευση Μοριακή τυποποίηση και υποτυποποίηση των ιών Γρίπης Απομόνωση RNA από το κλινικό δείγμα Από το κλινικό δείγμα αρχικά γινόταν η απομόνωση του ριβονουκλεϊνικού οξέος. Για την εκχύλιση του ιικού RNA χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό κιτ Viral RNA mini kit (Qiagen, Hilden, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Συγκεκριμένα, 180μl του κλινικού δείγματος αναμειγνύονταν με 720μl του λυτικού διαλύματος (AVL buffer) που περιείχε το φορέα απορρόφησης RNA (RNA carrier) σε σωληνάριο τύπου Eppendorf 2ml και ακολουθούσε έντονη ανάδευση σε συσκευή vortex (GVlab, Gilson, France) για 15 δευτερόλεπτα και επώαση 10 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου (22 C). Ο ρόλος του φορέα απορρόφησης ήταν η ενίσχυση της κατακράτησης του ιικού RNA στη μεμβράνη της στήλης εκχύλισης (QIΑmp membrane), ώστε να είναι αποτελεσματική η απομόνωσή του ακόμη και στην περίπτωση που η συγκέντρωσή του είναι πολύ μικρή. Μετά από την επώαση, προσθέτονταν 720μl απόλυτης αιθανόλης (100%) και γινόταν έντονη ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα. Στη διάρκεια της επώασης πραγματοποιούνταν η λύση των κυττάρων και η αδρανοποίηση των RNA νουκλεασών του δείγματος, ώστε να επιτευχθεί η απομόνωση ακέραιου ιικού RNΑ. Το διάλυμα συνολικού όγκου 1620μl τοποθετούνταν ανά 630μl στην ειδική στήλη εκχύλισης (QIAmp mini spin column), η οποία φέρει ειδικό φίλτρο απορρόφησης RNA, και ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 8000rpm στους 4 C (φυγόκεντρος 5415R, Eppendorf, Germany). Στη συνέχεια, η στήλη με το φίλτρο που περιείχε το εξαχθέν RNA, τοποθετούνταν σε νέο σωληνάριο, ακολουθούσε προσθήκη 500μl διαλύματος εκπλύσεως (AW1 των κατασκευαστών) και γινόταν νέα φυγοκέντρηση σε 8000rpm για 1 λεπτό στους 4 C. Μετά την απομάκρυνση του σωληναρίου που περιείχε το εναιώρημα (χωρίς το RNA), η στήλη με το φίλτρο τοποθετούνταν σε καθαρό σωληνάριο και προσθέτονταν 500μl διαλύματος εκπλύσεως (AW2 των κατασκευαστών). Ακολουθούσε φυγοκέντρηση στις 13200rpm για 4 λεπτά, με στόχο την απομάκρυνση κάθε υπολείμματος του υγρού εναιωρήματος από το φίλτρο. Με τις εκπλύσεις της στήλης επιτεύχθηκε η απομάκρυνση 64

65 των δεσμεμένων στο ιικό RNA πρωτεϊνών. Στο τελικό στάδιο της εκχύλισης, το φίλτρο τοποθετούνταν σε καθαρό σωληνάριο 2ml και μετά την προσθήκη 60μl διαλύματος έκλουσης RNA (AVE Elution Buffer), ακολουθούσε επώαση της στήλης για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (22 C) και τελική φυγοκέντρηση σε 8000rpm για 1 λεπτό, ώστε να επιτευχθεί η απελευθέρωση του νουκλεϊνικού οξέος από το φίλτρο τη στέλης μέσα στο διάλυμα έκλουσης. Το RNA συντηρούνταν σε θερμοκρασία -70 C, για περαιτέρω χρήση του στις μοριακές τεχνικές της μελέτης Ανάστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Μετά την απομόνωση του RNA από τα κλινικά δείγματα, πραγματοποιούνταν η ανάστροφη μεταγραφή και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (One step real time RT-PCR) στο θερμοκυκλοποιητή πραγματικού χρόνου Rotorgene plex (Corbett Research, Australia). Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε, ανίχνευε και τυποποιούσε ιούς γρίπης Α και Β (West Anglia Pathology Service, Clinical Microbiology Laboratories, HPA Cambridge & Papworth, edition No SOP/VIR/072a). 96 Για κάθε τύπο ιού Α και Β χρησιμοποιήθηκε ένα ζεύγος εκκινητών καθώς και ένας ανιχνευτής σημασμένος με φθοριόχρωμα (Taqman probe) για το σύγχρονο έλεγχο και των δύο τύπων στο ίδιο δείγμα (Πίν. 2). Οι εκκινητές είχαν τη δυνατότητα να ενισχύουν τμήματα των γονιδίων Μ και ΝΡ των ιών γρίπης Α και Β αντίστοιχα, ενώ δεν ενίσχυαν την ανάπτυξη γενετικού υλικού άλλων ιών, βακτηρίων ή μυκήτων, σύμφωνα με μελέτη που έγινε στο Health Protection Agency (HPA) του Cambridge. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και των ανιχνευτών παρέχονται στον παρακάτω πίνακα (Πιν.2). 65

66 Πίνακας 2. Εκκινητές και ανιχνευτές πρωτοκόλλου ανίχνευσης ιών γρίπης Α και Β. 96 Τύπος Αλληλουχία εκκινητών και ανιχνευτών Όνομα Γονίδιο Θέσεις σύνδεσης Α 5 - GAGTCTTCTAACMGAGGTCGAAACGTA -3 ΑΜ-forward M Α 5 - GGGCACGGTGAGCGTRAA -3 AM-reverse M Α 5 VIC- TCCTGTCACCTCTGAC MGBNFQ3 AM-probe M Β 5 - GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT -3 BNP-forward NP Β 5 - CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTC -3 BNP-reverse NP Β 5 Cy5-CCAGATCTGGTCATTGGTGCCCARAACTG-BHQ33 BNP-probe NP H RT-PCR πραγματοποιούνταν σε διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 25μl, το οποίο περιείχε 0.8μl του μείγματος ενζύμων RNA μεταγραφάσης και DNA πολυμεράσης Superscript TM III Platinum του κιτ (Superscript III One-step RT-PCR kit, Invitrogen, UK), 4.28μl Rnase-free νερό (Invitrogen), 12.5μl από το διάλυμα (2Χ) που παρέχεται με το κιτ και περιέχει τα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια (dntps), 0.5μl του ΑΜ-F(20μΜ), 1μl του AM-R(20μΜ), 0.4μl του AM-probe, 0.16μl του BNP-F(20μM), 0.16μl του BNP-R(20μM) και 0.2μl του BNP-probe(3.3μΜ). (Πίνακας 1) Αρχικά η αντίδραση της ανάστροφης μεταγραφής διεξαγόταν στους 50 C για 30 λεπτά και ακολουθούσε η αρχική μετουσίωση του DNA στους 95 C για 2 λεπτά. Η αντίδραση της PCR διεξαγόταν σε 45 κύκλους, καθένας από τους οποίους περιλάμβανε αποδιάταξη (denaturation) στους 95 C για 15 δευτερόλεπτα, υβριδισμό των εκκινητών και των ανιχνευτών στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες (annealing) και συγχρόνως επιμήκυνση της νεοσυντηθέμενης αλυσίδας DNA (extension) στους 60 C για 1 δευτερόλεπτο. Κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων ανίχνευση φθορισμού στο κανάλι Fam με εκθετική καμπύλη που εκδηλωνόταν επάνω από τη βασική γραμμή (threshold) υποδήλωνε την ενίσχυση και επομένως την ύπαρξη του ιού Α. Αντίστοιχα φθορισμός στο κανάλι του Cy5 υποδήλωνε την ύπαρξη του ιού γρίπης Β. Το Ct (threshold cycle), δηλαδή ο κύκλος της PCR κατά τον οποίο ανιχνευόταν για πρώτη φορά ο φθορισμός ήταν εκτίμηση του ιικού φορτίου. Για τον έλεγχο της ευαισθησίας της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν αραιώσεις των παρακάτω στελεχών. Το 66

67 A/Taiwan/1/86 (1.6x10 8 pfu/ml) ανιχνεύθηκε μέχρι και την αραίωση 10-7 που αντιστοιχεί σε 0.2 pfu/αντίδραση. Το στέλεχος Α/Moscow/10/99 (2.6x10 6 pfu/ml) ανιχνεύθηκε μέχρι την αραίωση 10-6 που αντιστοιχεί σε 3.25 pfu/αντιδραση και το στέλεχος B/Panama/45/90 (8x10 7 pfu/ml) ανιχνεύθηκε μέχρι την αραίωση 10-8 που αντιστοιχεί σε 0.01 pfu/αντίδραση. Η ειδικότητα της μεθόδου ελέγχθηκε με 24 άλλους αναπνευστικούς ιούς, όπως αδενοιούς, γρίπη C, RSV, παραγρίπη. Η μέθοδος έδωσε αρνητικό αποτέλεσμα για όλους τους άλλους ιούς. Αντίθετα έδωσε θετικό αποτέλεσμα για όλους τους υποτύπους των ιών γρίπης Α (Η1-Η16) Υποτυποποίηση των ιών γρίπης Α με nested RT-PCR Στα δείγματα που ανιχνεύθηκε ιός γρίπης Α ακολουθούσε υποτυποποίηση του ιού με τη μέθοδο της ενφωλεασμένης RT-PCR, με τη χρήση εμπορικού κιτ (Influ-check, Euroclone, Italy) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Οι εκκινητές της εταιρίας για την υποτυποποίηση των ιών γρίπης Α σε Η1 και Η3, ανιχνεύουν τμήμα του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης. Κατά την πρώτη PCR, 47μl αποστειρωμένου και απιονισμένου νερού προσθέτονταν στα έτοιμα σωληνάρια με 1μl του αντίστοιχου για Η1 ή Η3 εκκινητή και 2μl του εκχυλισμένου RNA. Οι συνθήκες ανάστροφης μεταγραφής και πολλαπλασιασμού ήταν στους 42 C για 45 λεπτά, στους 95C για 5 λεπτά και ακολουθούσαν 30 κύκλοι αποδιάταξης του DNA στους 95 C για 1 λεπτό, υβριδισμού των εκκινητών στους 48 C για 1 λεπτό και επιμήκυνσης στους 72 C για 1 λεπτό. Ο θερμοκυκλοποιητής που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μοντέλο Peltier Thermal Cycle PTC-0200 (Biorad, Germany). Το προϊόν της πρώτης PCR χρησιμοποιούνταν στην ενφωλεασμένη (nested) PCR, όπου 2μl αυτού αναμειγνύοταν με 22μl νερού και με 1μl του αντίστοιχου για Η1 ή Η3 εκκινητή μέσα στα έτοιμα σωληνάρια. Η αρχική αποδιάταξη γινόταν στους 95 C γα 5 λεπτά και ακολουθούσαν 30 κύκλοι αποδιάταξης του DNA στους 93 C για 1 λεπτό, υβριδισμού των εκκινητών στους 48 C για 1 λεπτό και επιμήκυνσης της αλυσίδας DNA στους 72 C για 1 λεπτό. Ακολουθούσε ηλεκτροφόρηση των προιόντων σε πηκτή αγαρόζης 2% (Ultrapure agarose, Invitrogen, UK) με 30mg βρωμιούχο αιθίδιο (10mg/μl) και σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ ΤΒΕ (89mM Tris borate 67

68 buffer με 2.5mM EDTA) (Invitrogen, UK) στα 120V για 30 λεπτά. Παράλληλα στην ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε μάρτυρας μοριακών βαρών (100bp ladder, Invitrogen, UK). Το αναμενόμενο προϊόν της PCR για τον υπότυπο Η1 ήταν 944 βάσεις, ενώ για τον υπότυπο Η3 ήταν 591 βάσεις. Μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή αγαρόζης μεταφερόταν σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας για την αποτύπωση των αποτελεσμάτων με σύστημα ψηφιακής κάμερας (GelLogic100,Kodak,USA). Κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων του κεφαλαίου 3.1 ακολουθήθηκαν όλες οι απαραίτητες διαδικασίες για την αποφυγή και τον έλεγχο τυχόν επιμολύνσεων των δειγμάτων, όπως η αποστείρωση αντιδραστηρίων και αναλωσίμων, η χρήση διαφορετικών χώρων για την απομόνωση του γενετικού υλικού, για την PCR και για την ηλεκτροφόρηση αλλά και η χρήση θετικών και αρνητικών μαρτύρων. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιούνταν το RNA στελεχών γρίπης Α(Η1Ν1), Α(Η3Ν2) και Β που μας παραχωρήθηκαν από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας και ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιούνταν νερό ελεύθερο νουκλεασών. 3.2 Καλλιέργεια και Απομόνωση ιών Γρίπης Κυτταροκαλλιέργεια Για την καλλιέργεια των ιών της Γρίπης σε κύτταρα χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά MDCK (Madine Darby Canine Kidney) που προέρχεται από κύτταρα νεφρού σκύλου και μας παραχωρήθηκε από τον ΠΟΥ. Τα κύτταρα αποθηκεύονται σε υγρό άζωτο για τη διατήρησή τους. Για την καλλιέργειά τους αρχικά το σωληνάριο τοποθετούνταν σε ανακινούμενο υδατόλουτρο στους 37 C μέχρι να ξεπαγώσουν τα κύτταρα. Μετά την ρευστοποίηση του εναιωρήματος των κυττάρων, αυτά τοποθετούνταν σε φιαλίδια με θρεπτικό υλικό σε τελικό όγκο 8ml. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε περιείχε DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium, Biochrom AG, Germany) 10%, FCS (Foetal Calf Serum, Biochrom AG, Germany) 10%, Tris Glycine 2%, Διττανθρακικό νάτριο (Biochrom AG, Germany) 2%, L-γλουταμίνη (Biochrom AG, Germany) 1% και Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη 1% (Gibco, UK). 68

69 Για την ανακαλλιέργεια των κυττάρων, το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό απορρίπτονταν και το εναπομείναν ταπήτιο κυττάρων πλένονταν με 2ml PBS (Phosphate Buffered Saline) με ph 7.4 και με Trypsin-EDTA (Gibco, UK). Στη συνέχεια γίνονταν επώαση στους 37 C για 20 λεπτά σε 1,5ml Trypsin-EDTA, έτσι ώστε να γίνει η αποκόλληση των κυττάρων από το φιαλίδιο. Ο έλεγχος της αποκόλλησης γινόταν σε ανάστροφο μικροσκόπιο (Axiovert 40, Carl Zeiss, Germany). Μετά την αποκόλληση, προσθέτονταν 8,5ml θρεπτικού υλικού που περιείχε DMEM 10%, FCS 5%, Tris Glycine 2%, Διττανθρακικό νάτριο 2%, L-γλουταμίνη 1% και Πενικιλίνη- Στρεπτομυκίνη 1% με ανάδευση, έτσι ώστε να διασπαστούν τα συσσωματώματα των κυττάρων. Στη συνέχεια, 1ml από τα 10ml του εναιωρήματος των κυττάρων τοποθετούνταν σε κάθε νέο σωληνάριο εμβολιασμού και επωάζονταν κεκλιμένα στους 37 C για 24 ώρες. Για κάθε κλινικό δείγμα χρησιμοποιούνταν τουλάχιστον τέσσερα σωληνάρια εμβολιασμού. Από τα σωληνάρια αυτά είχε αφαιρεθεί το θρεπτικό υλικό και είχαν προηγηθεί δυο πλύσεις με PBS. 200μl δείγματος τοποθετούνταν στο σωληνάριο με τα κύτταρα και επωάζονταν σε κεκλιμένο επίπεδο σε θερμοκρασία δωματίου (22 C) για μία ώρα. Στη συνέχεια αφαιρούνταν το δείγμα με αναρρόφηση και τοποθετούνταν 1ml θρεπτικού υλικού που περιείχε DMEM 10%, Tris Glycine 2%, διττανθρακικό νάτριο 2%, L-γλουταμίνη 1% και Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη 1% και 7,5μl θρυψίνη TPCK (Sigma, USA) ανά 10ml θρεπτικού υλικού. Το σωληνάριο επωάζονταν κεκλιμένο στους 37 C για 96 ώρες. Μετά από το διάστημα αυτό της επώασης του ιού, το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό αναρροφούνταν και εκτελούνταν η δοκιμασία αιμοσυγκόλλησης για τη διαπίστωση της απομόνωσης του ιού της γρίπης Καλλιέργεια σε εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας Τα εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας επωάζονταν για 8-10 ημέρες στους 37 C σε κλίβανο με σχετική υγρασία 70%. Μετά από το διάστημα αυτό γινόταν ο εμβολιασμός τους με τα δείγματα ασθενών. Με ειδική σύριγγα, 200μl δείγματος εμβολιάζονταν στην αμνιακή και αλλαντοϊκή κοιλότητα του αβγού κάτω από άσηπτες συνθήκες. Για κάθε κλινικό δείγμα χρησιμοποιούνταν 6 αβγά. 5 69

70 Μετά από 3 ημέρες επώασης στους 37 C, τα εμβολιασμένα αβγά τοποθετούνταν για 24 ώρες στους 4 C και στη συνέχεια γινόταν η συλλογή του αμνιακού και του αλλαντοϊκού υγρού Έλεγχος ανάπτυξης ιού με δοκιμασία αιμοσυγκόλλησης (ΗΑ) Προκειμένου να ελεγχθεί η ανάπτυξη του ιού, κάθε αμνιακό και αλλαντοϊκό υγρό ή υπερκείμενο της κυτταροκαλλιέργειας αραιώνονταν με φυσιολογικό ορό διαδοχικά από αναραίωτο εώς και 1:1024 σε πλάκες Perspex σχήματος V των 96 θέσεων. Σε όλα τα βοθρία προσθέτονταν 50μl ερυθρών αιμοσφαιρίων ανθρώπου ομάδος Ο και Rhesus αρνητικού αραιωθέντων σε φυσιολογικό ορό (2,5%). Στην τελευταία σειρά των πλακών δεν είχε τοποθετηθεί αμνιακό ή αλλαντοϊκό υγρό ή υπερκείμενο της κυτταροκαλλιέργειας αλλά μόνο φυσιολογικός ορός και ερυθρά αιμοσφαίρια. Η σειρά αυτή χρησίμευε ως μάρτυρας ερυθρών. Στα θετικά δείγματα η ανάπτυξη του ιού φαίνονταν από τη συγκόλληση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Ανάλογα με την αρχική αραίωση του αμνιακού ή αλλαντοϊκού υγρού ή του υπερκείμενου της καλλιέργειας MDCK στην οποία παρατηρείτο συγκόλληση, υπολογίζονταν και ο τίτλος του απομονωθέντος ιού. Π.χ. Αν παρατηρείτο συγκόλληση σε κάποιο δείγμα μέχρι και την αραίωση 1:80, η αραίωση αυτή θεωρούνταν ότι περιείχε μία μονάδα του ιού. Κατά την ακολουθούσα διαδικασία αναστολής της αιμοσυγκόλλησης για την τυποποίηση του απομονωθέντος ιού, χρησιμοποιούνταν 4 μονάδες δηλαδή διάλυμα 4 φορές πυκνότερο, 1:20, στο συγκεκριμένο παράδειγμα. Στην περίπτωση που ο ιός δεν είχε αναπτυχθεί επαρκώς, η διαδικασία του εμβολιασμού επαναλαμβανόταν για δεύτερη και τρίτη φορά σε νέα αβγά, μόνο που το υλικό του εμβολιασμού ήταν το αμνιακό υγρό της αρχικής καλλιέργειας. Στην περίπτωση της καλλιέργειας στα κύτταρα, η διαδικασία του εμβολιασμού επαναλαμβανόταν μέχρι τρεις φορές σε νέα καλλιέργεια και το υλικό του εμβολιασμού αποτελούσε το υπερκείμενο της αρχικής καλλιέργειας. 70

71 3.2.4 Τυποποίηση με αναστολή αιμοσυγκόλλησης (ΗΑΙ) Η τυποποίηση και υποτυποποίηση των στελεχών που απομονώνονταν είτε σε κυτταροκαλλιέργειες, είτε σε εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας έγινε με τη δοκιμασία αναστολής αιμοσυγκόλλησης (ΗΑΙ). Χρησιμοποιήθηκαν αντιδραστήρια που χορηγεί ο ΠΟΥ (Ατλάντα, ΗΠΑ) κάθε χρόνο στα Εθνικά Κέντρα Γρίπης και περιλαμβάνουν αλλαντοϊκό υγρό θετικής καλλιέργειας αντιπροσωπευτικών στελεχών γρίπης Α(Η3), Α(Η1) και Β, όπως και τους σχετικούς αντι-ορούς παρασκευασμένους σε κόνικλο. Η δοκιμασία αυτή εκτελείται ως εξής: σε πλάκες Perspex σχήματος V γίνονταν διαδοχικές αραιώσεις των αντι-ορών Α(Η3), Α(Η1) και Β σε φυσιολογικό ορό. Ο απομονωμένος ιός προσθέτονταν σε αραίωση με 4 μονάδες ιού, και ακολουθούσε επώαση μιας ώρας σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά προσθέτονταν ερυθρά αιμοσφαίρια ανθρώπου Ο ομάδος και Rh αρνητικού. Ανάλογα με την εμφάνιση αναστολής της αιμοσυγκόλλησης από ένα των χρησιμοποιηθέντων αντισωμάτων, τυποποιούνταν ο άγνωστος ιός ως ομόλογος του αντισώματος που τον εξουδετέρωσε. Συνυπήρχαν θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες για κάθε τύπο και υπότυπο. 3.3 Μοριακή ανάλυση των ιών γρίπης Α(Η3Ν2) Απομόνωση RNA από τις καλλιέργειες των ιών Α(Η3Ν2) Για την εκχύλιση του ιικού RNA από τις καλλιέργειες κυττάρων και εμβρυοφόρων αυγών στις οποίες είχαν απομονωθεί ιοί Α(Η3) χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό κιτ Viral RNA mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Το αρχικό υλικό για την απομόνωση αποτελούσαν τα μολυσμένα με ιό κύτταρα των κυτταροκαλλιεργειών και το αμνιακό και αλλαντοϊκό υγρό των καλλιεργειών σε εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας. Το αναλυτικό πρωτόκολλο περιγράφηκε στο κεφάλαιο Ανάστροφη μεταγραφή - Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Μετά την απομόνωση του RNA από τις καλλιέργειες, πραγματοποιήθηκε η ανάστροφη μεταγραφή και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τη μελέτη των τμημάτων των γονιδίων της ΗΑ, Μ και ΝΑ που μελετήθηκαν. Και για τα τρία γονίδια, 71

72 χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό κιτ One-step RT-PCR (Qiagen, Hilden, Germany). RT-PCR για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της ΗΑ Συγκεκριμένα για το γονίδιο ΗΑ, για κάθε αντίδραση συνολικού όγκου 50μl, 5μl εκχυλισμένου RNΑ αναμιγνύονταν με 10μl ρυθμιστικού διαλύματος (5χ), 2μl μείγματος dntps (10mM), 6μl του εκκινητή H3HAF6 (10μΜ) και 6μl του εκκινητή H3HAR1056 (10μM), 2μl μείγματος των ενζύμων ανάστροφης μεταγραφάσης και πολυμεράσης και 0.5μl αναστολέα RNA νουκλεασών (Rnase Out, Invitrogen, UK). Αναλυτικά οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 2 (σελ. 65). Οι συνθήκες της ανάστροφης μεταγραφής ήταν 60 C για 1 λεπτό, 50 C για 30 λεπτά και 95 C για 15 λεπτά. Ακολουθούσε η PCR με πρώτο βήμα την αποδιάταξη (denaturation) της αλυσίδας του cdna στους 94 C για 30 δευτερόλεπτα, δεύτερο βήμα τον υβριδισμό των εκκινητών (annealing) στους 50 C για 30 δευτερόλεπτα και τέλος την επιμήκυνση της αλυσίδας DNA (extension) στους 72 C για 1 λεπτό. Τα τρία βήματα επαναλαμβάνονταν 39 φορές και η αντίδραση έληγε με ένα στάδιο τελικής επιμήκυνσης του προϊόντος της στους 72 C για 10 λεπτά. Ακολουθούσε η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης 2% (Ultrapure agarose, Invitrogen, UK) με 30mg βρωμιούχο αιθίδιο (10mg/μl) και σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ ΤΒΕ (Invitrogen, UK) στα 120V για 30 λεπτά. Το αναμενόμενο προϊόν για το ενισχυμένο γονίδιο της αιμοσυγκολητίνης ήταν 1050 ζεύγη βάσεων. Μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή αγαρόζης μεταφερόταν στην τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας για την αποτύπωση των αποτελεσμάτων με σύστημα ψηφιακής κάμερας (Gel Logic 100, Kodak, USA). RT-PCR για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της Μ2 Για την ενίσχυση του γονιδίου της Μ2 πρωτεϊνης, για κάθε αντίδραση συνολικού όγκου 50μl, 5μl RNA αναμιγνύονταν με 10μl ρυθμιστικού διαλύματος (5χ), 2μl μείγματος dntp s (10mM), 6μl του εκκινητή ΜF8 (10μΜ) και 6μl του εκκινητή ΜR1024 (10μM), 2μl μείγματος των ενζύμων ανάστροφης μεταγραφάσης και πολυμεράσης και 0.5μl αναστολέα αναστολέα RNA νουκλεασών (Rnase out, 72

73 Invitrogen,UK). Αναλυτικά οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 2. Οι συνθήκες της ανάστροφης μεταγραφής ήταν 60 C για 1 λεπτό, 50 C για 30 λεπτά και 95 C για 15 λεπτά. Ακολουθούσε η PCR με 39 κύκλους αποδιάταξης στους 94 C για 30 δευτερόλεπτα, σύζευξης των εκκινητών στους 56 C για 30 δευτερόλεπτα και επιμήκυνσης στους 72 C για 1 λεπτό, με ένα επιπλέον βήμα ενίσχυσης στους 72 C για 10 λεπτά. Ακολουθούσε η ηλεκτροφόρηση των προιόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης, όπως ήδη περιγράφηκε. Το αναμενόμενο προϊόν για το ενισχυόμενο γονίδιο της μητρικής πρωτεΐνης Μ2 ήταν 1018 ζεύγη βάσεων. Η φωτογράφιση των αποτελεσμάτων της ηλεκτροφόρησης έγινε με το σύστημα ψηφιακής κάμερας. RT-PCR για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της ΝΑ Για την ενίσχυση του γονιδίου της ΝΑ πρωτεΐνης, ο συνολικός όγκος αντίδρασης ήταν 25μl, και περιείχε 2μl του RNA, 1χ ρυθμιστικού διαλύματος (5χ), 1μl μείγματος dntps (10mΜ), 0.6μl του εκκινητή Ν2F-1 (25μΜ), 0.6μl του εκκινητή Ν2R-1407 (25μΜ) και 1μl μείγματος ενζύμων RNA μεταγραφάσης και DNA πολυμεράσης. Αναλυτικά οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 3. Μετά από προθέρμανση στους 50 C ακολουθούσαν οι συνθήκες του προγράμματος του θερμοκυκλοποιητή για το πρωτόκολο της ανάστροφης μεταγραφής: 50 C για 30 λεπτά και 95 C για 15 λεπτά. Στη συνέχεια η PCR ήταν 40 κύκλοι αποδιάταξης στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα, υβριδισμού των εκκινητών στους 58 C για 30 δευτερόλεπτα και επιμήκυνση της αλυσίδας DNA στους 72 C για 2 λεπτά. Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR γινόταν σε πηκτή αγαρόζης 1% (Ultrapure Agarose, Invitrogen, UK) σε συνθήκες ίδιες με τις προαναφερθέντες. Το αναμενόμενο προϊόν για το ενισχυμένο γονίδιο της νευραμινιδάσης ήταν 1406 ζεύγη βάσεων. Ακολουθούσε η αποτύπωση των αποτελεσμάτων όπως ήδη περιγράφηκε. 73

74 Πίνακας 3. Αλληλουχίες χρησιμοποιηθέντων εκκινητών (σύμφωνα με οδηγίες του ΠΟΥ). Εκκινητής Γονίδιο Θέσεις Αλληλουχία σύνδεσης H3HAF6 ΗΑ AAGCAGGGGATAATTCTATTAACC-3 forward H3HAR1056 ΗΑ GTTTCTCTGGTACATTCCGC - 3 reverse MF8 Μ GCAGGTAGATATTGAAAGATGAG- 3 Forward MR1024 Μ AGAAACAAGGTAGTTTTTTACTC -3 reverse Ν2F-1 ΝΑ AGCAAAAGCAGGAGTGAAGA - 3 forward Ν2R-1407 Reverse ΝΑ ATATAGGCATGAGATTGATG - 3 Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στον θερμοκυκλοποιητή Peltier Thermal Cycler PTC-0200 (Biorad, Germany) και η ηλεκτροφόρηση των προιόντων της PCR στη συσκευή ηλεκτροφόρησης (ThermoEC, USA). Κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ακολουθήθηκαν όλες οι συνιστώμενες προφυλάξεις για την αποφυγή επιμολύνσεων των δειγμάτων. Όλα τα αντιδραστήρια και τα πλαστικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αποστειρωμένα και είχαν υποστεί διεργασία με DEPC. Σε όλες τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας το RNA ιού Α(Η3Ν2) που μας παραχωρήθηκε από τον ΠΟΥ και ως αρνητικός μάρτυρας νερό ελέυθερο νουκλεασών για τον έλεγχο τυχόν επιμολύνσεων. Χρησιμοποιήθηκε επίσης και δείκτης μοριακών βαρών (100bp ladder, Invitrogen, UK). Οι διαδικασίες απομόνωσης του γενετικού υλικού, της PCR και της ηλεκτροφόρησης πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούς χώρους. 74

75 3.3.3 Καθαρισμός προϊόντος PCR Μετά από την ενίσχυση των τμημάτων των γονιδίων ΗΑ, Μ2 και ΝΑ, τα προιόντα της PCR υφίσταντο καθαρισμό (purification) από τα ολιγονουκλεοτίδια, τα άλατα και τους εκκινητές, με το εμπορικό κιτ Chargeswitch PCR cleanup kit (Invitrogen, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Η μέθοδος βασίζεται σε μαγνητικά σφαιρίδια, τα οποία είναι θετικά φορτισμένα στις κατάλληλες συνθήκες ph και έτσι δεσμεύουν τα αρνητικά φορτισμένα νουκλεϊνικά οξέα, ενώ οι πρωτεϊνες και τα υπόλοιπα συστατικά μένουν στο διάλυμα και απορρίπτονται. Στη συνέχεια για την αποδέσμευση του DNA από τα μαγνητικά σφαιρίδια, χρησιμοποιείται ένα αλκαλικό διάλυμα με PH 8.5. Συγκεκριμένα, 25μl του προιόντος της PCR τοποθετούνταν σε αποστειρωμένο σωληνάριο του 1.7ml. Στο ίδιο σωληνάριο προσθέτονταν 25μl του διαλύματος Ν5 και 10μl των μαγνητικών σφαιριδίων. Μετά από επώαση για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου, τα δείγματα τοποθετούνταν στο ειδικό μαγνητικό στατό (Magnarack, Invitrogen, UK) για 1 λεπτό, έως ότου τα μαγνητικά σφαιρίδια δημιουργούσαν ίζημα. Το υπερκείμενο απορρίπτονταν και τα μαγνητικά σφαιρίδια αναδιαλύονταν σε 150μl πλυστικού διαλύματος W12. Τα δείγματα τοποθετούνταν στο στατό και το υπερκείμενο απορίπτονταν. Η πλύση επαναλαμβανόταν και στη συνέχεια τα μαγνητικά σφαιρίδια αναδιαλύονταν σε 30μl του ειδικού διαλύματος (elution buffer). Αφού τα δείγματα τοποθετούνταν στο ειδικό στατό, το υπερκείμενο που περιείχε το DNA μεταφερόταν σε καθαρό σωληνάριο και αποθηκεύονταν στους -20C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω έρευνα Ανεύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων προιόντος PCR (DNA sequencing) Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων των τμημάτων των γονιδίων ΗΑ, Μ2 και ΝΑ έγινε με την εφαρμογή της μεθόδου Sanger. 94 Με τη μέθοδο αυτή επιτυγχάνεται η ακριβής ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων της περιοχής του γονιδιώματος που βρίσκεται υπό μελέτη. Βασίζεται στη χρήση σημασμένων διδεοξυριβονουκλεοτιδίων (ddntps). Τα ddntps είναι σημασμένα με 4 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, μια για κάθε βάση Α, Τ, G, 75

76 C και στερούνται της 3 -ΟΗ ομάδας, με αποτέλεσμα όταν ενσωματώνονται στη νουκλεοτιδική αλληλουχία να παρεμποδίζουν την προσθήκη άλλων νουκλεοτιδίων, σταματώντας τη σύνθεση του μορίου. Το αποτέλεσμα είναι να προκύπτουν αλληλουχίες DNA διαφόρου μήκους, που ανιχνεύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή ακρυλαμιδίου. Το πρώτο βήμα γίνεται σε θερμοκυκλοποιητή και η διαφορά με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι ότι ενώ στην PCR χρησιμοποιούνται δύο εκκινητές και έτσι το αποτέλεσμα είναι ο εκθετικός πολλαπλασιασμός του γονιδίου, στην ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων χρησιμοποιείται ένας εκκινητής και έτσι το αποτέλεσμα είναι ο γραμμικός πολλαπλασιασμός των προϊόντων της ενίσχυσης. Μετά από τη διαδικασία καθαρισμού, τα προιόντα της PCR και ο εμπρόσθιος εκκινητής (30μΜ) που χρησιμοποιήθηκε στην κάθε αντίδραση πολλαπλασιασμού χρησιμοποιούνταν για τη διαδικασία του προσδιορισμού της αλληλουχίας των βάσεων. Η διαδικασία αυτή έγινε σε αυτόματο DNA sequencer (Applied Biosystems) της εταιρείας παροχής υπηρεσιών αλληλούχισης Lark Technologies (Cogenics Ltd, Essex, UK). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής : H3HAF6, MF8 και Ν2F-1 (Invitrogen, UK). (Πίν.2) Τα χρωμογράμματα αναλύθηκαν στο διαθέσιμο στο διαδίκτυο πρόγραμμα Chromas. Οι αλληλουχίες εισηχθησαν στην Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών, GenBank. Η σύγκρισή τους με άλλα στελέχη ιών γρίπης Α(Η3Ν2) έγινε στο διαθέσιμο στο διαδίκτυο πρόγραμμα Nucleotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) του NCBI (National Centre for Biotechnology Information). 57 Με το ClustalW έγινε η μετατροπή της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στην αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων, η συστοίχιση των στελεχών με τα στελέχη του εμβολίου και ο προσδιορισμός των γενετικών αποστάσεων και της ομολογίας τους. 98 Τα φυλογενετικά δέντρα δημιουργήθηκαν με το πρόγραμμα MEGA

77 3.4 Πρωτόκολλο της πορείας του δείγματος στο εργαστήριο Συνοψίζοντας, η πορεία των κλινικών δειγμάτων στο εργαστήριο ήταν η εξής: Aπομόνωση του RNA απευθείας από το δείγμα, ταχεία ανίχνευση των ιών γρίπης Α και Β με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Tα θετικά για γρίπη Α δείγματα υποτυποποιούνταν με τη μέθοδο της ενφωλεασμένης RT-PCR. Ακολουθούσε καλλιέργεια των θετικών δειγμάτων και έλεγχος της απομόνωσης με τη διαδικασία αιμοσυγκόλλησης ερυθρών αιμοσφαιρίων ανθρώπου και τυποποίηση με τη διαδικασία αναστολής της αιμοσυγκόλλησης με αντιορούς του ΠΟΥ. Από τις θετικές καλλιέργειες γινόταν εκχύλιση του RNA και μοριακή ανάλυση των γονιδίων των ΗΑ, ΝΑ και Μ2 πρωτεϊνών. Η μοριακή ανάλυση γινόταν με αλληλούχιση που ακολουθούσε τις τρεις αντιδράσεις PCR για την ενίσχυση τμημάτων των γονιδίων ΗΑ, ΝΑ και Μ2. Τα τμήματα που αλληλουχήθηκαν καταχωρήθηκαν στην GenBank Συμμετοχή του Εργαστηρίου σε εξωτερικούς ποιοτικούς ελέγχους Κάθε χρόνο το εργαστήριο λαμβάνει μέρος σε τρεις εξωτερικούς ποιοτικούς ελέγχους, έναν της ιδιωτικής εταιρείας QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics, Glasgow, UK) μετά από οδηγία του Παγκοσμίου Οργανισμού Υγείας και του EISS (European Influenza Surveillance Scheme), και δύο του Κέντρου Αναφοράς Γρίπης του Ηονγκ Κονγκ (WHO Influenza EQAP Team, Virology Devision, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR). Σε αυτούς του ελέγχους άγνωστα δείγματα ιών γρίπης αποστέλλονται στο εργαστήριο, ελέγχονται με τις προαναφερθείσες μεθόδους, λεπτομέρειες των οποίων συνοδεύουν τα αποτελέσματα. Με βάση τα αποτελέσματα του ποιοτικού ελέγχου γίνεται αξιολόγηση του εργαστηρίου και των μεθόδων που χρησιμοποιεί. Παρέχεται ακόμη γραπτή πιστοποίηση για τη συμμετοχή στο πρόγραμμα εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου. Παράλληλα, κάθε χρόνο το εργαστήριο αποστέλλει αντιπροσωπευτικά δείγματα ιών γρίπης στον Διεθνές Κέντρο Γρίπης, στο Mill Hill του Λονδίνου για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων του και περαιτέρω ανάλυση. 77

78 4. Αποτελέσματα 4.1 Αποτελέσματα ταχείας ανίχνευσης και τυποποίησης ιών γρίπης Α και Β με ποσοτική RT-PCR (real time reverse transcription-pcr) Ελέγχθηκαν διαγνωστικά τα κλινικά δείγματα ασθενών με γριπώδη συνδρομή που στάλθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Γρίπης Βόρειας Ελλάδας κατά τις περιόδους γρίπης , και Κατά τη διάρκεια της πρώτης περιόδου ( ) εξετάσθηκαν 170 δείγματα. Το αποτέλεσμα της ταχείας ανίχνευσης με τη χρήση της Real time One Step RT-PCR έδειξε ότι από το σύνολο των δειγμάτων, τα 63 περιείχαν το RNA ιού γρίπης Α ενώ σε 3 δείγματα ανιχνεύθηκε το RNA του ιού γρίπης Β. Κατά τη διάρκεια της δεύτερης περιόδου ( ) εξετάσθηκαν 140 κλινικά δείγματα. Σε αυτά ανιχνεύθηκαν 11 ιοί γρίπης Α και 42 ιοί γρίπης Β. Τέλος κατά τη διάρκεια της τρίτης περιόδου που μελετήθηκε ( ) εξετάσθηκαν 128 κλινικά δείγματα, από τα οποία στα 45 ανιχνεύθηκε το RNA του ιού γρίπης Α και στα 6 ανιχνεύθηκε το RNA του ιού γρίπης Β. (Πίν.4, Εικ.8) Πίνακας 4. Αποτελέσματα ανίχνευσης και τυποποίησης απομονωθέντων στελεχών ιών γρίπης. Χρονική ΣΥΝΟΛΟ περίοδος Αριθμός εξετασθέων Γρίπη Α 63(37,05%) 11(7,86%) 45(35,16%) 119(27,17%) Γρίπη Β 3(1,76%) 42(30%) 6(4,68%) 51(11,64%) Αρνητικά 103(61,19%) 87(62,14%) 77(60,16%) 268(61,19%) Τα ποσοστά είναι επί του συνόλου των εξετασθέντων δειγμάτων. 78

79 0,20 N o r m. F lu o r o. 0,15 0,10 0,05 0, Cycle -1,0 10 N o r m. F lu o r o. -1,5 10-2,0 10-2,5 10-3, Cycle Εικόνα 8. Αποτελέσματα Real time RT-PCR τυποποίησης αντιπροσωπευτικών ιών γρίπης Οι καμπύλες διαφόρων χρωματισμών αντιστοιχούν στο θετικό μάρτυρα και στα θετικά για γρίπη Α δείγματα. 79

80 4.2 Αποτελέσματα υποτυποποίησης ιών γρίπης Α με RT-PCR (reverse transcription-pcr) Σε όλα τα 119 στελέχη ιών γρίπης Α που ανιχνεύθηκαν έγινε μοριακή υποτυποποίηση με τη μέθοδο RT-PCR. Με τη διαδικασία αυτή βρέθηκαν 27 στελέχη γρίπης Α(Η3Ν2) κατά την περίοδο , 11 στελέχη κατά την περίοδο και 45 στελέχη κατά την περίοδο (Πίν.5) Μετά από ηλεκτροφόρηση τα θετικά δείγματα έδειξαν ταινία 591 ζεύγων βάσεων, που αντιστοιχούσε σε τμήμα του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης Η3, ενώ ταινία 944 ζεύγων βάσεων αντιστοιχούσε σε τμήμα του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης Η1. (Πιν.5, Εικ.9) Πίνακας 5. Αποτελέσματα μοριακής υποτυποποίησης ιών γρίπης Α. Δείγματα ΣΥΝΟΛΟ Εξεταστέα Η1 36(57,14%) (30,25%) Η3 27(42,86%) 11(100%) 45(100%) 83(69,75%) Τα ποσοστά είναι επί των θετικών για γρίπη Α δειγμάτων. 591bp L (-) (+4) Εικόνα 9. Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης αντιπροσωπευτικών δειγμάτων θετικών για γρίπη Α(Η3) 80

81 4.3 Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) Κατά την περίοδο το σύνολο των δειγμάτων που στάλθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Γρίπης Βόρειας Ελλάδας ήταν 170. Τα θετικά για τον ιό γρίπης Α(Η3Ν2) δείγματα ήταν 27 (15,88%). Την περίοδο αυτή συγχρόνως κυκλοφόρησαν και οι ιοί της γρίπης Α(Η1Ν1) (21,18%) και Β (1,76%). Το ποσοστό των αρνητικών για γρίπη δειγμάτων ήταν 61%. Η προέλευση των θετικών για γρίπη Α(Η3Ν2) δειγμάτων ήταν από Θεσσαλονίκη 67%, Αλεξανδρούπολη 20%, Σερρες 10%, Καστορια 3%. (Εικ.10) Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) περιόδου % 10% Θεσσαλονίκη 20% 67% Αλεξανδρούπολη Καστορια Σερρες Εικόνα 10. Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) που ανιχνεύθηκαν κατά την περίοδο Κατά την περίοδο το σύνολο των δειγμάτων που στάλθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Γρίπης Βόρειας Ελλάδας ήταν 140. Τα θετικά για τον ιό γρίπης Α(Η3Ν2) δείγματα ήταν 11 (7,86%). Την περίοδο αυτή κυκλοφόρησαν συγχρόνως και οι ιοί γρίπης Β (30%). Η προέλευσή των θετικών για γρίπη Α(Η3Ν2) δειγμάτων ήταν από Θεσσαλονίκη (46%), Κιλκίς (18%), Βέροια (18%) και Αλεξανδρούπολη (18%). (Εικ.11) 81

82 Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) περιόδου % 18% 18% 46% Θεσσαλονίκη Κιλκίς Βέροια Αλεξανδρούπολη Εικόνα 11. Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) που ανιχνεύθηκαν κατά την περίοδο Τέλος, κατά την περίοδο το σύνολο των δειγμάτων που στάλθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Γρίπης Βόρειας Ελλάδας ήταν 128. Τα θετικά για τον ιό γρίπης Α(Η3Ν2) δείγματα ήταν 45 (35,16%), ενώ την ίδια περίοδο ανιχνεύθηκαν και 6 ιοί γρίπης Β, δηλαδή σε ποσοστό 4,69%. Η προέλευσή των θετικών για γρίπη Α(Η3Ν2) δειγμάτων ήταν από Θεσσαλονίκη 45%, υπόλοιπη Κεντρική Μακεδονία 27%, Θράκη 14%, Φλώρινα 9%, Θεσσαλία 5%. (Εικ.12) 82

83 Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) περιόδου % 14% 5% 45% Θεσσαλονίκη Υπολοιπη Κεντρική Μακεδονία Φλώρινα Θράκη 27% Θεσσαλία Εικόνα 12. Γεωγραφική κατανομή στελεχών Α(Η3Ν2) που ανιχνεύθηκαν κατά την περίοδο Αποτελέσματα καλλιεργητικής απομόνωσης ιών γρίπης Α(Η3Ν2) Τα 83 δείγματα στα οποία ανιχνεύθηκε ιός γρίπης Α(Η3Ν2) καλλιεργήθηκαν σε εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας και σε κυτταροκαλλιέργειες. Κατά την περίοδο γρίπης , από τα 45 δείγματα, δυο ιοί απομονώθηκαν σε εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας και κανένας δεν απομονώθηκε σε κυτταροκαλλιέργειες. Κατά την περίοδο , από τα 11 δείγματα, κανένας ιός δεν απομονώθηκε σε αβγά όρνιθας, ενώ στα κύτταρα απομονώθηκαν 6 στελέχη ιών γρίπης Α(Η3Ν2). Τέλος κατά την περίοδο , από τα 45 θετικά δείγματα απομονώθηκαν 3 στελέχη ιών σε εβρυοφόρα αβγά και 21 στελέχη σε καλλιέργειες κυττάρων. Για την έρευνα επιλέχθηκαν συνολικά 34 στελέχη ιών από τις τρεις περιόδους γρίπης. (Πιν.6) Τα αποτελέσματα της καλλιέργειας και της διαδικασίας αναστολής της αιμοσυγκόλλησης για τα 34 στελέχη ιών που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα αυτή συνοψίζονται στον Πίνακα 6. 83

84 Όνομα στελέχους Απομόνωση Αποτελέσματα αναστολής αιμοσυγκόλλησης Είδος κλινικού δείγματος Α/Alexandroupolis/8/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ Α/Alexandroupolis/16 /05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Thessaloniki/19/05 AA A(H3N2) ΦΕ A/Thessaloniki/28/05 ΔΑ ΔΕ Ε A/ Thessaloniki /34/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Thessaloniki /42/05 ΔΑ ΔΕ E A/Thessaloniki/43/05 ΔΑ ΔΕ E A/Kastoria/45/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Thessaloniki/65/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A Thessaloniki /66/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Thessaloniki/67/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Thessaloniki/71/05 ΔΑ ΔΕ Ε A/Serres/94/05 AΑ A(H3N2) Ε A/Alexandroupolis/118/05 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Kilkis/85/06 AK A(H3N2) ΦΕ Α/Kilkis/88/06 AK A(H3N2) ΦΕ A/Thessaloniki/90/06 ΔΑ ΔΕ ΦΕ Α/Veria/94/06 AK A(H3N2) ΦΕ Α/Thessaloniki/119/06 AK A(H3N2) ΦΕ A/Thessaloniki/121/06 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Alexandroupolis/130/06 AK A(H3N2) ΦΕ A/Alexandroupolis/134/06 AK A(H3N2) ΦΕ A/Serres/8/07 AK A(H3N2) ΦΕ Α/Serres/12/07 AK A(H3N2) ΦΕ A/Evros/17/07 ΔΑ ΔΕ ΦΕ A/Serres/23/07 ΔΑ ΔΕ ΦΕ Α/Thessaloniki/26/07 AK A(H3N2) ΦΕ Α/Alexandroupolis/33/07 AK A(H3N2) ΦΕ Α/Thessaloniki/40/07 AK A(H3N2) ΦΕ Α/Thessaloniki/57/07 ΑΚ A(H3N2) ΦΕ A/Thessaloniki/63/07 ΔΑ ΔΕ ΦΕ Α/Serres/77/07 AA, ΑΚ A(H3N2) Ε A/Serres/78/07 AK A(H3N2) E Α/Alexandroupolis/99/07 AK A(H3N2) E ΔΑ - Δεν Απομονώθηκε ΑΑ - Απομονώθηκε σε Αβγά, ΑΚ - Απομονώθηκε σε Κύτταρα ΦΕ - Φαρυγγικό έκπλυμα, Ε- Επίχρισμα φάρυγγος, ΔΕ Δεν Έγινε Πίνακας 6. Αποτελέσματα καλλιέργειας και αναστολής αιμοσυγκόλλησης. 84

85 Για να μπορέσουμε να μελετήσουμε καλύτερα στελέχη που δεν απομονώθηκαν σε καλλιέργεια, επιλέχθηκαν για περαιτέρω μοριακή ανάλυση στελέχη που κατά την ποσοτική PCR ήταν σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, με βάση το Ct (threshold cycle) στο οποίο ανιχνεύθηκαν αλλά και της έντασης της ταινίας κατά την ηλεκτροφόρηση μετά από την ενφωλεασμένη PCR που ακολούθησε. Δεκαεφτά τέτοια στελέχη χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα αυτή. Επιδημιολογικά στοιχεία του συνόλου των στελεχών που επιλέχθηκαν για περαιτέρω μοριακό έλεγχο παρουσιάζονται στον Πινακα 7. 85

86 Ημερομηνία Εργαστηριακός Ηλικία Φύλο Περιοχή παραλαβής Αριθμός 20/1/05 8/05 50 ετών Α Αλεξανδρούπολη 27/1/05 16/05 30 ετών Α Αλεξανδρούπολη 27/1/05 19/05 8 ετών Α Θεσσαλονίκη 3/2/05 28/05 16 μηνών Α Θεσσαλονίκη 3/2/05 34/05 9 ετών Θ Θεσσαλονίκη 4/2/05 42/05 16 μηνών Θ Θεσσαλονίκη 4/2/05 43/05 2 ετών Α Θεσσαλονίκη 4/2/05 45/05 26 ετών Α Καστοριά 16/2/05 65/05 65 ετών Α Θεσσαλονίκη 16/2/05 66/05 58 ετών Θ Θεσσαλονίκη 16/2/05 67/05 25 ετών Θ Θεσσαλονίκη 16/2/05 71/05 4 μηνών Α Θεσσαλονίκη 24/2/05 94/05 5 ετών Α Σέρρες 8/3/05 118/05 13 μηνών Θ Αλεξανδρούπολη 23/2/06 85/06 30 ετών Α Κιλκίς 23/2/06 88/06 24 ετών Α Κιλκίς 27/2/06 90/06 24 ετών Α Θεσσαλονίκη 28/2/06 94/06 30 ετών Θ Βέροια 16/3/06 119/06 32 ετών Α Θεσσαλονίκη 16/3/06 121/06 8 ετών Θ Θεσσαλονίκη 28/3/06 130/06 10 ετών Α Αλεξανδρούπολη 6/4/06 134/06 6 ετών Θ Αλεξανδρούπολη 11/1/07 8/07 16 ετών Α Σέρρες 11/1/07 12/07 40 ετών Α Σέρρες 12/1/07 17/07 13 ετών Θ Έβρος 18/1/07 23/07 17 ετών Α Σέρρες 18/1/07 26/07 10 ετών Α Θεσσαλονίκη 19/1/07 33/07 13 ετών Θ Αλεξανδρούπολη 25/1/07 40/07 52 ετών Θ Θεσσαλονίκη 29/1/07 57/07 30 ετών Α Θεσσαλονίκη 29/1/07 63/07 34 ετών Α Θεσσαλονίκη 2/2/07 77/07 3 ετών Α Σέρρες 2/2/07 78/07 5 ετών Α Σέρρες 15/2/07 99/07 3 ετών Θ Αλεξανδρούπολη Α-Άρρεν, Θ-Θήλυ Πίνακας 7. Επιδημιολογικά στοιχεία στελεχών που επιλέχθηκαν για περαιτέρω μοριακό έλεγχο. 86

87 4.5 Αποτελέσματα της ενίσχυσης τμήματος των γονιδίων της ΗΑ, Μ2 και ΝΑ πρωτεΐνης Από τα στελέχη γρίπης Α(Η3Ν2) που ανιχνεύθηκαν και απομονώθηκαν στη Βόρεια Ελλάδα κατά το , επιλέχθηκαν 34 στελέχη από την αρχή, το μέσο και το τέλος κάθε περιόδου γρίπης για περαιτέρω μοριακό έλεγχο. Ακολούθησε η απομόνωση του ιικού RNA. Μοριακή ανάλυση του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης των ιών έγινε σε 23 στελέχη, 8 από την περίοδο , 8 από την περίοδο και 7 από την περίοδο Με την RT- PCR πολλαπλασιάσθηκε το τμήμα 1050 ζεύγων βάσεων του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης Η3, από το 6 ο νουκλεοτίδιο μέχρι και το 1056 ο. Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της PCR φαίνονται στην Εικόνα bp Εικόνα 7. Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης προιοντων PCR αντιπροσωπευτικών δειγμάτων για ενίσχυση τμήματος της ΗΑ. Μοριακή ανάλυση του γονιδίου της μητρικής πρωτεΐνης 2 (Μ2) των ιών έγινε σε όλα τα 34 στελέχη του Πίνακα 7. Ανάλυση του γονιδίου της Μ2 έγινε σε περισσότερα στελέχη από ότι του γονιδίου της ΗΑ, σε μια προσπάθεια να διαπιστωθεί το μέγεθος της εξάπλωσης ανθεκτικών στελεχών στη χώρα μας, όπως αναλυτικά θα αναφερθεί στη συνέχεια. Το RNA 14 στελεχών της περιόδου

88 2005, 8 στελεχών της περιόδου και 12 στελεχών της περιόδου χρησιμοποιήθηκε στην PCR για την ενίσχυση του τμήματος του γονιδίου της Μ2 που περιέχει τις γνωστές μεταλλάξεις ανθεκτικότητας στα αντιιικά φάρμακα αμανταδίνη και ριμανταδίνη. Με την RT-PCR πολλαπλασιάσθηκε τμήμα του γονιδίου της Μ2 πρωτεΐνης μήκους 1018 ζεύγων βάσεων, από το 8 ο νουκλεοτίδιο έως και το 1024 ο του γονιδίου. Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης φαίνονται στην Εικόνα bp Εικόνα 14. Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης προιοντων PCR αντιπροσωπευτικών δειγμάτων για ενίσχυση τμήματος της Μ2. Τέλος, μοριακή ανάλυση του γονιδίου της νευραμινιδάσης έγινε στα 23 στελέχη στα οποία έγινε επίσης ανάλυση του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης, έτσι ώστε να είναι εφικτή η επιδημιολογική συσχέτιση των γονιδίων ΗΑ και ΝΑ. Έτσι, το RNA 8 στελεχών της περιόδου , 8 στελεχών της περιόδου και 7 στελεχών της περιόδου χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση με RT-PCR τμήματος του γονιδίου της νευραμινιδάσης. Στόχος της μοριακής ανάλυσης του γονιδίου της νευραμινιδάσης ήταν επίσης η ανεύρεση τυχόν ανθεκτικών στελεχών στα αντιιικά φάρμακα οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη. Με την RT-PCR που ανέπτυξε το τμήμα 1406 ζεύγων βάσεων, από το 1 ο νουκλεοτίδιο μέχρι και το 88

89 1407 ο του γονιδίου της ΝΑ. Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της PCR φαίνονται στην Εικόνα bp Εικόνα 15. Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR αντιπροσωπευτικών δειγμάτων για ενίσχυση τμήματος της ΝΑ. 4.6 Αποτελέσματα διαδικασίας ανεύρεσης της αλληλουχίας των ενισχυμένων τμημάτων των ΗΑ, Μ2 και ΝΑ Με τη μεθοδολογία που αναφέρθηκε στο κεφάλαιο των Μεθόδων έγινε ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων των τμημάτων της αιμοσυγκολλητίνης, της μητρικής πρωτεΐνης και της νευραμινιδάσης. Οι αλληλουχίες της αιμοσυγκολλητίνης αντιπροσωπευτικών στελεχών κατατέθηκαν στη GenBank με αριθμούς πρόσβασης: EU716076, EU716077, EU716078, EU716079, EU716080, EU716081, EU716082, EU716083, EU716084, EU Οι αλληλουχίες της νευραμινιδάσης των στελεχών αυτών επίσης κατατέθηκαν με αριθμούς πρόσβασης: EU744874, EU744875, EU744876, EU744877, EU744878, EU744879, EU744880, EU744881, EU744882, EU